JP2023527925A - トマトの植物におけるＴｏＢＲＦＶに対する耐性 - Google Patents
トマトの植物におけるＴｏＢＲＦＶに対する耐性 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、そのゲノム中に、該ＱＴＬを欠く対応する植物に関して、トマトブラウンルゴースフルーツウイルスに対する改善された耐性を植物に付与するＱＴＬを含み、該ＱＴＬが、Ｓ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍから遺伝子移入され、配列番号１０２及び１１５を有するマーカーによって区切られた染色体領域内で、ＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０（配列番号１）及び配列番号１０１を有するＳＮＰ又は染色体１１上で区切られた染色体領域内で、第９染色体上に見出されるＳｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物に関する。このＱＴＬは、種子ＬＶＳＴＢＲＦＶＲＥＳ２ ＮＣＩＭＢ受託番号４３５９１の植物のゲノム中に存在するものから選択され得る。ＱＴＬは、好ましくは、第９又は第１１染色体上の異なるＳＮＰの定義された対立遺伝子によって特徴付けられる。また、本発明は、改善された耐性を有するこれらの植物の一部、ならびに子孫に対して、改善された耐性を他の遺伝的背景において導入するためのこれらの植物の使用、ならびにトマトブラウンルゴースフルーツウイルスに対する増加した葉及び／又は果実耐性を有するトマト植物又は種子を得るための異なる方法に関する。
Description
本発明は、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍとしても知られるＳｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ（トマト）の植物における、トバモウイルスであるトマトブラウンルゴースフルーツウイルス（ＴｏＢＲＦＶ、以前はＴＢＲＦＶと略された）に対する耐性に関する。より具体的には、本発明は、トマトブラウンルゴースフルーツウイルスに対する耐性を導く遺伝的決定因子を含むトマト植物及び果実に関する。本発明によれば、耐性は、Ｓ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍから第９染色体又は第１１染色体上のＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物のゲノムに遺伝子移入されたＤＮＡ配列又はＱＴＬによって提供される。第９染色体上の遺伝子移入されたＱＴＬは、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物のゲノム中にホモ接合性又はヘテロ接合性に存在することができる。第１１染色体上の遺伝子移入されたＱＴＬは、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物のゲノム中にホモ接合的に存在することが好ましい。本発明は、さらに、前記ＤＮＡ配列に連結されたマーカー、及びＤＮＡ配列又はＱＴＬを同定又は選択し、かつそのような耐性を有する植物を同定又は選択するためのそのようなマーカーの使用に関する。本発明はまた、そのような植物の種子及び子孫、ならびにそのような植物を得るための繁殖材料、ならびにこれらの植物の異なる用途に関する。
栽培及び商業形態のトマトはすべて、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ Ｍｉｌｌｅｒと最も頻繁に呼ばれる種に属する。Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎは非常に大きく多様なＳｏｌａｎａｃｅａｅ科内の比較的小さな属であり、コショウ、タバコ、タマゴを含む約９０属からなると考えられている。Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ属は２つの亜属、すなわち、市販のトマトと容易に交配できる種を含むエスクレントム複合体と、かなり困難な交配をする種を含むペルビアン複合体に分けられた（Stevens, M., and Rick, C. M. 1986）。Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ Ｍｉｌｌｅｒは作物としての価値から世界中に広く普及している。栽培されたトマトの正確な起源はまだ不明であるが、それはエクアドル、ペルー、ガラパゴス諸島出身で、初期にはアズテック諸島とインク諸島が７００年にもわたって栽培した米州からのものと思われる。メキシコは家畜化の場所であり、最も初期の導入源であったと思われる。チェリートマト（Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ ｖａｒ ｃｅｒａｓｉｆｏｒｍｅ）は現代の栽培形態の直接の祖先であると推定される。
トマトはその果実のために栽培され、生鮮市場又は加工製品として広く使用されている。トマトは、農作物として、環境条件が経済的に実行可能な収量の生産を可能にする限り、商業的に栽培される。生鮮市場のトマトの大半は、熟したブドウと熟した緑色の成熟期に手で収穫される。生鮮市場のトマトは年間を通じて入手可能である。トマトの加工は、ほとんどが機械的に収穫され、缶詰トマト、トマトジュース、トマトソース、ピューレ、ペースト、さらにはカチュップなど、様々な形で使用されている。
トマトは通常は単純な二倍体で、１２対の分化した染色体を有する。しかしながら、倍数体トマトも本発明の一部である。栽培トマトは自家受粉がほとんどである。トマトの花は雌雄同体である。商業栽培品種は、最初に受粉させた。トマトでは雑種の活力が同定されているため、雑種は、より良い収量と植物特性の均一性を持つ農家の間でますます人気が高まることによって、開放受粉品種を置き換えている。トマトは、その広範な普及と高い価値のために、集中的に繁殖されてきた。このことは、このように幅広い種類のトマトが現在入手可能である理由を説明するものである。形は小型から大型まであり、オウトウ、プラム、ナシ、ブロック、丸、ビーフステーキなどがある。トマトは、収穫のために果実を成熟させるのに要する時間によってグループ分けされ、一般に、栽培品種は早期、中期、又は後期成熟であると考えられている。トマトはまた、植物の成長習性：決定的、半決定的、又は不決定的によって分類される。受粉が成功すれば、植物はまず葉を成長させ、次に成熟した花を果実にする傾向がある。すべての果実は、ほぼ同時に植物上で熟成する傾向がある。不確定なトマトは、ある種の葉を育てることから出発し、成長期を通じて葉と花をつくり続ける。これらの植物は、いつでも異なる成熟段階にあるトマト果実をもつ傾向がある。半決定型トマトは、決定型と不定型の間に表現型をもち、決定型より大きく成長する以外は、典型的な決定型である。トマト育種の最近の進展により、果実の色の幅が広くなった。標準的な赤熟色に加えて、トマトはクリームのような白色、ライムのような緑色、ピンク色、黄色、黄金色、オレンジ色、又は紫色であることができる。
雑種市販のトマト種子は、手受粉によって生産することができる。雄親の花粉を収穫し、手作業で雌近交系の柱頭表面に塗布する。手受粉の前後では、花は被覆されているので、昆虫は外来の花粉をもたらさず、混合物や不純物を生成しない。花は受粉果実を識別するために標識され、そこから種子が収穫される。
トマト植物の生産性には、ウイルス、真菌、細菌、線虫、昆虫など、様々な病原体が影響している。トマトは特に多くのウイルスに感受性があり、従ってウイルス耐性は農業上重要である。
トバモウイルスは、農業、特に世界中の野菜や観賞作物に深刻な損害を与える最も重要な植物ウイルスの一つである。トバモウイルスは、種子伝播だけでなく、機械的手段によっても容易に伝播される。トバモウイルスは、一般に、４つのタンパク質をコードする一本鎖の正のＲＮＡゲノムをカプシド化する約３００ｎｍの桿状粒子を特徴とする。トマトでは、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）とトマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）は、不規則な熟成（表面に黄色い斑点があり、表面下に褐色の斑点がある果実）などによって作物生産に重大な損害を与えるため、世界中の生産者が懸念している。しかしながら、数種類の遺伝子が長年にわたって植物育種家によって同定されており、ＴＭＶ及び／又はＴｏＭＶ耐性トマト品種が現在利用可能である。
過去数十年間、現代の不確定なトマト品種及び多くの確定トマト品種は、実際に、この遺伝子のＴｍ－２遺伝子又は好ましくはＴｍ－２２対立遺伝子を含んでおり、２０１４年以前に市販トマト（ＴｏＭＶ及びＴＭＶ）に影響を及ぼした既知のトバモウイルスのほとんどすべての品種に対して免疫を与えている。
２０１４年から２０１５年にかけて、ヨルダン及びイスラエルなど中東のトマト生産地域で、ウイルスの大発生が深刻になった。影響を受けたトマト品種の大部分はＴＭＶ及び／又はＴｏＭＶ耐性と考えられたが、依然として重篤な影響を受け、典型的なＴＭＶ／ＴｏＭＶ様症状を示した：葉状のものはＴＭＶ／ＴｏＭＶ症状と非常に類似していたが、果実症状は果実病変及び変形を伴うこのようなウイルスからの通常の症状よりもはるかに頻繁で重度であった。果実の品質は非常に悪く、市場性はなかった。Ｓａｌｅｍら（Arch.Virol. 161 (2), 503-506.2015）は、ヨルダンで感染した症候性植物の果実と葉からＲＮＡを抽出し，種々の試験を行い，その配列はＧｅｎＢａｎｋ登録番号に相当する新しいＴｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ種を同定した。ＫＴ３８３４７４（配列番号１１２）；Ｓａｌｅｍらは、このヨルダンウイルス：トマトブラウンルゴースフルーツウイルス（以前はＴＢＲＦＶ、現在はＴｏＢＲＦＶ）と命名することを提案した。他のＴｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ配列との比較から、ＴＭＶ又はＴｏＭＶではなく、実際にＴｏｂａｍｏｖｉｒｕｓであることが示された。ＴＭＶ及び／又はＴｏＭＶに対する耐性は、この新しいウイルスＴｏＢＲＦＶに対する耐性を付与しない。Ｌｕｒｉａら（PLoS One.2017; 12(1): e0170429）は同時にイスラエルのトマトに感染するイスラエルのトバモウイルスの完全ゲノムを単離し、配列決定した。これはＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｋｘ６１９４１８（ｉｄ ｎｏ：１１３以降）に相当する。このように、イスラエルとヨルダンのウイルス間には非常に高い配列同一性（９９％以上の配列同一性）が認められ、トマトブラウンルゴースフルーツウイルスの２種類の異なる分離株と結論づけられている。
最近では、ヨーロッパ、特にシチリア、ドイツ、オランダ、フランス、メキシコでウイルスが同定され、現在ではトマト作物に対する主要な世界的脅威と考えられている。同定された株は、ヨルダン株ではなく、本質的にイスラエル株であると思われる。
トマトブラウンルゴースフルーツウイルスに対する耐性を示すトマト植物の同定、及びトマトブラウンルゴースフルーツウイルスに対する耐性をもたらす遺伝的決定因子（以下、ＱＴＬ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｔｒａｉｔ Ｌｏｃｕｓ）とも呼ばれる）の局在及び同定は、本出版物において忍容性に言及されているが、最近ＷＯ２０１８／２１９９４１に記載されている。２つのＱＴＬ、すなわち、ＱＴＬ１及びＱＴＬ２は、それぞれ６番染色体及び第９染色体上に見出され、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍの背景にホモ接合的に存在する場合、ＴｏＢＲＦＶに感染した、又は感染しそうなトマト植物の果実において、独立に又は組み合わせて、改善された忍容性又は耐性を付与する。第３のＱＴＬであるＱＴＬ、ＱＴＬ３は第１１染色体上に見出され、ホモ接合体で存在する場合、ＴｏＢＲＦＶに感染した、又は感染しそうなトマト植物の葉において、改善された忍容性又は耐性を付与する。
これらのＱＴＬは、単独で又は組み合わせて、ＴｏＢＲＦＶに対する忍容性又は耐性を提供するが、本発明者らは、ほとんどの場合、トマト植物に対して十分に高いレベルの耐性を付与することができず、その結果、果実のかなりの部分が影響を受け、市場性がないことを立証した。さらに、これらのＱＴＬは、ホモ接合性に存在する場合に耐性を提供すると記載されている。第９染色体上のＱＴＬ２がＴｍ－２２遺伝子と同じ遺伝子座に存在する限り、組換えを伴わずに「一括して」伝播される領域において、そのような第９染色体上のＱＴＬは、したがって、Ｔｍ－２２遺伝子との組合せに適さない。
ＷＯ２０１９／１１０１３０及びＷＯ２０１９／１１０８２１は、Ｓ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍから遺伝子移入され、ＴｏＢＲＦＶに対する耐性又は忍容性を付与するとされる、染色体６、１１及び１２上の３つの異なるＱＴＬの同定を開示している。しかしながら、第１１染色体上のＱＴＬは、第１１染色体のほぼ全配列に対応する５５Ｍ塩基の領域を規定する２つのマーカーの間に位置するものとして記載されている。明確な記述がなければ、第１１染色体上のこのＱＴＬは遺伝子移入には使用できない。
ＷＯ２０２０／０１８７８３は、Ｓ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ由来のＳｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ耐性対立遺伝子を含み、関連するＴｏＢＲＦＶ耐性対立遺伝子も含む、トマト染色体１１上の遺伝的領域を開示している。両方の対立遺伝子は本明細書の開示に従って同じマーカーに関連しているため、特にＳｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍに既に耐性であるがＴｏＢＲＦＶに感受性のある植物においては、ＴｏＢＲＦＶ耐性のみの遺伝子移入は不可能である。
トバモウイルスは容易に制御されるわけではないが、耐性遺伝子の同定・改善による遺伝子改善により、また、ＴＭＶ及び／又はＴｏＭＶを制御するために現在利用可能な耐性遺伝子は、新しいトマトブラウンルゴースフルーツウイルスによる損傷に対して無用であるため、同定された忍容性又は耐性ＱＴＬは、必ずしも十分に効率的ではなく、十分に特性化されておらず、Ｔｍ－２２と組み合わせることができないため、この新しいトバモウイルスに対する耐性を同定する緊急の必要性がある。
本発明者らは、野生Ｓ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ植物におけるＴｏＢＲＦＶに対する耐性を同定し、この耐性をＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物に侵入させることができ、従って、耐性Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍトマトをＴｏＢＲＦＶに得ることができた。本発明の耐性は、異なるＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍの遺伝的背景に伝達可能な相加的量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）に連結された新たに発見された配列によって付与される。
新たに発見されたＱＴＬは、本質的には、ウイルスに感染したトマト植物の果実のレベルで、またウイルスに感染したトマト植物の葉のレベルで、第９染色体上のＱＴＬに対して、そして本質的には第１１染色体上のＱＴＬに対する感染植物の葉のレベルで、トマトブラウンルゴースフルーツウイルス（ＴｏＢＲＦＶ）に対して耐性を付与する。
したがって、本発明は、これらの遺伝子組換え配列（ここではＱＴＬとも呼ばれる）を提供し、ＴｏＢＲＦＶに感染したトマト植物の葉及び／又は果実のレベルでＴｏＢＲＦＶ耐性の表現型を付与する。
本発明は、商業的植物、系統及び雑種を含むＴｏＢＲＦＶに対する耐性を示すＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物、ならびにＴｏＢＲＦＶに対する耐性を示すＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物又は集団（生殖質）を産生又は同定する方法を提供する。本発明はまた、ＴｏＢＲＦＶに対する耐性に関与する本発明のＱＴＬに連結された分子遺伝マーカー、特に一塩基多型（ＳＮＰ）を開示する。このような分子マーカーの方法及び使用によって得られた植物もまた提供される。
さらに、上記の耐性は、異なる遺伝的背景、すなわち、種々のトマトに容易に移入可能であり、本発明はまた、表現型を付与するＱＴＬの移入又は移入を可能にする異なる方法にも及ぶ。
本発明はまた、ＴｏＢＲＦＶ耐性を付与するＱＴＬに関連するこれらのＳＮＰに関連する情報のいくつかの方法及び用途、とりわけ、ＴｏＢＲＦＶ耐性植物を同定するための方法及びこの耐性に関連するさらなる分子マーカーを同定するための方法、ならびにＴｏＢＲＦＶによって寄生された環境におけるトマト生産の収量を改善するための方法、ならびにトマト畑をＴｏＢＲＦＶ寄生から保護するための方法を提供する。
定義：
「耐性」という用語は、植物の害虫又は病原体に対する反応、及び野菜種子産業に対する非生物的ストレスを記述するための、ＩＳＦ（国際種子連盟）野菜及び装飾作物セクションによって定義される。具体的には、耐性とは、植物品種が、同様の環境条件下での感受性植物品種と比較して、特定の有害動植物又は病原体の成長及び発達、及び／又はそれらが引き起こす損傷を制限する能力を意味する。耐性のある品種は、病気の症状や、重い害虫や病原体の圧力下での損傷を示すことがある。２つのレベルの耐性が定義されている。
「耐性」という用語は、植物の害虫又は病原体に対する反応、及び野菜種子産業に対する非生物的ストレスを記述するための、ＩＳＦ（国際種子連盟）野菜及び装飾作物セクションによって定義される。具体的には、耐性とは、植物品種が、同様の環境条件下での感受性植物品種と比較して、特定の有害動植物又は病原体の成長及び発達、及び／又はそれらが引き起こす損傷を制限する能力を意味する。耐性のある品種は、病気の症状や、重い害虫や病原体の圧力下での損傷を示すことがある。２つのレベルの耐性が定義されている。
高耐性（ＨＲ）：感受性植物と比較した場合、特定の有害生物の成長及び／又は発生、及び／又は通常の有害生物の圧力下でそれが引き起こす損害を高度に制限する植物。しかし、これらの植物は、重い害虫の圧力下で、ある種の症状や損傷を示すことがある。
中間耐性（ＩＲ）：特定有害動植物の成長及び／又は発生を高度に制限する植物、及び／又はその原因となる損傷であるが、高耐性植物に比べてより広範囲の症状又は損傷を示す可能性がある植物。中間耐性植物は、同様の環境条件下及び／又は害虫圧下で栽培した場合でも、感受性植物に比べて、依然として重度の症状又は損傷を示さない。
「忍容性」という用語は、通常、植物が成長、外観及び収量に重大な影響を与えることなく非生物的ストレスに耐える能力を表すために用いられる。
しかしながら、文献及び特許において、この用語は、植物の表現型を示すためにも使用され、ここで、少なくともいくつかの培養条件下で、全身的又は局所的な感染、ウイルス増殖、少なくとも、該植物の細胞におけるウイルスゲノム配列の存在、及び／又はそれらのゲノム組込みが確立され得る、感染量のウイルスに植物が曝露されたときに、疾患－症状の少なくとも一部が存在しないままである。したがって、忍容性植物は症状発現に対して耐性であるが、無症状のウイルスキャリアである。ときには、病気の症状を引き起こさずに、植物の中にウイルス配列が存在したり、増殖したりすることもある。忍容性植物は、ウイルスに感染するが、一般に、ウイルスの増殖及び発達を少なくとも中程度に制限することができることを理解されたい。
このため、この定義による忍容性植物は、中間耐性植物によって最もよく特徴づけられる。
ＴｏＢＲＦＶの場合、葉耐性又は葉状の耐性により、葉上の疾患症状が、ＴｏＢＲＦＶの感染用量への当該植物の曝露時に、存在しないか、又はそれほど重要でない植物の表現型を意味する。
しかし、感染した植物には果実に病気の症状が現れることがある。
しかし、感染した植物には果実に病気の症状が現れることがある。
果実耐性とは、ＴｏＢＲＦＶの場合、ＴｏＢＲＦＶの感染用量への当該植物の曝露時に、果実上の疾患症状が存在しないか、又はそれほど重要でない植物の表現型を意味する。しかし、感染した植物の葉には病気の症状が現れることがある。
ＴｏＢＲＦＶ感染の葉の症状には、一般にモザイク、小葉の歪み、多くの場合、症状のような靴下が含まれる。ＴｏＢＲＦＶ感染の果実の症状には、一般に典型的な黄色の病変（変色）及び果実の変形がある。多くの場合、果物には「チョコレート・スポット」もある。
感受性：植物が特定の有害動植物や病原体の成長と発達を制限できないこと；感受性植物は、ウイルス感染に関連した有害な症状、すなわち、ＴｏＢＲＦＶ感染の場合の葉の損傷と果実の損傷を示す。
トマトブラウンルゴースフルーツウイルスに感受性のＳ．ｌｉｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物は、例えば、２０１５年のＳａｌｅｍらの出版物に記載されているように、市販品種Ｃａｎｄｅｌａである。ＴｏＢＲＦＶ感染地域で栽培されたトマトの市販品種はすべて、現在まで、すなわち、本発明以前に、ＴｏＢＲＦＶに感受性であるか、又はＰＣＴ出願ＷＯ２０１８／２１９９４１に記載されているＨＡＺＴＢＲＦＶＲＥＳ１の堆積種などの忍容性ＱＴＬを有する植物に対して十分に耐性ではない。
したがって、本発明の植物は、品種Ｃａｎｄｅｌａに関しては、ＴｏＢＲＦＶに対して、より一般的には、忍容性植物を含むＴｏＢＲＦＶ感染領域において、及びＨＡＺＴＢＲＦＶＲＥＳ１に関して、少なくとも改善された耐性又は忍容性を有する。ＨＡＺＴＢＲＦＶＲＥＳ１に対応する植物に対する改善された耐性は、実験セクションの実施例５で実証されている。
本明細書中で使用される場合、用語「子孫（offspring）」又は「子孫（progeny）」は、１以上の親植物又はその子孫からの栄養又は有性生殖からの子孫として生じる任意の植物を指す。例えば、子孫植物は、親植物のクローン化又は自指によって、又は２つの親植物と交配することによって得られ、自指ならびにＦ１又はＦ２、又はさらに他の世代を含む。Ｆ１とは、親から生産された第１世代の子供で、そのうちの少なくとも１つが形質の供与体として初めて使用される。一方、第２世代（Ｆ２）又はその後の世代（Ｆ３、Ｆ４など）の子供は、Ｆ１’、Ｆ２’などの自指から生産された試料である。したがって、Ｆ１は、２つの純系の両親間の交配から生じる雑種（純系は形質についてホモ接合である）であり、一方、Ｆ２は、Ｆ１雑種の自家受粉から生じる子孫であり（通常は）である。
本明細書中で使用される場合、用語「交配する」、「交配すること」、「他家受粉」又は「異種交配」は、１つの植物上の１つの花の花粉が、他の植物上の花の胚珠（柱頭）に（人工的に又は自然に）適用されるプロセスを指す。
本明細書中で使用される場合、用語「遺伝的決定因子」及び／又は「ＱＴＬ」は、生物学的機能に関連するＤＮＡの任意のセグメントを指す。したがって、ＱＴＬ及び／又は遺伝的決定因子は、遺伝子、コード配列及び／又はそれらの発現に必要な調節配列を含むが、これらに限定されない。ＱＴＬ及び／又は遺伝的決定因子はまた、例えば、他のタンパク質の認識配列を形成する非発現ＤＮＡセグメントを含み得る。
本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子型」は、個体細胞、細胞培養物、組織、生物（例えば、植物）、又は生物群の遺伝的構成を指す。
本明細書中で使用される場合、用語「接木」は、台木を切り目で接木する操作である。移植の主な動機は、疾患管理のための遺伝的又は化学的アプローチが利用できない場合、土壌媒介性の有害動植物及び病原体による損傷を回避することである。耐性台木に感受性切片を移植すると、品種を耐性を繁殖させる必要がなく、耐性品種を作ることができる。さらに、移植は、非生物的ストレスに対する忍容性を高め、収量を増加させ、より効率的な水及び栄養素の使用をもたらす可能性がある。
本明細書中で使用される場合、用語「ヘテロ接合体」は、少なくとも１つの座位に存在する異なる対立遺伝子（所定の遺伝子の形態、遺伝的決定因子又は配列）を有する二倍体又は倍数体の個々の細胞又は植物を指す。
本明細書中で使用される場合、用語「ヘテロ接合性」は、特定の遺伝子座における異なる対立遺伝子（所定の遺伝子の形態、遺伝的決定因子又は配列）の存在を指す。
本明細書中で使用される場合、「相同染色体」、又は「相同染色体」（又は相同染色体）とは、減数分裂中に互いに対合する１つの母方染色体及び１つの父方染色体のセットを指す。これらのコピーは同じ遺伝子座と同じセントロメア位置に同じタイプの遺伝子をもっているが、それらの塩基配列や対立遺伝子によって異なることがある。
本明細書中で使用される場合、用語「ホモ接合体」は、全ての相同染色体上の１つ以上の座位に同じ対立遺伝子を有する個体細胞又は植物を指す。
本明細書中で使用される場合、用語「ホモ接合性」とは、相同染色体セグメント中の１つ以上の遺伝子座における同一の対立遺伝子の存在を指す。
本明細書中で使用される場合、用語「雑種」は、１つ以上の遺伝子が異なる両親間の交配から生じる任意の個体の細胞、組織又は植物を指す。
本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子座」（複数：「遺伝子座」）は、遺伝的に定義されている任意の部位を指し、これは単一位置（ヌクレオチド）又は染色体領域であり得る。遺伝子座は、遺伝子、遺伝的決定因子、遺伝子の一部、又はＤＮＡ配列であってもよく、異なる配列によって占められてもよい。遺伝子座はまた、ＳＮＰ（一塩基多型）、いくつかのＳＮＰ、又は２つの隣接ＳＮＰによって定義され得る。
本明細書中で使用される場合、用語「台木」は、接木プロセスにおいて、切り目を受け入れることができる植物の下部である。
本明細書中で使用される場合、用語「接ぎ穂」は、移植プロセスにおいて台木上に移植可能な植物のより高い部分である。
本発明は、異なる倍数体レベルの植物、本質的に二倍体植物、並びに三倍体植物、四倍体植物等を包含する。
本発明の文脈では、ＤＮＡ鎖及び対立遺伝子は、Ｉｌｌｕｍｉｎａが開発したＴＯＰ／ＢＯＴ指定方法に従ってＴＯＰに設計される：（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｌｌｕｍｉｎａ．ｃｏｍ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｔｅｃｈｎｏｔｅｓ／ｔｅｃｈｎｏｔｅ ｔｏｐｂｏｔ．ｐｄｆ）．
本発明者らは、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物中に存在する場合、単独で又は組み合わせて、トマトブラウンルゴースフルーツウイルス（ＴｏＢＲＦＶ）に感染した、又は感染しそうなトマト植物の果実及び／又は葉において改善された耐性を提供するＱＴＬを同定した。
本発明者らは、第９染色体上の１つの主要なＱＴＬ（以下、ＱＴＬ９と称する）を同定し、これは、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍの背景に存在する場合にＴｏＢＲＦＶ感染、特に果実耐性に耐性を付与するものであり、第１１染色体上のもう１つのＱＴＬ（以下、ＱＴＬ１１と称する）は、ＴｏＢＲＦＶに対する耐性、特に葉耐性を付与するものであり、上述のようにＱＴＬ９と組み合わせることができる。
本発明による種子及び植物は、Ｓ．ｐｉｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍの野生植物、関心対象であるが他の種において表現型を示す移入パートナー、及びＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍの反復感受性親であるＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍの植物との間の最初の交配から得られ、耐性をＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍの遺伝的背景に移入する。
ホモ接合性ＱＴＬ９及びＱＴＬ１１を含み、ＬＶＳＴＢＲＦＶＲＥＳ２と呼ばれるこの最初の交配から得られた耐性Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物の種子は、２０２０年４月１日に受託番号ＮＣＩＭＢ ４３５９１の下でＮＣＩＭＢに寄託された。これらの堆積種子から成長した植物は、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍトマトであり、ＴｏＢＲＦＶに対する耐性、すなわち、あらゆる既知のＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物、特に商業的なＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物に関して、このウイルスに対する少なくとも改善された果実耐性を示す。
実施例で示されているように、本発明による植物の表現型は、ＴｏＢＲＦＶに対する忍容性、すなわち、果実耐性、すなわち、葉及び果実耐性の両方ではなく、耐性として最もよく特徴づけられ、忍容性は、非生物的ストレスに対してのみ適用可能である。忍容性が耐性又は中間耐性の特徴付けにも広く使用されている限り、本発明の植物は忍容性植物として特徴付けることもできる。以下では、ＴｏＢＲＦＶに対する耐性について言及するが、この表現型には忍容性表現型が含まれており、いくつかの文献で定義されているように、中等度の耐性も含まれている。
また、実施例４、５、及び８に示されているように、本発明に係るＴｏＢＲＦＶ耐性は、先行技術に開示されている忍容性／耐性とは異なるものであり、実際、実施例５は、本発明に係る耐性のレベルが、ＷＯ２０１８／２１９９４１に記載されている耐性のレベルよりも高いことを示している。さらに、実施例４は、本発明及びＷＯ２０１８／２１９９４１に従って、ＴｏＢＲＦＶ耐性に関与する配列が異なることを確認する。実施例８は、本発明によるＴｏＢＲＦＶ耐性が、ＷＯ２０２０／０１８７８３に開示された遺伝的決定因子に反して、ステンフィリウム耐性に関連せず、したがって、この耐性とは異なることを示す。
