CN114929881A

CN114929881A - 用于病毒抗性的cca基因

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Publication number: CN114929881A
Application number: CN202080092042.6A
Authority: CN
Inventors: J·卡里斯瓦尔特; R·J·J·M·弗里特斯; D·J·W·卢德基宁; A·J·M·鲁弗斯
Original assignee: Rijk Zwaan Zaadteelt en Zaadhandel BV
Current assignee: Rijk Zwaan Zaadteelt en Zaadhandel BV
Priority date: 2019-12-04
Filing date: 2020-12-03
Publication date: 2022-08-19
Also published as: IL293400A; MA56910B1; CL2022001482A1; WO2021110855A1; EP4069853A1; JP2023504713A; MA56910A1; MX2022006616A; US20220403409A1; AU2020396217A1; CA3159997A1

Abstract

本发明涉及编码CCA添加酶的经修饰的CCA基因，该经修饰的CCA基因导致对具有TLS的正链RNA病毒的抗性，其中经修饰的CCA基因选自由以下组成的组：包含编码SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10或SEQID No.11所述的CCA添加酶的核苷酸序列的基因；包含含有SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15或SEQ ID No.16的启动子序列的基因；包含编码CCA添加酶的核苷酸序列的基因，所述CCA添加酶当与SEQ ID No.2或SEQ ID No.7相比时，具有至少一个氨基酸的缺失、取代或插入；包含编码CCA添加酶的核苷酸序列的基因，所述CCA添加酶当与SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10或SEQ ID No.11相比时，具有至少一个氨基酸的缺失、取代或插入；包含编码CCA添加酶的核苷酸序列的基因，所述CCA添加酶与SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10或SEQID No.11具有至少80％的序列同一性；和包含与SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15或SEQ ID No.16具有至少80％序列同一性的启动子序列的基因。本发明还涉及包含所述经修饰的基因的植物和种子，用于制备和鉴定所述植物的方法以及所述基因的用途。

Description

用于病毒抗性的CCA基因

技术领域

本发明涉及导致针对具有TLS的正链RNA病毒的抗性的经修饰的基因。本发明还涉及包含所述经修饰的基因的植物、产生这种植物的方法以及鉴定经修饰的基因和选择这种植物的方法。本发明还涉及一种用于鉴定植物中经修饰的基因的标志物，以及所述标志物的用途。

背景技术

在保护的和开放的田地作物种植中，病毒性疾病都是种植者必须应对的主要威胁之一。一旦作物受到感染，病毒就会通过难以控制的媒介(通常是昆虫)迅速传播。此外，栽培方法经常通过经由工具和田地工作人员的汁液传播而有助于病毒的进一步传播。

植物病毒通常依赖其宿主进行快速复制和传播，从而感染患病的同一宿主。不同的病毒具有其用来实现这一目标的不同系统。属于正链RNA病毒的一组病毒似乎使用在其3’-末端基因组序列的转移RNA样结构(TLS)作为这些过程中的关键因素。这些病毒TLS能够进行与其TLS结构中存在的反密码子序列的顺序相关的特异性氨基酰化，从而模仿普遍存在的转移RNA(tRNA)行为。然而，通常情况下，这些病毒基因组的TLS缺乏CCA尾，CCA尾是用于相关氨基酸的结合的必需tRNA属性。相反，病毒基因组经常终止于3’-CC；然而，这种CC尾可以通过利用病毒进入的任何寄主植物的tRNA核苷酸转移酶(也称为“CCA添加酶”)进行腺苷酸化。病毒基因组的这种腺苷酸化和随后的氨基酰化被认为形成病毒感染和传播的重要步骤，因为它们被认为在病毒稳定、翻译和复制中起着重要作用。一些属于烟草嵌纹病毒(Tobamovirus)、黄镶嵌病毒(Tymovirus)或雀麦花叶病毒(Bromovirus)的正链RNA病毒是使用这种tRNA模拟系统的例子。这些病毒除了在基因组的3’末端具有TLS外，通常在其sgRNA转录本的3’末端也具有TLS，该转录本TLS还可以在与宿主的CCA添加酶的相互作用中发挥作用。

许多基因已被确认参与植物的病毒抗性。病毒抗性可以基于各种机制，并且可以涉及植物发育的许多不同阶段和植物防御途径。然而，对于大量的病毒，还没有鉴定出抗性基因。尤其对于相对较新的病毒，或与其他病毒相似但破坏已知抗性的病毒，在病毒损害变得过于广泛之前，始终存在着鉴定新的抗性来源的挑战。新鉴定的抗性基因也可以作为保护作物对抗已知病毒疾病的补充。

发明内容

本发明的目的是提供一种导致对具有3’-末端转移RNA样结构(TLS)的正链RNA病毒的抗性的经修饰的基因。

本发明提供一种编码CCA添加酶的经修饰的CCA基因，该经修饰的CCA基因导致针对具有TLS的正链RNA病毒的抗性，其中经修饰的CCA基因选自由以下组成的组：

-包含核苷酸序列的基因，所述核苷酸序列编码SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQID No.10或SEQ ID No.11所述的CCA添加酶；

-包含启动子序列的基因，所述启动子序列包含SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQID No.14、SEQ ID No.15或SEQ ID No.16；

-包含编码CCA添加酶的核苷酸序列的基因，所述CCA添加酶当与SEQ ID No.2或SEQ ID No.7相比时，具有至少一个氨基酸的缺失、取代或插入；

-包含编码CCA添加酶的核苷酸序列的基因，所述CCA添加酶当与SEQ ID No.8、SEQID No.9、SEQ ID No.10或SEQ ID No.11相比时，具有至少一个氨基酸的缺失、取代或插入；

-包含编码CCA添加酶的核苷酸序列的基因，所述CCA添加酶与SEQ ID No.8、SEQID No.9、SEQ ID No.10或SEQ ID No.11具有至少80％的序列同一性；和

-包含启动子序列的基因，所述启动子与SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ IDNo.14、SEQ ID No.15或SEQ ID No.16具有至少80％序列同一性。

如本文所用，CCA基因是编码CCA添加酶的基因。如本文所用，CCA基因是包含由SEQID No.1表示的野生型CDS序列的基因，或包含与SEQ ID No.1具有至少80％序列同一性的序列的同源基因；或编码包含SEQ ID No.2的CCA添加酶的基因；或编码同源CCA添加酶的基因，所述同源CCA添加酶包含与SEQ ID No.2具有至少80％序列同一性的序列。如本文所用，基因还包含该基因的5’-UTR序列、启动子和3’-UTR序列。

CCA基因的启动子包含SEQ ID No.3，或包含与SEQ ID No.3具有至少80％序列同一性、优选85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。同源CCA基因包含与SEQ ID No.1具有至少80％序列同一性、优选85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。同源CCA添加酶包含与SEQ ID No.2具有至少80％序列同一性、优选85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。

与SEQ ID No.8具有至少80％序列同一性的CCA添加酶优选地包含N535D取代、R553S取代或K579N取代中的至少一个。与SEQ ID No.9具有至少80％序列同一性的CCA添加酶优选地包含K450E取代、R553S取代或K579N取代中的至少一个。与SEQ ID No.10具有至少80％序列同一性的CCA添加酶优选地包含K316N取代或A317V取代中的至少一个。与SEQ IDNo.11具有至少80％序列同一性的CCA添加酶优选地包含至少C211R取代。这些取代中的任何取代备选地是在同源序列的相应位置上的取代。

如本文所用，序列同一性是两个序列之间恰当比对后相同的核苷酸或氨基酸的百分比。本领域技术人员知晓如何比对序列，例如通过使用序列比对工具，如

其可用于核苷酸序列和蛋白质序列。为了获得最显著的结果，应获得给出最高序列同一性得分的最佳可能比对。通过比较评估中最短序列的长度来计算序列同一性百分比。

CCA添加酶在大多数活生物体中有活性，并在其中起着至关重要的作用，因为它对于向普遍存在的转移RNA(tRNA)的3’-末端添加CCA尾至关重要。在几乎所有的真核生物中，这种CCA尾是tRNA氨基酰化的先决条件，它不由tRNA基因编码，因此必须在转录后添加。专门的CCA添加酶识别所有tRNA，并负责在所有tRNA中合成正确的CCA尾。大多数真核生物基因组只有单一拷贝的CCA基因，该基因编码重要且高度保守的CCA添加酶。

CCA添加酶也参与其他RNA相关过程。其任务之一是例如tRNA质量控制，由此该酶在tRNA修复以及不稳定或偏离tRNA的降解中发挥作用。通过向因某种原因鉴定为有缺陷的RNA中添加双CCA尾而不是单个CCA尾，它可以对该RNA加标签进行降解。CCA添加酶还进一步参与处理其他非编码RNA，如lncRNA。

由于CCA添加酶的重要作用，CCA基因中的突变，尤其是在基因序列的高度保守部分中存在的突变，预计会对植物的生长和发育产生强烈的负面影响。因此，尽管已知许多病毒具有利用寄主植物的CCA添加酶感染同一寄主植物的3’-末端转移RNA样结构(TLS)，但CCA基因的重要功能使得CCA基因不太可能成为获得病毒抗性的方法中的靶标。

