JPWO2020111149A1 - トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスに抵抗性のナス科植物、ナス科植物細胞、およびナス科植物の作出方法 - Google Patents
トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスに抵抗性のナス科植物、ナス科植物細胞、およびナス科植物の作出方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
[1] 翻訳開始因子eIF4E遺伝子およびその相同遺伝子、受容体様キナーゼRLK遺伝子およびその相同遺伝子、ポリマーコート複合体deltaCOP遺伝子およびその相同遺伝子、ならびに核シャトルタンパク質相互作用因子NSI遺伝子およびその相同遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも1種の遺伝子が変異を有し、前記変異によって、前記変異を有する前記遺伝子の発現が抑制されているか、または前記変異を有する前記遺伝子のコードするタンパク質がトマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスに対して非機能的であり、前記ウイルスに対してウイルス抵抗性を有する、ナス科植物。
[2]前記トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスが、トマト黄化葉巻ウイルスである、[1]に記載のナス科植物。
[3] 前記変異が、ゲノム編集技術によってゲノム内の遺伝子に導入されたものである、[1]または[2]に記載のナス科植物。
[4] 前記変異が、下記(a)〜(d)の少なくとも1種である、[1]〜[3]のいずれかに記載のナス科植物。
(a)フレームシフト変異、
(b)ナンセンス変異、
(c)連続または非連続の3n塩基(n=1〜7)の欠損、および
(d)1または複数の塩基の置換、欠失、付加、および/または挿入。
[5] 前記翻訳開始因子eIF4E遺伝子またはその相同遺伝子に変異を有する、[1]〜[4]のいずれかに記載のナス科植物。
[6] 前記受容体様キナーゼRLK遺伝子またはその相同遺伝子に変異を有する、[1]〜[4]のいずれかに記載のナス科植物。
[7] 前記ポリマーコート複合体deltaCOP遺伝子およびその相同遺伝子に変異を有する、[1]〜[4]のいずれかに記載のナス科植物。
[8] 前記核シャトルタンパク質相互作用因子NSI遺伝子およびその相同遺伝子に変異を有する、[1]〜[4]のいずれかに記載のナス科植物。
[9] 前記翻訳開始因子eIF4E遺伝子は、そのcDNA配列が配列番号1に示される塩基配列を含むものであり、前記翻訳開始因子eIF4E遺伝子の相同遺伝子は、そのcDNA配列が配列番号1に示される塩基配列に対して85%以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、[5]に記載のナス科植物。
[10] 前記翻訳開始因子eIF4E遺伝子またはその相同遺伝子内の、配列番号3に示される塩基配列に対応する領域に変異を有する、[9]に記載のナス科植物。
[11] 前記配列番号3に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号13〜18から選ばれる1種に示される塩基配列に変異している、[10]に記載のナス科植物。
[12] 前記受容体様キナーゼRLK遺伝子は、そのcDNA配列が配列番号4に示される塩基配列を含むものであり、前記翻訳受容体様キナーゼRLK遺伝子の相同遺伝子は、そのcDNA配列が配列番号4に示される塩基配列に対して85%以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、[6]に記載のナス科植物。
[13] 前記受容体様キナーゼRLK遺伝子またはその相同遺伝子内の、配列番号6に示される塩基配列に対応する領域に変異を有する、[12]に記載のナス科植物。
[14] 前記配列番号6に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号19〜22から選ばれる1種に示される塩基配列に変異している、[13]に記載のナス科植物。
[15] 前記ポリマーコート複合体deltaCOP遺伝子は、そのcDNA配列が配列番号33または36に示される塩基配列を含むものであり、前記ポリマーコート複合体deltaCOP遺伝子の相同遺伝子は、そのcDNA配列が配列番号33または36に示される塩基配列に対して85%以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、[7]に記載のナス科植物。
[16] 前記ポリマーコート複合体deltaCOP遺伝子またはその相同遺伝子内の、配列番号35または38に示される塩基配列に対応する領域に変異を有する、[15]に記載のナス科植物。
[17] 前記配列番号35に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号48〜50から選ばれる1種に示される塩基配列に変異している、および/または前記配列番号38に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号51または52に示される塩基配列に変異している、[16]に記載のナス科植物。
[18] 前記核シャトルタンパク質相互作用因子NSI遺伝子は、そのcDNA配列が配列番号39に示される塩基配列を含むものであり、前記核シャトルタンパク質相互作用因子NSI遺伝子の相同遺伝子は、そのcDNA配列が配列番号39に示される塩基配列に対して85%以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、[17]に記載のナス科植物。
[19] 前記核シャトルタンパク質相互作用因子NSI遺伝子またはその相同遺伝子内の、配列番号41に示される塩基配列に対応する領域に変異を有する、[18]に記載のナス科植物。
[20] 前記配列番号41に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号53または54に示される塩基配列に変異している、[19]に記載のナス科植物。
[21] トマトである、[1]〜[20]のいずれかに記載のナス科植物。
[22] [1]〜[21]のいずれかに記載のナス科植物の部分。
[23] 果実である、[22]に記載のナス科植物の部分。
[24] 種子である、[22]に記載のナス科植物の部分。
[25] [1]〜[24]のいずれかに記載のナス科植物またはその部分の加工品。
[26] 食用である、[25]に記載の加工品。
[27] 翻訳開始因子eIF4E遺伝子およびその相同遺伝子、受容体様キナーゼRLK遺伝子およびその相同遺伝子、ポリマーコート複合体deltaCOP遺伝子およびその相同遺伝子、ならびに核シャトルタンパク質相互作用因子NSI遺伝子およびその相同遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも1種の遺伝子が変異を有し、前記変異によって、前記変異を有する前記遺伝子の発現が抑制されているか、または前記変異を有する前記遺伝子のコードするタンパク質がトマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスに対して非機能的であり、前記ウイルスに対してウイルス抵抗性を有する、ナス科植物細胞。
[28]前記トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスが、トマト黄化葉巻ウイルスである、[27]に記載のナス科植物。
[29] 前記変異が、ゲノム編集技術によってゲノム内の遺伝子に導入されたものである、[27]に記載のナス科植物細胞。
