RS62325B1 - Biljke otporne na fitoftoru koje pripadaju familiji solanaceae - Google Patents

Biljke otporne na fitoftoru koje pripadaju familiji solanaceae

Info

Publication number
RS62325B1
RS62325B1 RS20211129A RSP20211129A RS62325B1 RS 62325 B1 RS62325 B1 RS 62325B1 RS 20211129 A RS20211129 A RS 20211129A RS P20211129 A RSP20211129 A RS P20211129A RS 62325 B1 RS62325 B1 RS 62325B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
dmr6
plants
phytophthora
dlo1
genes
Prior art date
Application number
RS20211129A
Other languages
English (en)
Inventor
Schie Christianus Cornelis Nicolaas Van
Karin Ingeborg Posthuma
Tieme Zeilmaker
Boer Geert Johannes De
Original Assignee
Enza Zaden Beheer Bv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Enza Zaden Beheer Bv filed Critical Enza Zaden Beheer Bv
Publication of RS62325B1 publication Critical patent/RS62325B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/08—Fruits
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/82—Solanaceae, e.g. pepper, tobacco, potato, tomato or eggplant
    • A01H6/822—Capsicum sp. [pepper]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Opis
[0001] Ovaj se pronalazak odnosi na biljke kao slatka paprika koje imaju otpornost na Phytophthora ili biljke Capsicum spp. Koje pripadaju familiji Solanaceae pri čemu se pomenuta otpornost kodira kombinacijom dva odvojena gena.
[0002] Patogen biljke Phytophthora (klasa: Oomycetes, red: Peronosporales, familija: Pythiaceae) je vrsta koja oštećuje biljke Oomycetes (algašice) koje su sposobne da prouzrokuju velike ekonomske gubitke na usevima širom sveta, kao i ekološko oštećenje u prirodnim ekosistemima. Phytophthora patogeni su uglavnom patogeni dikotiledona i generalno su paraziti specifični za domaćina. Ovu vrstu je opisao Heinrich Anton de Bary 1875. Približno 100 vrsta je opisano među kojima i ekonomski važni patogeni biljaka kao što su Phytophthora capsici, Phytophthora infestans, i Phytophthora nicotinae.
[0003] Phytophthora infestans je infektivni agens krompirove plesni koji je prouzrokovao Veliku glad u Irskoj (1845-1849), i dalje je najdestruktivniji patogen useva iz grupe cvetnica (pomoćnica), uključujući paradajz i krompir. Agens korena soje (sojinog zrna) i agens truljenja stabla, Phytophthora sojae, je takođe prouzrokovao dugoročne probleme za poljoprivrednu industriju. Generalno, oboljenja biljaka prouzrokovana ovom vrstom je teško kontrolisati hemijski, i zato rast otpornih kultivara jeste glavna strategija upravljanja. Druge važne Phytophthora bolesti su:
Phytophthora cactorum - prouzrokuje truljenje korena rododendrona što utiče na rododendrone, azaleje i prouzrokuje krvarenje kore (bleeding canker) kod tvrdog drveća; Phytophthora capsici - inficira Cucurbitaceae voće, kao što su krastavci i tikvice, Phytophthora cinnamomi -prouzrokuje truljenje korena cimeta što utiče na drvenaste ukrasne biljke uključujući tuje i azaleje, Phytophthora fragariae - prouzrokuje truljenje crvenog korena koje utiče na jagode; Phytophthora kernoviae - patogen bukve i rododendrona, takođe nastaje na drugom drveću i drvenastom žbunju uključujući hrast i crniku, Phytophthora megakarya - jedna od vrsta bolesti mahune crnog kakaoa, je invazivna i verovatno odgovorna za najveći gubitak useva kakaoa u Africi; Phytophthora palmivora - prouzrokuje truljenje ploda u kokosovoj mahuni i plodu betela (brsta bibera), Phytophthora ramorum, Phytophthora quercina - prouzrokuje smrt hrasta, i Phytophthora sojae - prouzrokuje truljenje korena soje.
[0004] Phytophthora se ponekad pominje kao organizam sličan gljivama ali se klasifikuje u različito carstvo:
Chromalveolata (nekada Stramenopila i prethodno Chromista). Phytophthora je morfološki veoma slična "pravoj" gljivi iako je njena evoluciona istorija sasvim distinktivna. Nasuprot gljivama, hromalveolate su srodnije biljkama nego životinjama. Kako su ćelijski zidovi gljiva napravljeni primarno od hitina, zidovi ćelije hromalveolata su sagrađeni uglavnom od celuloze. Nivoi ploidije su različiti između ove dve grupe; Phytophthora ima diploidne (uparene) hromozome u vegetativnom (rastućem, nereproduktivnom) stadijumu života, Fungi su skoro uvek haploidne u ovom stanju. Biohemijskeputanje se takođe razlikuju, primetno visoko očuvane.
[0005] Phytophthoravrste mogu da se reprodukuju seksualno ili aseksualno. U brojnim vrstama, seksualne strukture nikada nisu primećene, ili su primećene u laboratorijskim uslovima parenja. Kod homotalnih vrsta, seksualne strukture nastaju u jednoj kulturi. Heterotalne vrste imaju sojeve parenja, označene kao A1 i A2. Kada se pari, anteridia uvodi gamete u oogonije, bilo tako što oogonija prolazi kroz anteridijum (amfiginija) ili spajanjem anteridijuma na proksimalnu (nižu) polovinu oogonijuma (paraginija), i ta unija proizvodi oospore. Kao i životinje, ali ne kao većina "pravih" gljiva, mejoza je gametska, isomatski nukleusi su diploidni. Aseksualni (mitotski) tipovi spora su hlamidospore, i sporangije koje proizvode zoospore. Hlamidospore su obično sferne i pigmentisane, i mogu imati zadebljani ćelijski zid da bi potpomogli njenu ulogu kao strukture (ključne) za opstanak. Sporangije mogu da budu zadržane putem razvijajućih hifa (ne otpadaju/prolaze rano) ili može lako da ih oduva vetar ili vode (prolazno) deluju kao strukture koje se rasteruju. Takođe, sporangija može da otpusti zoospore, koje imaju dve različite flagele koje one koriste da bi plivale prema biljci domaćinu.
[0006] Solanaceae, ili ponoćnice, je ekonomski važna familija cvetajućih biljaka. Opsezi familije se kreću od biljaka do drveća, i uključuju izvestan broj važnih poljoprivrednih useva, medicinskih biljaka, začina, korovskih trava, i ukrasnih biljaka. Veliki broj članova familije obuhvata jake alkaloide, i neki od njih su visoko toksični.
[0007] Familija Solanaceae pripada redu Solanales, u dikotiledonima grupe asterid (Magnoliopsida). Familija Solanaceae obuhvata približno 98 rodova i nekih 2.700 vrsta, sa velikom raznovrsnošću habitata, morfologijom i ekologijom.
[0008] Familija je rasprostranjena širom sveta prisutna na svim kontinentima izuzev Antarktika. Najveća raznovrsnost vrsta se nalazi u Južnoj Americi i Centralnoj Americi. Solanaceae uključuju izvestan broj najčešće prikupljanih i kultivisanih vrsta. Možda ekonomski najvažnija vrsta familije jeste Solanum, koji obuhvata krompir (Solanum tuberosum, zapravo, još jedno uobičajeno ime familije jeste "familija krompira"), paradajz (Solanum lycopersicum), i plavi patlidžan (Solanum melongena). Još jedna važna vrsta je Capsicum koja obuhvata 'ljute' paprike i slatke ili babure (Capsicum annuum).