然而，本发明提出了一种CCA基因中的修饰，其导致植物中的病毒抗性。

导致针对具有TLS的正链RNA病毒的抗性的CCA基因中的修饰是从由以下组成的组中选择的修饰：

-CCA基因的启动子序列中的修饰；

-CCA基因的基因组序列中的修饰；

-CCA基因的编码序列(CDS)中的修饰；

-CCA基因的调控序列中的修饰；和

-CCA基因的保守结构域中的修饰，或其任何组合。

CCA基因中导致抗性的修饰将改变所述基因的表达。备选地，或者作为结果，修饰可以影响所编码的蛋白质的活性和/或功能，或者不能编码蛋白质。本发明CCA基因中的修饰包括导致氨基酸变化的修饰、导致早期终止密码子的修饰、导致截短蛋白质的修饰或导致移码的修饰。由于修饰，所编码的蛋白质具有改变的功能、降低的功能或无功能。

本发明的CCA基因的改变的表达包括降低的表达、不表达或沉默。本发明的CCA基因中的修饰包括SEQ ID No.1的核苷酸序列或其同源序列中至少一个核苷酸的缺失、取代或插入，或者包含SEQ ID No.2或其同源序列的所编码的蛋白质中的至少一个氨基酸的缺失、取代或插入。修饰包括影响所编码的蛋白质的保守结构域(例如活性位点或催化结构域)的修饰，所编码的蛋白质是CCA添加酶。

在一个实施方案中，导致针对具有TLS的正链RNA病毒的抗性的修饰包括CCA基因的启动子序列中的缺失。适合于被修饰以产生抗性的CCA基因的启动子包含与SEQ ID No.3具有按优先顺序增加的至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的序列，条件是启动子序列包含SEQ ID No.4。CCA基因的启动子序列中的缺失产生所述基因的表达改变，从而产生抗性，包括调节序列中的缺失，特别是TATA框中的缺失，或包含SEQ ID No.4的缺失(表1)。

在一个优选的实施方案中，包含SEQ ID No.4的缺失是包含SEQ ID No.18的缺失，或包含SEQ ID No.19的缺失。

在一个实施方案中，导致针对具有TLS的正链RNA病毒的抗性的修饰包括导致氨基酸取代的CCA基因的CDS中的SNP。任选地，SNP导致CCA添加酶的保守结构域(例如活性位点或催化结构域)中的氨基酸取代。CCA添加酶的保守结构域包含PolyA_pol_头部_结构域(结构域ID IPR002646，可在InterPro数据库在线访问)，其包含SEQ ID No.2的位置82至241，或与SEQ ID No.2具有至少80％序列同一性的同源序列中的相应位置。保守结构域还包含polyA_pol_C-末端区域样结构域(结构域ID SSF81891，可在超家族数据库在线访问)。该结构域包含三个活性位点并且位于包含SEQ ID No.2的CCA添加酶的氨基酸244直至氨基酸583，或在与SEQ ID No.2具有至少80％序列同一性的同源CCA添加酶序列的相应位置。

令人惊讶的是，番茄(Solanum lycopersicum)物种与一般规则不同，在其基因组中包含两个CCA基因，这两个基因高度同源并具有95％的序列同一性。第一个CCA基因，在本文中鉴定为SlCCA1，由SEQ ID No.1表示。番茄中的第二个CCA基因在本文中被鉴定为SlCCA2，与SlCCA1相比具有11bp缺失，该缺失产生移码，从而产生提前终止密码子。番茄的SlCCA2基因由SEQ ID No.5表示。与SlCCA1基因相比，SlCCA2基因中的缺失存在于该基因的外显子9中，并导致SlCCA2的外显子10中的提前终止密码子。缺失具体是对应于SEQ IDNo.1的位置1062至1072的11bp缺失。缺失特别是包含SEQ ID No.6的缺失(表1)。

表1：CCA基因中的缺失

SEQ ID No.4	ATATTTATTT
		SEQ ID No.6	TTCAGCTTGGG
SEQ ID No.18	TTTTTAAATATTTATTT
		SEQ ID No.19	AAATATTTATTTTTTTT

研究表明，尽管番茄的SlCCA2基因中存在早期终止密码子，但该基因仍在表达。发现跨越具有缺失的区域的RNAseq读取，例如包含覆盖SEQ ID No.5的位置1055至1065的读取。因此，预期番茄中的SlCCA2基因产生截短的蛋白质。截短的蛋白质在位置350之后偏离SlCCA1编码的蛋白质，并在位置366之后终止，这在polyA_pol_C-末端区域样结构域内。因此，该结构域的三个活性位点中只有第一个仍然存在于由SlCCA2编码的CCA添加酶中。因此，预期该结构域在酶中具有改变的功能性、减少的功能性或无功能性。由野生型SlCCA2编码的CCA添加酶包含SEQ ID No.7并且与SEQ ID No.2具有90％的序列同一性。

对番茄中野生型SlCCA2基因的进一步研究表明，与野生型SlCCA1相比，它包含几个多态性，这可以从SEQ ID No.1和SEQ ID No.5的序列比对来推断。这些多态性之一，在位置631上SEQ ID No.1中的C对比SEQ ID No.5中的T，在野生型SlCCA2编码的蛋白质中产生氨基酸变体R211C。该位置被确定为属于PolyA_pol_头部_结构域的重要且高度保守的位点，该位点参与酶的核苷酸结合。值得注意的是，发现包含使SlCCA2中的这种氨基酸取代从C恢复为R的突变的番茄株系，即产生如SEQ ID No.11所示的C211R取代的T631C突变，显示出田间耐受ToBRFV的表型(另见表3)。

在一个实施方案中，导致针对具有TLS的正链RNA病毒的抗性的修饰包含在SEQ IDNo.5的位置631上或其同源序列中的相应位置上的T到C的SNP(T631C)，其导致SEQ ID No.7中或其同源序列中的相应位置中的C211R氨基酸取代。该实施方案特别涉及包含两个CCA基因的基因组，其中两个CCA基因在修饰后将在所编码的蛋白质的位置211上具有R。该实施方案导致至少包括至少田间耐受的抗性。包含该修饰的植物优选地是包含SlCCA2基因中的修饰的番茄植物，优选由SEQ ID No.11表示的修饰，其中所述修饰(即SEQ ID No.11的存在)导致ToBRFV抗性，具体地对ToBRFV的田间耐受性。

ToBRFV最初由Luria等人描述((2017)：A new Israeli tobamovirus isolateinfects tomato plants harboring Tm-2²resistance genes.PLoS ONE 12(1):e0170429.Doi:10.1371/journal.pone.0170429)。在该出版物发表时，番茄褐色皱果病毒(Tomato Brown Rugose Fruit Virus)仍缩写为TBRFV，但同时该病毒的常用缩写是ToBRFV，因此现在也用于本申请。

在更进一步的研究中，发现了几种产生ToBRFV抗性的SlCCA基因多态性。在野生番茄物种(特别是在醋栗番茄(Solanum pimpinellifolium)物种中)的CCA基因中发现了某些修饰；当这些修饰转移到对ToBRFV易感的番茄植株上时，番茄植株对ToBRFV产生抗性。产生导致抗性的氨基酸变化的SNP包括SEQ ID No.1或SEQ ID No.5的位置948上A到T的SNP(A948T)，SEQ ID No.1或SEQ ID No.5的位置950上C到T的SNP(C950T)，SEQ ID No.1的位置1348上A到G的SNP(A1348G)，SEQ ID No.1的位置1603上A到G的SNP(A1603G)，SEQ ID No.1的位置1659上A到T的SNP(A1659T)，或SEQ ID No.1的位置1737上G到T的SNP(G1737T)，或SEQ ID No.1的同源序列中的任何相应位置上。所述核苷酸变化分别产生SEQ ID No.2中的K316N取代、A317V取代、K450E取代、N535D取代、R553S取代或K579N取代，或者在SEQ IDNo.2的同源序列的相应位置处的氨基酸取代。

如本文所用，X000Y突变、SNP或取代是指野生型序列在位置000具有核苷酸或氨基酸X，其在经修饰序列中变为核苷酸或氨基酸Y。

SEQ ID No.8包含N535D突变、R553S突变和K579N突变。SEQ ID No.9包含K450E、R553S和K579N突变。SEQ ID No.10包含K316N和A317V突变。

此外，在CCA基因的启动子中发现了与番茄中的ToBRFV抗性相关的其他多态性。当与野生型SEQ ID No.3相比，显示抗性的CCA1基因在启动子序列中具有包含SEQ ID No.4的缺失。其他多态性包括启动子序列内的核苷酸取代，如例如图3的启动子序列比对中所示。值得注意的是，当与SEQ ID No.3相比，包含SEQ ID No.17的番茄野生型CCA2基因也具有包含SEQ ID No.4的缺失。SEQ ID No.4的缺失似乎是CCA基因启动子区域的TATA框中的缺失。

