JP2023504713A - ウイルス抵抗性のためのｃｃａ遺伝子 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＣＣＡ付加酵素をコードする改変ＣＣＡ遺伝子に関するものであり、改変ＣＣＡ遺伝子は、ＴＬＳを有するプラス鎖ＲＮＡウイルスに対する抵抗性をもたらし、改変ＣＣＡ遺伝子は：配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１によるＣＣＡ付加酵素をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子；配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、または配列番号１６を含むプロモーター配列を含む遺伝子；配列番号２または配列番号７と比較した場合に、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換、または挿入を有するＣＣＡ付加酵素をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子；配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１と比較した場合、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換、または挿入を有するＣＣＡ付加酵素をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子；配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＣＡ付加酵素をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子；および配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、または配列番号１６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するプロモーター配列を含む遺伝子、からなる群から選択される。本発明はさらに、改変された遺伝子を含む植物および種子、そのような植物を作製および同定するための方法、ならびに遺伝子の使用に関する。

Description

本発明は、ＴＬＳを有するプラス鎖ＲＮＡウイルスに対する抵抗性をもたらす改変遺伝子に関する。本発明はさらに、該改変遺伝子を含む植物、そのような植物を生産するための方法、および改変遺伝子の同定およびそのような植物の選択のための方法に関する。本発明はまた、植物における改変遺伝子の同定のためのマーカー、および該マーカーの使用に関する。

ウイルス性疾患は、保護されたおよび野外での作物栽培の両方で、栽培者が対処しなければならない主要な脅威の１つをもたらす。作物が感染すると、ウイルスの拡散は、制御が難しいベクター、通常は昆虫、を介して急速に発生し得る。さらに、栽培方法は、器具や作業者を介した樹液の伝達によって、ウイルスのさらなる拡散に寄与することがよくある。

植物ウイルスは典型的に、迅速な複製および拡散について宿主に依存し、それにより同じ宿主を病気に感染させる。ウイルスが異なれば、この目標を達成するために展開するシステムも異なる。プラス鎖ＲＮＡウイルスに属する特定のグループのウイルスは、これらのプロセスの必須因子として、３’末端ゲノム配列でトランスファーＲＮＡ様構造（ＴＬＳ）を使用するようである。これらのウイルスＴＬＳは、ＴＬＳ構造に存在するアンチコドン配列の順序に関連する特定のアミノアシル化が可能であり、それにより普遍的に存在するトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の動作を模倣する。しかしながら、通常、これらのウイルスゲノムのＴＬＳは、関連するアミノ酸の結合に不可欠なｔＲＮＡプロパティであるＣＣＡテールを欠く。代わりに、ウイルスゲノムはしばしば３’－ＣＣで終了する。しかしながら、このＣＣテールは、ウイルスが侵入した宿主植物の「ＣＣＡ付加酵素」とも呼ばれるｔＲＮＡヌクレオチジルトランスフェラーゼを利用してアデニル化することができる。ウイルスゲノムのこのアデニル化およびそれに続くアミノアシル化は、ウイルスの安定化、翻訳、複製に重要な役割を果たすことが認識されているため、ウイルスの感染と拡散に不可欠なステップを形成すると考えられている。トバモウイルス属、チモウイルス属、またはブロモウイルス属に属するいくつかのプラス鎖ＲＮＡウイルスは、このｔＲＮＡ模倣システムを使用する例である。これらのウイルスは、ゲノムの３’末端にＴＬＳを有するだけでなく、一般にｓｇＲＮＡ転写産物の３’末端にもＴＬＳを有し、この転写物ＴＬＳは、宿主のＣＣＡ付加酵素との相互作用においても機能し得る。

植物のウイルス抵抗性に関与している多くの遺伝子が認識されている。ウイルス抵抗性はさまざまなメカニズムに基づく可能性があり、植物の発達と植物の防御経路の多くの異なる段階が関与する可能性がある。しかしながら、多くのウイルスについては、いまだ抵抗性遺伝子は同定されていない。特に、比較的新しいウイルス、または他のウイルスと類似しているが既知の抵抗性を破るウイルスの場合、ウイルスの損傷が広範囲に及ぶ前に、抵抗性の新しい原因を特定するという課題が常にある。新たに同定された抵抗性遺伝子は、既知のウイルス病に対する作物の保護に追加することもできる。

本発明の目的は、３’末端トランスファーＲＮＡ様構造（ＴＬＳ）を有するプラス鎖ＲＮＡウイルスに対する抵抗性をもたらす改変遺伝子を提供することである。

本発明は、ＣＣＡ付加酵素をコードする改変ＣＣＡ遺伝子を提供し、この改変ＣＣＡ遺伝子は、ＴＬＳを有するプラス鎖ＲＮＡウイルスに対する抵抗性をもたらし、改変ＣＣＡ遺伝子は、以下からなる群から選択される：
－配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１によるＣＣＡ付加酵素をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子；
－配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、または配列番号１６を含むプロモーター配列を含む遺伝子；
－配列番号２または配列番号７と比較した場合に、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換、または挿入を有するＣＣＡ付加酵素をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子；
－配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１と比較した場合に、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換、または挿入を有するＣＣＡ付加酵素をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子；
－配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＣＡ付加酵素をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子；および
－配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、または配列番号１６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するプロモーター配列を含む遺伝子。

本明細書で使用される場合、ＣＣＡ遺伝子は、ＣＣＡ付加酵素をコードする遺伝子である。本明細書で使用される場合、ＣＣＡ遺伝子は、配列番号１によって表される野生型ＣＤＳ配列を含む遺伝子、または配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む相同遺伝子；または配列番号２を含むＣＣＡ付加酵素をコードする遺伝子；または、配列番号２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む相同ＣＣＡ付加酵素をコードする遺伝子、である。本明細書で使用される場合、遺伝子はまた、その遺伝子の５’－ＵＴＲ配列、プロモーター、および３’－ＵＴＲ配列を含む。

ＣＣＡ遺伝子のプロモーターは、配列番号３を含むか、または配列番号３に対して少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列を含む。相同ＣＣＡ遺伝子は、配列番号１に対して少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列を含む。相同性ＣＣＡ付加酵素は、配列番号２に対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列を含む。

配列番号８に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＣＡ付加酵素は、好ましくは、Ｎ５３５Ｄ置換、Ｒ５５３Ｓ置換、またはＫ５７９Ｎ置換のうちの少なくとも１つを含む。配列番号９に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＣＡ付加酵素は、好ましくは、Ｋ４５０Ｅ置換、Ｒ５５３Ｓ置換、またはＫ５７９Ｎ置換のうちの少なくとも１つを含む。配列番号１０に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＣＡ付加酵素は、好ましくは、Ｋ３１６Ｎ置換またはＡ３１７Ｖ置換のうちの少なくとも１つを含む。配列番号１１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＣＡ付加酵素は、好ましくは、少なくともＣ２１１Ｒ置換を含む。あるいは、これらの置換のいずれかは、相同配列の対応する位置での置換である。

本明細書で使用される場合、配列同一性は、それらの配列の適切なアラインメント後の２つの配列間で同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸のパーセンテージである。当業者は、例えば、ヌクレオチド配列およびタンパク質配列の両方に使用することができるＢＬＡＳＴ（登録商標）などの配列アラインメントツールを使用することによって、配列をアラインメントする方法を知っている。最も重要な結果を得るには、最高の配列同一性スコアを与える可能な限り最良のアラインメントを取得する必要がある。配列同一性のパーセンテージは、評価で最も短い配列の長さを比較して計算される。

