CN111593031A - 水稻ALS突变基因、含有该基因的植物转基因筛选载体pCALSm3及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及水稻ALS突变基因、含有该基因的植物转基因筛选载体pCALSm3及其应用。本发明的水稻ALS突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的植物遗传转化筛选载体利用水稻ALS突变基因的表达盒作为筛选标记，在愈伤组织筛选阶段使用嘧啶水杨酸类、咪唑啉酮类等除草剂作为筛选剂，获得的转基因植株具备嘧啶水杨酸类、咪唑啉酮类等除草剂的高抗性。该载体可作为转基因筛选载体附加其他功能元件使用，在转基因过程中利用植物内源基因，不引入菌源等外源筛选标记基因，不仅丰富了植物转基因筛选方法，还可有效降低外源基因引起的转基因植物的潜在安全风险，有利于转基因植物商业化应用。

Description

水稻ALS突变基因、含有该基因的植物转基因筛选载体 pCALSm3及其应用

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及水稻ALS突变基因、含有该基因的植物转基因筛选表达盒、含有该表达盒的植物转基因筛选载体及其应用。

背景技术

随着基因工程和分子生物学技术的迅速发展，转基因技术的应用范围越来越广泛。转基因技术具有诸多的优点，如可拓宽可利用的基因资源，创造新种质资源；可对植物性状进行定向定点变异和选择；为培育高产、优质、高抗优良品种提供新途径等。转基因作物于1996年被批准商业化种植，截至2017年，全球累计批准23种转基因作物进行商业化生产，涉及包括抗虫、抗除草剂、抗病、育性改变、品质改良等在内的超过16类目标性状。据统计，2017年全球26个国家和地区种植以抗除草剂和抗虫为主的大豆、玉米、棉花、油菜等转基因作物，面积达1.9亿公顷。转基因作物的大面积推广，为全球农业生产做出了巨大贡献。

目前，随着转基因产品的不断推广，人们对转基因产品的态度日趋客观和积极，但对转基因产品的争议仍甚嚣尘上，转基因产品潜在的安全风险问题仍受到普遍关切，因此，转基因产品需要严格的控制和监管。对于转基因作物的争议关键之一是筛选标记可能带来的潜在风险，其转入植物后对靶标生物的抗性、所表达蛋白质的致敏性以及对受体作物本身营养成分、天然毒素和抗营养物质含量等方面的影响是未知的。目前使用最多的是抗生素类和除草剂类筛选标记，如潮霉素-HPT筛选系统、卡纳霉素-NPTII筛选系统、草丁膦-Bar筛选系统等。这些筛选标记绝大多数为细菌等来源的外源基因，这也是引起公众担忧的原因之一。如果能用植物内源的基因作为筛选标记重新转化植物则可去除外源基因引起的风险和担忧。

乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase，ALS；EC2.2.1.6)是催化植物体内支链氨基酸(异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸)合成起始步骤的关键酶(Herrera-Estrella L,BlockM D,M essens E,et al.Chimeric genes as dominant selectable markers in plantcells.The EM BO Journal,1983,2(6):987-995.)，是植物特有酶，动物中没有该酶，故可通过抑制ALS酶阻断支链氨基酸的生物合成，进而达到清除植物杂草的目的，而且对人畜无害。目前，已针对该酶研发和应用多种除草剂如磺酰脲类、咪唑啉酮类、嘧啶水杨酸和磺酰胺类除草剂等。ALS氨基酸序列中某个位点的突变，可使得ALS蛋白结构发生改变，导致ALS抑制剂无法结合ALS，使得ALS对除草剂的敏感性降低，从而对相关除草剂产生抗性(Tan S,Evans RR,Dahm er M L,et al.Imidazolinone-tolerant crops：history,currentstatus and future.Pest Management Science,2005,61(3)：246-257；Duggleby RG,McCourt JA,Guddat LW.Structure and mechanism of inhibition of plantacetohydroxyacid synthase.Plant Physiology and Biochemistry,2008,46(3)：309-324；Lee H,Rustgi S,Kumar N,et al.Single nucleotide mutation in the barleyacetohydroxy acid synthase(AH AS)gene confers resistance to imidazolinoneherbicides.Proceedings of the National Academy of Sciences,2011,108(21)：8909.)。

发明内容

本发明的目的之一在于提供水稻ALS突变蛋白及其编码基因；本发明的另一目的是为解决目前基因遗传转化中因使用外源筛选标记而导致的潜在安全风险的问题，提供一种利用植物内源基因作为筛选标记应用于植物遗传转化筛选的载体。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供水稻ALS突变蛋白，所述ALS突变蛋白相对于野生型ALS蛋白在95、96、171、548和627位具有氨基酸突变。上述氨基酸位点的组合突变可显著提高ALS蛋白对于ALS抑制剂类除草剂的抗性，进而赋予植物对多种ALS抑制剂类除草剂的高抗性。

本发明所述的ALS突变蛋白中，95、96、171、548和627位氨基酸突变可为将所述植物的野生型ALS蛋白的95、96、171、548和627位氨基酸突变为丙氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸和苏氨酸中的任意一种。

更优选地，所述ALS突变蛋白相对于野生型在95位由Gly突变为Ala，在96位由Ala突变为Thr，在171位由Pro突变为Arg，在548位由Trp突变为Leu，在627位由Ser突变为Ile。优选地，所述ALS突变蛋白具有如下(1)或(2)的氨基酸序列：

(1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(2)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、插入或缺失得到的能够使植物具有ALS抑制剂类除草剂抗性的ALS突变蛋白的氨基酸序列。

本发明提供的水稻ALS突变蛋白对于咪唑啉酮类、嘧啶水杨酸类、磺酰脲类或磺酰胺类除草剂均具有较高的抗性。

本发明提供编码所述ALS突变蛋白的核酸。所有能够编码所述ALS突变蛋白的核酸序列均在本发明的保护范围内，例如：如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

本发明提供包含编码所述ALS突变蛋白的核酸的生物材料，具体可为包含编码所述ALS突变蛋白的核酸的表达盒、载体、宿主细胞或转基因植物细胞系。

本发明提供所述ALS突变蛋白或编码所述ALS突变蛋白的核酸或含有所述核酸的生物材料的如下任一应用：

(1)在使植物具有ALS抑制剂类除草剂抗性或提高植物对ALS抑制剂类除草剂抗性中的应用；

(2)在制备转基因植物中的应用；

(3)在植物种质资源改良中的应用；

(4)在作为植物遗传转化的筛选标记或构建植物遗传转化筛选载体中的应用。

本发明所述ALS抑制剂类除草剂包括但不限于咪唑啉酮类、嘧啶水杨酸类、磺酰脲类或磺酰胺类除草剂。

本发明所述植物包括但不限于水稻、玉米、小麦、大豆、高梁、花生、芝麻、棉花、亚麻子、茵宿、燕麦、油菜籽、大麦、黑麦、小米、烟草、青稞、拟南芥等。优选地，所述植物为水稻、玉米、小麦、大豆、高梁、花生或小米。

第二方面，本发明提供一种植物转基因筛选表达盒，其以植物内源基因作为筛选标记，所述植物内源基因为ALS突变基因。

优选地，所述ALS突变基因为水稻ALS突变基因。

更优选地，所述水稻ALS突变基因(ALSm3)的的编码蛋白为本发明所述的ALS突变蛋白。

本发明发现，序列如SEQ ID NO.1所示的ALS突变蛋白更适于作为筛选标记，在植物基因转化过程中能够更高效地发挥筛选标记的功能。

所述水稻ALS突变基因(ALSm3)的核苷酸序列可为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

所述植物转基因筛选表达盒还包含用于启动和终止所述ALS突变基因转录的启动子和终止子。

所述启动子可为植物组成型启动子或植物组织特异性启动子。

其中，所述植物组成型启动子可为水稻ALS基因启动子，水稻或玉米的Ubi启动子或Actin启动子；所述植物组织特异性启动子可为Rubisco小亚基启动子或Cab启动子。

优选地，所述启动子为水稻ALS基因启动子。

所述终止子可为在植物中可以终止基因转录的DNA序列，包括水稻ALS基因终止子、Ubi终止子等。

优选地，所述终止子为水稻Ubi终止子。

本发明发现，采用水稻ALS基因启动子和Ubi终止子配合调控水稻ALS突变基因的转录，能够更好地控制ALS突变基因的高效、稳定、适度表达，使得ALS基因突变体更好地发挥筛选标记的功能。

作为本发明的优选方案，所述植物转基因筛选表达盒的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

本发明提供所述ALS突变基因在作为植物遗传转化的筛选标记中的应用。

基于上述植物转基因筛选表达盒，本发明进一步提供一种植物遗传转化筛选载体，该载体含有上述的植物转基因筛选表达盒。

优选地，本发明的植物遗传转化筛选载体为植物双元表达载体，可通过克隆其他表达盒进入该载体进行遗传转化；所述其他表达盒是指除上述的植物转基因筛选表达盒外的表达盒，包括但不限于荧光蛋白表达盒、GUS报告基因表达盒、抗虫表达盒、抗除草剂表达盒等。

更优选地，本发明的植物遗传转化筛选载体还包括一系列多克隆位点如AfeI、AvrII、PmlI、SnaBI、AloI、PmeI等，以便后续克隆目的基因进入。

作为本发明的优选方案，本发明提供的植物遗传转化筛选载体为pCALSm3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

上述植物遗传转化筛选载体可通过以下方法制备得到：

(1)构建植物转基因筛选表达盒：将序列如SEQ ID NO.2所示的ALS突变基因置于该基因自身启动子ALSpro驱动下表达，在其下游以水稻Ubi终止子终止表达，得到序列如SEQ ID NO.3所示的植物转基因筛选表达盒；

(2)将植物转基因筛选表达盒连入植物双元表达载体pC0310，获得植物遗传转化筛选载体。

本发明还提供所述水稻ALS突变蛋白或所述转基因筛选表达盒在作为植物遗传转化筛选标记中的应用。

本发明还提供所述水稻ALS突变蛋白、所述转基因筛选表达盒或所述植物遗传转化筛选载体在植物遗传中的应用。

所述的应用具体为：将植物转基因筛选表达盒或植物遗传转化筛选载体转入植物愈伤组织后，在筛选阶段将愈伤组织接种到添加除草剂的筛选培养基中，进行抗性筛选。

所述除草剂可为嘧啶水杨酸类或咪唑啉酮类除草剂，例如：双草醚、灭草烟或咪唑乙烟酸。

优选地，所述筛选培养基中，含有0.25～1μmol/L双草醚、200～1000μg/L灭草烟或300～1000μg/L咪唑乙烟酸。

所述筛选培养基中，优选含有0.3-0.4μmol/L双草醚，更优选地，含有0.4μmol/L双草醚可获得良好的筛选效率；或优选含有200-500μg/L灭草烟，更优选地，含有250-300μg/L灭草烟可获得良好的筛选效率；或优选含有300-500μg/L咪唑乙烟酸，更优选地，含有400-500μg/L咪唑乙烟酸可获得良好的筛选效率。

进一步地，所述的应用具体为：在植物转基因筛选表达盒或植物遗传转化筛选载体转入植物愈伤组织后的分化阶段，将从筛选培养基中得到的阳性愈伤采用含有除草剂的分化培养基进行分化培养。