第１の態様によれば、本発明は、したがって、そのゲノム中に第９染色体上のＱＴＬ（以下、ＱＴＬ９と称する）及び／又は第１１染色体上のＱＴＬ（以下、ＱＴＬ１１と称する）を含み、感染の場合、特にＱＴＬ９の果実レベル及びＱＴＬ１１の葉レベルにおいて、ＴｏＢＲＦＶに対する改善された耐性を付与するＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物、ならびにそれらのゲノム中のＱＴＬ９及び／又はＱＴＬ１１を含むトマト植物の種子及び細胞に関する。耐性を付与する前記ＱＴＬは、最初、野生Ｓ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍから遺伝子移入され、従って、耐性ＱＴＬ、又はＱＴＬ９若しくはＱＴＬ１１、又は以下の記載における本発明のイントログレス配列と呼ばれる。本発明はまた、耐性を付与するこれらの遺伝子移入配列を含む、そのような植物又は種子の細胞に関する。
忍容性／耐性表現型は、実験セクション、特に実施例１に記載されているように、自然感染又は人工接種によって、最初の葉レベルで、又は果実レベルで試験し、スコア化することができる。
ＴｏＢＲＦＶに対する改善された耐性を付与するＱＴＬは、好ましくは、ＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０（配列番号１）及び配列番号１０１を有するＳＮＰによって区切られた染色体間隔又は領域内の第９染色体上に位置する。
本発明者らは、実際に、例のセクションにおいて、ＱＴＬ９に対応する、この領域内の遺伝子組換え配列が、関心のある表現型と共に遺伝することを実証した。
本発明によるＱＴＬ９及びＴｏＢＲＦＶに対する改善された耐性を付与することは、ＬＶＳＴＢＲＦＶＲＥＳ２の種子のゲノム中に存在するものから選択される。従って、ＱＴＬ９は、これらの寄託された種子のゲノム中に存在する。これらのＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍの種子の試料は、フランスの２６８００ Ｐｏｒｔｅｓ－ｌｅｓ－ＶａｌｅｎｃｅのＲｕｅ Ｌｏｕｉｓ ＳａｉｌｌａｎｔにあるＨＭ．Ｃｌａｕｓｅ Ｓ．Ａ．によって、特許手続きのための微生物（「ブダペスト条約」と産業、食品、海洋細菌のナショナルコレクション（ＮＣＩＭＢ）（ＮＣＩＭＢ，Ｌｔｄ，Ｆｅｒｇｕｓｏｎ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ Ｅｓｔａｔｅ，Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ ＡＢ２１ ９ＹＡ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ））２０２０年４月１日、アクセッション番号４３５９１として寄託された。このトマト種子の堆積物は、ＨＭ条項Ｓ．Ａ．、Ｒｕｅ Ｌｏｕｉｓ Ｓａｉｌｌａｎｔ，２６８００ Ｐｏｒｔｅｓ－ｌｅｓ－Ｖａｌｅｎｃｅ，Ｆｒａｎｃｅによって維持される。
ＴｏＢＲＦＶに対する改善された耐性を付与する本発明による他のＱＴＬは、好ましくは、染色体１１上、ＳＮＰ ＴＯ－０２０１２３７（配列番号１０２）及びＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９９２４２３２（配列番号１１５）、好ましくはＳＮＰ ＴＯ－０２０１２３７（配列番号１０２）及びＳＮＰ ＴＯ－０２０１２４１（配列番号１０６）によって区切られた染色体間隔又は領域内に位置する。本発明によるＱＴＬ１１は、ＱＴＬ９と組み合わせることができるＴｏＢＲＦＶに対する改善された耐性を付与するものであり、ＬＶＳＴＢＲＦＶＲＥＳ２、ＮＣＩＭＢ ４３５９１の種子のゲノム中に存在するものから選択される。ＱＴＬ１１は、実際に、ＬＶＳＴＢＲＦＶＲＥＳ２ ＮＣＩＭＢ受託番号４３５９１の種子のゲノム中に存在する。
ＳＮＰ（一塩基多型）又は本明細書で言及するマーカーに対応する特異的多型、ならびにＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍゲノム中のこれらのＳＮＰ又はマーカーのフランキング配列を、実験セクション（特にＱＴＬ９については表Ｇ及びＨ、ＱＴＬ１１については表Ｋを参照）及び付随する配列リストに示す。トマトゲノムのバージョン２．５０に関して、第９染色体及び第１１染色体上のそれらの位置、ならびにそれらの隣接配列も示されている。
この点において、定義上、ＳＮＰは、ゲノム中の単一ヌクレオチドを指し、それは、存在する対立遺伝子に依存して変動するが、隣接するヌクレオチドは同一であることに留意されたい。異なるＳＮＰの位置を明確に同定するために、それらの位置は、表Ｇ、Ｈ及びＫに、そのバージョン２．５０のトマトゲノム配列を参照することにより、及び配列番号により同定されるそれらの隣接配列を参照することにより示される。本願の特定のＳＮＰに関連する配列、例えば、ＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０の配列番号１において、配列内の１個のヌクレオチドのみが実際に多型に対応し、すなわち、配列番号１の２０１番目のヌクレオチドのみが、表Ｇに示すようにＡ又はＧであり得るＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０の多型位置に対応し、隣接配列は、ゲノム中のＳＮＰの位置決めのために示されるが、そのような多型の一部ではない。したがって、ＳＮＰマーカー又はこのＳＮＰの対立遺伝子の検出は、このマーカーの多型ヌクレオチドの検出を指し、すべての隣接配列が同一である必要はない。
同様に、明細書及び表Ｋで言及されている他のマーカー（厳密にはＳＮＰではない）は、単一ヌクレオチドの挿入を示すＩＮＤＥＬマーカーである。例えば、表ＫによるＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９６８４４４９（配列番号１１２）の９６８４４９位におけるマーカーＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９６８４４４９（配列番号１１２）については、９６８４４９位は対立遺伝子であり、すなわち、Ｔの挿入に対応するＣ又はＣＴであることを意味し、ＳＬ２．５０における「Ｃ」の位置は表Ｋに記載される９６８４４４９位である。対立遺伝子がこれらのＩＮＤＥＬマーカーの１つの位置のみに関係する限り、簡単にするために、言語拡張により、以下ではそれらをＳＮＰマーカーと呼ぶこともできる。
隣接配列、ＳＮＰ又はＩＮＤＥＬマーカー（以下のＳＮＰに同化される）によって同定されるゲノム又は染色体領域は、したがって、明確に定義され、あいまいではない。
２つのＳＮＰ Ｘ及びＹによって区切られたゲノム領域は、ゲノムのセクション、より具体的には染色体のセクションを指し、これら２つのＳＮＰの位置の間に位置し、好ましくは該ＳＮＰを含む。従って、この染色体領域のヌクレオチド配列は、ＳＮＰ Ｘに対応するヌクレオチドで始まり、ＳＮＰ Ｙに対応するヌクレオチドで終わる、すなわち、ＳＮＰは、本発明に従って、それらが区切る領域内に含まれる。
所定のゲノム領域における「Ｓ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ由来のイントログレス配列」により、この領域で見出されるゲノム配列は、Ｓ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍドナー、すなわち、イントログレッションパートナーにおいて見出される対応するゲノム配列と同じ遺伝子座であり、同じ遺伝子座においてＬＶＳＴＢＲＦＶＲＥＳ２（ＮＣＩＭＢ ４３５９１）において見出される対応するゲノム配列と同じ配列であることが理解されるべきである。「同じ配列」を有することにより、比較される２つの配列は、ゲノム領域の子孫への伝達中に起こり得る潜在的な点突然変異の例外と同一であること、すなわち、好ましくは１キロベースの長さで少なくとも９９％同一であることを意味する。
特定のゲノム領域が、同じ遺伝子座のＳ．ｐｉｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍドナーに見られる対応するゲノム領域と本発明の意味において同じ配列を有することは、もし前記ゲノム領域がＴｏＢＲＦＶに対する耐性を付与することができ、Ｓ．ｐｉｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ起源であるならば、結論づけられる。Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍの植物、種子又は細胞のゲノム中に遺伝子組み換え配列が存在することは、例えば、ＧＩＳＨ（遺伝的ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）によって示され得る。ＧＩＳＨは、ある種又は亜種から他の種へのクロマチン物質の移入を検出するための強力な技術である。ＧＩＳＨの利点は、移入過程が「移入ゲノムの写真」によって可視化されることである。この技術を用いることで、ゲノムの特定の領域がホモ接合又はヘテロ接合であるかどうかを、共優性である分子細胞遺伝学的マーカーの使用のために確立することも可能である。この技術により、目的の遺伝子がどの染色体に組み込まれているかを決定することも可能である。
本発明者らは、本発明のＴｏＢＲＦＶ耐性を付与するＱＴＬを、主に、上記の第９染色体及び１１の領域に沿った異なる遺伝子座、すなわち、ＱＴＬ９について配列番号１～１０１を有する１０１個のＳＮＰによって規定される１０１個の異なる遺伝子座、及びＱＴＬ１１について配列番号１０２～１１５を有する１４個のマーカーによって規定される１４個の異なる遺伝子座における、遺伝子移入ＱＴＬの代表的配列の存在を同定することによって同定し、マッピングした。これらのＳＮＰは、以下において、本発明のＳＮＰ、又はＱＴＬ９のための本発明の１０１ＳＮＰと称される。それらの中の好ましいＳＮＰは、配列番号１～１４を有する１４個のＳＮＰ；特に配列番号１、２、１０、１２及び１４を有するＳＮＰである。
したがって、耐性表現型を付与する遺伝子組換え配列又はＱＴＬの存在は、本発明の植物、種子又は細胞のゲノム中のこれらのＳＮＰマーカーに基づいて同定することができる。好ましくは、ＱＴＬ９については、遺伝子移入配列又はＱＴＬの存在は、配列番号１～１０１を有する１０１個のＳＮＰの１つによって、好ましくは１４個のＳＮＰ（ＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０（配列番号１）、ＴＯ－０２０１２２１（配列番号２）、ＴＯ－０２０１２２２（配列番号３）、ＴＯ－０２０１２２３（配列番号４）、ＴＯ－０２０１２２４（配列番号５）、ＴＯ－０２０１２２５（配列番号６）、ＴＯ－０２０１２２６（配列番号７）、ＴＯ－０２０１２２７（配列番号８）、ＴＯ－０２０１２２８（配列番号９）、ＴＯ－０２０１２２９（配列番号１０）、ＴＯ－０２０１２３０（配列番号１１）、ＴＯ－０２０１２３１（配列番号１２）、ＴＯ－０２０１２３２（配列番号１３）及びＴＯ－０２０１２３３（配列番号１４）を含む）のリストから選択されるＳＮＰ、より好ましくは５つのＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０、ＴＯ－０２０１２２１、ＴＯ－０２０１２２９、ＴＯ－０２０１２３１及びＴＯ－０２０１２３３のうちの１つによってトマト植物において同定又は特徴付けられる。本発明のＱＴＬ９は、例えば、ＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０又はＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２９によって同定又は特徴付けられ得る。
別の適切なＳＮＰは、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００及び１０１を有するものである。
好ましい実施形態によれば、ＱＴＬ９については、本発明のトマト植物、細胞又は種における遺伝子移入配列の存在は、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、又は少なくとも５つの前記１０１のＳＮＰマーカー、又は前記１４のＳＮＰマーカー、好ましくは、それらのうちの少なくとも１つはＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０又はＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２９によって同定可能である。例えば、ＴｏＢＲＦＶ耐性を付与するイントログレス配列の存在は、少なくとも２つのＳＮＰ、例えば、１つはＴＯ－０２０１２２９であり、もう１つは、配列番号１～１０１（配列番号１０を除く）を有するＳＮＰから選択された異なるＳＮＰであるハプロタイプの存在によって検出される。
本発明の耐性を付与するＱＴＬ又は遺伝子移入配列を表すこれらの分子マーカーの対立遺伝子は、本発明の１０１個のＳＮＰについて表Ｈの最後の列に報告される。上記の１４のＳＮＰマーカーについて、遺伝子移入されたＱＴＬを代表する対立遺伝子は、ＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２１の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２２の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２３の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２４の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２５の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２６の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２７の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２２８の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２２９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３０の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２３１の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１３２の対立遺伝子Ｇ及びＴＯ－０２０１３３の対立遺伝子Ｇである。
したがって、本発明によるトマト植物、細胞又は種子のゲノムにおけるＱＴＬの存在は、前記遺伝子座でＱＴＬを代表する配列を検出することによって、より好ましくは、トマトの耐性対立遺伝子の１つ又は複数を検出することによって、検出又は明らかにすることができる。例えば、ＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２１の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２２の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２３の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２４の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２５の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２６の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２７の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２２８の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２２９Ａ、ＴＯ－０２０１２３０の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２３１の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２３２の対立遺伝子Ｇ、及びＴＯ－０２０１２３３の対立遺伝子Ｇ、より好ましくは、ＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０の対立遺伝子Ｇ、配列番号ＴＯ－０２０１２２１の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３１の対立遺伝子Ｃ、又はＴＯ－０２０１２３３の対立遺伝子Ｇ、さらにより好ましくは、ＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０の対立遺伝子Ｇ及び／又はＴＯ－０２０１２２９の対立遺伝子Ａを検出することによる。
好ましい態様によれば、第９染色体、ＱＴＬ９上の本発明のＱＴＬは、少なくとも２個、好ましくは３個、好ましくは少なくとも５個の配列番号１～１０１を有するＳＮＰの耐性対立遺伝子、好ましくは少なくとも１個の検出された耐性対立遺伝子がＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０の対立遺伝子Ｇ及び／又はＴＯ－０２０１２２９の対立遺伝子Ａであることを検出することにより、トマト植物、細胞又は種子のゲノム中で検出される。
ＱＴＬ９は、隣接するＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０により一方の側で区切られた、又は隣接する第９染色体の染色体間隔上にあり、他方の側では配列番号１０１を有する隣接するＳＮＰマーカーにより区切られた、又は隣接する第９染色体間隔上にある。ＱＴＬ９が見出される第９染色体のより好ましい染色体間隔は、ＴＯ－０２０１２２０及びＴＯ－０２０１２３３によって区切られた間隔である。さらに好ましい間隔は、配列番号２０及びＴＯ－０２０１２３３を有するＳＮＰによって区切られた間、又は配列番号２２及びＴＯ－０２０１２３３を有するＳＮＰ間の間隔、又は配列番号２６及びＴＯ－０２０１２３３を有するＳＮＰ間の間隔、又は配列番号３０及びＴＯ－０２０１２３３を有するＳＮＰ間の間隔、又は配列番号３４及びＴＯ－０２０１２３３を有するＳＮＰ間の間隔、又は配列番号３８及びＴＯ－０２０１２２１及びＴＯ－０２０１２３３を有するＳＮＰ間の間隔、又は好ましくは、ＳＮＰＴＯ－０２０１２２１及びＴＯ－０２０１２３３間の間隔である。
本発明によるＱＴＬ１１は、好ましくは、配列番号１０２～１１５を有するマーカーのうちの１つによって、好ましくは、配列番号１０２～１１１を有するＳＮＰマーカーのうちの１つによって、好ましくは、ＴＯ－０２０１２３７（配列番号１０２）、ＴＯ－０２０１２３８（配列番号１０３）、ＴＯ－０２０１２３９（配列番号１０４）、ＴＯ－０２０１２４０（配列番号１０５）及びＴＯ－０２０１２４１（配列番号１０６）、ならびに／又はマーカーＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９６４４４９（配列番号１１２）、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９７９８９６（配列番号１１３）、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９８２３４０５（配列番号１１４）及びＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９９２４２３２（配列番号１１５）のうちの少なくとも１つによって検出される。好ましくは、このＱＴＬ１１の存在は、配列番号１０２～１１５を有するマーカーの耐性対立遺伝子の少なくとも１つ、好ましくは配列番号１０２～１１５を有するＳＮＰの耐性対立遺伝子の１つを検出することによって特徴付けることができる。好ましい実施形態によれば、ＱＴＬ１１の存在は、表Ｋの最後の列に開示されているように、配列番号１１２～１１５を有するマーカーの少なくとも１つの対立遺伝子ＣＴの検出によって特徴付けられる。ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９６８４４４９、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９７７９８９６の対立遺伝子ＡＴ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９８２３４０５の対立遺伝子Ｃ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９９２４２３２の対立遺伝子ＧＴ、ＴＯ－０２０１２３７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２３８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２４０の対立遺伝子Ａ及びＴＯ－０２０１２４１の対立遺伝子Ａ、好ましくはＴＯ－０２０１２３７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２３８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２４０の対立遺伝子Ａ及びＴＯ－０２０１２４１の対立遺伝子Ａの少なくとも１つによる。及び／又はＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９６８４４４９の対立遺伝子ＣＴ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９７７９８９６の対立遺伝子ＡＴ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９８２３４０５ の対立遺伝子Ｃ、及びＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９９２４２３２による。
したがって、ＱＴＬ１１の好ましいマーカーは、配列番号１０２～１１５（表Ｋ）を有するもの、あるいは配列番号１０２～１１１を有するもの、あるいはマーカーのリストＴＯ－０２０１２３７、ＴＯ－０２０１２３８、ＴＯ－０２０１２３９、ＴＯ－０２０１２４０、ＴＯ－０２０１２４１、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９６８４４４９、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９７７９８９６、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９８２３４０５及びＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９９２４２３２、あるいはマーカーのリストＴＯ－０２０１２３７、ＴＯ－０２０１２３８、ＴＯ－０２０１２３９、ＴＯ－０２０１２４０２及びＴＯ－０のリストマーカーＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９６８４４４９、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９７７９８９６、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９８２３４０５、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９９２４２３２である。好ましい耐性対立遺伝子は、これらの異なるリストに対応するものであり、表Ｋに示されており、これらのマーカー及び／又は耐性対立遺伝子のリストは、本発明の全ての異なる態様に適用可能である。
本発明のトマトＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物、細胞又は種子は、ＴｏＢＲＦＶ耐性を付与する本発明のＱＴＬ９、ＱＴＬ１１、又は遺伝子移入配列についてホモ接合性であり得る。しかしながら、本発明は、そのようなホモ接合植物、細胞又は種子に限定されない。実際、本発明者らはまた、このＱＴＬ９によって付与される耐性が相加的であり、本発明のＱＴＬ９をヘテロ接合性で有するそのような植物もまた、ＱＴＬをホモ接合性で含むが感受性植物のレベルを上回るレベルで、ＴｏＢＲＦＶ（実験セクション参照）に対して耐性であることを実証した。従って、本発明はまた、第９染色体上のそのゲノム中に、上記の本発明のＱＴＬ９、又は遺伝子移入配列をヘテロ接合性に有するトマトＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物、細胞、又は種子を包含する。
ＱＴＬ１１はまた、本発明のＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物、細胞又は種子中にホモ接合性又はヘテロ接合性で存在し得るが、耐性対立遺伝子が劣性であるため（この点に関しては実施例９を参照のこと）、ホモ接合性段階でＴｏＢＲＦＶ耐性を付与するだけである。ＱＴＬ９及びＱＴＬ１１のヘテロ接合又はホモ接合の存在は、独立して定義することができる。
好ましい態様によれば、本発明の植物、種子又は細胞は、ホモ接合性又はヘテロ接合性のＱＴＬ９、ならびにホモ接合性又はヘテロ接合性のいずれかで上記に定義されたＱＴＬ１１を含む。好ましい組み合わせは、両方ともホモ接合的に存在するＱＴＬ９及びＱＴＬ１１、ホモ接合的にＱＴＬ１１とヘテロ接合的に存在するＱＴＬ９、及びヘテロ接合的に存在するＱＴＬ１１である。
好ましくは、本発明によるＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物は、商業的な植物又は系統である。このような市販の植物又は系統もまた、ＴＭＶ（タバコモザイクウイルス）に対する耐性を付与するＴｍ－２遺伝子（対立遺伝子Ｔｍ－２又はＴｍ－２２（Ｔｍ－２ａとしても知られる））の存在に起因して、ＴｏＭＶ（トマトモザイクウイルス）に対する耐性を示すことが好ましい
本発明のこの態様による植物はまた、好ましくは、線虫耐性形質（Ｍｉ－１又はＭｉ－ｊ）、ならびにフサリウム及びベルチシリウム耐性、及びＴＹＬＣＶ耐性というさらなる特徴を有する。
本発明のこの態様による植物はまた、好ましくは、線虫耐性形質（Ｍｉ－１又はＭｉ－ｊ）、ならびにフサリウム及びベルチシリウム耐性、及びＴＹＬＣＶ耐性というさらなる特徴を有する。
本発明によれば、他の耐性又は忍容性も考えられる。
好ましい実施形態によれば、本発明の植物は、ペピノモザイクウイルス（ＰｅｐＭＶ）に耐性ではない。更に別の態様によれば、本発明のトマト植物はまた、ＰｅｐＭＶに耐性である。
さらに、本発明の商業的植物は、少なくとも１０グラム、好ましくは２５グラムの完全成熟、好ましくは少なくとも１００ｇの完全成熟、さらにより好ましくは少なくとも１５０ｇ又は少なくとも２００ｇの完全成熟である、適切な条件下で果実を生じる。さらに、植物当たりの果実数は、本発明のＱＴＬ９の存在によって本質的に影響を受けない。すなわち、本発明による植物の生産性は、同じ遺伝子型を有するが、前記ＱＴＬ９を欠く植物に対して２０％を超えて劣らない。本発明の植物、例えば、堆積種子から成長した植物は、従って、一般に、クラスター当たり少なくとも３個、好ましくは約４個のトマトを有し、これらの果実は、好ましくは１５０ｇ～１８０ｇの重量を有する。
さらに別の実施形態によれば、本発明の植物は、決定的、不定的、又は半不定的植物、又はその種子若しくは細胞であり、すなわち、決定的、不定的、又は半不定的成長習性に対応する。
決定型とは、まず葉を成長させ、受粉が成功すれば果実に成熟する花をつけるトマトのことである。すべての果実は、ほぼ同時に植物上で熟成する傾向がある。不確定なトマトは、ある種の葉を育てることから出発し、成長期を通じて葉と花をつくり続ける。これらの植物は、いつでも異なる成熟段階にあるトマト果実をもつ傾向がある。半決定型トマトは、決定型と不定型の間に表現型をもち、決定型より大きく成長する以外は、典型的な決定型である。
本発明はまた、本発明のＱＴＬ９をホモ接合性に有する植物と他のＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍとを交配することによって得られるＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍの雑種植物に関する。
本発明のＱＴＬ９は添加物であるため、上記の交配によって産生されたＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍの雑種植物はＴｏＢＲＦＶに対して耐性を有する。好ましくは、他のＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ交配パートナーは、本発明の前記ＱＴＬ９を欠いているが、ＷＯ２０１８／２１９９４１に記載されたＱＴＬの１つ、好ましくは、第９染色体上のＱＴＬ２又は染色体１１上のＱＴＬ３を含んでもよい。あるいは、他のＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ交配パートナーは、染色体１１上のＷＯ２０２０／０１８７８３、ＷＯ２０１９／１１０１３０及びＷＯ２０１９／１１０８２１に記載されたＱＴＬを、ＴｏＢＲＦＶ耐性を付与するものとして含み得る。
本発明のＱＴＬ９は添加物であるため、上記の交配によって産生されたＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍの雑種植物はＴｏＢＲＦＶに対して耐性を有する。好ましくは、他のＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ交配パートナーは、本発明の前記ＱＴＬ９を欠いているが、ＷＯ２０１８／２１９９４１に記載されたＱＴＬの１つ、好ましくは、第９染色体上のＱＴＬ２又は染色体１１上のＱＴＬ３を含んでもよい。あるいは、他のＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ交配パートナーは、染色体１１上のＷＯ２０２０／０１８７８３、ＷＯ２０１９／１１０１３０及びＷＯ２０１９／１１０８２１に記載されたＱＴＬを、ＴｏＢＲＦＶ耐性を付与するものとして含み得る。