在一个实施方案中，本发明经修饰的CCA基因的启动子包含SEQ ID No.12、SEQ IDNo.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15或SEQ ID No.16。当与包含SEQ ID No.3的野生型启动子序列相比，所有这些启动子序列都具有包含SEQ ID No.4的缺失(图3b)。

如本文所用，针对具有TLS的正链RNA病毒的抗性，具体地针对烟草嵌纹病毒的抗性，更具体地针对ToBRFV的抗性，包括对病毒的耐受性和/或田间耐受性。病毒抗性可以在不同的水平上表达，从而涉及不同的机制。当植物对病毒具有真正的抗性时，该病毒在寄主植物中的感染和/或复制受到抗性机制的限制。当进行幼龄植物生物测定法时，抗性植物不显示易感症状。

如本文所用，当植物对病毒具有耐受性时，可在植物中发生病毒复制和增殖，其可例如通过qPCR实验来测量。在生物测定法中可以观察到一些轻微症状，但与对易感植物的影响相比，病毒的存在对植物健康性的影响大大降低。

耐受的一种特定形式是田间耐受，如本文所用，当植物具有田间耐受时，寄主植物不能限制病毒的复制和繁殖，并且在受控条件下对幼龄植物进行的生物测定法中，植物将表现出症状。然而，当这样的植物在正常栽培条件下在田间生长时，宿主能够减少病毒存在对植物健康性的影响，并且不会观察到任何症状或观察到有限的症状。此外，作物的产量不会显著降低，与无病毒作物的产量相当。

在一个实施方案中，导致针对具有TLS的正链RNA病毒的抗性的修饰包括一个CCA基因中的两个或更多个上述修饰的组合，该组合可以是编码序列中的修饰、启动子序列中的修饰或启动子序列中的修饰和编码序列中的修饰。当两个CCA基因存在于植物基因组中时，修饰也可以是两个CCA基因的每一个中的至少一个修饰的组合，其中两个CCA基因中的修饰可以不同或也可以相同。修饰尤其可以是由SEQ ID No.1表示的基因中的至少一个修饰和由SEQ ID No.5表示的基因中的至少一个修饰的组合；或由SEQ ID No.1表示的基因中的至少一个修饰和由SEQ ID No.3表示的启动子中的至少一个修饰的组合；或由SEQ IDNo.5表示的基因中的至少一个修饰和由SEQ ID No.17表示的启动子中的至少一个修饰的组合，或由SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5和SEQ ID No.17的同源序列中的修饰的组合。

具有TLS的正链RNA病毒包含烟草嵌纹病毒属、黄镶嵌病毒属或雀麦花叶病毒属的病毒。具有TLS的正链RNA病毒优选地为烟草嵌纹病毒属的病毒，具体地ToBRFV或TMV或ToMV或CGMMV物种的病毒。本发明的CCA基因中的修饰优选地导致ToBRFV抗性，任选地与针对另一种病毒，具体地另一种烟草嵌纹病毒的抗性组合。

本发明涉及一种包含本发明经修饰的CCA基因的植物。包含经修饰的CCA基因的植物优选地为茄科(Solanaceae)植物，其包括番茄(Solanum lycopersicum)、辣椒(Capsicumannuum)、茄子(Solanum melongena)、小米椒(Capsicum frutescens)、马铃薯(Solanumtuberosum)、矮牵牛属物种(Petunia spp)或烟草(Nicotiana tabacum)物种的植物。本发明的植物优选地为非野生且具有农艺价值的栽培植物，具体地农艺精品植物。

在一个实施方案中，包含本发明经修饰的CCA基因的植物对具有TLS的正链RNA病毒具有抗性，具体地对烟草嵌纹病毒属、黄镶嵌病毒属或雀麦花叶病毒属的病毒，优选地烟草嵌纹病毒属的病毒具有抗性。正链RNA病毒最优选是番茄褐色皱果病毒(ToBRFV)物种或烟草嵌纹病毒(TMV)物种或番茄花叶病毒(ToMV)物种。

在优选实施方案中，本发明的植物是包含经修饰的CCA基因的番茄物种植物，该植物对烟草嵌纹病毒，具体地番茄褐色皱果病毒(ToBRFV)具有抗性。本发明番茄植物中CCA基因的修饰包括选自包括以下各项的组的修饰：SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.5的位置948上A到T的SNP；SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.5的位置950上C到T的SNP；SEQ ID No.1的位置1348上A到G的SNP；SEQ ID No.1的位置1603上A到G的SNP；SEQ ID No.1的位置1659上A到T的SNP；SEQ ID No.1的位置1737上G到T的SNP；SEQ ID No.5的位置631上T到C的SNP；CCA基因启动子中的缺失，具体地在包含SEQ ID No.3的启动子序列中包含SEQ ID No.4的缺失；或SEQ ID No.1、SEQ ID No.3和SEQ ID No.5的同源序列中的相应修饰。CCA基因的某种修饰可产生一种或多种抗性。

表4概述了CCA基因中的SNP修饰产生其编码的蛋白质(即，CCA添加酶)中的氨基酸取代，这构成了本发明的一部分。修饰从易感(指示位置之前)到抗性(指示位置之后)进行显示。

在一个实施方案中，本发明的番茄植物包含两个经修饰的CCA基因。在一个实施方案中，本发明的番茄植物包含：包含SEQ ID No.8和SEQ ID No.12的CCA1基因和包含SEQ IDNo.10和SEQ ID No.14的CCA2基因；或者所述植物包含：包含SEQ ID No.8和SEQ ID No.12的CCA1基因和包含SEQ ID No.7和SEQ ID No.15的CCA2基因；或者所述植物包含：包含SEQID No.9和SEQ ID No.13的CCA1基因和包含SEQ ID No.11和SEQ ID No.16的CCA2基因。

ToBRFV抗性通过与已知对ToBRFV易感(S)的对照品种进行比较来确定。可用作对照的ToBRFV易感番茄品种有Endeavour F1和Ramyle F1。作为抗性对照，可以使用以NCIMB43511或NCIMB 43512保藏的植物；这些保藏物的植物包含本发明经修饰的CCA基因。NCIMB43511包含编码SEQ ID No.8的CCA1基因和编码SEQ ID No.10的CCA2基因。NCIMB 43512包含编码SEQ ID No.8的CCA1基因和编码SEQ ID No.7的CCA2基因。NCIMB 43511和NCIMB43512的CCA1基因的启动子包含SEQ ID No.12。NCIMB 43511的CCA2基因的启动子包含SEQID No.14。NCIMB 43512的CCA2基因的启动子包含SEQ ID No.15。

为了确定抗性，将待测种质的种子播种在标准育苗盘中，播种后4周接种幼苗。通过在与硅藻土混合的0.01M磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中将感染ToBRFV的番茄植物的叶片磨碎来制备接种物。然后在幼苗上撒上金刚砂粉末，然后用接种物轻轻擦拭叶子。适当地以0-5的等级对抗性进行评分；评分量表的描述见表2。优选地在接种后14-21天(dai)在生物测定法中观察番茄幼苗的症状。

如本文所用，当使用根据表2的评分并执行如上所述的生物测定法时，由于存在经修饰的CCA基因而对ToBRFV具有抗性的番茄植株的评分为3或低于3，优选低于2.5。在一个实施方案中，植物对ToBRFV具有耐受性，并且评分为2或低于2，优选地评分为1或低于1。在另一个实施方案中，植物对ToBRFV具有田间耐受性(FT)，在生物测定法中的评分为3或低于3，优选地低于2.5，但在田间条件下的评分为2或低于2。作为任何生物测定法中的标准，必须对代表性数量的植物进行评分，以获得可靠的评级，例如某品系的10个植物，并应取平均分。当正确执行测试时，本测试中的易感(S)对照的评分应高于3，优选地高于3.5。

本发明的植物包含纯合或杂合的经修饰的CCA基因，即经修饰的CCA基因可以存在于植物基因组中染色体对的两条染色体上，或仅存在于染色体对的一条染色体上。当某一物种中存在两个经修饰的CCA基因时，例如在番茄植物中，它们可以存在于相引相(coupling phase)，即两个经修饰的CCA基因位于同一染色体上，也可以存在于互斥相，即每个互补染色体上有一个经修饰的CCA基因。本发明的植物包括自交系植物、杂种植物、开放授粉品种、双单倍体植物或分离群体植物。

在一个实施方案中，本发明的植物是包含经修饰的CCA基因的番茄植物，该经修饰的CCA基因包含在番茄植物的基因组中，所述番茄植物的代表性种子以保藏编号NCIMB43511或NCIMB 43512保藏在NCIMB。

在一个实施方案中，本发明的植物是以NCIMB 43511或NCIMB 43512保藏的茄属番茄植物，或其后代植物，其包含所述保藏物中存在的CCA基因中的一个或多个或所有多态性。

