CN106573963A - 疫霉属抗性的属于茄科的植物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及属于茄科(Solanaceae)的植物，其中所述植物包含提供疫霉属(Phytophthora)抗性的遗传性状，并且其中所述抗性性状由至少两种基因的组合编码，所述植物与对疫霉属易感的属于茄科的所述植物相比，具有所述基因的降低的表达或转录或由所述基因编码的蛋白的降低的活性。本发明特别地涉及选自由以下组成的组属于茄科的植物：甜椒(Capsicum annuum)、辣椒属物种(Capsicum spp.)、马铃薯(Solanum tuberosum)、碧冬茄属(Petunia)、番茄(Solanum lycopersicum)、本氏烟(Nicotiana benthamiana)、和烟草(Nicotiana tabacum)。且本发明的疫霉属抗性特别地为对选自由以下组成的组的植物病原体的抗性：疫霉属物种(Phytophthora spp.)、辣椒疫霉(Phytophthora capsici)、致病疫霉(Phytophthora infestans)和烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)。

Description

疫霉属抗性的属于茄科的植物
说明
本发明涉及疫霉属(Phytophthora)抗性的属于茄科(Solanaceae)的植物，其中所述抗性由两个单独的基因的组合编码。本发明还涉及这些基因用于提供属于茄科的疫霉属抗性的植物的用途和由本发明基因编码的蛋白。
植物病原体疫霉属(纲：卵菌纲(Oomycetes)，目：霜霉目(Peronosporales)，科：腐霉科(Pythiaceae))为能够对全世界作物造成巨大经济损失以及对自然生态系统造成环境损害的植物损害性卵菌的属(水霉菌(water molds))。疫霉属病原体主要是双子叶植物的病原体，且通常是宿主特异性寄生物。该属于1875年由Heinrich Anton de Bary首次描述。已描述了约100个种(species)，其中经济上重要的植物病原体如辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)、致病疫霉(Phytophthora infestans)和烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)。
致病疫霉为导致爱尔兰大饥荒(the Great Irish Famine)(1845-1849)的马铃薯疫病(potato blight)的感染原(infective agent)，并且仍然是茄科作物包括番茄和马铃薯的最具破坏性的病原体。大豆根和茎腐病病原体大豆疫霉(Phytophthora sojae)也对农业产业造成长期存在的问题。通常，由该属导致的植物病害难以化学控制，且因此抗性品种的种植为主要的管理策略。其他重要的疫霉属病为：
恶疫霉(Phytophthora cactorum)—导致影响杜鹃花属(rhododendrons)，杜鹃花(azaleas)的杜鹃花属根腐病(rhododendron root rot)，并且导致阔叶树(hardwoodtrees)的伤流溃疡病；辣椒疫霉(Phytophthora capsici)—感染葫芦科(Cucurbitaceae)果实，诸如黄瓜和南瓜；樟疫霉(Phytophthora cinnamomi)—导致影响木本观赏植物包括侧柏(arborvitae)和杜鹃花的樟属根腐病(cinnamon root rot)；草莓疫莓(Phytophthorafragariae)—导致影响草莓的红根腐病(red root rot)；Phytophthora kernoviae—榉木和杜鹃花属的病原体，也发生在其他树木和灌木包括栎树(oak)和圣栎上；Phytophthoramegakarya—一种可可黑荚病物种，是侵入性的，并且可能是造成非洲最大可可作物损失的原因；棕榈疫霉(Phytophthora palmivora)—导致椰子和槟榔果腐病；Phytophthoraramorum、栎疫霉(Phytophthora quercina)—导致栎树死亡；以及大豆疫霉(Phytophthorasojae)—导致大豆根腐病。
疫霉属有时被称为真菌样生物体，但它被归类在不同的界下：囊泡藻界(Chromalveolata)(原来为茸鞭生物界(Stramenopila)且先前为藻菌界(Chromista))。疫霉属在形态上非常相似于“真正的”真菌，但其进化历史是截然不同的。与真菌相比，囊泡藻界比起动物与植物更紧密相关。然而，真菌细胞壁主要由几丁质构成，囊泡藻界细胞壁主要由纤维素构成。这两组之间的倍性水平不同；疫霉属在生命期的营养(生长，非生殖)阶段具有二倍体(配对)染色体，真菌在该阶段几乎总是单倍体。生物化学途径也不同，特别是高度保守方面。
疫霉属可有性地或无性地产生。在许多物种中，性结构从未被观察到，或仅在实验室交配中被观察到。在同宗配合物种中，性结构在单一培养物中发生。异宗配合物种具有交配株，命名为A1和A2。当交配时，通过藏卵器穿过精子器(amphigyny)，或通过精子器附连至藏卵器的近端(下部)部分(the proximal(lower)half of the oogonium)(侧殖(paragyny))，精子器将配子引入到藏卵器中，并结合产生卵孢子。像动物，但不像大部分“真正的”真菌，减数分裂为配子的，且体细胞核是二倍体。无性(有丝分裂)孢子类型为厚壁孢子，且孢子囊产生游动孢子。厚壁孢子通常为球形和有颜色的，并且可具有增厚的细胞壁以辅助其作为存活结构的作用。孢子囊可由苞菌丝(subtending hyphae)保留(非早落的)或作为传播结构通过风或水张力容易地脱落(早落的)。此外，孢子囊可释放游动孢子，游动孢子具有两种不相似的鞭毛，游动孢子使用鞭毛以游向宿主植物。
茄科植物(Solanaceae或nightshades)，为经济上重要的开花植物科。该科范围从草本植物到乔木，并包括许多重要的农作物、药用植物、香料、野草和观赏植物。该科许多成员包含强生物碱，且有些为高毒性的。