[0009] Vrsta Physalis proizvodi takozvane mehurice, kao i meksički paradajz (Physalis philadelphica), peruansku jagodu i ljoskavac. Rod Lycium sadrži bodkastolisne bobice sa trnjem kao godži bobice i obični vučac (bodkastolisna kustovnica) Lycium barbarum. Nicotiana obuhvata, između ostalih vrsta, biljku duvana. Neki drugi važni članovi Solanaceae uključuju nekoliko ukrasnih biljaka kao što je Petunia, Browallia i Lycianthes, izvor psihoaktivnih alkaloida, datura, mandragora (mandragora), i velebilje veliki bun, crni bun (atropa belladonna) (smrtonosna ponoćnica). Izvesne vrste su univerzalno poznate po svojim medicinskim upotrebama, svojim psihotropnim dejstvima ili po tome što su otrovne.
[0010] Izuzimajući duvan (Nicotianoideae) i petuniju (Petunioideae), većina ekonomski važnih vrsta je sadržana u podfamiliji Solanoideae. U krajnjem slučaju, ali ništa manje važno, Solanacea uključuju veliki broj organizama koji su važni za ispitivanje ključnih bioloških pitanja na ćelijskom, molekularnom i genetskom nivou, kao što je duvan, petunija i N. Benthaminia.
[0011] WO 2008/092505 opisuje biljke, biljke koje su otporne na patogen virusnog, bakterijskog, gljivičnog porekla ili su poreklom algašice, pri čemu te biljke imaju smanjeni nivo, smanjenu aktivnost ili potpuno odsustvo DMR6 proteina u poređenju sa biljkama koje nisu otporne na patogen, posebno organizme gljiva (Fungi) ili razdela (filum) algašica.
[0012] Doktorska teza Tiema Cailmakera (Tieme Zeilmaker) od 6. Februara 2012, Univerzitet Utreht ("Funkcionalni i primenjeni aspekti NA PERONOSPORE OTPORNIH gena 1 i 6 kod gena uročnjaka (Functional and applied aspects of the DOWNY MILDEW RESISTANT 1 and 6 genes in Arabidopsis) (PhD thesis)", 6 February 2012 (2012-02-06), Universiteit Utrecht) opisuje različite DMR6 homologe koji imaju delimično redundantne, ali distinktivne, funkcije za suzbijanje imuniteta kod vrste uročnjaka Arabidopsis.
[0013] S obzirom na ekonomski značaj biljke sa velikim brojem članova iz familije Solanaceae i destruktivno dejstvo biljnog patogena Phytophthora na brojne članove ove familije, cilj je, između ostalog, ovog pronalaska da obezbedi biljke otporne na Phytophthora i posebno slatku papriku (Capsicum annuum) ili Capsicum spp.
[0014] Gore navedeni cilj, između ostalog, zadovoljen je ovim pronalaskom time što obezbeđuje biljke kako je navedeno u priloženim patentnim zahtevima.
[0015] Opisane su biljke koje pripadaju familiji Solanaceae pri čemu ove biljke imaju genetski trag koji obezbeđuje otpornost na Phytophthora i pri čemu se ta crta otpornosti kodira kombinacijom najmanje dva gena koji imaju smanjenu ekspresiju, ili smanjenu transkripciju, ili smanjenu aktivnost proteina kodiranih prisutnim genima u poređenju sa istom biljkom koja pripada familiji Solanaceae koje su vrlo podložne dejstvu Phytophthora.
[0016] Opisane su biljke koje pripadaju famliji Solanaceae izabrane iz grupe koja obuhvata krompir, petuniju, paradajz, plavi patlidžan, plavi patlidžan, duvan i slatku papriku.
[0017] Prema ovom pronalasku, ove biljke su slatka paprika (Capsicum annuum) ili Capsicum spp., Phytophthora otpornost je otpornost na Phytophthora capsici i kombinacija najmanje dva gena su geni koji kodiraju proteine prema SEK ID Br.16 i SEK ID Br.17 ili proteini koji imaju barem 90% identičnost sekvence sa SEK ID Br.16 i/ili SEK ID Br.17, poželjno najmanje 95% identičnost sekvence, najpoželjnije najmanje 99% identičnost sekvence.
[0018] Opisane su biljke koje pripadaju familiji Solanaceae pri čemu te biljke obuhvataju genetsku crtu koja omogućava otpornost na Phytophthora, pri čemu ova crta otpornosti može da se dobije aktivnošću smanjene regulacije kombinacije dva gena ili smanjenjem aktivnosti proteina kodiranih genima kod biljke podložne na dejstvo Phytophthora, pri čemu dva gena kodiraju kombinacije SEK ID Br.1 i 2 ili SEK ID Br.3 i 4 ili SEK ID Br.5 i 6 ili proteini koji imaju najmanje 80%, 85%, ili 90% identičnost sekvence kao što je 91%, 92%, 93% i 94% identičnost sekvence, poželjno najmanje 95% identičnost sekvence, kao što je 96%, 97%, 98% i 99% identičnost sekvence.
[0019] S obzirom na pogodna svojstva ovih gena za obezbeđivanje biljaka otpornih na dejstvo Phytophthora, opisana je upotreba kombinacije dva gena, pri čemu pomenuta kombinacija dva gena kodira kombinacije proteina jesu SEK ID Br. 16 i 17 ili proteini koji imaju najmanje 90% identičnost sekvence za obezbeđivanje otpornosti na Phytophthora kod biljaka jeste slatka paprika (Capsicum annuum) ili biljke Capsicum spp.
[0020] Opisana upotrebe obuhvata smanjenu ekspresiju, ili smanjenu transkripciju, prisutnih gena ili smanjenu aktivnost proteina kodiranih prisutnim genima u poređenju sa slatkom paprikom (Capsicum annuum) ili Capsicum spp biljke podložne na dejstvo Phytophthora.
[0021] Opisani su proteini i geni pogodni za obezbeđivanje otpornosti na dejstvo Phytophthora na biljke kod kojih su proteini izabrani iz grupe koja obuhvata SEK ID Br.1, 2, 3, 4, 5, 6, 16, 17, 18 i 19 i proteine koji imaju najmanje 90% identičnost sekvence sa tim, poželjno najmanje, 95%, najpoželjnije najmanje 99%.
[0022] Ovaj će pronalazak biti bolje ilustrovan u primerima datim u nastavku.
Primeri
Primer 1(krompir)
RNKi konstrukti koji ciljaju sekvence krompira SEK ID BR.7 i 8
[0023] 3 različita RNKi konstrukta su napravljena, koji obuhvataju/ciljaju:
1. 5’ kraj SEK ID BR 7: ekvivalent sekvenci kodiranja -159-200 (-159 od početka znači u 5’utr).
2. Himera sa 5’ kraja SEK ID BR.7 i 8: ekvivalent sekvenci kodiranja 4-199 1-204.
3. Srednji deo SEK ID BR.7 (visoko homologan srednjoj SEK ID BR 8):ekvivalent sekvenci kodiranja 334-743.
[0024] Fragmenti su pojačani iz genomske DNK i klonirani u pENTR-D-TOPO vektor. Za himerni konstrukt, 2 fragmenta su spojena korišćenjem prajmera sa komplementarnim prepustima, i naknadno produžavanje i pojačavanje da bi se stvorio fuzioni fragment. Fragmenti su preneti korišćenjem Gateway LR reakcije na RNKi vektor pK7GWiWG2 (Karimi et al., 2002, Trends Plant Sci 7), stvaranjem invertovanog ponavljanja sa strukturom u obliku ukosnice. Zato što pK7GWiWG2 vektor zahteva streptomicin za bakterijsku selekciju, soj Agrobacterium korišćen za transformaciju krompira (LBA4404) već nosi streptomicin marker selekcije, kompletna RNAi (ukosnica) kaseta je preneta na drugačiji vektor transformacije biljke, pGreen0029 (bakterijski kao i marker selekcije biljke = Kanamicin) (Hellens et al., 2000, Plant Mol Biol 42). Krajnji konstrukti dozvoljavaju stabilnu ekspresiju 35S-promoterom vođenu ukosnicu u RNK koja formira dsRNK koja indukuje utišavanje, pošto intronom formirana petlja ukosnice biva upletena. Barem šest nezavisnih T1 transformanata je održavano za svaki konstrukt.