[30] 前記変異が、下記(a)〜(d)の少なくとも1種である、[27]〜[29]のいずれかに記載のナス科植物細胞。
(a)フレームシフト変異、
(b)ナンセンス変異、
(c)連続または非連続の3n塩基(n=1〜7)の欠損、および
(d)1または複数の塩基の置換、欠失、付加、および/または挿入。
[31] 前記翻訳開始因子eIF4E遺伝子またはその相同遺伝子に変異を有する、[27]〜[30]のいずれかに記載のナス科植物細胞。
[32] 前記受容体様キナーゼRLK遺伝子またはその相同遺伝子に変異を有する、[27]〜[30]のいずれかに記載のナス科植物細胞。
[33] 前記ポリマーコート複合体deltaCOP遺伝子およびその相同遺伝子に変異を有する、[27]〜[30]のいずれかに記載のナス科植物細胞。
[34] 前記核シャトルタンパク質相互作用因子NSI遺伝子およびその相同遺伝子に変異を有する、[27]〜[30]のいずれかに記載のナス科植物細胞。
[35] 前記翻訳開始因子eIF4E遺伝子は、そのcDNA配列が配列番号1に示される塩基配列を含むものであり、前記翻訳開始因子eIF4E遺伝子の相同遺伝子は、そのcDNA配列が配列番号1に示される塩基配列に対して85%以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、[31]に記載のナス科植物細胞。
[36] 前記翻訳開始因子eIF4E遺伝子またはその相同遺伝子内の、配列番号3に示される塩基配列に対応する領域に変異を有する、[35]に記載のナス科植物細胞。
[37] 前記配列番号3に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号13〜18から選ばれる1種に示される塩基配列に変異している、[36]に記載のナス科植物細胞。
[38] 前記受容体様キナーゼRLK遺伝子は、そのcDNA配列が配列番号4に示される塩基配列を含むものであり、前記翻訳受容体様キナーゼRLK遺伝子の相同遺伝子は、そのcDNA配列が配列番号4に示される塩基配列に対して85%以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、[32]に記載のナス科植物細胞。
[39] 前記受容体様キナーゼRLK遺伝子またはその相同遺伝子内の、配列番号6に示される塩基配列に対応する領域に変異を有する、[38]に記載のナス科植物細胞。
[40] 前記配列番号6に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号19〜22から選ばれる1種に示される塩基配列に変異している、[39]に記載のナス科植物細胞。
[41] 前記ポリマーコート複合体deltaCOP遺伝子は、そのcDNA配列が配列番号33または36に示される塩基配列を含むものであり、前記ポリマーコート複合体deltaCOP遺伝子の相同遺伝子は、そのcDNA配列が配列番号33または36に示される塩基配列に対して85%以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、[33]に記載のナス科植物細胞。
[42] 前記ポリマーコート複合体deltaCOP遺伝子またはその相同遺伝子内の、配列番号35または38に示される塩基配列に対応する領域に変異を有する、[41]に記載のナス科植物細胞。
[43] 前記配列番号35に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号48〜50から選ばれる1種に示される塩基配列に変異している、および/または前記配列番号38に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号51または52に示される塩基配列に変異している、[42]に記載のナス科植物細胞。
[44] 前記核シャトルタンパク質相互作用因子NSI遺伝子は、そのcDNA配列が配列番号39に示される塩基配列を含むものであり、前記核シャトルタンパク質相互作用因子NSI遺伝子の相同遺伝子は、そのcDNA配列が配列番号39に示される塩基配列に対して85%以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、[43]に記載のナス科植物細胞。
[45] 前記核シャトルタンパク質相互作用因子NSI遺伝子またはその相同遺伝子内の、配列番号41に示される塩基配列に対応する領域に変異を有する、[44]に記載のナス科植物細胞。
[46] 前記配列番号41に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号53または54に示される塩基配列に変異している、[45]に記載のナス科植物細胞。
[47] トマトである、[27]〜[46]のいずれかに記載のナス科植物細胞。
[48] [27]〜[47]のいずれかに記載のナス科植物細胞を有し、トマト黄化葉巻ウイルス抵抗性を有する、ナス科植物およびその部分。
[49] 果実である、[48]に記載のナス科植物の部分。
[50] 種子である、[48]に記載のナス科植物の部分。
[51] [48]〜[50]のいずれかに記載のナス科植物またはその部分の加工品。
[52] 食用である、[51]に記載の加工品。
[53] 翻訳開始因子eIF4E遺伝子およびその相同遺伝子、受容体様キナーゼRLK遺伝子およびその相同遺伝子、ポリマーコート複合体deltaCOP遺伝子およびその相同遺伝子、ならびに核シャトルタンパク質相互作用因子NSI遺伝子およびその相同遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも1種の遺伝子を選択する工程と、ナス科植物のゲノム内の選択した遺伝子に対して、前記選択した遺伝子の発現が抑制される変異、または前記選択した遺伝子のコードするタンパク質が、トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスに対して非機能的になる変異を導入する工程と、前記ウイルスに対して抵抗性を有するナス科植物を選別する工程とを含む、トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスに対して抵抗性の、ウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
[54]前記トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスが、トマト黄化葉巻ウイルスである、[53]に記載のナス科植物。
[55] 前記変異を、ゲノム編集技術によってゲノム内の遺伝子に導入する、[53]または[54]に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
[56] 前記変異が、下記(a)〜(d)の少なくとも1種である、[53]〜「55]に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
(a)フレームシフト変異、
(b)ナンセンス変異、
(c)連続または非連続の3n塩基(n=1〜7)の欠損、および
(d)1または複数の塩基の置換、欠失、付加、および/または挿入。
[57] 前記翻訳開始因子eIF4E遺伝子またはその相同遺伝子に変異を導入する、[53]〜[56]のいずれかに記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
[58] 前記受容体様キナーゼRLK遺伝子またはその相同遺伝子に変異を導入する、[53]〜[56]のいずれかに記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