ＣＣＡ付加酵素は、ほとんどの生物で活性があり、普遍的に存在するトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の３’末端にＣＣＡテールを付加するために不可欠であるため、その中で重要な役割を果たす。ほとんどすべての真核生物では、ｔＲＮＡのアミノアシル化の前提条件であるこのＣＣＡテールは、ｔＲＮＡ遺伝子によってコードされていないため、転写後に追加する必要がある。特殊なＣＣＡ付加酵素は、すべてのｔＲＮＡを認識し、それらすべてで適切なＣＣＡテールの合成を行う。ほとんどの真核生物のゲノムには、必須で高度に保存されたＣＣＡ付加酵素をコードするＣＣＡ遺伝子のコピーが１つしかない。

ＣＣＡ付加酵素は、他のＲＮＡ関連プロセスにも関与している。そのタスクの１つは、たとえばｔＲＮＡの品質管理であり、これにより、酵素はｔＲＮＡの修復や、不安定なｔＲＮＡや逸脱したｔＲＮＡの分解に関与する。何らかの理由で欠陥があると特定されたＲＮＡにシングルではなくダブルＣＣＡテールを追加することにより、このＲＮＡに分解のタグを付与する。ＣＣＡ付加酵素は、ＩｎｃＲＮＡなどの他の非コードＲＮＡの処理にも関与している。

ＣＣＡ付加酵素の重要な役割のため、ＣＣＡ遺伝子の突然変異、特に遺伝子配列の高度に保存された部分に存在する突然変異は、植物の成長と発達に強い悪影響を与えると予想される。したがって、多くのウイルスが宿主植物のＣＣＡ付加酵素を同じ宿主植物の感染に利用する３’末端トランスファーＲＮＡ様構造（ＴＬＳ）を有することが知られていても、本質的な機能により、ＣＣＡ遺伝子はウイルス抵抗性を得るためのアプローチで標的になりそうになかった。

しかしながら、本発明は、植物におけるウイルス抵抗性をもたらすＣＣＡ遺伝子の改変を提示する。

ＴＬＳを有するプラス鎖ＲＮＡウイルスに対する抵抗性をもたらすＣＣＡ遺伝子の改変は、以下からなる群から選択される改変である：
－ＣＣＡ遺伝子のプロモーター配列の改変；
－ＣＣＡ遺伝子のゲノム配列の改変；
－ＣＣＡ遺伝子のコード配列（ＣＤＳ）の改変；
－ＣＣＡ遺伝子の調節配列の改変；および
－ＣＣＡ遺伝子の保存ドメインの改変、またはこれらの任意の組み合わせ。

抵抗性をもたらすＣＣＡ遺伝子の改変は、該遺伝子の発現を変化させるであろう。あるいは、または結果として、改変は、コードされたタンパク質の活性および／または機能に影響を及ぼし得るか、またはタンパク質がコード化され得ない。本発明のＣＣＡ遺伝子の改変は、アミノ酸変化をもたらす改変、早期終止コドン（ｅａｒｌｙ ｓｔｏｐ ｃｏｄｏｎ）をもたらす改変、短縮型タンパク質をもたらす改変、またはフレームシフトをもたらす改変を含む。改変により、コードされたタンパク質の機能が変化したり、機能が低下したり、機能しなくなったりする。

本発明のＣＣＡ遺伝子の変化した発現は、発現の低下、発現なし、またはサイレンシングを含む。本発明のＣＣＡ遺伝子の改変は、配列番号１のヌクレオチド配列またはその相同配列中の少なくとも１つのヌクレオチド、または配列番号２またはその相同配列にコードされた中の少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換、または挿入を含む。改変は、ＣＣＡ付加酵素であるコードされたタンパク質の活性部位または触媒ドメインなどの保存されたドメインに影響を与える改変を含む。

一実施形態では、ＴＬＳを有するプラス鎖ＲＮＡウイルスに対する抵抗性をもたらす改変は、ＣＣＡ遺伝子のプロモーター配列の欠失を含む。抵抗性をもたらすように改変されるのに適したＣＣＡ遺伝子のプロモーターは、優先度が高い順に、プロモーター配列が配列番号４を含むという条件で、配列番号３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。ＣＣＡ遺伝子のプロモーター配列の欠失は、該遺伝子の発現の変化をもたらし、それにより抵抗性において、調節配列の欠失、特に、ＴＡＴＡボックスの削除、または配列番号４を含む削除（表１）、を含む。

好ましい実施形態では、配列番号４を含む欠失は、配列番号１８を含む欠失、または配列番号１９を含む欠失である。

一実施形態では、ＴＬＳを有するプラス鎖ＲＮＡウイルスに対する抵抗性をもたらす改変は、アミノ酸置換をもたらすＣＣＡ遺伝子のＣＤＳにおけるＳＮＰを含む。任意に、ＳＮＰは、ＣＣＡ付加酵素の活性部位または触媒ドメインなどの保存されたドメインでのアミノ酸置換をもたらす。ＣＣＡ付加酵素の保存されたドメインは、配列番号２の８２から２４１の位置、または配列番号２に対して少なくとも８０％配列同一性を有する相同配列の対応する位置を含むＰｏｌｙＡ＿ｐｏｌ＿ｈｅａｄ＿ドメイン（ドメインＩＤ ＩＰＲ００２６４６、ＩｎｔｅｒＰｒｏデータベースでオンラインでアクセス可能）を含む。保存されたドメインは、ｐｏｌｙＡ＿ｐｏｌ＿Ｃ末端領域様ドメイン（ドメインＩＤ ＳＳＦ８１８９１、スーパーファミリーデータベースでオンラインでアクセス可能）も含む。このドメインは３つの活性部位を含み、配列番号２を含むＣＣＡ付加酵素のアミノ酸２４４からアミノ酸５８３まで、または配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性を有する相同ＣＣＡ付加酵素配列の対応する位置に位置する。

驚くべきことに、ソラナム・リコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）種は一般的な規則から逸脱し、そのゲノムに２つのＣＣＡ遺伝子を含み、これらの遺伝子は相同性が高く、９５％の配列同一性を共有していることが見出された。本明細書でＳｌＣＣＡ１として識別される第１のＣＣＡ遺伝子は、配列番号１によって表される。本明細書でＳｌＣＣＡ２として識別されるＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍの第二のＣＣＡ遺伝子は、ＳｌＣＣＡ１遺伝子と比較して１１ｂｐの欠失（この欠失はフレームシフトをもたらし、それにより、早期終止コドンである）を有する。Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍのＳｌＣＣＡ２遺伝子は、配列番号５で表される。ＳｌＣＣＡ１遺伝子と比較したＳｌＣＣＡ２遺伝子の欠失は、遺伝子のエクソン９に存在し、ＳｌＣＣＡ２のエクソン１０の早期終止コドンにつながる。欠失は、具体的には、配列番号１の位置１０６２から１０７２に対応する１１ｂｐの欠失である。欠失は、特に、配列番号６を含む欠失である（表１）。

研究によると、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍのＳｌＣＣＡ２遺伝子の早期終止コドンにもかかわらず、この遺伝子はまだ発現している。配列番号５の位置１０５５から１０６５をカバーする配列を含むリードなど、欠失を有する領域にまたがるＲＮＡｓｅｑリードが見出された。したがって、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍのＳｌＣＣＡ２遺伝子は切断されたタンパク質をもたらすと予想される。切断されたタンパク質は、位置３５０の後でＳｌＣＣＡ１でエンコードされたタンパク質から逸脱し、ｐｏｌｙＡ＿ｐｏｌ＿Ｃ末端領域のようなドメイン内にある位置３６６の後で終了する。その結果、このドメインの３つの活性部位のうち最初の部位のみがＳｌＣＣＡ２によってコードされるＣＣＡ付加酵素にまだ存在する。したがって、このドメインは、酵素の機能が変更されているか、減少しているか、まったく機能していないと予想される。野生型ＳｌＣＣＡ２によってコードされるＣＣＡ付加酵素は、配列番号７を含み、配列番号２に対して９０％の配列同一性を有する。

Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍの野生型ＳｌＣＣＡ２遺伝子に関するさらなる研究は、配列番号１と配列番号５の配列アラインメントから推測できるように、野生型ＳｌＣＣＡ１と比較して、いくつかの多型を含むことを示した。これらの多型の一つ、位置６３１の、配列番号１のＣ対配列番号５のＴは、野生型ＳｌＣＣＡ２でコードされたタンパク質のアミノ酸変異体Ｒ２１１Ｃをもたらす。この位置は、酵素のヌクレオチド結合に関与するＰｏｌｙＡ＿ｐｏｌ＿ｈｅａｄ＿ｄｏｍａｉｎの必須で高度に保存されたサイト内にあると判断された。注目すべきことに、ＳｌＣＣＡ２のこのアミノ酸置換をＣからＲに戻す変異を含むＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ系統、すなわち、配列番号１１に示されるＣ２１１Ｒ置換をもたらすＴ６３１Ｃ変異は、フィールド耐性（ｆｉｅｌｄ ｔｏｌｅｒａｎｔ）ＴｏＢＲＦＶ表現型を示すことが見出された（表３も参照）。

一実施形態では、ＴＬＳを有するプラス鎖ＲＮＡウイルスに対する抵抗性をもたらす改変は、配列番号５の位置６３１上の、またはその相同配列中の対応する位置上のＴからＣのＳＮＰ（Ｔ６３１Ｃ）を含み、これは、配列番号７の、またはその相同配列の対応する位置でのＣ２１１Ｒアミノ酸置換をもたらす。この実施形態は、特に、２つのＣＣＡ遺伝子を含むゲノムに関連し、それにより、両方のＣＣＡ遺伝子は、改変後に、コードされたタンパク質の２１１位にＲを有する。この実施形態は、少なくともフィールド耐性（ｆｉｅｌｄ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）を含む抵抗性をもたらす。この改変を含む植物は、好ましくは、ＳｌＣＣＡ２遺伝子の改変を含むＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物であり、好ましくは、配列番号１１によって表される改変であり、この改変は、すなわち、配列番号１１の存在が、ＴｏＢＲＦＶ抵抗性、特にＴｏＢＲＦＶフィールド耐性をもたらすものである。

ＴｏＢＲＦＶは、Luria et al（(2017): A new Israeli tobamovirus isolate infects tomato plants harboring Tm-22 resistance genes. PLoS ONE 12(1):e0170429. Doi:10.1371/journal.pone.0170429）によって最初に記述された。その出版の時点では、トマトブラウンルゴースフルーツウイルス（Ｔｏｍａｔｏ Ｂｒｏｗｎ Ｒｕｇｏｓｅ Ｆｒｕｉｔ Ｖｉｒｕｓ）はまだＴＢＲＦＶと略されていたが、そのうちに、このウイルスの一般的に使用される略語はＴｏＢＲＦＶとなり、したがって現在、本出願でも使用されている。

またさらなる研究の間に、ＴｏＢＲＦＶ抵抗性をもたらすいくつかのＳｌＣＣＡ遺伝子多型が同定された。野生のトマト種、特にソラナム・ピンピネリフォリウム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ）種のＣＣＡ遺伝子に特定の改変が見られ、これらの改変がＴｏＢＲＦＶ感受性のＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物に移されたとき、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物はＴｏＢＲＦＶに抵抗性を示した。抵抗性をもたらすアミノ酸変化をもたらすＳＮＰは、配列番号１または配列番号５の９４８位のＡからＴのＳＮＰ（Ａ９４８Ｔ）、配列番号１または配列番号５の９５０位のＣからＴのＳＮＰ（Ｃ９５０Ｔ）、配列番号１の位置１３４８位のＡからＧのＳＮＰ（Ａ１３４８Ｇ）、配列番号１の位置１６０３位のＡからＧのＳＮＰ（Ａ１６０３Ｇ）、配列番号１の位置１６５９位のＡからＴのＳＮＰ（Ａ１６５９Ｔ）、または配列番号１の位置１７３７位のＧからＴのＳＮＰ（Ｇ１７３７Ｔ）、または配列番号１の相同配列中の対応する位置のいずれかのＳＮＰを含む。前記ヌクレオチド変化はそれぞれ、配列番号２のＫ３１６Ｎ置換、Ａ３１７Ｖ置換、Ｋ４５０Ｅ置換、Ｎ５３５Ｄ置換、Ｒ５５３Ｓ置換、またはＫ５７９Ｎ置換、または配列番号２の相同配列の対応する位置におけるアミノ酸置換をもたらす。

本明細書で使用される場合、Ｘ０００Ｙ変異、ＳＮＰ、または置換は、野生型配列が位置０００にヌクレオチドまたはアミノ酸Ｘを有し、改変された配列においてヌクレオチドまたはアミノ酸Ｙに変更されることを意味する。

配列番号８は、Ｎ５３５Ｄ変異、Ｒ５５３Ｓ変異、およびＫ５７９Ｎ変異を含む。配列番号９は、Ｋ４５０Ｅ、Ｒ５５３Ｓ、およびＫ５７９Ｎ変異を含む。配列番号１０は、Ｋ３１６ＮおよびＡ３１７Ｖ変異を含む。

さらに、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍのＴｏＢＲＦＶ抵抗性と相関する他の多型が、ＣＣＡ遺伝子のプロモーター中に見出された。抵抗性を示したＣＣＡ１遺伝子は、野生型配列番号３と比較した場合、プロモーター配列に配列番号４を含む欠失を有していた。他の多型は、例えば図３のプロモーター配列アラインメントに示されるように、プロモーター配列内にヌクレオチド置換を含んでいた。注目すべきことに、配列番号１７を含むＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍの野生型ＣＣＡ２遺伝子は、配列番号３と比較した場合、配列番号４を含む欠失も有する。配列番号４の欠失は、ＣＣＡ遺伝子のプロモーター領域のＴＡＴＡボックスの欠失のようである。

一実施形態では、本発明の改変ＣＣＡ遺伝子のプロモーターは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、または配列番号１６を含む。これらのプロモーター配列のすべては、配列番号３を含む野生型プロモーター配列と比較した場合、配列番号４を含む欠失を有する（図３ｂ）。

本明細書で使用される場合、ＴＬＳを有するプラス鎖ＲＮＡウイルスに対する抵抗性、特にトバモウイルスに対する抵抗性、より具体的にはＴｏＢＲＦＶに対する抵抗性は、ウイルスに対する耐性および／またはフィールド耐性を含む。ウイルス抵抗性はさまざまなレベルで発現する可能性があり、それによってさまざまなメカニズムが関与する。植物がウイルスに対して真に抵抗性がある場合、宿主植物におけるウイルスの感染および／または複製は、抵抗性メカニズムによって制限される。若い植物のバイオアッセイが行われるとき、抵抗性植物は感受性症状を示さない。

本明細書で使用される場合、植物がウイルスに耐性である場合、ウイルスの複製および増殖は植物において起こり得、例えば、ｑＰＣＲ実験を通して測定することができる。バイオアッセイではいくつかの軽度の症状が観察されるが、感受性の高い植物への影響と比較して、植物の適応度に対するウイルスの存在の影響は大幅に減少する。

耐性の特定の形態は、本明細書で使用されるフィールド耐性であり、植物がフィールド耐性である場合、宿主植物はウイルスの複製および増殖を制限することができず、若い植物に対して制御された条件下で行われるバイオアッセイでは、植物は症状を示す。しかしながら、そのような植物が通常の栽培慣行の下で野外で栽培される場合、宿主はウイルスの存在が植物の健康に与える影響を減らすことができ、症状は見られないか、限られたものとなる。さらに、作物の収量は大幅に減少することはなく、ウイルスを含まない作物の収量に匹敵する。

