ES2886551T3 - Plantas resistentes a Phytophthora pertenecientes a la familia Solanaceae - Google Patents

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Abstract

Planta perteneciente a la familia Solanaceae en donde dicha planta comprende un rasgo genético que proporciona resistencia a Phytophthora y en donde dicho rasgo genético que proporciona resistencia a Phytophthora está codificado por una combinación de al menos dos genes que tienen una expresión o transcripción reducida de dichos dos genes en comparación con dicha planta perteneciente a la familia Solanaceae que es susceptible a Phytophthora en donde: dicha planta es pimiento dulce (Capsicum annuum) o Capsicum spp., dicha resistencia a Phytophthora es la resistencia a Phytophthora capsici y dicha combinación de al menos dos genes son genes que codifican proteínas de acuerdo con las SEQ ID No. 16 y SEQ ID No. 17, o proteínas que tienen al menos 90 % de identidad de secuencia con las SEQ ID Nos. 16 y 17.

Description

DESCRIPCIÓN
Plantas resistentes a Phytophthora pertenecientes a la familia Solanaceae
La presente invención se refiere a plantas de pimiento dulce o Capsicum spp. resistentes a Phytophthora pertenecientes a la familia Solanaceae en donde dicha resistencia está codificada por una combinación de dos genes separados.
El patógeno vegetal Phytophthora (clase: Oomycetes, orden: Peronosporales, familia: Pythiaceae) es un género de Oomycetes (mohos acuáticos) que dañan las plantas, capaces de causar grandes pérdidas económicas en los cultivos en todo el mundo, así como daños ambientales en los ecosistemas naturales. Los patógenos de Phytophthora son en su mayoría patógenos de dicotiledóneas y generalmente son parásitos específicos del huésped. El género fue descrito por primera vez por Heinrich Anton de Bary en 1875. Se han descrito aproximadamente 100 especies entre las que se encuentran patógenos vegetales de importancia económica como Phytophthora capsici, Phytophthora infestans y Phytophthora nicotinae.
Phytophthora infestans fue el agente infeccioso del tizón de la papa que causó la Gran Hambruna Irlandesa (1845­ 1849), y sigue siendo el patógeno más destructivo de los cultivos de solanáceas, incluidos el tomate y la papa. El agente de pudrición del tallo y la raíz de la soja, Phytophthora sojae, también ha causado problemas en la industria agrícola desde hace mucho tiempo. En general, las enfermedades de las plantas causadas por este género son difíciles de controlar químicamente, por lo que el crecimiento de cultivares resistentes es la principal estrategia de manejo. Otras enfermedades importantes por Phytophthora son:
Phytophthora cactorum - causa la pudrición de la raíz del rododendro que afecta a los rododendros, azaleas y causa chancro sangrante en árboles de madera dura; Phytophthora capsici - infecta frutas de cucurbitáceas, tales como pepinos y calabazas, Phytophthora cinnamomi - causa pudrición de la raíz de canela que afecta a plantas ornamentales leñosas que incluyen arborvitae y azalea, Phytophthora fragariae - causa pudrición de raíz roja que afecta a las fresas; Phytophthora kernoviae - patógeno de hayas y rododendros, que también se encuentra en otros árboles y arbustos que incluyen el roble y la encina, Phytophthora megakarya - una de las especies de la enfermedad de la mazorca negra del cacao, es invasiva y probablemente responsable de la mayor pérdida de cosechas de cacao en África; Phytophthora palmivora - causa pudrición de la fruta en cocos y nueces de betel, Phytophthora ramorum, Phytophthora quercina - causa la muerte del roble y Phytophthora sojae - causa la pudrición de la raíz de la soja.
Phytophthora se conoce a veces como un organismo similar a los hongos, pero se clasifica en un reino diferente: Chromalveolata (antes Stramenopila y antes Chromista). Phytophthora es morfológicamente muy similar a los hongos verdaderos, pero su historia evolutiva es bastante distinta. A diferencia de los hongos, las chromalveolatas están más relacionadas con las plantas que con los animales. Mientras que las paredes celulares de los hongos están compuestas principalmente de quitina, las paredes celulares de la chromalveolata están compuestas principalmente de celulosa. Los niveles de ploidía son diferentes entre estos dos grupos; Phytophthora tiene cromosomas diploides (emparejados) en la etapa vegetativa (en crecimiento, no reproductivo) de la vida. Los hongos casi siempre son haploides en este estado. Las vías bioquímicas también difieren, especialmente las altamente conservadas.
Phytophthoras puede reproducirse sexualmente o asexualmente. En muchas especies, las estructuras sexuales nunca se han observado o solo se han observado en apareamientos de laboratorio. En especies homotálicas, las estructuras sexuales aparecen en un solo cultivo. Las especies heterotálicas tienen cepas de apareamiento, designadas como A1 y A2. Cuando se aparean, los anteridios introducen gametos en el oogonio, ya sea por el paso del oogonio a través del anteridio (anfiginio) o por el anteridio que se une a la mitad proximal (inferior) del oogonio (paragineo), y la unión produce oosporas. Como los animales, pero no como la mayoría de los hongos “verdaderos”, la meiosis es gamética y los núcleos somáticos son diploides. Los tipos de esporas asexuales (mitóticas) son clamidosporas y esporangios que producen zoosporas. Las clamidosporas suelen ser esféricas y pigmentadas, y pueden tener una pared celular engrosada para ayudar en su función como estructura de supervivencia. Los esporangios pueden ser retenidos por las hifas subtendientes (no caducas) o pueden desprenderse fácilmente por la tensión del viento o del agua (caducas) que actúan como estructuras de dispersión. Además, los esporangios pueden liberar zoosporas, que tienen dos flagelos diferentes que usan para nadar hacia una planta huésped.