本发明植物中的病毒抗性，具体地ToBRFV抗性，以中间方式(intermediatemanner)遗传。如本文所用，中间是指当本发明经修饰的CCA基因纯合存在时发现更高水平的抗性。然而，本发明经修饰的CCA基因的杂合存在仍赋予一定水平的ToBRFV抗性。纯合和杂合植物两者的ToBRFV抗性使植物更适合在ToBRFV存在的条件下栽培。当杂合植物有两个不同的经修饰的CCA基因时，也表现出杂合水平的改善，其中每个经修饰的CCA基因来自不同的亲本。因此，杂合和纯合植物都被认为具有改进的农艺性状。此外，杂合植物可通过杂交和选择用于纯合植物的开发，因此杂合植物也构成本发明的一部分。

本发明还涉及一种包含本发明经修饰的CCA基因的种子，该种子可以生长成本发明的植物。本发明还涉及通过使所述种子生长成植物，将所述种子用于产生本发明的植物的用途。本发明还涉及本发明植物的植物部分，其包括本发明植物的果实或本发明植物的种子，其中植物部分在其基因组中包含经修饰的CCA基因。

本发明还涉及一种用于种子生产的方法，该方法包括从本发明的种子中生长植物，允许植物产生带有种子的果实，收获果实，并提取这些种子。种子的生产适当地通过自交或通过与另一植物杂交来完成，该另一植物任选也是本发明的植物。由此产生的种子有能力生长成对具有TLS的正链RNA病毒、具体地对烟草嵌纹病毒属的病毒、更具体地对ToBRFV具有抗性的植物。

本发明还涉及杂交种子和生产所述杂交种子的方法，包括将第一亲本植物与第二亲本植物杂交并收获所得杂交种子，其中第一亲本植物和/或第二亲本植物是包含本发明经修饰的CCA基因的本发明植物。可从杂交种子生长的包含本发明CCA基因的产生的杂交植物也是本发明的植物，该杂交植物对具有TLS的正链RNA病毒、具体地对烟草嵌纹病毒属的病毒、更具体地对ToBRFV具有抗性。

本发明涉及一种用于产生对具有TLS的正链RNA病毒、具体地对烟草嵌纹病毒属的病毒、更具体地对ToBRFV具有抗性的植物的方法，包括在CCA基因中引入修饰，该修饰导致抗性。所述方法包括在CCA基因的编码序列和/或启动子序列中引入缺失、取代或插入。可通过使用化合物(例如甲基磺酸乙酯(EMS))的诱变方法；或者使用物理手段，如UV照射、快中子照射或其他照射技术进行此类修饰的引入。

还可以使用更特异的、靶向方法进行修饰的引入，包括通过同源重组、基于寡核苷酸的突变引入、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应子核酸酶(TALEN)或成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统的靶向基因组编辑。

还可以通过从包含所述经修饰的CCA基因的植物的基因渗入进行本发明经修饰的CCA基因的引入，例如从以NCIMB 43511或NCIMB 43512保藏的植物，或从其后代，或从对具有TLS的正链RNA病毒、具体地对烟草嵌纹病毒属的病毒、更具体地对ToBRFV具有抗性的其他植物，并且其中鉴定了一个经过经修饰的CCA基因。可以使用育种方法，如杂交和选择、回交、重组选择或产生遗传序列从抗性植物转移到易感植物的其他育种方法。抗性植物可以属于相同的物种，或属于不同的和/或野生物种。可以通过本领域已知的技术(例如胚胎拯救)克服物种间杂交的困难，或者可以应用同转殖(cis-genesis)。保藏物的后代可以是该保藏物的有性后代或营养后代，其可以是自交的和/或杂交的，也可以属于F1、F2或进一步的后代，只要保藏物的后代仍然包含该保藏物的经修饰的CCA基因。通过这种方法产生的植物也是本发明的一部分。

在一个实施方案中，将经修饰的CCA基因从醋栗番茄物种的植物基因渗入番茄。在另一实施方案中，将经修饰的CCA基因从包含经修饰的CCA基因的番茄植物基因渗入缺乏经修饰的CCA基因的番茄植物，或基因渗入包含任选的不同CCA基因中的不同修饰的番茄植物。

用于在性不亲和的植物之间转移序列的转基因技术也可用于通过将经修饰的CCA基因从一个物种转移到另一个物种来生产本发明的植物。可适当使用的技术包括本领域技术人员已知的一般植物转化技术，例如使用农杆菌(Agrobacterium)介导的转化方法。

本发明还涉及一种用于产生对具有TLS的正链RNA病毒、特别是对ToBRFV具有抗性的植物的方法，所述方法包括：

a)将包含本发明经修饰的CCA基因的本发明植物与另一种植物杂交；

b)任选地对由步骤a)产生的植物执行一轮或多轮自交和/或杂交以获得进一步的后代群体；

c)从步骤a)中杂交产生的群体中或从步骤b)的进一步的后代群体中选择包含本文所定义的经修饰的CCA基因的植物，该植物针对具有TLS的正链RNA病毒、具体地对ToBRFV具有抗性。

a)将包含本发明经修饰的CCA基因的本发明第一亲本植物与第二亲本植物杂交，第二亲本植物是不包含本发明经修饰的CCA基因的另一植物，或是包含CCA基因中的不同修饰的另一植物；

b)将由步骤a)产生的植株与第二亲本植株回交至少三代；

c)从第三代以上的回交群体中选择至少包含步骤a)的第一亲本植物的经修饰的CCA基因的植物。

本发明还提供了一种将另一种期望性状引入对具有TLS的正链RNA病毒、特别是对ToBRFV具有抗性的植物的方法，包括：

a)将包含本发明经修饰的CCA基因的植物与包含其他所需性状的第二植物杂交以产生F1后代；

b)在F1中任选地选择包含病毒抗性和其他所需性状的植物；

c)将任选地选择的F1后代与亲本之一杂交至少三代，以产生回交后代；

d)选择包含病毒抗性和其他所需性状的回交后代；和

e)任选地连续重复步骤c)和d)一次或多次，以产生包含病毒抗性和其他所需性状的选择的第四代以上的回交后代。

任选地，在任何杂交或回交步骤之后执行自交步骤。在该方法的任何杂交或自交步骤之后，可备选地进行选择包含病毒抗性和其他所需性状的植物。其他所需性状可以选自但不限于以下组：对细菌、真菌或病毒疾病的抗性，昆虫或害虫抗性，发芽率提高，植株大小，株型，保质期延长，水胁迫和热胁迫耐受性以及雄性不育性。本发明包括用这种方法产生的植物和从中获得的果实。

本发明还涉及一种产生包含本发明经修饰的CCA基因的植物的方法，该植物对具有TLS的正链RNA病毒、具体地对烟草嵌纹病毒、更具体地对ToBRFV具有抗性，所述方法通过使用组织培养或通过使用营养繁殖进行。

本发明涉及一种鉴定包含本发明经修饰的CCA基因的植物的方法，该植物对具有TLS的正链RNA病毒、具体地对烟草嵌纹病毒、更具体地对ToBRFV具有抗性，其中鉴定包括确定SEQ ID No.1的CCA基因或其同源序列中修饰的存在，以及分析包含所述修饰的植物是否对具有TLS的正链RNA病毒、具体地对烟草嵌纹病毒、更具体地对ToBRFV具有抗性。确定CCA基因中修饰的存在包括适当地通过使用标志物来鉴定本文所述的任一种修饰，具体地表4所示的SNP修饰，所述标志物被设计用于鉴定此类修饰，因为其序列包含该特定修饰。

本发明还涉及一种选择对具有TLS的正链RNA病毒、具体地对ToBRFV具有抗性的植物的方法，该方法包括在植物中鉴定本发明经修饰的CCA基因，然后选择所述植物作为对具有TLS的正链RNA病毒、具体地对烟草嵌纹病毒、更具体地对ToBRFV具有抗性的植物。任选地，可通过执行如实施例1所述的生物测定法来确认病毒抗性。通过这种方法获得的所选植物也是本发明的一部分。

本发明还涉及适用于生产本发明植物的繁殖材料，其中所述繁殖材料适用于有性繁殖，具体地以选自小孢子、花粉、子房、胚珠、胚囊或卵细胞，或者适用于营养繁殖，具体选自插条、根、干细胞或原生质体，或适于再生细胞的组织培养，具体地选自叶、花粉、胚、子叶、下胚轴、分生组织细胞、根、根尖、花药、花、种子和茎，并且其中从繁殖材料产生的植物包含本发明经修饰的CCA基因，该基因提供对具有TLS的正链RNA病毒、具体地对ToBRFV的抗性。本发明的植物可用作繁殖材料的来源。包含可再生细胞的组织培养物也构成本发明的一部分。

本发明还涉及本发明植物的细胞。这种细胞可以是分离形式或者是完整植物或其部分的一部分并且仍然可以形成本发明的细胞，因为这种细胞包含本发明经修饰的CCA基因。本发明植物的每个细胞携带本发明经修饰的CCA基因。本发明的细胞也可以是可再生细胞，其可以再生成本发明的新植物。