一実施形態では、ＴＬＳを有するプラス鎖ＲＮＡウイルスに対する抵抗性をもたらす改変は、１つのＣＣＡ遺伝子における２つ以上の上記改変の組み合わせを含み、この組み合わせは、コード配列における改変、プロモーター配列の改変、またはプロモーター配列の改変およびコード配列の改変であり得る。改変はまた、２つのＣＣＡ遺伝子が植物のゲノムに存在する場合、２つのＣＣＡ遺伝子のそれぞれにおける少なくとも１つの改変の組み合わせであり得る。ここで、両方のＣＣＡ遺伝子における改変は、異なるかまたは同じであり得る。改変は、特に、配列番号１によって示される遺伝子における少なくとも１つの改変、および配列番号５によって示される遺伝子における少なくとも１つの改変の組み合わせ；または、配列番号１によって示される遺伝子における少なくとも１つの改変、および配列番号３によって示されるプロモーターにおける少なくとも１つの改変との組み合わせ；または、配列番号５によって示される遺伝子の少なくとも１つの改変、および配列番号１７によって示されるプロモーターの少なくとも１つの改変の組み合わせ；または配列番号１、配列番号３、配列番号５、および配列番号１７の相同配列の改変、であり得る。

ＴＬＳを有するプラス鎖ＲＮＡウイルスは、トバモウイルス属、チモウイルス属、またはブロモウイルス属のウイルスを含む。ＴＬＳを有するプラス鎖ＲＮＡウイルスは、好ましくは、トバモウイルス属のウイルス、特に、ＴｏＢＲＦＶまたはＴＭＶまたはＴｏＭＶまたはＣＧＭＭＶ種のウイルスである。本発明のＣＣＡ遺伝子の改変は、好ましくは、ＴｏＢＲＦＶ抵抗性をもたらし、任意で他のウイルス、特に他のトバモウイルスに対する抵抗性と組み合わせた抵抗性をもたらす。

本発明は、本発明の改変ＣＣＡ遺伝子を含む植物に関する。改変ＣＣＡ遺伝子を含む植物は、好ましくは、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ ｆａｍｉｌｙ）の植物であり、ソラナム・リコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、カプシカム・アヌウム（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ）、ソラナム・メロンゲナ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｅｌｏｎｇｅｎａ）、カプシカム・フルテセンス（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）、ソラナム・ツベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ペチュニア属（Ｐｅｔｕｎｉａ ｓｐｐ）、またはニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）の種の植物を含む。本発明の植物は、好ましくは、野生ではなく、農業的価値を有し、特に農業的にエリートである栽培植物である。

一実施形態では、本発明の改変ＣＣＡ遺伝子を含む植物は、ＴＬＳを有するプラス鎖ＲＮＡウイルス、特にトバモウイルス属のウイルス、チモウイルス属、またはブロモウイルス属、好ましくはトバモウイルス属のウイルス、に抵抗性がある。プラス鎖ＲＮＡウイルスは、最も好ましくは、トマトブラウンルゴースフルーツウイルス（ＴｏＢＲＦＶ）種またはタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）種またはトマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）種である。

好ましい実施形態において、本発明の植物は、改変ＣＣＡ遺伝子を含むＳｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ種の植物であり、この植物は、トバモウイルス、特にトマトブラウンルゴースフルーツウイルス（ＴｏＢＲＦＶ）に耐性がある。本発明のＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物におけるＣＣＡ遺伝子の改変は、配列番号１および／または配列番号５の９４８位のＡからＴ ＳＮＰ；配列番号１および／または配列番号５の９５０位のＣからＴ ＳＮＰ；配列番号１の１３４８位のＡからＧ ＳＮＰ；配列番号１の１６０３位のＡからＧ ＳＮＰ；配列番号１の１６５９位のＡからＴ ＳＮＰ；配列番号１の１７３７位のＧからＴ ＳＮＰ；配列番号５の６３１位のＴからＣ ＳＮＰ；ＣＣＡ遺伝子のプロモーターの欠失、特に配列番号３を含むプロモーター配列からの配列番号４を含む欠失；または、配列番号１、配列番号３および配列番号５の相同配列における対応する改変、を含む群から選択される改変を含む。ＣＣＡ遺伝子における特定の改変は、１つ以上の抵抗性のカテゴリーの抵抗性をもたらし得る。

本発明の一部を形成する、ＣＣＡ付加酵素であるそのコードされたタンパク質におけるアミノ酸置換をもたらすＣＣＡ遺伝子におけるＳＮＰ改変の概要を表４に示す。改変は、感受性（示された位置の前）から耐性（示された位置の後）まで示される。

一実施形態では、本発明のＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物は、２つの改変ＣＣＡ遺伝子を含む。一実施形態では、本発明のＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物は、配列番号８および配列番号１２を含むＣＣＡ１遺伝子、ならびに配列番号１０および配列番号１４を含むＣＣＡ２遺伝子を含む；または、植物は、配列番号８および配列番号１２を含むＣＣＡ１遺伝子、ならびに配列番号７および配列番号１５を含むＣＣＡ２遺伝子を含む；または、植物は、配列番号９および配列番号１３を含むＣＣＡ１遺伝子、ならびに配列番号１１および配列番号１６を含むＣＣＡ２遺伝子を含む。

ＴｏＢＲＦＶ抵抗性は、ＴｏＢＲＦＶ感受性であることが知られている対照品種との比較によって決定される。対照として使用できるＴｏＢＲＦＶ感受性トマト品種の例は、エンデバー（Ｅｎｄｅａｖｏｕｒ）Ｆ１およびラミール（Ｒａｍｙｌｅ）Ｆ１である。抵抗性対照として、本発明の改変ＣＣＡ遺伝子を含む、ＮＣＩＭＢ４３５１１またはＮＣＩＭＢ４３５１２として寄託された植物を使用することができる。ＮＣＩＭＢ４３５１１は、配列番号８をコードするＣＣＡ１遺伝子および配列番号１０をコードするＣＣＡ２遺伝子を含む。ＮＣＩＭＢ４３５１２は、配列番号８をコードするＣＣＡ１遺伝子および配列番号７をコードするＣＣＡ２遺伝子を含む。ＮＣＩＭＢ４３５１１およびＮＣＩＭＢ４３５１２のＣＣＡ１遺伝子のプロモーターは配列番号１２を含む。ＮＣＩＭＢ４３５１１のＣＣＡ２遺伝子のプロモーターは配列番号１４を含む。ＮＣＩＭＢ４３５１２のＣＣＡ２遺伝子のプロモーターは配列番号１５を含む。

抵抗性を決定するために、試験される系統の種子を標準的な苗トレイに播種し、播種の４週間後に苗に接種する。接種材料は、ＴｏＢＲＦＶに感染したトマトの葉をセライトと混合した０．０１ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）中で粉砕することによって調製される。次に、接種材料で葉を優しくこする前に、苗にカーボランダム粉末をまぶす。抵抗性は０－５のスケールで適切に採点される：スコアの尺度の説明は表２に記載。バイオアッセイでの若いトマト植物の症状の観察は、接種（ｄａｉ）の１４～２１日後に行うことが好ましい。

本明細書で使用されるように、改変ＣＣＡ遺伝子の存在によりＴｏＢＲＦＶに抵抗性であるＳｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物は、上記のようなバイオアッセイが行われ、表２によるスコアリングが使用された場合に、３または３より低い、好ましくは２．５より低いスコアを有する。一実施形態では、植物は、ＴｏＢＲＦＶに対して抵抗性があり、２または２より低い、好ましくは１または１より低いスコアを有する。他の実施形態では、植物は、ＴｏＢＲＦＶに対するフィールド耐性（ＦＴ）を有し、スコアがバイオアッセイにおいて３または３より低く、好ましくは２．５より低く、野外条件ではスコアが２または２より低い。あらゆるバイオアッセイの基準であるように、信頼できる評価を得るためには、代表的な数の植物、例えば、特定の系統の１０の植物、をスコアリングし、平均スコアを取得する必要がある。この試験の感受性対照は、試験が適切に実行された場合、３より高い、できれば３．５より高いスコアを有するべきである。