茄科属于菊类植物群(asterid group)双子叶植物(木兰纲(Magnoliopsida))中的茄目(Solanales)。茄科由约98个属和约2,700个种组成，具有多种多样的生境、形态学和生态学。
该科具有全球性分布，存在于除了南极大陆以外的所有大陆上。在南美洲和中美洲发现了物种的最大多样性。茄科包括许多通常收集或栽培的物种。也许该科的经济上最重要的属为茄属植物(Solanum)，其包括马铃薯(Solanum tuberosum，事实上，该科的另一个通用名为“马铃薯科(potato family)”)、番茄(Solanum lycopersicum))和茄子(aubergine)或茄子(eggplant)(Solanum melongena)。另一个重要的属为辣椒属(Capsicum)，包括辣椒(pepper)和甜椒(sweet pepper)或灯笼椒(bell pepper)(Capsicumannuum)。
酸浆属(Physalis)产生所谓的地樱桃(groundcherry)，以及树蕃茄(tomatillo)(毛酸浆(Physalis philadelphica))、灯笼果(Cape gooseberry)及菇茑(Chineselantern)。枸杞属(Lycium)包含枸杞(boxthorn)和枸杞(wolfberry)Lycium barbarum。除其他物种以外，烟草属(Nicotiana)包含烟草植物。茄科的一些其他重要成员包括许多观赏植物，诸如碧冬茄属(Petunia)、布洛华丽茄属(Browallia)和红丝线属(Lycianthes)，精神活性生物碱的来源，曼陀罗属(Datura)、茄参属(Mandragora)(曼德拉草(mandrake))和颠茄(Atropa belladonna)(致命的茄科植物)。某些物种因其药物用途、其精神药物效应(psychotropic effects)或是有毒的而广为人知。
除了烟草(烟草亚科(Nicotianoideae))和碧冬茄属(Petunia)(矮牵牛亚科(Petunioideae))以外，大部分经济上重要的属包含在茄亚科(Solanoideae)中。最后，但不是不重要地，茄科包括在细胞、分子和遗传水平的基本生物学问题的研究中是重要的许多模式生物体，诸如烟草、碧冬茄属(Petunia)和本氏烟(N.benthaminia)。
考虑到茄科的许多植物成员的经济重要性和植物病原体疫霉属对该科的许多成员的破坏效应，除其他目的以外，本发明的目的是提供疫霉属抗性植物。
除其他目的以外，以上目的由本发明通过提供如在所附权利要求中概述的植物来实现。
特别地，除其他目的以外，本发明的以上目的根据第一方面通过属于茄科的植物来实现，其中本发明植物包含提供疫霉属抗性的遗传性状，并且其中本发明的抗性性状由至少两种基因的组合编码，本发明植物与属于对疫霉属易感的茄科的相同植物相比，具有本发明基因的降低的表达或降低的转录或由本发明基因编码的蛋白的降低的活性。
根据本发明的该第一方面的一个优选的实施方案，本发明的属于茄科的植物选自由以下组成的组：马铃薯、碧冬茄属(Petunia)、番茄、茄子(aubergine)、茄子(eggplant)、烟草和甜椒，更优选地马铃薯、碧冬茄属(Petunia)、番茄、甜椒和烟草。
根据本发明的该第一方面的另一个优选的实施方案，本发明的疫霉属抗性为对选自由以下组成的组的植物病原体的抗性：疫霉属物种(Phytophthora spp.)、辣椒疫霉、致病疫霉和烟草疫霉。
根据该第一方面的一个特别优选的实施方案，本发明涉及马铃薯，本发明的疫霉属抗性为对致病疫霉的抗性，并且本发明的至少两种基因的组合为编码根据SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的蛋白的基因或者编码与SEQ ID No.1和SEQ ID No.2具有至少80％、85％或90％序列同一性，诸如91％、92％、93％和94％序列同一性，优选地至少95％序列同一性，诸如96％、97％、98％和99％序列同一性的蛋白的基因。
根据该第一方面的另一个特别优选的实施方案，本发明涉及碧冬茄属(Petunia)，本发明的疫霉属抗性为对烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)的抗性，并且本发明的至少两种基因的组合为编码根据SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的蛋白的基因或者编码与SEQID No.3和SEQ ID No.4具有至少80％、85％或90％序列同一性，诸如91％、92％、93％和94％序列同一性，优选地至少95％序列同一性，诸如96％、97％、98％和99％序列同一性的蛋白的基因。
根据该第一方面的另一个特别优选的实施方案，本发明涉及番茄，本发明的疫霉属抗性为对致病疫霉的抗性，并且本发明的至少两种基因的组合为编码根据SEQ ID No.5和SEQ ID No.6的蛋白的基因或者编码与SEQ ID No.5和SEQ ID No.6具有至少80％、85％或90％序列同一性，诸如91％、92％、93％和94％序列同一性，优选地至少95％序列同一性，诸如96％、97％、98％和99％序列同一性的蛋白的基因。
根据该第一方面的另一个特别优选的实施方案，本发明涉及甜椒(Capsicumannuum)或辣椒属物种(Capsicum spp.)，疫霉属抗性为对辣椒疫霉的抗性，并且至少两种基因的组合为编码根据SEQ ID No.16和SEQ ID No.17的蛋白的基因或者编码与SEQ IDNo.16和/或SEQ ID No.17具有至少90％序列同一性，优选地至少95％序列同一性，最优选地至少99％序列同一性的蛋白的基因。
根据该第一方面的另一个特别优选的实施方案，本发明涉及本氏烟(Nicotianabenthamiana)，疫霉属抗性为对辣椒疫霉、致病疫霉或烟草疫霉(Phytophthoranicotinanae)或其组合的抗性，并且所述至少两种基因的组合为编码根据SEQ ID No.18的蛋白的基因或者编码与SEQ ID No.18具有至少70％序列同一性，优选地至少85％序列同一性，最优选地至少95％序列同一性的蛋白的基因。