本发明还涉及本发明植物的植物组织，其包含本发明经修饰的CCA基因。组织可以是未分化的组织或已经分化的组织。未分化的组织例如是茎尖、花药、花瓣或花粉，并可用于微繁殖以获得生长成本发明的新植物的新小植株。组织也可以从本发明的细胞生长。

此外，本发明还涉及本发明的植物、细胞、组织或种子的后代，该后代包含本发明经修饰的CCA基因。这样的后代本身可以是植物、细胞、组织或种子。后代尤其可以是以NCIMB编号43511或NCIMB 43512保藏的本发明植物的后代。如本文所用，后代包括来自与本发明植物杂交的第一子代和所有其他子代，其中杂交包括与自身杂交或与另一种植物杂交，并且其中被确定为后代的子代包含本发明经修饰的CCA基因。子代可以通过保藏物的自交和/或进一步的杂交获得。后代还包括通过营养繁殖或其他形式的增殖获得的材料。

本发明还涉及一种用于鉴定植物中经修饰的CCA基因的标志物，该标志物包含如本文所述的CCA基因中的任何修饰，从而可以鉴定所述修饰。本发明的标志物具体是这样一种标志物，其包含SNP修饰，即多态性，如表4所示，并因此适合于鉴定SNP修饰。使用这种标志物来鉴定经修饰的CCA基因也是本发明的一部分。

将在下面的实施例中进一步说明本发明，这些实施例仅用于说明目的。这些实施例无意以任何方式限制本发明。在实施例和本申请中，参考下述附图。

附图说明

图1-SEQ ID No.1(番茄的野生型CCA1基因)和SEQ ID No.5(番茄的野生型CCA2基因)的CDS序列。

图2-SEQ ID No.2(由SEQ ID No.1编码的野生型CCA添加酶)、SEQ ID No.7(由SEQID No.5编码的野生型CCA添加酶)和SEQ ID No.8-11(具有导致抗性的修饰的CCA添加酶)的蛋白质序列。CCA1_NCIMB 43511和CCA1_NCIMB 43512与SEQ ID No.8相同。CCA1_TO1与SEQ ID No.9相同。CCA1_Ramyle F1和CCA1_Sl3_00与SEQ ID No.2相同。CCA2_NCIMB43512、CCA2_Sl3_00、CCA2_Ramyle F1和CCA2_Endeavour F1与SEQ ID No.7相同。TO1与SEQ IDNo.11相同。

图3a-SEQ ID No.3(番茄的野生型CCA1基因的启动子)、SEQ ID No.17(番茄的野生型CCA2基因的启动子)和SEQ ID No.12-16的启动子序列。CCA1_NCIMB43511_43512是与SEQ ID No.12相同的序列。图3b显示了核苷酸917之前的区段的替代比对，当与SEQ IDNo.3相比时，该区段包含所有这些序列中的缺失。

图4-CCA添加酶的结构域示意图。

保藏

包含本发明经修饰的CCA基因的番茄(Solanum lycopersicum)的种子于2019年11月7日保藏在英国国家工业、食品和和海洋微生物保藏中心(NCIMB Ltd,FergusonBuilding,Craibstone Estate,Bucksburn,Aberdeen AB21 9YA,UK)，保藏号为NCIMB43511和NCIMB 43512。

具体实施方式

实施例

实施例1

用于番茄中ToBRFV抗性的生物测定法

在ToBRFV生物测定法中观察到在一个或两个CCA基因中具有修饰的番茄株系。作为抗性对照，包括三个醋栗番茄来源。使用Endeavor F1和Ramyle F1作为易感对照。

将待测种质的种子播种在标准育苗盘中，播种后4周接种每个种质10株幼苗。通过在与硅藻土混合的0.01M磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中将感染ToBRFV的番茄植物的叶片磨碎来制备接种物。对植物撒上金刚砂粉末，然后用接种物轻轻擦拭叶子。接种后19天，根据表2进行症状的评分。

表2:ToBRFV抗性的评分量表

评分	症状
		0	无症状
1	不干净，单点，有一些轻微变色
		2	花叶，清晰可见的症状
3	严重花叶，头部开始变形
		4	严重花叶，茎坏死，头部严重变形，疱状突起中有斑点
5	死植物

生物测定法的结果如表3所示；给出了10株接种苗的平均评分。TO313是具有NCIMB43511的CCA基因型的品系与具有NCIMB 43512的CCA基因型的品系之间的杂交物。“CCA基因型”是指该品系的CCA1和CCA2序列与所述保藏物相同。

表3:ToBRFV生物测定法评分

种质	生物测定法评分
			GNL.3951	0.3	抗性对照
GNL.3919	0.5	抗性对照
			Ramyle F1	4.0	易感对照
Endeavour F1	5.0	易感对照
			TO1	2.8	在CCA2中包含C211R的田间耐受品系
TO310	1.7	NCIMB 43512的CCA基因型
			TO311	1.3	NCIMB 43512的CCA基因型
TO313	1.5	NCIMB 43511和43512的CCA基因型
			TO314	1.2	NCIMB 43511的CCA基因型
TO315	1.2	NCIMB 43511的CCA基因型

实施例2

鉴定导致ToBRFV抗性的CCA基因的修饰

对就ToBRFV抗性进行分离的不同番茄群体精确定位到11号染色体上的一个小区域，该区域仅包含四个可能有助于ToBRFV抗性的潜在基因。全基因组序列可用于内部在这些群体开发中使用的抗性和易感品系的背景。因此，对该区域进行了SNP调用方法(SNP-calling approach)，这意味着通过相互比较序列来鉴定该区域中独特的多态性。

目标区域的基因中有两个CCA基因，分别命名为CCA1和CCA2。发现CCA1是一个完整的CCA基因，在易感和抗性材料之间具有各种多态性，但所有这些都导致含有CCA添加酶的必需结构域和活性位点的蛋白质。然而，CCA2基因也包含各种多态性，但在包括易感材料在内的所有品系中，CCA2基因都有提前终止密码子，产生截短的蛋白质，所述截短的蛋白质不再包含CCA添加酶的所有必需活性位点。所编码的蛋白质在polyA_pol_C-末端区域样结构域内被截短，因此该结构域的三个活性位点中只有第一个仍然存在于番茄的CCA2基因中(图4)。

观察不同抗性品系具有不同的多态性。许多多态性产生非保守氨基酸变化，这些多态性如表4所示。

表4：番茄中与ToBRFV抗性相关的某些SNP修饰

此外，发现ToBRFV抗性的存在与CCA1基因启动子中的缺失相关。在启动子中存在缺失的所有情况下，该缺失至少包含序列ATATTTATTT(SEQ ID No.4；表1)，但除了仅SEQ IDNo.4的缺失外，该缺失还可以多具有几个核苷酸，例如多出1到10个核苷酸。在某些情况下，例如发现缺失包含SEQ ID No.18所示的序列，或SEQ ID No.19所示的序列，两者均包含SEQID No.4。

启动子中的缺失存在于富含TATA的区域中，因此被认为是启动子的TATA框中的缺失。

通过分析表型和基因型分离中的相关性，确定CCA基因中的修饰(可以是CCA1基因中的修饰和/或CCA2基因中的修饰，也可以是启动子中和/或编码序列中的修饰)是抗性番茄植物的ToBRFV抗性的原因。

实施例3

CCA基因的修饰获得对具有TLS的正链RNA病毒的抗性

在目标植物种子中引入修饰，所述植物需要对具有TLS的正链RNA病毒的抗性，例如对烟草嵌纹病毒如ToBRFV、ToMV或TMV的抗性。通过诱变(如EMS处理)、通过辐射手段或通过特异性靶向方法(如CRISPR)引入修饰。当使用非靶向方法例如EMS时，这与诸如TILLING的鉴定技术相组合。这样，对于诱变以及靶向修饰手段两者，都可以生成和鉴定CCA基因中的修饰。本领域技术人员熟悉将修饰引入目标植物基因组的这些方法。

然后使经修饰的种子发芽并生长植物，将其杂交或自交以产生M2种子。随后，基于与该物种的一种或多种CCA基因的野生型序列的比较，进行植物筛选以鉴定CCA基因中的修饰。例如，对于番茄，可以与SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5或SEQ ID No.17进行比较。本领域技术人员熟悉TILLING以鉴定特定基因中的突变(McCallum等人.(2000)Nature Biotechnology,18:455-457)，以及用于鉴定核苷酸变化的技术，例如DNA测序等。

具有经修饰的CCA基因的植物是纯合的或通过自交、杂交或使用技术人员熟悉的双单倍体技术制成纯合的。然后可以对基于CCA基因中的修饰鉴定和选择的植物测试对具有TLS的正链RNA病毒的抗性，例如对烟草嵌纹病毒如对ToBRFV、ToMV或TMV的抗性。以这种方式产生、鉴定和选择的植物被证实由于CCA基因中的一个或多个修饰而具有它们的病毒抗性。