Detalji ogleda sa zaraženima fitoftorom
[0025] Odvojeni listovi su uzeti iz biljaka T1 (prva generacija transgenika), i postavljeni na tacnu sa 100% RH sa peteljčicama u vlažnoj pamučnoj vuni ili oazi (Oasis). Phytophthora infestans (P.inf) zoospore/sporangije su prikupljene iz P.inf kultura (raž-saharoza-agar ploče), i 10ul kapi suspenzije spora koja je sadržala 10e3 sporangije (10e5/ml) je postavljeno na svaku stranu središnje vene. Tacne su inkubirane na 18 C. Brzine infekcije lista su ocenjene 11. dana, kao 1. Potpuno inficirano/preraslo, 2. Delimično inficirano (10-50% područja), i 3. Čisto (<10% područja).
[0026] Kao što je prikazano na slikama 1 i 2, dvostruko utišane (SEK ID BR.7 i 8) biljke sa slike 2a pokazuju da samo 50% jeste inficirano, dvostruko utišano (himerne) biljke sa slike 2b pokazuju da je samo 60% inficirano, pri čemu kontrolna grupa sa slike 1 pokazuje da su sve biljke bile inficirane. Kao što je prikazano na slici 3, 40 do 50% utišanih biljaka SEK ID BR.7 i SEK ID BR: 8 su čiste, pri čemu su te biljke koje imaju samo SEK ID BR.7 utišale samo 10% od broja delimično inficiranih biljaka. Prema tome, utišavanje obe SEK ID BR.7 i 8 obezbeđuje otpornost na Phytophthora infestans.
Primer 2 (petunija)
[0027] Linije umetanja transpozona su identifikovane iz zbirke/biblioteke (Vandenbussche et al., 2008, Plant Journal 54).2 dTph1 aleli umetanja transpozona su pronađeni u SEK ID BR 9 i 3 dTph1 aleli umetanja transpozona u SEK ID BR 10. Urađeno je nekoliko ukrštanja da bi se generisali dvostruki mutanti.
Detalji ogleda sa truležom donjeg dela stabla od korena Phytophthora nicotianae
[0028] Biljke su rasle u standardnom tresetu za humus, pojedinačno stavljene u saksije, na 23 C.
P.nicotianae spore su požnjevene iz kultura (lima-bean-agar podloga ili V8-agar ploče), i 2ml suspenzije spora koje obuhvataju 10e4 (ogled Sept) spore su nakapane u tlo sa svakom biljkom. Propadanje biljke je redovno nadgledano.
[0029] Kao što je prikazano na slici 4, dvostruki mutanti, tj. biljke koje imaju mutacije i u SEK ID BR 9 i SEK ID BR 10 imaju procenat živih biljaka od 45%, pri čemu procenat živih biljaka pojedinačnih mutanata (mutanti u SEK ID BR.9 ili SEK ID BR.10) iznosi samo 20%.
Primer 3 (paradajz)
[0030] Biljke paradajza su transformisane sa dva konstrukta, bilo za obezbeđivanje prekomernog eksprimovanja (overexpress) i SEK ID BR. 11, i SEK ID BR. 12, ili za obezbeđivanje utišavanja i SEK ID BR.11 i SEK ID BR.12. U slučaju sekvence paradajza SEK ID BR. 11 konstrukti utišavanja su generisani korišćenjem Gateway kloniranja od 300 bp fragmenta identičnog srednjem delu CDS od SEK ID BR.11.
Sekvenca:
[0031]
Korišćenje prajmera:
[0032]
S. Lycopersicum AttB1-F aaaaagcaggcttcttgggtgaacaaggacaaca S.Lycopersicum AttB2-R agaaagctgggtaaaacgaagccactgacatcc Generisani ulazni vektor ENTRY je bio kloniran tehnikom Gateway u pHellsgate12 binarni vektor. Prema Agrobacterium transformaciji prema standardnom postupku za paradajz. Konstrukti utišavanja su mogli da utišaju i SEK ID BR. 11 i SEK ID BR. 12, zahvaljujući sličnostima sekvenci.
[0033] Izdanci iz transformisanih biljaka paradajza su podvrgnuti testu bolesti imunizacijom Phytophthora infestans izolata US11. 7 dana posle imunizacije biljke su vizuelno analizirane prebrojavanjem listova na vizuelnom nivou od 1 do 9, pri čemu 1 znači podložno i 9 znači otporno. Kao kontrola za podložne biljke, korišćeni su TS33, TS19 i OT9. Kao kontrola za otporne biljke, koristi se poznat rezistentan divlji pristup LA1269. Izmereno je 8 listova svake biljke. Tabela dole u tekstu obezbeđuje prosečnu ocenu sa 8 listova po biljci.
Silecing = utisane biljke
Overexpres - prekomerno
[0034] U ovoj tabeli je pokazano da SEK ID BR. 11 i SEK ID BR. 12 biljaka sa prekomernim eksprimovanjem jesu podložne u pogledu izolata US11. Utišana biljka postiže značajno više ocene od podložne kontrolne biljke OT9. Na primer biljka 556-01-08 ima prosečnu ocenu od 8,5. Uzorak ove biljke je prikazan na slici 5 u kutiji G10, i nije inficiran slično rezistetnoj kontrolnoj biljci LA1296 kako je prikazano u kutiji D8. Prema tome, utišavanje (silencing) obe SEK ID BR.
11 i SEK ID BR.12 obezbeđuje otpornost na Phytophthora infestans.
Primer 4 (N. benthamiana)
[0035] Da bi se ispitalo da li je DMR6 posredovao otpornost u N. benthamiana naspram Phytophthora infestans DMR6 ortolog je kloniran u VIGS vektoru ekspresije. N. benthamiana biljke su utišane za DMR6 i naknadno kapima imunizovane sa rastvorom spore P. infestans. I do 7 dpi, biljke su ocenjene u pogledu razvoja bolesti. Ovaj eksperiment je izveden tri puta sa sličnim rezultatima. DMR6 utišavanje jasno daje kao rezultat manju kolonizaciju patogenom u poređenju sa praznim kontrolnim vektorom ili divljim tipom neutišanih biljaka.