従って、本発明はまた、開示されているように、ホモ接合性又はヘテロ接合性でＱＴＬ９、ならびにＷＯ２０１８／２１９９４１に開示されている第９染色体上のＱＴＬ２；ヘテロ接合；ＷＯ２０１８／２１９９４１に開示されているように、染色体１１上のＱＴＬ３は、好ましくはホモ接合を含むトマト植物、種子又は細胞に関する。ＷＯ２０２０／０１８７８３、ＷＯ２０１９／１１０１３０及びＷＯ２０１９／１１０８２１に開示されているように、染色体１１上の１つ以上のＱＴＬは、ホモ接合性又はヘテロ接合性である。
さらに、本発明の発明者らが、ＴｏＢＲＦＶ耐性を付与する、以下においてＱＴＬ１１と呼ばれる、染色体１１上のＱＴＬを同定した限り、このＱＴＬ１１は、本発明のＱＴＬ９と組み合わせて存在し得る。第１１染色体上のこのＱＴＬはまた、ＱＴＬ９を提供したＳ．ｐｉｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍの遺伝子移入パートナーからの遺伝子移入配列にも対応する。ＱＴＬ１１に対応する遺伝子移入配列は、ＳＮＰ ＴＯ－０２０１２３７（配列番号１０２）及びＳＮＰ ＴＯ－０２０１２４１（配列番号１０６）によって区切られた領域内の第１１染色体上に見出される。本出願の実験セクションで実証されているように、このＱＴＬ１１は、トマト植物のゲノム中に存在する場合、特にＱＴＬ９と組み合わせて存在する場合、該ＱＴＬ１１を欠く同一植物に関してＴｏＢＲＦＶに対する耐性の増加を提供する。従って、各ＱＴＬは独立してＴｏＢＲＦＶ耐性を付与するが、ＱＴＬの組み合わせは、１つのＱＴＬによって提供される抵抗に関して増加した耐性、すなわち、少なくとも累積的であり、特に、耐性は、本質的に、ＱＴＬ１１については葉レベルであり、ＱＴＬ９については果実レベルであるので、増大した耐性を提供する。従って、本発明は、ＴｏＢＲＦＶ耐性、好ましくは葉耐性を付与するために、ホモ接合性又はヘテロ接合性のいずれかであるが、好ましくはホモ接合性である、ゲノム中にこのＱＴＬ１１を含むトマト植物、細胞及び種子にも向けられる。好ましくは、このＱＴＬ１１は、本発明のＱＴＬ９と組み合わせて見出されるべきである。
従って、本発明はまた、ＱＴＬ９及びＱＴＬ１１を含むトマト植物に関し、従って、該ＱＴＬ１１を欠く対応する植物に関して、植物のＴｏＢＲＦＶに対する耐性レベルを増加させ；本発明はまた、その細胞及び種子を包含する。
さらに、上記に開示したように、ＴｏＭＶ及びＴＭＶ耐性を提供する耐性遺伝子の存在は、特に不確定な商業的品種に対して有利である。本発明のいくつかの好ましい態様によれば、ＴｏＭＶ及びＴＭＶ耐性の両方を付与するＴｍ－２２遺伝子（Ｔｍ－２２又はＴｍ－２（２）としても知られる）は、従って、本発明のＱＴＬ９、本発明のＱＴＬ１１、又はＱＴＬ９及びＱＴＬ１１と組み合わされる。しかしながら、本発明者らは、Ｔｍ－２２遺伝子及びＱＴＬ９が、組換え事象を起こしにくい「一括して」伝達される領域において、第９染色体の同じアーム上に位置することに留意した。したがって、同じ第９染色体上のＴｍ－２２遺伝子とＱＴＬ９を組み合わせることは日常的には困難である。しかしながら、Ｔｍ－２２遺伝子及びＱＴＬ９の両方が優性又は少なくとも累積的であるため、Ｔｍ－２２遺伝子及びＱＴＬ９は、有利には、第９染色体の２つの異なる相同体上に見出され、すなわち、それらは両方ともヘテロ接合性で存在する。いずれにせよ、Ｔｍ－２２遺伝子は、好ましくはヘテロ接合的に存在する。
一実施形態によれば、本発明は、従って、本発明のＱＴＬ９を含む植物、細胞又は種子、ヘテロ接合体、ならびにＴｍ－２２遺伝子又はその類似体に向けられ、ＴｏＭＶ及びＴＭＶ耐性を提供する。Ｔｍ－２２遺伝子は当業者に周知であり、この遺伝子に適した配列は、タンパク質配列についてＳｏｌｙｃ０９ｇ０１８２２０、又はＧｅｎｅＢａｎｋ ＡＦ５３６２０１、及びＡＡＱ１０７３６と呼ばれる。バリアント及びアナログは、本発明の分野において周知である。好ましい実施形態によれば、本発明のＴｍ－２２遺伝子は、ＡＡＱ１０７３６（配列番号１１４）において報告された８６１アミノ酸配列を有するタンパク質、又はこの配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有し、Ｔｍ－２２活性、すなわちＴｏＭＶ株のウイルスＲＮＡ複製を阻害する能力を示すタンパク質をコードする遺伝子である。
好ましい態様によれば、本発明のトマト植物、細胞又は種子は、従って、ヘテロ接合性の両方であるＱＴＬ９及びＴｍ－２２遺伝子又はそのバリアント、ならびにホモ接合性又はヘテロ接合性の本発明のＱＴＬ１１を含み、これらの組み合わせは、ＴｏＢＲＦＶ、ＴｏＭＶ及びＴＭＶ耐性を提供する。必要に応じて、さらに耐性を加えてもよい。
出願ＰＣＴ／ＩＢ２０１９／００６７４において同じ出願人の名前で開示されているように、Ｔｍ－１遺伝子の存在もまた、ＴｏＢＲＦＶ耐性を改善し得る。従って、本発明による植物、細胞又は種子は、有利には、Ｔｍ－１遺伝子も含む。Ｔｍ－１遺伝子は、とりわけ石橋ら、２００７年に発表された（ウイルスＲＮＡ複製の阻害剤は植物耐性遺伝子によりコードされる）と定義される。ＰＮＡＳ ８月２１日、２００７年８月２１日、１０４（３４）１３８３３－１３８３８；好ましくは、「Ｔｍ－１遺伝子」とは、文献で報告されたＴｍ－１活性を有するタンパク質をコードする遺伝子配列、すなわち、野生型ＴｏＭＶ株Ｔｍ－１感受性、例えば、本稿で開示された株ＴｏＭＶ－Ｌのウイルス複製を阻害する能力を指す。好ましい態様によれば、本発明のＴｍ－１遺伝子は、配列番号１１５（ＮＣＢＩ ＢＡ Ｆ７５７２４）に対応する石橋らに報告された７５４アミノ酸配列を有するタンパク質、又はこの配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％の配列同一性を有し、石橋ら、２００７年に報告されたＴｍ－１活性、すなわち野生型Ｔｍ－１感受性ＴｏＭＶ株のウイルスＲＮＡ複製を阻害する能力を示すタンパク質をコードする遺伝子である。
したがって、本発明は、本発明のＱＴＬ９、及び潜在的にはＷＯ２０１８／２１９９４１に定義されるように、染色体１１上のＴｍ－２２遺伝子及びＱＴＬ１１、又はＱＴＬ３に加えて、ホモ接合性又はヘテロ接合性のいずれかでＴｍ－１遺伝子を含むトマト植物、細胞又は種子も包含する。したがって、本発明は、本発明のＱＴＬ１１に加えて、好ましくはホモ接合的に、又はヘテロ接合的に、Ｔｍ－１遺伝子を含むトマト植物、細胞又は種子も包含する。
さらに別の態様によれば、本発明の植物は、接木プロセスにおいて、割木又は台木として使用される。接木は、コオロギなどの作物に長年使用されてきたプロセスであるが、トマトにはごく最近になってから使用されるようになった。移植は、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａのようなテルル病原体又はある種の線虫に対するあるレベルの耐性を提供するために使用され得る。従って、グレーティングは、栽培される植物又は品種と寄生された土壌との間の接触を防止することを意図している。移植片又ははさみとして使用される対象品種、場合によりＦ１雑種を、根株として使用される耐性植物に移植する。耐性のある台木は健康であり、土壌から病気から分離した移植片の正常な供給源となる。
上述のように、本発明は、改善されたＴｏＢＲＦＶ耐性を示すＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物、ならびにそれらの植物、及びこれらの植物又は種子の細胞、又はそれらのゲノム中の耐性ＱＴＬ９及び／又はＱＴＬ１１を含む他の植物部分、Ｓ．ｐｉｍｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍから移入された、及び該ＱＴＬを含む本発明の植物の子孫に向けられる。
子孫は、本発明の植物との交配からの第１、第２、及びそれ以上の子孫を包含し、ここで、交配は、それ自体との交配又は他の植物との交配を含む。本発明による植物又は種子は、受託番号ＮＣＩＭＢ ４３５９１の下でＮＣＩＭＢに寄託された寄託種子ＬＶＳＴＢＲＦＶＲＥＳ２から成長した植物の子孫又は子孫であり得る。寄託された種子から育てられた植物は、ＱＴＬ１１と同様に、改善された表現型を付与する本発明のＱＴＬ９のホモ接合体であり；従って、それらは、それらのゲノムにおいて、第９及び第１１染色体の相同体の各々に関心のあるＱＴＬを有する。それらは、交差、自己フィング、及び／又は戻し交配によって、これらの配列を別のバックグラウンドに移すために使用することができる。
また、本発明は、ＬＶＳＴＢＲＦＶＲＥＳ２（ＮＣＩＭＢ ４３５９１）の寄託された種子、及び関心のある表現型を付与するＱＴＬ９及びＱＴＬ１１をホモ接合的に含む、これらの種子のうちの１つから成長した植物に対するものである。これらの種子は植物品種に対応せず、本発明のＱＴＬを除くほとんどの遺伝子についてホモ接合性ではなく、従って、それらの表現型は、本発明のＴｏＢＲＦＶ耐性／忍容性を除いて、増殖中に固定されず；本発明のＴｏＢＲＦＶ耐性を除いて、それらの表現型形質の大部分は、増殖中に分離する。
また、本発明は、改善された表現型を付与する可能性のある、改善された表現型を付与するＱＴＬ９及び／又はＱＴＬ１１を含む、上記の植物又は種子、すなわち、改善された表現型を付与する配列を、潜在的に組み合わせて含む、本発明は、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物からのＱＴＬｓ、その代表的種子を、ＮＣＩＭＢ受託ＮＣＩＭＢ－４３５９１の下で、別のＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ遺伝的バックグラウンドに、例えば、該植物を第２のトマト植物親と交配し、目的の表現型に関与するＱＴＬ９及び／又はＱＴＬ１１を有する植物の選択により、沈着させた、植物又は種子を、上記定義のように、提供する。このような交配では、ＱＴＬ９とＱＴＬ１１を、適切であれば、転送することができる。
本発明の種子又は植物は、異なる方法によって得ることができ、本質的に生物学的な方法によってのみ得られるものではないことに留意されたい。
このような態様によれば、本発明は、トマト植物又は種子、好ましくは、そのゲノムにおける１以上の突然変異を含み得る、非天然トマト植物又は種子に関し、それらは、植物に、例えば、寄託番号ＮＣＩＭＢ ４３５９１の下で、代表的な試料がＮＣＩＭＢに寄託された植物のゲノム中に存在するような突然変異である、トマトブラウンルゴースフルーツウイルスに対する果実及び／又は葉の耐性を提供する。
別の実施形態では、本発明は、トマトのゲノムに１つ以上の突然変異を有する植物又は種子を得る方法に関する。この方法は、植物に、トマトブラウンルゴースフルーツウイルスに対する果実及び／又は葉の耐性を提供する。このような方法は、実施例７に例示されており、以下を含むことができる：
ａ）変異原性物質で修飾したトマトのＭ０種子をＭ１種子にすること；
ｂ）このようにして得られたＭ１種子から成長している植物で、Ｍ１植物を得ること；
ｃ）Ｍ１植物の自家受精によるＭ２種子を生産すること；及び
ｄ）ステップｂ）及びｃ）ｎ回繰り返して、Ｍ１＋ｎ種子を得ること。
ａ）変異原性物質で修飾したトマトのＭ０種子をＭ１種子にすること；
ｂ）このようにして得られたＭ１種子から成長している植物で、Ｍ１植物を得ること；
ｃ）Ｍ１植物の自家受精によるＭ２種子を生産すること；及び
ｄ）ステップｂ）及びｃ）ｎ回繰り返して、Ｍ１＋ｎ種子を得ること。
Ｍ１＋ｎの種子を植物に育て、ＴｏＢＲＦＶ感染に供する。生き残った植物、又はＴｏＢＲＦＶ感染のより軽度の症状を有する植物は、１世代以上増殖させながら、ＴｏＢＲＦＶに対する果実及び／又は葉の耐性について選択し続ける。
この方法では、工程ａ）のＭ１種子は、ＥＭＳ突然変異誘発のような化学的突然変異誘発によって得ることができる。他の化学的突然変異誘発剤としては、限定されるものではないが、ジエチル硫酸、エチレンイミン、プロパンスルトン、Ｎ－メチル－Ｎ－ニトロソウレタン、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－メチル尿素、Ｎ－エチル－Ｎ－ニトロソウレア、及びアジ化ナトリウムが挙げられる。
あるいは、突然変異は、例えば、Ｘ線、高速中性子、ＵＶ照射から選択される照射によって誘発される。
本発明の別の実施形態において、突然変異は、遺伝子工学によって誘導される。このような突然変異には、ＴｏＢＲＦＶの果実及び／又は葉の耐性を付与する配列の統合、ならびにＴｏＢＲＦＶの果実及び／又は葉の耐性又は忍容性を付与する代替配列による居住配列の置換も含まれる。好ましくは、突然変異は、上記のように、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物の相同配列の置換におけるＱＴＬ９及び／又はＱＴＬ１１の統合である。さらにより好ましくは、突然変異は、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍゲノムの第９染色体上のＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０（配列番号１）及びＳＮＰ ＴＯ－０２０１２３３（配列番号１４）内に含まれる配列、又はその断片を、寄託番号ＮＣＩＭＢ ４３５９１の下でＮＣＩＭＢに寄託された植物のゲノム中に存在する第９染色体上の相同配列により置換することであり、その配列又は断片は、ＴｏＢＲＦＶに対する耐性を付与する。さらに別の実施形態によれば、突然変異は、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍゲノムの第１１染色体上のＳＮＰ ＴＯ－０２０１２３７（配列番号１０２）及びＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９９２４２３２（配列番号１１５）内に含まれる配列、又はＳＮＰ ＴＯ－０２０１２３７及びＳＮＰ ＴＯ－０２０１２４１内に含まれる配列のような断片の、寄託番号ＮＣＩＭＢ ４３５９１の下で植物のゲノム中に存在する第１１染色体上の相同配列による置換であり、ここで、その配列又は断片は、ホモ接合性で存在する場合、ＴｏＢＲＦＶに対する耐性を付与する。
使用可能な遺伝子工学的手段は、種々の新しい技術である「新品種改善技術」と呼ばれる技術の使用を含み、これは、遺伝的変異を介して植物に新たな特性を生み出すために開発及び／又は使用され、標的突然変異誘発、新規遺伝子の標的導入又は遺伝子サイレンシング（ＲｄＤＭ）を目的とする。このような新しい繁殖技術の例は、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）技術（ＺＦＮ－１、ＺＦＮ－２及びＺＦＮ－３、米国特許第９，１４５，５６５号参照）、オリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発（ＯＤＭ）、シスジェネシス及びイントラジェネシス、接ぎ木（ＧＭ台木上で）、逆育種、アグロ浸潤（アグロ浸潤「センス・ストリクト」、アグロ接種、フローラルディップ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ、米国特許第８，５８６，３６３号及び第９，１８１，５３５号参照）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（米国特許第８，６９７，３５９号；第８，７７１，９４５号；第８，７９５，９６５号；第８，８６５，４０６号；第８，８７１，４４５号；第８，８８９，３５６号；第８，８９５，３０８号；第８，９０６，６１６号；第８，９３２，８１４号；第８，９４５，８３９号；第８，９９３，２３３号；及び第８，９９９，６４１号参照）、操作されたメガヌクレアーゼの再操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡガイドゲノム編集（Gao et al., Nature Biotechnology (2016)）、及び合成ゲノミクスの使用によって促進される標的配列変化である。標的ゲノム編集の主要な部分は、新たな育種技術のための別の呼称であり、修飾が意図されているゲノム中の選択された位置でＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導するための応用である。ＤＳＢの直接修復は標的ゲノムの編集を可能にする。このような用途は、突然変異（例えば、標的突然変異又は正確な天然遺伝子編集）を生成するため、ならびに遺伝子（例えば、シス遺伝子、遺伝子内又はトランスジーン）の正確な挿入を生成するために利用することができる。突然変異に至る応用は、しばしば、ＳＤＮ１、ＳＤＮ２及びＳＤＮ３のような部位特異的ヌクレアーゼ（ＳＤＮ）技術として同定される。ＳＤＮ１については、結果は標的化された非特異的遺伝子欠失突然変異である：ＤＮＡＤＳＢの位置は正確に選択されるが、宿主細胞によるＤＮＡ修復はランダムであり、小さなヌクレオチド欠失、付加又は置換をもたらす。ＳＤＮ２については、ＳＤＮを用いて、標的化ＤＳＢを生成し、ＤＳＢを修復するために、ＤＮＡ修復鋳型（１個又は数個のヌクレオチド変化を除き、標的化ＤＳＢ ＤＮＡ配列と同一の短いＤＮＡ配列）を用いる。これは、目的の所望の遺伝子における標的化及び所定の点突然変異をもたらす。ＳＤＮ３に関しては、ＳＤＮは、新しいＤＮＡ配列（例えば、遺伝子）を含むＤＮＡ修復鋳型と共に使用される。この技術の成果は、そのＤＮＡ配列の植物ゲノムへの組込みである。ＳＤＮ３の使用を例示する最も可能性の高い用途は、選択されたゲノム位置におけるシスジェニック、遺伝子内、又はトランスジェニック発現カセットの挿入である。これらの各技術の完全な説明は、２０１１年に欧州委員会の共同研究センター（ＪＲＣ）将来技術研究所によって作成された「新しい植物育種技術－最先端の技術と商業開発の見通し」のレポートに見出すことができる。
本本発明によれば、ＴｏＢＲＦＶに対する耐性又は中程度の耐性は、本発明の耐性植物の市場に出さない果実の重要な減少に対応する。特に、本明細書に開示される耐性植物は、果実の少なくとも７０％が成熟時に市場に出回る、すなわち、変色斑点がなく、褐色化した萼がなく、粗い表面で小さすぎず、褐色の壊死斑点がないようなトマトを実らせる。好ましくは、少なくとも８０％の果実は成熟時に市場性を維持し、好ましくは少なくとも９０％の果実が二重感染の場合でも市場性を維持する。
上述のように、本発明の植物は、ＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０及び配列番号１０１を有するＳＮＰによって区切られたこの染色体の領域における第９染色体上の遺伝子移入配列の存在、及び／又はＳＮＰ ＴＯ－０２０１２３７及びＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９９２４２３２、好ましくはＳＮＰ ＴＯ－０２０１２３７及びＳＮＰ ＴＯ－０２０１２４１によって区切られたこの染色体の領域における第１１染色体上の遺伝子移入配列の存在によって特徴付けられる。しかし、Ｓ．ｐｉｍｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ由来の遺伝子内配列は、これらの境界又は隣接配列を越えて見出される可能性がある。同様に、イントログレッシングされた配列は上述の領域内に見出されるが、領域全体は必ずしもイントログレッシングされた配列で構成されているとは限らない。本発明者らがＱＴＬ９について同定し、使用したマーカーを考慮すると、ＴｏＢＲＦＶ耐性を付与する遺伝子移入配列は、好ましくは、本発明の植物、種子又は細胞のゲノムにおいて、表Ｈに記載の配列番号１～１０１を有する１０１個のＳＮＰを包含する１０１遺伝子座のうちの少なくとも１つ以上、より好ましくは、以下の１４個の遺伝子座：第９染色体上のＴＯ－０２０１２２０を包含する遺伝子座、ＴＯ－０２０１２２１を包含する遺伝子座、ＴＯ－０２０１２２２を包含する遺伝子座、ＴＯ－０２０１２２３を包含する遺伝子座、ＴＯ－０２０１２２４を包含する遺伝子座、ＴＯ－０２０１２２５を包含する遺伝子座、ＴＯ－０２０１２２６を包含する遺伝子座、ＴＯ－０２０１２２７を包含する遺伝子座、ＴＯ－０２０１２２８を包含する遺伝子座、ＴＯ－０２０１２２９を包含する遺伝子座、ＴＯ－０２０１２３０を包含する遺伝子座、ＴＯ－０２０１２３１を包含する遺伝子座、ＴＯ－０２０１２３２を包含する遺伝子座、及びＴＯ－０２０１２３３を包含する遺伝子座のうちの少なくとも１つに見出すことができる。
「ＳＮＰマーカーを包含する遺伝子座」とは、ＳＮＰの多型の周囲の配列、好ましくはＳＮＰの上流約２メガ塩基から下流約２メガ塩基、好ましくは１メガ塩基、好ましくはＳＮＰの上流及び下流約０．５メガ塩基まで延在する配列を意味する。
これらの遺伝子座におけるイントログレス配列は、ＮＩＣＭＢ４３５９１に対応する種子ＬＶＳＴＢＲＦＶＲＥＳ２の対応する遺伝子座に見出される配列である。
ＱＴＬ１１については、ホモ接合性で存在する場合にＴｏＢＲＦＶ耐性を付与するイントログレス配列は、好ましくは、本発明の植物、種子又は細胞のゲノムにおいて、表Ｋに記載された配列番号１０２～１１５を有する１４のマーカーを包含する１４の遺伝子座のうちの少なくとも１つ以上が見出され、これらの遺伝子座におけるイントログレス配列は、ＮＩＣＭＢ４３５９１に対応する種子ＬＶＳＴＢＲＦＶＲＥＳ２の対応する遺伝子座において見出されるものである。
本発明は、別の態様において、上記の本発明の種子又は植物から得られる可能性が高い任意の植物、及びそのような植物の植物部分にも関し、最も好ましくは、外植片、穂木、挿し木、種子、果実、根、台木、花粉、胚珠、胚、プロトプラスト、葉、葯、茎、葉柄、子葉、花、根の先端、胚軸、及びその他の植物の一部であって、前記植物、外植片、挿し穂、挿し木、種子、果実、根、台木、花粉、胚珠、胚、プロトプラスト、葉、葯、茎、葉柄、子葉、花、根の先端、胚軸、及び／又は植物部分は、本発明の第１の態様による種子又は植物、すなわち目的とするＱＴＬ９及び／又はＱＴＬ１１を有する、ゲノム内でホモ接合又はヘテロ接合である。これらの植物の部分、とりわけ外植片、穂木、挿し穂、種子、果実、根、台木、花粉、胚珠、胚、プロトプラスト、葉、葯、茎、葉柄、子葉、花、根端又は胚軸は、それらのゲノムにおいて、目的の表現型、すなわち、ＴｏＢＲＦＶに対する耐性、特にＱＴＬ９に対する果実耐性、及びＱＴＬ１１に対する葉面耐性を付与するＱＴＬ９及び／又はＱＴＬ１１を含む。
好ましい実施形態によれば、本発明は、上述のように種子に向けられ、本発明の第１の態様に従い植物に成長し、従って、耐性ＱＴＬ９、又はＱＴＬ１１、又は上述のように遺伝子移入された配列の存在により、ＴｏＢＲＦＶ感染に対して耐性を示す。
本発明のこの態様において言及されるＱＴＬ９及びＱＴＬ１１は、本発明の植物の文脈において上述されるものである。
植物部分は、有利には、ＱＴＬ９に加えて、又はその代わりに、上記定義のＱＴＬ１１を含むことができる。
本発明の第１の態様に関連して定義されるＱＴＬの異なる特徴は、発明のこの態様に準用される。したがって、ＱＴＬ９は、好ましくは、寄託材料ＬＶＳＴＢＲＦＶＲＥＳ２（ＮＣＩＭＢ受託番号４３５９１）に対応する植物のゲノム中に存在するものから選択される。それは有利には、表ＨのＳＮＰの耐性対立遺伝子の少なくとも１つの存在によって特徴付けられ、好ましくは、ＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２１の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２２の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２３の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２４の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２５の対立遺伝子Ａ、対立遺伝子Ａの存在による ＴＯ－０２０１２２６の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２７の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２２８の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２２９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３０の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２３１の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２３２の対立遺伝子Ｇ及び／又は対立遺伝子ＴＯ－０２０１３３のＧ、より好ましくはＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０の対立遺伝子Ｇ、ＳＥＱ ＩＤ ＴＯ－０２０１２２１の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３１の対立遺伝子Ｃ又はＴＯ－０２０１２３３の対立遺伝子Ｇ、さらにより好ましくは、ＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０の対立遺伝子Ｇ及び／又はＴＯ－０２０１２２９の対立遺伝子Ａによる。
ＱＴＬ１１は、好ましくは、寄託材料ＬＶＳＴＢＲＦＶＲＥＳ２（ＮＣＩＭＢ受託番号４３５９１）に対応する植物のゲノム中に存在するものから選択される。それは有利には、表Ｋのマーカーの耐性対立遺伝子の少なくとも１つの存在によって特徴付けられ、好ましくは、ＴＯ－０２０１２３７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２３８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２４０の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２４１の対立遺伝子Ａ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９６８４４４９の対立遺伝子ＣＴ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９７７９８９６の対立遺伝子ＡＴ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９８２３４０５の対立遺伝子Ｃ及びＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９９２４２３２の対立遺伝子ＧＴにより、例えば、ＴＯ－０２０１２３７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２３８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２４０の対立遺伝子Ａ、及びＴＯ－０２０１２４１の対立遺伝子Ａの少なくとも１つの存在による。
本発明はまた、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物の細胞にも関心のある表現型をＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物、潜在的にはＱＴＬ９及びＱＴＬ１１に独立に付与する本発明のＱＴＬ９又はＱＴＬ１１をそれらのゲノム中に含むように、本発明はＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物の細胞に関する。ＱＴＬ９は、ＱＴＬ１１と同様に、本発明のフレームにおいて既に定義されているものであり、本発明の前述の態様による植物及び種子に関して既に開示されているのと同じ特徴及び好ましい実施形態によって特徴付けられる。このＱＴＬ、すなわち、ＱＴＬ９又はＱＴＬ１１の存在は、上記に開示され、当業者に周知の技術によって明らかにすることができる。とりわけ、ＱＴＬが本発明のそのような細胞のゲノム中にホモ接合的に存在するか、又はヘテロ接合的に存在するかを決定することができる。ＱＴＬ９は、有利には、表ＨのＳＮＰの耐性対立遺伝子の少なくとも１つの存在によって特徴付けられ、好ましくは、ＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２１の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２２の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２３の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２４の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２５の対立遺伝子Ａ、対立遺伝子Ａの存在によるＴＯ－０２０１２２６の対立遺伝子、ＴＯ－０２０１２２７の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２２８の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２２９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３０の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２３１の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２３２の対立遺伝子Ｇ及び／又は対立遺伝子ＴＯ－０２０１３３のＧにより、より好ましくはＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０の対立遺伝子Ｇ、ＳＥＱ ＩＤ ＴＯ－０２０１２２１の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３１の対立遺伝子Ｃ又はＴＯ－０２０１２３３の対立遺伝子Ｇ、さらにより好ましくは、ＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０の対立遺伝子Ｇ及び／又はＴＯ－０２０１２２９の対立遺伝子Ａによる。ＱＴＬ１１は有利には、表Ｋのマーカーの耐性対立遺伝子の少なくとも１つの存在によって、好ましくはＴＯ－０２０１２３７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２３８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２４０の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２４１の対立遺伝子Ａ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９６８４４４９の対立遺伝子ＣＴ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９７７９８９６の対立遺伝子ＡＴ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９８２３４０５の対立遺伝子Ｃ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９９２４２３２の対立遺伝子ＧＴの存在により、例えば、ＴＯ－０２０１２３７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２３８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２４０の対立遺伝子Ａ、及びＴＯ－０２０１２４１の対立遺伝子Ａの少なくとも１つの存在による。