所述除草剂可为嘧啶水杨酸类或咪唑啉酮类除草剂，例如：双草醚、灭草烟或咪唑乙烟酸。

优选地，所述分化培养基中，含有0.05-1μmol/L双草醚、25-1000μg/L灭草烟或25-1000μg/L咪唑乙烟酸。

所述分化培养基中，优选含有0.05-0.25μmol/L双草醚，更优选地，含有0.1μmol/L双草醚可获得良好的分化效率；或优选含有30-100μg/L灭草烟，更优选地，含有50μg/L灭草烟可获得良好的分化效率；或优选含有30-100μg/L咪唑乙烟酸，更优选地，含有50μg/L咪唑乙烟酸可获得良好的分化效率，同时有效抑制非转基因愈伤分化成苗。

进一步地，所述的应用具体为：在植物转基因筛选表达盒或植物遗传转化筛选载体转入植物愈伤组织后的生根阶段，将分化培养得到的阳性苗采用含除草剂的生根培养基进行生根培养。

所述除草剂可为嘧啶水杨酸类或咪唑啉酮类除草剂，例如：双草醚、灭草烟或咪唑乙烟酸。

优选地，所述生根培养基中，含有0.05-10μmol/L双草醚、25-1000μg/L灭草烟或25-1000μg/L咪唑乙烟酸。

所述生根培养基中，优选含有0.05-5μmol/L双草醚，更优选地，含有0.1μmol/L双草醚可获得良好的生根效率；或优选含有50-100μg/L灭草烟，更优选地，含有50μg/L灭草烟可获得良好的生根效率；或优选含有50-100μg/L咪唑乙烟酸，更优选地，含有50μg/L咪唑乙烟酸可获得良好的生根效率，同时有效抑制非转基因分化苗生根。

以水稻为例，其他植物转基因方法可参考水稻：

1)诱导：水稻种子去壳消毒后，将成熟胚接种于诱导培养基中，诱导胚性愈伤组织，27℃暗培养30-50天；

2)侵染：将步骤1)所得愈伤组织与胚乳、芽分离，接种于携带所述植物遗传转化筛选载体的农杆菌的悬浮液(将携带所述植物遗传转化筛选载体的农杆菌悬浮于悬浮培养基中)中进行侵染，室温静置30分钟，之后晾干待用；

3)共培养：将晾干的愈伤组织转到共培养基中，22℃暗培养3天，至愈伤组织表面出现菌体；

4)筛选：将共培养后的愈伤组织清洗后接种到添加双草醚、灭草烟或咪唑乙烟酸的筛选培养基中，27℃暗培养30-50天，进行抗性筛选；

5)分化：将获得的抗性愈伤组织接种到添加双草醚、灭草烟或咪唑乙烟酸的分化培养基上，27℃光照培养25-40天至分化出幼苗；

6)生根：将幼苗接种到添加双草醚、灭草烟或咪唑乙烟酸的生根培养基上生根，30℃光照培养10-20天，并进行PCR检测，选择检测为阳性的植株种植；

以上所涉培养基的具体配方如下：

诱导培养基为N6D培养基，其为以N6培养基为基本培养基，所含2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)浓度为3mg/L、水解酪蛋白(CH)浓度为0.3-0.6g/L、脯氨酸(Pro)浓度为0.3-0.5g/L、蔗糖浓度为30g/L、植物凝胶(Phytagel)浓度为3g/L，pH值为5.9的培养基；

悬浮培养基为N6-AA培养基，其为以N6培养基为基本培养基，所含2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)浓度为2mg/L、水解酪蛋白(CH)浓度为0.3-0.6g/L、脯氨酸(Pro)浓度为0.3-0.5g/L、蔗糖浓度为20g/L、葡萄糖浓度为10g/L、乙酰丁香酮(AS)浓度为100-200μM，pH值为5.4的培养基；

共培养基为N6-AS培养基，其为以N6培养基为基本培养基，所含2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)浓度为2mg/L、水解酪蛋白(CH)浓度为0.3-0.6g/L、脯氨酸(Pro)浓度为0.3-0.5g/L、蔗糖浓度为20g/L、葡萄糖浓度为10g/L、乙酰丁香酮(AS)浓度为100-200μM、琼脂粉(Agar)浓度为7g/L，pH值为5.6的培养基；

筛选培养基为N6S培养基，其为以N6培养基为基本培养基，所含2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)浓度为2-3mg/L、水解酪蛋白(CH)浓度为0.6-1g/L、脯氨酸(Pro)浓度为0.5-1.5g/L、蔗糖浓度为30g/L、植物凝胶(Phytagel)浓度为3g/L、头孢(Cn)浓度为500mg/L。筛选培养基中筛选剂双草醚浓度为0.25-1μmol/L，或灭草烟浓度为200-1000μg/L，或咪唑乙烟酸浓度为300-1000μg/L，pH值为5.8的培养基；

分化培养基为MSRe培养基，其为以MS培养基为基本培养基，所含激动素(KT)浓度为1-2mg/L、α-萘乙酸(NAA)浓度为0.5-2mg/L、山梨醇浓度为20-40g/L、蔗糖浓度为30g/L、植物凝胶(Phytagel)浓度为3g/L。分化培养基中筛选剂双草醚浓度为0.05-1μmol/L、或灭草烟浓度为25-1000μg/L或咪唑乙烟酸浓度为25-1000μg/L，pH值为5.9的培养基；

生根培养基为1/2MSR培养基，其为以1/2MS培养基为基本培养基，所含蔗糖浓度为20g/L、多效唑浓度为0.5-1mg/L、植物凝胶(Phytagel)浓度为3g/L。生根培养基中筛选剂双草醚浓度为0.05-10μmol/L、灭草烟浓度为25-1000μg/L或咪唑乙烟酸浓度为25-1000μg/L，pH值为5.8的培养基；

本发明的有益效果至少包括：本发明提供水稻ALS突变蛋白，该突变蛋白可使得植物高抗ALS抑制剂类除草剂。本发明还提供利用水稻ALS突变基因作为筛选标记的植物转基因筛选表达盒、植物遗传转化筛选载体以及相应的基因转化筛选方法。本发明的植物遗传转化筛选载体可作为转基因筛选载体附加其他功能元件使用进行植物基因转化。本发明的筛选标记为植物内源基因，在转基因过程中不引入菌源等外源筛选标记基因，不仅丰富了植物转基因筛选方法，还可有效降低外源基因引起的转基因植物的潜在安全风险以及公众对转基因植物安全性的担忧，有利于转基因植物的商业化应用，市场价值和社会效益均良好。

附图说明

图1为本发明实施例1中pCALSm3载体经XhoI酶切的电泳图；其中，M为Marker，CK为未酶切的pCALSm3重组质粒，1-4为酶切的pCALSm3重组质粒，可切出大小约为1.7kb片段。

图2为本发明实施例2中转化后农杆菌的PCR检测电泳结果；其中，M为Marker，1为阴性对照(水做模板)，2为pCALSm3重组质粒阳性对照，3-12为转pCALSm3重组质粒农杆菌单克隆菌液样品。

图3为本发明实施例1中pC0310载体图谱。

图4为本发明实施例1中pCALSm3载体图谱。

图5为本发明实施例3中普通水稻苗期双草醚临界浓度测试比较图；其中，苗盆左侧为9311，右侧为ZH11，其中，0代表未施用双草醚，10×代表300mg/L，20×为600mg/L。

图6为本发明实施例3中普通水稻苗期灭草烟临界浓度测试图；其中，0.2×代表19.6mg/L，0.5×，1×，2×，5×分别为相应的倍数；苗盆所种苗均为ZH11。

图7为本发明实施例3中普通水稻苗期咪唑乙烟酸临界浓度测试；其中，5×代表375mg/L，20×，50×，100×，300×分别为相应的倍数；苗盆所种苗均为ZH11。

图8为本发明实施例4中水稻愈伤对双草醚抗性临界浓度测试结果；其中，N6为愈伤在不添加筛选压的培养上筛选40d结果，N6+分别为添加0.25、0.5、1及2μmol/L双草醚筛选压。

图9为本发明实施例8中双草醚筛选培养基筛选愈伤组织40d结果。

图10为本发明实施例14、20和28中分化培养基中添加双草醚、灭草烟或咪唑乙烟酸分化愈伤组织30d的结果；其中，1和2为添加双草醚(0.1μmol/L)的分化培养，3和4为添加灭草烟(50μg/L)的分化培养，5和6为添加咪唑乙烟酸(50μg/L)的分化培养；其中，1、3、5为非转基因愈伤进行分化，2、4、6为转基因阳性愈伤进行分化。

图11为本发明实施例37、47和55中生根培养基中添加双草醚、灭草烟或咪唑乙烟酸生根15d的结果；其中，1和2为添加双草醚(0.1μmol/L)的生根培养，3和4为添加灭草烟(50μg/L)的生根培养，5和6分为添加咪唑乙烟酸(50μg/L)的生根培养；其中，1、3、5为非转基因分化苗进行生根，2、4、6为转基因阳性分化苗进行生根。

图12为本发明实施例63中转基因样品植株PCR检测电泳图；其中，M为Marker，1为H₂O、2为ZH11非转基因植株基因组DNA，3为质粒阳性对照，4-23为筛选获得的转基因植株基因组DNA。

图13为本发明实施例64中T0转基因株系除草剂抗性测试结果；其中，a-d：双草醚筛选株系移栽后喷施90mg/m²双草醚结果；a-d分别为喷施前，喷施后7天、14天、21天，图中箭头表示野生型对照ZH11，在喷施14天时已完全死亡；e和f：灭草烟筛选株系移栽后喷施3×(294mg/L)灭草烟，e：喷施前，f：喷施21天后；g-h：咪唑乙烟酸筛选株系后，喷施20×(1500mg/L)咪唑乙烟酸，g：喷施前，h：喷施21天后；其中，ZH11为野生型对照，9311和MH63均为普通栽培稻对照，2-1、2-2、33-2、41和49-1均为转基因株系。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1含有水稻ALS突变蛋白的植物遗传转化筛选载体的构建

1、水稻ALS突变蛋白的获得

本发明对现有的植物ALS除草剂抗性突变位点进行了大量的分析和组合对比，针对水稻ALS蛋白从不同的位点组合中筛选得到相对于水稻野生型ALS蛋白在95位(Gly突变为Ala)、96位(Ala突变为Thr)、171位(Pro突变为Arg)、548位(Trp突变为Leu)、和627位(Ser突变为Ile)具有氨基酸突变的ALS突变蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，该突变蛋白相比于95位、96位、171位、548位、627位各单点突变体以及其它位点组合突变体具有更高的ALS抑制剂抗性，并且解决了各单点突变体抗除草剂类型较为单一的问题，对于咪唑啉酮类、嘧啶水杨酸类、磺酰脲类或磺酰胺类除草剂均具有较高的抗性，能够赋予植物对多种ALS抑制剂类除草剂的高抗性，可提供多种除草剂轮换的有效解决方案。

2、植物转基因筛选表达盒的制备

本发明的植物转基因筛选表达盒OsALSP-ALSm3-OsUbiT(序列如SEQ ID NO.3所示)的构建方法如下：

设计引物0310-AA3U-F/0310-AA3U-Rv1从水稻基因组中扩增启动子OsALSP片段；利用引物0310-AA3U-F2/0310-AA3U-Rv2从合成的水稻ALS突变基因(ALSm3)片段中扩增获得目的基因ALSm3片段；利用引物0310-AA3U-F3/0310-AA3U-Rv从水稻基因组中扩增获得终止子OsUbiT片段。其中，引物0310-AA3U-F和0310-AA3U-Rv的5’端均有15个左右核苷酸序列与载体相应连接位置重复；相邻片段的上下游引物5’端也有15bp重复(0310-AA3U-Rv1与0310-AA3U-F2，0310-AA3U-Rv2与0310-AA3U-F3)，以便后续利用Gibson Assembly重组连接。