根据该第一方面的另一个特别优选的实施方案，本发明涉及烟草(Nicotianatabacum)，疫霉属抗性为对辣椒疫霉和/或致病疫霉和/或烟草疫霉(Phytophthoranicotianae)的抗性，并且至少两种基因的组合为编码根据SEQ ID No.19的蛋白和与SEQID No.19具有至少70％序列同一性，优选地至少85％序列同一性，最优选地至少95％序列同一性的蛋白的基因。
根据该第一方面的又另一个特别优选的实施方案，本发明涉及属于茄科的植物，其中本发明植物包含提供疫霉属抗性的遗传性状，其中本发明的抗性性状是通过在疫霉属易感植物中下调两种基因的组合的活性或降低由本发明的基因编码的蛋白的活性可获得的，其中本发明的两种基因编码以下的组合：SEQ ID No.1和2或SEQ ID No.3和4或SEQ IDNo.5和6或与其具有至少80％、85％或90％序列同一性，诸如91％、92％、93％和94％序列同一性，优选地至少95％序列同一性，诸如96％、97％、98％和99％序列同一性的蛋白。
根据另外优选的实施方案，本发明的属于茄科的植物选自由以下组成的组：马铃薯、碧冬茄属(Petunia)和番茄。
鉴于本发明的基因用于提供疫霉属抗性植物的有利特性，根据第二方面，本发明涉及两种基因的组合用于在属于茄科的植物中提供疫霉属抗性的用途，其中所述两种基因的组合编码选自由以下组成的组的蛋白组合：SEQ ID No.1和2；SEQ ID No.3和4；SEQ IDNo.5和6；SEQ ID No.16和17；SEQ ID No.18和与SEQ ID No.18具有至少70％序列同一性，优选地至少85％序列同一性，最优选地至少95％序列同一性的蛋白；以及SEQ ID No.19和与SEQ ID No.19具有至少70％序列同一性，优选地至少85％序列同一性，最优选地至少95％序列同一性的蛋白。
根据本发明，本发明的抗性优选地为针对选自由以下组成的组的植物病原体的抗性：疫霉属物种、辣椒疫霉、致病疫霉和烟草疫霉。
根据另外优选的实施方案，本发明用于在属于茄科的植物中提供疫霉属抗性的用途，包括与对疫霉属易感的属于茄科的植物相比，本发明的基因的降低表达或降低转录或由本发明的基因编码的蛋白的降低活性。
根据该第二方面的另外优选的实施方案，本发明的属于茄科的植物选自由以下组成的组：甜椒(Capsicum annuum)、辣椒属物种(Capsicum spp.)、马铃薯(Solanumtuberosum)、碧冬茄属(Petunia)、番茄(Solanum lycopersicum)、本氏烟、和烟草(Nicotiana tabacum)。
鉴于本发明蛋白和基因提供疫霉属抗性的特性，根据第三方面，本发明涉及适合于对植物提供疫霉属抗性的蛋白和基因。特别地，根据该第三方面，本发明涉及选自由以下组成的组的蛋白：SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、16、17、18和19以及与其具有至少90％序列同一性，优选地至少95％，最优选地至少99％序列同一性的蛋白。
在下文实施例中，将参考附图进一步说明本发明，其中：
图1示出了在用致病疫霉感染之后对照马铃薯植株的分离的叶片测定，其中所有叶片都被致病疫霉感染。
图2示出了在用致病疫霉感染之后SEQ ID NO.7&8沉默的马铃薯植株的分离的叶片测定，其中每片叶片来自独立的植株。图2a示出了来自用沉默SEQ ID NO.7&8两者的中间构建体沉默的植株的叶片。图2b示出了来自嵌合沉默植株的叶片。
图3示出了被致病疫霉感染的植株的百分比，其中第一个条显示对照组(约10％被部分感染)，第二个条显示仅SEQ ID NO 7被沉默的植株(约10％被部分感染)，第三个条显示SEQ ID NO 7和8两者在各自序列的中间部分被沉默的植株(约50％干净的)，第四个条显示SEQ ID NO 7和8两者在5’末端被沉默的植株(约40％干净的)。
图4示出了用烟草疫霉接种之后存活碧冬茄属(Petunia)植株的百分比，其中第一个条显示野生型对照植株(0％存活)，第二个条显示SEQ ID NO 9突变体(20％存活植株)，第三个条显示SEQ ID NO 10突变体(20％存活植株)，且第四个条显示双突变体，即SEQ IDNO 9和10两者(45％存活植株)。
图5示出了来自致病疫霉病测试的番茄植株的叶片。
实施例
实施例1(马铃薯)
靶向马铃薯SEQ ID NO.7和8的RNAi构建体
制备了3种不同的RNAi构建体，其携带/靶向：
1.SEQ ID NO 7的5’末端：相当于编码序列-159-200
(距离起始的-159意指在5’utr)。
2.SEQ ID NO.7和8的5’末端的嵌合体：相当于编码序列4-199+1-204。
3.SEQ ID NO.7的中间部分(与SEQ ID NO 8的中部高度同源)：相当于编码序列334-743。
将片段从基因组DNA扩增并克隆到pENTR-D-TOPO载体中。对于嵌合构建体，将2个片段使用具有互补突出端的引物偶联，并随后延伸和扩增以产生融合片段。将片段使用Gateway LR反应转移至RNAi载体pK7GWiWG2(Karimi等，2002,Trends Plant Sci 7)，创建具有发夹结构的反向重复序列。由于pK7GWiWG2载体需要用于细菌选择的链霉素，且用于马铃薯转化的农杆菌菌株(LBA4404)已携带了链霉素选择标志物，将完整的RNAi(发夹)盒转移至不同的植物转化载体，pGreen0029(细菌以及植物选择标志物＝卡那霉素)(Hellens等，2000,Plant Mol Biol 42)。最终的构建体允许35S-启动子驱动的发夹RNA的稳定表达，该发夹RNA在发夹环形成内含子被剪接掉之后形成沉默诱导dsRNA。对于每种构建体维持至少六个独立的T1转化株。
致病疫霉测定细节