Las Solanaceae o solanáceas, son una familia económicamente importante de plantas con flores. La familia abarca desde hierbas hasta árboles e incluye varios cultivos agrícolas importantes, plantas medicinales, especias, malezas y ornamentales. Muchos miembros de la familia contienen alcaloides potentes y algunos son muy tóxicos.
La familia Solanaceae pertenece al orden Solanales, en el grupo de las astéridas de las dicotiledóneas (Magnoliopsida). La familia Solanaceae está formada por aproximadamente 98 géneros y unas 2700 especies, con una gran diversidad de hábitats, morfología y ecología.
La familia tiene una distribución mundial con presencia en todos los continentes excepto en la Antártida. La mayor diversidad de especies se encuentra en América del Sur y América Central. Las Solanaceae incluyen una serie de especies comúnmente recolectadas o cultivadas. Quizás el género económicamente más importante de la familia es Solanum, que comprende la papa (Solanum tuberosum, de hecho, otro nombre común de la familia es la "familia de la papa"), del tomate (Solanum lycopersicum) y la berenjena o planta de la berenjena (Solanum melongena). Otro género importante es Capsicum que comprende pimientos y pimientos dulces o morrones (Capsicum annuum). El género Physalis produce las llamadas cerezas molidas, así como el tomatillo (Physalis philadelphica), la uchuva y el farolillo chino. El género Lycium contiene los licios y el yaoyín Lycium barbarum. Nicotiana contiene, entre otras especies, la planta del tabaco. Algunos otros miembros importantes de Solanaceae incluyen varias plantas ornamentales como Petunia, Browallia y Lycianthes, la fuente de alcaloides psicoactivos, Datura, Mandragora (mandrágora) y Atropa belladona (belladona mortal). Algunas especies se conocen universalmente por sus usos medicinales, sus efectos psicotrópicos o por ser venenosas.
Con la excepción del tabaco (Nicotianoideae) y la petunia (Petunioideae), la mayoría de los géneros económicamente importantes están incluidos en la subfamilia Solanoideae. Finalmente, pero no menos importante, las solanáceas incluyen muchos organismos modelo que son importantes en la investigación de cuestiones biológicas fundamentales a nivel celular, molecular y genético, como el tabaco, la petunia y N. benthaminia.
El documento WO 2008/092505 describe plantas que son resistentes a un patógeno de origen viral, bacteriano, fúngico u oomiceto, en donde las plantas tienen un nivel reducido, una actividad reducida o una ausencia completa de proteína DMR6 en comparación con las plantas que no son resistentes al patógeno, en particular organismos de los hongos o el filo Oomycota.
Tieme Zeilmaker: "Functional and applied aspects of the DOWNY MILDEW RESISTANT 1 and 6 genes in Arabidopsis (tesis doctoral)", 6 de febrero de 2012 (2012-02-06), Universiteit Utrecht describe varios homólogos de DMR6 que tienen funciones parcialmente redundantes pero distintas en la supresión de la inmunidad en Arabidopsis.
Al considerar la importancia económica de muchas plantas miembros de la familia Solanaceae y el efecto destructivo del patógeno vegetal Phytophthora en muchos miembros de esta familia, es un objetivo, entre otros objetivos, de la presente invención proporcionar plantas resistentes a Phytophthora y especialmente pimiento dulce (Capsicum annuum) o Capsicum spp.
El objetivo anterior, entre otros objetivos, cumple con la presente invención al proporcionar plantas como se indica en las reivindicaciones adjuntas.
Se describen plantas pertenecientes a la familia Solanaceae en donde las presentes plantas comprenden un rasgo genético que proporciona resistencia a Phytophthora y en donde el presente rasgo de resistencia está codificado por una combinación de al menos dos genes que tienen una expresión reducida, o una transcripción reducida, o una actividad reducida de las proteínas codificadas por los presentes genes en comparación con la misma planta perteneciente a la familia Solanaceae que es susceptible a Phytophthora.
Se describen plantas pertenecientes a la familia Solanaceae seleccionadas del grupo que consiste en patata, petunia, tomate, berenjena, tabaco y pimiento dulce.
De acuerdo con la presente invención, las presentes plantas son pimiento dulce (Capsicum annuum) o Capsicum spp, la resistencia a Phytophthora es la resistencia a Phytophthora capsici y la combinación de al menos dos genes son genes que codifican proteínas de acuerdo con SEQ ID No. 16 y SEQ ID No. 17 o proteínas que tienen al menos 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID No. 16 y/o SEQ ID No. 17, preferiblemente al menos 95 % de identidad de secuencia, más preferiblemente al menos 99 % de identidad de secuencia.
Se describen plantas pertenecientes a la familia Solanaceae en donde las plantas comprenden un rasgo genético que proporciona resistencia a Phytophthora, en donde el presente rasgo de resistencia se obtiene mediante la regulación negativa de la actividad de la combinación de dos genes o la reducción de la actividad de las proteínas codificadas por los genes en una planta susceptible a Phytophthora, en donde los dos genes que codifican las combinaciones de SEQ ID Nos. 1 y 2 o SEQ ID Nos. 3 y 4 o SEQ ID Nos. 5 y 6 o proteínas que tienen al menos 80 %, 85 % o 90 % de identidad de secuencia con las mismas tal como 91 %, 92 %, 93 % y 94 % de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 95 % de identidad de secuencia, tal como 96 %, 97 %, 98 % y 99 % de identidad de secuencia.