上述引物序列如下：

0310-AA3U-F:CGTTTTTAATGTATGCTCCACCATGttggCGTAAAGTCTTCACTCCTCCCCC(SEQID NO.5)

0310-AA3U-Rv1：CGTAGCCATGGTGGGTGGTGGCGG(SEQ ID NO.6)；

0310-AA3U-F2：CACCCACCATGGCTACGACCGCCGC(SEQ ID NO.7)；

0310-AA3U-Rv2：GGCTGAGGACTCTAGATTAATACACAGTCCTGCCATCA(SEQ ID NO.8)；

0310-AA3U-F3：TGTATTAATCTAGAGTCCTCAGCCATAGAGCTG(SEQ ID NO.9)；

0310-AA3U-Rv:TGCCCGGGCCTGCAgGACAAATTTGTTTGTCAGATCAAATTTTTAAGC(SEQ IDNO.10)。

PCR扩增反应体系如下：

PCR扩增程序如下：94℃预变性3min；94℃变性30s，55-65℃退火30s，68℃延伸3min，35个循环；68℃延伸10min，16℃结束。

引物0310-AA3U-F和0310-AA3U-Rv1扩增的PCR产物为OsALSP片段，经1％琼脂糖凝胶电泳回收大小为2180bp产物；引物0310-AA3U-F2和0310-AA3U-Rv2扩增的PCR产物为ALSm3片段，1％琼脂糖凝胶电泳回收大小为1941bp；引物0310-AA3U-F3和0310-AA3U-Rv扩增的PCR产物为OsUbiT片段，1％琼脂糖凝胶电泳回收大小为310bp。

3、植物遗传转化筛选载体的构建

使用Gibson Assembly方法，将上述1中的扩增产物插入到pC0310载体(pC0310为发明人依托pCAMBIA1300载体骨架，经过改造获得，其中主要删除了其潮霉素筛选元件及相邻区域不必要区域，以使得T-Border内部除多克隆位点外不含其它菌源序列。因此，在T-Border中后续连入植物源序列，转入植物时降低公众对转基因担忧，载体图谱见图3)BstXI和PstI双酶切位点间，具体方法如下：

(1)用BstXI+PstI对载体质粒pC0310进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后，利用

Gel Extraction kit(Omega,下同)回收7kb左右大小条带，得到pC0310线性片段。

BstXI+PstI双酶切反应体系如下：

(2)2×Lightening Cloning Kit连接试剂盒

连接OsALSP-ALSm3-OsUbiT表达盒到pC0310载体上，连接体系如下：

连接程序：50℃，30min。

(3)转化：取上述连接产物2μl，加入到大肠杆菌感受态细胞中，轻微混匀，冰浴半小时；用电转仪1.8KV电击转化大肠杆菌感受态细胞；加入LB培养基1ml，37℃、220rpm振荡培养1h，5000rpm离心30s，弃800μl上清，将剩余菌体与培养基混匀，涂布于含卡那霉素的LB平板上。37℃培养16h左右，挑取单菌落，用特异性引物(0310-F2和0310-R2)做菌落PCR验证，挑选阳性菌落，37℃、220rpm摇菌过夜，利用高纯质粒小提试剂盒(中科瑞泰)提取质粒，酶切检测正确后(如图1)，保菌并送测序。命名为pCALSm3，载体图谱见图4，测序得到其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

引物序列：

0310-F2:GGGCCATACTTGTTGGATATCAT(SEQ ID NO.11)；

0310-R2:TTGTTCATGGCGTAATGTCTCC(SEQ ID NO.12)。

实施例2农杆菌转化及鉴定

取-80℃保存的农杆菌EHA105感受态细胞加1μl实施例1中得到的测序正确pCALSm3质粒，1.8KV电击转化。涂布于含有卡那霉素、利福平和链霉素的YEP培养板上，28℃培养48h左右，挑取单菌落摇菌过夜，用特异性引物(0310-F2和0310-R2)进行菌液PCR验证(如图2)，可扩增得到约900bp目的片段，挑选阳性克隆(工程农杆菌)，摇菌36-48h，保存菌液用于侵染。

实施例3普通水稻苗期双草醚、灭草烟及咪唑乙烟酸的临界浓度测试

双草醚是稻田用除草剂，普通水稻对其具有抗性，因此在水稻上喷施药剂规定浓度的除草剂不会对水稻造成伤害，多数喷施安全浓度在30mg/L；灭草烟是一种非选择性灭生性除草剂，普通水稻对其不具抗性，多数推荐喷施浓度为95-98mg/L；咪唑乙烟酸属咪唑啉酮类除草剂，主要用于豆科作物防除禾本科杂草及阔叶杂草，具有选择性强、杀草谱广及活性高等优点，推荐浓度为75mg/L，普通水稻对其抗性较弱。

本实施例分析水稻对双草醚、灭草烟和咪唑乙烟酸抗性的临界浓度，通过实验测试，结果如图5、图6和图7所示。对于双草醚，无论是粳稻中花11(ZH11)还是籼稻9311，在苗期喷施20×(60mg/m²)浓度以上均枯萎死亡，为测试出具更高抗性的转基因株系，选择90mg/m²作为喷施浓度；对于灭草烟，粳稻中花11(ZH11)在苗期喷施0.5×(49mg/L)浓度以上均枯萎死亡，为测试出具更高抗性的转基因株系，选择3×(294mg/L)作为喷施浓度；对于咪唑乙烟酸，粳稻中花11(ZH11)在苗期喷施5×(375mg/L)浓度以上均枯萎死亡，为测试出具更高抗性的转基因株系，选择20×(1500mg/L)作为喷施浓度。

实施例4愈伤时期ZH11双草醚的筛选压力测试

本实施例研究愈伤时期ZH11对双草醚抗性的临界浓度，通过测试，结果如图8所示。对于双草醚，在N6培养基上添加0.25μmol/L以上就使愈伤增殖受到抑制。

实施例5双草醚-pCALSm3遗传转化体系——筛选(1)

以水稻为例，将实施例2得到的工程农杆菌通过农杆菌介导的遗传转化法转化水稻中花11(ZH11)愈伤组织，共培养3d后，清洗5-6遍，转移至含双草醚的抗性筛选培养基(N6+2.4-D 2mg/L+CH 0.6g/L+Pro 0.5g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+Cn 500mg/L+双草醚0.6μmol/L)上，30℃暗培养30-50d，筛选获得抗性愈伤。

实施例6双草醚-pCALSm3遗传转化体系——筛选(2)

以水稻为例，将实施例2得到的工程农杆菌通过农杆菌介导的遗传转化法转化水稻中花11(ZH11)愈伤组织，共培养3d后，清洗5-6遍，转移至含双草醚抗性筛选培养基(N6+2.4-D 2.5mg/L+CH 0.8g/L+Pro 0.8g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+Cn 500mg/L+双草醚0.25μmol/L)上，30℃暗培养30-50d，筛选获得抗性愈伤。

实施例7双草醚-pCALSm3遗传转化体系——筛选(3)

以水稻为例，将实施例2得到的工程农杆菌通过农杆菌介导的遗传转化法转化水稻中花11(ZH11)愈伤组织，共培养3d后，清洗5-6遍，转移至含双草醚抗性筛选培养基(N6+2.4-D 2mg/L+CH 0.6g/L+Pro 0.8g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+Cn 500mg/L+双草醚0.3μmol/L)上，30℃暗培养30-50d。

实施例8双草醚-pCALSm3遗传转化体系——筛选(4)

以水稻为例，将实施例2得到的工程农杆菌通过农杆菌介导的遗传转化法转化水稻中花11(ZH11)愈伤组织，共培养3d后，清洗5-6遍，转移至含双草醚抗性筛选培养基(N6+2.4-D 2mg/L+CH 0.6g/L+Pro 0.5g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+Cn 500mg/L+双草醚0.4μmol/L)上，30℃暗培养30-50d，筛选获得抗性愈伤(如图9)。

实施例9双草醚-pCALSm3遗传转化体系——筛选(5)

以水稻为例，将实施例2得到的工程农杆菌通过农杆菌介导的遗传转化法转化水稻中花11(ZH11)愈伤组织，共培养3d后，清洗5-6遍，转移至含双草醚抗性筛选培养基(N6+2.4-D 2mg/L+CH 0.8g/L+Pro 0.5g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+Cn 500mg/L+双草醚0.5μmol/L)上，30℃暗培养30-50d，筛选获得抗性愈伤。

实施例10双草醚-pCALSm3遗传转化体系——筛选(6)

以水稻为例，将实施例2得到的工程农杆菌通过农杆菌介导的遗传转化法转化水稻中花11(ZH11)愈伤组织，共培养3d后，清洗5-6遍，转移至含双草醚抗性筛选培养基(N6+2.4-D 2.5mg/L+CH 0.6g/L+Pro 0.5g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+Cn 500mg/L+双草醚0.8μmol/L)上，30℃暗培养30-50d，筛选获得抗性愈伤。

实施例11双草醚-pCALSm3遗传转化体系——筛选(7)

以水稻为例，将实施例2得到的工程农杆菌通过农杆菌介导的遗传转化法转化水稻中花11(ZH11)愈伤组织，共培养3d后，清洗5-6遍，转移至含双草醚抗性筛选培养基(N6+2.4-D 2.5mg/L+CH 0.6g/L+Pro 0.5g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+Cn 500mg/L+双草醚1μmol/L)上，30℃暗培养30-50d，筛选获得抗性愈伤。

实施例12pCALSm3遗传转化体系——筛选统计

通过实施例5-11中利用不同浓度的双草醚进行筛选的阳性率比较发现(见表1)，筛选培养基中添加0.3-0.4μmol/L双草醚，均可得到超过40％的阳性愈伤，添加低浓度的筛选压都会使阳性愈伤率降低，高浓度的筛选压也会使阳性愈伤率降低，推测是由于随筛选压浓度升高导致愈伤完全被抑制而无法获得阳性愈伤。因此在筛选培养基中优选添加0.3-0.4μmol/L双草醚，更优选添加0.4μmol/L双草醚可获得良好的筛选效率。

表1不同浓度双草醚的筛选结果统计

实施例13双草醚-pCALSm3遗传转化体系——分化(1)

将获得的抗性愈伤转移至含双草醚抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA 2mg/L+山梨醇30g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+双草醚0.05μmol/L)上，分化25-30d获得阳性苗。

实施例14双草醚-pCALSm3遗传转化体系——分化(2)

将获得的抗性愈伤转移至含双草醚抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA 2mg/L+山梨醇30g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+双草醚0.1μmol/L)上，分化25-30d获得阳性苗(图10)。

实施例15双草醚-pCALSm3遗传转化体系——分化(3)

将获得的抗性愈伤转移至含双草醚抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA 2mg/L+山梨醇30g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+双草醚0.25μmol/L)上，分化25-30d获得阳性苗。

实施例16双草醚-pCALSm3遗传转化体系——分化(4)