序列表

<110> 瑞克斯旺种苗基团公司（Rijk Zwaan Zaadteelt en Zaadhandel B.V.）

<120> 用于病毒抗性的CCA基因

<130> L/P167106PC01/JGE

<140> EPPCT/2019/083733

<141> 2019-12-04

<160> 19

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 1770

<212> DNA

<213> 番茄（Solanum lycopersicum）

<220>

<223> CCA1 cDNA|Sl3_00 番茄 (S) 野生型

<400> 1

atgaaggctt tgagtatagc cgtagcagca ttttcaacat tccatacaac tcgccctcgt 60

ctcttcactt tcccaaaccc ttctacttct tcttctctcc ttcttccgtc cttcaaacta 120

aagagatttt ctatcttctc cattcaacaa ccgccgccgg cgttagggtt ttacgccgga 180

gttacaacaa tggtggaggg ctcagcattt cagccgttgt cagttcaagt gaaggaccat 240

attgatttat cgccaaaaga ggagcagata ttcaaccgtc ttcttcaagt tgtcgagcat 300

tataatatgg gaacacagct tcgtgttgct ggtggttggg ttcgcgataa gctgctaggt 360

aaagagtgct atgatattga tattgctctt gacaacatgt atggacgaga attctgtgag 420

aaagtgaacg agtacttgtc agcatcaggt gaggaaaccc aaggagttgg tgttatccag 480

tgcaatcccg atcagtcaaa acacttggaa acagcgagga tgcgcctttt cgacgtatgg 540

attgattttg tcaacttaag agcagaagac tacagtgaga acagtcgaat tccaacaatg 600

aaatttggga ctgcaaaaca ggatgctgat cgcagggatt taaccattaa tagcttgttt 660

tacaacatta acaccagatc agtcgaagat cttacagaaa gaggcattgc agatctgaag 720

tctggaaaaa ttgtcactcc actacctcca aagcagacct ttttggatga tcccctaaga 780

gttcttcgag ctattcgttt tggtgcaagg tttgggttta tattagatga agaactaaag 840

aaggcagctg cagatgaaga cgtgagagtt gctattgctg ataaaattag cagagaacgc 900

ataggacatg aaattgatct tatgatgtct ggtgaccaac cggtcaaagc aatgacttat 960

attgctgact tgaagttatt ttcggctgta tttagtcttc cttctgattt tgagccatca 1020

attcctgatg gatgtgatag gctgtgtgtt acttgcttgg gttcagcttg ggaactttta 1080

aaccttattg gacgctcctc attttcagat gatcagagga gactttgcct gtatgctgct 1140

ttatttttgc cattcagaga gaccatttat agagataaca aagccaaaaa gattccagtt 1200

gtcaattata tttttcgcaa ttctctcaag ttgaaggcca gtgatgcgga aatagtcatg 1260

agcttgcata cggtaactag gaaatttgtc accttaatat cactactcat ttctaaagac 1320

gatatccaag ttcttgaagt tgattggaaa agggatacca ttgaggttcc aatagcttca 1380

aaacttagaa tattgactgg tttgctactt cgagaaatta aagaattttg gcgtgtcgct 1440

cttcttctat ctatgctgct acatcctgtt gacgttgtgt cctctacaag tttctcaaat 1500

gagaactttg aactggacaa gagtagcgga ttatttaaga cagtagagaa tgcagtaaga 1560

acactaggtc tggagaaggt ttgggaaatg aaaccactgg ttaatggaaa ggaaattatg 1620

aatattttgg agattaaaag tggagggcca gttgttagag aatggcaaca aaaactgctg 1680

gagtggcagc tcgcacaccc ttctggttca gctgaagaat gcatcgactg gatgaagcaa 1740

gcacagtcaa aacgtgcaag aaccgagtag 1770

<210> 2

<211> 589

<212> PRT

<213> 番茄

<220>

<223> CCA1蛋白|野生型CCA添加酶

<400> 2

Met Lys Ala Leu Ser Ile Ala Val Ala Ala Phe Ser Thr Phe His Thr

1 5 10 15

Thr Arg Pro Arg Leu Phe Thr Phe Pro Asn Pro Ser Thr Ser Ser Ser

20 25 30

Leu Leu Leu Pro Ser Phe Lys Leu Lys Arg Phe Ser Ile Phe Ser Ile

35 40 45

Gln Gln Pro Pro Pro Ala Leu Gly Phe Tyr Ala Gly Val Thr Thr Met

50 55 60

Val Glu Gly Ser Ala Phe Gln Pro Leu Ser Val Gln Val Lys Asp His

65 70 75 80

Ile Asp Leu Ser Pro Lys Glu Glu Gln Ile Phe Asn Arg Leu Leu Gln

85 90 95

Val Val Glu His Tyr Asn Met Gly Thr Gln Leu Arg Val Ala Gly Gly

100 105 110

Trp Val Arg Asp Lys Leu Leu Gly Lys Glu Cys Tyr Asp Ile Asp Ile

115 120 125

Ala Leu Asp Asn Met Tyr Gly Arg Glu Phe Cys Glu Lys Val Asn Glu

130 135 140

Tyr Leu Ser Ala Ser Gly Glu Glu Thr Gln Gly Val Gly Val Ile Gln

145 150 155 160

Cys Asn Pro Asp Gln Ser Lys His Leu Glu Thr Ala Arg Met Arg Leu

165 170 175

Phe Asp Val Trp Ile Asp Phe Val Asn Leu Arg Ala Glu Asp Tyr Ser

180 185 190

Glu Asn Ser Arg Ile Pro Thr Met Lys Phe Gly Thr Ala Lys Gln Asp

195 200 205

Ala Asp Arg Arg Asp Leu Thr Ile Asn Ser Leu Phe Tyr Asn Ile Asn

210 215 220

Thr Arg Ser Val Glu Asp Leu Thr Glu Arg Gly Ile Ala Asp Leu Lys

225 230 235 240

Ser Gly Lys Ile Val Thr Pro Leu Pro Pro Lys Gln Thr Phe Leu Asp

245 250 255

Asp Pro Leu Arg Val Leu Arg Ala Ile Arg Phe Gly Ala Arg Phe Gly

260 265 270

Phe Ile Leu Asp Glu Glu Leu Lys Lys Ala Ala Ala Asp Glu Asp Val

275 280 285

Arg Val Ala Ile Ala Asp Lys Ile Ser Arg Glu Arg Ile Gly His Glu

290 295 300

Ile Asp Leu Met Met Ser Gly Asp Gln Pro Val Lys Ala Met Thr Tyr

305 310 315 320

Ile Ala Asp Leu Lys Leu Phe Ser Ala Val Phe Ser Leu Pro Ser Asp

325 330 335

Phe Glu Pro Ser Ile Pro Asp Gly Cys Asp Arg Leu Cys Val Thr Cys

340 345 350

Leu Gly Ser Ala Trp Glu Leu Leu Asn Leu Ile Gly Arg Ser Ser Phe

355 360 365

Ser Asp Asp Gln Arg Arg Leu Cys Leu Tyr Ala Ala Leu Phe Leu Pro

370 375 380

Phe Arg Glu Thr Ile Tyr Arg Asp Asn Lys Ala Lys Lys Ile Pro Val

385 390 395 400

Val Asn Tyr Ile Phe Arg Asn Ser Leu Lys Leu Lys Ala Ser Asp Ala

405 410 415

Glu Ile Val Met Ser Leu His Thr Val Thr Arg Lys Phe Val Thr Leu

420 425 430

Ile Ser Leu Leu Ile Ser Lys Asp Asp Ile Gln Val Leu Glu Val Asp

435 440 445

Trp Lys Arg Asp Thr Ile Glu Val Pro Ile Ala Ser Lys Leu Arg Ile

450 455 460

Leu Thr Gly Leu Leu Leu Arg Glu Ile Lys Glu Phe Trp Arg Val Ala

465 470 475 480

Leu Leu Leu Ser Met Leu Leu His Pro Val Asp Val Val Ser Ser Thr

485 490 495

Ser Phe Ser Asn Glu Asn Phe Glu Leu Asp Lys Ser Ser Gly Leu Phe

500 505 510

Lys Thr Val Glu Asn Ala Val Arg Thr Leu Gly Leu Glu Lys Val Trp

515 520 525

Glu Met Lys Pro Leu Val Asn Gly Lys Glu Ile Met Asn Ile Leu Glu

530 535 540

Ile Lys Ser Gly Gly Pro Val Val Arg Glu Trp Gln Gln Lys Leu Leu

545 550 555 560

Glu Trp Gln Leu Ala His Pro Ser Gly Ser Ala Glu Glu Cys Ile Asp

565 570 575

Trp Met Lys Gln Ala Gln Ser Lys Arg Ala Arg Thr Glu

580 585

<210> 3

<211> 1001

<212> DNA

<213> 番茄

<220>

<223> 野生型CCA1基因的启动子

<400> 3

atatactata tctatatata ttactttggt gtgttaaaag agtgagaatg agatattaca 60

tcaaaataat ttttcttcct tatttatttg tttggtttct taagtaaaat atatattttt 120

tgttaaattc tgatttctag ttatagtaca agaaaaactt gttgaataca cctttatcgg 180

tgaaatatcc ttaaggacag tgatttaggt atgcctcaag ttacgtgatt tccaatagtt 240

ttacaacaat aataatacaa atataaatca ttctttccat tttttttgtc tttctttctc 300

tcactttata caaacacaaa ttgtgtaaaa aattatacaa aatttgtgtt tgtataaaac 360

gagagagaga tttcatatac aaatatttta acttgattca attgtatacg agtttaaagt 420

ttatgcagat atacaaactg aatcattcat aaatatacat agtagttaga tatatacaat 480

tatctaattg atatacatat acaattcacc tctctcccct ctctatccca ctctagctcg 540

cctctctcat ctctctctct caatcttgct cgtcgctcta acctaacaca gagaacatat 600

acatatacaa acacaatatt catagacaca gacgaatgag cgctcgatta atataaattg 660

gcgcgattta tacaaattag atgctccata acaaacataa tctgattatg aagcataaat 720

aacaaaatta tagctgagaa ctctaatata aatttttttt tatctttgat acacctaaaa 780

tttactcaat aaaatgtgac tatatttatt ctaagctaat tacattattg tacttattca 840

tgttttaact ttaactattt ttattttttt ttaaatattt attttttttt aaataaaaaa 900

ataaacttgc cacatcatga aagatgtagt tgggatgacc cgacccgttt tctatgctta 960