Dadas las propiedades ventajosas de los presentes genes para proporcionar plantas resistentes a Phytophthora, se describe el uso de una combinación de dos genes, en donde dicha combinación de dos genes que codifica combinaciones de proteínas son SEQ ID Nos. 16 y 17 o proteínas que tienen al menos 90 % de identidad de secuencia para proporcionar resistencia a Phytophthora en plantas de pimiento dulce (Capsicum annuum) o Capsicum spp.
El uso descrito comprende una expresión reducida, o transcripción reducida, de los genes presentes o una actividad reducida de proteínas codificadas por los genes presentes en comparación con plantas de pimiento dulce (Capsicum annuum) o Capsicum spp que son susceptibles a Phytophthora.
Se describen proteínas y genes adecuados para proporcionar resistencia a Phytophthora a plantas en donde las proteínas se seleccionan del grupo que consiste en SEQ ID Nos. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 16, 17, 18 y 19 y proteínas que tienen al menos 90 % de identidad de secuencia con la misma, preferiblemente al menos 95 %, más preferiblemente al menos 99 %.
La invención se ilustrará con más detalle en los ejemplos siguientes.
Ejemplos
Ejemplo 1 (papa)
Construcciones de ARNi dirigidas a las SEQ ID Nos. 7 y 8 de papa
Se realizaron 3 construcciones de ARNi diferentes, que albergan/dirigidas a:
1. Extremo 5' de la SEQ ID No. 7: equivalente a la secuencia codificante -159-200 (-159 desde el comienzo significa en 5'utr).
2. Quimera del extremo 5' de SEQ ID Nos. 7 y 8: equivalente a la secuencia codificante 4-199 1-204.
3. Parte intermedia de la SEQ ID No. 7 (altamente homóloga a la parte intermedia de la SEQ ID No. 8): equivalente a la secuencia codificante 334-743.
Los fragmentos se amplificaron a partir de ADN genómico y se clonaron en el vector pENTR-D-TOPO. Para la construcción quimérica, se acoplaron 2 fragmentos mediante el uso de cebadores con proyecciones complementarias, y la posterior extensión y amplificación para crear el fragmento fusionado. Los fragmentos se transfirieron mediante el uso de una reacción Gateway LR al vector de ARNi pK7GWiWG2 (Karimi y otros, 2002, Trends Plant Sci 7), lo que crea una repetición invertida con estructura de horquilla. Debido a que el vector pK7GWiWG2 requiere estreptomicina para la selección bacteriana, y la cepa de Agrobacterium usada para la transformación de la papa (LBA4404) ya lleva un marcador de selección de estreptomicina, el casete completo de ARNi (horquilla) se transfirió a un vector de transformación vegetal diferente, pGreen0029 (marcador de selección tanto bacteriano como de plantas = Kanamicina) (Hellens y otros, 2000, Plant Mol Biol 42). Las construcciones finales permiten la expresión estable de un ARN en horquilla dirigido por el promotor 35S que forma un ARNbc que induce el silenciamiento, después de que el intrón que forma el bucle en horquilla se separa. Se mantuvieron al menos seis transformantes T1 independientes para cada construcción.
Detalles del ensayo de Phytophthora infestans
Se tomaron hojas desprendidas de plantas T1 (transgénicos de primera generación) y se colocaron en una bandeja con 100 % de HR con pecíolos en algodón húmedo u Oasis. Se recolectaron zoosporas/esporangios de Phytophthora infestans (P.inf) de cultivos de P.inf (placas de centeno-sacarosa-agar), y se colocó una gota de 10 pl de suspensión de esporas que contenía 10e3 de esporangios (10e5/ml) a cada lado de la vena media. Las bandejas se incubaron a 18 °C. Las tasas de infección de las hojas se puntuaron el día 11, como 1. Completamente infectado/sobrecrecimiento, 2. Parcialmente infectado (10-50 % del área) y 3. Limpio (<10 % del área).
Como se muestra en las Figuras 1 y 2, las plantas con silenciamiento doble (SEQ ID Nos. 7 y 8) de la Figura 2a muestran que solo el 50 % está infectado, las plantas con silenciamiento doble (quiméricas) de la Figura 2b muestran que solo el 60 % está infectado, mientras que el grupo de control de la Figura 1 muestra que todas las plantas estaban infectadas. Como se muestra en la Figura 3, del 40 al 50 % de las plantas con SEQ ID No. 7 y SEQ ID No. 8 silenciadas están limpias, mientras que de las plantas que solo tienen SEQ ID No. 7 silenciada solo el 10 % de las plantas se puntúan como parcialmente infectadas. Por consiguiente, el silenciamiento de ambas SEQ ID Nos.
7 y 8 proporciona resistencia a Phytophthora infestans.
Ejemplo 2 (petunia)
Las líneas de inserción de transposones se identificaron a partir de una colección/biblioteca (Vandenbussche y otros, 2008, Plant Journal 54). Se encontraron 2 alelos de inserción de transposones dTph1 en SEQ ID No. 9 y 3 alelos de inserción de transposones dTph1 en SEQ ID No. 10. Se hicieron varios cruces para generar dobles mutantes.
Detalles del ensayo de Phytophthora nicotianae
Las plantas se cultivaron en tierra para macetas estándar, en macetas individualmente, a 23 °C.
Se recolectaron esporas de P. nicotianae de cultivos (placas de frijol-lima-agar o agar V8), y se gotearon 2 ml de suspensión de esporas que contenía esporas 10e4 (ensayo Sept) sobre el suelo con cada planta. El colapso de la planta se monitoreó regularmente.