从T1(第一代转基因)植株采取分离的叶片，并放置在具有100％RH的托盘中，其中叶柄在潮湿的脱脂棉(cotton-wool)或Oasis中。将致病疫霉(P.inf)的游动孢子/孢子囊从P.inf培养物(黑麦-蔗糖-琼脂板)收获，并将10ul包含10e3个孢子囊的孢子悬液的液滴(10e5/ml)放置在中脉的每一侧上。将托盘在18C下孵育。在第11天对叶片感染率进行如下评分：1.完全感染/过生长，2.部分感染(10％-50％的面积)，和3.干净的(<10％的面积)。
如图1和2中示出的,图2a的双沉默的(SEQ ID NO.7&8)植株显示仅50％被感染，图2b的双沉默的(嵌合的)植株显示仅60％被感染，而图1的对照组显示所有植株被感染。如在图3中示出的，40％至50％的SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8两者沉默的植株是干净的，而仅SEQ ID NO.7沉默的植株仅10％的植株评分为部分感染。因此，SEQ ID NO.7和8两者的沉默提供对致病疫霉的抗性。
实施例2(碧冬茄属(Petunia))
从集合/文库鉴定转座子插入系(Vandenbussche等，2008,Plant Journal 54)。2个dTph1转座子插入等位基因见于SEQ ID NO 9中，且3个dTph1转座子插入等位基因见于SEQ ID NO 10中。进行几轮杂交以产生双突变体。
烟草疫霉测定细节
在23C，使植物在标准盆栽土壤中生长，单独地盆栽。
将烟草疫霉孢子从培养物(利马-豆-琼脂或V8-琼脂板)收获，并将2ml的包含10e4个(测定Sept)孢子的孢子悬液滴到每株植株的土壤上。定期监测植株萎蔫(collapse)。
如图4中示出的，双突变体，即具有在SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10两者的突变的植株具有45％的存活植株的百分比，而单突变体(在SEQ ID NO.9的突变或在SEQ ID NO.10的突变)的存活植株的百分比仅为20％。
实施例3(番茄)
番茄植株用两种构建体转化，用于提供SEQ ID NO.11和12两者的过表达，或用于提供SEQ ID NO.11和12两者的沉默。番茄SEQ ID NO.11沉默构建体使用Gateway克隆与SEQID NO.11的CDS的中部相同的300bp片段产生。
序列：
TTGGGTGAACAAGGACAACATATGGCTATCAATTATTATCCTCCTTGTCCACAACCAGAACTTACTTATGGGCTTCCGGCCCATACTGATCCAAATTCACTTACAATTCTTCTTCAAGACTTGCAAGTTGCGGGTCTTCAAGTTCTTAAAGATGGCAAATGGTTAGCTGTAAAACCTCAACCTGACGCCTTTGTCATTAATCTTGGGGATCAATTGCAGGCAGTAAGTAACGGTAAGTACAGAAGTGTATGGCATCGAGCTATTGTGAATTCAGATCAAGCTAGGATGTCAGTGGCTTCGTTT
使用的引物：
S.Lycopersicum AttB1-F aaaaagcaggcttcttgggtgaacaaggacaaca
S.Lycopersicum AttB2-R agaaagctgggtaaaacgaagccactgacatcc
将产生的ENTRY载体Gateway克隆到pHellsgate12二元载体中。接着根据用于番茄的标准程序进行农杆菌转化。由于序列中的相似性，沉默构建体能够沉默SEQ ID NO.11和12两者。
来自转化的番茄植株的后代通过接种致病疫霉分离株US11经历疾病测试。在接种后7天，植株通过以从1至9的视觉刻度对叶片评分进行视觉分析，其中1意指易感，且9意指抗性。使用植株TS33、TS19和OT9作为易感对照。使用已知抗性的野生登录种(wildaccession)LA1269作为抗性对照。每植株测量8片叶片。下表提供了来自每株植株8片叶片的平均评分。
LA1269 RC 8,7
TS33 VC 1,3
TS19 VC 1,5
OT9 VC 2,0
551-06-01 过表达 2,8
551-06-02 过表达 3,3
551-06-03 过表达 3,0
551-06-07 过表达 1,5
551-06-08 过表达 2,3
551-06-09 过表达 2,3
551-06-12 过表达 2,3
556-02-01 沉默 6,5
556-02-02 沉默 8,5
556-02-03 沉默 8,3
556-02-06 沉默 7,3
556-02-11 沉默 7,3
556-01-01 沉默 7,8
556-01-02 沉默 8,3
556-01-03 沉默 8,5
556-01-04 沉默 8,5
556-01-05 沉默 8,5
556-01-06 沉默 6,0
556-01-07 沉默 5,5
556-01-08 沉默 8,5
556-01-09 沉默 7,0
556-01-10 沉默 8,5
556-01-11 沉默 8,8
556-01-12 沉默 7,8
在该表中示出了，SEQ ID NO.11和12过表达的植株对分离株US11易感。沉默的植株提供比易感对照OT9显著高的评分。例如，植株556-01-08具有8.5的平均评分。该植株的样品以箱G10在图5中示出，并且与如以箱D8示出的抗性对照植株LA1296相似地不被感染。因此，SEQ ID NO.11和12两者的沉默提供对致病疫霉的抗性。
实施例4(本氏烟)
为了研究DMR6是否介导本氏烟针对致病疫霉的抗性，将DMR6直向同源物克隆在VIGS表达载体中。本氏烟植株对于DMR6被沉默，且随后用致病疫霉的孢子溶液滴注接种。多达至7dpi，将植株对于疾病发展评分。将该实验进行三次，得到相似的结果。与空载体对照或野生型未沉默的植株相比，DMR6沉默明显地导致较少病原体定植。
沉默构建体DMR6的序列：