tgagagcggg tcatcacttg tccgttagaa agagagaaga a 1001

<210> 4

<211> 10

<212> DNA

<213> 番茄

<220>

<223> 启动子序列中的缺失

<400> 4

atatttattt 10

<210> 5

<211> 1101

<212> DNA

<213> 番茄

<220>

<223> CCA2 cDNA|Sl3_00 番茄 (S) 野生型

<400> 5

atgaaggctt tgagtatagc cgtagcagca ttttcaacat tccatacaac tcgccctcgt 60

ctcttcactt tcccaaaccc ttctacttct tcttctctcc ttcttccgtc cttcaaacta 120

aagagatttt ctatcttctc cgttcaacaa acgccgccgg cgttagggtt ttacgccgga 180

gttacaacaa tggtggaggg ctcagcattt cagccgttgt cagttcaagt gaaggaccat 240

attgatttat cgccgaaaga ggagcagata ttcaaccgtc ttcttcaagt tgtcgagcat 300

tataatatgg gaacacagct tcgtgttgct ggtggttggg ttcgcgataa gctgctaggt 360

aaagagtgct atgatattga tattgctctt gacaacatgt atggacgaga attctgtgag 420

aaagtgaacg agtacttgtc agcatcaggt gaggaaaccc aaggagttgg tgttatccaa 480

tgcaatcctg atcagtcaaa acacttggaa acagcaagga tgcgcctttc cgacgtatgg 540

attgattttg tcaacttaag agcagaagac tacagtgaga acagtcgaat tccaacaatg 600

aaatttggca ctgcaaaaca ggatgctgat tgcagggatt taaccatcaa tagcttgttt 660

tacaacatta acaccagatc agtcgaagat cttacagaaa gaggcattgc agatctgaag 720

tctggaaaaa ttgtcactcc actacctcca aaacagacct ttttggatga tcccctaaga 780

gttcttcgag ctattcgttt tggtgcaagg tttgggttta tattagatga agaactaaag 840

aaggcagctg cagatgaaga cgtgagagtt gctattgctg ataaaattag cagagaacgc 900

ataggacatg aaattgatct tatgatgtct ggtgaccaac cggtcaaagc aatgacttat 960

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<213> 番茄

<220>

<223> CCA基因中的缺失

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<212> PRT

<213> 番茄

<220>

<223> CCA2蛋白|野生型CCA添加酶

<400> 7

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<212> PRT

<213> 番茄

<220>

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<400> 8

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245 250 255

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260 265 270

Phe Ile Leu Asp Glu Glu Leu Lys Lys Ala Ala Ala Asp Glu Asp Val

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<211> 366

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<213> 番茄

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Cys Asn Pro Asp Gln Ser Lys His Leu Glu Thr Ala Arg Met Arg Leu

165 170 175

Ser Asp Val Trp Ile Asp Phe Val Asn Leu Arg Ala Glu Asp Tyr Ser

180 185 190

Glu Asn Ser Arg Ile Pro Thr Met Lys Phe Gly Thr Ala Lys Gln Asp

195 200 205

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Thr Arg Ser Val Glu Asp Leu Thr Glu Arg Gly Ile Ala Asp Leu Lys

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245 250 255

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275 280 285

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<212> DNA

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<223> CCA1启动子|NCIMB43511, NCIMB43512

<400> 12

atggtatgaa atttaccata tacatatcta tatatattac tttggtgtgt taaaagagtg 60

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taaaatatat attttttgtt aaattctgat ttctagttat agtacaagaa aaacttgttg 180

aatacacctt tatcggtgaa atatccttaa ggacagtgat ataggtatgc ctcaagttac 240

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tgtgtttgta taaaacgaga gagagatttc ataaacaaat attttaactt gattcaattg 420

tatacgaatt taaagtttat gcagatatac aaactgaatc attcataaat atacatagta 480

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ttattgtact tattcatgtt ttaactttaa ctatttttat ttttttttta aataaaaaaa 900

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<210> 13

<211> 1001

<212> DNA

<213> 番茄

<220>

<223> CCA1启动子|TO1

<400> 13

aatggtatga aatttaccat atacaatatc tatatatatt actttggtgt gttaaaagag 60

tgagaatgag atattacatc aaaataattt ttcttcctta tttatttgtt tggtttctta 120

agtaaaatat atattttttg ttaaattctg atttctagtt atagtacaag aaaaacttgt 180

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acgtgatttc caatagtttt acaacaataa taatacaaat ataaatcatt ctttccatct 300

tttttgtctt tctttctctc actttataca aacacaaatt gtgtaaaaaa ttatacaaaa 360

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tctttgatac acctaaaatt tactcaataa aatgtgacta tatttattct aagctaatta 840

cattattgta cttattcatg ttttaacttt aactattttt attttttttt aaataaaaaa 900

ataaacttgc cacatcatga aagatgtagt tgggatgacc cgacccgttt tctatgctta 960

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<210> 14

<211> 1002

<212> DNA

<213> 番茄

<220>

<223> CCA2启动子|NCIMB43511

<400> 14

aagactgaag ggtatggaat ttaccatata ctatatctat atatattact ttggtttgtt 60

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tttggtttct taagtaaaat atattttttt gttagattct ttattcctaa ttttagtaca 180

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ttacattatt gtatttattc atgttttaac tttaactata tattttttta aaaataaaaa 900

aataaacttg ccacatcatg aaagatgtgg ttgagatgac ccgacccgtt tcttatgctt 960

atgagagcgg gtcatcactt gtccgttaga aagagagaag aa 1002

<210> 15

<211> 1002

<212> DNA

<213> 番茄

<220>

<223> CCA2启动子|NCIMB43512

<400> 15

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agaaaaactt gttgaataca catttactgg tgaaatatcc ttaaggataa tgacataggc 240

acgcctcaag ttacgtgact tccaatagtt ttacaacaat aattatacaa atataaatat 300

ttcttgccat ctttttttgt ctctctctca ctttatacaa acacaagtta tacaaaagac 360

aatataaaat ttgtgtttgt ataaaacgag agagagattt catatacaaa tgttttaact 420

tgattcaatt atatacgaat ttaaatttta tgtagatata tagactgaat cattcattaa 480

tatacatagt agttaaatat atacaattat ctaatcggta tacatataca attcacctct 540

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gctctaacca aacacagaga acatatacat atacaaacac aatttcatat acacagacga 660

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ataatctggt tatgaagcgt aaataacaaa attatagctg tagagctcta atataatttt 780

ttatctttga tactcctaaa atttactcaa taaaatgtga ctatatttat tctaagctaa 840

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<210> 16

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<212> DNA

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<220>

<223> CCA2启动子|TO1

<400> 16

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cgcctcaagt tacgtgactt ccaatagttt tacaacaata attatacaaa tataaatatt 300

tcttgccatc tttttttgtc tctctctcac tttatacaaa cacaagttat acaaaagaca 360

atataaaatt tgtgtttgta taaaacgaga gagagatttc atatacaaat gttttaactt 420

gattcaatta tatacgaatt taaattttat gcagatatat agactgaatc attcattaat 480

atacatagta gttaaatata tacaattatc taatcggtat acatatacaa ttcacctctc 540

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aatacaattg gagcgattta tacaaattag atgctccata acaaacataa tctggttatg 720

aagcgtaaat aacaaaatta tagctgtaga gctctaatat aattttttat ctttgatact 780

cctaaaattt actcaataaa atgtgactat atttattcta agctaattac attattgtat 840

ttattcatgt tttaacttta actatatatt tttttaaaaa taaaaaaata aacttgccac 900

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tcacttgtcc gttagaaaga gagaagaa 988