[59] 前記ポリマーコート複合体deltaCOP遺伝子またはその相同遺伝子に変異を導入する、[53]〜[56]のいずれかに記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
[60] 前記核シャトルタンパク質相互作用因子NSI遺伝子またはその相同遺伝子に変異を導入する、[53]〜[56]のいずれかに記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
[61] 前記翻訳開始因子eIF4E遺伝子は、そのcDNA配列が配列番号1に示される塩基配列を含むものであり、前記翻訳開始因子eIF4E遺伝子の相同遺伝子は、そのcDNA配列が配列番号1に示される塩基配列に対して85%以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、[57]に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
[62] 前記翻訳開始因子eIF4E遺伝子またはその相同遺伝子内の、配列番号3に示される塩基配列に対応する領域に変異を導入する、[61]に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
[63] 前記配列番号3に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号13〜18から選ばれる1種に示される塩基配列になるように変異を導入する、[62]に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
[64] 前記受容体様キナーゼRLK遺伝子は、そのcDNA配列が配列番号4に示される塩基配列を含むものであり、前記受容体様キナーゼRLK遺伝子の相同遺伝子は、そのcDNA配列が配列番号4に示される塩基配列に対して85%以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、[58]に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
[65] 前記受容体様キナーゼRLK遺伝子またはその相同遺伝子内の、配列番号6に示される塩基配列に対応する領域に変異を導入する、[64]に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
[66] 前記配列番号6に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号19〜22から選ばれる1種に示される塩基配列になるように変異を導入する、[65]に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
[67] 前記ポリマーコート複合体deltaCOP遺伝子は、そのcDNA配列が配列番号33または36に示される塩基配列を含むものであり、前記ポリマーコート複合体deltaCOP遺伝子の相同遺伝子は、そのcDNA配列が配列番号33または36に示される塩基配列に対して85%以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、[59]に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
[68] 前記ポリマーコート複合体deltaCOP遺伝子またはその相同遺伝子内の、配列番号35または38に示される塩基配列に対応する領域に変異を導入する、[67]に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
[69] 前記配列番号35に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号48〜50から選ばれる1種に示される塩基配列になるように変異を導入する、および/または前記配列番号38に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号51または52に示される塩基配列になるように変異を導入する、[68]に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
[70] 前記核シャトルタンパク質相互作用因子NSI遺伝子は、そのcDNA配列が配列番号39に示される塩基配列を含むものであり、前記核シャトルタンパク質相互作用因子NSI遺伝子の相同遺伝子は、そのcDNA配列が配列番号39に示される塩基配列に対して85%以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、[60]に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
[71] 前記核シャトルタンパク質相互作用因子NSI遺伝子またはその相同遺伝子内の、配列番号41に示される塩基配列に対応する領域に変異を導入する、[70]に記載のトマト黄化葉巻ウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
[72] 前記配列番号41に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号53または54に示される塩基配列になるように変異を導入する、[71]に記載のトマト黄化葉巻ウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
[73] 前記ナス科植物がトマトである、[53]〜[72]のいずれかに記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
[74] [53]〜[73]のいずれかに記載の作出方法によって得られた、ウイルス抵抗性ナス科植物。
[75] [53]〜[73]のいずれかに記載の作出方法によって得られたウイルス抵抗性ナス科植物またはその後代を、自家受粉または他家受粉させる工程を含む、トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスに対して抵抗性のウイルス抵抗性ナス科植物の育種後代の作出方法。
[76] [75]に記載の作出方法によって得られた、トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスに対して抵抗性である、ウイルス抵抗性ナス科植物。
一態様において、本実施形態は、TYLCV抵抗性ナス科植物に関する。本実施形態において、TYLCV抵抗性ナス科植物とは、TYLCVの感染を阻害する性質、感染してもTYLCVの増殖を抑制する性質および/またはTYLCVの感染症状の発現を抑制する性質を有する植物である。TYLCV抵抗性ナス科植物は、TYLCVの感染を阻害するか、感染してもTYLCVの増殖を抑制する性質を有する植物であることが好ましい。
eIF4E遺伝子とは、“eukaryotic translation iniciation factor 4E”、即ち、真核生物翻訳開始因子4Eをコードする遺伝子である。eIF4Eは、真核生物における翻訳開始因子の一種であり、タンパク質合成の開始において重要な役割を有する。eIF4Eは、eIF(iso)4Eとともに、eIF4Eファミリーを構成している。また、ナス科植物は、複数のeIF4Eのアイソフォームを有すると考えられる。例えば、トマトにおいては、eIF4Eは2種のアイソフォームからなり、2番染色体および3番染色体上に存在することが知られている。また、eIF(iso)4Eは、トマトにおいて1種存在し、9番染色体上に存在することが知られている。
