CN114945273A

CN114945273A - 增加植物对抗真菌感染的抗性

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Publication number: CN114945273A
Application number: CN202080083067.XA
Authority: CN
Inventors: P·埃普勒; B·J·德扬; H·舒尔塞斯; R·弗拉赫曼; D·A·胡贝特; A-C·赫维希
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2019-11-29
Filing date: 2020-11-25
Publication date: 2022-08-26
Also published as: US20230002455A1; BR112022006229A2; WO2021105191A1; EP4064830A1

Abstract

本发明涉及在植物、植物部分和/或植物细胞中赋予或增加对抗真菌病原体的抗性的方法。为此，本发明聚焦于与相应的野生型植物、野生型植物部分和/或野生型植物细胞相比，促进或增加植物、植物部分和/或植物细胞中Myb41型转录因子(Myb41)、其片段或同源物的产生和/或积累。本发明还涉及具有增加的对抗真菌病原体的抗性的植物、植物部分和/或植物细胞，以及产生或使用此类植物、植物部分或从其生产产品的材料和方法。

Description

增加植物对抗真菌感染的抗性

发明概要

本发明涉及在植物、植物部分和/或植物细胞中赋予或增加对抗真菌病原体的抗性的方法。为此，本发明聚焦于与相应的野生型植物、野生型植物部分和/或野生型植物细胞相比，促进或增加植物、植物部分和/或植物细胞中Myb41型转录因子(Myb41)、其片段或其同源物的产生和/或积累。本发明还涉及具有增加的对抗真菌病原体的抗性的植物、植物部分和/或植物细胞，以及产生或使用此类植物、植物部分或从其生产产品的材料和方法。

发明背景

农作物植物的种植主要起到生产人和动物的食物的作用。目前常规的单一作物栽培尤其对疾病的流行病样传播高度易感。结果是产量显著降低。迄今为止，主要通过使用杀虫剂来控制致病生物。如今，对人类而言，也存在直接改变植物或病原体的遗传配置的可能性。或者，真菌感染后由植物产生的天然存在的杀真菌剂也可以被合成并施用于植物。抗性通常描述植物预防或至少减少有害病原体的侵染和定殖的能力。可以在天然存在的抗性中辨别出不同的机制，利用这些机制植物避免被植物病原性生物体定殖(Schopfer和Brennicke(1999)PflanzenPhysiologie，Springer Verlag，Berlin-Heidelberg，德国)。

关于生理小种特异性抗性，也称为宿主抗性，在相容和不相容相互作用之间进行区分。在相容相互作用中，在毒性病原体和易感植物之间发生相互作用。病原体存活，并且可以建立繁殖结构，而宿主严重阻碍发育或死亡。另一方面，病原体感染植物但在症状轻微发展之前或之后生长受到抑制(主要是由于NBS-LRR家族的R基因的存在，参见下文)时，发生不相容的相互作用。在后一种情况下，植物对相应的病原体具有抗性(Schopfer和Brennicke，参见上文)。然而，这种类型的抗性主要对某种菌株或病原体是特异性的。

在相容和不相容相互作用中，发生宿主对病原体的防御和特异性反应。然而，在自然界中，由于病原体的新毒性小种(virulent race)的快速进化发展，这种抗性经常被克服(Neu等(2003)American Cytopathol.Society，MPMI 16No.7:626-633)。

大多数病原体是植物物种特异性的。这意味着病原体可以在某些植物物种中诱导疾病，但在其他植物物种中不诱导疾病(Heath(2002)Can.J.Plant Pathol.24:259-264)。某些植物物种中对抗病原体的抗性被称为非宿主抗性。非宿主抗性提供了强力的、广泛的和永久的防止植物病原体的保护。提供非宿主抗性的基因提供了强力的、广泛的和永久的对抗非宿主植物中特定疾病的保护的机会。特别地，这种抗性对病原体的不同菌株起作用。

真菌分布在全世界。迄今已知大约100 000种不同的真菌物种。其中锈菌是非常重要的。它们可以有一个复杂的发育周期，具有多达五个不同的孢子阶段(性孢子、锈孢子、夏孢子、冬孢子和担孢子)。

在植物被病原性真菌感染期间，通常观察到不同的阶段。植物病原性真菌与其潜在宿主植物之间相互作用的第一阶段对于真菌定殖在植物是决定性的。在感染的第一阶段期间，孢子附着于植物的表面，萌发，并且真菌穿透植物。真菌可以经由现有的开口(如气孔、皮孔、排水器和伤口)穿透植物，或者作为机械力的结果并借助细胞壁消化酶，它们直接穿透植物表皮。形成了特定的感染结构用于植物的穿透。为了抵抗，植物已经形成了物理屏障，如蜡层，以及具有抗真菌作用的化学化合物以抑制孢子萌发、菌丝生长或穿透。