Sekvenca utišavajućeg konstrukta DMR6:
[0036]
[0037] VIGS je korišćen da se utiša i testira funkcija N. benthamiana DMR6. Kao vizuelna kontrola za procedure, PDS gen je takođe ciljan. PDS utišane biljke su korišćene da označe u koje vreme je početo utišavanje. Utišavanje je moralo početi ± 2 dana pre nego što je primećena depigmentacija usled nivoa proteina već uspostavljenih u biljci. Ali na početku vremenskog okvira utišavanja, utišavanje neće biti vršeno velikom brzinom i čekanje od dva dana daje mehanizmu vremena da se uspostavi dobra brzina utišavanja. Još jedna prednost korišćenja PDS utišanih biljaka je što one dajuindikaciju koji delovi biljke su utišani. Beljenje/depigmentacija je primećena na svim delovima iznad imunizacije. U vakuumom imunizovanim biljkama novo tkivo je pokazalo jako fotobeljenje i delovi nekih kotelidona su takođe pokazali bela područja. U biljkama imunizovanim špricem, depigmentacija je bila najjača na najmlađim listovima, kod potpuno izraslih listova pigment je već sintetisan i utišavanje biva teže primetiti vizuelno. Beljenje PDS utišanih biljaka je primećeno 8-10 dana posle imunizacije sa sojem Agrobacterium koji obuhvata TRV vektor.8. dana su započeti ogledi sa infekcijom.
[0038] Izvedena su dva odvojena VIGS eksperimenta. Biljke iz oba eksperimenta su korišćene za odvojene oglede infekcije lista. Ogled infekcije sa P. capsici je urađen 8 dana posle Agro-infiltracije, na listovima 2-6 iznad nefiltriranog lista. Rastvor zoospora koji obuhvata 5 *10<3>spora/ml-1 je nanet na odvojene listove. Prvi VIGS je pokazao male stope infekcije P. capsici posle 7 dana (videti Tabelu 1.). Idealno, 100% neutišanih listova pokazuje infekciju.
Tabela 1. Rezultati iz ogleda infekcije 1. VIGS eksperimenta. Nijedan od DMR6 utišanih listova nije pokazao infekciju.3 od 7 neutišanih listova je pokazalo infekciju.
Smatra se da je ova niska sporulacija uzrok niske infekcije N. benthamiana listova. Međutim, nijedan od DMR6 utišanih listova nije pokazao simptome infekcije, nasuprot 40% listova koji nisu utišani koliko je pokazalo infekciju. Da bi se povećala stopa infekcije, urađene su promene u pogledu sticanja spora i postupak infekcije je prouzrokovao agresivniju infekciju tokom drugog ogleda infekcije. Utvrđen je jedan DMR6 utišani neinficirani list i drugi DMR6 utišani listovi su pokazali odloženu infekciju i sporije širenje infekcije.
Primer 5
Uvod
[0039] Izvestan broj gena koji kodiraju negativne regulatore imuniteta su aktivirani tokom infekcije patogenom tako da je taj indukovani odgovor odbrane kontrolisano i smanjeno regulisan da bi se sprečila prekomerna aktivacija. Primeri su NUDT7 kodirana Nudix hidrolaza i WRKY48 kodiran faktor transkripcije koji su indukovani posle infekcije ili MAMP terapije. Takođe, na PERONOSPORU OTPORAN (DOWNY MILDEW RESISTANT) 6 gen (DMR6) se aktivira tokom infekcije sa kompatibilnim i nekompatibilinim izolatima na peronosporu otporne Hyaloperonospora arabidopsidis. Inaktivacija DMR6 mutacijom dovodi do male konstitutivne aktivacije gena povezanih sa odbranom i otpornosti na peronosporu H. arabidopsidis.
[0040] DMR6 pripada superfamiliji od 2-oksoglutarat Fe(II) zavisnih oksigenaza (2OG oksigenaze, Pfam domen PF03171). Ova superfamilija obuhvata 151 člana u Arabidopsis-u. Međutim, za većinu ovih proteina, uključujući DMR6, njihova metabolička aktivnost je nepoznata.2OG oksigenaze su poznate po tome što katalizuju podosta reakcija koje uključuju
1
oksidaciju supstrata korišćenjem molekularnog O2. One obično koriste gvožđe kao ko-faktor i zahtevaju 2-oksoglutarat kao kosupstrat za dovod dva elektrona. Opšte obeležje ovih enzima je prisustvo konzervisanog HxD/ExnH motiva smeštenog na beta ravni sa dvostrukim lancem. Zajedno sa četvorolančanim beta ravnima (želatinasti valjkasti prevoj) obuhvata aktivni centar.
2OG oksigenaze su implicirane u sekudarnom metabolizmu i biosintezi signalnih molekula npr. Biosinteza flavonoida,giberelina, i alkaloida.
[0041] U ovom primeru, mi funkcionalno analiziramo Arabidopsis DMR6 oksigenazu i srodne DMR6-SLIČNE OKSIGENAZE (DLO) 1 i 2. Prekomerno eksprimovanje DMR6, DLO1, i DLO2 je povećalo podložnost bolesti uz indikaciju da tri proteina mogu da deluju kao negativni regulator imuniteta. DLO1, ali ne DLO2, je visoko koregulisano sa DMR6, međutim oni se razlikuju u svom prostornom eksprimovanju tokom infekcije peronosporom. Utvrđeno je da je dvostruki mutant dmr6-3_dlo1 potpuno otporan na H. arabidopsidis i pokazao je izrazito smanjen rast povezan sa visokim nivoima salicilne kiseline.
Rezultati
Prekomerno eksprimovanje DMR6 daje kao rezultat pospešenu podložnost (hemi-)biotrofnim patogenima
[0042] Semenke dmr6-1 mutanta su bile prethodno opisane kao otpornije na H. Arabidopsidis, ali ne na P. syringae. Kada su testirane na odraslim dmr6-1 biljkama, međutim, primećena je jaka otpornost na P. syringae DC3000. Takođe odrasle dmr6-1 biljke su bile otpornije na obavezni biotrof H. arabidopsis u poređenju sa semenkama. Pored toga, jaka otpornost na hemibiotrofnu algašicu Phytophthora capsici je bila očigledna kod dmr6-1 biljaka kada je upoređeno sa roditeljskom linijom Ler eds1-2; pri čemu su preživele sve dmr6-1 mutirane biljke, P. capsici je uništio ogromnu većinu biljaka roditeljske linije i komplementirao dmr6-1 mutant. Otpornost dmr6-1 mutanta na različite (hemi-)biotrofe ukazuje da biljke divljeg tipa DMR6 negativno regulišu imunitet na ove patogene.
[0043] Da bi se ovo proučavalo, DMR6 sekvenca kodiranja je ispoljena iz konstitutivnog 35S promotera u transgenskim Col-0 linijama. Linije DMR6 prekomernog eksprimovanja pokazivale su jasan porast podložnosti oboljevanju od H. arabidopsidis i P. syringae. Nivo sporulacije H. arabidopsidis, koji je bio mera infekicije peronosporom, udvostručen je u linijama DMR6-prekomernog eksprimovanja u odnosu na kontrolu. Takođe, razvoj hloroze povezane sa bolešću je bio izraženiji u linijama sa prekomernim eksprimovanjem DMR6 nego kod netransgenskih Col-0 biljaka.
[0044] Povećana podloženost šestonedeljne biljke delovanju P. syringae bakterije je bila takođe jasno vidljiva. Iako je kontrolna linija (Col-0) pokazala relativno nizak nivo hloroze i lezija 3 dana posle imunizacije, linija prekomernog eksprimovanja DMR6 je pokazala simptome ozbiljnije bolesti, tj. više hloroze i više i veće lezije. Povećana podložnost DMR6 prekomernih eksprimatora na P. syringae infekciju potvrđena je ogledima bakterijskog rasta koji su pokazali povećane bakterijske titre 1. i 3. dana posle inokulacije u poređenju sa Col-0 kontrolom. Pored toga, eksprimovanje gena koji su marker odbrane na PR-1, PR-2, PR-5 kod neinficiranog tkiva lista je smanjena za 50 do 80% u liniji prekomernog eksprimovanja DMR6 u poređenju sa divljim tipom Col-0 biljke već imaju veoma nizak nivo eksprimovanja. Smanjeni imunitet linije DMR6 prekomernog eksprimovanja, zajedno da povećanom otpornošću drm6-1 mutanta, jako podržava ulogu DMR6 kao negativnog regulatora imuniteta.