acaactcgggttcagattgcaggaagccatagcagagagcctaggcttagagaaagagtgtataaaggatgtattgggcgaacaaggtcaacacatggctatcaatttctatcctccttgtccacaaccagaactcacttatgggctgccagcacatactgatccaaatgcccttacaattcttcttcaagacttagaagtagctggtcttcaagttcttaaagatggcgaatggttggccgtcaagcctcaaccagatgcctttgtcattaatcttggtgatcaactgcaggcagtgagtaatgggagatacaaaagcgtatggcatcgagctattgtaaattcagacaaagccaggttgtcagtggcttcgttcctttgtccgtgcgatagcgcgaaaatcagtgct
使用VIGS进行沉默并测试本氏烟DMR6的功能。作为用于该程序的视觉对照，PDS基因也被靶向。使用PDS沉默的植株来指示沉默开始的时间。由于蛋白水平已在植株中建立，沉默应该在观察到白化±2天之前已经开始。但在沉默时间帧开始时，沉默将不会以高比率，并且两天的等待给予该机制时间以建立良好的沉默比率。使用PDS沉默的植株的另一个优势为它们给出了植株的哪些部分被沉默的指示。在接种之上的所有部分中观察到白化。在真空接种的植株中，新组织显示强烈的光白化且子叶的一些部分也显示白色区域。在注射器接种的植株中，白化在最嫩的叶片中是最强的，在完全长成的叶片中，色素已被合成且沉默将更难以目视观察。在用包含TRV载体的农杆菌菌株接种后8-10天观察到PDS沉默的植株的白化。在第8天时开始感染测定。
进行两个单独的VIGS实验。来自两个实验的植株用于分离的叶片感染测定。在农杆菌浸润(Agro-infiltration)后8天，对浸润的叶片上面的2-6片叶片进行辣椒疫霉(P.capsici)感染测定。将包含5*103个孢子/ml-1的游动孢子溶液施加至分离的叶片。在第7天之后，第一VIGS显示低的辣椒疫霉感染率(参见表1)。理想地，100％的未沉默的叶片显示感染。
表1.来自第一VIGS实验的感染测定的结果。DMR6沉默的叶片未显示感染。7片未沉默的叶片中的3片显示感染。
感染 未感染 总计 ％感染
DMR6沉默的 0 11 11 0％
未沉默的 3 4 7 43％
这种低孢子形成被认为是本氏烟叶片的低感染的原因。然而，与未被沉默的叶片的40％显示感染相比，DMR6沉默的叶片无一显示感染症状。为了增加感染率，在获得孢子和感染方法中进行改变，以在第二感染测定期间导致更侵蚀性的感染。发现一个DMR6沉默的未感染的叶片，且其他DMR6沉默的叶片显示延缓的感染和较慢的感染扩散。
实施例5
介绍
编码免疫负调节物的许多基因在病原体感染期间被活化，使得可诱导的防御反应被控制并下调以防止过度活化。实例为在感染或MAMP处理后被诱导的编码Nudix水解酶的NUDT7和编码转录因子的WRKY48。相似地，霜霉抗性基因6(DOWNY MILDEW RESISTANT6gene)(DMR6)在用霜霉Hyaloperonospora arabidopsidis的相容和不相容的分离株感染期间被活化。通过突变失活DMR6导致防御相关基因的低组成型活化和对霜霉H.arabidopsidis的抗性。
DMR6属于2-酮戊二酸Fe(II)依赖性加氧酶的超家族(2OG加氧酶，Pfam结构域PF03171)。该超家族在拟南芥中包括151个成员。然而，对于大部分这些蛋白，包括DMR6，它们的代谢活性是未知的。已知2OG加氧酶催化牵涉使用分子O2氧化底物的许多反应。它们通常使用铁作为辅因子并且需要2-酮戊二酸作为共底物以供应两个电子。这些酶的一般标志(hallmark)为位于双链β片层上的保守的HxD/ExnH基序的存在。它连同两个四股β片层(jelly roll折叠)一起包封活性中心。2OG加氧酶参与次级代谢和信号分子的生物合成，例如黄酮类、赤霉素类和生物碱类的生物合成。
在该实施例中，我们功能上分析拟南芥DMR6加氧酶和相关的DMR6-样加氧酶(DMR6-LIKE OXYGENASES)(DLO)1和2。DMR6、DLO1和DLO2的过表达增加疾病易感性，表明这三种蛋白可充当免疫负调节物。DLO1，而非DLO2，与DMR6高度共调节，然而它们在其霜霉感染期间的空间表达方面不同。发现dmr6-3_dlo1双突变体完全抗性H.arabidopsidis，并显示与高水平水杨酸相关的强烈降低的生长。
结果
DMR6的过表达导致增强的对(半)活体营养型病原体的易感性
dmr6-1突变体的幼苗先前被描述为对H.arabidopsidis更具抗性，但对丁香假单胞菌(P.syringae)不具抗性。然而，当对成年dmr6-1植株测试时，观察到对丁香假单胞菌DC3000的强抗性。此外，与幼苗相比，成年dmr6-1植株对专性活体营养型拟南芥霜霉(H.arabidopsis)更具抗性。另外，当与亲本系Ler eds1-2相比时，在dmr6-1植株中对半活体营养型辣椒疫霉的强抗性是明显的；而所有dmr6-1突变体植株存活，辣椒疫霉破坏了绝大多数亲本系的植株和补偿的dmr6-1突变体。dmr6-1突变体对不同(半)活体营养型的抗性表明在野生型植株中，DMR6负调节对这些病原体的免疫。
为了研究这一点，DMR6编码序列在转基因Col-0系中由组成型35S启动子表达。DMR6过表达系显示对H.arabidopsidis和丁香假单胞菌的疾病易感性的明显增加。与对照相比，DMR6-过表达系中的H.arabidopsidis孢子形成水平(其为霜霉感染的量度)加倍。此外，疾病相关的缺绿病的发展在DMR6-过表达系中比在非转基因Col-0植株中更明显。
六周龄植株对丁香假单胞菌细菌的增加的易感性也是明显可见的。尽管对照品系(Col-0)在接种后3天显示相对低水平的缺绿病和病变，但DMR6-过表达系显示更严重的疾病症状，即更多的缺绿病和更多和更大的病变。DMR6-过表达对丁香假单胞菌感染的增加的易感性得到细菌生长测定确认，该测定显示与Col-0对照相比，在接种后1和3天细菌滴度增加。此外，在未感染的叶片组织中的防御标志物基因PR-1、PR-2和PR-5的表达在DMR6-过表达系中与已具有非常低水平的表达的野生型Col-0植株相比降低了50％至80％。DMR6-过表达系的降低的免疫连同drm6-1突变体的增强的抗性强烈支持DMR6作为免疫负调节物的作用。