本発明による細胞は、任意のタイプのＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ細胞、特に、関心のあるＱＴＬ９及び／又はＱＴＬ１１を有する、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物全体を再生することができる単離細胞及び／又は細胞であり得る。
本発明はまた、本発明に従って上記で定義された植物の非再生可能細胞又は再生可能細胞の組織培養を対象とする。好ましくは、再生可能な細胞は、本発明の胚、プロトプラスト、分裂組織細胞、カルス、花粉、葉、葯、茎、葉柄、根、根の先端、果実、種子、花、子葉、及び／又は胚軸に由来し、細胞は、そのゲノムにＱＴＬ９及び／又はＱＴＬ１１を含み、ＱＴＬ９のＴｏＢＲＦＶに対する果実耐性、及びＱＴＬ１１のＴｏＢＲＦＶに対する葉面耐性の改善された表現型を独立して付与する。
好ましくは、このような細胞はＱＴＬ９を含み、本発明の文脈で定義されるように、ホモ接合性又はヘテロ接合性のいずれかでＱＴＬ１１も含む。
このような細胞はまた、有利には、本発明の第１の態様の文脈において開示されているように、本明細書においても適用可能な、任意の追加の耐性又は忍容性遺伝子を含む。
組織培養は、好ましくは、前述のトマト植物の生理学的及び形態学的特徴を有する植物を再生することができ、前述のトマト植物と実質的に同じ遺伝子型を有する植物を再生することができる。本発明はまた、本発明の組織培養物から再生されたトマト植物を提供する。
また、本発明は、本発明の改善された表現型を付与する、上記に定義された植物のプロトプラスト、又は上記に定義された組織培養物からの、ＱＴＬ９及び／又はＱＴＬ１１を含有する前記プロトプラストを提供する。
本発明はまた、本発明の植物の組織に関するものであり、組織は未分化組織又は分化組織であり得る。このような組織は、本発明のＱＴＬを含む１以上の細胞を含む。
また、本発明は、上記で定義したように、移入された配列又はＱＴＬを含む、本発明による耐性トマト植物を生成することができる増殖材料に関する。
別の態様によれば、本発明はまた、本発明の改善された表現型を有するＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物を得るための育種プログラムにおける繁殖パートナーとして、好ましくは本発明のＱＴＬ９をホモ接合体で含む、本発明のトマト植物の使用に関する。実際、このような繁殖パートナーは、目的の表現型を付与するＱＴＬ９をそのゲノムにホモ接合的に保持している。この植物とトマト植物、特に系統とを交配することにより、所望の表現型を付与する本発明のＱＴＬ９を子孫に移すことが可能である。従って、本発明の植物は、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物又は生殖質、すなわちＴｏＢＲＦＶ耐性に所望の表現型を付与するＱＴＬ９を移入するための繁殖パートナーとして用いることができる。目的のＱＴＬ９をヘテロ接合体としてもつ植物又は種子は、上記のように繁殖パートナーとしても用いることができるが、表現型の分離は、繁殖プログラムをより複雑にする可能性が高い。
本発明の改善された表現型は、ＴｏＢＲＦＶに対する耐性、特に、果実耐性又は葉耐性、又は果実及び葉耐性である。
繁殖パートナーはまた、本発明で定義されたＱＴＬ１１を含んでもよく、好ましくはホモ接合性である。
導入されたＱＴＬ９は、有利には、疾患に対する耐性、早期の果実成熟、干ばつ忍容性、果実形状などの他の望ましい遺伝的形質を含む品種に導入される。好ましくは、遺伝子導入されたＱＴＬ９は、有利には、Ｔｍ－２２遺伝子を含む植物又は品種に導入される。
更に別の態様によれば、本発明はまた、繁殖パートナーとして本発明のＱＴＬ１１をホモ接合体で含む、本発明のトマト植物の同じ使用に関する。
また、本発明は、受託番号ＮＣＩＭＢ ４３５９１の下でＮＣＩＭＢに寄託されたＬＶＳＴＢＲＦＶＲＥＳ２の植物又は種子、及び／又はホモ接合性ＱＴＬ９及び／又はＱＴＬ１１を含む、それから誘導された植物と同じ使用に関する。また、この植物は、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物又は生殖質に所望の表現型を付与することを目的とした育種プログラムにおいて、移入パートナーとして適している。
このような育種プログラムにおいて、所望の表現型を示す、又は所望の表現型に連結されたＱＴＬ９を有する子孫の選択は、有利には、ＳＮＰマーカーの対立遺伝子、特に配列番号１～１０１を有する本発明のＳＮＰマーカーに基づいて行うことができる。
ＱＴＬ９の場合、植物の子孫は、好ましくは、ＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２１の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２２の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２３の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２４の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２５の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２６の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２７の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２２８の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２２９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３０の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２３１の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２３２の対立遺伝子Ｇ及び／又はＴＯ－０２０１３３の対立遺伝子Ｇの存在に基づいて選択され、より好ましくはＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０の対立遺伝子Ｇ、配列番号ＴＯ－０２０１２２１の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３１の対立遺伝子Ｃ、又はＴＯ－０２０１２３３の対立遺伝子Ｇ、さらにより好ましくは、ＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０の対立遺伝子Ｇ及び／又はＴＯ－０２０１２２９の対立遺伝子Ａによる。
あるいは、改善された表現型又はこれらの対立遺伝子の組み合わせに関連する本発明の１０１個のＳＮＰの耐性対立遺伝子のいずれか１つの存在に基づいて、選択を行うことができる。
このような選択は、選択される植物の遺伝物質試料中に目的の対立遺伝子が存在する場合に行われる。この対立遺伝子又はこれらの対立遺伝子の存在は、実際に、本発明のＱＴＬ９又は遺伝子移入配列の存在を、前記ＳＮＰによって定義される遺伝子座に確認する。しかしながら、点突然変異又は組換え事象に続いて、これらの対立遺伝子の少なくとも１つ又は２つが失われ、関心のあるＱＴＬ９を有する残りの染色体断片が依然として関心のある表現型を付与することが考えられる。
ＱＴＬ１１を有する子孫の選択は、有利には、配列番号１０２～１１５を有するマーカーの対立遺伝子、好ましくは配列番号１０２～１１１を有するＳＮＰマーカーの対立遺伝子、好ましくはＴＯ－０２０１２３７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２３８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２４０の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２４１の対立遺伝子Ａ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９６８４４４９の対立遺伝子ＣＴ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９７７９８９６の対立遺伝子ＡＴ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９８２３４０５の対立遺伝子Ｃ及びＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９９２４２３２の対立遺伝子ＧＴ、例えば、ＴＯ－０２０１２３７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２３８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２４０の対立遺伝子Ａ、及びＴＯ－０２０１２４１の対立遺伝子Ａの少なくとも１つの存在による。
従って、本発明による植物、又は受託番号ＮＣＩＭＢ ４３５９１の下で堆積された種子から成長させた植物は、本発明の改善された表現型を有する市販のトマト系統及び品種を得るためのマーカー支援選択において特に有用である。
本発明はまた、所望の表現型を付与する遺伝子配列を同定し、配列決定し、及び／又はクローニングすることを目的とするプログラムにおける前記植物の使用に関する。
本発明の前の態様について記載された任意の特定の実施形態は、本発明のこの態様にも、特に関心のある表現型を付与するＱＴＬ９及びＱＴＬ１１の特徴に関して、適用可能である。
さらに別の態様によれば、本発明はまた、所望の表現型、特に商業的植物及び近交親系を有するＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物の生産又は繁殖のための方法又はプロセスに関する。本発明はまた、実際に、他のトマト植物、特に他のトマト品種、又は他の種若しくは近交系親株に対するＴｏＢＲＦＶ耐性を付与する本発明のＱＴＬ又は遺伝子組換え配列を移入することにも向けられ、トマトの新しいタイプ及び品種を生産するのに有用である。
この点に関して、本発明はまた、ＴｏＢＲＦＶ耐性を有するＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物を繁殖させる方法を含み、該方法は、ＴｏＢＲＦＶ耐性を付与する本発明のＱＴＬ９を有する寄託種ＬＶＳＴＢＲＦＶＲＥＳ２ ＮＣＩＭＢ ４５９１又はその子孫から成長した植物と、好ましくは該ＱＴＬを欠く最初のＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物とを交配する工程を含む。ＱＴＬは、上述のように定義され、すなわち、Ｓ．ｐｉｍｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍから遺伝子移入され、好ましくは、ＬＶＳＴＢＲＦＶＲＥＳ２、ＮＣＩＭＢ受託番号４３５９１の種子のゲノム中に存在する。このＱＴＬは、配列番号１～１０１を有するＳＮＰマーカーの耐性対立遺伝子の少なくとも１つによって同定可能である。
本発明はまた、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物にＴｏＢＲＦＶ耐性を付与するための方法であって、本発明の耐性ＱＴＬ９を導入するために該植物を遺伝的に改変することを含む方法に関する。上記のＱＴＬ９は、上記のように定義され、好ましくは、ＬＶＳＴＢＲＦＶＲＥＳ２、ＮＣＩＭＢ受託番号４３５９１のシードのゲノム中に存在する。遺伝子改変は、当業者に周知の任意の方法又は手段によって実施することができる。
本発明はまた、ＴｏＢＲＦＶ耐性を有するＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物を繁殖させるため、及びＱＴＬ９の代わりにＱＴＬ１１と関連してＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物にＴｏＢＲＦＶ耐性を付与するための同じ方法に関する。このような場合、ＱＴＬは、配列番号１０２～１１５を有するマーカーの耐性対立遺伝子の少なくとも１つによって同定可能である。
本発明は、従って、ＴｏＢＲＦＶに対して耐性を有するＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物を繁殖させるための方法に関し、この方法は、Ｓ．ｐｉｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍから移入されたＳ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍから移入された、ＴｏＢＲＦＶ耐性を付与する、ＱＴＬ９を有する寄託種子ＮＣＩＭＢ４３５９１又はその子孫から育てられた植物と、該ＱＴＬ９を欠く最初のＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物とを交配させる工程を含み、ここで、第９染色体上の該ＱＴＬ９は、植物ＬＶＳＴＢＲＦＶＲＥＳ２、ＮＣＩＭＢ受託番号４５９１の種子のゲノム中に存在し、ＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０の対立遺伝子Ｇ、配列番号ＴＯ－０２０１２２１の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３１の対立遺伝子Ｃ又はＴＯ－０２０１２３３の対立遺伝子Ｇによって同定される。
本発明はまた、ＴｏＢＲＦＶに対する耐性を有するＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物を育種するための方法に関し、Ｓ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍから遺伝子移入され、ＴｏＢＲＦＶ耐性を付与する第１１染色体上にＱＴＬ１１を有する寄託種子ＮＣＩＭＢ ４３５９１又はその子孫から成長した植物を、前記ＱＴＬ１１を欠く最初のＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物と交配するステップを含み、染色体１１上の前記ＱＴＬ１１は、植物ＬＶＳＴＢＲＦＶＲＥＳ２、ＮＣＩＭＢアクセッション番号４３５９１の種子のゲノムに存在し、ＴＯ－０２０１２３７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２３８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２４０の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２４の対立遺伝子Ａ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９６８４４４９の対立遺伝子ＣＴ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９７７９８９６の対立遺伝子ＡＴ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９８２３４０５の対立遺伝子Ｃ又はＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９９２４２３２の対立遺伝子ＧＴによって識別可能である。
具体的には、本発明はまた、以下：
ａ）ＴｏＢＲＦＶ耐性を付与するＱＴＬ９を含む、寄託された種子ＮＣＩＭＢ ４３５９１又はその子孫から成長した植物と、好ましくは前記ＱＴＬを欠く最初のＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物とを交配する工程；
ｂ）本発明のＱＴＬ９を含む、得られた子孫中の１つの植物を選択する工程；
ｃ）工程ｂ）で得られた植物の１～数倍の自家受粉を任意に行い、このようにして得られた子孫において、ＴｏＢＲＦＶに対して耐性を示す植物を選択し、果実耐性、葉の耐性、あるいはその両方である工程
を含む、ＴｏＢＲＦＶ耐性を有するプラントの製造方法又は工程に関する。
ａ）ＴｏＢＲＦＶ耐性を付与するＱＴＬ９を含む、寄託された種子ＮＣＩＭＢ ４３５９１又はその子孫から成長した植物と、好ましくは前記ＱＴＬを欠く最初のＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物とを交配する工程；
ｂ）本発明のＱＴＬ９を含む、得られた子孫中の１つの植物を選択する工程；
ｃ）工程ｂ）で得られた植物の１～数倍の自家受粉を任意に行い、このようにして得られた子孫において、ＴｏＢＲＦＶに対して耐性を示す植物を選択し、果実耐性、葉の耐性、あるいはその両方である工程
を含む、ＴｏＢＲＦＶ耐性を有するプラントの製造方法又は工程に関する。
あるいは、方法又はプロセスは、ステップａ）の代わりに、以下：
ａ１）ＴｏＢＲＦＶ耐性を付与するＱＴＬ９を含む、寄託された種子（ＮＣＩＭＢ ４３５９１）に対応する植物、又はその子孫と、好ましくは該ＱＴＬを欠く最初のＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物とを交配する工程；
ａ２）Ｆ２集団を作製するために、Ｆ１雑種を自己指で増やす工程
を含み得る。
ａ１）ＴｏＢＲＦＶ耐性を付与するＱＴＬ９を含む、寄託された種子（ＮＣＩＭＢ ４３５９１）に対応する植物、又はその子孫と、好ましくは該ＱＴＬを欠く最初のＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物とを交配する工程；
ａ２）Ｆ２集団を作製するために、Ｆ１雑種を自己指で増やす工程
を含み得る。
上記の方法又はプロセスにおいて、ＳＮＰマーカーは、好ましくは、工程ｂ）及び／又はｃ）において、目的の耐性表現型を付与する配列を有する植物を選択するために使用される。
ＳＮＰマーカーは、好ましくは、本出願の他の箇所で言及されているようなそれらの全ての組合せ、好ましくは配列番号１～１４を有するＳＮＰを含む、配列番号１～１０１を有する本発明の１０１個のＳＮＰマーカーの１つ以上である。
１つ以上のＳＮＰの対立遺伝子に基づいて植物を選択することにより、その植物は、最初の植物に関して、果実忍容性／耐性、葉忍容性／耐性、又は両方であるか否かにかかわらず、ＴｏＢＲＦＶ耐性を有するものとして選択されることが理解されるべきである。ただし、ＳＮＰの対立遺伝子が、このＳＮＰについてのＬＶＳＴＢＲＦＶＲＥＳ２親の対立遺伝子に対応する対立遺伝子であり、最初のＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物の対立遺伝子ではない場合である。例えば、ＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２１の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２２の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２３の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２４の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２５の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２６の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２７の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２２８の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２２９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３０の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２３１の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２３２の対立遺伝子Ｇ及び／又はＴＯ－０２０１３３の対立遺伝子Ｇが検出される場合、より好ましくは、ＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０の対立遺伝子Ｇ、ＳＥＱ ＩＤ ＴＯ－０２０１２２１の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３１の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２３２の対立遺伝子Ｇ、又はＴＯ－０２０１２３３の対立遺伝子Ｇが検出される場合、さらにより好ましくは、ＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０の対立遺伝子Ｇ及び／又はＴＯ－０２０１２２９の対立遺伝子Ａが検出される場合に、本発明の改善された表現型を有するものとして植物が選択され得る。表Ｇに示したＳＮＰの他の耐性対立遺伝子を用いることもできる。
好ましくは、工程ａ）のＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物は、商業的に所望の形質又は所望の園芸形質を有する植物を得るために使用されるエリート系統である。有利には、このような植物は、ホモ接合性又はヘテロ接合性のＴｍ－２２遺伝子の存在のために、ＴＭＶに対して耐性である。
上記で定義された方法又はプロセスは、有利には、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物の全ての特徴を有する植物を得るために、好ましくは工程ｃ）の後に戻し交雑工程を含むことができる。従って、これらの特徴を有するプラントの製造のための方法又はプロセスは、以下の追加の工程：
ｄ）ｂ）又はｃ）で選択した耐性植物をＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物と交配する工程；
ｅ）本発明のＱＴＬ９又は遺伝子移入配列を有する植物を選択する工程
を含んでもよい。
ｄ）ｂ）又はｃ）で選択した耐性植物をＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物と交配する工程；
ｅ）本発明のＱＴＬ９又は遺伝子移入配列を有する植物を選択する工程
を含んでもよい。
工程ａ）で使用される植物、すなわち、寄託された種子に対応する植物は、寄託された種子から成長させた植物であり得る；あるいは、本発明の第１の態様による任意の植物であってもよく、ＱＴＬ９又は内部移入配列を有し、好ましくはこれらの配列をホモ接合的に有する表現型を付与する。
好ましくは、このような植物はまた、好ましくはホモ接合性であると定義されるＱＴＬ１１を含む。
工程ｅ）において、ＳＮＰマーカーは、最初の植物に関して、ＴｏＢＲＦＶ耐性を有する植物を選択するために使用することができる。ＳＮＰマーカーは、前のセクションで説明したように、本発明のものである。好ましい実施形態によれば、本発明の方法又はプロセスは、選択工程のうちの少なくとも１つ、すなわち、ｂ）、ｃ）、及び／又はｅ）について、選択が、配列番号１～１０１を有するＳＮＰの耐性対立遺伝子のうちの少なくとも１つの検出に基づくように実施される。好ましい対立遺伝子及び組合せは既に開示されており、本発明のこの実施形態に適用可能である。
改善された表現型を有し、この表現型を付与するＱＴＬをホモ接合体で有する植物が選択される場合、選択は、反復感受性Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍの親を表す対立遺伝子の不在と組み合わせて、ＱＴＬを表す対立遺伝子、すなわちＬＶＳＴＢＲＦＶＲＥＳ２の親の存在に基づいて、本発明の１以上のＳＮＰに基づいてなされるべきであることに留意されたい。
選択はまた、遺伝子移入された配列に連結された任意の他のマーカー、及び感受性のある親の常在配列と反対することによるこれらの侵入した配列の存在を表すものに基づいて行うことができる。別のマーカーを定義する方法は、本発明の範囲内にあり、別のセクションで開示される。
工程ｅ）で選択される植物は、好ましくは、商業的植物、特に、通常の培養条件下で少なくとも１０ｇ、好ましくは２５ｇ、少なくとも１００ｇ、少なくとも１５０ｇ、又は少なくとも２００ｇの全成熟を有する果実を有する植物である。
好ましくは、工程ｄ）及びｅ）は、少なくとも２回、好ましくは３回繰り返され、必ずしも同じＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物ではない。当該Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物は、繁殖系統であることが好ましい。
線虫形質に対する耐性又はＴｏＭＶに対する耐性は、上記に開示されたプロセスの各選択段階において、さらに選択され得る。
自家受粉と戻し交配は任意の順序で行われ、インターカレートすることができる。例えば、戻し交配は１回又は複数回の自家受粉の前後に行われ、自家受粉は１回又は複数回の戻し交配の前後に行われる。
所望の改善された表現型を有する子孫の選択は、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍの親からのＴｏＢＲＦＶ耐性の比較に基づいて、とりわけ実施例で開示されているプロトコールを介して行うこともできる；試験された耐性／忍容性は、果実耐性／忍容性、又は葉耐性／忍容性、又はその両方であり得る。
対立遺伝子検出に用いられる方法は、特定の染色体上のＳＮＰの２つの異なる対立遺伝子間の区別を可能にする任意の技術に基づくことができる。
本発明はまた、工程ａ）において、ＴｏＢＲＦＶ耐性を付与するＱＴＬ１１を含む、寄託された種子ＮＣＩＭＢ ４３５９１から成長した植物、又はその子孫を用いる、同じ方法に関する。次に、すべての検出／選択工程は、ＱＴＬ１１に関して、特に配列番号１０２～１１５を有するマーカーを用いて、より好ましくはＴＯ－０２０１２３７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２３８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２４０の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２４１の対立遺伝子Ａ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９６８４４４９の対立遺伝子ＣＴ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９７７９８９６の対立遺伝子ＡＴ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９８２３４０５の対立遺伝子Ｃ及び／又はＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９９２４２３２対立遺伝子ＧＴの存在に基づいて；例えば、ＴＯ－０２０１２３７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２３８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２４０の対立遺伝子Ａ、及びＴＯ－０２０１２４１の対立遺伝子Ａの少なくとも１つの存在によって実施される。マーカー及び耐性対立遺伝子の別の好ましいリストは、既に上記で開示されている。
従って、本発明はまた、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物にＴｏＢＲＦＶに対する耐性を付与する方法に関し、
ａ）寄託された種子ＮＣＩＭＢ ４３５９１、又はその子孫から育てられ、Ｓ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍから遺伝子移入された、第９染色体上にＱＴＬ９及び／又は第１１染色体上にＱＴＬ１１を有し、ＮＣＩＭＢ ４３５９１において独立してＴｏＢＲＦＶ耐性を付与する植物と、好ましくは前記ＱＴＬ（複数可）を欠く、最初のＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物とを交配する工程、
ｂ）ＱＴＬ９及び／又はＱＴＬ１１を有する、このようにして得られた子孫において植物を選択する工程；
ｃ）ｂ）において得られた植物の１～数倍の自家受粉を任意に行い、このようにして得られた子孫において、ＴｏＢＲＦＶに対する耐性を有する植物を選択する工程
を含む。
ａ）寄託された種子ＮＣＩＭＢ ４３５９１、又はその子孫から育てられ、Ｓ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍから遺伝子移入された、第９染色体上にＱＴＬ９及び／又は第１１染色体上にＱＴＬ１１を有し、ＮＣＩＭＢ ４３５９１において独立してＴｏＢＲＦＶ耐性を付与する植物と、好ましくは前記ＱＴＬ（複数可）を欠く、最初のＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物とを交配する工程、
ｂ）ＱＴＬ９及び／又はＱＴＬ１１を有する、このようにして得られた子孫において植物を選択する工程；
ｃ）ｂ）において得られた植物の１～数倍の自家受粉を任意に行い、このようにして得られた子孫において、ＴｏＢＲＦＶに対する耐性を有する植物を選択する工程
を含む。