将获得的抗性愈伤转移至含双草醚抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA 1mg/L+山梨醇20g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+双草醚0.5μmol/L)上，分化25-30d获得阳性苗。

实施例17双草醚-pCALSm3遗传转化体系——分化(5)

将获得的抗性愈伤转移至含双草醚抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA 1mg/L+山梨醇20g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+双草醚0.8μmol/L)上，分化25-30d获得阳性苗。

实施例18双草醚-pCALSm3遗传转化体系——分化(6)

将获得的抗性愈伤转移至含双草醚抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA 1mg/L+山梨醇20g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+双草醚1μmol/L)上，分化25-30d获得阳性苗。

实施例19灭草烟-pCALSm3遗传转化体系——分化(1)

将获得的抗性愈伤转移至含灭草烟抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA 2mg/L+山梨醇30g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+灭草烟25μg/L)上，分化25-30d获得阳性苗。

实施例20灭草烟-pCALSm3遗传转化体系——分化(2)

将获得的抗性愈伤转移至含灭草烟抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA 2mg/L+山梨醇30g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+灭草烟50μg/L)上，分化25-30d获得阳性苗(图10)。

实施例21灭草烟-pCALSm3遗传转化体系——分化(3)

将获得的抗性愈伤转移至含灭草烟抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA 2mg/L+山梨醇30g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+灭草烟100μg/L)上，分化25-30d获得阳性苗。

实施例22灭草烟-pCALSm3遗传转化体系——分化(4)

将获得的抗性愈伤转移至含灭草烟抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA 1mg/L+山梨醇20g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+灭草烟250μg/L)上，分化25-30d获得阳性苗。

实施例23灭草烟-pCALSm3遗传转化体系——分化(5)

将获得的抗性愈伤转移至含灭草烟抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA 1mg/L+山梨醇20g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+灭草烟375μg/L)上，分化25-30d获得阳性苗。

实施例24灭草烟-pCALSm3遗传转化体系——分化(6)

将获得的抗性愈伤转移至含灭草烟抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA 1mg/L+山梨醇20g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+灭草烟500μg/L)上，分化25-30d获得阳性苗。

实施例25灭草烟-pCALSm3遗传转化体系——分化(7)

将获得的抗性愈伤转移至含灭草烟抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA 0.5mg/L+山梨醇20g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+灭草烟800μg/L)上，分化25-30d获得阳性苗。

实施例26灭草烟-pCALSm3遗传转化体系——分化(8)

将获得的抗性愈伤转移至含灭草烟抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA 0.5mg/L+山梨醇20g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+灭草烟1000μg/L)上，分化25-30d获得阳性苗。

实施例27咪唑乙烟酸-pCALSm3遗传转化体系——分化(1)

将获得的抗性愈伤转移至含咪唑乙烟酸抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA2mg/L+山梨醇30g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+咪唑乙烟酸25μg/L)上，分化25-30d获得阳性苗。

实施例28咪唑乙烟酸-pCALSm3遗传转化体系——分化(2)

将获得的抗性愈伤转移至含咪唑乙烟酸抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA2mg/L+山梨醇30g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+咪唑乙烟酸50μg/L)上，分化25-30d获得阳性苗(图10)。

实施例29咪唑乙烟酸-pCALSm3遗传转化体系——分化(3)

将获得的抗性愈伤转移至含咪唑乙烟酸抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA2mg/L+山梨醇30g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+咪唑乙烟酸100μg/L)上，分化25-30d获得阳性苗。

实施例30咪唑乙烟酸-pCALSm3遗传转化体系——分化(4)

将获得的抗性愈伤转移至含咪唑乙烟酸抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA1mg/L+山梨醇20g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+咪唑乙烟酸250μg/L)上，分化25-30d获得阳性苗。

实施例31咪唑乙烟酸-pCALSm3遗传转化体系——分化(5)

将获得的抗性愈伤转移至含咪唑乙烟酸抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA1mg/L+山梨醇20g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+咪唑乙烟酸375μg/L)上，分化25-30d获得阳性苗。

实施例32咪唑乙烟酸-pCALSm3遗传转化体系——分化(6)

将获得的抗性愈伤转移至含咪唑乙烟酸抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA1mg/L+山梨醇20g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+咪唑乙烟酸500μg/L)上，分化25-30d获得阳性苗。

实施例33咪唑乙烟酸-pCALSm3遗传转化体系——分化(7)

将获得的抗性愈伤转移至含咪唑乙烟酸抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA0.5mg/L+山梨醇20g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+咪唑乙烟酸800μg/L)上，分化25-30d获得阳性苗。

实施例34咪唑乙烟酸-pCALSm3遗传转化体系——分化(8)

将获得的抗性愈伤转移至含咪唑乙烟酸抗性的分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA0.5mg/L+山梨醇20g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+咪唑乙烟酸1000μg/L)上，分化25-30d获得阳性苗。

实施例35pCALSm3遗传转化体系——分化统计

通过实施例13-18、19-26及27-34中添加不同浓度的双草醚、灭草烟及咪唑乙烟酸进行分化培养的出苗率比较发现(见表2、表3及表4)，分化培养基中添加双草醚、灭草烟或咪唑乙烟酸均可抑制ZH11的愈伤分化，而转基因阳性愈伤的有较高的分化率。因此在分化培养基中优选添加0.05-0.25μmol/L双草醚、30-100μg/L灭草烟或30-100μg/L咪唑乙烟酸，更优选添加0.1μmol/L双草醚、50μg/L灭草烟或50μg/L咪唑乙烟酸在抑制非转基因时可获得良好的分化效率。

表2不同浓度双草醚分化结果统计

表3不同浓度灭草烟分化结果统计

表4不同浓度咪唑乙烟酸分化结果统计

表2、3、4中MSRe代表未添加筛选剂的分化培养基，培养基成分见发明内容部分；BS代表双草醚，BS0.05代表添加双草醚0.05μmol/L。

实施例36双草醚-pCALSm3遗传转化体系——生根(1)

经分化获得的阳性苗转移至含双草醚抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑1mg/L+Phytagel 3g/L+双草醚0.05μmol/L)上，最后获得阳性转基因植株。

实施例37双草醚-pCALSm3遗传转化体系——生根(2)

经分化获得的阳性苗转移至含双草醚抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑1mg/L+Phytagel 3g/L+双草醚0.1μmol/L)上，最后获得阳性转基因植株(图11)。

实施例38双草醚-pCALSm3遗传转化体系——生根(3)

经分化获得的阳性苗转移至含双草醚抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑1mg/L+Phytagel 3g/L+双草醚0.2μmol/L)上，最后获得阳性转基因植株。

实施例39双草醚-pCALSm3遗传转化体系——生根(4)

经分化获得的阳性苗转移至含双草醚抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑1mg/L+Phytagel 3g/L+双草醚0.3μmol/L)上，最后获得阳性转基因植株。

实施例40双草醚-pCALSm3遗传转化体系——生根(5)

经分化获得的阳性苗转移至含双草醚抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑1mg/L+Phytagel 3g/L+双草醚0.4μmol/L)上，最后获得阳性转基因植株。

实施例41双草醚-pCALSm3遗传转化体系——生根(6)

经分化获得的阳性苗转移至含双草醚抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑0.5mg/L+Phytagel 3g/L+双草醚0.5μmol/L)上，最后获得阳性转基因植株。

实施例42双草醚-pCALSm3遗传转化体系——生根(7)

经分化获得的阳性苗转移至含双草醚抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑0.5mg/L+Phytagel 3g/L+双草醚1μmol/L)上，最后获得阳性转基因植株。

实施例43双草醚-pCALSm3遗传转化体系——生根(8)

经分化获得的阳性苗转移至含双草醚抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑0.5mg/L+Phytagel 3g/L+双草醚3μmol/L)上，最后获得阳性转基因植株。

实施例44双草醚-pCALSm3遗传转化体系——生根(9)

经分化获得的阳性苗转移至含双草醚抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑0.8mg/L+Phytagel 3g/L+双草醚5μmol/L)上，最后获得阳性转基因植株。

实施例45双草醚-pCALSm3遗传转化体系——生根(10)

经分化获得的阳性苗转移至含双草醚抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑0.8mg/L+Phytagel 3g/L+双草醚10μmol/L)上，最后获得阳性转基因植株。

实施例46灭草烟-pCALSm3遗传转化体系-生根(1)

经分化获得的阳性苗转移至含灭草烟抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑1mg/L+Phytagel 3g/L+灭草烟25μg/L)上，最后获得阳性转基因植株。

实施例47灭草烟-pCALSm3遗传转化体系-生根(2)

经分化获得的阳性苗转移至含灭草烟抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑1mg/L+Phytagel 3g/L+灭草烟50μg/L)上，最后获得阳性转基因植株(图11)。

实施例48灭草烟-pCALSm3遗传转化体系-生根(3)

经分化获得的阳性苗转移至含灭草烟抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑1mg/L+Phytagel 3g/L+灭草烟100μg/L)上，最后获得阳性转基因植株。

实施例49灭草烟-pCALSm3遗传转化体系-生根(4)

经分化获得的阳性苗转移至含灭草烟抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑0.5mg/L+Phytagel 3g/L+灭草烟250μg/L)上，最后获得阳性转基因植株。

实施例50灭草烟-pCALSm3遗传转化体系-生根(5)

经分化获得的阳性苗转移至含灭草烟抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑0.5mg/L+Phytagel 3g/L+灭草烟375μg/L)上，最后获得阳性转基因植株。

实施例51灭草烟-pCALSm3遗传转化体系-生根(6)

经分化获得的阳性苗转移至含灭草烟抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑0.5mg/L+Phytagel 3g/L+灭草烟500μg/L)上，最后获得阳性转基因植株。

实施例52灭草烟-pCALSm3遗传转化体系-生根(7)

经分化获得的阳性苗转移至含灭草烟抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑0.8mg/L+Phytagel 3g/L+灭草烟625μg/L)上，最后获得阳性转基因植株。

实施例53灭草烟-pCALSm3遗传转化体系-生根(8)

经分化获得的阳性苗转移至含灭草烟抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑0.8mg/L+Phytagel 3g/L+灭草烟1000μg/L)上，最后获得阳性转基因植株。

实施例54咪唑乙烟酸-pCALSm3遗传转化体系-生根(1)

经分化获得的阳性苗转移至含咪唑乙烟酸抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑1mg/L+Phytagel 3g/L+咪唑乙烟酸25μg/L)上，最后获得阳性转基因植株。

实施例55咪唑乙烟酸-pCALSm3遗传转化体系-生根(2)

经分化获得的阳性苗转移至含咪唑乙烟酸抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑1mg/L+Phytagel 3g/L+咪唑乙烟酸50μg/L)上，最后获得阳性转基因植株(图11)。

实施例56咪唑乙烟酸-pCALSm3遗传转化体系-生根(3)

经分化获得的阳性苗转移至含咪唑乙烟酸抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑1mg/L+Phytagel 3g/L+咪唑乙烟酸100μg/L)上，最后获得阳性转基因植株。

实施例57咪唑乙烟酸-pCALSm3遗传转化体系-生根(4)

经分化获得的阳性苗转移至含咪唑乙烟酸抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑0.5mg/L+Phytagel 3g/L+咪唑乙烟酸250μg/L)上，最后获得阳性转基因植株。

实施例58咪唑乙烟酸-pCALSm3遗传转化体系-生根(5)