RLK遺伝子とは、“Receptor−Like Kinase”、即ち、受容体様キナーゼをコードするトマトの遺伝子である。RLKは、シロイヌナズナではBAM1(Barely Any Meristem 1)と呼ばれ、葉や配偶子形成に関わる、シュートと花分裂組織機能に必要なCLAVATA1関連レセプター様キナーゼタンパク質をコードしている。また、シロイヌナズナのBAM1にはかなり相同性の高いBAM2の存在が認められており、トマトにおいても、近年の研究から、相同性の高い相同体の存在がわかってきた。このような相同体とは、本実施形態に係わるRLKを「RLK1」(Solyc02g091840、2番染色体上)とすると、「RLK2」として知られるものである。尚、シロイヌナズナのBAM1については、TYLCVの近縁ウイルスのC4タンパク質との関連や、近縁ウイルスの複製にも関与することが示唆されているものの、トマトのRLKとTYLCVとの関係については、今まで報告はない。
deltaCOP遺伝子は、ポリマーコート複合体COPIの成分をコードする遺伝子である。COPIの正確な役割の詳細は不明ではあるが、ゴルジ体との関連、およびゴルジ体への小胞輸送との関連が知られている。シロイヌナズナの研究においては、小胞輸送はジェミニウイルス科のウイルスの移行タンパク質の輸送に関連があるため、ウイルス感染にも関係があると推察されている。
NSI遺伝子は、核シャトルタンパク質相互作用因子であると考えられている。シロイヌナズナの研究において、NSI遺伝子は、ベゴモウイルス属のCabbage leaf curl virus(CaLCuV)の移行タンパク(NSP;核シャトルタンパク質)と相互作用することが示されている。そのため、CaLCuVのウイルス感染および複製に関与すると推察される。トマトでは、NSI遺伝子は、アセチルトランスフェラーゼ様タンパク遺伝子として染色体10番に存在する(Solyc10g074910)。アセチルトランスフェラーゼ様タンパク遺伝子は、染色体5番にもう1つ存在する(Solyc05g010250)が、前者と後者の相同性は高くない。トマトのNSI遺伝子とTYLCVとの関係については、今まで報告はない。
本実施形態において、ナス科植物は、翻訳開始因子eIF4E遺伝子およびその相同遺伝子、受容体様キナーゼRLK遺伝子およびその相同遺伝子、ポリマーコート複合体deltaCOP遺伝子およびその相同遺伝子、ならびに核シャトルタンパク質相互作用因子NSI遺伝子およびその相同遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも1種の遺伝子に変異を有する(以下、変異を有する遺伝子を「TYLCV抵抗性遺伝子」ともいう)。当該変異とは、変異を有する遺伝子の発現を抑制するか、または遺伝子がコードするタンパク質をTYLCVに対して非機能的とするものである。TYLCVに対して非機能的なタンパク質とは、TYLCVが植物に感染し、増殖する際に利用できないか、TYLCVの感染および増殖を低減させるタンパク質を指す。一態様において、TYLCV抵抗性遺伝子は、タンパク質をコードしないように変異したものであってもよい。
(a)フレームシフト変異、
(b)ナンセンス変異、
(c)連続または非連続の3n塩基(n=1〜7)の欠損、および
(d)1または複数の塩基の置換、欠失、付加、および/または挿入。
本実施形態におけるTYLCV抵抗性のナス科植物は、TYLCVに抵抗性を示す限り、他のウイルスや細菌に対する抵抗性を示す、複合抵抗性ナス科植物であってもよい。他のウイルスの具体例としては、ナス科に感染する全てのポティウイルス(PVY等)、PVYと同様のVPgをウイルスゲノムの5’末端に有し、翻訳開始因子の変異による抵抗性が報告されているBymovirus属およびSobemovirus属に属するウイルス、翻訳開始因子の変異による抵抗性が報告されているCarmovirus属に属するウイルス等が挙げられる。
一態様において、本実施形態は、ナス科植物またはその部分の加工品に関する。当該加工品に特に限定はなく、食用、工業用、医療用などの加工品が挙げられ、特に食用の加工品であることが好ましい。
一態様において、本実施形態は、TYLCV抵抗性を有するナス科植物細胞に関する。
一態様において、本実施形態は、本発明のTYLCV抵抗性ナス科植物の作出方法に関する。具体的には、下記の工程を含む作出方法に関する。
翻訳開始因子eIF4E遺伝子およびその相同遺伝子、受容体様キナーゼRLK遺伝子およびその相同遺伝子、ポリマーコート複合体deltaCOP遺伝子およびその相同遺伝子、ならびに核シャトルタンパク質相互作用因子NSI遺伝子およびその相同遺伝子からなる群より少なくとも1種の遺伝子を選択する工程と、
ナス科植物のゲノム内の選択した遺伝子に対して、選択した遺伝子の発現が抑制される変異、または選択した遺伝子のコードするタンパク質がTYLCVに対して非機能的になる変異を導入する工程と、TYLCVに対して抵抗性を有するナス科植物を選別する工程。
(1)直接ゲノム編集: TYLCVに対して機能的なeIF4E、RLK、deltaCOPまたはNSIを有する植物のゲノムを直接編集することにより、目的とする箇所にピンポイントで変異を導入し、TYLCV抵抗性遺伝子を有する植物を作出する方法。
(2)変異遺伝子導入: 次の手順(A)と(B)とを組み合わせた方法である。(A):TYLCV抵抗性遺伝子を作製し、適当なプロモーターを用いて植物に導入する。(B):植物が有する、上記(A)で作製したTYLCV抵抗性遺伝子に対応する内生の遺伝子の内、TYLCVに対して機能的な遺伝子をTYLCVに対して非機能的なものとする。
以下、それぞれの方法について説明する。
直接ゲノム編集は、CRISPR、TALEN等、部位特異的ヌクレアーゼを用いた公知のゲノム編集技術を用いて実施することができる。ゲノムの特定部位を切断可能な制限酵素を用いて二本鎖切断を導入すると、これが修復される際に、修復エラーにより各種変異が導入される。その結果、標的遺伝子(本実施形態ではTYLCVに対して機能的なeIF4E、RLK、deltaCOPまたはNSIをコードする遺伝子)に変異が導入される。
変異遺伝子導入は、下記(A)と(B)の手順を組み合わせた方法である。
(A):TYLCV抵抗性遺伝子を作製し、適当なプロモーターを用いて植物に導入する。
(B):植物が有する、上記(A)で作製したTYLCV抵抗性遺伝子に対応する内生の遺伝子の内、TYLCVに対して機能的な遺伝子をTYLCVに対して非機能的なものとする。
上記(A)と(B)を実施する順序は、植物が死に至らない限り、特に限定はなく、(B)を先に実施してもよい。なお、(B)のみを特定の部位において実施する方法が、上記(1)直接ゲノム編集である。
eIF4遺伝子に変異を導入するための組換えアグロバクテリウムAの作製
トマトの3番染色体に存在するとされるeIF4E遺伝子(Solyc03g005870)のエクソン2(配列番号2)内に、ガイドRNAが認識する部位を任意に設定した。設定した20塩基長の部位(配列番号3:AGGGTAAATCTGATACCAGC)に対応する二本鎖DNAを合成し、ベクターpUC19_AtU6oligo(国立研究開発法人 農業生物資源研究所より入手)内の制限酵素BbsIサイトに挿入し、組換えベクターAを構築した。なお、野生株のトマトの3番染色体に存在するeIF4E遺伝子のcDNA配列を図1および配列番号1に示した。
RLK遺伝子に変異を導入するための組換えアグロバクテリウムBの作製
トマトの2番染色体に存在するとされるRLK遺伝子(Solyc02g091840)のエクソン1(配列番号5)内に、ガイドRNAが認識する部位を任意に設定した。設定した20塩基長の部位(配列番号6:TCTCTAGAGTACCTTGCAGT)に対応する二本鎖DNAを合成し、ベクターpUC19_AtU6oligo(国立研究開発法人 農業生物資源研究所より入手)内の制限酵素BbsIサイトに挿入し、組換えベクターBを構築した。なお、野生株のトマトの2番染色体に存在するRLK遺伝子のcDNA配列を図2および配列番号4に示した。