別の態様によれば、本発明は、以下の工程を含む、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物にＴｏＢＲＦＶに対する耐性を付与する方法に関し、
ａ）寄託された種子ＮＣＩＭＢ ４３５９１、又はその子孫から育てられ、Ｓ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍから遺伝子移入された、第９染色体上にＱＴＬ９及び／又は第１１染色体上にＱＴＬ１１を有し、ＮＣＩＭＢ ４３５９１において独立してＴｏＢＲＦＶ耐性を付与する植物と、好ましくは前記ＱＴＬ（複数可）を欠く、最初のＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物とを交配し、したがって、Ｆ１集団を生成する工程、
ａ２）Ｆ１雑種を自己指令してＦ２個体群を作製する工程、
ｂ）このようにしてＴｏＢＲＦＶに対する耐性を獲得した子孫の個体の選択工程
を含む。
ａ）寄託された種子ＮＣＩＭＢ ４３５９１、又はその子孫から育てられ、Ｓ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍから遺伝子移入された、第９染色体上にＱＴＬ９及び／又は第１１染色体上にＱＴＬ１１を有し、ＮＣＩＭＢ ４３５９１において独立してＴｏＢＲＦＶ耐性を付与する植物と、好ましくは前記ＱＴＬ（複数可）を欠く、最初のＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物とを交配し、したがって、Ｆ１集団を生成する工程、
ａ２）Ｆ１雑種を自己指令してＦ２個体群を作製する工程、
ｂ）このようにしてＴｏＢＲＦＶに対する耐性を獲得した子孫の個体の選択工程
を含む。
ＳＮＰマーカーは、工程ｂ）及び／又はｃ）独立してＴｏＢＲＦＶ耐性を付与するＱＴＬ９及び／又はＱＴＬ１１を有する植物を選択するために有利に使用される。
本発明はまた、最初の市販のＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物に関して、トマトブラウンルゴースフルーツウイルスに対する果実及び／又は葉の忍容性及び／又は耐性に対応する、所望の改善された表現型を有する、市販のトマト植物又はその近交系を得るための方法に関し、
ａ）ＴｏＢＲＦＶ耐性を付与するＱＴＬ９を有する寄託種子ＬＶＳＴＢＲＦＶＲＥＳ２ ＮＣＩＭＢ受託番号４３５９１又はその子孫を市販のＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物と発芽させて得られた植物を逆交雑させる工程、
ｂ）本発明のＱＴＬ９を有する植物を選択する工程
を含む。
ａ）ＴｏＢＲＦＶ耐性を付与するＱＴＬ９を有する寄託種子ＬＶＳＴＢＲＦＶＲＥＳ２ ＮＣＩＭＢ受託番号４３５９１又はその子孫を市販のＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物と発芽させて得られた植物を逆交雑させる工程、
ｂ）本発明のＱＴＬ９を有する植物を選択する工程
を含む。
好ましくは、選択は、本発明の他の方法について詳述されているように、本発明の１０１個以上のＳＮＰの１つ又は複数に基づいて行われる。
あるいは、工程ａ）の子孫は、ＱＴＬ１１を有する子孫であり、工程ｂ）の選択は、ＱＴＬ１１に基づき、本発明の他の方法について詳述されているように、好ましくは配列番号１０２～１１５を有する本発明の１４のマーカーの１つ以上に基づく。
本発明による本発明のすべての方法及びプロセスにおいて、最初のＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物は、決定的、不定、又は半決定的である。
既に開示されているように、本発明によるトマト植物は、トマトモザイクウイルス、線虫、ＴＹＬＣＶ、及びフサリウム及びベルチシリウムに対しても耐性であることが好ましい。本発明の方法及び方法においてこのような植物を得るために、繁殖スキームで使用されるＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍの両親は、好ましくは、トマトモザイクウイルス、線虫、ＴＹＬＣＶ及びＦｕｓａｒｉｕｍ及びＶｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍに対する耐性を付与する配列を有し、選択工程は、本発明の改善された表現型を付与するＱＴＬに加えて、これらの耐性配列を有する植物を選択するために実施される。
本発明はまた、上記に開示されたいずれかの方法及び方法によって得られたか又は得られるＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物及び種子に関する。このような植物は、本発明の第１の態様による改善された表現型を有するＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物である。このようなＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍの種子は、好ましくは、植物栄養素、増強微生物、又は種子及び植物の環境を消毒するための製品のような個々の又は組み合わされた活性種でコーティング又はペレット化される。このような種及び化学物質は、植物の成長を促進する製品、例えばホルモン、又は環境ストレスに対する耐性を増大させる製品、例えば防御刺激剤、又は基質及びその直接の環境のｐＨを安定化させる製品、又は栄養素であり得る。
それらはまた、本明細書ではウイルス及び病原性微生物を含む、若い植物の成長に不利な薬剤から保護するための製品、例えば、接触、摂取又はガス拡散によって作用する殺菌、殺菌、殺殺、殺虫又は除草製品であってもよく、それは、例えばタイムの抽出物などの任意の適切な精油である。これらの製品はすべて、植物の耐性反応を強化し、及び／又は、当該植物の環境を消毒又は調節する。それらはまた、生きた生物材料、例えば、非病原性微生物、例えば少なくとも１つの真菌、又は細菌、又はウイルスであってもよく、必要に応じてその生存能力を保証する培地を伴う；この微生物、例えば、シュードモナス属、バチルス属、トリコデルマ属、クロノスタキス属、フザリウム属、リゾクトニア属などのタイプは植物の成長を刺激するか、病原体から植物を保護する。
全ての従来の方法及び方法において、必要であればＱＴＬのホモ接合状態を確認するために、潜在的に本発明の他の対立遺伝子型ＳＮＰの不在と組み合わせて、耐性ＱＴＬ９に関連するＳＮＰの少なくとも１つの対立遺伝子を検出することによって、ＴｏＢＲＦＶ耐性に関与するＱＴＬ又は遺伝子移入配列を有する植物の同定を行うことができる。従って、本発明のホモ接合性ＱＴＬ又は遺伝子移入配列を有する植物の同定は、ＱＴＬ９について配列番号１～１０１を有するＳＮＰの耐性対立遺伝子のうちの少なくとも１つの同定、ならびに前記ＳＮＰの感受性対立遺伝子の不在に基づくであろう。例えば、本発明のＱＴＬ９をホモ接合で有する植物の同定は、ＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２１の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２２の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２３の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２４の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２５の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２６の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２７の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２２８の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２２９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３０の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２３１の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２３２の対立遺伝子Ｇ及び／又はＴＯ－０２０１３３の対立遺伝子Ｇの同定に基づき、ならびに対応する感受性対立遺伝子の不存在、すなわちＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２１の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２２の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２３の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２４の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２２５の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２６の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２７の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２８の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２９の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２３０の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３１の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３２の対立遺伝子Ａ及び／又はＴＯ－０２０１２３３の対立遺伝子Ａの不存在に基づく。
同様に、本発明のホモ接合性ＱＴＬ又は遺伝子移入配列を有する植物の同定は、ＱＴＬ１１について配列番号１０２～１１５を有するマーカーの耐性対立遺伝子のうちの少なくとも１つの同定、ならびに前記ＳＮＰの感受性対立遺伝子の不存在に基づくであろう。例えば、本発明のＱＴＬ１１をホモ接合で有する植物の同定は、ＴＯ－０２０１２３７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２３８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２４０の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２４１の対立遺伝子Ａ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９６８４４４９の対立遺伝子ＣＴ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９７７９８９６の対立遺伝子ＡＴ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９８２３４０５の対立遺伝子Ｃ及び／又はＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９９２４２３２の対立遺伝子ＧＴの同定に基づき、ならびに対応する感受性の対立遺伝子の不存在、すなわちＴＯ－０２０１２３７の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３８の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ－０２０１２３９の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２４０の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２４１の対立遺伝子Ｃ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９６８４４４９の対立遺伝子Ｃ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９７７９８９６の対立遺伝子Ａ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９８２３４０５の対立遺伝子Ｔ及びＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９９２４２３２の対立遺伝子Ｇの不存在に基づくであろう。
本発明はまた、本発明者らにより提供される情報、すなわち、ＬＶＳＴＢＲＦＶＲＥＳ２の寄託種子中に存在するＱＴＬ９及びＱＴＬ１１の存在、及び改善された表現型をＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物に付与すること、ならびにこれらのＱＴＬ又は侵入配列に関連する分子マーカーの開示の使用に関する。この知識は、特に、ＱＴＬの正確なマッピング、それらの配列の定義、改善された表現型を付与するＱＴＬを含むトマト植物の同定、及びこれらのＱＴＬに関連するさらなる又は代替マーカーの同定に用いることができる。このようなさらなるマーカーは、その位置、すなわち、本発明に開示された１０１マーカーに近い位置、好ましくはＱＴＬ９について配列番号１～１４を有する１４のＳＮＰから、及び本発明により明らかにされたＴｏＢＲＦＶ耐性との関連によって特徴付けられる。ＱＴＬ１１については、適用可能なマーカーは、配列番号１０２～１１５を有するマーカーである。
この点に関して、本発明はまた、ＬＶＳＴＢＲＦＶＲＥＳ２（ＮＣＩＭＢアクセッション番号４３５９１）の種子のゲノムに見出される本発明のＱＴＬ９を有するＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物を同定し、検出し、及び／又は選択する方法に関し、前記ＱＴＬは、前記配列を欠く対応する植物に関してＴｏＢＲＦＶに対する改善された耐性を与え、該方法は、同定及び／又は選択される植物の遺伝物質試料において、表ＨのＳＮＰマーカーの耐性対立遺伝子の少なくとも１つ、とりわけＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２１の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２２の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２３の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２４の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２５の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２６の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２７の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２２７の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２２８の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２２９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３０の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２３１の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２３２の対立遺伝子Ｇ及びＴＯ－０２０１３３の対立遺伝子Ｇのうちの１つ、より好ましくはＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０の対立遺伝子Ｇ、ＳＥＱ ＩＤ ＴＯ－０２０１２２１の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３１の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２３３の対立遺伝子Ｇのうちの１つ、例えば、ＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０の対立遺伝子Ｇ及びＴＯ－０２０１２２９の対立遺伝子Ａのうちの１つを検出することを含む。好ましくは、配列番号１～１０１を有するＳＮＰの耐性対立遺伝子の少なくとも２又は３又は５を検出する。
本発明はまた、ＴｏＢＲＦＶに対する耐性を付与するＱＴＬ９を有するＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物、及び配列番号１～１０１を有するＳＮＰ、特に配列番号１～１４を有するＳＮＰの耐性対立遺伝子の少なくとも１つを有するＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物を検出又は選択する方法に関し、ここで、検出又は選択は、人工感染の自然感染のいずれかで、試験される植物にＴｏＢＲＦＶを接種することを含むＴｏＢＲＦＶ感染の条件下でなされる。関心のある表現型の存在は、特に本発明のＱＴＬ９を有する親を含む育種スキームにおいて、本発明のＱＴＬ９又は遺伝子移入配列の存在を有益に示す。
本発明はまた、ＬＶＳＴＢＲＦＶＲＥＳ２の種子のゲノムに見られる本発明のＱＴＬ１１を有するＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍを同定し、検出し及び／又は選択する同方法に関し、上記ＱＴＬは、前記配列を欠く植物に関してＴｏＢＲＦＶに対する改善された耐性を付与し、該方法は、同定及び／又は選択される植物の遺伝物質試料において、表Ｋのマーカーの耐性対立遺伝子の少なくとも１つ、とりわけＴＯ－０２０１２３７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２３８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２４０の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２４１の対立遺伝子Ａ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９６８４４４９の対立遺伝子ＣＴ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９７７９８９６の対立遺伝子ＡＴ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９８２３４０５の対立遺伝子Ｃ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９９２４２３２の対立遺伝子ＧＴのうちの１つを検出することを含む。好ましくは、配列番号１０２～１１５を有するＳＮＰの耐性対立遺伝子の少なくとも２つ又は３つ又は５つが検出されるか、又は９つのマーカーＴＯ－０２０１２３７－、ＴＯ－０２０１２４１及びＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９６８４４４９、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９７９８９６、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９８２３４０５及びＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９９２４２３２のうちの２つ又は３つ又は４つが検出されるべきである。別の実施形態によれば、マーカーＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９６８４４９、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９７９８９６、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９８２３４０５及びＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９９２４２３２の耐性対立遺伝子の少なくとも１つ、２つ又は３つが検出されるべきである。マーカー及び耐性対立遺伝子の別の好ましいリストは、既に上記で開示されている。検出又は選択は、ＴｏＢＲＦＶ感染の条件下で行うことができる。目的の表現型の存在は、本発明のＱＴＬ１１又は遺伝子移入された配列の存在をホモ接合的に示す有益なものである。
本発明はまた、本発明のＱＴＬを有するＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物、特に市販のトマト植物を検出及び／又は選択する方法に関し、選択される植物の遺伝物質試料において、上記の耐性対立遺伝子、すなわち、
－第９染色体上のＱＴＬについては、ＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２１の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２２の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２３の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２４の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２５の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２６の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２７の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２２８の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２２９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３０の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２３１の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２３２の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２３３の対立遺伝子Ｇ、好ましくはＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０の対立遺伝子Ｇ、ＳＥＱ ＩＤ ＴＯ－０２０１２２１の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３１の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２３２の対立遺伝子Ｇ、又はＴＯ－０２０１２３３の対立遺伝子Ｇの少なくとも１つ；又は
ＴＯ－０２０１２３７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２３８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２４０の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２４１の対立遺伝子Ａ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９６８４４４９の対立遺伝子ＣＴ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９７７９８９６の対立遺伝子ＡＴ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９８２３４０５の対立遺伝子Ｃ及びＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９９２４２３２の対立遺伝子ＧＴ、例えばＴＯ－０２０１２３７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２３８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３９の対立遺伝子、ＴＯ－０２０１２４０の対立遺伝子Ａ又はＴＯ－０２０１２４１の対立遺伝子Ａ
の少なくとも１つの検出を含む。
－第９染色体上のＱＴＬについては、ＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２１の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２２の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２３の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２４の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２５の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２６の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２７の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２２８の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２２９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３０の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２３１の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２３２の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２３３の対立遺伝子Ｇ、好ましくはＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０の対立遺伝子Ｇ、ＳＥＱ ＩＤ ＴＯ－０２０１２２１の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３１の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２３２の対立遺伝子Ｇ、又はＴＯ－０２０１２３３の対立遺伝子Ｇの少なくとも１つ；又は
ＴＯ－０２０１２３７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２３８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２４０の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２４１の対立遺伝子Ａ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９６８４４４９の対立遺伝子ＣＴ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９７７９８９６の対立遺伝子ＡＴ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９８２３４０５の対立遺伝子Ｃ及びＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９９２４２３２の対立遺伝子ＧＴ、例えばＴＯ－０２０１２３７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２３８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３９の対立遺伝子、ＴＯ－０２０１２４０の対立遺伝子Ａ又はＴＯ－０２０１２４１の対立遺伝子Ａ
の少なくとも１つの検出を含む。
耐性対立遺伝子の別の好ましいリストは、既に上記で開示されている。
本方法は、特に、ＴｏＢＲＦＶ耐性を付与する本発明のＱＴＬを含む、ＬＶＳＴＢＲＦＶＲＥＳ２（ＮＣＩＭＢ受託番号４３５９１）を初期の親、又はその子孫とする育種プログラムに適合される。
本発明は、さらに、前記ＱＴＬの存在を明らかにする任意の分子マーカーの検出に基づいて、ＴｏＢＲＦＶ耐性を付与する本発明のＱＴＬ９及び／又はＱＴＬ１１を有するＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物を検出及び選択する方法に関する。実際、本発明のＱＴＬ９及びＱＴＬ１１が本発明者によって同定されたため、本発明の１０１個のＳＮＰ（配列番号１～１０１）又は１４個のマーカー（配列番号１０２～１１５）に加えて、分子マーカーの同定及び使用が、当業者によって容易に達成され得る。ＱＴＬ９は、本発明の１０１のＳＮＰのうちの少なくとも１つの存在を特徴とすることができるが、異なる代替マーカーの使用を介して同定することもできる。ＱＴＬ１１にも同様である。本発明には、従って、トマトゲノム中の本発明のＱＴＬを同定するための任意のそのような分子マーカーの方法及び使用も含まれ、ここで、該ＱＴＬは、該ＱＴＬを欠く対応する植物に関してＴｏＢＲＦＶに対する耐性を付与し、該ＱＴＬは、配列番号１～１０１、好ましくは１～１４を有するＳＮＰの少なくとも１つの耐性対立遺伝子の存在を特徴とする。