OKSIGENAZE DMR6 i OKSIGENAZE SLIČNE SA DMR6 predstavljaju odvojene grane distinktivne klade za cvetnice (skrivenosemenice)
[0045] Genom Arabidopsis obuhvata više od 1502OG gena oksigenaze od kojih su neki slični DMR6. Da bi se analizirala evoluciona konzervacija DMR6 i srodnih oksigenaza kod cvetnica, filogenetski smo analizirali familiju 2OG oksigenaza koje obuhvataju PF03171 domen Pfam superfamilije 20G-Fe(II) oksigenaza. Iz Arabidopsis thaliana i osamnaest cvetnica, čije su sekvence genoma i modeli proteina bili dostupni u bazi podataka Phytozome (Fitozom) v7.0 (www.Phytozome.net), ukupno 2951 proteina koji obuhvataju PF03171 domen je bilo izabrano korišćenjem algoritma HMMER3. Da bi se filtrirali mali fragmenti proteina i ukonili veoma veliki proteini, uključili smoproteine koji nisu prekoračili 20% dužinske razlike prema DMR6. Pored toga, zadržani su samo proteini koji imaju razliku dužine domena oksidoreduktaze manju od 20% u poređenju sa DMR6. Ovo je kao rezultat dalo odabir 2038 proteina koji ispunjavaju sve kriterijume, uključujući 110 od 151 predviđenih A. thaliana 2OG oksigenaza. Filogenetsko grupisanje je dalo kao rezultat stablo na kom je prikazan veliki broj distinktivnih klada koje predstavljaju različite enzimske aktivnosti. Dobro karakterisane oskigenaze uključuju flavonon-3-hidroksilaze (F3H), 1-aminociklopropan-1-karboksilnu kiselinu (ACC) oksidazu, i antocijanidin sintazu (ANS) koje su prisutne u distinktivnim kladama drugačijim od DMR6 klade. Dve odvojene grane moguće je razlikovati u DMR6 kladi gde svaka obuhvata 2OG oksigenaze iz dikot(iledon)a i monokot(iledon)a što ukazuje na činjenicu da su ove podklade već bile prisutne kod pretka svih cvetnica ili ranije (82% statistički podržana ‘bootstrap’ pouzdanost). Duplikacije gena u DMR6 kladi su česte kod monokot(iledon)a u gornjem delu drveta i kod soje (sojinog zrna) i vinove loze na obe grane DMR6 klade. U nižoj podkladi, dva A. thaliana DMR6 homologa se grupišu zajedno sa dva proteina iz Arahidopsis lyrata nagoveštavajući da su oni rezultat relativno skorije duplikacije gena kod zajedničkog pretka ove dve vrste.
[0046] Ovi A. thaliana proteini su sada naznačeni kao sa DMR6 SLIČNA OKSIGENAZA ili DLO (sa genom At4g10500 koji kodira DLO1 i At4g10490 koji kodira DLO2). Takođe DLO podklada pokazuje jasno odvajanje proteina monokot(iledon)a i dikot(iledon)a što nagoveštava da je taj predak svih cvetnica već posedovao DLO pored DMR6. Grupisanjem blizu DMR6, DLO formira interesantnu grupu koja je potom analizirana detaljnije, s fokusom naA. thaliana DLO1 i DLO2 gene.
Prekomerno eksprimovanje DLO1 i DLO2 dopunjava dmr6 mutant
[0047] DLO bi mogli imati istu biološku aktivnost kao DMR6 i bili su, zbog toga, testirani za komplementaciju dmr6-1 mutanta. U tom smislu, DLO1 i DLO2 su eksprimovani pod konstitutivnim 35S promoterom i preneti u dmr6-1 mutiranu pozadinu. Četiri nezavisne T3 linije, transformisane sa 35S:DLO1 ili 35S:DLO2, su analizirane za njihov nivo ekspresije i 3 linije po konstruktu su izabrane koje su pokazale jasnu ekspresiju transgena. Da bi se proverila komplementarnost, 2 nedelje stare biljke su bile inficirane sa H. arabidopsidis izolatom Cala2 i 5 dana posle inokulacije (dpi) broj spora po mg semenki je ocenjen kao mera podložnosti.
[0048] Zanimljivo, kako je dmr6-1 pokazao jasan otpor, 35S::DLO1 i 35S::DLO2 biljke su bile visoko podložne, slično ili više od Ler eds1-2 koji je roditeljska linija dmr6-1 mutanta. Kako i DLO1 i DLO2 mogu da komplementiraju dmr6-1 mutantni fenotip mi zaključujemo da DLO imaju funkciju sličnu DMR6.
[0049] Pošto prekomerno eksprimovanje DMR6 u Col-0 pozadini daje kao rezultat pospešenu podložnost peronospori i drugim patogenima, mi smo u nastavku ispitivali da li bi prekomerno eksprimovanje DLO1 i DLO2 učinilo i Col-0 podložnijim. Transformanti koji eksprimuju 35S:DLO1 i 35S:DLO2 transgene su bili izabrani i kao kontrole Col-0 sa prekomernim eksprimovanjem DMR6 i visoko podložni Col eds1-2 mutant su uključeni. Ogledi bolesti sa H. arabidopsidis su pokazali da prekomerno eksprimovanje DLO1 i DLO2 jeste pospešilo podložnost u poređenju sa Col-0 roditeljskom linijom kao što je prikazano putem višeg nivoa sporulacije. Primećena pospešena podložnost je bila uporediva sa biljkama sa prekomernim eksprimovanjem DMR6 i Col eds1-2 mutantom. Ovo potvrđuje da DLO1 i DLO2 protein ima aktivnost sličnu ili identičnu sa DMR6 što daje kao rezultat iste fenotipne efekte.
Ekspresija DLO1, ali ne DLO2, je povezana sa imunitetom
[0050] Linije komplementarnost DLO1 i DLO2 i i prekomernog eksprimovanja su sve generisane korišćenjem 35S promotera. Verovatno je, međutim, da ekspresija DLO divljeg tipa jeste visoko regulisana slično ekspresiji DMR6, koja se izrazito aktivira tokom odbrane biljke. Dakle, analizirali smo javno dostupne podatke o ekspresiji gena da bismo odredili da li DLO1 i DLO2 pokazuju ekspresiju povezanu sa imunitetom sličnu DMR6. Za ovu analizu korišćeni su podaci o 9 različitih eksperimenata Affymetrix mikronizova koji se svi bave sa transkripcionim profilisanjem posle napada patogena, primene hormona povezane sa odbranom i terapija sa elisitorom/efektorom.
[0051] Analiza ekspresije je usredsređena na 302OG oksigenaze koje pripadaju velikoj kladi
1
koja obuhvata DLO i DMR6. Hijerarhijsko grupisanje gena je omogućilo grupisanje gena 2OG oksigenaze prema njihovim obrascima ekspresije, i obezbeđuje informaciju o tome koji se geni koregulišu tokom odgovora imunog sistema biljke. Upada u oči to su DLO1 grupacije sa DMR6, pri čemu DLO2 ne pokazuje nikakvu koregulaciju sa DMR6 ili DLO1. DMR6 i DLO1 su oba aktivirana posle infekcije sa preronosporom H. Arabidopsidis, praškastom buđi tzv. pepelnicom Erysiphe orontii, i bakterijom P. syringae a isto tako i posle SA terapije. DLO2 grupacije su dosta udaljene od DMR6 i DLO1 i čini se da ne reaguju na različite eksperimetne. Dalja analiza dostupnih podataka mikroniza korišćenjem Genevestigatora je otkrila da DLO2 nije eksprimovan kao odgovor na bilo koju terapiju ili bilo koje tkivo, izuzev silika, što nameće zaključak da DLO2 nema ulogu u imunitetu vegetativnih tkiva biljke.