染色体1番のdeltaCOP遺伝子に変異を導入するための組換えアグロバクテリウムCの作製
トマトの1番染色体に存在するとされるdeltaCOP遺伝子(Solyc01g103480)のエクソン6(配列番号34)内に、ガイドRNAが認識する部位を任意に設定した。設定した20塩基長の部位(配列番号35:ACTGGCTTTGGCAGCGACTC)に対応する二本鎖DNAを合成し、ベクターpUC19_AtU6oligo(国立研究開発法人 農業生物資源研究所より入手)内の制限酵素BbsIサイトに挿入し、組換えベクターCを構築した。なお、野生株のトマトの1番染色体に存在するdeltaCOP遺伝子のcDNA配列を図13および配列番号33に示した。
染色体10番のdeltaCOP遺伝子に変異を導入するための組換えアグロバクテリウムDの作製
トマトの10番染色体に存在するとされるdeltaCOP遺伝子(Solyc10g038120)のエクソン2(配列番号37)内に、ガイドRNAが認識する部位を任意に設定した。設定した20塩基長の部位(配列番号38:TTCATGTCTCTGCAATCCAT)に対応する二本鎖DNAを合成し、ベクターpUC19_AtU6oligo(国立研究開発法人 農業生物資源研究所より入手)内の制限酵素BbsIサイトに挿入し、組換えベクターDを構築した。なお、野生株のトマトの10番染色体に存在するdeltaCOP遺伝子のcDNA配列を図14および配列番号36に示した。
NSI遺伝子に変異を導入するための組換えアグロバクテリウムEの作製
トマトの10番染色体に存在するとされるNSI遺伝子(Solyc10g074910)のエクソン4(配列番号40)内に、ガイドRNAが認識する部位を任意に設定した。設定した20塩基長の部位(配列番号41:GAGGAATTTGTTCTAGTTGA)に対応する二本鎖DNAを合成し、ベクターpUC19_AtU6oligo(国立研究開発法人 農業生物資源研究所より入手)内の制限酵素BbsIサイトに挿入し、組換えベクターEを構築した。なお、野生株のトマトの10番染色体に存在するNSI遺伝子のcDNA配列を図15および配列番号39に示した。
トマトの形質転換
形質転換するトマトとして、公知の品種であるマニーメーカーもしくは自社品種Sを用いた。アグロバクテリウムを用いたトマトの形質転換は一般的な教科書(例えば、田部井豊編、「形質転換プロトコール<植物編>(Protocols for plant transformation)」、株式会社化学同人社、2012)に記載の方法に準じて実施した。具体的には、トマトの種子を無菌培地中で発芽させて得た子葉片、または通常播種した子葉片若しくは本葉片を殺菌したものを用意した。次に、実施例1〜5で得た組換えアグロバクテリウムA〜Eのそれぞれを、濁度が0.1〜1.0になるまで培養した培養液を用意し、当該培養液に葉片を10分程度浸漬して、アグロバクテリウムに感染させた。
遺伝子編集継代の選抜
トランスジェニック当代の標的遺伝子内に遺伝子組み換えおよび編集(塩基の欠損、挿入または置換)部位が存在するか否かを確認するために、下記プライマーを用いたPCRによって目的の部位を増幅した。
eIF4E遺伝子(Solyc03g005870)内の領域に対しては、プライマー1(ATCCATCACCCAAGCAAGTTAATT(配列番号7))およびプライマー2(GTCCACAAAGCTATTTTTTCTCCC(配列番号8))、
RLK遺伝子(Solyc02g091840)内の領域に対しては、プライマー3(TTAACACGTCTGCGTAACCTC(配列番号9))およびプライマー4(CCGGTGAAGGTATTGTAGTATCC(配列番号10))、
delta01遺伝子(Solyc01g103480)内の領域に関しては、プライマー7(CGCATGTCAGCTATGCTAAATG(配列番号42))およびプライマー8(GTAGAGCAAATCCACCAGAACCAT(配列番号43))、
delta10遺伝子(Solyc10g038120)内の領域に関しては、プライマー9(ATGAAGCGCAAAGCCAGTGAG(配列番号44))およびプライマー10(ATCCACATCAGTGCTTGGTC(配列番号45))、
NSI遺伝子(Solyc10g074910)内の領域に関しては、プライマー11(CAGGTTATAGATACACCATCCA(配列番号46))およびプライマー12(TAAATCACCGGAAAGAAAG(配列番号47))。
尚、プライマー7は、delta01遺伝子のイントロン内の配列に基づくものであるため、配列番号33のcDNA配列中には対応する配列は存在しない。
eIF4E変異トマトのTYLCV抵抗性確認試験
TYLCVは自然界ではコナジラミにより虫媒されるが、感染葉汁液による機械的接種では感染しない。そのため多検体に効率よくTYLCVを感染させるために、アグロバクテリウムによるウイルス感染性クローン接種法を用いた。この方法では、遺伝子組み換えの方法と同様に、アグロバクテリウムのバイナリベクターにTYLCVの全長配列を組み込んだもの(感染性クローン)を作製し、当該クローンでアグロバクテリウムを形質転換する。得られた組換えアグロバクテリウムを液体培養した後、培地を0.01MのMESバッファー(pH5.7)に置換し、植物体(ここではトマト)の成長点、若めの茎もしくは葉柄にアグロバクテリウムを注射等で接種すると、注射部位付近の細胞にアグロバクテリウムが感染する。感染したアグロバクテリウムが植物のゲノムにTYLCVのDNAを導入すると、植物ゲノムに導入されたTYLCVのDNAはバイナリベクターに設計されたNOSプロモーター等によって発現されて、ウイルスが産生され、感染が成立する。自然界のTYLCVも植物細胞の核内で複製されることから、この感染性クローン接種を疑似接種として用いた。
RLK変異トマトのTYLCV抵抗性確認試験
実施例8と同様に、実施例7で選抜した、RLK遺伝子の編集系統の個体(T0)を隔離温室内で生育し、自家受粉させて種子を回収した。トランスジェニック後代(T1)となるこれらの種子を播種し、生育させた。こうして得られた実生苗に対して、実施例8と同様に、TYLCV−イスラエル系統の感染性クローンを接種した。
delta01変異トマトのTYLCV抵抗性確認試験
実施例8と同様に、実施例7で選抜した、delta01遺伝子の編集系統の個体(T0)を隔離温室内で生育し、自家受粉させて種子を回収した。トランスジェニック後代(T1)となるこれらの種子を播種し、生育させた。こうして得られた実生苗に対して、実施例8と同様に、TYLCV−イスラエル系統の感染性クローンを接種した。
delta10変異トマトのTYLCV抵抗性確認試験
実施例8と同様に、実施例7で選抜した、delta10遺伝子の編集系統の個体(T0)を隔離温室内で生育し、自家受粉させて種子を回収した。トランスジェニック後代(T1)となるこれらの種子を播種し、生育させた。こうして得られた実生苗に対して、実施例5と同様に、TYLCV−イスラエル系統の感染性クローンを接種した。
NSI変異トマトのTYLCV抵抗性確認試験
実施例8と同様に、実施例7で選抜した、NSI遺伝子の編集系統の個体(T0)を隔離温室内で生育し、自家受粉させて種子を回収した。トランスジェニック後代(T1)となるこれらの種子を播種し、生育させた。こうして得られた実生苗に対して、実施例5と同様に、TYLCV−イスラエル系統の感染性クローンを接種した。
TYLCV抵抗性eIF4E遺伝子のシーケンシング
前述のプライマー1およびプライマー2を用いてTYLCV抵抗性T1個体のeIF4E編集部位付近(すなわち、3番染色体上のeIF4E遺伝子内のエクソン2(配列番号2)の14番塩基近傍から3’側の領域)をPCR(T100サーマルサイクラー、Bio−Rad社製)で増幅し、増幅断片をクローニングして塩基配列を確認した。
TYLCV抵抗性RLK遺伝子のシーケンシング