大豆锈菌豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)直接穿透角质层和植物表皮。在穿过表皮细胞后，真菌到达叶肉的细胞间隙，在那里真菌开始穿过叶子传播。为了获得营养，真菌穿透叶肉细胞并在叶肉细胞内部形成吸器。在穿透过程中，穿透的叶肉细胞的质膜保持完整。

亚洲大豆锈病的发病机理的初始步骤是真菌通过植物角质层进入表皮细胞的初始穿透。植物角质层是覆盖气生表皮的胞外疏水层，并且由两种主要组分组成，即聚合物角质和角质层蜡(关于植物角质层的综述参见Yeats TH，Rose JK.The formation andfunction of plant cuticles.Plant Physiol.2013；163(1)：5-20)。角质层提供对抗干燥、外部环境胁迫和病原体的保护。例如，已经显示番茄“cd”突变体中较低的角质量与增加的对灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的易感性相关(Isaacson等，2009)。为了促进穿透角质层，许多真菌病原体分泌酶以降解或弱化角质层，如，例如角质酶，这是一类水解角质聚合物的小的非特异性酯酶。

除了角质外，表皮蜡在病原体发育和防御中也起重要作用。例如，已经显示蒺藜苜蓿(M.trunctula)的“锈管萌发抑制物1”(IRG1)突变体在叶背面显示出较少的表皮蜡晶体，并且蜡伯醇基团强烈减少。这种表面改变导致对抗真菌病原体豆薯层锈菌、无斑柄锈菌(Puccinia emaculata)和炭疽病真菌三叶草炭疽菌(C.trifolii)的抗性增加(Uppalapati等，2012)。作者发现IRG1编码Cys(2)His(2)锌指转录因子，也称为PALM1。

活体营养型植物病原性真菌的营养依赖于植物活细胞的代谢。这种类型的真菌属于活体营养型真菌组，如许多锈病真菌、白粉病真菌、或卵菌病原体如疫霉属(Phytophthora)或霜霉属(Peronospora)。死体营养型植物病原性真菌的营养依赖于植物的死细胞，例如来自镰孢属(Fusarium)、丝核菌属(Rhizoctonia)或球腔菌属(Mycospaerella)的种。大豆锈病已经占据中间位置，因为它直接穿透表皮，被穿透的细胞随之变成坏死的。穿透后，真菌转换到专性活体营养型生命方式。基本上遵循这种感染策略的活体营养型真菌病原体的亚组是半死体型的。

大豆锈病最近变得越来越重要。该疾病由活体营养型锈病豆薯层锈菌(Sydow)和山马蝗层锈菌(Phakopsora meibomiae)(Arthur)引起。它们都属于担子菌门(Basidiomycota)，锈菌目(Uredinales)，层锈菌科(Phakopsoraceae)。两种锈菌都感染广谱的豆科植物宿主植物。

豆薯层锈菌是大豆(Glycine max)上更具侵袭性的病原体，并且因此至少目前对农业是非常重要的。可以在世界上几乎所有热带和亚热带大豆种植区中发现豆薯层锈菌。豆薯层锈菌在自然界中能够感染17个豆科的31个种，并且能够在受控条件下在另外60个种上生长(Sinclair等(编辑)，Proceedings of the Rust Workshop(1995)，NationalSoybeana Research Laboratory，Publication No.1(1996)，Rytter J.L.等，PlantDis.87，818(1984))。已经在加勒比盆地和波多黎各发现了山马蝗层锈菌(P.meibomiae)，并且迄今尚未造成实质性损害。

豆薯层锈菌目前只能通过杀真菌剂在田间防治。对整个分离株谱具有抗性的大豆植物是不可获得的。在寻找抗性大豆种质时，发现了介导大豆对豆薯层锈菌抗性的NBS-LRR家族的6个显性R基因。它们赋予的抗性迅速丧失，因为豆薯层锈菌发展出新的毒性小种。

近年来，真菌病害(例如大豆锈病)在农业生产中变得更加重要。因此，在现有技术中需要开发防治真菌和提供抗真菌疾病的植物的方法。

已经对感染植物表皮层的白粉病和霜霉病进行了许多研究。然而，应对感染叶肉的大豆锈病或感染难以接近的内部组织的镰刀菌属(Fusarium)真菌的问题仍未解决。

本发明的目的尤其是提供一种增加对抗真菌病原体，优选对抗层锈菌科真菌病原体，更优选对抗层锈菌属真菌病原体，最优选对抗豆薯层锈菌(Sydow)和/或山马蝗层锈菌(Arthur)(也称为大豆锈病)的抗性的方法。