Como se muestra en la Figura 4, los dobles mutantes, es decir, las plantas que tienen mutaciones en SEQ ID No. 9 y SEQ ID No. 10 tienen un porcentaje de plantas vivas del 45 %, mientras que el porcentaje de plantas vivas de simples mutantes (mutante en SEQ iD No. 9 o SEQ ID No. 10) es solo el 20 %.
Ejemplo 3 (tomate)
Las plantas de tomate se transformaron con dos construcciones, ya sea para proporcionar la sobreexpresión de ambas SEQ ID Nos. 11 y 12, o para proporcionar el silenciamiento de ambas SEQ ID Nos. 11 y 12. Las construcciones de silenciamiento de SEQ iD No. 11 en tomate se generaron mediante el uso de la clonación Gateway de un fragmento de 300 pb idéntico a la parte intermedia del CDS de la SEQ ID No. 11.
Secuencia:
TT GGGT GAAC AAGGAC AAC AT AT GGCT AT C AATT ATT AT CCTCCTT GT CC AC A A CC AG AACTT ACTT AT GGGCTT CCGGCCC A T ACT GAT CC AAATT C ACTT AC AA TT CTT CTT CAA GACTT GCAAGTT GCGGGT CTT CAAGTT CTTAAAGAT GGCAAAT GGTT AGCT GTAAAAC CT C AACCT GACGCCTTT GT C ATT AA T CTT GGGGAT C AATT GC AG GC AGT AAGT AACGG T AAGT AC AGAAGT GT AT GGC AT C GAGCT ATT GT GAATT C AG AT C AAGC T AGGAT GT C A GT GGCTT CGTTT
Mediante el uso de los cebadores:
S. Lycopersicum AttB1-F aaaaagcaggcttcttgggtgaacaaggacaaca
S. Lycopersicum AttB2-R agaaagctgggtaaaacgaagccactgacatcc
El vector de ENTRADA generado se clonó por Gateway en el vector binario pHellsgate12. Después, la transformación de Agrobacterium de acuerdo con el procedimiento estándar para tomate. Las construcciones de silenciamiento fueron capaces de silenciar ambas SEQ ID Nos. 11 y 12, debido a similitudes en las secuencias. La descendencia de las plantas de tomate transformadas se sometió a una prueba de enfermedad mediante la inoculación del aislado US11 de Phytophthora infestans. 7 días después de la inoculación, las plantas se analizaron visualmente mediante la asignación de puntuación a las hojas en una escala visual de 1 a 9, en donde 1 significa susceptible y 9 significa resistente. Como un control de susceptibles se usaron las plantas TS33, TS19 y OT9. Como control de resistentes se usa la accesión silvestre LA1269 resistente conocida. Se midieron 8 hojas por planta. La siguiente tabla proporciona la puntuación promedio de las 8 hojas por planta
Figure imgf000006_0001
En la tabla se muestra que las plantas que sobreexpresan las SEQ ID Nos. 11 y 12 son susceptibles al aislado US11. La planta silenciada proporciona puntuaciones significativamente más altas que el control susceptible OT9. Por ejemplo, la planta 556-01-08 tiene una puntuación promedio de 8,5. Una muestra de esta planta se muestra en la Figura 5 en el recuadro G10, y no está infectada de manera similar a la planta de control resistente LA1296 como se muestra en el recuadro D8. Por consiguiente, el silenciamiento de ambas SEQ ID Nos. 11 y 12 proporciona resistencia a Phytophthora infestans.
Ejemplo 4 (N. benthamiana)
Para investigar si DMR6 mediaba la resistencia en N. benthamiana contra Phytophthora infestans, se clonó el ortólogo de DMR6 en un vector de expresión VIGS. Las plantas de N. benthamiana se silenciaron para DMR6 y se inocularon posteriormente con una solución de esporas de P. infestans. Hasta 7 dpi, las plantas se puntuaron para el desarrollo de enfermedades. Este experimento se realizó tres veces con resultados similares. El silenciamiento de DMR6 claramente resulta en una menor colonización por parte del patógeno en comparación con el control de vector vacío o las plantas no silenciadas de tipo salvaje.
Secuencia de silenciamiento del constructo DMR6
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Se usó VIGS para silenciar y probar la función de N. benthamiana DMR6. Como un control visual de los procedimientos, también se dirigió al gen PDS. Las plantas silenciadas con PDS se usaron para indicar en qué momento comenzó el silenciamiento. El silenciamiento debe haber comenzado ± 2 días antes de que se observe el blanqueamiento debido a los niveles de proteína ya establecidos en la planta. Pero al comienzo del período de silenciamiento, el silenciamiento no será a una tasa alta y esperar dos días le da tiempo al mecanismo para establecer una buena tasa de silenciamiento. Otra ventaja de usar plantas silenciadas con PDS es que dan una indicación de qué partes de las plantas están silenciadas. El blanqueo se observó en todas las partes por encima de la inoculación. En las plantas inoculadas al vacío, el nuevo tejido mostró un fuerte fotoblanqueo y partes de algunos de los cotiledones también mostraron áreas blancas. En las plantas inoculadas con jeringa el blanqueamiento fue más fuerte en las hojas más jóvenes, en las hojas totalmente crecidas el pigmento ya está sintetizado y el silenciamiento será más difícil de observar visualmente. Se observó el blanqueo de las plantas silenciadas con PDS 8-10 días después de la inoculación con la cepa de Agrobacterium que contenía el vector TRV. El día 8 se iniciaron los ensayos de infección.