经分化获得的阳性苗转移至含咪唑乙烟酸抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑0.5mg/L+Phytagel 3g/L+咪唑乙烟酸375μg/L)上，最后获得阳性转基因植株。

实施例59咪唑乙烟酸-pCALSm3遗传转化体系-生根(6)

经分化获得的阳性苗转移至含咪唑乙烟酸抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑0.5mg/L+Phytagel 3g/L+咪唑乙烟酸500μg/L)上，最后获得阳性转基因植株。

实施例60咪唑乙烟酸-pCALSm3遗传转化体系-生根(7)

经分化获得的阳性苗转移至含咪唑乙烟酸抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑0.8mg/L+Phytagel 3g/L+咪唑乙烟酸625μg/L)上，最后获得阳性转基因植株。

实施例61咪唑乙烟酸-pCALSm3遗传转化体系-生根(8)

经分化获得的阳性苗转移至含咪唑乙烟酸抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑08mg/L+Phytagel 3g/L+咪唑乙烟酸1000μg/L)上，最后获得阳性转基因植株。

实施例62pCALSm3遗传转化体系——生根统计

通过实施例36-45、46-53及54-61中添加不同浓度的双草醚、灭草烟及咪唑乙烟酸进行生根培养的生根存活率比较发现(见表5、表6及表7)，生根培养基中添加0.05-10μmol/L双草醚或25-1000μg/L灭草烟或25-1000μg/L咪唑乙烟酸，均可抑制ZH11的分化苗存活，而大部分转基因阳性分化苗存活率还分别达到80％以上。根据分析结果，在生根培养基中优选添加0.05-5μmol/L双草醚、50-100μg/L灭草烟或50-100μg/L咪唑乙烟酸，更优选添加0.1μmol/L双草醚、50μg/L灭草烟或50μg/L咪唑乙烟酸可获得良好的生根存活效率。

表5不同浓度双草醚生根结果统计

表6不同浓度灭草烟生根结果统计

表7不同浓度咪唑乙烟酸生根结果统计

实施例63转基因株系鉴定

为了鉴定获得的株系是否为转基因株系，本实施例对经筛选培养、分化培养和生根培养获得的部分阳性转基因植株进行PCR验证。

首先提取样品DNA，DNA提取步骤如下：取约2cm长的水稻叶片置于2ml离心管中；在研钵中加入800μl1.5×CTAB，研磨叶片至匀浆并倒回离心管内；65℃水浴20-30min，每5min颠倒混匀1次；12000rpm离心10min；吸取400μl上清液至新的离心管，加入2倍体积经冰预冷的无水乙醇，-20℃冰置20min；12000rpm离心10min；弃上清，加入500μl 75％乙醇，颠倒漂洗，8000rpm离心5min；弃上清，置于超净台吹干或自然晾干，加100μl ddH₂O溶解DNA。

为了区分水稻内源基因，设计一对引物(0310-F4/0310-R4)对转基因株系基因组DNA样品进行PCR扩增检测，该引物对以内源水稻基因组为模板无法扩增获得片段，以转基因表达盒为模板扩增获得片段大小约为670bp。

引物序列如下：

0310-F4:CATTGAGAACCTCCCTGTG(SEQ ID NO.13)；

0310-R4:GACAAATTTGTTTGTCAGATCAA(SEQ ID NO.14)。

以转化用质粒DNA作为阳性对照，ZH11基因组DNA作为阴性对照。

PCR反应程序如下：94℃预变性5min，94℃变性45s，55-65℃退火45s；72℃延伸1.5min；30-35个循环；72℃再延伸10min；16℃结束。

PCR反应体系如下：

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，结果如图12所示。电泳结果表明，大部分转基因样品中含有约670bp的转基因条带，与载体对照大小相同；而阴性对照ZH11无法扩出条带。

实施例64抗性表型鉴定

选取部分生根材料在移栽7-14天后(3-5叶期左右)，喷施90mg/m²双草醚(图13的a，b)。喷施后3-7天，野生型出现叶片枯黄。7天后，野生型对照ZH11已枯黄致死，转基因株系多数植株生长正常，部分出现黄化。14天后，野生型对照ZH11及转基因敏感株系已完全死亡，存活株系为双草醚抗性株系(图13的c，d)。

选取部分生根材料在移栽7-14天后(3-5叶期左右)，喷施294mg/L灭草烟(图13的e)，21天后，野生型对照ZH11、9311或MH63出现不同程度的枯黄、枯萎或死亡，但转基因阳性株系生长正常，存活株系为灭草烟抗性株系(图13的f)。

选取部分生根材料在移栽7-14天后(3-5叶期左右)，喷施1500mg/L咪唑乙烟酸(图13的g)，21天后，野生型对照ZH11、9311或MH63出现不同程度的枯黄、枯萎或死亡，但转基因阳性株系生长正常，存活株系为咪唑乙烟酸抗性株系(图13的h)。

上述结果表明，通过筛选获得的转基因株系高抗双草醚，同时也高抗灭草烟、咪唑乙烟酸。上述三种除草剂仅为所属除草剂类别的代表，获得的转基因株系不仅具备这三种除草剂的高抗性，还具备其他磺酰脲类、咪唑啉酮类、嘧啶水杨酸类除草剂如苄嘧磺隆、氯磺隆、嘧硫草醚、嘧草醚、灭草喹等的高抗性。

上述结果表明，本申请已成功建立基于双草醚/灭草烟/咪唑乙烟酸-ALSm3筛选标记的遗传转化全时期筛选系统，可用于水稻遗传转化。

本发明获得的pCALSm3作为植物双元表达载体，可以通过克隆其他表达盒进入该载体，进行遗传转化，获得相应的性状。如：将荧光蛋白表达盒、GUS报告基因表达盒、抗虫表达盒、抗除草剂表达盒、其他功能基因等。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 海南波莲水稻基因科技有限公司

<120> 水稻ALS突变基因、含有该基因的植物转基因筛选载体pCALSm3及其应用

<130> KHP201110921.7

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 644

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Thr Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Ser Ala Ala Ala

1 5 10 15

Thr Ala Lys Thr Gly Arg Lys Asn His Gln Arg His His Val Leu Pro

20 25 30

Ala Arg Gly Arg Val Gly Ala Ala Ala Val Arg Cys Ser Ala Val Ser

35 40 45

Pro Val Thr Pro Pro Ser Pro Ala Pro Pro Ala Thr Pro Leu Arg Pro

50 55 60

Trp Gly Pro Ala Glu Pro Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ala

65 70 75 80

Leu Glu Arg Cys Gly Val Ser Asp Val Phe Ala Tyr Pro Gly Ala Thr

85 90 95

Ser Met Glu Ile His Gln Ala Leu Thr Arg Ser Pro Val Ile Thr Asn

100 105 110

His Leu Phe Arg His Glu Gln Gly Glu Ala Phe Ala Ala Ser Gly Tyr

115 120 125

Ala Arg Ala Ser Gly Arg Val Gly Val Cys Val Ala Thr Ser Gly Pro

130 135 140

Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Ala Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser

145 150 155 160

Val Pro Met Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Arg Arg Arg Met Ile Gly

165 170 175

Thr Asp Ala Phe Gln Glu Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile

180 185 190

Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Leu Asp Val Glu Asp Ile Pro Arg Val

195 200 205

Ile Gln Glu Ala Phe Phe Leu Ala Ser Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val

210 215 220

Leu Val Asp Ile Pro Lys Asp Ile Gln Gln Gln Met Ala Val Pro Val

225 230 235 240

Trp Asp Thr Ser Met Asn Leu Pro Gly Tyr Ile Ala Arg Leu Pro Lys

245 250 255

Pro Pro Ala Thr Glu Leu Leu Glu Gln Val Leu Arg Leu Val Gly Glu

260 265 270

Ser Arg Arg Pro Ile Leu Tyr Val Gly Gly Gly Cys Ser Ala Ser Gly

275 280 285

Asp Glu Leu Arg Trp Phe Val Glu Leu Thr Gly Ile Pro Val Thr Thr

290 295 300

Thr Leu Met Gly Leu Gly Asn Phe Pro Ser Asp Asp Pro Leu Ser Leu

305 310 315 320

Arg Met Leu Gly Met His Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Asp

325 330 335

Lys Ala Asp Leu Leu Leu Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val

340 345 350

Thr Gly Lys Ile Glu Ala Phe Ala Ser Arg Ala Lys Ile Val His Ile

355 360 365

Asp Ile Asp Pro Ala Glu Ile Gly Lys Asn Lys Gln Pro His Val Ser

370 375 380

Ile Cys Ala Asp Val Lys Leu Ala Leu Gln Gly Leu Asn Ala Leu Leu

385 390 395 400

Gln Gln Ser Thr Thr Lys Thr Ser Ser Asp Phe Ser Ala Trp His Asn

405 410 415

Glu Leu Asp Gln Gln Lys Arg Glu Phe Pro Leu Gly Tyr Lys Thr Phe

420 425 430

Gly Glu Glu Ile Pro Pro Gln Tyr Ala Ile Gln Val Leu Asp Glu Leu

435 440 445

Thr Lys Gly Glu Ala Ile Ile Ala Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met

450 455 460

Trp Ala Ala Gln Tyr Tyr Thr Tyr Lys Arg Pro Arg Gln Trp Leu Ser

465 470 475 480

Ser Ala Gly Leu Gly Ala Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ala Gly

485 490 495

Ala Ser Val Ala Asn Pro Gly Val Thr Val Val Asp Ile Asp Gly Asp

500 505 510

Gly Ser Phe Leu Met Asn Ile Gln Glu Leu Ala Leu Ile Arg Ile Glu

515 520 525

Asn Leu Pro Val Lys Val Met Val Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met

530 535 540

Val Val Gln Leu Glu Asp Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr

545 550 555 560

Tyr Leu Gly Asn Pro Glu Cys Glu Ser Glu Ile Tyr Pro Asp Phe Val

565 570 575

Thr Ile Ala Lys Gly Phe Asn Ile Pro Ala Val Arg Val Thr Lys Lys

580 585 590

Ser Glu Val Arg Ala Ala Ile Lys Lys Met Leu Glu Thr Pro Gly Pro

595 600 605

Tyr Leu Leu Asp Ile Ile Val Pro His Gln Glu His Val Leu Pro Met

610 615 620

Ile Pro Ile Gly Gly Ala Phe Lys Asp Met Ile Leu Asp Gly Asp Gly

625 630 635 640

Arg Thr Val Tyr

<210> 2

<211> 1935

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggctacga ccgccgcggc cgcggccgcc gccctgtccg ccgccgcgac ggccaagacc 60