令人惊讶的是，我们发现真菌病原体，特别是层锈菌科的真菌病原体，例如大豆锈病，可以通过Myb41蛋白的表达来控制，所述Myb41蛋白最初已被鉴定为角质生物合成的阻遏物(Cominelli等(2008)Over expression of the Arabidopsis AtMYB41 gene alterscell expansion and leaf surface permeability.Plant J.53(1):53-64)。Cominelli等已经发现了AtMYB41的过表达导致矮化表型，其与影响角质层生物合成的一些突变体所呈现的相似。

转录因子的MYB超家族是大型且功能多样的蛋白质家族，其可以在所有真核生物中发现。在植物中，Myb家族已经选择性地扩展了。例如，在拟南芥(Arabidopsis)中，可以发现196个Myb转录因子同源物，其属于4个不同的家族(关于拟南芥中的Myb转录因子的全面综述参见Dubos等(2010)，Trends in Plant Science，Vol.15，No.10；573-581)。

本发明中描述的Myb41蛋白属于R2R3-MYB家族，其由拟南芥中的126个成员组成。据报道，R2R3-MYB基因参与许多不同的调节网络，所述调节网络控制发育、代谢以及对生物和非生物胁迫的反应。

在拟南芥中，AtMYB41响应干旱、ABA和盐处理而高水平表达，表明了在胁迫反应中可能的作用。在拟南芥中过量表达这种转录因子的转基因系显示出与影响角质层生物合成的一些突变体所呈现的相似的多效性表型(矮化外观)(Cominelli等(2008)Over-expression of the Arabidopsis AtMYB41 gene alters cell expansion and leafsurface permeability.Plant J.53(1):53-64)。然而，该出版物并未分析表型的真正原因。通过转录组和代谢组分析对AtMyb41过表达系的进一步表征显示了AtMyb41参与几种细胞过程，包括初级代谢的控制以及对渗透胁迫的短期转录反应的负调节(Lippold等，AtMyb41 regulates transcriptional and metabolic responses to osmotic stressin Arabidopsis.Plant Physiol.149:1761-1772(2009))。通过进一步评价Myb41在盐和干燥耐受中的作用，发现其通过丝裂原激活的蛋白激酶MPK6的Ser251的磷酸化来调节；通过MPK6的MYB41的磷酸化是MYB41在盐耐受中的生物学功能所必需的(Hoang等，BiochemBiophys Res Commun.2012年5月；422(1)181-186)。

最近，AtMyb41基因过表达的分子机制与叶中木栓素(Suberin)的合成联系了起来。(Kosma等，AtMYB41 activates ectopic suberin synthesis and assembly inmultiple plant species and cell types.Plant J.80:216-229(2014)。木栓素是在所有植物的根和维管组织中发现的脂质和酚细胞壁杂聚物。木栓素在植物水分关系和保护植物免受生物和非生物胁迫中起着关键作用。Kosma等显示了AtMYB41的表达可以激活木栓素合成和细胞壁相关木栓素样片层沉积所必需的所有步骤。因此，AtMYB41的过表达将增加木栓素、木质素和苯丙素生物合成基因转录物，并将提高叶中单木质醇的量，导致在叶的表皮和叶肉细胞中形成木栓素样片层。

叶中木栓素片层的形成从未与增加的对抗真菌病原体的抗性相关联。因此，发现在大豆中过表达AtMyb41后对豆薯层锈菌的抗性增加是令人惊讶的。此外，如Le Gall等(Cell Wall Metabolism in Response to Abiotic Stress.Plants 2015，112-166)针对蔷薇类和拟南芥属中盐反应的差异所述，对于不同物种，似乎存在对应激物的不同反应。因此，不可能将例如拟南芥中发现的胁迫反应外推到其他植物种。

发明概述

因此，本发明提供了一种用于赋予或增加植物、植物部分或植物细胞中的真菌抗性的方法，其中所述方法包括与相应的野生型植物、野生型植物部分或野生型植物细胞相比，增加所述植物、植物部分或植物细胞中Myb41的产生和/或积累的步骤。

还提供了在植物、植物部分或植物细胞中赋予或增加真菌抗性的方法，其中所述方法包括与相应的野生型植物、野生型植物部分或野生型植物细胞相比，增加所述植物、植物部分或植物细胞中Myb41蛋白的表达和/或生物活性，其中所述Myb41蛋白由以下编码：