Se realizaron dos experimentos VIGS separados. Las plantas de ambos experimentos se usaron para ensayos de infección de hojas desprendidas. El ensayo de infección por P. capsici se realizó 8 días después de la agroinfiltración, en las hojas 2-6 por encima de la hoja infiltrada. La solución de zoosporas que contiene 5*103 esporas/ml-1 se aplicó a hojas desprendidas. El primer VIGS mostró bajas tasas de infección de P. capsici después de 7 días (ver tabla 1.). Idealmente, el 100 % de las hojas no silenciadas presentan infección.
Tabla 1. Resultados del ensayo de infección del 1er experimento VIGS. Ninguna de las hojas silenciadas con DMR6 mostró infección. 3 de cada 7 hojas no silenciadas mostraron infección.
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Se cree que esta baja esporulación es la causa de la baja infección de las hojas de N. benthamiana. Sin embargo, ninguna de las hojas silenciadas con DMR6 mostró síntomas de infección, a diferencia el 40 % de las hojas que no fueron silenciadas mostraron infección. Para aumentar la tasa de infección, se realizaron cambios en la adquisición de esporas y en el método de infección, lo que provocó una infección más agresiva durante el segundo ensayo de infección. Se encontró una hoja no infectada silenciada con DMR6 y otras hojas silenciadas con DMR6 mostraron una infección retardada y una propagación más lenta de la infección.
Ejemplo 5
Introducción
Varios genes que codifican reguladores negativos de la inmunidad se activan durante la infección por patógenos, de modo que la respuesta de defensa inducible se controla y regula a la baja para evitar la sobreactivación. Ejemplos de ello son la Nudix hidrolasa que codifica NUDT7 y el factor de transcripción que codifica WRKY48 que son inducidos después de la infección o el tratamiento MAMP. De manera similar, el gen DOWNYMILDEWRESISTANT 6 (DMR6) se activa durante la infección con aislamientos compatibles e incompatibles del mildiú velloso Hyaloperonospora arabidopsidis. La inactivación de DMR6 por mutación conduce a una baja activación constitutiva de genes relacionados con la defensa y la resistencia al mildiú velloso H. arabidopsidis.
DMR6 pertenece a la superfamilia de oxigenasas dependientes de 2-oxoglutarato Fe (II) (2OG oxigenasas, dominio Pfam PF03171). Esta superfamilia comprende 151 miembros en Arabidopsis. Sin embargo, para la mayoría de estas proteínas, incluida la DMR6, se desconoce su actividad metabólica. Se sabe que las 2OG oxigenasas catalizan una gran cantidad de reacciones que implican la oxidación de un sustrato mediante el uso de O2 molecular. Ellas comúnmente usan hierro como cofactor y requieren 2-oxoglutarato como cosustrato para suministrar dos electrones. Una característica general de estas enzimas es la presencia del motivo conservado HxD/ExnH ubicado en una hoja beta de doble hebra. Junto con dos hojas beta de cuatro hebras (pliegue en rollo de gelatina) encapsula el centro activo. Las 2OG oxigenasas están implicadas en el metabolismo secundario y la biosíntesis de moléculas de señalización, por ejemplo, la biosíntesis de flavonoides, giberelinas y alcaloides.
En este ejemplo, analizamos funcionalmente la oxigenasa DMR6 de Arabidopsis y las OXIGENASAS SIMILARES A DMR6 (DLO) 1 y 2 relacionadas. La sobreexpresión de DMR6, DLO1 y DLO2 aumentó la susceptibilidad a la enfermedad, lo que indica que las tres proteínas pueden actuar como un regulador negativo de la inmunidad. DLO1, pero no DLO2, está altamente corregulado con DMR6, sin embargo, difieren en su expresión espacial durante la infección por mildiú velloso. Se encontró que el doble mutante dmr6-3_dlo1 era completamente resistente a H. arabidopsidis y mostró un crecimiento fuertemente reducido asociado con altos niveles de ácido salicílico.
Resultados
La sobreexpresión de DMR6 resulta en una mayor susceptibilidad a patógenos (hemi) biotróficos
Se describió previamente que las plántulas del mutante dmr6-1 eran más resistentes a H. arabidopsidis, pero no a P. syringae. Sin embargo, cuando se probó en plantas adultas dmr6-1, se observó una fuerte resistencia a P. syringae DC3000. También las plantas adultas dmr6-1 fueron más resistentes al biotrofo obligado H. arabidopsis en comparación con las plántulas. Además, fue evidente una fuerte resistencia al oomiceto hemi-biotrófico Phytophthora capsici en las plantas dmr6-1 en comparación con la línea parental Lereds1-2; mientras que todas las plantas mutantes dmr6-1 sobrevivieron, P. capsici destruyó la gran mayoría de plantas de la línea parental y complementó el mutante dmr6-1. La resistencia del mutante dmr6-1 a diferentes (hemi) biotrofos sugiere que en las plantas de tipo salvaje DMR6 regula negativamente la inmunidad a estos patógenos.
Para estudiar esto, la secuencia codificante de DMR6 se expresó a partir del promotor constitutivo 35S en líneas transgénicas Col-0. Las líneas de sobreexpresión de DMR6- mostraron un claro aumento en la susceptibilidad a la enfermedad de H. arabidopsidis y P. syringae. El nivel de esporulación de H. arabidopsidis, que es una medida de la infección por mildiú velloso, se duplicó en las líneas de sobreexpresión de DMR6 en comparación con el control. Además, el desarrollo de clorosis asociada a la enfermedad fue más pronunciado en las líneas de sobreexpresión de DMR6 que en las plantas Col-0 no transgénicas.