トマトゲノム中の本発明のＱＴＬ９を同定するための任意のそのような代替分子マーカーの方法及び使用も含まれ、前記ＱＴＬはＴｏＢＲＦＶ耐性を付与し、前記ＱＴＬは、配列番号１～１０１を有するＳＮＰの耐性対立遺伝子の少なくとも１つの存在によって特徴付けられ、好ましくはＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２１の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２２の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２３の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２４の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２５の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２６の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２７の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２２８の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２２９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３０の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２３１の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２３２の対立遺伝子Ｇ及びＴＯ－０２０１３３の対立遺伝子Ｇによって、より好ましくは、ＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０の対立遺伝子Ｇ、配列番号ＴＯ－０２０１２２１の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３１の対立遺伝子Ｃ及びＴＯ－０２０１２３３の対立遺伝子Ｇのうちの１つ、さらにより好ましくは、ＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０の対立遺伝子Ｇ及びＴＯ－０２０１２２９の対立遺伝子Ａの１つによって特徴付けられる。
トマトゲノム中の本発明のＱＴＬ１１を同定するための任意のそのような代替分子マーカーの方法及び使用もまた含まれ、前記ＱＴＬはホモ接合で存在する場合にＴｏＢＲＦＶ耐性を付与し、前記ＱＴＬは、配列番号１０２～１１５を有するマーカーの耐性対立遺伝子の少なくとも１つ、好ましくは配列番号１０２～１１１を有するＳＮＰの耐性対立遺伝子の少なくとも１つの存在によって、より好ましくはＴＯ－０２０１２３７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２３８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２４０の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２４１の対立遺伝子Ａ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９６８４４４９の対立遺伝子ＣＴ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９７７９８９６の対立遺伝子ＡＴ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９８２３４０５の対立遺伝子Ｃ、及びＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９９２４２３２の対立遺伝子ＧＴ；例えば、ＴＯ－０２０１２３７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２３８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２４０の対立遺伝子Ａ、及びＴＯ－０２０１２４１の対立遺伝子Ａのいずれか１つの存在におって特徴付けられる。耐性対立遺伝子の別の好ましいリストは、既に上記で開示されている。
本発明はまた、ＴｏＢＲＦＶ耐性を付与する、前述のような耐性ＱＴＬを有するトマト植物を検出及び／又は選択するための方法に関し、前記方法は、
ａ）特にトマト植物において前記耐性を付与する、ＴｏＢＲＦＶ耐性に関与するＱＴＬ９又はＱＴＬ１１に遺伝的に連結するか、又は関連する少なくとも１つの遺伝子マーカーの存在についてトマト植物を分析する工程、
ｂ）ＴｏＢＲＦＶ耐性に関与する遺伝子マーカー及び関連するＱＴＬ９又はＱＴＬ１１を含む植物を選択する工程
を含み、ここで、ＱＴＬ及び遺伝子マーカーは、ＴＯ－０２０１２２０によって区切られたゲノム領域、及びＱＴＬ９について配列番号１０１を有するＳＮＰ、好ましくは、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍのゲノムにおいてＴＯ－０２０１２２０及びＴＯ－０２０１２３３によって区切られた領域、ならびにＱＴＬ１１について配列番号１０２及び１１５を有するマーカーによって区切られたゲノム領域、好ましくは、配列番号１０２及び１１１を有するマーカーによって区切られた領域に見出されるべきである。
ａ）特にトマト植物において前記耐性を付与する、ＴｏＢＲＦＶ耐性に関与するＱＴＬ９又はＱＴＬ１１に遺伝的に連結するか、又は関連する少なくとも１つの遺伝子マーカーの存在についてトマト植物を分析する工程、
ｂ）ＴｏＢＲＦＶ耐性に関与する遺伝子マーカー及び関連するＱＴＬ９又はＱＴＬ１１を含む植物を選択する工程
を含み、ここで、ＱＴＬ及び遺伝子マーカーは、ＴＯ－０２０１２２０によって区切られたゲノム領域、及びＱＴＬ９について配列番号１０１を有するＳＮＰ、好ましくは、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍのゲノムにおいてＴＯ－０２０１２２０及びＴＯ－０２０１２３３によって区切られた領域、ならびにＱＴＬ１１について配列番号１０２及び１１５を有するマーカーによって区切られたゲノム領域、好ましくは、配列番号１０２及び１１１を有するマーカーによって区切られた領域に見出されるべきである。
会合、又は遺伝的会合、より具体的には遺伝的連鎖により、遺伝的マーカー（例えば、ＳＮＰマーカーの特定の対立遺伝子）の多型と関心のある表現型とが同時に生じる、すなわち、偶然の出現によって予想されるよりもしばしば、一緒に遺伝する、すなわち、それらのゲノム近接の結果として、対立遺伝子と表現型の原因となる遺伝的配列との非ランダムな会合が存在することが理解されるべきである。
遺伝子マーカーは、ＱＴＬ９について上記に開示された１０１子のマーカーのうちの１つ又は代替マーカーのいずれかであり、好ましくは減数分裂の９０％以上、好ましくは減数分裂の９５％、９６％、９８％又は９９％以上において、関心のある表現型で遺伝する。
ＱＴＬ１１についても同様である。
ＱＴＬ１１についても同様である。
本発明のＱＴＬ又は遺伝子移入された配列の定義及び好ましい特徴は、本明細書の他のセクションで定義されるとおりである。ＴｏＢＲＦＶ耐性を付与するＱＴＬは、種子ＬＶＳＴＢＲＦＶＲＥＳ２のゲノムに見られるように有利である。
従って、本発明は、本発明のＴｏＢＲＦＶ耐性を付与する、トマトゲノム中のＱＴＬを微細マッピング又は同定するための、１つ以上の分子マーカー又は遺伝マーカーの使用に関するものであり、ここで、該１つ以上のマーカーは、以下の染色体領域：
－ＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０（配列番号１）及び配列番号１０１を有するＳＮＰにより第９染色体上で区切られた染色体領域において、
－本発明の１０１個のＳＮＰマーカーのうちの１つの遺伝子座から、好ましくは配列番号１～１４を有するＳＮＰのうちの１つの遺伝子座から、さらに好ましくはＴＯ－０２０１２２０、ＴＯ－０２０１２２１、ＴＯ－０２０１２２９、ＴＯ－０２０１２３１又はＴＯ－０２０１２３３のうちの１つの遺伝子座から２メガベース単位未満であるところ
のうちの１つに位置する。
－ＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０（配列番号１）及び配列番号１０１を有するＳＮＰにより第９染色体上で区切られた染色体領域において、
－本発明の１０１個のＳＮＰマーカーのうちの１つの遺伝子座から、好ましくは配列番号１～１４を有するＳＮＰのうちの１つの遺伝子座から、さらに好ましくはＴＯ－０２０１２２０、ＴＯ－０２０１２２１、ＴＯ－０２０１２２９、ＴＯ－０２０１２３１又はＴＯ－０２０１２３３のうちの１つの遺伝子座から２メガベース単位未満であるところ
のうちの１つに位置する。
好ましい実施形態によれば、上記の１つ以上のマーカーは、ＴＯ－０２０１２１０及び配列番号１０１を有するＳＮＰによって、又はＴＯ－０２０１２１０及びＴＯ－０２０１２３３によって、又はＴＯ－０２０１２２１及びＴＯ－０２０１２３３によって区切られる染色体領域内にある。
前記１つ以上の分子マーカー又は遺伝子マーカーは、さらに好ましくは、０．０５以下のｐ値で、配列番号１～１０１を有するＳＮＰの以下の耐性対立遺伝子の少なくとも１つと関連している。例えば、ＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２１の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２２の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２３の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２４の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２５の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２６の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２７の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２２８の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２２９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３０の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２３１の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０２１３２の対立遺伝子Ｇ及び／又はＴＯ－０２０１３３の対立遺伝子Ｇである。
分子マーカー又は遺伝マーカーは、好ましくはＳＮＰマーカーである。それは、好ましくは０．５メガ塩基未満で、本発明の１０１個のＳＮＰのうちの少なくとも１つの座から１メガ塩基未満である。
ｐ値は、好ましくは０．０１未満である。
さらに、本発明は、ＴｏＢＲＦＶ耐性を付与する第９染色体上のＱＴＬに関連する、本発明の１０１個のＳＮＰマーカーの少なくとも１つの使用に関し、該ＱＴＬに関連する１つ以上の代替的分子マーカー又は遺伝マーカーを同定するための、本発明の１０１個のＳＮＰマーカーのうちの少なくとも１つの使用に関し、ここで、該１つ以上の代替的分子マーカー又は遺伝マーカーは、
－ＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０（配列番号１）及び配列番号１０１を有するＳＮＰにより第９染色体上で区切られた染色体領域において、
－本発明の１０１個のＳＮＰマーカーのうちの１つの遺伝子座から、好ましくは配列番号１～１４を有するＳＮＰのうちの１つの遺伝子座から、さらに好ましくはＴＯ－０２０１２２０、ＴＯ－０２０１２２１、ＴＯ－０２０１２２９、ＴＯ－０２０１２３１又はＴＯ－０２０１２３３のうちの１つの遺伝子座から２メガベース単位未満であるところ
にある。
－ＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０（配列番号１）及び配列番号１０１を有するＳＮＰにより第９染色体上で区切られた染色体領域において、
－本発明の１０１個のＳＮＰマーカーのうちの１つの遺伝子座から、好ましくは配列番号１～１４を有するＳＮＰのうちの１つの遺伝子座から、さらに好ましくはＴＯ－０２０１２２０、ＴＯ－０２０１２２１、ＴＯ－０２０１２２９、ＴＯ－０２０１２３１又はＴＯ－０２０１２３３のうちの１つの遺伝子座から２メガベース単位未満であるところ
にある。
好ましい実施形態によれば、前記代替マーカーは、上述の好ましい染色体領域内にある。遺伝的関連又は連鎖は、有利には、別のメーカーを追跡し、関心のあるＱＴＬを含む植物から生じる子孫におけるＱＴＬの存在を検出することによって検出することができる。
別の分子マーカーは、好ましくは０．０５以下、好ましくは０．０１未満のｐ値で前記ＱＴＬと会合する。ＱＴＬは、好ましくは、寄託された種子ＮＣＩＭＢ ４３５９１のゲノム中に見出されるものである。
分子マーカー又は遺伝子マーカー及び耐性表現型は、好ましくは減数分裂の９０％以上、好ましくは９５％以上で一緒に遺伝する。
本発明のこの態様による分子マーカー又は遺伝マーカーは、好ましくはＳＮＰである。それらは、好ましくは０．５メガ塩基未満で、本発明の１０１個のＳＮＰのうちの少なくとも１つの座から１メガ塩基未満である。
また、本発明は、マーカーが、
－配列番号１０２を有するマーカー及び配列番号１１５を有するマーカーによって染色体１１上に区切られた染色体領域において、
－表Ｋの１４のマーカーのうちの１つの遺伝子座から、好ましくはＴＯ－０２０１２３７、ＴＯ－０２０１２３８、ＴＯ－０２０１２３９、ＴＯ－０２０１２４０、ＴＯ－０２０１２４０、ＴＯ－０２０１２４１、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９６８４４９、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９７９８９６、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９８２３４０５又はＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９９２４２３２のうちの１つの遺伝子座から２メガベース単位未満であるところ
で局在化されている／局在化された、同一の方法及び用途に関する。
－配列番号１０２を有するマーカー及び配列番号１１５を有するマーカーによって染色体１１上に区切られた染色体領域において、
－表Ｋの１４のマーカーのうちの１つの遺伝子座から、好ましくはＴＯ－０２０１２３７、ＴＯ－０２０１２３８、ＴＯ－０２０１２３９、ＴＯ－０２０１２４０、ＴＯ－０２０１２４０、ＴＯ－０２０１２４１、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９６８４４９、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９７９８９６、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９８２３４０５又はＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９９２４２３２のうちの１つの遺伝子座から２メガベース単位未満であるところ
で局在化されている／局在化された、同一の方法及び用途に関する。
同様に、本発明はまた、本出願に記載されるように、トマト植物にＴｏＢＲＦＶ耐性を付与するＱＴＬに関連する分子マーカー又は遺伝子マーカーを同定するための方法を包含し、以下の工程：
－ＴＯ－０２０１２２０及びＴＯ－０２０１２３３によって区切られたゲノム間隔、又は本発明の１０１個のＳＮＰのうちの１つの座位から２メガ塩基未満、好ましくは０．５メガ塩基未満で区切られたゲノム間の分子マーカー又は遺伝マーカーを同定する工程；
－ＴｏＢＲＦＶ耐性を示す植物から出された分離集団、例えば、寄託された種子に対応する植物から出された分離集団において、該分子マーカー又は遺伝子マーカーの対立遺伝子又は状態が、ＴｏＢＲＦＶ耐性の表現型と関連しているか、又は関連しているかどうかを決定する工程
を含む。
－ＴＯ－０２０１２２０及びＴＯ－０２０１２３３によって区切られたゲノム間隔、又は本発明の１０１個のＳＮＰのうちの１つの座位から２メガ塩基未満、好ましくは０．５メガ塩基未満で区切られたゲノム間の分子マーカー又は遺伝マーカーを同定する工程；
－ＴｏＢＲＦＶ耐性を示す植物から出された分離集団、例えば、寄託された種子に対応する植物から出された分離集団において、該分子マーカー又は遺伝子マーカーの対立遺伝子又は状態が、ＴｏＢＲＦＶ耐性の表現型と関連しているか、又は関連しているかどうかを決定する工程
を含む。
さらに別の態様によれば、本発明はまた、ＴｏＢＲＦＶ感染に対する耐性又は忍容性に関連する少なくとも１つの遺伝子マーカーの存在について、植物、好ましくはＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物又はトマトの生殖質を遺伝子型タイピングする方法に向けられ、この方法は、本発明の１０１個のマーカーのうちの少なくとも１つを含むか、又は上記に開示された代替分子マーカーのうちの少なくとも１つを含む核酸の試験植物のゲノムにおける決定又は検出を含む。好ましくは、本方法は、本発明のＳＮＰの耐性対立遺伝子の少なくとも１つを含む核酸において、ＴｏＢＲＦＶに対する耐性に関連する特異的配列を試験すべき植物の試料中で同定する工程を含む。
この方法の最も好ましい実施形態によれば、この方法は、ＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０の対立遺伝子Ｇ又はＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２９の対立遺伝子Ａを含む核酸の存在の試験された植物における検出を含む。
本発明はまた、ＱＴＬ１１に関して、及び配列番号１０２を有するマーカー及び配列番号１１５を有するマーカーによって染色体１１上に区切られた染色体領域に関して、同じ方法に関する。
この領域の関連マーカー又はＳＮＰは、好ましいリストと同様に、本発明において既に開示されている。
この領域の関連マーカー又はＳＮＰは、好ましいリストと同様に、本発明において既に開示されている。
本発明の耐性植物がＴｏＢＲＦＶ感染によって引き起こされる損傷を制限する能力に鑑み、それらは、有利には、ＴｏＢＲＦＶに寄生又は寄生又は感染される可能性のある環境下で増殖される；このような条件下では、本発明の耐性又は忍容性植物は、感受性植物よりも市場性の高いトマトを産生する。従って、本発明は、本発明の前の態様に従って定義されるように、第９染色体上のＱＴＬ９及び／又は第１１染色体上のＱＴＬ１１をそれらのゲノム中に含むトマト植物を成長させ、ＴｏＢＲＦＶに対する前記植物の耐性を付与することを含む、ＴｏＢＲＦＶによって感染された環境におけるトマト植物の収量を改善する方法にも関する。
好ましくは、本方法は、目的のＱＴＬ又は遺伝子移入配列を含むトマト植物を選択又は選択する第一段階を含む。この方法は、トマト畑、トンネル又はガラスハウスの生産性を向上させる方法、又はトマトの生産における化学的又は殺菌剤の用途の強度又は数を減少させる方法として定義することもできる。
また、本発明は、上記で定義したトマト植物を成長させることを含む、ＴｏＢＲＦＶの寄生又は感染の状態におけるトマト生産の損失を低減する方法に関する。
これらの方法は、フィールド、トンネル、ガラスハウスのいずれにおいても、トマト植物の個体群にとって特に有用である。
別法として、トマト生産の収量を改善し又は損失を低減するための前記方法は、ＴｏＢＲＦＶに耐性／忍容性のトマト植物を同定し、本発明のＱＴＬ９及び／又はＱＴＬ１１をそれらのゲノム中に含み、前記植物にＴｏＢＲＦＶ耐性を付与し、次に、前記耐性植物を、ウイルスが寄生するか又は寄生する可能性のある環境中で成長させる第一段階を含んでもよい。好ましい態様によれば、第一段階で同定される植物は、ＴＯ－０２０１２２９の対立遺伝子Ａ、又は配列番号１～１０１を有するＳＮＰの耐性対立遺伝子の少なくとも１つを含む。
本発明の耐性植物はまた、ＴｏＢＲＦＶの増殖を制限することができ、従って、さらなる植物の感染及びウイルスの増殖を制限する。従って、本発明はまた、フィールド、トンネル若しくはガラスハウス、又はその他のタイプのプランテーションを、ＴｏＢＲＦＶ感染から保護する方法、又は、前記フィールド、トンネル若しくはガラスハウスのＴｏＢＲＦＶによる感染のレベルを少なくとも制限する方法、又は、特にトマトのフィールド、トンネル若しくはガラスハウスにおけるＴｏＢＲＦＶの拡散を制限する方法に関する。そのような方法は、好ましくは、本発明の耐性又は忍容性植物、すなわち、そのゲノム中に第９染色体上のＱＴＬ９を含み、該植物ＴｏＢＲＦＶ耐性を付与する植物を成長させる工程を含む。使用される本発明の植物は、好ましくは、ＴＯ－０２０１２２９の対立遺伝子Ａ、又は配列番号１～１０１を有するＳＮＰの耐性対立遺伝子の少なくとも１つを含む。別の実施形態によれば、使用される植物は、配列番号１０２～１１５を有するマーカーの耐性対立遺伝子の少なくとも１つを含む。
本発明はまた、フィールド、トンネル、ガラスハウス、又は他のプランテーションにおけるＴｏＢＲＦＶ感染又は寄生を制御するためのＴｏＢＲＦＶ耐性植物の使用に関する。このような植物は、そのゲノム中に、ＱＴＬ９及び／又はＱＴＬ１１、又は上記定義のように第９染色体又は１１上のＳ．ｐｉｍｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ由来の遺伝子組換え配列を含む、本発明の植物である。この使用又は方法はまた、そのウイルス集団を減少させることによって、フィールド、トンネル又はガラスハウスを消毒するための方法でもある。
ＱＴＬのすべての好ましい特徴は、本発明の他の態様に関連して定義されたとおりであり、すなわち、好ましくはＬＶＳＴＢＲＦＶＲＥＳ２（ＮＣＩＭＢ受入番号４３５９１）の種子に存在し、ＱＴＬ９の場合は配列番号１～１０１を有するＳＮＰマーカーによって；好ましくは、ＱＴＬ９の場合は配列番号１～１４を有するＳＮＰマーカー、好ましくはＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２１の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２２の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２３の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２４の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２５の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２６の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２７の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２２８の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２２９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３０の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２３１の対立遺伝子Ｃ、ＱＴＬ９のＴＯ－０２０２１３２の対立遺伝子Ｇ及び／又はＴＯ－０２０１３３の対立遺伝子Ｇによって識別可能であり；ＱＴＬ１１の場合は配列番号１０２～１１５を有するマーカー、好ましくは、ＱＴＬ１１の場合はＴＯ－０２０１２３７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２３８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２４０の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２４１の対立遺伝子Ａ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９６８４４４９の対立遺伝子ＣＴ、ＳＬ２．５０ｃｈ ９７７９８９６１１の対立遺伝子ＡＴ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９８２３４０５の対立遺伝子Ｃ及び／又はＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９９２４２３２の対立遺伝子ＧＴによって識別可能である。
さらに別の態様では、本発明はまた、以下を含むトマトを製造する方法に関する：
ａ）ＱＴＬ９及び／又はＱＴＬ１１を含む本発明のＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物を生育すること；
ｂ）果実を結実させること；及び
ｃ）当該植物の果実を、好ましくは成熟時及び／又は成熟前に収穫すること。
ａ）ＱＴＬ９及び／又はＱＴＬ１１を含む本発明のＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物を生育すること；
ｂ）果実を結実させること；及び
ｃ）当該植物の果実を、好ましくは成熟時及び／又は成熟前に収穫すること。
ＱＴＬ９及びＱＴＬ１１に関するすべての好ましい実施形態は、本発明の先の態様の文脈において既に開示されている。この方法は、有利には、トマトをトマト加工食品に加工するさらなる工程を含んでもよい。
実施例１：材料及び方法。
１．Ａ．発生源の妥当性確認試験
この試験は、試験した系統又は遺伝的背景当たり約１５の植物の３つの反復を用いて実施した。
２葉の段階で植物を播種し、感染させた。その後、感染後７、１４、２８日目に葉の目視評価により採点を行った。この試験では、スケールは次のとおりであった：
９：無症状
５：中等度のモザイク及び／又は壊死症状
１：強力なモザイク及び／又は壊死症状
ＥＬＩＳＡ試験は、４つの系統について植物により実施され、２つの感受性対照についてはバルクで３２日後に実施された。
１．Ａ．発生源の妥当性確認試験
この試験は、試験した系統又は遺伝的背景当たり約１５の植物の３つの反復を用いて実施した。
２葉の段階で植物を播種し、感染させた。その後、感染後７、１４、２８日目に葉の目視評価により採点を行った。この試験では、スケールは次のとおりであった：
９：無症状
５：中等度のモザイク及び／又は壊死症状
１：強力なモザイク及び／又は壊死症状
ＥＬＩＳＡ試験は、４つの系統について植物により実施され、２つの感受性対照についてはバルクで３２日後に実施された。
１．Ｂ．Ｆ２集団の表現型タイピング
２葉の段階で植物を播種し、感染させた。その後、感染後７、１４、２８日目に葉の目視評価により採点を行った。この試験では、スケールは次のとおりであった：
９：無症状
７：軽度のモザイク症状
５：中等度のモザイク症状
３：強力なモザイク症状及び／又はバブリング
１：非常に強いモザイク症状及び／又はバブリング及び／又は変形
ＱＴＬ分析のために、異なる表現型変数／形質が、本発明者らによって使用され、特に１４ｄｐｉにおける注記、２１ｄｐｉにおける注記、２８ｄｐｉにおける注記、ＡＵＤＰＣが使用された。
ＡＵＤＰＣ（疾患進行曲線下面積）は、以下の式を用いて算出した。
２葉の段階で植物を播種し、感染させた。その後、感染後７、１４、２８日目に葉の目視評価により採点を行った。この試験では、スケールは次のとおりであった：
９：無症状
７：軽度のモザイク症状
５：中等度のモザイク症状
３：強力なモザイク症状及び／又はバブリング
１：非常に強いモザイク症状及び／又はバブリング及び／又は変形
ＱＴＬ分析のために、異なる表現型変数／形質が、本発明者らによって使用され、特に１４ｄｐｉにおける注記、２１ｄｐｉにおける注記、２８ｄｐｉにおける注記、ＡＵＤＰＣが使用された。
ＡＵＤＰＣ（疾患進行曲線下面積）は、以下の式を用いて算出した。
ここで、「ｎ」は症状評価回数、「ｙ」は症状の強さ（１～９回）、「ｔ」はｄｐｉ（接種後日数）の時間である。
１．３．ＤＮＡ抽出：
ＤＮＡは、ＮｕｃｌｅｏＭａｇ（登録商標）Ｐｌａｎｔキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を用いて、製造業者の手順に従って粉砕した葉から抽出した。ＤＮＡ精製は、植物組織からゲノムＤＮＡを単離するための磁気ビーズ１０技術に基づいた。ＤＮＡ濃度は、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ｄｓＤＮＡアッセイキットで定量した。
ＤＮＡは、ＮｕｃｌｅｏＭａｇ（登録商標）Ｐｌａｎｔキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を用いて、製造業者の手順に従って粉砕した葉から抽出した。ＤＮＡ精製は、植物組織からゲノムＤＮＡを単離するための磁気ビーズ１０技術に基づいた。ＤＮＡ濃度は、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ｄｓＤＮＡアッセイキットで定量した。
１．４．フィールド条件下でのＴｏＢＲＦＶ耐性評価のためのプロトコール
接種段階：植え付け後１０日目と１７日目。このように植物は２回感染した。各時点で、最も若い２枚の葉を接種する。最後に、４つの異なる葉を接種する。
接種段階：植え付け後１０日目と１７日目。このように植物は２回感染した。各時点で、最も若い２枚の葉を接種する。最後に、４つの異なる葉を接種する。
接種調製物：
単離：ＴｏＢＲＦＶ Ｊｏｒｄａｎ局所株２０１７。
ＴｏＢＲＦＶに感染した若葉は、ＴＹＬＣＶ（Ｔｙ）及びＴＭＶに耐性の植物から自然感染した植物から採取され、接種材料中に数種類のウイルスが存在しないようにする。
接種材料４ｍＬを粉砕して調製するには，ＴｏＢＲＦＶ症状のある若葉１ｇが必要である。
単離：ＴｏＢＲＦＶ Ｊｏｒｄａｎ局所株２０１７。
ＴｏＢＲＦＶに感染した若葉は、ＴＹＬＣＶ（Ｔｙ）及びＴＭＶに耐性の植物から自然感染した植物から採取され、接種材料中に数種類のウイルスが存在しないようにする。
接種材料４ｍＬを粉砕して調製するには，ＴｏＢＲＦＶ症状のある若葉１ｇが必要である。
接種の検証及び接種：
接種前に、接種材料中のＴｏＢＲＦＶの存在をＴＭＶイムノストリップ（このイムノストリップは特異的ではなく、ＴｏＢＲＦＶも認識する）を用いてチェックし、ＰｅｐＭＶ（Ｐｅｐｉｎｏ）の非存在をＰｅｐＭＶイムノトリップを用いてチェックする。感染植物がＴＭＶ耐性である限り、ＴＭＶ免疫ストリップによって接種材料中のＴｏＢＲＦＶの存在を検出することができる。