DMR6和DMR6-样加氧酶代表开花植物中不同进化枝的不同分支
拟南芥基因组包含超过150种2OG加氧酶基因，其中一些基因与DMR6相似。为了分析开花植物中DMR6和相关加氧酶的进化保守性，我们系统发生地分析了包含2OG-Fe(II)加氧酶超家族Pfam结构域PF03171的2OG加氧酶家族。从其中基因组序列和蛋白模型在Phytozome v7.0数据库(www.Phytozome.net)中是可用的拟南芥(Arabidopsis thaliana)和18个开花植物，使用HMMER3算法选择出了包含PF03171结构域的总计2951种蛋白。为了过滤小蛋白片段和去除非常大的蛋白，我们仅包括与DMR6不超过20％长度差异的蛋白。此外，仅保留具有与DMR6相比小于20％的氧化还原酶结构域的长度差异的蛋白。这导致满足所有标准的2038种蛋白的选择，包括151种预测的拟南芥(A.thaliana)2OG加氧酶中的110种。系统发生聚类产生了一个树，其中显示了代表不同酶活性的许多不同的进化枝。充分表征的加氧酶包括存在于不同于DMR6进化枝的不同进化枝中的黄烷酮-3-羟化酶(F3H)、1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)氧化酶和花青素合酶(ANS)。在DMR6进化枝中可区分两个单独的分枝，每个分枝包含来自双子叶植物(dicots)和单子叶植物(monocots)的2OG加氧酶，表明这些亚进化枝已存在于所有开花植物的祖先中或更早(82％bootstrap置信)。在DMR6进化枝的两个分枝中，DMR6进化枝中的基因重复在树的上部的单子叶植物中以及在大豆和葡萄中是频繁的。在较低的亚进化枝中，两个拟南芥DMR6同系物连同来自琴叶拟南芥(Arabidopsislyrata)的两种蛋白聚类，表明它们是这两种物种的共同祖先中相对较近的基因重复的结果。
这些拟南芥蛋白现在被命名为DMR6-样加氧酶或DLO(基因At4g10500编码DLO1和At4g10490编码DLO2)。此外，DLO亚进化枝显示单子叶植物和双子叶植物蛋白的明显分离，表明除DMR6以外，所有开花植物的祖先已拥有DLO。分组与DMR6接近(Grouping closely toDMR6)，DLO形成有趣的组，随后对该组进行了更详细的分析，重点是拟南芥(A.thaliana)DLO1和DLO2基因。
DLO1和DLO2的过表达补偿dmr6突变体
DLO可具有与DMR6相同的生物活性，因此，测试对dmr6-1突变体的补偿作用。为此，DLO1和DLO2在组成型35S启动子下表达，并转化到dmr6-1突变体背景中。分析用35S:DLO1或35S:DLO2转化的4种独立的T3系的DLO1和DLO2表达水平，并且每种构建体选择显示出明显转基因表达的3种系。为了检查补偿作用，用H.arabidopsidis分离株Cala2感染2周龄植物，并且在接种后5天(dpi)，将每mg幼苗的孢子数评分作为易感性的量度。
有趣地，尽管dmr6-1显示出明显的抗性，但35S::DLO1和35S::DLO2植株是高度易感的，相似于或高于为dmr6-1突变体的亲本系的Ler eds1-2。由于DLO1和DLO2两者可补偿dmr6-1突变体表型，我们得出如下结论：DLO具有与DMR6相似的功能。
由于DMR6在Col-0背景中的过表达导致对霜霉和其他病原体的易感性增强，我们接下来研究过表达DLO1和DLO2是否也将使Col-0更易感。选择表达35S:DLO1和35S:DLO2转基因的转化株，并且包括过表达DMR6的Col-0和高度易感的Col eds1-2突变体作为对照。用H.arabidopsidis的疾病测定显示，与Col-0亲本系相比，DLO1和DLO2的过表达增强了易感性，如通过较高水平的孢子形成显示的。观察到的增强的易感性与DMR6过表达植株和Coleds1-2突变体相当。这确认了DLO1和DLO2蛋白具有与DMR6相似或相同的活性，导致相同的表型效应。
DLO1，而非DLO2的表达是免疫相关的
DLO1和DLO2补偿和过表达系都使用35S启动子产生。然而，野生型DLO的表达可能是高度调节的，类似于在植物防御期间被强烈活化的DMR6的调控。因此，我们分析公众可得的基因表达数据以确定DLO1和DLO2是否显示相似于DMR6的免疫相关表达。对于该分析，使用了9个不同的Affymetrix微阵列实验的数据，所有这些实验都在病原体攻击、防御相关激素应用和诱导物/效应物处理之后处理转录谱。
表达分析集中于30种2OG加氧酶，其属于包含DLO和DMR6的大进化枝。基因的分层聚类允许2OG加氧酶基因根据它们的表达模式进行分组，提供关于在植物免疫应答期间共调节的基因的信息。显著地，DLO1与DMR6聚类，而DLO2未显示与DMR6或DLO1的任何共调节。DMR6和DLO1在用霜霉H.arabidopsidis、白粉病白粉菌(Erysiphe orontii)和细菌丁香假单胞菌的感染且以及SA处理之后均被活化。DLO2聚类远离(well away from)DMR6和DLO1，并且在不同的实验中似乎是无反应的。使用Genevestigator对可用微阵列数据的进一步分析显示，DLO2在对任何处理的应答或在除了长角果(siliques)以外的任何组织中都不表达，表明DLO2在营养性植物组织的免疫中不具有作用。
DLO对H.arabidopsidis感染的应答性通过定量PCR(qPCR)实验地验证。DMR6和DLO1在用相容或不相容的H.arabidopsidis分离株的感染植株中高度活化。此外，在用SA模拟物BTH处理后，DMR6和DLO1都被强烈活化。相比之下，DMR6和DLO1不应答茉莉酮酸甲酯(MeJA)，已知茉莉酮酸甲酯(MeJA)活化茉莉酮酸诱导的基因。在不同实验条件下，DLO2表达是不可检测到的(cT值高于35)，确认了Genevestigator数据。在植物的免疫应答期间DMR6和DLO1两者都被活化的事实表明，在野生型植株的叶片中，DLO1也充当防御的负调节物。然而，仍然存在如下问题：为什么dmr6突变体在可能接管DMR6功能的完整的DLO1基因的存在下具有此类明显的抗性表型？