La mayor susceptibilidad de las plantas de seis semanas a la bacteria P. syringae también fue claramente visible. Mientras que la línea de control (Col-0) mostró un nivel relativamente bajo de clorosis y lesiones a los 3 días después de la inoculación, la línea de sobreexpresión de DMR6- mostró síntomas de enfermedad más graves, es decir, más clorosis, más lesiones y más grandes. La mayor susceptibilidad de los sobreexpresores de DMR6 a la infección por P. syringae se confirmó mediante ensayos de crecimiento bacteriano que mostraron un aumento de los títulos bacterianos 1 y 3 días después de la inoculación en comparación con el control Col-0. Además, la expresión de los genes marcadores de defensa PR-1, PR-2 y PR-5 en tejido foliar no infectado se redujo entre un 50 y un 80 % en la línea de sobreexpresión de DMR6 en comparación con las plantas Col-0 de tipo salvaje que ya tienen un muy bajo nivel de expresión. La inmunidad reducida de la línea de sobreexpresión de DMR6, junto con la resistencia mejorada del mutante drm6-1, apoya fuertemente el papel de DMR6 como un regulador negativo de la inmunidad. DMR6 y las OXYGENASAS SIMILARES A DMR6 representan ramas separadas de un clado distinto en plantas con flores
El genoma de Arabidopsis contiene más de 150 genes de la 2OG oxigenasa, algunos de los cuales son similares a DMR6. Para analizar la conservación evolutiva de DMR6 y las oxigenasas relacionadas en plantas con flores, analizamos filogenéticamente la familia de las 2OG oxigenasas que contienen el dominio Pfam de la superfamilia de las 20G oxigenasas-Fe (II) PF03171. A partir de Arabidopsis thaliana y dieciocho plantas con flores, cuyas secuencias genómicas y modelos de proteínas estaban disponibles en la base de datos Phytozome v7.0 (www.Phytozome.net), se seleccionaron un total de 2951 proteínas que contenían el dominio PF03171 mediante el uso del algoritmo HMMER3. Para filtrar pequeños fragmentos de proteínas y eliminar proteínas muy grandes, sólo incluimos proteínas que no superaban una diferencia de longitud del 20 % con respecto a DMR6. Además, solo se retuvieron las proteínas que tienen una diferencia de longitud del dominio oxidorreductasa de menos del 20 % en comparación con DMR6. Esto resultó en una selección de 2038 proteínas que cumplen con todos los criterios, incluidas 110 de las 1512OG oxigenasas predichas de A. thaliana. La agrupación filogenética resultó en un árbol en el que se muestran muchos clados distintos que representan diferentes actividades enzimáticas. Las oxigenasas bien caracterizadas incluyen flavonona-3-hidroxilasa (F3H), ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico (ACC) oxidasa y antocianidina sintasa (ANS) que están presentes en distintos clados diferentes del clado DMR6. Se pueden distinguir dos ramas separadas en el clado DMR6 que contienen cada una 2OG oxigenasas de dicotiledóneas y monocotiledóneas, lo que indica que estos subclados ya estaban presentes en el ancestro de todas las plantas con flores o antes (82 % de confianza de arranque). Las duplicaciones de genes en el clado DMR6 son frecuentes en monocotiledóneas en la parte superior del árbol y en soja y vid en ambas ramas del clado DMR6. En el subclado inferior, dos homólogos de DMR6 de A. thaliana se agrupan junto con dos proteínas de Arahidopsis lyrata, lo que sugiere que son el resultado de una duplicación de genes relativamente reciente en el ancestro común de estas dos especies.
Estas proteínas de A. thaliana ahora se denominan OXIGENASA SIMILAR A DMR6 o DLO (con el gen At4g10500 que codifica DLO1 y At4g10490 que codifica DLO2). Además, el subclado DLO muestra una clara separación de las proteínas monocotiledóneas y dicotiledóneas, lo que sugiere que el ancestro de todas las plantas con flores ya poseía un DLO además de DMR6. Agrupados estrechamente a DMR6, los DLO forman un grupo interesante que posteriormente se analizó con más detalle, al enfocarse en los genes DLO1 y DLO2 de A. thaliana.
La sobreexpresión de DLO1 y DLO2 complementa al mutante dmr6
Los DLO podrían tener la misma actividad biológica que DMR6 y, por lo tanto, se probaron para la complementación del mutante dmr6-1. Con este fin, DLO1 y DLO2 se expresaron bajo el promotor constitutivo 35S y se transformaron en el fondo mutante dmr6-1. Se analizaron cuatro líneas T3 independientes, transformadas con 35S:DLO1 o 35SDLO2, para determinar su nivel de expresión y se seleccionaron 3 líneas por construcción que mostraron una clara expresión transgénica. Para comprobar la complementación, se infectaron plantas de 2 semanas de edad con el aislado Cala2 de H. arabidopsidis y 5 días después de la inoculación (dpi) se puntuó el número de esporas por mg de plántulas como medida de susceptibilidad.
Curiosamente, aunque dmr6-1 mostró una clara resistencia, las plantas 35S:DLO1 y 35S:DLO2 fueron altamente susceptibles, similares o superiores a Ler eds1-2 que es la línea parental del mutante dmr6-1. Como tanto DLO1 como DLO2 pueden complementar el fenotipo mutante dmr6-1, concluimos que los DLO tienen una función similar a la de DMR6.