前述のプライマー3およびプライマー4を用いてTYLCV抵抗性T1個体のRLK編集部位付近(すなわち、2番染色体上のRLK遺伝子内のエクソン1(配列番号5)の631番塩基近傍から3’側の領域)をPCR(T100サーマルサイクラー、Bio−Rad社製)で増幅し、増幅断片をクローニングして塩基配列を確認した。
delta01遺伝子のシーケンシング
前述のプライマー7(配列番号42)およびプライマー8(配列番号43)を用いてT0個体のdelta01遺伝子エクソン6内の編集部位付近をPCR(T100サーマルサイクラー、Bio−Rad社製)で増幅し、増幅断片をクローニングして塩基配列を確認した。
delta10遺伝子のシーケンシング
前述のプライマー9(配列番号44)およびプライマー10(配列番号45)を用いてT0個体のdelta10遺伝子エクソン2内の編集部位付近をPCR(T100サーマルサイクラー、Bio−Rad社製)で増幅し、増幅断片をクローニングして塩基配列を確認した。
NSIのシーケンシング
前述のプライマー11(配列番号46)およびプライマー12(配列番号47)を用いてT1個体のNSI遺伝子エクソン4内の編集部位付近をPCR(T100サーマルサイクラー、Bio−Rad社製)で増幅し、増幅断片をクローニングして塩基配列を確認した。
TYLCV抵抗性のeIF4E遺伝子およびRLK遺伝子を導入したトマトの形質転換体の作出
実施例1で得た組換えアグロバクテリウムAおよび実施例2で得た組み換えアグロバクテリウムBを用いるか、もしくは実施例1及び2のガイドRNA認識部位をつなげて配したバイナリベクターFで組み替えたアグロバクテリウムFを用いて、実施例6と同様に、トマトにアグロバクテリウムを感染させて、トランスジェニック当代を得る。
配列番号2: eIF4E遺伝子のエクソン2であり、135番〜154番塩基が標的配列である。
配列番号3: eIF4E遺伝子のエクソン2内の標的配列
配列番号4: RLK遺伝子(Solyc02g091840)のcDNA配列であり、1番〜2818番塩基がエクソン1であり、790番〜809番塩基が標的配列である。
配列番号5: RLK遺伝子のエクソン1であり、790番〜809番塩基が標的配列である。
配列番号6: RLK遺伝子のエクソン1内の標的配列
配列番号7: eIF4E遺伝子検出用のプライマー1
配列番号8: eIF4E遺伝子検出用のプライマー2
配列番号9: RLK遺伝子検出用のプライマー3
配列番号10: RLK遺伝子検出用のプライマー4
配列番号11: TYLCV検出用のプライマー5
配列番号12: TYLCV検出用のプライマー6
配列番号13: eIF4E遺伝子の変異領域I1
配列番号14: eIF4E遺伝子の変異領域I2
配列番号15: eIF4E遺伝子の変異領域I3
配列番号16: eIF4E遺伝子の変異領域I4
配列番号17: eIF4E遺伝子の変異領域I5
配列番号18: eIF4E遺伝子の変異領域I6
配列番号19: RLK遺伝子の変異領域R1
配列番号20: RLK遺伝子の変異領域R2
配列番号21: RLK遺伝子の変異領域R3
配列番号22: RLK遺伝子の変異領域R4
配列番号23: 変異eIF4E遺伝子のcDNA配列であり、451番〜471番塩基が変異領域I1である。
配列番号24: 変異eIF4E遺伝子のcDNA配列であり、451番〜467番塩基が変異領域I2である。
配列番号25: 変異eIF4E遺伝子のcDNA配列であり、451番〜467番塩基が変異領域I3である。
配列番号26: 変異eIF4E遺伝子のcDNA配列であり、451番〜467番塩基が変異領域I4である。
配列番号27: 変異eIF4E遺伝子のcDNA配列であり、451番〜461番塩基が変異領域I5である。
配列番号28: 変異eIF4E遺伝子のcDNA配列であり、451番〜467番塩基が変異領域I6である。
配列番号29: 変異RLK遺伝子のcDNA配列であり、790番〜804番塩基が変異領域R1である。
配列番号30: 変異RLK遺伝子のcDNA配列であり、790番〜802番塩基が変異領域R2である。
配列番号31: 変異RLK遺伝子のcDNA配列であり、790番〜810番塩基が変異領域R3である。
配列番号32: 変異RLK遺伝子のcDNA配列であり、790番〜804番塩基が変異領域R4である。
配列番号33: 染色体1番に存在するdeltaCOP遺伝子(delta01遺伝子)(Solyc01g103480)のcDNA配列であり、402番〜572番塩基がエクソン6であり、471番〜490番塩基が標的配列である。
配列番号34: delta01遺伝子のエクソン6であり、70番〜89番塩基が標的配列である。
配列番号35: delta01遺伝子のエクソン6の標的配列
配列番号36: 染色体10番に存在するdeltaCOP遺伝子(delta10遺伝子)(Solyc10g038120)のcDNA配列であり、106番〜274番塩基がエクソン2であり、136番〜155番塩基が標的配列である。
配列番号37: delta10遺伝子のエクソン2であり、31番〜50番塩基が標的配列である。
配列番号38: delta01遺伝子のエクソン2の標的配列
配列番号39: NSI遺伝子(Solyc10g074910)のcDNA配列であり、209番〜393番塩基がエクソン4であり、283番〜302番塩基が標的配列である。
配列番号40: NSI遺伝子のエクソン4であり、74番〜93番塩基が標的配列である。
配列番号41: NSI遺伝子のエクソン4の標的配列
配列番号42: delta01遺伝子検出用のプライマー7
配列番号43: delta01遺伝子検出用のプライマー8
配列番号44: delta10遺伝子検出用のプライマー9
配列番号45: delta10遺伝子検出用のプライマー10
配列番号46: NSI遺伝子検出用のプライマー11
配列番号47: NSI遺伝子検出用のプライマー12
配列番号48: delta01遺伝子の変異領域D011
配列番号49: delta01遺伝子の変異領域D012
配列番号50: delta01遺伝子の変異領域D013
配列番号51: delta10遺伝子の変異領域D101
配列番号52: delta10遺伝子の変異領域D102
配列番号53: NSI遺伝子の変異領域N1
配列番号54: NSI遺伝子の変異領域N2
配列番号55: 変異delta01遺伝子のcDNA配列であり、471番〜488番塩基が変異領域D011である。
配列番号56: 変異delta01遺伝子のcDNA配列であり、470番〜487番塩基が変異領域D012である。
配列番号57: 変異delta01遺伝子のcDNA配列であり、470番〜484番塩基が変異領域D013である。
配列番号58: 変異delta10遺伝子のcDNA配列であり、135番〜154番塩基が変異領域D101である。
配列番号59: 変異delta10遺伝子のcDNA配列であり、135番〜151番塩基が変異領域D102である。
配列番号60: 変異NSI遺伝子のcDNA配列であり、283番〜303番塩基が変異領域N1である。
配列番号61: 変異NSI遺伝子のcDNA配列であり、283番〜293番塩基が変異領域N2である。
Claims (54)
- 翻訳開始因子eIF4E遺伝子およびその相同遺伝子、受容体様キナーゼRLK遺伝子およびその相同遺伝子、ポリマーコート複合体deltaCOP遺伝子およびその相同遺伝子、ならびに核シャトルタンパク質相互作用因子NSI遺伝子およびその相同遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも1種の遺伝子が変異を有し、
前記変異によって、前記変異を有する前記遺伝子の発現が抑制されているか、または前記変異を有する前記遺伝子のコードするタンパク質がトマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスに対して非機能的であり、