ggccgtaaga accaccagcg acaccacgtc cttcccgctc gaggccgggt gggggcggcg 120

gcggtcaggt gctcggcggt gtccccggtc accccgccgt ccccggcgcc gccggccacg 180

ccgctccggc cgtgggggcc ggccgagccc cgcaagggcg cggacatcct cgtggaggcg 240

ctggagcggt gcggcgtcag cgacgtgttc gcctacccgg gcgccacgtc catggagatc 300

caccaggcgc tgacgcgctc cccggtcatc accaaccacc tcttccgcca cgagcagggc 360

gaggcgttcg cggcgtccgg gtacgcgcgc gcgtccggcc gcgtcggggt ctgcgtcgcc 420

acctccggcc ccggggcaac caacctcgtg tccgcgctcg ccgacgcgct gctcgactcc 480

gtcccgatgg tcgccatcac gggccaggtc cgccgccgca tgatcggcac cgacgccttc 540

caggagacgc ccatagtcga ggtcacccgc tccatcacca agcacaatta ccttgtcctt 600

gatgtggagg acatcccccg cgtcatacag gaagccttct tcctcgcgtc ctcgggccgt 660

cctggcccgg tgctggtcga catccccaag gacatccagc agcagatggc cgtgccggtc 720

tgggacacct cgatgaatct accagggtac atcgcacgcc tgcccaagcc acccgcgaca 780

gaattgcttg agcaggtctt gcgtctggtt ggcgagtcac ggcgcccgat tctctatgtc 840

ggtggtggct gctctgcatc tggtgacgaa ttgcgctggt ttgttgagct gactggtatc 900

ccagttacaa ccactctgat gggcctcggc aatttcccca gtgacgaccc gttgtccctg 960

cgcatgcttg ggatgcatgg cacggtgtac gcaaattatg ccgtggataa ggctgacctg 1020

ttgcttgcgt ttggtgtgcg gtttgatgat cgtgtgacag ggaaaattga ggcttttgca 1080

agcagggcca agattgtgca cattgacatt gatccagcag agattggaaa gaacaagcaa 1140

ccacatgtgt caatttgcgc agatgttaag cttgctttac agggcttgaa tgctctgcta 1200

caacagagca caacaaagac aagttctgat tttagtgcat ggcacaatga gttggaccag 1260

cagaagaggg agtttcctct ggggtacaaa acttttggtg aagagatccc accgcaatat 1320

gccattcagg tgctggatga gctgacgaaa ggtgaggcaa tcatcgctac tggtgttggg 1380

cagcaccaga tgtgggcggc acaatattac acctacaagc ggccacggca gtggctgtct 1440

tcggctggtc tgggcgcaat gggatttggg ctgcctgctg cagctggtgc ttctgtggct 1500

aacccaggtg tcacagttgt tgatattgat ggggatggta gcttcctcat gaacattcag 1560

gagctggcat tgatccgcat tgagaacctc cctgtgaagg tgatggtgtt gaacaaccaa 1620

catttgggta tggtggtgca attggaggat aggttttaca aggcgaatag ggcgcataca 1680

tacttgggca acccggaatg tgagagcgag atatatccag attttgtgac tattgctaag 1740

gggttcaata ttcctgcagt ccgtgtaaca aagaagagtg aagtccgtgc cgccatcaag 1800

aagatgctcg agactccagg gccatacttg ttggatatca tcgtcccgca ccaggagcat 1860

gtgctgccta tgatcccaat tgggggcgca ttcaaggaca tgatcctgga tggtgatggc 1920

aggactgtgt attaa 1935

<210> 3

<211> 4431

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgtaaagtct tcactcctcc ccctttctct ctagttagcg gagacatgac aaccagtcat 60

ccgattaggt ttatagtggc attgcaagca gtcagcaaat gaataaatga aagaggcaat 120

cttcatggtc ctcttcatct tgtctcacat gcgagttgat tttagaccaa cacggtaact 180

caggggataa aatagatttg ttacaaattt ccaataagta agattccatg aaattggtga 240

tagtatataa tgattttatt gcacaagcta tgcattgcag ctactgattc aacactattc 300

agaaaaaaaa agaacaagtg tatttctggt aaaactgttc cattcaaaat ctagtccacg 360

actagtccat gatttggtcg tgtgaaaaca atggatgcac tatatagtct ctagtactat 420

tctattgtac taagcactat atatagtatt ataaactacg gtttatggag tagccagcaa 480

gacaataagt taacaagaaa taaatttaaa gtactaaaca caataagcca attagcatgg 540

tgaaatgatg atttgctatg actaatctac gactaattgt gcgacttgct atttggtcga 600

gtcgtagccc tctagtcgtc tgacttgact gacgttatga ctagtctacg acttgataac 660

agcgatccag atgtcttaag tgatgaggag aagaaagaac taccagaaag taaaccttat 720

atgcatagtt acatacacag gtacacttcc gaaggcccca atcaatggaa taccatatgc 780

tcttattagg ctattatatg gttctgggta acaattaaat atatcatggg tgtaccgcca 840

atgtgaaatt gagaactgca tacacatagc cacattataa aatataaatg cactatgctc 900

ctgatcatgg aatgccaacc ccttattatc aaacccaaag aagggaaatc cctttctatc 960

tcaagcatgc acaattacct ttgtttagca taaatctatc aaatattgca atgcaaacct 1020

taagcacaga tgtcctccct cttaaatatt aatcataatc ctcagtaaat ggacatacag 1080

cataaagtac tttaaattac cataggttga attggaaata ttctttttag tagctcacag 1140

aaaaatgggt actaaaacta actattagta aacataaaag ccccttaatg ataggagggc 1200

tctacacaag acagtcagta gcatgataac cacctacaat gttgttccta caaataaaaa 1260

tactgtagca atctcttact aagttaaaac atactgaggt tctagggttt aaccataagt 1320

aattagaata tcaaaatagc tcaagattag agaaggtcct acagaaaaac acggttatct 1380

gcttctcaaa tggcctagct acaccgggca ctagcaggat cttaaacagc actaaaataa 1440

gtatctccct tggtcatcaa atcgaaaaga aaatcctaca gagtccacgc ctttccttcc 1500

ccccactaat taacgaaaag aaacgcagag ttccaattaa ggagaaagag atacggggta 1560

caacaaacat cgcattcgtc tcgtgctagg gttttcggga ggcgggtcta gggttgaggc 1620

aaaaaggggg agggaattga gcagggggtt accgcggtag tcgacgccgg agttgagctt 1680

gacgacgacg gggcgccccc tgatggactt gaggaagtcg gagggcgtct tcaccgcccc 1740

gccgccgccg ccaccgccgc cgccgcccga gccggacttc tcgccgccac tgctcatctt 1800

gcgctgcgtt tgtgcgggtg cgggtgcggg tgctagactg ctaggtctcg cggttgcatc 1860

cgcatccgac tttgagatcg attttttatc gggttctgta ccctccaccc gttattggga 1920

ctgacccacc tgtcatcctc atccaatcga ctgacacgcg ggcccagatc gaccccgacg 1980

tggctgtgtg tcatcctatc ccaccgacat atggggccca ctgtgacgtg gccccacacg 2040

atcccatccg agccacacat cgcctcacgc tgcgtcaccg cgcgcggaca aaacacccac 2100

acccccacac tctccacccc tctctccctc tcgcccaaac ccagaaaccc tcgccgccgc 2160

cgccgccgcc accacccacc atggctacga ccgccgcggc cgcggccgcc gccctgtccg 2220

ccgccgcgac ggccaagacc ggccgtaaga accaccagcg acaccacgtc cttcccgctc 2280

gaggccgggt gggggcggcg gcggtcaggt gctcggcggt gtccccggtc accccgccgt 2340

ccccggcgcc gccggccacg ccgctccggc cgtgggggcc ggccgagccc cgcaagggcg 2400

cggacatcct cgtggaggcg ctggagcggt gcggcgtcag cgacgtgttc gcctacccgg 2460

gcgccacgtc catggagatc caccaggcgc tgacgcgctc cccggtcatc accaaccacc 2520

tcttccgcca cgagcagggc gaggcgttcg cggcgtccgg gtacgcgcgc gcgtccggcc 2580

gcgtcggggt ctgcgtcgcc acctccggcc ccggggcaac caacctcgtg tccgcgctcg 2640

ccgacgcgct gctcgactcc gtcccgatgg tcgccatcac gggccaggtc cgccgccgca 2700

tgatcggcac cgacgccttc caggagacgc ccatagtcga ggtcacccgc tccatcacca 2760

agcacaatta ccttgtcctt gatgtggagg acatcccccg cgtcatacag gaagccttct 2820

tcctcgcgtc ctcgggccgt cctggcccgg tgctggtcga catccccaag gacatccagc 2880

agcagatggc cgtgccggtc tgggacacct cgatgaatct accagggtac atcgcacgcc 2940

tgcccaagcc acccgcgaca gaattgcttg agcaggtctt gcgtctggtt ggcgagtcac 3000

ggcgcccgat tctctatgtc ggtggtggct gctctgcatc tggtgacgaa ttgcgctggt 3060

ttgttgagct gactggtatc ccagttacaa ccactctgat gggcctcggc aatttcccca 3120

gtgacgaccc gttgtccctg cgcatgcttg ggatgcatgg cacggtgtac gcaaattatg 3180

ccgtggataa ggctgacctg ttgcttgcgt ttggtgtgcg gtttgatgat cgtgtgacag 3240

ggaaaattga ggcttttgca agcagggcca agattgtgca cattgacatt gatccagcag 3300

agattggaaa gaacaagcaa ccacatgtgt caatttgcgc agatgttaag cttgctttac 3360

agggcttgaa tgctctgcta caacagagca caacaaagac aagttctgat tttagtgcat 3420

ggcacaatga gttggaccag cagaagaggg agtttcctct ggggtacaaa acttttggtg 3480

aagagatccc accgcaatat gccattcagg tgctggatga gctgacgaaa ggtgaggcaa 3540

tcatcgctac tggtgttggg cagcaccaga tgtgggcggc acaatattac acctacaagc 3600

ggccacggca gtggctgtct tcggctggtc tgggcgcaat gggatttggg ctgcctgctg 3660

cagctggtgc ttctgtggct aacccaggtg tcacagttgt tgatattgat ggggatggta 3720

gcttcctcat gaacattcag gagctggcat tgatccgcat tgagaacctc cctgtgaagg 3780

tgatggtgtt gaacaaccaa catttgggta tggtggtgca attggaggat aggttttaca 3840

aggcgaatag ggcgcataca tacttgggca acccggaatg tgagagcgag atatatccag 3900

attttgtgac tattgctaag gggttcaata ttcctgcagt ccgtgtaaca aagaagagtg 3960

aagtccgtgc cgccatcaag aagatgctcg agactccagg gccatacttg ttggatatca 4020

tcgtcccgca ccaggagcat gtgctgccta tgatcccaat tgggggcgca ttcaaggaca 4080

tgatcctgga tggtgatggc aggactgtgt attaatctag agtcctcagc catagagctg 4140

ctgctgttct agggttcaca agtctgccta tttgtcttcc ccaatggagc tatggttgtc 4200

tggtctggtc cttggtcgtg tcccgtttca ttgtgtacta tttacctgta atgtgtatcc 4260

ttaagtctgg tttgatggtg tctgaaacgt tttgctgtgg tagagcagca tggaagaact 4320

ataatgaata agtgatccct aatcattgtg tccaaatttt gcttctgcta tacccttttg 4380

tgctgtttct tatgttttgc ttaaaaattt gatctgacaa acaaatttgt c 4431

<210> 4

<211> 10933

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctgcaggccc gggcagcgct gaagaacttc cctaggcacg tgtacgtatt ttttaccagg 60