(i)与SEQ ID NO.1具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性的外源核酸，或其功能性片段或其剪接变体；

(ii)编码与SEQ ID NO.2或5具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性的蛋白质或其功能性片段的外源核酸；

(iii)能够在严格条件下与根据(i)或(ii)的任何核酸的互补序列杂交的外源核酸；或

(iv)与上述(i)至(iii)的核酸编码相同的Myb41蛋白的外源核酸，但由于遗传密码的简并性而不同于上述(i)至(iii)的核酸。

本发明还提供了包含编码本发明的Myb41蛋白的核酸的重组载体构建体。

还提供了用本发明的一种或多种重组载体构建体转化的遗传修饰的植物、遗传修饰的植物部分或遗传修饰的植物细胞。

本发明还提供了过表达本发明的Myb41蛋白的作物植物、作物植物部分或作物植物细胞。

此外，本发明提供了一种用于生产与相应的野生型植物、植物部分或植物细胞相比具有增加的真菌抗性的遗传修饰的作物植物、遗传修饰的作物植物部分或遗传修饰的作物植物细胞的方法，所述方法包括

(a)将编码Myb41蛋白的外源核酸引入植物、植物部分或植物细胞中，

(b)从植物、植物部分或植物细胞产生遗传修饰的植物、遗传修饰的植物部分或遗传修饰的植物细胞；和

(c)在来自所述植物的遗传修饰的植物、遗传修饰的植物部分或遗传修饰的植物细胞中表达Myb41蛋白。

根据本发明的一个方面，将Myb41蛋白或编码Myb41蛋白的核酸用于增加植物中的真菌抗性。

本发明还提供了控制田地中的真菌的方法，优选通过减少或延迟田地中植物的感染和/或减少或延迟真菌孢子从田地中排放，所述方法包括以下步骤：(a)种植来自本发明的任何植物的种子和/或(b)增加植物中的木栓素片层形成。

并且本发明提供了本发明的植物的可收获部分，其中植物的可收获部分包含编码本发明的Myb41蛋白的外源核酸。

本发明还提供了源自本发明的植物、源自可通过本发明的方法生产的植物或源自本发明的植物的可收获部分的产品，其中产品包含编码Myb41蛋白的外源核酸和/或本发明的Myb41蛋白。根据本发明的优选产品是水果，更优选种子，以及源自此类水果的产品，优选干果和干果块、粗粉和油。根据本发明最优选的是大豆、大豆粉和大豆油。

本发明还提供了一种用于生产产品的方法，所述方法包括a)使本发明的植物或通过本发明的方法可获得的植物生长和b)从或通过植物和/或植物部分(优选种子)产生所述产品，其中产品包含编码本发明的Myb41蛋白的外源核酸和/或本发明的Myb41蛋白。

并且本发明提供了一种测定植物对抗真菌的抗性的方法，该方法包括筛选所述植物的细胞中Myb41基因的过表达。

在本发明的上下文中，设想真菌抗性包括对抗活体营养型、半活体营养型或半死体营养型真菌，优选对抗锈菌、霜霉病、白粉病、叶斑病、晚疫病、镰刀菌属和/或壳针孢属，的抗性。

同样在本发明的上下文中，植物优选选自分类科蝶形花科、十字花科和禾本科的成员，最优选大豆。

本发明还提供了一种用于育种真菌抗性作物植物的方法，所述方法包括

(a)将本发明的植物或通过本发明的方法可获得的植物与第二植物杂交；

(b)从步骤(a)的杂交获得种子；

(c)种植所述种子并使种子生长成植物；和

(d)从所述植物中选择此类表达本发明的Myb41蛋白的植物。

如上所述，本发明的目的主要通过独立权利要求的主题来实现。本发明的优选实施方案由从属权利要求的主题限定或在下文中更详细地描述。

附图简述

图1显示了用于确定野生型和转基因大豆植物对抗锈菌豆薯层锈菌的患病叶面积的水平的评分系统(如Godoy，C.V.，Koga，L.J.&Canteri，M.G.Graphical scale forassessment of soybean rust severity.Fitopatologia brasileira 31:063-068.2006中所述)。

图2显示了本发明实施例中使用的植物转化载体的示意图，所述植物转化载体含有在欧芹泛素启动子控制下的Myb41 DNA片段。

图3显示了位置氨基酸保守性的图。每列：星数表示保守程度(更多的星表示更高的保守程度)；星号下面的第一个字母/“-”是SEQ ID NO.2中遇到的相应氨基酸(或比对空位)；下面的所有字母/“-”以频率递减的顺序表示氨基酸，或用“-”表示同源Myb 41基因中遇到的比对空位。