Como la sobreexpresión de DMR6 en el fondo Col-0 resulta en una mayor susceptibilidad al mildiú velloso y otros patógenos, a continuación, investigamos si la sobreexpresión de DLO1 y DLO2 también haría que Col-0 sea más susceptible. Se seleccionaron transformantes que expresan los transgenes 35S:DLO1 y 35S:DLO2 y se incluyeron como controles Col-0 que sobreexpresa DMR6 y el mutante Col eds1-2 altamente susceptible. Los ensayos de enfermedad con H. arabidopsidis mostraron que la sobreexpresión de DLO1 y DLO2 aumentó la susceptibilidad en comparación con la línea parental Col-0, como lo muestra el mayor nivel de esporulación. La susceptibilidad mejorada observada fue comparable a las plantas con sobreexpresión de DMR6 y al mutante Col eds1-2. Esto confirma que las proteínas DLO1 y DLO2 tienen una actividad similar o idéntica a DMR6 lo que resulta en los mismos efectos fenotípicos.
La expresión de DLO1, pero no de DLO2, está relacionada con la inmunidad
Las líneas de sobreexpresión y complementación de DLO1 y DLO2 se generaron todas mediante el uso del promotor 35S. Sin embargo, es probable que la expresión de los DLO de tipo salvaje esté altamente regulada, similar a la de DMR6, que se activa fuertemente durante la defensa de la planta. Por lo tanto, analizamos los datos de expresión génica disponibles públicamente para determinar si DLO1 y DLO2 muestran una expresión relacionada con la inmunidad similar a DMR6. Para este análisis, se usaron datos de 9 experimentos de micromatrices de Affymetrix diferentes, todos relacionados con el perfil transcripcional después del ataque de patógenos, la aplicación de hormonas relacionadas con la defensa y el tratamiento con inductor/efector.
El análisis de expresión se enfocó en 30 2OG oxigenasas que pertenecen al gran clado que contiene los DLO y DMR6. La agrupación jerárquica de los genes permitió agrupar los genes de 2OG oxigenasa de acuerdo con sus patrones de expresión, lo que proporciona información sobre qué genes están corregulados durante las respuestas inmunitarias de las plantas. Sorprendentemente, DLO1 se agrupa con DMR6, mientras que DLO2 no muestra ninguna corregulación con DMR6 o DLO1. Tanto DMR6 como DLO1 se activan después de la infección con el mildiú velloso H. arabidopsidis, el mildiú polvoroso Erysiphe orontii y la bacteria P. syringae, así como el tratamiento con SA. DLO2 se agrupa muy lejos de DMR6 y DLO1 y parece no responder en los diferentes experimentos. Un análisis más detallado de los datos de micromatrices disponibles mediante el uso de Genevestigator reveló que DLO2 no se expresa en respuesta a ningún tratamiento o en ningún tejido, a excepción de silicuas, lo que sugiere que DLO2 no tiene un papel en la inmunidad de los tejidos vegetales vegetativos.
La sensibilidad de los DLO a la infección por H. arabidopsidis se verificó experimentalmente mediante PCR cuantitativa (qPCR). DMR6 y DLO1 están altamente activados en plantas infectadas con un aislado compatible o incompatible de H. arabidopsidis. También después del tratamiento con el imitador de SA BTH, tanto DMR6 como DLO1 se activan fuertemente. Por el contrario, DMR6 y DLO1 no responden al jasmonato de metilo (MeJA), que se sabe que activa genes inducidos por ácido jasmónico. La expresión de DLO2 es indetectable (valores de cT superiores a 35) en las diferentes condiciones experimentales lo que confirma los datos de Genevestigator. El hecho de que tanto DMR6 como DLO1 se activen durante la respuesta inmunitaria de la planta sugiere que en las hojas de las plantas de tipo salvaje DLO1 también actúa como un regulador negativo de la defensa. Sin embargo, la pregunta que permanece es ¿por qué los mutantes dmr6 tienen un fenotipo de resistencia tan claro en presencia de un gen DLO1 intacto que podría asumir la función de DMR6?
DLO1 y DMR6 muestran una expresión espacial diferente en hojas infectadas
Para analizar la expresión específica de tejido de DLO1 durante la infección por mildiú velloso, generamos líneas transgénicas que contienen una construcción con el promotor DLO1 fusionado con el gen reportero GUS (proDUOi: GUS). Dado que no observamos ninguna expresión de DLO2, no se construyó ninguna fusión GUS con el promotor de DLO2. Después de la infección por H. arabidopsidis, la expresión espacial de DMR6 se detectó específicamente en los sitios que están en contacto directo con el patógeno, como se ha descrito anteriormente. Por el contrario, la expresión de DLO1 no se indujo en células que están en estrecho contacto con el patógeno, sino solo en o alrededor de las venas principales de cotiledones y hojas infectados. Curiosamente, la expresión de DLO1 se observó solo en áreas de la hoja que están cerca de los sitios de infección por H. arabidopsidis, lo que indica que la activación de DLO1 depende de la presencia del patógeno. La ausencia de actividad DLO1 en células que contienen haustorios podría explicar por qué DLO1 no puede complementar completamente la pérdida de actividad DMR6 en los mutantes dmr6. Si bien estos datos muestran distintas actividades de los genes DMR6 y DLO1, el grado de redundancia de estos genes no está claro y, por lo tanto, se estudió genéticamente más a fondo.