tgaactccaa gtcctggacc cttttttaag cttagattgt cgtttcccgc cttcagttta 120

aactatcagt gtttgacagg atatattggc gggtaaacct aagagaaaag agcgtttatt 180

agaataacgg atatttaaaa gggcgtgaaa aggtttatcc gttcgtccat ttgtatgtgc 240

atgccaacca cagggttccc ctcgggatca aagtactttg atccaacccc tccgctgcta 300

tagtgcagtc ggcttctgac gttcagtgca gccgtcttct gaaaacgaca tgtcgcacaa 360

gtcctaagtt acgcgacagg ctgccgccct gcccttttcc tggcgttttc ttgtcgcgtg 420

ttttagtcgc ataaagtaga atacttgcga ctagaaccgg agacattacg ccatgaacaa 480

gagcgccgcc gctggcctgc tgggctatgc ccgcgtcagc accgacgacc aggacttgac 540

caaccaacgg gccgaactgc acgcggccgg ctgcaccaag ctgttttccg agaagatcac 600

cggcaccagg cgcgaccgcc cggagctggc caggatgctt gaccacctac gccctggcga 660

cgttgtgaca gtgaccaggc tagaccgcct ggcccgcagc acccgcgacc tactggacat 720

tgccgagcgc atccaggagg ccggcgcggg cctgcgtagc ctggcagagc cgtgggccga 780

caccaccacg ccggccggcc gcatggtgtt gaccgtgttc gccggcattg ccgagttcga 840

gcgttcccta atcatcgacc gcacccggag cgggcgcgag gccgccaagg cccgaggcgt 900

gaagtttggc ccccgcccta ccctcacccc ggcacagatc gcgcacgccc gcgagctgat 960

cgaccaggaa ggccgcaccg tgaaagaggc ggctgcactg cttggcgtgc atcgctcgac 1020

cctgtaccgc gcacttgagc gcagcgagga agtgacgccc accgaggcca ggcggcgcgg 1080

tgccttccgt gaggacgcat tgaccgaggc cgacgccctg gcggccgccg agaatgaacg 1140

ccaagaggaa caagcatgaa accgcaccag gacggccagg acgaaccgtt tttcattacc 1200

gaagagatcg aggcggagat gatcgcggcc gggtacgtgt tcgagccgcc cgcgcacgtc 1260

tcaaccgtgc ggctgcatga aatcctggcc ggtttgtctg atgccaagct ggcggcctgg 1320

ccggccagct tggccgctga agaaaccgag cgccgccgtc taaaaaggtg atgtgtattt 1380

gagtaaaaca gcttgcgtca tgcggtcgct gcgtatatga tgcgatgagt aaataaacaa 1440

atacgcaagg ggaacgcatg aaggttatcg ctgtacttaa ccagaaaggc gggtcaggca 1500

agacgaccat cgcaacccat ctagcccgcg ccctgcaact cgccggggcc gatgttctgt 1560

tagtcgattc cgatccccag ggcagtgccc gcgattgggc ggccgtgcgg gaagatcaac 1620

cgctaaccgt tgtcggcatc gaccgcccga cgattgaccg cgacgtgaag gccatcggcc 1680

ggcgcgactt cgtagtgatc gacggagcgc cccaggcggc ggacttggct gtgtccgcga 1740

tcaaggcagc cgacttcgtg ctgattccgg tgcagccaag cccttacgac atatgggcca 1800

ccgccgacct ggtggagctg gttaagcagc gcattgaggt cacggatgga aggctacaag 1860

cggcctttgt cgtgtcgcgg gcgatcaaag gcacgcgcat cggcggtgag gttgccgagg 1920

cgctggccgg gtacgagctg cccattcttg agtcccgtat cacgcagcgc gtgagctacc 1980

caggcactgc cgccgccggc acaaccgttc ttgaatcaga acccgagggc gacgctgccc 2040

gcgaggtcca ggcgctggcc gctgaaatta aatcaaaact catttgagtt aatgaggtaa 2100

agagaaaatg agcaaaagca caaacacgct aagtgccggc cgtccgagcg cacgcagcag 2160

caaggctgca acgttggcca gcctggcaga cacgccagcc atgaagcggg tcaactttca 2220

gttgccggcg gaggatcaca ccaagctgaa gatgtacgcg gtacgccaag gcaagaccat 2280

taccgagctg ctatctgaat acatcgcgca gctaccagag taaatgagca aatgaataaa 2340

tgagtagatg aattttagcg gctaaaggag gcggcatgga aaatcaagaa caaccaggca 2400

ccgacgccgt ggaatgcccc atgtgtggag gaacgggcgg ttggccaggc gtaagcggct 2460

gggttgtctg ccggccctgc aatggcactg gaacccccaa gcccgaggaa tcggcgtgac 2520

ggtcgcaaac catccggccc ggtacaaatc ggcgcggcgc tgggtgatga cctggtggag 2580

aagttgaagg ccgcgcaggc cgcccagcgg caacgcatcg aggcagaagc acgccccggt 2640

gaatcgtggc aagcggccgc tgatcgaatc cgcaaagaat cccggcaacc gccggcagcc 2700

ggtgcgccgt cgattaggaa gccgcccaag ggcgacgagc aaccagattt tttcgttccg 2760

atgctctatg acgtgggcac ccgcgatagt cgcagcatca tggacgtggc cgttttccgt 2820

ctgtcgaagc gtgaccgacg agctggcgag gtgatccgct acgagcttcc agacgggcac 2880

gtagaggttt ccgcagggcc ggccggcatg gccagtgtgt gggattacga cctggtactg 2940

atggcggttt cccatctaac cgaatccatg aaccgatacc gggaagggaa gggagacaag 3000

cccggccgcg tgttccgtcc acacgttgcg gacgtactca agttctgccg gcgagccgat 3060

ggcggaaagc agaaagacga cctggtagaa acctgcattc ggttaaacac cacgcacgtt 3120

gccatgcagc gtacgaagaa ggccaagaac ggccgcctgg tgacggtatc cgagggtgaa 3180

gccttgatta gccgctacaa gatcgtaaag agcgaaaccg ggcggccgga gtacatcgag 3240

atcgagctag ctgattggat gtaccgcgag atcacagaag gcaagaaccc ggacgtgctg 3300

acggttcacc ccgattactt tttgatcgat cccggcatcg gccgttttct ctaccgcctg 3360

gcacgccgcg ccgcaggcaa ggcagaagcc agatggttgt tcaagacgat ctacgaacgc 3420

agtggcagcg ccggagagtt caagaagttc tgtttcaccg tgcgcaagct gatcgggtca 3480

aatgacctgc cggagtacga tttgaaggag gaggcggggc aggctggccc gatcctagtc 3540

atgcgctacc gcaacctgat cgagggcgaa gcatccgccg gttcctaatg tacggagcag 3600

atgctagggc aaattgccct agcaggggaa aaaggtcgaa aaggtctctt tcctgtggat 3660

agcacgtaca ttgggaaccc aaagccgtac attgggaacc ggaacccgta cattgggaac 3720

ccaaagccgt acattgggaa ccggtcacac atgtaagtga ctgatataaa agagaaaaaa 3780

ggcgattttt ccgcctaaaa ctctttaaaa cttattaaaa ctcttaaaac ccgcctggcc 3840

tgtgcataac tgtctggcca gcgcacagcc gaagagctgc aaaaagcgcc tacccttcgg 3900

tcgctgcgct ccctacgccc cgccgcttcg cgtcggccta tcgcggccgc tggccgctca 3960

aaaatggctg gcctacggcc aggcaatcta ccagggcgcg gacaagccgc gccgtcgcca 4020

ctcgaccgcc ggcgcccaca tcaaggcacc ctgcctcgcg cgtttcggtg atgacggtga 4080

aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg 4140

gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg gcgcagccat 4200

gacccagtca cgtagcgata gcggagtgta tactggctta actatgcggc atcagagcag 4260

attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa 4320

taccgcatca ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg 4380

ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg 4440

gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag 4500

gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga 4560

cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct 4620

ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc 4680

tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg 4740

gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc 4800

tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca 4860

ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag 4920

ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct 4980

ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc 5040

accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 5100

tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca 5160

cgttaaggga ttttggtcat gcattctagg tactaaaaca attcatccag taaaatataa 5220

tattttattt tctcccaatc aggcttgatc cccagtaagt caaaaaatag ctcgacatac 5280

tgttcttccc cgatatcctc cctgatcgac cggacgcaga aggcaatgtc ataccacttg 5340

tccgccctgc cgcttctccc aagatcaata aagccactta ctttgccatc tttcacaaag 5400

atgttgctgt ctcccaggtc gccgtgggaa aagacaagtt cctcttcggg cttttccgtc 5460

tttaaaaaat catacagctc gcgcggatct ttaaatggag tgtcttcttc ccagttttcg 5520

caatccacat cggccagatc gttattcagt aagtaatcca attcggctaa gcggctgtct 5580

aagctattcg tatagggaca atccgatatg tcgatggagt gaaagagcct gatgcactcc 5640

gcatacagct cgataatctt ttcagggctt tgttcatctt catactcttc cgagcaaagg 5700

acgccatcgg cctcactcat gagcagattg ctccagccat catgccgttc aaagtgcagg 5760

acctttggaa caggcagctt tccttccagc catagcatca tgtccttttc ccgttccaca 5820

tcataggtgg tccctttata ccggctgtcc gtcattttta aatataggtt ttcattttct 5880

cccaccagct tatatacctt agcaggagac attccttccg tatcttttac gcagcggtat 5940

ttttcgatca gttttttcaa ttccggtgat attctcattt tagccattta ttatttcctt 6000

cctcttttct acagtattta aagatacccc aagaagctaa ttataacaag acgaactcca 6060

attcactgtt ccttgcattc taaaacctta aataccagaa aacagctttt tcaaagttgt 6120

tttcaaagtt ggcgtataac atagtatcga cggagccgat tttgaaaccg cggtgatcac 6180

aggcagcaac gctctgtcat cgttacaatc aacatgctac cctccgcgag atcatccgtg 6240

tttcaaaccc ggcagcttag ttgccgttct tccgaatagc atcggtaaca tgagcaaagt 6300

ctgccgcctt acaacggctc tcccgctgac gccgtcccgg actgatgggc tgcctgtatc 6360

gagtggtgat tttgtgccga gctgccggtc ggggagctgt tggctggctg gtggcaggat 6420

atattgtggt gtaaacaaat tgacgcttag acaacttaat aacacattgc ggacgttttt 6480

aatgtatgct ccaccatgtt ggcgtaaagt cttcactcct ccccctttct ctctagttag 6540

cggagacatg acaaccagtc atccgattag gtttatagtg gcattgcaag cagtcagcaa 6600

atgaataaat gaaagaggca atcttcatgg tcctcttcat cttgtctcac atgcgagttg 6660

attttagacc aacacggtaa ctcaggggat aaaatagatt tgttacaaat ttccaataag 6720