前記ウイルスに対してウイルス抵抗性を有する、ナス科植物。 - 前記トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスが、トマト黄化葉巻ウイルスである、請求項1に記載のナス科植物。
- 前記変異が、ゲノム編集技術によってゲノム内の遺伝子に導入されたものである、請求項1または2に記載のナス科植物。
- 前記変異が、下記(a)〜(d)の少なくとも1種である、請求項1〜3のいずれか一項に記載のナス科植物。
(a)フレームシフト変異、
(b)ナンセンス変異、
(c)連続または非連続の3n塩基(n=1〜7)の欠損、および
(d)1または複数の塩基の置換、欠失、付加、および/または挿入。 - 前記翻訳開始因子eIF4E遺伝子またはその相同遺伝子に変異を有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載のナス科植物。
- 前記受容体様キナーゼRLK遺伝子またはその相同遺伝子に変異を有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載のナス科植物。
- 前記ポリマーコート複合体deltaCOP遺伝子およびその相同遺伝子に変異を有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載のナス科植物。
- 前記核シャトルタンパク質相互作用因子NSI遺伝子およびその相同遺伝子に変異を有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載のナス科植物。
- 前記翻訳開始因子eIF4E遺伝子は、そのcDNA配列が配列番号1に示される塩基配列を含むものであり、
前記翻訳開始因子eIF4E遺伝子の相同遺伝子は、そのcDNA配列が配列番号1に示される塩基配列に対して85%以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、請求項5に記載のナス科植物。 - 前記翻訳開始因子eIF4E遺伝子またはその相同遺伝子内の、配列番号3に示される塩基配列に対応する領域に変異を有する、請求項9に記載のナス科植物。
- 前記配列番号3に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号13〜18から選ばれる1種に示される塩基配列に変異している、請求項10に記載のナス科植物。
- 前記受容体様キナーゼRLK遺伝子は、そのcDNA配列が配列番号4に示される塩基配列を含むものであり、
前記翻訳受容体様キナーゼRLK遺伝子の相同遺伝子は、そのcDNA配列が配列番号4に示される塩基配列に対して85%以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、請求項6に記載のナス科植物。 - 前記受容体様キナーゼRLK遺伝子またはその相同遺伝子内の、配列番号6に示される塩基配列に対応する領域に変異を有する、請求項12に記載のナス科植物。
- 前記配列番号6に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号19〜22から選ばれる1種に示される塩基配列に変異している、請求項13に記載のナス科植物。
- 前記ポリマーコート複合体deltaCOP遺伝子は、そのcDNA配列が配列番号33または36に示される塩基配列を含むものであり、
前記ポリマーコート複合体deltaCOP遺伝子の相同遺伝子は、そのcDNA配列が配列番号33または36に示される塩基配列に対して85%以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、請求項7に記載のナス科植物。 - 前記ポリマーコート複合体deltaCOP遺伝子またはその相同遺伝子内の、配列番号35または38に示される塩基配列に対応する領域に変異を有する、請求項15に記載のナス科植物。
- 前記配列番号35に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号48〜50から選ばれる1種に示される塩基配列に変異している、および/または
前記配列番号38に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号51または52に示される塩基配列に変異している、請求項16に記載のナス科植物。 - 前記核シャトルタンパク質相互作用因子NSI遺伝子は、そのcDNA配列が配列番号39に示される塩基配列を含むものであり、
前記核シャトルタンパク質相互作用因子NSI遺伝子の相同遺伝子は、そのcDNA配列が配列番号39に示される塩基配列に対して85%以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、請求項17に記載のナス科植物。 - 前記核シャトルタンパク質相互作用因子NSI遺伝子またはその相同遺伝子内の、配列番号41に示される塩基配列に対応する領域に変異を有する、請求項18に記載のナス科植物。
- 前記配列番号41に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号53または54に示される塩基配列に変異している、請求項19に記載のナス科植物。
- トマトである、請求項1〜20のいずれか一項に記載のナス科植物。
- 請求項1〜21のいずれか一項に記載のナス科植物の部分。
- 果実である、請求項22に記載のナス科植物の部分。
- 種子である、請求項22に記載のナス科植物の部分。
- 請求項1〜24のいずれか一項に記載のナス科植物またはその部分の加工品。
- 食用である、請求項25に記載の加工品。
- 翻訳開始因子eIF4E遺伝子およびその相同遺伝子、受容体様キナーゼRLK遺伝子およびその相同遺伝子、ポリマーコート複合体deltaCOP遺伝子およびその相同遺伝子、ならびに核シャトルタンパク質相互作用因子NSI遺伝子およびその相同遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも1種の遺伝子が変異を有し、
前記変異によって、前記変異を有する前記遺伝子の発現が抑制されているか、または前記変異を有する前記遺伝子のコードするタンパク質がトマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスに対して非機能的であり、
前記ウイルスに対してウイルス抵抗性を有する、ナス科植物細胞。 - 前記トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスが、トマト黄化葉巻ウイルスである、請求項27に記載のナス科植物。
- ナス科植物がトマトである、請求項27または28に記載のナス科植物細胞。
- 請求項27〜29のいずれか一項に記載のナス科植物細胞を有し、トマト黄化葉巻ウイルス抵抗性を有する、ナス科植物およびその部分。
- 翻訳開始因子eIF4E遺伝子およびその相同遺伝子、受容体様キナーゼRLK遺伝子およびその相同遺伝子、ポリマーコート複合体deltaCOP遺伝子およびその相同遺伝子、ならびに核シャトルタンパク質相互作用因子NSI遺伝子およびその相同遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも1種の遺伝子を選択する工程と、
ナス科植物のゲノム内の選択した遺伝子に対して、前記選択した遺伝子の発現が抑制される変異、または前記選択した遺伝子のコードするタンパク質がトマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスに対して非機能的になる変異を導入する工程と、