[0052] Odgovor DLO na H. arabidopsidis infekciju je bio eksperimentalno verifikovan kvantitativnom PCR (qPCR). DMR6 i DLO1 su visoko aktivni kod biljaka inficiranih sa kompatibilnim ili nekompatibilnm izolatom H. arabidopsidis. Takođe posle terapije sa SA mimic BTH, oba DMR6 i DLO1 su jako aktivirani. Suprotno tome, DMR6 i DLO1 ne reaguju na metil jasmonat (MeJA), za koji se zna da aktivira jasmonskom kiselinom indukovane gene. DLO2 ekspresija je nedektibilna (cT vrednosti više od 35) u različitim eksperimentalnim uslovima koji potvrđuju podatke Genevestigatora. Činjenica da su i DMR6 i DLO1 aktivirani tokom odgovora imunog sistema biljke nagoveštava da listovi DLO1 biljaka divljeg tipa deluju kao negativni regulator odbrane. Međutim, ostaje pitanje zašto dmr6 mutanti imaju tako jasan fenotip otpornosti u prisustvu nedirnutog DLO1 gena koji bi mogao preuzeti DMR6 funkciju?
DLO1 i DMR6 pokazuju različitu prostornu ekspresiju u inficiranim listovima
[0053] Da bi se analizirala ekspresija specifična za tkivo DLO1 tokom infekcije peronoporom, generisali smo transgenske linije koje obuhvataju konstrukt sa DLO1 promoterom fuzionisan na GUS reporter gen (proDLO1:GUS). Pošto nismo primetili nikakvu ekspresiju DLO2, nikakva GUS fuzija sa promoterom DLO2 nije konstruisana. Posle H. arabidopsidis infekcije, DMR6 prostorna ekspresija je bila specifično detektovana na mestima koja su u direktnom kontaktu sa patogenom kao što je prethodno opisano. Nasuprot tome, DLO1 ekspresija nije indukovana u ćelijama koje su u bliskom kontaktu sa patogenom već samo u ili oko glavnih vena inficiranih kotiledona i listova. Interesantno, DLO1 ekspresija je primećena samo u oblastima lista koje su blizu mesta H. arabidopsidis infekcije, što ukazuje na to da aktivacija DLO1 zavisi od prisustva patogena. Odsustvo DLO1 aktivnosti u ćelijama koje sadrže haustoriju bi moglo objasniti zašto DLO1 ne može u potpunosti da bude komplement za gubitak DMR6 aktivnosti kod dmr6 mutanata. Pri čemu ovi podaci pokazuju distinktivne aktivnosti DMR6 i DLO1 gena, nivo redundantnosti ovih gena je nejasan i samim tim je dodatno proučavan genetski.
DLO1 funkcije delimično redundantna sa DMR6
[0054] Analiza redundantnosti u mutiranim linijama je najbolje izvedena u istoj genetskoj pozadini. Mi smo, dakle, dobili mutante u Col-0 pozadini za DMR6 (GABI-KAT linija GK-249H03.01, naznačeni mutant dmr6-3) i DLO1 (SALK linija 059907, naime dlo1). dmr6-3_dlo1 dvostruki mutanti su generisani i fenotipično analizirani zajedno sa dmr6-3 i dlo1 pojedinačnim mutantima, kao i sa roditeljskom Col-0 linijom. Nivo podložnosti H. arabidopsidis Waco9 je izrazito smanjen u dmr6-3 mutantu, ali samo blago smanjen u dlo1 mutantu. Kombinovanje dve mutacije u dmr6-3_dlo1 dvostrukom mutantu je dalo kao rezultat biljke koje su pokazale potpunu otpornost na H. arabidopsidis.
[0055] U nastavku smo testirali nivo ekspresije gena povezanog sa odbranom u mutantima, kao što je prethodno istraživanje na dmr6-1 i dmr6-2 mutantima pokazalo povećane nivoe ekspresije PR-1 i drugih gena odbrane. Takođe dmr6-3 mutant je pokazao povišenu ekspresiju PR-1, PR-2 i PR-5, potvrđujući prethodne rezultate. Jedino dlo1 mutant nije pokazao značajno uvođenje ekspresije tri PR gena.
[0056] Nasuprot tome, dmr6-3_dlo1 dvostruki mutant je pokazao izuzetno visoke nivoe ekspresije gena povezanog sa odbranom. PR-1 transkripata je bilo više od 30.000 puta više kod više dmr6-3_dlo1 mutanata nego kod Col-0, i više od 100-struko viši nego kod dmr6-3 pojedinačnog mutanta. U testiranim mutantima bila je jasna međusobna veza između nivoa otpornosti na peronosporu i povećanje otpornosti u ekspresiji gena povezanog sa odbranom, što nagoveštava da je otpornost prouzrokovana aktivacijom odgovora imunog sistema biljke. Naši podaci pokazuju da dlo1 mutacija povećava imunitet dmr6-3 pojedinačnog mutanta, što ukazuje da DLO1 i DMR6 deluju delimično redundantno.
[0057] Ovo je bilo dodatno potvrđeno fenotipom rasta tih mutanata. Biljke su rasle tokom 5,5 nedelja pod kratkotrajnim dnevnim uslovima su pokazali značajne razlike između genotipova. Kako dlo1 mutant raste slično Col-0, i dmr6-3 mutant samo pokazuje blago smanjenje rasta, dmr6-3_dlo1 dvostruki mutant je pokazao jako smanjenje rasta što je dalo kao rezultat patuljaste biljke. Smanjenje rasta i nivo otpornosti na peronosporu se dovode u vezu u testiranim mutantima, nagoveštavajući da su ova dva fenotipa funkcionalno povezani.
[0058] Poznato je da jaku aktivaciju imuniteta biljke može da prati ozbiljno smanjenje rasta, što u mnogim slučajevima može da se poveže sa visokim nivoima SA. Takođe, nivoi SA su bili više od 200 puta viši u dmr6-3_dlo1 dvostrukom mutantu nego kod Col-0 kontrole, i ~20 puta viši nego kod dmr6-3 mutanta. Pojedinačni mutant dmr6-3 je pokazao umereno ~10 struko povećanje kod SA u poređenju sa Col-0 kontrolom, pri čemu dlo1 mutant nije akumulirao više SA od Col-0.
[0059] Da bi se testiralo da li SA nivo kod dmr6-3_dlo1 jeste uzrok patuljastog fenotipa i visokog nivoa otpornosti na peronosporu, dvostruki mutant je ukršten na sid2 mutant, koji je izrazito kompromitovan u SA biosintezi kao rezultat gubitka izohorizmat sintaze 1. Trostruki mutant
1
dmr6-3_dlo1_sid2 je pokazao skoro potpun oporavak rasta fenotipa dmr6-3_dlo1 dvostrukog mutanta, iako je ostao nešto malo manji od sid2 mutanta. Ogledi sa bolešću su pokazali i visok nivo otpornosti dmr6-3_dlo1 dvostrukog mutanta i dmr6-3 jednostrukog mutanta je bio jako smanjen u odsustvu SID2. Zbog niskog SA nivoa, sid2 mutant je podložniji H. arabidopsidis nego Col-0 divljeg tipa. Nivo podložnosti H. arabidopsidis se dovodi u vezu sa nivoom ukupnog SA kod mutanata. Oba, i dmr6 kao i dmr6-3_dlo1 dvostruki mutant, ne pokazuju sporulaciju na 5 dpi i imaju najviše SA nivoe. Trostruki mutant dmr6-3_dlo1_sid2 i dalje proizvodi više SA nego Col-0, što bi moglo da objasni njegovu nižu podložnost peronospori.