DLO1和DMR6在感染的叶片中显示不同的空间表达
为了分析在霜霉感染期间DLO1的组织特异性表达，我们产生了包含具有与GUS报告基因融合的DLO1启动子的构建体(proDLO1:GUS)的转基因系。由于我们未观察到DLO2的任何表达，未构建具有DLO2的启动子的GUS融合物。在H.arabidopsidis感染后，如先前描述的，在与病原体直接接触的部位特异性地检测到DMR6空间表达。相比之下，在与病原体紧密接触的细胞中未诱导DLO1表达，而仅在感染的子叶和叶片的主脉中或周围诱导DLO1表达。有趣地，DLO1表达仅在叶片的接近H.arabidopsidis感染部位的区域中被观察到，表明DLO1的活化取决于病原体的存在。在包含吸器(haustoria)的细胞中不存在DLO1活性可解释为什么DLO1不能完全补偿dmr6突变体中DMR6活性的损失。尽管这些数据显示DMR6和DLO1基因的不同活性，这些基因的冗余程度是不清楚的，并因此进一步进行遗传学研究。
DLO1功能是与DMR6部分冗余的
突变体系中的冗余分析最好在相同的遗传背景下进行。因此，我们在Col-0背景下获得突变体：DMR6(GABI-KAT系GK-249H03.01，被命名为突变体dmr6-3)和DLO1(SALK系059907，被命名为dlo1)。产生dmr6-3_dlo1双突变体，并连同dmr6-3和dlo1单突变体以及与亲本Col-0系一起进行表型分析。对H.arabidopsidis Waco9的易感性水平在dmr6-3突变体中强烈降低，但在dlo1突变体中仅轻微降低。在dmr6-3_dlo1双突变体中结合两个突变导致显示对H.arabidopsidis的完全抗性的植物。
因为关于dmr6-1和dmr6-2突变体的先前研究显示PR-1和其他防御基因的表达水平增加，我们接下来测试突变体中防御基因表达的水平。dmr6-3突变体同样显示升高的PR-1、PR-2和PR-5的表达，确认了先前的结果。dlo1突变体仅显示三种PR基因的不显著的诱导表达。
相比之下，dmr6-3_dlo1双突变体显示极高水平的防御基因表达。PR-1转录物在更多dmr6-3_dlo1突变体中比在Col-0中高超过30,000倍，并且比在dmr6-3单突变体中高超过100倍。在测试的突变体中，在对霜霉的抗性水平和防御基因表达的增加之间存在明显的相关性，表明抗性是由植物免疫应答的活化引起的。我们的数据显示dlo1突变增强dmr6-3单突变体的免疫，表明DLO1和DMR6部分冗余地起作用。
这进一步由突变体的生长表型证实。在短日照条件下生长5,5周的植株显示基因型之间的显著差异。尽管dlo1突变体生长相似于Col-0，且dmr6-3突变体仅显示轻微的生长减少，dmr6-3_dlo1双突变体显示强烈的生长减少，导致矮化的植物。生长减少和对霜霉的抗性水平在测试的突变体中相关，表明这两种表型功能上相关。
熟知的是，植物免疫的强活化可伴随严重的生长减少，这在许多情况下可以与高SA水平相关。事实上，SA水平在dmr6-3_dlo1双突变体中比在Col-0对照中高超过200倍，并且比在dmr6-3突变体中高～20倍。与Col-0对照相比，单突变体dmr6-3显示出SA的～10倍的中度增加，而dlo1突变体未累积比Col-0多的SA。
为了测试dmr6-3_dlo1中的高SA水平是否是矮化表型和对霜霉的高水平抗性的原因，将双突变体与sid2突变体杂交，sid2突变体由于异分支酸合酶1(isochorismatesynthase 1)损失而在SA生物合成中强烈受损。三突变体dmr6-3_dlo1_sid2显示几乎完全恢复dmr6-3_dlo1双突变体的生长表型，尽管它仍保持略小于sid2突变体。疾病测定显示dmr6-3_dlo1双突变体和dmr6-3单突变体的高水平的抗性同样在缺乏SID2的情况下被强烈降低。由于低的SA水平，sid2突变体比野生型Col-0更易感染H.arabidopsidis。对H.arabidopsidis的易感性水平与突变体中总SA的水平非常相关。dmr6以及dmr6-3_dlo1双突变体两者显示在5dpi没有孢子形成并且具有最高的SA水平。三突变体dmr6-3_dlo1_sid2仍然产生比Col-0多的SA，这可能解释它对霜霉的较低的易感性。
结论是，对H.arabidopsidis的抗性以及dmr6-3_dlo1突变体的生长减少是SA水平增加的结果。双突变体的极端表型证明DLO1和DMR6基因冗余地起作用。然而，dmr6单突变体比dlo1突变体对霜霉更具抗性。连同观察到的DMR6和DLO1基因表达的不同定位，本发明数据表明DMR6和DLO1基因作为植物免疫的负调节物具有不同但部分冗余的功能。

Claims (16)

1.属于茄科(Solanaceae)的植物，其中所述植物包含提供疫霉属(Phytophthora)抗性的遗传性状，并且其中所述抗性性状由至少两种基因的组合编码，所述植物与对疫霉属易感的所述属于茄科的植物相比，具有所述两种基因的降低的表达或转录或由所述两种基因编码的蛋白的降低的活性。
2.根据权利要求1所述的植物，其中所述属于茄科的植物选自由以下组成的组：甜椒(Capsicum annuum)、辣椒属物种(Capsicum spp.)、马铃薯(Solanum tuberosum)、碧冬茄属(Petunia)、番茄(Solanum lycopersicum)、本氏烟(Nicotiana benthamiana)、和烟草(Nicotiana tabacum)。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的植物，其中所述疫霉属抗性为对选自由以下组成的组的植物病原体的抗性：疫霉属物种(Phytophthora spp.)、辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)、致病疫霉(Phytophthora infestans)和烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的植物，其中所述植物为马铃薯(Solanumtuberosum)，所述疫霉属抗性为对致病疫霉的抗性，并且所述至少两种基因的组合为编码根据SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的蛋白的基因或者编码与SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.2具有至少90％序列同一性，优选地至少95％序列同一性，最优选地至少99％序列同一性的蛋白的基因。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的植物，其中所述植物为碧冬茄属(Petunia)，所述疫霉属抗性为对烟草疫霉的抗性，并且所述至少两种基因的组合为编码根据SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的蛋白的基因或者编码与SEQ ID No.3和/或SEQ ID No.4具有至少90％序列同一性，优选地至少95％序列同一性，最优选地至少99％序列同一性的蛋白的基因。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的植物，其中所述植物为番茄(Solanumlycopersicum)，所述疫霉属抗性为对致病疫霉和/或辣椒疫霉的抗性，并且所述至少两种基因的组合为编码根据SEQ ID No.5和SEQ ID No.6的蛋白的基因或者编码与SEQ ID No.5和/或SEQ ID No.6具有至少90％序列同一性，优选地至少95％序列同一性，最优选地至少99％序列同一性的蛋白的基因。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的植物，其中所述植物为甜椒(Capsicum annuum)或辣椒属物种(Capsicum spp.)，所述疫霉属抗性为对辣椒疫霉的抗性，并且所述至少两种基因的组合为编码根据SEQ ID No.16和SEQ ID No.17的蛋白的基因或者编码与SEQ IDNo.16和/或SEQ ID No.17具有至少90％序列同一性，优选地至少95％序列同一性，最优选地至少99％序列同一性的蛋白的基因。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的植物，其中所述植物为本氏烟，所述疫霉属抗性为对辣椒疫霉和/或致病疫霉和/或烟草疫霉的抗性，并且所述至少两种基因的组合为编码根据SEQ ID No.18的蛋白的基因和与SEQ ID No.18具有至少70％序列同一性，优选地至少85％序列同一性，最优选地至少95％序列同一性的蛋白的基因。
9.根据权利要求1至3中任一项所述的植物，其中所述植物为烟草(Nicotianatabacum)，所述疫霉属抗性为对辣椒疫霉和/或致病疫霉和/或烟草疫霉的抗性，并且所述至少两种基因的组合为编码根据SEQ ID No.19的蛋白的基因和与SEQ ID No.19具有至少70％序列同一性，优选地至少85％序列同一性，最优选地至少95％序列同一性的蛋白的基因。
10.属于茄科的植物，其中所述植物包含提供疫霉属抗性的遗传性状，所述抗性性状是通过在疫霉属易感植物中下调两种基因的组合的表达或翻译或降低由所述两种基因的组合编码的蛋白的活性可获得的，其中所述两种基因的组合编码选自由以下组成的组的蛋白：SEQ ID No.1和2；SEQ ID No.3和4；SEQ ID No.5和6；SEQ ID No.16和17；SEQ ID No.18和与SEQ ID No.18具有至少70％序列同一性，优选地至少85％序列同一性，最优选地至少95％序列同一性的蛋白；以及SEQ ID No.19和与SEQ ID No.19具有至少70％序列同一性，优选地至少85％序列同一性，最优选地至少95％序列同一性的蛋白。
11.根据权利要求10所述的植物，其中所述属于茄科的植物选自由以下组成的组：甜椒(Capsicum annuum)、辣椒属物种、马铃薯(Solanum tuberosum)、碧冬茄属(Petunia)、番茄(Solanum lycopersicum)、本氏烟、和烟草(Nicotiana tabacum)。
12.根据权利要求10或权利要求11所述的植物，其中所述疫霉属抗性为对选自由以下组成的组的植物病原体的抗性：疫霉属物种、辣椒疫霉、致病疫霉和烟草疫霉。
13.两种基因的组合用于在属于茄科的植物中提供疫霉属抗性的用途，其中所述两种基因编的组合码选自由以下组成的组的蛋白组合：SEQ ID No.1和2；SEQ ID No.3和4；SEQID No.5和6；SEQ ID No.16和17；SEQ ID No.18和与SEQ ID No.18具有至少70％序列同一性，优选地至少85％序列同一性，最优选地至少95％序列同一性的蛋白；以及SEQ ID No.19和与SEQ ID No.19具有至少70％序列同一性，优选地至少85％序列同一性，最优选地至少95％序列同一性的蛋白。
14.根据权利要求13所述的用途，其中所述属于茄科的植物选自由以下组成的组：甜椒(Capsicum annuum)、辣椒属物种、马铃薯(Solanum tuberosum)、碧冬茄属(Petunia)、番茄(Solanum lycopersicum)、本氏烟、和烟草(Nicotiana tabacum)。
15.根据权利要求13或权利要求14所述的植物，其中所述疫霉属抗性为对选自由以下组成的组的植物病原体的抗性：疫霉属物种、辣椒疫霉、致病疫霉和烟草疫霉。
16.蛋白，所述蛋白选自由以下组成的组：SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、16、17、18和19以及与其具有至少90％序列同一性，优选地至少95％，最优选地至少99％序列同一性的蛋白。
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