<210> 17

<211> 1001

<212> DNA

<213> 番茄

<220>

<223> 野生型CCA2基因的启动子

<400> 17

aagactgaag ggtatggaat ttaccatata ctatatctat atatattact ttggtttgtt 60

aaaagaggga caatgagata ttacatcaaa ataatttttc ttttcttcct tatttattta 120

tttggtttct taagtaaaat atattttttg ttagattctt tattcctaat tttagtacaa 180

gaaaaacttg ttgaatatac atttactggt gaaatatcct taaagataat gacataggca 240

cgcctcaagt tacgtgactt ccaatagttt tacaacaata attatacaaa tataaatatt 300

tcttgccatc tttttttgtc tctctctcac tttatacaaa cacaagttat acaaaagaca 360

atataaaatt tgtgtttgta taaaacgaga gagagatttc atatacaaat gttttaactt 420

gattcaatta tatacgaatt taaattttat gcagatatat agactgaatc attcattaat 480

atacatagta gttaaatata tacaattatc taatcggtat acatatacaa ttcacctctc 540

tccactctct acccactcta gctcgtctct ctcatctctc tctctcaatc tcgctcgtcg 600

ctctaaccaa acacagagaa catatacata tacaaacaca atttcataga cacaaacgaa 660

tgagcgctcg attaatacaa ttggagcgat ttatacaaat tagatgctcc ataacaaaca 720

taatctggtt atgaagcgta aataacaaaa ttatagctgt agagctctaa tataattttt 780

tatctttgat actcctaaaa tttactcaat aaaatgtgac tatatttatt ctaagctaat 840

tacattattg tatttattca tgttttaact ttaactatat atttttttaa aaataaaaaa 900

ataaacttgc cacatcatga aagatgtagt tgagatgacc cgacccgttt cttatgctta 960

tgagagcggg tcatcacttg tccgttagaa agagagaaga a 1001

<210> 18

<211> 17

<212> DNA

<213> 番茄

<220>

<223> 启动子序列中的缺失

<400> 18

tttttaaata tttattt 17

<210> 19

<211> 17

<212> DNA

<213> 番茄

<220>

<223> 启动子序列中的缺失

<400> 19

aaatatttat ttttttt 17

Claims

1.一种编码CCA添加酶的经修饰的CCA基因，该经修饰的CCA基因导致针对具有TLS的正链RNA病毒的抗性，其中所述经修饰的CCA基因选自由以下组成的组：

-包含核苷酸序列的基因，所述核苷酸序列编码SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10或SEQ ID No.11所述的CCA添加酶；

-包含启动子序列的基因，所述启动子序列包含SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ IDNo.14、SEQ ID No.15或SEQ ID No.16；

-包含编码CCA添加酶的核苷酸序列的基因，所述CCA添加酶当与SEQ ID No.2或SEQ IDNo.7相比时，具有至少一个氨基酸的缺失、取代或插入；

-包含编码CCA添加酶的核苷酸序列的基因，所述CCA添加酶当与SEQ ID No.8、SEQ IDNo.9、SEQ ID No.10或SEQ ID No.11相比时，具有至少一个氨基酸的缺失、取代或插入；

-包含编码CCA添加酶的核苷酸序列的基因，所述CCA添加酶与SEQ ID No.8、SEQ IDNo.9、SEQ ID No.10或SEQ ID No.11具有至少80％的序列同一性；和

-包含启动子序列的基因，所述启动子与SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15或SEQ ID No.16具有至少80％序列同一性。

2.权利要求1所述的经修饰的CCA基因，其中至少一个氨基酸的缺失、取代或插入存在于所编码的CCA添加酶的保守结构域或活性位点中。

3.权利要求1所述的经修饰的CCA基因，其包含启动子序列中的修饰，所述启动子序列包含SEQ ID No.3，具体地启动子序列的调节序列中的修饰，其中所述修饰尤其包括缺失。

4.权利要求1-3中任一项所述的经修饰的CCA基因，其包含一个CCA基因中两个或更多个修饰的组合，具体地启动子序列中的修饰和编码序列中的修饰的组合。

5.权利要求1-4中任一项所述的经修饰的CCA基因，其中与SEQ ID No.8具有至少80％序列同一性的CCA添加酶包含N535D取代、R553S取代或K579N取代中的至少一个；与SEQ IDNo.9具有至少80％序列同一性的CCA添加酶包含K450E取代、R553S取代或K579N取代中的至少一个；与SEQ ID No.10具有至少80％序列同一性的CCA添加酶包含K316N取代或A317V取代中的至少一个；与SEQ ID No.11具有至少80％序列同一性的CCA添加酶包含至少C211R取代；或者与SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10或SEQ ID No.11具有至少80％序列同一性的CCA添加酶包含在同源序列的对应位置上的那些取代中的任何一个。

6.包含权利要求1-5中任一项所定义的经修饰的CCA基因的植物。

7.权利要求6所述的植物，其对具有TLS的正链RNA病毒具有抗性，优选对烟草嵌纹病毒(Tobamovirus)具有抗性，最优选对ToBRFV具有抗性。

8.权利要求6或7所述的植物，其为茄科(Solanaceae)的植物，优选为番茄(Solanumlycopersicum)物种的植物。

9.权利要求8所述的番茄植物，其中所述植物包含两个经修饰的CCA基因。

10.权利要求8或9所述的番茄植物，其中经修饰的CCA基因包含在番茄植物的基因组中，所述番茄植物的代表性种子以保藏编号NCIMB 43511或NCIMB 43512保藏在NCIMB。

11.种子，其中从所述种子生长的植物包含权利要求1-5中任一项所定义的经修饰的CCA基因。

12.用于识别经修饰的CCA基因的标志物，其中所述标志物检测从由以下组成的组中选择的修饰：

-SEQ ID No.1的第948位上A到T的SNP，

-SEQ ID No.1的第950位上C到T的SNP，

-SEQ ID No.1的第1348位上A到G的SNP，

-SEQ ID No.1的1603位上A到G的SNP，

-SEQ ID No.1的第1659位上A到T的SNP，

-SEQ ID No.1的第1737位上G到T的SNP，

-SEQ ID No.5的第631位上T到C的SNP，和

-SEQ ID No.3中包含SEQ ID No.4的缺失，

或其中所述标志物检测与SEQ ID No.1或SEQ ID No.3或SEQ ID No.5具有至少80％序列同一性的同源序列的相应位置上的修饰。

13.权利要求12所述的标志物用于鉴定番茄植物中的ToBRFV抗性和/或用于选择ToBRFV抗性番茄植物的用途。

14.产生ToBRFV抗性番茄植物的方法，包括在CCA基因中引入修饰，其中包含所述修饰的CCA基因如权利要求1-5中任一项所定义。

15.用于选择ToBRFV抗性番茄植物的方法，包括鉴定CCA基因中修饰的存在，任选地对植物测试ToBRFV抗性，以及选择包含所述修饰的植物作为ToBRFV抗性植物。

16.权利要求15所述的方法，其中通过使用如权利要求12所定义的标志物来执行鉴定。

17.用于产生对包含TLS的正链RNA病毒具有抗性的植物的方法，所述方法包括：

a)将权利要求6-10中任一项所述的包含经修饰的CCA基因的第一亲本植物与第二亲本植物杂交；

b)任选地对由步骤a)中的杂交产生的植物执行一轮或多轮自交和/或杂交以获得进一步的后代群体；

c)从步骤a)中杂交产生的植物或从步骤b)的进一步的后代群体中选择包含经修饰的CCA基因的植物，其中所选择的植物对包含TLS的正链RNA病毒具有抗性。

18.用于产生对ToBRFV具有抗性的番茄植物的方法，所述方法包括：

a)将权利要求8-10中任一项所述的包含经修饰的CCA基因的第一亲本植物与第二亲本植物杂交；

b)任选地对步骤a)中杂交产生的植物执行一轮或多轮自交和/或杂交以获得进一步的后代群体；

c)从步骤a)中杂交产生的植物中或从步骤b)的进一步的后代群体中选择包含经修饰的CCA基因的植物，其中所选择的植物对ToBRFV具有抗性。

19.权利要求17或18所述的方法，其中第二亲本植物也包含经修饰的CCA基因。

20.权利要求17-19中任一项所述的方法，其中通过使用权利要求12所述的标志物来执行对包含CCA基因中的修饰的植物的选择。

21.权利要求18或19所述的方法，其中对ToBRFV具有抗性的植物进行表型选择，具体地通过使用用于ToBRFV抗性的生物测定法进行表型选择。

22.权利要求17-21中任一项所述的方法，其中权利要求6-10中任一项所述的植物是从以NCIMB保藏号43511或NCIMB 43512保藏的种子生长的植物或其后代植物。

23.用于产生杂交种子的方法，包括将第一亲本植物与第二亲本植物杂交并收获所得杂交种子，其中第一亲本植物和/或第二亲本植物是包含权利要求1-5中任一项所述的经修饰的CCA基因的植物，并且其中所述经修饰的CCA基因的存在导致从杂交种子生长的植物的ToBRFV抗性。