接種前に、接種材料中のＴｏＢＲＦＶの存在をＴＭＶイムノストリップ（このイムノストリップは特異的ではなく、ＴｏＢＲＦＶも認識する）を用いてチェックし、ＰｅｐＭＶ（Ｐｅｐｉｎｏ）の非存在をＰｅｐＭＶイムノトリップを用いてチェックする。感染植物がＴＭＶ耐性である限り、ＴＭＶ免疫ストリップによって接種材料中のＴｏＢＲＦＶの存在を検出することができる。
接種材料はＴＭＶ免疫ストリップで陽性、ＰｅｐＭＶ免疫ストリップで陰性である。
接種材料は、この葉を接種材料に浸した粗いスポンジで穏やかにこすることによって、試験する植物の２つの若葉に適用する。
症状評価
第１評価は、１番目の果実群が赤く、２番目の果実群が赤くなったときに実施する。
第２評価は、少なくとも第３クラスターが赤色の場合に行う。
第１評価は、１番目の果実群が赤く、２番目の果実群が赤くなったときに実施する。
第２評価は、少なくとも第３クラスターが赤色の場合に行う。
葉の症状のスケール
９：無症状／７：少葉弱症状／５：一部葉中程度症状／３：全葉中程度症状／１：全葉強い症状。
９：無症状／７：少葉弱症状／５：一部葉中程度症状／３：全葉中程度症状／１：全葉強い症状。
果実症状の尺度：
９：無症状の果実
７：１果又は数果の軽い症状（変色）
５：２～３個以上の果実で軽度／中程度の果実変色
３：果実の３０％以上で中／強の果実変色及び／又は小さな果実変形
１：果実の５０％以上に非常に強い変色及び／又は中／強の果実変形及び／又は果実壊死斑
９：無症状の果実
７：１果又は数果の軽い症状（変色）
５：２～３個以上の果実で軽度／中程度の果実変色
３：果実の３０％以上で中／強の果実変色及び／又は小さな果実変形
１：果実の５０％以上に非常に強い変色及び／又は中／強の果実変形及び／又は果実壊死斑
１．５．Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ ｓｐｐ耐性評価プロトコール
Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ ｓｐｐは植物病原菌であり、トマトの灰色葉斑の原因病原菌である。Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｐｉｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ由来のＳｍ遺伝子は、Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍに対する遺伝的優性耐性を提供する。
Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ ｓｐｐは植物病原菌であり、トマトの灰色葉斑の原因病原菌である。Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｐｉｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ由来のＳｍ遺伝子は、Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍに対する遺伝的優性耐性を提供する。
接種調製物：
Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ、Ｓｉｃｉｌｉａｎ株は－８０℃で保存し、Ｖ８培地で培養後、凍結保存した試験管から接種材料を直接調製する。分生子は、培地の表面を引っかき、１％グルコースで水中に懸濁し、次に、ムスリン上で濾過することによって得られる。１０４～１０５／ｍＬの分生子を含む液を得る。
Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ、Ｓｉｃｉｌｉａｎ株は－８０℃で保存し、Ｖ８培地で培養後、凍結保存した試験管から接種材料を直接調製する。分生子は、培地の表面を引っかき、１％グルコースで水中に懸濁し、次に、ムスリン上で濾過することによって得られる。１０４～１０５／ｍＬの分生子を含む液を得る。
接種：
試験する小植物は、播種後１７～２４日に対応する３つの未折り畳み葉の段階である。接種材料は、液滴が形成されるまで、すべての葉面にスプレーすることによって塗布される。
試験する小植物は、播種後１７～２４日に対応する３つの未折り畳み葉の段階である。接種材料は、液滴が形成されるまで、すべての葉面にスプレーすることによって塗布される。
症状の評価：
その後、感染後７～８日目に葉の視覚的評価により採点を行った。この試験では、スケールは次のとおりであった：
９：無症状
７：感受性の高い植物よりも数が少ない茶色の壊死性病変
１：葉の両面に小さいか大きい茶色の壊死性病変
その後、感染後７～８日目に葉の視覚的評価により採点を行った。この試験では、スケールは次のとおりであった：
９：無症状
７：感受性の高い植物よりも数が少ない茶色の壊死性病変
１：葉の両面に小さいか大きい茶色の壊死性病変
実施例２：ＴｏＢＲＦＶ耐性のドナーの同定及びＱＴＬの予備的マッピング
ＴｏＢＲＦＶ耐性のための適切な野生ドナーの同定
５００を超える異なる野生系統を、これらの野生系統における耐性を付与する配列を、特に商業的植物におけるＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍバックグラウンドに潜在的に侵入させる目的で、ＴｏＢＲＦＶに対する潜在的な耐性源を同定するために、本発明者らによってスクリーニングされた。
ＴｏＢＲＦＶ耐性のための適切な野生ドナーの同定
５００を超える異なる野生系統を、これらの野生系統における耐性を付与する配列を、特に商業的植物におけるＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍバックグラウンドに潜在的に侵入させる目的で、ＴｏＢＲＦＶに対する潜在的な耐性源を同定するために、本発明者らによってスクリーニングされた。
本発明者らが期待した耐性のタイプは果実忍容性／耐性であったが、このような試験は果実の大きさ及び形態が異なる野生系統には適用することができない。従って、本発明者らは、このパラメータをスクリーニングすることができないため、果実耐性の代用として、葉症状試験の供給源をランク付けすることを決定した。
スクリーニングした野生系統のうち、Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ、Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ、Ｓ．ｐｉｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ種では、４つの潜在的感染源（０．９％）のみが同定され、他のウイルスとは異なり、ＴｏＢＲＦＶに対する耐性感染源を見つけることが困難であることが示された。
これらの供給源はいずれも無症状植物の割合が高かったが、これらの植物はすべてＥＬＩＳＡ法で陽性であり、全耐性又は免疫性は認められなかった。
対照には、ＴｏＢＲＦＶに感受性があることが知られているＳ１及びＳ２を用いた。しかし、対照植物Ｓ２はＴｍ－２２遺伝子の存在によりＴＭＶに耐性を示した。
耐性／忍容性の可能性を植物の葉で評価した；実際、これらの野生系統の果実の異なる形状、色、サイズを考慮すると、果実レベルでの耐性のランク付けはできなかった。
表Ａは、得られた結果を報告する。
しかしながら、３２ｄｐｉ後、ＥＬＩＳＡ法では全植物が陽性を示し、これらの植物によって運ばれる耐性は全部ではないことが示された（表Ａ）。
得られた結果を考慮して、本発明者らは、２８ｄｐｉでより良好な葉耐性レベルを示す供給源Ｄに焦点を当てることを決定したが、本研究の目的は、葉耐性の原因ではなく、ソース果実耐性を同定することであった。
Ｆ２マッピング－ＨＭＣ１＊供給源Ｄ－人工試験
各々２４０個体の４つのＦ２集団が、感受性親ＨＭＣ１と耐性野生線源Ｄを交配することによって開発された。ＨＭＣ１は、約１００ｇの赤丸果実を有する不定増殖系統であり、Ｔｍ－２２遺伝子を含む。
各々２４０個体の４つのＦ２集団が、感受性親ＨＭＣ１と耐性野生線源Ｄを交配することによって開発された。ＨＭＣ１は、約１００ｇの赤丸果実を有する不定増殖系統であり、Ｔｍ－２２遺伝子を含む。
視覚的スコアリングは、７、１４、２８ｄｐｉ（前述の表Ｂ参照）の異なる日付で行われている。
人工条件下でのＦ２スクリーニングの結果を表Ｂに示す。すなわち、１～９段階で評価し、「１」又は「３」のスコアの植物を感受性とみなし、「５」のスコアの植物を中程度の耐性とみなし、「７」又は「９」のスコアの植物を葉の耐性に関して高耐性とみなす。
コラム４－８では、１、３、５、７、及び９のスコアを持つ植物の数を報告する。コラム９（１＝Ｓ）は、スコアが１、３、５、又は７の植物数を示す。コラム１０（９＝Ｒ）は、スコアが９の植物の数を示す。コラム１１とコラム１２は、「Ｓ」（スコア１、３、５、又は７）及び「Ｒ」（スコア９）と評価された植物の割合を報告している。
ＱＴＬ解析
実施例１に詳述したようにＤＮＡを抽出した。ＱＴＬ分析のために、発明者らは異なる表現型変数／形質を使用した：注１４ｄｐｉ、注２１ｄｐｉ、注２８ｄｐｉ、ＡＵＤＰＣ。ＡＵＤＰＣ（疾患進行曲線下面積）は、以下の式を用いて算出した。
実施例１に詳述したようにＤＮＡを抽出した。ＱＴＬ分析のために、発明者らは異なる表現型変数／形質を使用した：注１４ｄｐｉ、注２１ｄｐｉ、注２８ｄｐｉ、ＡＵＤＰＣ。ＡＵＤＰＣ（疾患進行曲線下面積）は、以下の式を用いて算出した。
ここで、「ｎ」は症状評価回数、「ｙ」は症状の強さ（１～９回）、「ｔ」はｄｐｉ（接種後日数）の時間である。
Ｆ２集団の遺伝子型タイピング（供給源Ｄ及びＨＭＣ１に基づく）は、１６９のＳＮＰセットを用いて行った。これらのＳＮＰは、以下に従って選択された：
・多型／対立遺伝子頻度
・物理地図距離に応じて均等に配置されたＳＮＰ
・多型／対立遺伝子頻度
・物理地図距離に応じて均等に配置されたＳＮＰ
ＱＴＬ分析は、ＭＡＳＴ－Ａマーカー支援選択ツール（専有ソフトウェア）における二親集団のＱＴＬ検出（ＡＮＯＶＡ）モデルを用いて行った。
マッピング結果（ＡＵＤＰＣに対応する形質についてのＰｖａｌｕｅプロットを示す図１を参照）は、ＴｏＢＲＦＶ耐性に関連する２つのＱＴＬ候補を明らかにした。この２つのＱＴＬ候補は、第９染色体（ＱＴＬ９）及び第１１染色体（ＱＴＬ１１）に位置し、Ｓｏｕｒｃｅ Ｄに由来する正の対立遺伝子である。
ＴｏＢＲＦＶ耐性に関連するＱＴＬ９及びＱＴＬ１１と有意に関連するマーカー及びトマトゲノム上のそれらの位置を表Ｃに要約する。
結果は、ＴｏＢＲＦＶ耐性に関与するＱＴＬ９が、トマトゲノムのバージョンＳＬ２．５０上の位置３９８７２９６と位置４００３９５８７の間の第９染色体上に位置することを示した。第９染色体のこの領域は組換え率が低いことが知られている領域である。
ＱＴＬ１１の原因であるＴｏＢＲＦＶ耐性は、トマトゲノムのバージョンＳＬ２．５０に基づいて、第１１染色体上、４５２４６７１位に位置する。
実施例３：ＱＴＬマッピング及び検証。フィールドテスト。
ＢＣ１Ｆ２ ＱＴＬマッピング及び検証
供給源Ｄと感受性親ＨＭＣ１の間のＢＣ１Ｆ２集団は、表Ｃに記載されたＳＮＰを用いて開発されており、１５８の個々の植物は、実施例１に記載されているように、ヨルダンにおいてフィールド接種条件下で表現型分類されている。
ＢＣ１Ｆ２ ＱＴＬマッピング及び検証
供給源Ｄと感受性親ＨＭＣ１の間のＢＣ１Ｆ２集団は、表Ｃに記載されたＳＮＰを用いて開発されており、１５８の個々の植物は、実施例１に記載されているように、ヨルダンにおいてフィールド接種条件下で表現型分類されている。
果実の症状を９～１のスケールで評価した：
９：無症状－７：少数の果実に弱い症状－５：一部の果実に中程度の症状－３：すべての果実に中程度の症状－１：強い症状。
９：無症状－７：少数の果実に弱い症状－５：一部の果実に中程度の症状－３：すべての果実に中程度の症状－１：強い症状。
表Ｄは、フィールド接種条件下でのＢＣ１Ｆ２スクリーニングの結果を示している。すなわち、植物は１～９の尺度で評価され、１又は３のスコアをもつ植物は感受性であるとみなされ、５のスコアをもつ植物は中間耐性であるとみなされ、７又は９のスコアをもつ植物は高度耐性であるとみなされる。Ｓ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ由来の果実のサイズが小さいため、供給源Ｄの果実評価は行わなかった。
実施例１に記載したように、葉からＤＮＡを抽出した。
ＢＣ１Ｆ２集団は、Ｆ２マッピング集団におけるＴｏＢＲＦＶ耐性と有意に関連するＳＮＰのサブセットを用いて遺伝子型タイピングを行った。マーカー形質関連は、ＭＡＳＴ－Ａマーカー支援選択ツール（専有ソフトウェア）におけるクロスＡＮＯＶＡによって行われた。
マッピング結果は、ＱＴＬ９がＴｏＢＲＦＶに対する果実耐性に関連すること、すなわち、既に葉耐性に関連する同じ領域であることを明らかにした。
ＢＣ３Ｆ２ ＱＴＬマッピング－フィールドテスト
供給源ＤとＨＭＣ１の間にそれぞれ約１４０のＢＣ３ ３Ｆ２集団を接種フィールド条件下で評価した。接種及び症状の評価のプロトコールは、ＢＣ１Ｆ２に使用され、実施例１に記載されたプロトコールと同一である。これらの植物のスコアは表Ｅに詳述されており、スコア１～９の尺度はＢＣ１Ｆ２の場合と同様である。
供給源ＤとＨＭＣ１の間にそれぞれ約１４０のＢＣ３ ３Ｆ２集団を接種フィールド条件下で評価した。接種及び症状の評価のプロトコールは、ＢＣ１Ｆ２に使用され、実施例１に記載されたプロトコールと同一である。これらの植物のスコアは表Ｅに詳述されており、スコア１～９の尺度はＢＣ１Ｆ２の場合と同様である。
実施例１に記載したように、葉からＤＮＡを抽出した。
ＢＣ３Ｆ２個体は、Ｆ２マッピング集団におけるＴｏＢＲＦＶ耐性に関連すると同定された第９及び第１１染色体上の多型ＳＮＰのサブセットで遺伝子型タイピングを行った。
第９及び第１１染色体の遺伝パップは、マーカーの位置及び順序を確認するためにＪｏｉｎＭａｐソフトウェアを用いて作成した。
ＱＴＬ検出は、ＭａｐＱＴＬソフトウェア及びこれらの家系で行われた遺伝マップを用いて行った。
ＱＴＬマッピングの結果は、ＴｏＢＲＦＶに対する果実耐性に関して第９染色体上の主要なＱＴＬの存在を確認する。ピーク関連マーカーは表Ｆに記載されている。
実施例４：系統の再配列決定及び固有のＳＮＰの同定
ＷＯ２０１８／２１９９４１（ＨＡＺＴＢＲＦＶＲＥＳ１）で使用された供給源Ｄ及び系統を含むＴｏＢＲＦＶの３つの忍容性／耐性源、及び再発性マッピング集団で使用された３つの感受性系統を含む６つのトマト系統を再配列した。
ＷＯ２０１８／２１９９４１（ＨＡＺＴＢＲＦＶＲＥＳ１）で使用された供給源Ｄ及び系統を含むＴｏＢＲＦＶの３つの忍容性／耐性源、及び再発性マッピング集団で使用された３つの感受性系統を含む６つのトマト系統を再配列した。
種子を播種し、新鮮な葉からＤＮＡを抽出し、全ゲノム配列決定を行った。
順序付けられたシーケンス深さは最小２０倍であった。配列決定はＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑ ２ｘ１５０ｎｔ技術を用いて行った。
読み取り値はＳＬ２．４０トマト参照ゲノム上にマッピングし、バリアント呼び出し分析はｓａｍｔｏｏｌｓを用いて行った。供給源ＤからのＳＮＰを可能な限り固有に同定するために、ＳＮＰを濾過し、供給源Ｄで見出された対立遺伝子を、プロジェクトの他の系統で同定されたＳＮＰの対立遺伝子及び３６０のトマトゲノムと比較した（“Genomic analyses provide insights into the history of tomato breeding”; Lin et al. Nature Genetics, 2014）。
これに基づいて、ＱＴＬ９（ＳＬ２．４０ｃｈ０９：１０Ｍｂ～５５Ｍｂ）を含む区間において、供給源Ｄからの３１０の固有ＳＮＰを同定した。最良のものを選択するために、いくつかの品質のフィルターを適用した（トマトゲノム上の固有なＢｌａｓｔ及び隣接配列中の％ＡＴ）。
１０１個のＳＮＰのリストが選択された（表Ｈ参照）。１４個のＳＮＰ（表Ｇ参照）が大規模な背景パネルで試験され、ＱＴＬ９の存在を追跡する能力が確認されている。これらのうち５つのＳＮＰ（表Ｇ参照）は、供給源Ｄに対する特異性という点で非常に良好な結果を示している。
１０１個のＳＮＰのリストが選択された（表Ｈ参照）。１４個のＳＮＰ（表Ｇ参照）が大規模な背景パネルで試験され、ＱＴＬ９の存在を追跡する能力が確認されている。これらのうち５つのＳＮＰ（表Ｇ参照）は、供給源Ｄに対する特異性という点で非常に良好な結果を示している。
表Ｇ：ＱＴＬ９間隔における線源Ｄ再配列決定からの１４個の特定のＳＮＰのリスト。表には、１４個のＳＮＰの名前、ＳＬ２．５０ゲノム中の位置、括弧内の多型を伴う配列、及び感受性対立遺伝子と耐性対立遺伝子が示されている。非常に良好な結果を示す５個のＳＮＰをアスタリスクで示す。
多型は括弧内に示す。
「Ｓ」の列は、感受性対立遺伝子、すなわち再発性親ＨＭＣに存在することを報告し、一方、「Ｒ」の列は、供給源Ｄに見られるように、耐性対立遺伝子を示した。
「Ｓ」の列は、感受性対立遺伝子、すなわち再発性親ＨＭＣに存在することを報告し、一方、「Ｒ」の列は、供給源Ｄに見られるように、耐性対立遺伝子を示した。
表Ｈ：ＱＴＬ９間隔における線源Ｄ再配列決定からの１０１個の特定のＳＮＰのリスト。表Ｈは、ＳＬ２．５０ゲノム中の位置、配列リスト中の配列の配列番号、及び本発明者により同定された１０１個のＳＮＰの感受性対立遺伝子及び耐性対立遺伝子を示す。上述の１４個のＳＮＰ及び５個のＳＮＰが非常に良好な結果を示しており、それぞれ１つ又は２つのアスタリスクによって示されている。
したがって、これらのＳＮＰは、本発明に記載されるようにＱＴＬ９を有する植物と、ＴｏＢＲＦＶに対する忍容性を付与する第９染色体上の異なるＱＴＬを有するＷＯ２０１８／２１９９４１に記載されるＨＡＺＴＢＲＦＶＲＥＳ１に由来する植物との間の識別を可能にする。したがって、本発明に開示されたＱＴＬは、ＷＯ２０１８／２１９９４１に開示されたＱＴＬとは、配列の観点から明らかに異なる。
実施例５：フィールド試験における新しいＱＴＬ９の特性評価
ヨルダンで２つの異なる試験が実施され、本発明のＱＴＬ９及びＷＯ２０１８／２１９９４１に記載されたＱＴＬの配列の相違に加えて、これらの相違する配列がＴｏＢＲＦＶに対する異なるタイプの耐性を付与することを確認した。
ヨルダンで２つの異なる試験が実施され、本発明のＱＴＬ９及びＷＯ２０１８／２１９９４１に記載されたＱＴＬの配列の相違に加えて、これらの相違する配列がＴｏＢＲＦＶに対する異なるタイプの耐性を付与することを確認した。
第１の試験Ｔ１（３７２植物）は、異なるエリート線（チェック）、実施例２～４に記載した対照Ｓ１及びＳ２、ならびにＷＯ２０１８／２１９９４１に記載した第９染色体及び１１上のＱＴＬを含む植物を用いて、夏に１つのトンネルで実施された。
２番目の試験Ｔ２（１１６５個の植物）は、２つのトンネルで、以前の試験Ｔ１と同じエリート線（チェック）と対照からなる２つのトンネルと、実施例４で述べた線源Ｄから発行されたＢＣ３Ｆ２で、次の冬に実施された。
この実施例では、試験した植物の第６及び第９染色体上のＱＴＬ９及びＱＴＬ１１の座位に見出される配列のタイプ／起源を以下のように定義する。
→ＱＴＬ９及びＱＴＬ１１の遺伝子座でエリート系列に見出される配列、及びエリート系統におけるこれらの遺伝子座の伸長により「対立遺伝子」は、「Ｒｅ」としてコードされる；
→ＱＴＬ９及びＱＴＬ１１の座位にある感受性株Ｓ１及びＳ２（感受性株におけるこれらの座位の「対立遺伝子」）に見出される配列は、「Ｓ」としてコードされる；
→ＷＯ２０１８／２１９９４１に記載されているＨＡＺＴＢＲＦＶＲＥＳ１に由来する忍容性／耐性植物においてＱＴＬ９及びＱＴＬ１１の座位で見出される配列（ＨＡＺＴＢＲＦＶＲＥＳ１のこれらの座位の「対立遺伝子」）は、「Ｒｈ」としてコードされる；
→ＱＴＬ９及びＱＴＬ１１の座位で供給源Ｄから発行された耐性植物ＢＣ３Ｆ２（本発明の植物におけるこれらの座位の「対立遺伝子」）に見出される配列は、「Ｒｄ」としてコードされる。
→ＱＴＬ９及びＱＴＬ１１の遺伝子座でエリート系列に見出される配列、及びエリート系統におけるこれらの遺伝子座の伸長により「対立遺伝子」は、「Ｒｅ」としてコードされる；
→ＱＴＬ９及びＱＴＬ１１の座位にある感受性株Ｓ１及びＳ２（感受性株におけるこれらの座位の「対立遺伝子」）に見出される配列は、「Ｓ」としてコードされる；
→ＷＯ２０１８／２１９９４１に記載されているＨＡＺＴＢＲＦＶＲＥＳ１に由来する忍容性／耐性植物においてＱＴＬ９及びＱＴＬ１１の座位で見出される配列（ＨＡＺＴＢＲＦＶＲＥＳ１のこれらの座位の「対立遺伝子」）は、「Ｒｈ」としてコードされる；
→ＱＴＬ９及びＱＴＬ１１の座位で供給源Ｄから発行された耐性植物ＢＣ３Ｆ２（本発明の植物におけるこれらの座位の「対立遺伝子」）に見出される配列は、「Ｒｄ」としてコードされる。
実施例１に記載したように、植物には２回、植え付け後１週間目に１回、２週間目に２回接種した。
次に、果実及び葉の症状に関して、例１．４に記載した尺度に従って、植物をスコア化した。しかし、成葉期（赤い果実を持つ植物）で葉症状を評価する限り、葉症状は希少な若葉を考慮して評価することは困難であった。
結果の統計解析
他の潜在的影響、すなわち、ＱＴＬ１１座に見出される「対立遺伝子」、植物の遺伝子型、及びトンネルの効果を考慮して、植物のＱＴＬ９座に見出される「対立遺伝子」によって付与される耐性のレベルを決定するために、混合モデルを用いてデータを分析した。混合モデルは以下の通りであった：
スコア＝μ＋（遺伝子型）ランダム＋トンネル＋ＱＴＬ９＋ＱＴＬ１１＋ε
ここで、スコア（果実耐性又は葉耐性）は観察された変数であり、μは形質の平均値であり、εは残差誤差であり、（遺伝子型）ランダム、トンネル、ＱＴＬ９及びＱＴＬ１１は影響である。
他の潜在的影響、すなわち、ＱＴＬ１１座に見出される「対立遺伝子」、植物の遺伝子型、及びトンネルの効果を考慮して、植物のＱＴＬ９座に見出される「対立遺伝子」によって付与される耐性のレベルを決定するために、混合モデルを用いてデータを分析した。混合モデルは以下の通りであった：
スコア＝μ＋（遺伝子型）ランダム＋トンネル＋ＱＴＬ９＋ＱＴＬ１１＋ε
ここで、スコア（果実耐性又は葉耐性）は観察された変数であり、μは形質の平均値であり、εは残差誤差であり、（遺伝子型）ランダム、トンネル、ＱＴＬ９及びＱＴＬ１１は影響である。
トンネル効果は、すべてのトンネルに存在するチェックの結果、推定された。
遺伝子型効果は、試験された品種が出現する個体群の変動を捕らえるための変量効果として扱われた。
ＱＴＬ９遺伝子座の各遺伝子型、及び各形質（果実症状及び葉症状）について、発明者らは、他の効果とは無関係に、各遺伝子型の可能性をより良く推定するために、調整値を抽出した。
例えば、Ｒｄ／Ｒｄに対応する遺伝子型の場合、調整値は次のようになる：
μ＋ＱＴＬ９［ＲｄＲｄ］＋平均（遺伝子型）＋平均（トンネル）＋平均（ＱＴＬ１１）
ここで、μは形質（果実症状又は葉の症状）の推定平均値であり、ＱＴＬ９［Ｒｄ／Ｒｄ］はＱＴＬ９の遺伝子型ＲｄＲｄの推定効果であり、平均（遺伝子型）、平均（トンネル）及び平均（ＱＴＬ１１）は対応する推定効果の平均である。Ｔｕｋｅｙ検定を用いて調整値間の多重比較を行った。
μ＋ＱＴＬ９［ＲｄＲｄ］＋平均（遺伝子型）＋平均（トンネル）＋平均（ＱＴＬ１１）
ここで、μは形質（果実症状又は葉の症状）の推定平均値であり、ＱＴＬ９［Ｒｄ／Ｒｄ］はＱＴＬ９の遺伝子型ＲｄＲｄの推定効果であり、平均（遺伝子型）、平均（トンネル）及び平均（ＱＴＬ１１）は対応する推定効果の平均である。Ｔｕｋｅｙ検定を用いて調整値間の多重比較を行った。
結果：
果実症状に対するＱＴＬ９の効果：
果実症状に対応する形質について、ＱＴＬ９遺伝子座に関する異なる試験遺伝子型の調整値を、上記で詳述した混合モデルを用いて計算した。結果を表Ｉに報告し、図２Ａ及び２Ｂに示す。
果実症状に対するＱＴＬ９の効果：
果実症状に対応する形質について、ＱＴＬ９遺伝子座に関する異なる試験遺伝子型の調整値を、上記で詳述した混合モデルを用いて計算した。結果を表Ｉに報告し、図２Ａ及び２Ｂに示す。
これらの結果から、本発明で定義されるＱＴＬ９の存在（この実施例ではＲｄ遺伝子型に対応する）は、ＷＯ２０１８／２１９９４１で定義されるＱＴＬ２によって提供される耐性のレベル（この実施例ではＲｈ遺伝子型に対応する）と有意に異なり、有意に高い耐性のレベルを提供すると推定することができる。
さらに、果実耐性に対するＱＴＬ９の対立遺伝子の影響の分析は、下記に示すように（表Ｉの抽出物）、図３に示すように、Ｒｄ対立遺伝子の有意な相加効果を示す。
果実スコアの再分配もまたＱＴＬ９遺伝子型によって決定されている。結果を図４に示す。
これらの結果から示されるように、本発明のＱＴＬ９は、ホモ接合状態（この例では遺伝子型ＲｄＲｄ）で存在する場合、果実スコアが５、７又は９（２０８のうち、それぞれ４８、６１及び５９植物）である植物の８０％以上を与える。約６０％の植物（２０８個体中１２０個体）は、２回の感染後に７又は９のスコアを示す。すなわち、果実にはほとんど症状がない。
これらの結果はまた、本発明によるＱＴＬ９が、ヘテロ接合状態（この例では遺伝子型ＲｄＳ）で存在する場合、果実スコアがそれぞれ５、７又は９（それぞれ２２５のうち６３、３６及び１３の植物）の植物の約５０％を与えることを確認する。約２２％の植物（２２５のうち４９）は、２回の感染後に７又は９のスコアを示す。すなわち、果実にはほとんど症状がない。
これに対して、ＲｈＲｈ遺伝子型についても、約８０％の植物が５、７、９の果実スコアを有しているが、３５％未満の植物は、それぞれ７、９のスコア（８９のうちそれぞれ３０及び１）を有しており、２回の感染後、果実にほとんど症状がない。
葉症状におけるＱＴＬ９効果：
葉の症状に対応する形質については、ＱＴＬ９遺伝子座に関する異なる試験遺伝子型の調整値を、上記で詳述した混合モデルを用いて計算した
結果を表Ｊに報告し、図５に示す。
葉の症状に対応する形質については、ＱＴＬ９遺伝子座に関する異なる試験遺伝子型の調整値を、上記で詳述した混合モデルを用いて計算した
結果を表Ｊに報告し、図５に示す。
これらの結果から、本発明で定義されたＱＴＬ９の存在（この実施例ではＲｄ遺伝子型に対応する）は、ＷＯ２０１８／２１９９４１で定義されたＱＴＬ２によって提供される葉耐性のレベル（この実施例ではＲｈ遺伝子型に対応する）と有意に異なり、有意に高い葉耐性のレベルを提供すると推定できる。さらに、この結果は、ＱＴＬ９のヘテロ接合性の存在が高いレベルの葉耐性を提供するのに十分であることも示している（遺伝子型ＲｄＲｄ及びＲｄＳの調整値は統計的に同一である）。
実施例６：第１１染色体上の固有なＳＮＰのライン再配列決定及び同定
第９染色体上のＱＴＬについて実施例４に開示されたのと同じ実験を、発明者らにより同定された第１１染色体上のＱＴＬに適用した。ＳＮＰ分析は、同じ植物集団について実施した。
第９染色体上のＱＴＬについて実施例４に開示されたのと同じ実験を、発明者らにより同定された第１１染色体上のＱＴＬに適用した。ＳＮＰ分析は、同じ植物集団について実施した。
本発明によるＱＴＬ１１の存在に関して有益なＳＮＰは、下記の表Ｋ（配列番号１０２～１１１）、ならびにゲノムのＳＬ２．５０バージョンにおけるそれらの位置、及び感受性及び耐性対立遺伝子に報告される。
その後、本発明者らは、ＴｏＢＲＦＶ耐性を付与する遺伝子組換え配列の存在に関して有益な追加マーカーを同定するために、さらなる調査を行った。これらのマーカーは、ＴｏＢＲＦＶ耐性を付与する供給源Ｄ由来の遺伝子組換え配列に非常に特異的である。
実施例７：エチルメタンスルホン酸エステル（ＥＭＳ）によるトマト種子の遺伝子改変
トマト品種の種子は、０．５％（ｗ／ｖ）又は０．７％ＥＭＳのいずれかの通気溶液に、室温で２４時間、品種あたり約２０００種の種子を浸漬することによりＥＭＳで処理する。
トマト品種の種子は、０．５％（ｗ／ｖ）又は０．７％ＥＭＳのいずれかの通気溶液に、室温で２４時間、品種あたり約２０００種の種子を浸漬することによりＥＭＳで処理する。
ＥＭＳ投与量あたり品種あたり約１５００個の処理種子を発芽させ、得られた植物を、好ましくは、例えば５月から９月にかけて、温室内で成長させて種子を生産する。成熟後、Ｍ２種子を収穫し、処理ごとに１つの品種につき１プールでバルクする。得られたＭ２種子のプールを出発物質として用いて、個々のＭ２種子及びトマトブラウンルゴースフルーツウイルスに対する耐性を有する植物を同定する。
実施例８：Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍに対する耐性
ＷＯ２０２０／０１８７８３は、Ｓ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ由来のＳｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ耐性対立遺伝子を含むトマト染色体１１上ノの遺伝的領域を開示しており、また、ＴＢＲＦＶ耐性対立遺伝子もまた、それらは非常に密接に連鎖しており、それらは非常に同一のマーカーによって特徴付けられ、従って、同時侵入すると主張されている。本発明者らにより同定された第１１染色体上のＱＴＬが、ＷＯ２０２０／０１８７８３に開示された耐性対立遺伝子と異なることを確認するために、本発明者らは、本発明による植物をＳｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍに対する耐性について試験した。Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ耐性のプロトコールは、実施例１．５に開示されているとおりである。
ＷＯ２０２０／０１８７８３は、Ｓ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ由来のＳｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ耐性対立遺伝子を含むトマト染色体１１上ノの遺伝的領域を開示しており、また、ＴＢＲＦＶ耐性対立遺伝子もまた、それらは非常に密接に連鎖しており、それらは非常に同一のマーカーによって特徴付けられ、従って、同時侵入すると主張されている。本発明者らにより同定された第１１染色体上のＱＴＬが、ＷＯ２０２０／０１８７８３に開示された耐性対立遺伝子と異なることを確認するために、本発明者らは、本発明による植物をＳｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍに対する耐性について試験した。Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ耐性のプロトコールは、実施例１．５に開示されているとおりである。
結果：
５つの異なる遺伝子型から１５７以上の異なる植物を試験し、遺伝子型あたり少なくとも１８の反復を行った。
試験した遺伝子型／品種は以下の通りであった。
－Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ耐性対照（Ｒ）１例
－Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ中間耐性対照（ＩＲ）１例
－Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ感受性対照（Ｓ）１例
－供給源Ｄ
－ＢＣ５Ｆ３ ＨＭＣ１＊供給源Ｄ
５つの異なる遺伝子型から１５７以上の異なる植物を試験し、遺伝子型あたり少なくとも１８の反復を行った。
試験した遺伝子型／品種は以下の通りであった。
－Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ耐性対照（Ｒ）１例
－Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ中間耐性対照（ＩＲ）１例
－Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ感受性対照（Ｓ）１例
－供給源Ｄ
－ＢＣ５Ｆ３ ＨＭＣ１＊供給源Ｄ
Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ耐性の結果を以下の表Ｌに示す。
表Ｌ：Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ耐性。「平均値」は、１．５に詳述した症状評価に従い、同一科の全植物の平均スコアを示す。解釈は、その品種が耐性（Ｒ）であるか感受性（Ｓ）であるかを示す。ＱＴＬ１１は、本発明によるＱＴＬであり、その存在は、前述の実施例に開示されたマーカーで試験される。ＮＴは試験しないことを意味する。
結論：ＴｏＢＲＦＶ耐性を提供する本発明による供給源ＤからのＱＴＬ１１は、本発明のＱＴＬ１１を含むが、試験植物はステンフィリウムに耐性ではないため、ＷＯ２０２０／０１８７８３によるＴｏＢＲＦＶ遺伝的耐性とは対照的に、ステンフィリウム耐性とは関連しない。
したがって、本発明のＱＴＬ１１は、染色体１１上のＷＯ２０２０／０１８７８３に開示された耐性とは異なると結論付けることができる。
実施例９：ＱＴＬ１１により提供されるＴｏＢＲＦＶ耐性の分析
供給源Ｄと感受性の親ＨＭＣ２の間のＦ２集団が得られている。ＨＭＣ２は葉レベルでＴｏＢＲＦＶに対する感受性が高い系統である。実施例１．Ｂに記載されているように、葉症状のためにＴｏＢＲＦＶ接種後に１３４の個々の植物体を表現型決定し、ＱＴＬ１１のＳＮＰマーカーに基づいて遺伝子型決定した。
供給源Ｄと感受性の親ＨＭＣ２の間のＦ２集団が得られている。ＨＭＣ２は葉レベルでＴｏＢＲＦＶに対する感受性が高い系統である。実施例１．Ｂに記載されているように、葉症状のためにＴｏＢＲＦＶ接種後に１３４の個々の植物体を表現型決定し、ＱＴＬ１１のＳＮＰマーカーに基づいて遺伝子型決定した。
葉の症状に対応する形質については、ＱＴＬ１１遺伝子座に関する異なる試験遺伝子型の調整値を、ＱＴＬ９に使用したモデルと同様の混合モデルを用いて計算した。結果を表Ｍに報告し、図６に示す。
ＱＴＬ１１における対立遺伝子の葉耐性への影響の分析は、表Ｍに示され、図６に示されるように、耐性対立遺伝子の有意な劣性効果を示す。
Claims (30)
- トマトブラウンルゴースフルーツウイルス（ＴｏＢＲＦＶ）に耐性を示すＳｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物であって、ゲノム中に、第９染色体（ＱＴＬ９）上に量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）及び／又は第１１染色体（ＱＴＬ１１）上にＱＴＬを含み、ここで、該ＱＴＬの各々は、Ｓ．ｐｉｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍから遺伝子移入され、植物にＴｏＢＲＦＶに対する耐性を付与し、
－第９染色体上の前記ＱＴＬは、ＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０（配列番号１）及び配列番号１０１を有するＳＮＰによって区切られた染色体領域内に位置し、
－第１１染色体上の前記ＱＴＬは、配列番号１０２を有するＳＮＰ及び配列番号１１５を有するマーカーによって区切られた染色体領域内に位置する、上記Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物。 - 前記ＱＴＬ（複数可）が、ＬＶＳＴＢＲＦＶＲＥＳ２ ＮＣＩＭＢ受託番号４３５９１の種子のゲノム中に存在する、請求項１に記載の植物。
- 第９染色体上の前記ＱＴＬが、配列番号１～１０１を有するＳＮＰマーカーの１つ、好ましくはＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０（配列番号１）、ＴＯ－０２０１２２１（配列番号２）、ＴＯ－０２０１２２２（配列番号３）、ＴＯ－０２０１２２３（配列番号４）、ＴＯ－０２０１２２４（配列番号５）、ＴＯ－０２０１２２５（配列番号６）、ＴＯ－０２０１２２６（配列番号７）、ＴＯ－０２０１２２７（配列番号８）、ＴＯ－０２０１２２８（配列番号９）、ＴＯ－０２０１２２９（配列番号１０）、ＴＯ－０２０１２３０（配列番号１１）、ＴＯ－０２０１２３１（配列番号１２）、ＴＯ－０２０１２３２（配列番号１３）及びＴＯ－０２０１２３３（配列番号１４）を含むリストから選択されるＳＮＰのうちの１つ、より好ましくは、ＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０、ＴＯ－０２０１２２１、ＴＯ－０２０１２２９、ＴＯ－０２０１２３１、及びＴＯ－０２０１２３３のうちの１つによって同定され得る、請求項１に記載の植物。
- 第９染色体上の前記ＱＴＬが、ＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０及び／又はＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２９によって同定され得る、請求項３に記載の植物。
- 第９染色体上の前記ＱＴＬが、以下の対立遺伝子：ＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２１の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２２の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２３の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２４の対立遺伝子 Ａ、ＴＯ－０２０１２２５の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２６の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２７の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２２８の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２２９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３０の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２３１の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２３２の対立遺伝子Ｇ及びＴＯ－０２０１２３３の対立遺伝子Ｇのうちの少なくとも１つ、好ましくはＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０の対立遺伝子Ｇ、ＳＥＱ ＩＤ ＴＯ－０２０１２２１の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３１の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２２３２の対立遺伝子Ｇ、又はＴＯ－０２０１２３３の対立遺伝子Ｇのうちの１つ、さらにより好ましくはＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０の対立遺伝子Ｇ及び／又はＴＯ－０２０１２２９の対立遺伝子Ａによって同定され得る、請求項１～４のいずれか１項に記載の植物。
- 第９染色体上の前記ＱＴＬが、ＴＯ－０２０１２２０及びＴＯ－０２０１２３３によって区切られた領域、好ましくはＴＯ－０２０１２２１及びＴＯ－０２０１２３３によって区切られた領域内に見出される、請求項１又は２に記載の植物。
- 第９染色体上の前記ＱＴＬが、植物のゲノム中にホモ接合的又はヘテロ接合的に存在する、請求項１～６のいずれか１項に記載の植物。
- 第１１染色体上の該ＱＴＬが、配列番号１０２～１１５を有するマーカーのうちの１つ、好ましくは、ＴＯ－０２０１２３７（配列番号１０２）、ＴＯ－０２０１２３８（配列番号１０３）、ＴＯ－０２０１２３９（配列番号１０４）、ＴＯ－０２０１２４０（配列番号１０５）及びＴＯ－０２０１２４１（配列番号１０６）を含むリストから選択されるＳＮＰの１つ、又はＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９６８４４４９（配列番号１１２）、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９７９８９６（配列番号１１３）、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９８２３４０５（配列番号１１４）及びＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９９２４２３２（配列番号１１５）を含むリストから選択されるマーカーのうちの１つによって同定され得る、請求項１に記載の植物。
- 第１１染色体上の前記ＱＴＬが、以下の対立遺伝子：ＴＯ－０２０１２３７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２３８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２４０の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２４１の対立遺伝子Ａ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９６８４４４９の対立遺伝子ＣＴ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９７７９８９６の対立遺伝子ＡＴ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９８２３４０５の対立遺伝子Ｃ及びＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９９２４２３２の対立遺伝子ＧＴのうちの少なくとも１つ、好ましくはＴＯ－０２０１２３７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２３８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２４０の対立遺伝子Ａ及びＴＯ－０２０１２４１の対立遺伝子Ａのうちの少なくとも１つによって同定され得る、請求項１～２及び８のいずれか１項に記載の植物。
- 第１１染色体上の前記ＱＴＬが、ＴＯ－０２０１２３７及びＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９９２４２３２、好ましくはＴＯ－０２０１２３７及びＴＯ－０２０１２４１によって区切られる領域に見出される、請求項１～２及び８～９のいずれか１項に記載の植物。
- 第１１染色体上の前記ＱＴＬが、植物のゲノム中にホモ接合的に存在する、請求項１～６のいずれか１項に記載の植物。
- ＴｏＢＲＦＶによる自然感染の場合、成熟時の果実の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％が変色することなく市場に出回る、請求項１～１１のいずれか１項に記載の植物。
- 前記植物が、ＬＶＳＴＢＲＦＶＲＥＳ２（ＮＣＩＭＢ受託番号４３５９１）の種子の子孫である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の植物。
- ＴＭＶ、好ましくはＴｍ－２２遺伝子に対する耐性を付与するゲノム配列もまた含有する、請求項１～１３のいずれか１項に記載の植物。
- Ｔｍ－２２遺伝子がヘテロ接合的に存在する、請求項１４に記載の植物。
- Ｔｍ－１遺伝子をさらに含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の植物。
- 第９染色体上のＱＴＬ９及び／又は第１１染色体上のＱＴＬ１１をそのゲノム中に含み、独立してＴｏＢＲＦＶに対する耐性を付与する、請求項１～１６のいずれか１項に記載のＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物の細胞。
- 細胞が、胚、プロトプラスト、分裂組織細胞、カルス、花粉、葉、葯、茎、葉柄、根、根の先端、種子、花、子葉、及び／又は胚軸に由来し、それらのゲノムに第９染色体上のＱＴＬ９及び／又は第１１染色体上のＱＴＬ１１を含み、独立してＴｏＢＲＦＶに対する耐性を付与する、請求項１～１６のいずれか１項に記載の植物の細胞の組織培養物。
- 請求項１～１６のいずれか一項に記載のＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物の植物部分、特に種子、外植片、生殖材料、穂木、挿し木、種子、果実、根、台木、花粉、胚珠、胚、プロトプラスト、葉、葯、茎、葉柄又は花であって、前記植物部分が請求項１７に記載の細胞を含む上記部分。
- 請求項１～１６のいずれか１項に記載の植物に発生する、Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物の種子。
- Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物、好ましくはＴｏＢＲＦＶに感受性のＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物にＴｏＢＲＦＶ耐性を付与するための育種プログラムにおける繁殖パートナーとして、ＱＴＬ９及び／又はＱＴＬ１１をホモ接合性に有し、独立して請求項１に定義されるＴｏＢＲＦＶに対する耐性を付与する、受託番号ＮＣＩＭＢ ４３５９１の下でＮＣＩＭＢに寄託されたＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍの植物若しくは種子、又はその一部若しくはその子孫の使用。
- Ｓ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍから遺伝子移入されたＱＴＬを含み、ＴｏＢＲＦＶ耐性を付与するＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物を検出及び／又は選択する方法であって、該方法が、ＱＴＬに連結された少なくとも１つの遺伝子マーカーの検出を含み、該遺伝子マーカーが、
－配列番号１～１０１を有するＳＮＰマーカーを含む群において、好ましくはＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０、ＴＯ－０２０１２２１、ＴＯ－０２０１２２２、ＴＯ－０２０１２２３、ＴＯ－０２０１２２４、ＴＯ－０２０１２２５、ＴＯ－０２０１２２６、ＴＯ－０２０１２２７、ＴＯ－０２０１２２８、ＴＯ－０２０１２２９、ＴＯ－０２０１２３０、ＴＯ－０２０１２３１、ＴＯ－０２０１２３２及びＴＯ－０２０１２３３を含む群において選択され、より好ましくは前記遺伝子マーカーは、ＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０、ＴＯ－０２０１２２１、ＴＯ－０２０１２２９、ＴＯ－０２０１２３１及びＴＯ－０２０１２３３のうちの１つであり、又は
－配列番号１０２～１１を有するマーカーを含む群において、好ましくはマーカーＴＯ－０２０１２３７、ＴＯ－０２０１２３８、ＴＯ－０２０１２３９、ＴＯ－０２０１２４０、ＴＯ－０２０１２４１、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９６８４４４９、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９７７９８９６、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９８２３４０５及びＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９９２４２３２を含む群において、より好ましくはＳＮＰマーカーＳＮＰ ＴＯ－０２０１２３７、ＴＯ－０２０１２３８、ＴＯ－０２０１２３９、ＴＯ－０２０１２４０及びＴＯ－０２０１２４１を含む群において選択される上記方法。 - 選択する植物の遺伝物質試料において、Ｓ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍから遺伝子移入された、第９染色体上にＱＴＬ及び／又は第１１染色体上にＱＴＬを含み、独立してＴｏＢＲＦＶ耐性を付与するＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物を検出及び／又は選択する方法であって、該方法が、以下の対立遺伝子：
－第９染色体上のＱＴＬについて、ＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２１の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２２の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２３の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２４の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２５の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２６の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２２７の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２２８の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２２９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３０の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２３１の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２３２の対立遺伝子Ｇ及びＴＯ－０２０１２３３の対立遺伝子Ｇ、好ましくはＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０の対立遺伝子Ｇ、ＳＥＱ ＩＤ ＴＯ－０２０１２２１の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３１の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ－０２０１２３２の対立遺伝子Ｇ又はＴＯ－０２０１２３３の対立遺伝子Ｇのうちの少なくとも１つ、又は
－第１１染色体上のＱＴＬについて、ＴＯ－０２０１２３７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２３８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２４０の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２４１の対立遺伝子Ａ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９６８４４４９の対立遺伝子ＣＴ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９７７９８９６の対立遺伝子ＡＴ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９８２３４０５の対立遺伝子Ｃ又はＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９９２４２３２の対立遺伝子ＧＴ
のうちの少なくとも１つの検出を含む上記方法。 - Ｓ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍから遺伝子移入された配列の存在を検出し、ＴｏＢＲＦＶ耐性を付与するための遺伝子マーカーの使用であって、前記遺伝子マーカーが、
－配列番号１～１０１を有するＳＮＰマーカー、好ましくはＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０、ＴＯ－０２０１２２１、ＴＯ－０２０１２２２、ＴＯ－０２０１２２３、ＴＯ－０２０１２２４、ＴＯ－０２０１２２５、ＴＯ－０２０１２２６、ＴＯ－０２０１２２７、ＴＯ－０２０１２２８、ＴＯ－０２０１２２９、ＴＯ－０２０１２３０、ＴＯ－０２０１２３１、ＴＯ－０２０１２３２及びＴＯ－０２０１２３３を含むリスト、より好ましくはＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０、ＴＯ－０２０１２２１、ＴＯ－０２０１２２９、ＴＯ－０２０１２３１及びＴＯ－０２０１２３３を含むリストにおけるＳＮＰマーカーを含む群から選択され、又は
－配列番号１０２～１１５を有するマーカーを含む群、好ましくはマーカーＴＯ－０２０１２３７、ＴＯ－０２０１２３８、ＴＯ－０２０１２３９、ＴＯ－０２０１２４０、ＴＯ－０２０１２４０、ＴＯ－０２０１２４１、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９６８４４９、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９７９８９６、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９８２３４０５及びＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９９２４２３２を含む群から選択される上記使用。 - トマトゲノム中のＱＴＬを同定するためのマーカーの使用であって、前記ＱＴＬは、Ｓ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍから遺伝子移入され、ＴｏＢＲＦＶに対する果実耐性を付与し、ここで、前記マーカーは、ＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０及び配列番号１０１を有するＳＮＰにより第９染色体上で区切られた染色体領域に局在し、ここで、前記マーカーは、以下のＳＮＰ対立遺伝子：ＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０のＧ、ＳＥＱ ＩＤ ＴＯ－０２０１２２１の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２２９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３１の対立遺伝子Ｃ、又はＴＯ－０２０１２３３の対立遺伝子Ｇのうちの少なくとも１つと、ｐ値０．０５以下で関連付けられる上記使用。
- トマトゲノム中のＱＴＬを同定するためのマーカーの使用であって、前記ＱＴＬは、Ｓ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍから遺伝子移入され、ＴｏＢＲＦＶに対する果実耐性を付与し、ここで、前記マーカーは、配列番号１０２～１１５を有するマーカーにより第１１染色体上で区切られた染色体領域に局在し、ここで、前記マーカーは、以下の耐性対立遺伝子：ＴＯ－０２０１２３７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ－０２０１２３８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２３９の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２４０の対立遺伝子Ａ、ＴＯ－０２０１２４の対立遺伝子Ａ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９６８４４４９の対立遺伝子ＣＴ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９７７９８９６の対立遺伝子ＡＴ、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９８２３４０５の対立遺伝子Ｃ、又はＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９９２４２３２の対立遺伝子ＧＴのうちの少なくとも１つと、ｐ値０．０５以下で関連付けられる上記使用。
- Ｓ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物に、ＴｏＢＲＦＶに対する耐性を付与するための方法であって、
ａ）寄託された種子ＮＣＩＭＢ ４３５９１、又はその子孫から育てられ、Ｓ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍから遺伝子移入された、第９染色体上にＱＴＬ９及び／又は第１１染色体上にＱＴＬ１１を有し、ＮＣＩＭＢ ４３５９１において独立してＴｏＢＲＦＶ耐性を付与する植物と、好ましくは前記ＱＴＬ（複数可）を欠く、最初のＳ．ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ植物とを交配する工程、
ｂ）ＱＴＬ９及び／又はＱＴＬ１１を有する、このようにして得られた子孫において植物を選択する工程；
ｃ）ｂ）において得られた植物の１～数倍の自家受粉を任意に行い、このようにして得られた子孫において、ＴｏＢＲＦＶに対する耐性を有する植物を選択する工程
を含む上記方法。 - ＴｏＢＲＦＶが蔓延した環境におけるトマトの収量を改善する方法であって、Ｓ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍから遺伝子移入された、第９染色体上にＱＴＬ９及び／又は第１１染色体上にＱＴＬ１１をそれらのゲノムに含むトマト植物を栽培し、独立してＴｏＢＲＦＶに対する耐性を前記植物に付与することを含み、ここで、前記ＱＴＬは種子ＬＶＳＴＢＲＦＶＲＥＳ２ ＮＣＩＭＢアクセッション番号４３５９１の植物のゲノムに存在し、ＱＴＬ９についてはＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０、ＴＯ－０２０１２２１、ＴＯ－０２０１２２９、ＴＯ－０２０１２３１及びＴＯ－０２０１２３３のうちの少なくとも１つによって識別可能であり、ＱＴＬ１１についてはマーカーＴＯ－０２０１２３７、ＴＯ－０２０１２３８、ＴＯ－０２０１２３９、ＴＯ－０２０１２４０、ＴＯ－０２０１２４１、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９６８４４４９、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９７７９８９６、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９８２３４０５及びＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９９２４２３２のうちの少なくとも１つによって識別可能である上記方法。
- ＴｏＢＲＦＶ蔓延状態におけるトマト生産の損失を減少させる方法であって、
Ｓ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍから遺伝子移入された、第９染色体上にＱＴＬ９及び／又は第１１染色体上にＱＴＬ１１をそのゲノムに含むトマト植物を栽培し、独立してＴｏＢＲＦＶに対する耐性を前記植物に付与することを含み、ここで、前記ＱＴＬは種子ＬＶＳＴＢＲＦＶＲＥＳ２ ＮＣＩＭＢアクセッション番号４３５９１の植物のゲノムに存在しＱＴＬ９についてはＳＮＰ ＴＯ－０２０１２２０、ＴＯ－０２０１２２１、ＴＯ－０２０１２２９、ＴＯ－０２０１２３１及びＴＯ－０２０１２３３のうちの少なくとも１つによって識別可能であり、ＱＴＬ１１についてはマーカーＴＯ－０２０１２３７、ＴＯ－０２０１２３８、ＴＯ－０２０１２３９、ＴＯ－０２０１２４０、ＴＯ－０２０１２４１、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９６８４４４９、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９７７９８９６、ＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９８２３４０５及びＳＬ２．５０ｃｈ１１ ９９２４２３２のうちの少なくとも１つによって識別可能である上記方法。 - －ＴｏＢＲＦＶに耐性を示すトマト植物を同定する工程であって、そのゲノムにおいて、Ｓ．ｐｉｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍから遺伝子移入された、第９染色体上にＱＴＬ９を含み、前記植物にＴｏＢＲＦＶに対する果実耐性を付与し、又はそのゲノムにおいて、Ｓ．ｐｉｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍから遺伝子移入された、第１１染色体上のＱＴＬ１１を含み、前記植物の葉にＴｏＢＲＦＶに対する耐性を付与し、ここで、前記ＱＴＬは、種子ＬＶＳＴＦＶＲＥＳ２ ＮＣＩＭＢ受託番号４３５９１の植物のゲノム中に存在する工程；
－当該植物をＴｏＢＲＦＶが寄生する環境又はＴｏＢＲＦＶが寄生する状態で生育させる工程
を含む、請求項２８～２９のいずれか１項に記載の方法。
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