本発明の植物は、ホモ接合性またはヘテロ接合性に改変ＣＣＡ遺伝子を含む、すなわち、改変ＣＣＡ遺伝子は、植物のゲノム中の染色体対の両方の染色体上に、または染色体対の一方の染色体上のみに存在し得る。２つの改変ＣＣＡ遺伝子が特定の種、例えばＳｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍに存在する場合、それらは相引相、すなわち同じ染色体上の２つの改変ＣＣＡ遺伝子に、または相反相、すなわち各相補染色体上の１つの改変ＣＣＡ遺伝子に存在し得る。本発明の植物は、近交系、雑種、放任受粉品種、倍加半数体、または分離集団の植物を含む。

一実施形態では、本発明の植物は、その代表的な種子が寄託番号ＮＣＩＭＢ４３５１１またはＮＣＩＭＢ４３５１２の下に寄託されたＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物のゲノムに含まれる改変ＣＣＡ遺伝子を含むＳｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物である。

一実施形態では、本発明の植物は、ＮＣＩＭＢ４３５１１またはＮＣＩＭＢ４３５１２として寄託されたＳｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物、または前記寄託物に存在するＣＣＡ遺伝子の１つ以上またはすべての多型を含むその後代である。

本発明の植物におけるウイルス抵抗性、特にＴｏＢＲＦＶ抵抗性は、中間（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）の様式で遺伝する。本明細書で使用される場合、中間とは、本発明の改変ＣＣＡ遺伝子がホモ接合的に存在する場合に、より高いレベルの抵抗性が見出されることを意味する。しかしながら、本発明の改変ＣＣＡ遺伝子のヘテロ接合性の存在は、依然として、特定のレベルのＴｏＢＲＦＶ抵抗性を付与する。ホモ接合性植物およびヘテロ接合性植物の両方のＴｏＢＲＦＶ抵抗性により、植物はＴｏＢＲＦＶが存在する条件下での栽培により適したものとなる。ヘテロ接合性レベルの改善は、ヘテロ接合性植物が２つの異なる改変ＣＣＡ遺伝子を有し、それによって各改変ＣＣＡ遺伝子が異なる親に由来する場合にも発現し得る。したがって、ヘテロ接合性植物およびホモ接合性植物の両方が、改良された農業特性を有すると考えられる。さらに、ヘテロ接合性植物は、交配および選択によるホモ接合性植物の発育に使用することができ、したがって、ヘテロ接合性植物もまた、本発明の一部を形成する。

本発明はさらに、本発明の改変ＣＣＡ遺伝子を含む種子に関する。この種子は、本発明の植物に成長することができる。本発明はまた、前記種子を植物に成長させることによる、本発明の植物の生産のための前記種子の使用に関する。本発明はまた、本発明の植物の果実または本発明の植物の種子を含む、本発明の植物の植物部分に関する。ここで、植物部分は、そのゲノム中に改変ＣＣＡ遺伝子を含む。

本発明はさらに、本発明の種子から植物を成長させ、植物に種子を有する果実を生産させ、果実を収穫し、そしてそれらの種子を抽出することを含む種子生産のための方法に関する。種子の生産は、自家受粉によって、または任意選択で本発明の植物でもある別の植物と交配することによって適切に行われる。そのように生産された種子は、ＴＬＳを有するプラス鎖ＲＮＡウイルス、特にトバモウイルス属のウイルス、より具体的にはＴｏＢＲＦＶに抵抗性を有する植物に成長する能力を有する。

本発明はさらに、雑種種子、および第１の親植物を第２の親植物と交配し、得られた雑種種子を収穫することを含む、前記雑種種子を生産する方法に関する。ここで、第１の親植物および／または第２の親植物は本発明の改変ＣＣＡ遺伝子を含む本発明の植物である。本雑種種子が成長して得られる雑種植物は本発明のＣＣＡ遺伝子を含み、ＴＬＳを有するプラス鎖ＲＮＡウイルス、特にトバモウイルス属のウイルス、より具体的にＴｏＢＲＦＶに対して耐性を有する、本発明の植物でもある。

本発明は、ＴＬＳを有するプラス鎖ＲＮＡウイルス、特にトバモウイルス属のウイルス、より具体的にはＴｏＢＲＦＶに対して抵抗性である植物を生産する方法に関し、該方法は、ＣＣＡ遺伝子に抵抗性につながる改変を導入することを含む。該方法は、ＣＣＡ遺伝子のコード配列および／またはプロモーター配列における欠失、置換、または挿入の導入を含む。このような改変の導入は、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）などの化合物を使用する、または、ＵＶ照射、高速中性子照射、またはその他の照射技術などの物理的手段を使用する、突然変異誘発アプローチによって行うことができる。

改変の導入は、相同組換え、オリゴヌクレオチドベースの変異導入、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはクラスター化規則的散在型短パリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）システムによる標的ゲノム編集を含む、より具体的な標的アプローチを使用して行うこともできる。

本発明の改変ＣＣＡ遺伝子の導入はまた、前記改変ＣＣＡ遺伝子を含む植物、例えば、ＮＣＩＭＢ４３５１１またはＮＣＩＭＢ４３５１２として寄託された植物から、またはその後代から、またはＴＬＳを有するプラス鎖ＲＮＡウイルス、特にトバモウイルス属のウイルス、より具体的にはＴｏＢＲＦＶに耐性があり、改変ＣＣＡ遺伝子が同定された別の植物から、の遺伝子移入によって行うことができる。交配および選択、戻し交雑、組換え選択などの育種方法、または抵抗性植物から感受性植物への遺伝子配列の移入をもたらす他の育種方法を使用することができる。抵抗性植物は、同じ種のものでも、異なる種および／または野生種のものでもよい。種間の交雑における困難は、胚救済などの当技術分野で知られている技術によって克服することができ、またはシスジェネシスを適用することができる。寄託物の後代は、その寄託物の有性的または栄養的子孫であり得、それは自殖および／または交配することができ、寄託物の後代がまだその寄託物の改変ＣＣＡ遺伝子を含む限り、Ｆ１、Ｆ２、またはそれ以降の世代であり得る。そのような方法によって生産された植物もまた、本発明の一部である。

一実施形態では、改変ＣＣＡ遺伝子は、Ｓ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ種の植物からＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍに遺伝子移入される。他の実施形態では、改変ＣＣＡ遺伝子は、改変ＣＣＡ遺伝子を含むＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物から、改変ＣＣＡ遺伝子を欠くＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物、または、任意に異なるＣＣＡにおける異なる改変を含むＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物に遺伝子移入される。

性的に不適合である植物間で配列を導入するために使用されるトランスジェニック技術はまた、改変ＣＣＡ遺伝子をある種から別の種に導入することによって、本発明の植物を生産するために使用され得る。適切に使用することができる技術は、アグロバクテリウム媒介形質転換法の使用など、当業者に知られている一般的な植物形質転換技術を含む。

本発明はまた、
ａ）本発明の改変ＣＣＡ遺伝子を含む本発明の植物を他の植物と交配すること；
ｂ）任意に、ステップａ）の結果として生じた植物を自殖および／または交配する１回以上のラウンドを実行して、さらなる世代の集団を取得すること；
ｃ）ステップａ）の交配から生じる集団から、またはステップｂ）のさらなる世代の集団から、本明細書で定義される改変ＣＣＡ遺伝子を含む、ＴＬＳを有するプラス鎖ＲＮＡウイルス、特にＴｏＢＲＦＶに抵抗性を有する植物を選択すること、
を含む、ＴＬＳを有するプラス鎖ＲＮＡウイルス、特にＴｏＢＲＦＶに抵抗性のある植物を生産するための方法に関する。