taagattcca tgaaattggt gatagtatat aatgatttta ttgcacaagc tatgcattgc 6780

agctactgat tcaacactat tcagaaaaaa aaagaacaag tgtatttctg gtaaaactgt 6840

tccattcaaa atctagtcca cgactagtcc atgatttggt cgtgtgaaaa caatggatgc 6900

actatatagt ctctagtact attctattgt actaagcact atatatagta ttataaacta 6960

cggtttatgg agtagccagc aagacaataa gttaacaaga aataaattta aagtactaaa 7020

cacaataagc caattagcat ggtgaaatga tgatttgcta tgactaatct acgactaatt 7080

gtgcgacttg ctatttggtc gagtcgtagc cctctagtcg tctgacttga ctgacgttat 7140

gactagtcta cgacttgata acagcgatcc agatgtctta agtgatgagg agaagaaaga 7200

actaccagaa agtaaacctt atatgcatag ttacatacac aggtacactt ccgaaggccc 7260

caatcaatgg aataccatat gctcttatta ggctattata tggttctggg taacaattaa 7320

atatatcatg ggtgtaccgc caatgtgaaa ttgagaactg catacacata gccacattat 7380

aaaatataaa tgcactatgc tcctgatcat ggaatgccaa ccccttatta tcaaacccaa 7440

agaagggaaa tccctttcta tctcaagcat gcacaattac ctttgtttag cataaatcta 7500

tcaaatattg caatgcaaac cttaagcaca gatgtcctcc ctcttaaata ttaatcataa 7560

tcctcagtaa atggacatac agcataaagt actttaaatt accataggtt gaattggaaa 7620

tattcttttt agtagctcac agaaaaatgg gtactaaaac taactattag taaacataaa 7680

agccccttaa tgataggagg gctctacaca agacagtcag tagcatgata accacctaca 7740

atgttgttcc tacaaataaa aatactgtag caatctctta ctaagttaaa acatactgag 7800

gttctagggt ttaaccataa gtaattagaa tatcaaaata gctcaagatt agagaaggtc 7860

ctacagaaaa acacggttat ctgcttctca aatggcctag ctacaccggg cactagcagg 7920

atcttaaaca gcactaaaat aagtatctcc cttggtcatc aaatcgaaaa gaaaatccta 7980

cagagtccac gcctttcctt ccccccacta attaacgaaa agaaacgcag agttccaatt 8040

aaggagaaag agatacgggg tacaacaaac atcgcattcg tctcgtgcta gggttttcgg 8100

gaggcgggtc tagggttgag gcaaaaaggg ggagggaatt gagcaggggg ttaccgcggt 8160

agtcgacgcc ggagttgagc ttgacgacga cggggcgccc cctgatggac ttgaggaagt 8220

cggagggcgt cttcaccgcc ccgccgccgc cgccaccgcc gccgccgccc gagccggact 8280

tctcgccgcc actgctcatc ttgcgctgcg tttgtgcggg tgcgggtgcg ggtgctagac 8340

tgctaggtct cgcggttgca tccgcatccg actttgagat cgatttttta tcgggttctg 8400

taccctccac ccgttattgg gactgaccca cctgtcatcc tcatccaatc gactgacacg 8460

cgggcccaga tcgaccccga cgtggctgtg tgtcatccta tcccaccgac atatggggcc 8520

cactgtgacg tggccccaca cgatcccatc cgagccacac atcgcctcac gctgcgtcac 8580

cgcgcgcgga caaaacaccc acacccccac actctccacc cctctctccc tctcgcccaa 8640

acccagaaac cctcgccgcc gccgccgccg ccaccaccca ccatggctac gaccgccgcg 8700

gccgcggccg ccgccctgtc cgccgccgcg acggccaaga ccggccgtaa gaaccaccag 8760

cgacaccacg tccttcccgc tcgaggccgg gtgggggcgg cggcggtcag gtgctcggcg 8820

gtgtccccgg tcaccccgcc gtccccggcg ccgccggcca cgccgctccg gccgtggggg 8880

ccggccgagc cccgcaaggg cgcggacatc ctcgtggagg cgctggagcg gtgcggcgtc 8940

agcgacgtgt tcgcctaccc gggcgccacg tccatggaga tccaccaggc gctgacgcgc 9000

tccccggtca tcaccaacca cctcttccgc cacgagcagg gcgaggcgtt cgcggcgtcc 9060

gggtacgcgc gcgcgtccgg ccgcgtcggg gtctgcgtcg ccacctccgg ccccggggca 9120

accaacctcg tgtccgcgct cgccgacgcg ctgctcgact ccgtcccgat ggtcgccatc 9180

acgggccagg tccgccgccg catgatcggc accgacgcct tccaggagac gcccatagtc 9240

gaggtcaccc gctccatcac caagcacaat taccttgtcc ttgatgtgga ggacatcccc 9300

cgcgtcatac aggaagcctt cttcctcgcg tcctcgggcc gtcctggccc ggtgctggtc 9360

gacatcccca aggacatcca gcagcagatg gccgtgccgg tctgggacac ctcgatgaat 9420

ctaccagggt acatcgcacg cctgcccaag ccacccgcga cagaattgct tgagcaggtc 9480

ttgcgtctgg ttggcgagtc acggcgcccg attctctatg tcggtggtgg ctgctctgca 9540

tctggtgacg aattgcgctg gtttgttgag ctgactggta tcccagttac aaccactctg 9600

atgggcctcg gcaatttccc cagtgacgac ccgttgtccc tgcgcatgct tgggatgcat 9660

ggcacggtgt acgcaaatta tgccgtggat aaggctgacc tgttgcttgc gtttggtgtg 9720

cggtttgatg atcgtgtgac agggaaaatt gaggcttttg caagcagggc caagattgtg 9780

cacattgaca ttgatccagc agagattgga aagaacaagc aaccacatgt gtcaatttgc 9840

gcagatgtta agcttgcttt acagggcttg aatgctctgc tacaacagag cacaacaaag 9900

acaagttctg attttagtgc atggcacaat gagttggacc agcagaagag ggagtttcct 9960

ctggggtaca aaacttttgg tgaagagatc ccaccgcaat atgccattca ggtgctggat 10020

gagctgacga aaggtgaggc aatcatcgct actggtgttg ggcagcacca gatgtgggcg 10080

gcacaatatt acacctacaa gcggccacgg cagtggctgt cttcggctgg tctgggcgca 10140

atgggatttg ggctgcctgc tgcagctggt gcttctgtgg ctaacccagg tgtcacagtt 10200

gttgatattg atggggatgg tagcttcctc atgaacattc aggagctggc attgatccgc 10260

attgagaacc tccctgtgaa ggtgatggtg ttgaacaacc aacatttggg tatggtggtg 10320

caattggagg ataggtttta caaggcgaat agggcgcata catacttggg caacccggaa 10380

tgtgagagcg agatatatcc agattttgtg actattgcta aggggttcaa tattcctgca 10440

gtccgtgtaa caaagaagag tgaagtccgt gccgccatca agaagatgct cgagactcca 10500

gggccatact tgttggatat catcgtcccg caccaggagc atgtgctgcc tatgatccca 10560

attgggggcg cattcaagga catgatcctg gatggtgatg gcaggactgt gtattaatct 10620

agagtcctca gccatagagc tgctgctgtt ctagggttca caagtctgcc tatttgtctt 10680

ccccaatgga gctatggttg tctggtctgg tccttggtcg tgtcccgttt cattgtgtac 10740

tatttacctg taatgtgtat ccttaagtct ggtttgatgg tgtctgaaac gttttgctgt 10800

ggtagagcag catggaagaa ctataatgaa taagtgatcc ctaatcattg tgtccaaatt 10860

ttgcttctgc tatacccttt tgtgctgttt cttatgtttt gcttaaaaat ttgatctgac 10920

aaacaaattt gtc 10933

<210> 5

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgtttttaat gtatgctcca ccatgttggc gtaaagtctt cactcctccc cc 52

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgtagccatg gtgggtggtg gcgg 24

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cacccaccat ggctacgacc gccgc 25

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggctgaggac tctagattaa tacacagtcc tgccatca 38

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgtattaatc tagagtcctc agccatagag ctg 33

<210> 10

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tgcccgggcc tgcaggacaa atttgtttgt cagatcaaat ttttaagc 48

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gggccatact tgttggatat cat 23

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttgttcatgg cgtaatgtct cc 22

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cattgagaac ctccctgtg 19

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gacaaatttg tttgtcagat caa 23

Claims (10)

1.水稻ALS突变蛋白，其特征在于，所述ALS突变蛋白相对于野生型ALS蛋白在95、96、171、548和627位具有氨基酸突变。

2.根据权利要求1所述的ALS突变蛋白，其特征在于，所述ALS突变蛋白相对于野生型ALS蛋白在95位由Gly突变为Ala，在96位由Ala突变为Thr，在171位由Pro突变为Arg，在548位由Trp突变为Leu，在627位由Ser突变为Ile；

优选地，所述ALS突变蛋白具有如下(1)或(2)的氨基酸序列：

(1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(2)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、插入或缺失得到的能够使植物具有ALS抑制剂类除草剂抗性的ALS突变蛋白的氨基酸序列。

3.一种核酸，其特征在于，其编码权利要求1或2所述的ALS突变蛋白。

4.一种生物材料，其特征在于，其为包含权利要求3所述核酸的表达盒、载体、宿主细胞或转基因植物细胞系。

5.权利要求1或2所述的ALS突变蛋白或权利要求3所述的核酸或权利要求4所述的生物材料的如下任一应用：

(1)在使植物具有ALS抑制剂类除草剂抗性或提高植物对ALS抑制剂类除草剂抗性中的应用；

(2)在制备转基因植物中的应用；

(3)在植物种质资源改良中的应用；

(4)在作为植物遗传转化的筛选标记或构建植物遗传转化筛选载体中的应用。

6.一种植物转基因筛选表达盒，其特征在于，以植物内源基因作为筛选标记，所述植物内源基因为ALS突变基因；

优选地，所述ALS突变基因为水稻ALS突变基因；

更优选地，所述水稻ALS突变基因的编码蛋白为权利要求1或2所述的ALS突变蛋白。

7.根据权利要求6所述的植物转基因筛选表达盒，其特征在于，所述表达盒还包含用于启动和终止所述ALS突变基因转录的启动子和终止子；

所述启动子为水稻ALS基因启动子，水稻或玉米的Ubi启动子、Actin启动子、Rubisco小亚基启动子或Cab启动子；

所述终止子为水稻ALS基因终止子或Ubi终止子；

优选地，所述启动子为水稻ALS基因启动子；所述终止子为水稻Ubi终止子；

更优选地，所述表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

8.一种植物遗传转化筛选载体，其特征在于，含有权利要求6或7所述的植物转基因筛选表达盒；

优选地，所述植物遗传转化筛选载体为植物双元表达载体，可通过克隆其他表达盒进入该载体进行遗传转化；

所述其他表达盒为除权利要求6或7所述的植物转基因筛选表达盒之外的表达盒；

更优选地，所述植物遗传转化筛选载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

9.权利要求6或7所述的植物转基因筛选表达盒或权利要求8所述的植物遗传转化筛选载体在植物遗传转化中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用包括：将所述植物转基因筛选表达盒或所述植物遗传转化筛选载体转入植物愈伤组织后，在筛选阶段采用含有除草剂的筛选培养基进行抗性筛选；

优选地，所述筛选培养基中，含有0.25～1μmol/L双草醚、200～1000μg/L灭草烟或300～1000μg/L咪唑乙烟酸；

和/或，所述应用包括：在植物转基因筛选表达盒或植物遗传转化筛选载体转入植物愈伤组织后的分化阶段，采用含有除草剂的分化培养基进行分化培养；

优选地，所述分化培养基中，含有0.05～1μmol/L双草醚、25～1000μg/L灭草烟或25～1000μg/L咪唑乙烟酸；

和/或，

所述应用包括：在植物转基因筛选表达盒或植物遗传转化筛选载体转入植物愈伤组织后的生根阶段，采用含有除草剂的生根培养基进行生根培养；

优选地，所述生根培养基中，含有0.05～10μmol/L双草醚、25～1000μg/L灭草烟或25～1000μg/L咪唑乙烟酸。

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