[0060] Zaključeno je da je ne samo otpornost na H. arabidopsidis, kao i smanjenje rasta dmr6-3_dlo1 mutanta rezultat povećanih SA nivoa. Ekstremni fenotipovi dostrukog mutanta pokazuju da DLO1 i DMR6 geni deluju redundantno. Međutim, dmr6 pojedinačni mutant je otporniji na peronosporu nego dlo1 mutant. Zajedno sa primećenom različitom lokalizacijom ekspresije DMR6 i DLO1 gena, ovi podaci ukazuju da DMR6 i DLO1 geni imaju distinktivne ali delimično redundantne funkcije kao negativni regulatori imuniteta biljke.
1
1
1
1
�
2
2
2
2
2
2
1
2
4
4

Claims (1)

Patentni zahtev
1. Biljka koja pripada familiji Solanaceae pri čemu pomenuta biljka obuhvata genetsku karakteristiku koja obezbeđuje otpornost na Phytophthora i pri čemu je pomenuta genetska karakteristika koja obezbeđuje otpornost na Phytophthora kodirana kombinacijom najmanje dva gena koji imaju smanjenu ekspresiju ili transkripciju pomenuta dva gena u poređenju sa pomenutom biljkom koja pripada familiji Solanaceae koja je podložna Phytophthora pri čemu: Pomenuta biljka je slatka paprika (Capsicum annuum) ili Capsicum spp., pri čemu pomenuta otpornost na Phytophthora jeste otpornost na Phytophthora capsici i pomenuta kombinacija najmanje dva gena su geni koji kodiraju proteine prema SEK ID Br.16 i SEK ID Br.17, ili proteini koji imaju identičnost sekvence od najmanje 90% sa SEK ID Br.16 i 17.
Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5
RS20211129A 2014-06-18 2015-06-18 Biljke otporne na fitoftoru koje pripadaju familiji solanaceae RS62325B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP2014062802 2014-06-18
PCT/EP2015/063682 WO2015193418A1 (en) 2014-06-18 2015-06-18 Phytophthora resistant plants belonging to the solanaceae family
EP15734588.5A EP3167051B1 (en) 2014-06-18 2015-06-18 Phytophthora resistant plants belonging to the solanaceae family

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62325B1 true RS62325B1 (sr) 2021-10-29

Family

ID=53524732

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20211129A RS62325B1 (sr) 2014-06-18 2015-06-18 Biljke otporne na fitoftoru koje pripadaju familiji solanaceae

Country Status (9)

Country Link
US (2) US20170314039A1 (sr)
EP (1) EP3167051B1 (sr)
JP (1) JP6675332B2 (sr)
CN (1) CN106573963B (sr)
ES (1) ES2886551T3 (sr)
HU (1) HUE055977T2 (sr)
PL (1) PL3167051T3 (sr)
RS (1) RS62325B1 (sr)
WO (1) WO2015193418A1 (sr)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11685926B2 (en) 2007-02-01 2023-06-27 Enza Zaden Beheer B.V. Disease resistant onion plants
US10787673B2 (en) 2007-02-01 2020-09-29 Enza Zaden Beheer B.V. Disease resistant Brassica plants
WO2008092505A1 (en) 2007-02-01 2008-08-07 Enza Zaden Beheer B.V. Disease resistant plants
US10501754B2 (en) 2007-02-01 2019-12-10 Enza Zaden Beheer B.V. Disease resistant potato plants
RU2672335C2 (ru) 2013-07-22 2018-11-13 Шьенца Байотекнолоджис 5 Б.В. Гены, обеспечивающие устойчивость подсолнечника к ложной мучнистой росе
US12173302B2 (en) 2014-01-14 2024-12-24 Enza Zaden Beheer B.V. Disease resistant petunia plants
RS62325B1 (sr) 2014-06-18 2021-10-29 Enza Zaden Beheer Bv Biljke otporne na fitoftoru koje pripadaju familiji solanaceae
EP3257944A1 (en) 2016-06-14 2017-12-20 Nunhems B.V. Tomato plants having alterations in the dmr6 gene
WO2019174721A1 (en) * 2018-03-13 2019-09-19 Dümmen Group B.V. Tobamovirus resistant solanaceae plant
WO2020074237A1 (en) 2018-10-11 2020-04-16 Nunhems B.V. Downy mildew resistant lettuce mutant
CN112725351B (zh) * 2021-03-23 2022-11-11 上海师范大学 基因OsWRKY43在水稻抗白叶枯病中的应用
CN113881802B (zh) * 2021-11-08 2022-05-06 北京市农林科学院 与控制辣椒果实Vc含量基因连锁的SNP分子标记KQ8-3918及应用和专用引物
CN115725643B (zh) * 2022-10-19 2023-08-15 河南农业大学 NtMYB35转录因子在烟草抗黑胫病中的应用
CN119307510B (zh) * 2024-11-01 2025-12-02 河南省纳普生物技术有限公司 植物免疫调控相关的cua基因与其直系同源基因及其在抗病分子育种中的应用

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL9000773A (nl) 1990-04-02 1991-11-01 Rijkslandbouwhogeschool Werkwijze voor het beschermen van planten tegen pathogenen.