本発明はまた、
ａ）本発明の改変ＣＣＡ遺伝子を含む本発明の第１の親植物を、本発明の改変ＣＣＡ遺伝子を含まない他の植物である、またはＣＣＡ遺伝子に異なる改変を含む他の植物である、第２の親植物と交配すること；
ｂ）ステップａ）の結果として生じた植物を少なくとも３世代にわたって第２の親植物と戻し交雑すること；
ｃ）３代またはそれ以上の戻し交配集団から、少なくともステップａ）の第１の親植物の改変ＣＣＡ遺伝子を含む植物を選択すること、
を含む、ＴＬＳを有するプラス鎖ＲＮＡウイルス、特にＴｏＢＲＦＶに抵抗性のある植物を生産するための方法に関する。

本発明はさらに、
ａ）本発明の改変ＣＣＡ遺伝子を含む植物を、Ｆ１後代を生産するための他の所望の形質を含む第２の植物と交配させること；
ｂ）任意に、Ｆ１で、ウイルス耐性およびその他の望ましい形質を含む植物を選択すること；
ｃ）任意に選択されたＦ１後代を親の１つと少なくとも３世代交配し、戻し交雑後代を生産すること；
ｄ）ウイルス抵抗性および他の所望の形質を含む戻し交雑後代を選択すること；および
ｅ）任意にステップｃ）およびｄ）を連続して１回以上繰り返して、ウイルス耐性および他の所望の形質を含む選択された４番目以上の戻し交雑後代を生産すること、
を含む、ＴＬＳを有するプラス鎖ＲＮＡウイルス、特にＴｏＢＲＦＶに抵抗性のある植物に他の所望の形質を導入する方法を提供する。

任意に、交配または戻し交雑のステップの後に自殖ステップが実行される。あるいは、ウイルス抵抗性および他の所望の形質を含む植物の選択は、方法のいかなる交配または自殖の後に行うことができる。他の所望の形質は、以下の群：細菌、真菌またはウイルス性疾患に対する抵抗性、昆虫または害虫抵抗性、発芽の改善、植物のサイズ、植物の種類、貯蔵寿命の改善、水ストレスおよび熱ストレス耐性、および雄性不稔性、から選択できるが、これらに限定されない。本発明は、本方法によって生産された植物およびそれから得られた果実を含む。

本発明はさらに、組織培養を使用する、または栄養繁殖を使用することによる、本発明の改変ＣＣＡ遺伝子を含む、ＴＬＳを有するプラス鎖ＲＮＡウイルス、特にトバモウイルス、より具体的にはＴｏＢＲＦＶに対して抵抗性がある植物の生産方法に関する。

本発明は、本発明の改変ＣＣＡ遺伝子を含む、ＴＬＳを有するプラス鎖ＲＮＡウイルス、特にＴｏＢＲＦＶに対して抵抗性がある植物を同定するための方法に関し、該同定は、配列番号１のＣＣＡ遺伝子またはその相同配列における改変の存在を決定すること、および改変を含む植物が、ＴＬＳを有するプラス鎖ＲＮＡウイルス、特にトバモウイルス、およびより具体的には、ＴｏＢＲＦＶに対して抵抗性であるかどうかを分析すること、を含む。ＣＣＡ遺伝子における改変の存在を決定することは、本明細書に記載の改変のいずれか、特に表４に示されるＳＮＰ改変を、その配列がその特定の改変を含むとして、そのような改変を同定するために設計されたマーカーを適切に使用することによる同定を含む。

本発明はさらに、ＴＬＳを有するプラス鎖ＲＮＡウイルス、特にＴｏＢＲＦＶに抵抗性のある植物を選択する方法に関し、該方法は、植物における本発明の改変ＣＣＡ遺伝子の同定、続いて該植物を、ＴＬＳを有するプラス鎖ＲＮＡウイルス、特にトバモウイルス、より具体的にはＴｏＢＲＦＶに抵抗性がある植物として選択することを含む。任意に、ウイルス抵抗性は、実施例１に記載されるようにバイオアッセイを実施することによって確認することができる。そのような方法によって得られる選択された植物もまた、本発明の一部である。

本発明はまた、本発明の植物を生産するのに適した繁殖材料、ここで、該繁殖材料は、有性生殖に適しており、特に、小胞子、花粉、子房、胚珠、胚嚢、または卵細胞から選択される、または栄養繁殖に適しており、特に挿し木、根、幹細胞、または原形質体から選択される、または再生可能な細胞の組織培養に適しており、特に葉、花粉、胚、子葉、胚軸、分裂組織細胞、根、根端、葯、花、種子および茎であり、該繁殖材料から生産された植物は、ＴＬＳを有するプラス鎖ＲＮＡウイルス、特にトバモウイルス、より具体的にはＴｏＢＲＦＶに対する抵抗性を提供する本発明の改変ＣＣＡ遺伝子を含む、に関する。本発明の植物は、繁殖材料の供給源として使用できる。再生可能な細胞を含む組織培養もまた、本発明の一部を形成する。

本発明はさらに、本発明の植物の細胞に関する。そのような細胞は、単離された形態または完全な植物の一部またはその一部のいずれかであり得るが、そのような細胞は本発明の改変ＣＣＡ遺伝子を含むので、依然として本発明の細胞を形成する。本発明の植物の各細胞は、本発明の改変ＣＣＡ遺伝子を保有している。本発明の細胞はまた、本発明の新しい植物に再生することができる再生可能な細胞であり得る。

本発明はさらに、本発明の改変ＣＣＡ遺伝子を含む、本発明の植物の植物組織に関する。組織は、未分化組織またはすでに分化した組織であり得る。未分化組織は、例えば、茎頂、葯、花弁、または花粉であり、本発明の新しい植物に成長する新しい小植物体を得るためのマイクロプロパゲーションに使用できる。組織はまた、本発明の細胞から成長させることができる。

さらに、本発明は、本発明の植物、細胞、組織、または種子の後代に関する。この後代は、本発明の改変ＣＣＡ遺伝子を含む。そのような後代は、それ自体が植物、細胞、組織、または種子であり得る。後代は、特に、ＮＣＩＭＢ番号４３５１１またはＮＣＩＭＢ４３５１２の下で寄託された本発明の植物の後代であり得る。本明細書で使用される場合、後代は、本発明の植物との、それ自体または他の植物との交配からの最初およびすべてのさらなる後代を含む。後代であると決定された子孫は、本発明の改変ＣＣＡ遺伝子を含む。子孫は、寄託物の自殖および／またはさらなる交配によって得ることができる。後代はまた、栄養繁殖または他の形態の増殖によって得られる材料を含む。

本発明はまた、植物中の改変ＣＣＡ遺伝子を同定するためのマーカーに関する。このマーカーは、本明細書に記載されるようなＣＣＡ遺伝子における改変のいずれかを含み、それにより前記改変を同定することができる。本発明のマーカーは、特に、表４に示されるように、ＳＮＰ改変、すなわち多型を含み、そしてそれによって同定するのに適したマーカーである。改変ＣＣＡ遺伝子の同定のためのそのようなマーカーの使用もまた、本発明の一部である。