前記ウイルスに対して抵抗性を有するナス科植物を選別する工程とを含む、トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスに対して抵抗性の、ウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。 - 前記トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスが、トマト黄化葉巻ウイルスである、請求項31に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
- 前記変異を、ゲノム編集技術によってゲノム内の遺伝子に導入する、請求項31または32に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
- 前記変異が、下記(a)〜(d)の少なくとも1種である、請求項31〜33のいずれか一項に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
(a)フレームシフト変異、
(b)ナンセンス変異、
(c)連続または非連続の3n塩基(n=1〜7)の欠損、および
(d)1または複数の塩基の置換、欠失、付加、および/または挿入。 - 前記翻訳開始因子eIF4E遺伝子またはその相同遺伝子に変異を導入する、請求項31〜34のいずれか一項に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
- 前記受容体様キナーゼRLK遺伝子またはその相同遺伝子に変異を導入する、請求項31〜34のいずれか一項に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
- 前記ポリマーコート複合体deltaCOP遺伝子またはその相同遺伝子に変異を導入する、請求項31〜34のいずれか一項に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
- 前記核シャトルタンパク質相互作用因子NSI遺伝子またはその相同遺伝子に変異を導入する、請求項31〜34のいずれか一項に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
- 前記翻訳開始因子eIF4E遺伝子は、そのcDNA配列が配列番号1に示される塩基配列を含むものであり、
前記翻訳開始因子eIF4E遺伝子の相同遺伝子は、そのcDNA配列が配列番号1に示される塩基配列に対して85%以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、請求項35に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。 - 前記翻訳開始因子eIF4E遺伝子またはその相同遺伝子内の、配列番号3に示される塩基配列に対応する領域に変異を導入する、請求項39に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
- 前記配列番号3に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号13〜18から選ばれる1種に示される塩基配列になるように変異を導入する、請求項40に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
- 前記受容体様キナーゼRLK遺伝子は、そのcDNA配列が配列番号4に示される塩基配列を含むものであり、
前記受容体様キナーゼRLK遺伝子の相同遺伝子は、そのcDNA配列が配列番号4に示される塩基配列に対して85%以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、請求項36に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。 - 前記受容体様キナーゼRLK遺伝子またはその相同遺伝子内の、配列番号6に示される塩基配列に対応する領域に変異を導入する、請求項36に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
- 前記配列番号6に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号19〜22から選ばれる1種に示される塩基配列になるように変異を導入する、請求項40に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
- 前記ポリマーコート複合体deltaCOP遺伝子は、そのcDNA配列が配列番号33または36に示される塩基配列を含むものであり、
前記ポリマーコート複合体deltaCOP遺伝子の相同遺伝子は、そのcDNA配列が配列番号33または36に示される塩基配列に対して85%以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、請求項37に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。 - 前記ポリマーコート複合体deltaCOP遺伝子またはその相同遺伝子内の、配列番号35または38に示される塩基配列に対応する領域に変異を導入する、請求項45に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
- 前記配列番号35に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号48〜50から選ばれる1種に示される塩基配列になるように変異を導入する、および/または
前記配列番号38に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号51または52に示される塩基配列になるように変異を導入する、請求項46に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。 - 前記核シャトルタンパク質相互作用因子NSI遺伝子は、そのcDNA配列が配列番号39に示される塩基配列を含むものであり、
前記核シャトルタンパク質相互作用因子NSI遺伝子の相同遺伝子は、そのcDNA配列が配列番号39に示される塩基配列に対して85%以上の配列相同性を有する塩基配列を含むものである、請求項38に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。 - 前記核シャトルタンパク質相互作用因子NSI遺伝子またはその相同遺伝子内の、配列番号41に示される塩基配列に対応する領域に変異を導入する、請求項48に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
- 前記配列番号41に示される塩基配列に対応する領域が、配列番号53または54に示される塩基配列になるように変異を導入する、請求項49に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
- 前記ナス科植物がトマトである、請求項31〜50のいずれか一項に記載のウイルス抵抗性ナス科植物の作出方法。
- 請求項31〜51のいずれか一項に記載の作出方法によって得られた、ウイルス抵抗性ナス科植物。
- 請求項31〜51のいずれか一項に記載の作出方法によって得られたウイルス抵抗性ナス科植物またはその後代を、自家受粉または他家受粉させる工程を含む、トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスに対して抵抗性のウイルス抵抗性ナス科植物の育種後代の作出方法。
- 請求項53に記載の作出方法によって得られた、トマトに黄化葉巻様症状を呈するベゴモウイルス属ウイルスに対して抵抗性のウイルス抵抗性ナス科植物。
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