US6100451A (en) 1995-05-18 2000-08-08 Board Of Trustees Of The University Of Kentucky Pathogen-inducible regulatory element
ATE412008T1 (de) 1996-07-29 2008-11-15 Plant Bioscience Ltd Polynukleotid und seine verwendung zur modulation der abwehr-reaktion in pflanzen
EP1006780A4 (en) 1997-01-24 2005-03-09 Dna Plant Techn Corp PROCESS AND 2-COMPONENT COMPOSITIONS THAT INTRODUCE THE LETALITY OF PLANT CELLS
US6271439B1 (en) 1998-03-04 2001-08-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for regulating cell death and enhancing disease resistance to plant pathogens
EP1033405A3 (en) 1999-02-25 2001-08-01 Ceres Incorporated Sequence-determined DNA fragments and corresponding polypeptides encoded thereby
US20040031072A1 (en) 1999-05-06 2004-02-12 La Rosa Thomas J. Soy nucleic acid molecules and other molecules associated with transcription plants and uses thereof for plant improvement
IL130014A0 (en) 1999-05-18 2000-02-29 Yeda Res & Dev Genetically modified plants having modified amino acid content
DE19927575A1 (de) 1999-06-17 2000-12-21 Basf Ag Verfahren zur Erhöhung der Widerstandskraft von Kulturpflanzen gegen phytopathogene Pilze und Bakterien mit Hilfe molekulargenetischer Methoden
WO2001055347A1 (en) 2000-01-26 2001-08-02 Cornell Research Foundation, Inc. Oomycete-resistant transgenic plants by virtue of pathogen-induced expression of a heterologous hypersensitive response elicitor
IL134580A0 (en) 2000-02-16 2001-04-30 Univ Bar Ilan Nucleic acid sequences and different uses thereof
EP1356065A2 (en) 2000-11-03 2003-10-29 Monsanto Technology LLC Method of imparting disease resistance to plants by reducing polyphenol oxidase activity
US7323338B2 (en) 2001-05-02 2008-01-29 Gavish-Galilee Bio Applications Ltd. Plants characterized by an increased content of methionine and related metabolites, methods of generating same and uses thereof
WO2003000906A2 (en) 2001-06-22 2003-01-03 Syngenta Participations Ag Plant disease resistance genes
US7700834B2 (en) 2001-11-13 2010-04-20 U.S. Smokless Tobacco Company Nicotiana nucleic acid molecules and uses thereof
US7750211B2 (en) 2002-09-10 2010-07-06 The Samuel Roberts Noble Foundation Methods and compositions for production of flavonoid and isoflavonoid nutraceuticals
US20060143729A1 (en) 2004-06-30 2006-06-29 Ceres, Inc. Nucleotide sequences and polypeptides encoded thereby useful for modifying plant characteristics
US20060048240A1 (en) 2004-04-01 2006-03-02 Nickolai Alexandrov Sequence-determined DNA fragments and corresponding polypeptides encoded thereby
CA2579927A1 (en) 2004-09-24 2006-03-30 Basf Plant Science Gmbh Plant cells and plants with increased tolerance to environmental stress
JP2008517604A (ja) 2004-10-21 2008-05-29 ヴェンガンザ インコーポレイテッド 植物の害虫および病原体に対する耐性を付与するための方法および物質
WO2006047358A1 (en) 2004-10-22 2006-05-04 Agrinomics Llc Generation of plants with altered oil content
WO2007051483A1 (en) 2005-11-01 2007-05-10 Universiteit Utrecht Holding B.V. Disease resistant plants
US10787673B2 (en) 2007-02-01 2020-09-29 Enza Zaden Beheer B.V. Disease resistant Brassica plants
US11685926B2 (en) 2007-02-01 2023-06-27 Enza Zaden Beheer B.V. Disease resistant onion plants
US10501754B2 (en) 2007-02-01 2019-12-10 Enza Zaden Beheer B.V. Disease resistant potato plants
WO2008092505A1 (en) 2007-02-01 2008-08-07 Enza Zaden Beheer B.V. Disease resistant plants
DK2455473T4 (da) * 2007-02-01 2021-11-08 Enza Zaden Beheer Bv Sygdomsresistente planter
DK2840142T3 (en) 2007-06-06 2019-03-18 Monsanto Technology Llc Genes and uses for plant improvement
WO2009009142A2 (en) 2007-07-10 2009-01-15 Monsanto Technology, Llc Transgenic plants with enhanced agronomic traits
US8138398B2 (en) * 2008-02-14 2012-03-20 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Sweet pepper hybrid 9942815
CA2780707A1 (en) 2009-11-17 2011-05-26 Basf Plant Science Company Gmbh Plants with increased yield
CA2804412A1 (en) * 2010-07-07 2012-01-12 Her Majesty The Queen In Right Of The Province Of Nova Scotia, As Represented By The Nova Scotia Agricultural College (Nsac) On Behalf Of The Minister Of Agriculture Proteins related to the suppression of phytophthora infections in members of the solanaceae family
US10323256B2 (en) 2011-12-09 2019-06-18 Ceres, Inc. Transgenic plants having altered biomass composition
RU2672335C2 (ru) 2013-07-22 2018-11-13 Шьенца Байотекнолоджис 5 Б.В. Гены, обеспечивающие устойчивость подсолнечника к ложной мучнистой росе
US9873889B2 (en) 2013-08-02 2018-01-23 Cornell University Increasing leaf longevity and disease resistance by altering salicylic acid catabolism
MX361557B (es) * 2013-08-27 2018-12-10 Evogene Ltd Polinucleotidos y polipetidos aislados, y metodos para utilizarlos para mejorar el rendimiento y/o caracteristicas agricolas de la planta.
CN106029876A (zh) * 2014-01-14 2016-10-12 安莎种子公司 属于茄科的疫霉属抗性植物
RS62325B1 (sr) 2014-06-18 2021-10-29 Enza Zaden Beheer Bv Biljke otporne na fitoftoru koje pripadaju familiji solanaceae
EP3280442A4 (en) 2015-04-08 2018-10-31 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody therapeutics that bind cd123
US20210071195A1 (en) 2017-08-29 2021-03-11 Scienza Biotechnologies 3 B.V. Soybean plants resistant to phytophthora sojae

Also Published As

Publication number Publication date
CN106573963A (zh) 2017-04-19
JP6675332B2 (ja) 2020-04-01
CN106573963B (zh) 2021-07-20
JP2017518067A (ja) 2017-07-06
US20200332313A1 (en) 2020-10-22
PL3167051T3 (pl) 2021-12-06
HUE055977T2 (hu) 2022-02-28
ES2886551T3 (es) 2021-12-20
WO2015193418A8 (en) 2017-03-23
EP3167051B1 (en) 2021-08-04
US20170314039A1 (en) 2017-11-02
WO2015193418A1 (en) 2015-12-23
EP3167051A1 (en) 2017-05-17
US11299746B2 (en) 2022-04-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3167051B1 (en) Phytophthora resistant plants belonging to the solanaceae family
EP2465933B1 (en) Disease-inducible promoters
CN109777810B (zh) Pub41基因作为负调控因子在提高番茄灰霉病和青枯病抗性中的应用
Shah et al. Genetic improvement of tomato (Solanum lycopersicum) with ATDREB1A gene for cold stress tolerance using optimized Agrobacterium-mediated transformation system.
EP3094722B1 (en) Phytophthora resistant plants belonging to the solanaceae family
AU2016399130B2 (en) Application of herbicide-tolerant protein
US20180066275A1 (en) Herbicide-resistant protein, encoding gene and use thereof
AU2016218740B2 (en) Herbicide resistance protein, and encoding genes and application thereof
US11242537B2 (en) Method for improving sensitivity of plant to gibberellin inhibitor and use thereof
US20070028332A1 (en) Gene capable of imparting salt stress resistance
CN103243110A (zh) 抗稻瘟病菌的水稻基因OsWRKY19及其应用
CN106906228B (zh) 能显著提高棉花抗病性的GhLMM基因及其应用
CN116103322B (zh) 一种增强植物抵御灰霉菌侵染的功能基因及应用
CN117947051B (zh) 一种马铃薯StCuRG1基因、生物材料及过表达StCuRG1基因的应用
Carlson Advancement of Blight Tolerance Biotechnology in Chestnut and a Tissue Culture-Free Method for the Genetic Transformation and Regeneration of Populus
HK1234757A1 (en) Phytophthora resistant plants belonging to the solanaceae family
CN103173439B (zh) 与百草枯抗性相关rna及其对应的蛋白、编码基因与应用
CN117925684A (zh) 水稻抗逆性相关蛋白gnp3及其编码基因与应用
CN113403321A (zh) OsAKR4C10在创建非转基因草甘膦抗性水稻种质资源中的应用
Mazlin Over-Expression of Two Putative Disease Resistant Genes NBS-Type RGC and WRKY Against Fusarium Oxysporum F. Sp. Cubense in Plants
HANDA et al. Date of Submission of the report: May 27, 2004 BARD Project Number: US-3132-99 Project Title: Enhancing Quality Attributes Of Potato And Tomato By Modifying And Controlling Their Oxidative Stress Outcome Investigators Institutions
JP2006006122A (ja) エタノール耐性遺伝子を用いる形質転換植物の選抜方法及びそのための形質転換用ベクター