図１は、配列番号１（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍの野生型ＣＣＡ１遺伝子）および配列番号５（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍの野生型ＣＣＡ２遺伝子）のＣＤＳ配列を示す。 図２は、配列番号２（配列番号１によってコードされる野生型ＣＣＡ付加酵素）、配列番号７（配列番号５によってコードされる野生型ＣＣＡ付加酵素）、および配列番号８～１１（抵抗性につながる改変を伴うＣＣＡ付加酵素）のタンパク質配列を示す。ＣＣＡ１＿ＮＣＩＭＢ４３５１１およびＣＣＡ１＿ＮＣＩＭＢ４３５１２は配列番号８と同じ。ＣＣＡ１＿ＴＯ１は配列番号９と同じである。ＣＣＡ１＿Ｒａｍｙｌｅ Ｆ１およびＣＣＡ１＿Ｓｌ３＿００は配列番号２と同じである。ＣＣＡ２＿ＮＣＩＭＢ４３５１２、ＣＣＡ２＿Ｓｌ３＿００、ＣＣＡ２＿Ｒａｍｙｌｅ Ｆ１およびＣＣＡ２＿Ｅｎｄｅａｖｏｕｒ Ｆ１は配列番号７と同じである。ＴＯ１は配列番号１１と同じである。 同上 同上 同上 図３ａは、配列番号３（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍの野生型ＣＣＡ１遺伝子のプロモーター）、配列番号１７（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍの野生型ＣＣＡ２遺伝子のプロモーター）および配列番号１２－１６のプロモーター配列を示す。ＣＣＡ１＿ＮＣＩＭＢ４３５１１＿４３５１２は、配列番号１２と同じ配列である。図３ｂは、ヌクレオチド９１７の前のストレッチの代替のアラインメントを示しており、このストレッチは、配列番号３と比較した場合、これらの配列のすべてにおける欠失を含む。 同上 同上 図４は、ＣＣＡ付加酵素のドメインを示す。

本発明は、例示のみを目的とする以下の実施例においてさらに例示される。実施例は、いかなる方法でも本発明を限定することを意図するものではない。実施例および本願では、図を参照する。

寄託
本発明の改変ＣＣＡ遺伝子を含むトマトＳｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍの種子は、２０１９年１１月７日に、ＮＣＩＭＢ Ｌｔｄ、Ｆｅｒｇｕｓｏｎ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ、Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ Ｅｓｔａｔｅ、Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ、Ａｂｅｒｄｅｅｎ ＡＢ２１ ９ＹＡ、ＵＫに受託番号ＮＣＩＭＢ４３５１１およびＮＣＩＭＢ４３５１２で寄託された。

実施例１
Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍのＴｏＢＲＦＶ耐性のバイオアッセイ
１つまたは両方のＣＣＡ遺伝子に改変があるＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ系統が、ＴｏＢＲＦＶバイオアッセイで観察された。抵抗性対照として、３つのＳ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍソースが含まれていた。感受性対照として、エンデバーＦ１およびラミールＦ１を使用した。

試験する系統の種子を標準的な苗トレイに播種し、播種の４週間後に系統ごとに１０本の苗に接種した。接種材料は、ＴｏＢＲＦＶに感染したトマトの葉をセライトと混合した０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）で粉砕することによって調製した。接種材料で葉を優しくこする前に、植物にカーボランダム粉末をまぶした。症状のスコアリングは、接種後１９日目に表２に従って行った。

バイオアッセイの結果を表３に示す。接種した１０本の苗の平均スコアを示す。ＴＯ３１３は、ＮＣＩＭＢ４３５１１のＣＣＡ遺伝子型を持つ系統とＮＣＩＭＢ４３５１２のＣＣＡ遺伝子型を持つ系統の間の交雑種である。「ＣＣＡ遺伝子型」は、参照された寄託物のように、系統がＣＣＡ１およびＣＣＡ２の配列を有することを意味する。

実施例２
ＴｏＢＲＦＶ耐性につながるＣＣＡ遺伝子の改変の同定。
ＴｏＢＲＦＶ耐性のために分離されたさまざまなＳｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ集団は、ＴｏＢＲＦＶ耐性に寄与する可能性が高い４つの潜在的な遺伝子のみを含む１１番染色体上の小さな領域に細かくマッピングされた。これらの集団の開発に使用された抵抗性および感受性系統の背景については、全ゲノム配列が社内で利用可能であった。したがって、その領域に対してＳＮＰ呼び出しアプローチが実行された。これは、配列を相互に比較することにより、領域内の固有の多型が識別されたことを意味する。

関心のある領域の遺伝子の中には、ＣＣＡ１およびＣＣＡ２と呼ばれる２つのＣＣＡ遺伝子があった。ＣＣＡ１は完全なＣＣＡ遺伝子であり、感受性および抵抗性材料の間にさまざまな多型が見られたが、それらはすべて、ＣＣＡ付加酵素の必須ドメインと活性部位を含むタンパク質につながった。しかし、ＣＣＡ２遺伝子にはさまざまな多型も含まれていたが、感受性材料を含むすべての系統で、ＣＣＡ２遺伝子には早期停止コドンがあり、ＣＣＡ付加酵素のすべての必須活性部位を含まなくなった切断型タンパク質が生成された。コードされたタンパク質は、ポリＡ＿ｐｏｌ＿Ｃ末端領域のようなドメイン内で切り詰められ、その結果、このドメインの３つの活性部位のうち最初の部位のみがＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍのＣＣＡ２遺伝子に存在する（図４）。

異なる抵抗性系統は、異なる多型を有することが観察された。多くの多型が非保存的なアミノ酸変化をもたらし、その多型を表４に示す。

さらに、ＴｏＢＲＦＶ抵抗性の存在がＣＣＡ１遺伝子のプロモーターの欠失と相関していることが見出された。プロモーターに欠失があったすべての状況において、この欠失は少なくとも配列ＡＴＡＴＴＴＡＴＴＴ（配列番号４；表１）を含んでいたが、欠失はまた、配列番号４の単なる欠失に加えて、数ヌクレオチド以上、例えば１～１０ヌクレオチド以上を有し得た。ある場合には、例えば、欠失は、配列番号１８によって表される配列、または配列番号１９によって表される配列を含み、これらは両方とも配列番号４を含むことが見出された。

プロモーターの欠失はＴＡＴＡリッチ領域に存在していたため、プロモーターのＴＡＴＡボックスの欠失であると考えられた。

表現型と遺伝子型の分離における相関関係の分析を通じて、プロモーターの改変および／またはコード配列の改変であり得る、ＣＣＡ１遺伝子の改変および／またはＣＣＡ２遺伝子の改変であるＣＣＡ遺伝子の改変が、抵抗性Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物のＴｏＢＲＦＶ抵抗性の原因であると決定された。

実施例３
ＴＬＳを有するプラス鎖ＲＮＡウイルスに対する抵抗性を得るためのＣＣＡ遺伝子の改変
ＴＬＳを有するプラス鎖ＲＮＡウイルスに対する抵抗性が必要とされる目的の植物の種子、例えば、ＴｏＢＲＦＶ、ＴｏＭＶ、またはＴＭＶなどのトバモウイルスに対する抵抗性に改変が導入される。改変は、ＥＭＳ処理などの突然変異誘発、放射線手段、またはＣＲＩＳＰＲなどの特定の標的アプローチによって導入される。ＥＭＳなどの非標的化アプローチが使用される場合、これはＴＩＬＬＩＮＧなどの識別技術と組み合わされる。このようにして、突然変異誘発および標的修飾手段の両方について、ＣＣＡ遺伝子の改変を生成および同定することができる。当業者は、目的の植物のゲノムに改変を導入するためのこれらの手段に精通している。

次に、改変された種子が発芽し、植物が成長し、それらを交配または自殖させてＭ２種子を生成する。続いて、その種の１つまたは複数のＣＣＡ遺伝子の野生型配列との比較に基づいて、ＣＣＡ遺伝子の改変を同定するために植物スクリーニングが実施される。例えば、Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍの場合、配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号１７との比較を行うことができる。当業者は、特定の遺伝子の突然変異を同定するためのＴＩＬＬＩＮＧ（McCallum et. al. (2000) Nature Biotechnology, 18:455-457）、およびとりわけＤＮＡ配列決定などのヌクレオチド変化を同定するための技術に精通している。

改変されたＣＣＡ遺伝子を有する植物は、ホモ接合性であるか、または自殖、交配、または当業者によく知られている倍加半数体技術の使用によってホモ接合性にされる。次に、ＣＣＡ遺伝子の改変に基づいて同定および選択された植物を、ＴＬＳを有するプラス鎖ＲＮＡウイルスに対する抵抗性、例えば、ＴｏＢＲＦＶ、ＴｏＭＶ、またはＴＭＶなどのトバモウイルスに対する抵抗性について試験することができる。この方法で生産、同定、選択された植物は、ＣＣＡ遺伝子の１つまたは複数の改変の結果としてウイルス抵抗性を有することが確認される。