La función de DLO1 es parcialmente redundante con DMR6
El análisis de redundancia en líneas mutantes se realiza mejor en el mismo fondo genético. Por lo tanto, obtuvimos mutantes en el fondo Col-0 para DMR6 (línea GABI-KAT GK-249H03.01, mutante designado dmr6-3) y DLO1 (línea SALK 059907, llamado dlol). Se generaron dobles mutantes dmr6-3_dlo1 y se analizaron fenotípicamente junto con los simples mutantes dmr6-3 y dlol, así como con la línea parental Col-0. El nivel de susceptibilidad a H. arabidopsidis Waco9 se redujo fuertemente en el mutante dmr6-3, pero sólo se redujo ligeramente en el mutante dlol. La combinación de las dos mutaciones en el doble mutante dmr6-3_dlo1 resultó en plantas que mostraron una resistencia completa a H. arabidopsidis.
A continuación, probamos el nivel de expresión del gen de defensa en los mutantes, ya que investigaciones anteriores sobre los mutantes dmr6-1 y dmr6-2 mostraron niveles aumentados de expresión de PR-1 y otros genes de defensa. Además, el mutante dmr6-3 mostró una expresión elevada de PR-1, PR-2 y PR-5, lo que confirma los resultados anteriores. El mutante dlol solo no mostró una inducción significativa de la expresión de los tres genes PR.
Por el contrario, el doble mutante dmr6-3_dlo1 mostró niveles extremadamente altos de expresión del gen de defensa. Las transcripciones de PR-1 fueron más de 30000 veces más altas en el mutante dmr6-3_dlo1 que en Col-0, y más de 100 veces más altas que en el simple mutante dmr6-3. En los mutantes probados hubo una clara correlación entre el nivel de resistencia al mildiú velloso y el aumento en la expresión de genes de defensa, lo que sugiere que la resistencia es causada por la activación de las respuestas inmunitarias de las plantas. Nuestros datos muestran que la mutación dlol mejora la inmunidad del simple mutante dmr6-3, lo que indica que DLO1 y DMR6 actúan parcialmente redundantes.
Esto fue corroborado adicionalmente por el fenotipo de crecimiento de los mutantes. Las plantas cultivadas durante 5,5 semanas en condiciones de días cortos mostraron diferencias notables entre los genotipos. Mientras que el mutante dlol crece de manera similar a Col-0, y el mutante dmr6-3 solo muestra una ligera reducción del crecimiento, el doble mutante dmr6-3_dlo1 mostró una fuerte reducción del crecimiento que resultó en plantas enanas. La reducción del crecimiento y el nivel de resistencia al mildiú velloso están correlacionados en los mutantes probados, lo que sugiere que estos dos fenotipos están funcionalmente vinculados.
Es bien sabido que una fuerte activación de la inmunidad vegetal puede ir acompañada de una reducción severa del crecimiento, que en muchos casos puede estar relacionada con niveles elevados de SA. De hecho, los niveles de SA fueron más de 200 veces más altos en el doble mutante dmr6-3_dlo1 que en el control Col-0, y ~20 veces mayor que en el mutante dmr6-3. El simple mutante dmr6-3 mostró un modesto -aumento de 10 veces en SA en comparación con el control Col-0, mientras que el mutante dlol no acumuló más SA que Col-0.
Para probar si el alto nivel de SA en dmr6-3_dlo1 es la causa del fenotipo enano y el alto nivel de resistencia al mildiú velloso, el doble mutante se cruzó con el mutante sid2, que está fuertemente comprometido en la biosíntesis de SA como resultado de la pérdida de la isocorismato sintasa 1. El triple mutante dmr6-3_dlo1_sid2 mostró una recuperación casi completa del fenotipo de crecimiento del doble mutante dmr6-3_dlo1, aunque permaneció ligeramente más pequeño que el mutante sid2. Los ensayos de la enfermedad mostraron que también el alto nivel de resistencia del doble mutante dmr6-3_dlo1 y del simple mutante dmr6-3 se redujo fuertemente en ausencia de SID2. Debido al bajo nivel de SA, el mutante sid2 es más susceptible a H. arabidopsidis que el Col-0 de tipo salvaje. El nivel de susceptibilidad a H. arabidopsidis correlaciona bien con el nivel de SA total en los mutantes. Tanto dmr6 como el doble mutante dmr6-3_dlo1 no muestran esporulación a 5 dpi y tienen los niveles de SA más altos. El triple mutante dmr6-3 dlo1_sid2 todavía produce más SA que Col-0, lo que podría explicar su menor susceptibilidad al mildiú velloso.
Se concluyó que tanto la resistencia a H. arabidopsidis como la reducción del crecimiento del mutante dmr6-3_dlo1 es el resultado de niveles aumentados de SA. Los fenotipos extremos del doble mutante demuestran que los genes DLO1 y DMR6 actúan de forma redundante. Sin embargo, el simple mutante dmr6 es más resistente al mildiú velloso que el mutante dlol. Junto con la localización diferente observada de la expresión de los genes DMR6 y

Claims (1)

REIVINDICACIONES
1. Planta perteneciente a la familia Solanaceae en donde dicha planta comprende un rasgo genético que proporciona resistencia a Phytophthora y en donde dicho rasgo genético que proporciona resistencia a Phytophthora está codificado por una combinación de al menos dos genes que tienen una expresión o transcripción reducida de dichos dos genes en comparación con dicha planta perteneciente a la familia Solanaceae que es susceptible a Phytophthora en donde:
dicha planta es pimiento dulce (Capsicum annuum) o Capsicum spp., dicha resistencia a Phytophthora es la resistencia a Phytophthora capsici y dicha combinación de al menos dos genes son genes que codifican proteínas de acuerdo con las SEQ ID No. 16 y SEQ ID No. 17, o proteínas que tienen al menos 90 % de identidad de secuencia con las SEQ ID Nos. 16 y 17.
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