Claims (23)

1. ＣＣＡ付加酵素をコードする改変ＣＣＡ遺伝子であって、改変ＣＣＡ遺伝子は、ＴＬＳを有するプラス鎖ＲＮＡウイルスに対する抵抗性をもたらし、改変ＣＣＡ遺伝子は：
   －配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１に示される、ＣＣＡ付加酵素をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子；
   －配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、または配列番号１６を含む、プロモーター配列を含む遺伝子；
   －配列番号２または配列番号７と比較した場合に、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換、または挿入を有するＣＣＡ付加酵素をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子；
   －配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１と比較した場合、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換、または挿入を有するＣＣＡ付加酵素をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子；
   －配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＣＡ付加酵素をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子；および
   －配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、または配列番号１６に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するプロモーター配列を含む遺伝子、
   からなる群から選択される、改変ＣＣＡ遺伝子。
2. 少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換、または挿入が、コードされたＣＣＡ付加酵素の保存されたドメインまたは活性部位に存在する、請求項１に記載の改変ＣＣＡ遺伝子。
3. プロモーター配列の改変を含み、プロモーター配列が配列番号３を含み、特にプロモーター配列の調節配列の改変を含み、改変が特に欠失を含む、請求項１に記載の改変ＣＣＡ遺伝子。
4. １つのＣＣＡ遺伝子における２つ以上の改変の組み合わせ、特にプロモーター配列における改変およびコード配列における改変の組み合わせを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の改変ＣＣＡ遺伝子。
5. 配列番号８に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＣＡ付加酵素が、Ｎ５３５Ｄ置換、Ｒ５５３Ｓ置換、またはＫ５７９Ｎ置換の少なくとも１つを含む；配列番号９に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＣＡ付加酵素が、Ｋ４５０Ｅ置換、Ｒ５５３Ｓ置換、またはＫ５７９Ｎ置換の少なくとも１つを含む；配列番号１０に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＣＡ付加酵素が、Ｋ３１６Ｎ置換またはＡ３１７Ｖ置換の少なくとも１つを含む；配列番号１１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＣＡ付加酵素は、少なくともＣ２１１Ｒ置換を含む；または、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＣＡ付加酵素が、相同配列の対応する位置にこれらの置換のいずれか１つを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の改変ＣＣＡ遺伝子。
6. 請求項１～５のいずれか一項に記載の改変ＣＣＡ遺伝子を含む植物。
7. ＴＬＳを有するプラス鎖ＲＮＡウイルス、好ましくはトバモウイルス、最も好ましくはＴｏＢＲＦＶに抵抗性である、請求項６に記載の植物。
8. ナス科の植物、好ましくはソラナム・リコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）種の植物、である、請求項６または７に記載の植物。
9. 植物が２つの改変ＣＣＡ遺伝子を含む、請求項８に記載のソラナム・リコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）植物。
10. 改変ＣＣＡ遺伝子が、その代表的な種子が寄託番号４３５１１またはＮＣＩＭＢ４３５１２でＮＣＩＭＢに寄託されたソラナム・リコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）植物のゲノムに含まれる、請求項８または９に記載のソラナム・リコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）植物。
11. 種子であって、該種子から成長した植物が、請求項１～５のいずれか一項に記載の改変ＣＣＡ遺伝子を含む、種子。
12. 改変されたＣＣＡ遺伝子を同定するためのマーカーであって、マーカーが：
    －配列番号１の９４８位のＡからＴ ＳＮＰ、
    －配列番号１の９５０位のＣからＴ ＳＮＰ、
    －配列番号１の１３４８位のＡからＧ ＳＮＰ、
    －配列番号１の１６０３位のＡからＧ ＳＮＰ、
    －配列番号１の１６５９位のＡからＴ ＳＮＰ、
    －配列番号１の１７３７位のＧからＴ ＳＮＰ、
    －配列番号５の６３１位のＴからＣ ＳＮＰ、および
    －配列番号４を含む配列番号３の欠失、
    からなる群から選択される改変を検出するか、または、
    マーカーが、配列番号１または配列番号３または配列番号５に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する相同配列の対応する位置の改変を検出する、
    マーカー。
13. ソラナム・リコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）植物におけるＴｏＢＲＦＶ抵抗性の同定、および／またはＴｏＢＲＦＶ抵抗性ソラナム・リコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）植物の選択のための、請求項１２に記載のマーカーの使用。
14. ＣＣＡ遺伝子に改変を導入することを含む、ＴｏＢＲＦＶ抵抗性ソラナム・リコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）植物を生産するための方法であって、改変を含むＣＣＡ遺伝子は、請求項１～５のいずれか一項に記載されるものである、方法。
15. ＣＣＡ遺伝子における改変の存在を同定すること、任意に植物をＴｏＢＲＦＶ抵抗性について試験すること、および前記改変を含む植物をＴｏＢＲＦＶ抵抗性植物として選択することを含む、ＴｏＢＲＦＶ抵抗性ソラナム・リコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）植物を選択するための方法。
16. 請求項１２に記載のマーカーを使用することによって識別が行われる、請求項１５に記載の方法。
17. ＴＬＳを含むプラス鎖ＲＮＡウイルスに抵抗性のある植物の生産方法であって：
    ａ）請求項６～１０のいずれか一項に記載の改変ＣＣＡ遺伝子を含む第１の親植物を第２の親植物と交配すること；
    ｂ）任意に、ステップａ）の交配から生じる植物の自殖および／または交配の１回以上のラウンドを実行して、さらなる世代の個体群を取得すること；
    ｃ）ステップａ）の交配から生じる植物から、またはステップｂ）のさらなる世代の集団から、改変ＣＣＡ遺伝子を含む植物を選択すること、ここで、選択された植物は、ＴＬＳを含むプラス鎖ＲＮＡウイルスに抵抗性である、
    を含む、方法。
18. ＴｏＢＲＦＶに抵抗性のあるソラナム・リコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）植物の生産方法であって：
    ａ）請求項８～１０のいずれか一項に記載の改変ＣＣＡ遺伝子を含む第１の親植物を第２の親植物と交配すること；
    ｂ）任意に、ステップａ）の交配から生じる植物の自殖および／または交配の１回以上のラウンドを実行して、さらなる世代の個体群を取得すること；
    ｃ）ステップａ）の交配から生じる植物から、またはステップｂ）のさらなる世代の集団から、改変ＣＣＡ遺伝子を含む植物を選択し、ここで、選択された植物は、ＴｏＢＲＦＶに抵抗性である、
    を含む、方法。
19. 前記第２の親植物もまた、改変ＣＣＡ遺伝子を含む、請求項１７または１８に記載の方法。
20. ＣＣＡ遺伝子の改変を含む植物の選択が、請求項１２に記載のマーカーを使用することによって行われる、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の方法。
21. ＴｏＢＲＦＶに抵抗性のある植物が表現型的に選択される、特にＴｏＢＲＦＶ耐性のバイオアッセイを使用することにより選択される、請求項１８または１９に記載の方法。
22. 請求項６～１０のいずれかに記載の植物が、ＮＣＩＭＢ受託番号４３５１１またはＮＣＩＭＢ４３５１２に基づいて寄託された種子から成長した植物、またはその植物の後代である、請求項１７～２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 第１の親植物を第２の親植物と交配し、得られたハイブリッド種子を収穫することを含むハイブリッド種子の生産方法であって、第１の親植物および／または第２の親植物が、請求項１～５のいずれか一項に記載の改変ＣＣＡ遺伝子を含み、該改変ＣＣＡ遺伝子の存在が、ハイブリッド種子から成長する植物においてＴｏＢＲＦＶ抵抗性をもたらす、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

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