图4显示了本发明的Myb41序列(SEQ ID NO.2)和通过其UniProt标识符鉴定的同源物的相应序列的多重比对。氨基酸序列仅针对顶部序列SEQ ID NO.2给出，对于每个位置的每个其他序列，仅指示不同的氨基酸或空位的“-”(“.”表示“与顶部序列中相同的氨基酸”)。

图5显示了源自表达Myb41过表达载体构建体的9个独立转化事件(每个事件11-12株植物)的107株转基因大豆植物的评分结果。使用T1代植物进行实验。通过PCR检查植物的转基因。弃去非转基因植物。用豆薯层锈菌的孢子接种携带Myb41表达盒的T1大豆植物。通过RT-PCR检查Myb41基因的表达。在接种后14天对所有叶片上的患病叶片面积进行评估。在所有叶片上显示真菌菌落或强烈黄化/褐变的叶片面积的百分比的平均值被认为是患病叶片面积。与非转基因对照植物平行评估表达Myb41(通过RT-PCR检查表达)的所有107株大豆T1植物。表达Myb41的植物和野生型对照植物的患病叶面积的平均值显示在图5中。与非转基因对照植物相比，Myb41的过表达显著地(***:p<0.001)将患病叶面积减少33.5％。

序列简述

发明详述

本发明聚焦于Myb41用于保护植物对抗真菌感染和此类感染性疾病的进展的应用。

本发明的技术教导在本文中使用语言手段，特别是通过使用科学和技术术语来表达。然而，本领域技术人员理解，如果仅因为存在表达教导的多种方式，每种方式必然不能完全表达所有概念性连接，则语言手段(如它们可能是详细和精确的)仅可以近似技术教导的全部内容，因为每种表达必然必须结束。考虑到这一点，本领域技术人员理解，本发明的主题是本文表示的或通过书面描述的固有约束以大致方式表达的各个技术概念的总和。特别地，本领域技术人员将理解，各个技术概念的含义在本文中作为在技术上合理的情况下拼写概念的每个可能组合的缩写来进行，使得例如三个概念或实施例A、B和C的公开是概念A+B、A+C、B+C、A+B+C的简写注释。

如本文所用的，单数和单数形式的术语，如“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指代物，除非内容另有明确规定。因此，例如，提及“植物”、“该植物”或“一个植物”还包括多个植物；此外，根据上下文，术语“植物”的使用还可以包括该植物的或通过杂交由其衍生的植物的遗传上相似或相同的后代；实际上，术语“核酸”的使用任选包括该核酸分子的许多拷贝；类似地，术语“探针”任选(并且通常)涵盖许多相似或相同的探针分子。同样如本文所用，词语“包含(comprising)”或变体，如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”将被理解为暗示包括所述元素、整数或步骤，或元素、整数或步骤的组，但不排除任何其他元素、整数或步骤，或元素、整数或步骤的组。

如本文所用的，术语“和/或”是指并涵盖一个或多个相关所列项目的任何和所有可能的组合，以及在替代方案(“或”)中解释时缺乏组合。术语“包含”还涵盖术语“由……组成”。

关于可测量值(例如质量、剂量、时间、温度、序列同一性等的量)使用时，术语“约”是指指定值的±0.1％、0.25％、0.5％、0.75％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％或甚至20％的变化以及指定值。因此，如果给定的组合物被描述为包含“约50％X”，则应当理解，在一些实施方案中，组合物包含50％X，而在其他实施方案中，其可以包含40％至60％X(即50％±10％)的任何值。

如本文所用的，术语“基因”是指生物化学信息，在核酸中实现时，其可以转录成基因产物，即另外的核酸，优选RNA，并且优选还可以翻译成肽或多肽。因此，该术语还用于表示类似于所述信息的核酸部分和这种核酸的序列(本文中也称为“基因序列”)。

同样如本文所用的，术语“等位基因”是指基因的变化，其特征在于与野生型基因序列相比，基因序列中的一个或多个特定差异，无论是否存在其他序列差异。本发明的等位基因或核苷酸序列变体以递增的优选顺序与野生型基因的核苷酸序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％-84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸“序列同一性”。相应地，在“等位基因”是指用于表达肽或多肽的生物化学信息时，等位基因的相应核酸序列以递增的优选顺序与相应的野生型肽或多肽具有至少30％、40％、50％、60％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％-84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸“序列同一性”。

氨基或核酸序列的突变或改变可以是取代、缺失或插入中的任一种；术语“突变”或“改变”还涵盖这些的任意组合。在下文中，通过参考氨基酸序列突变更详细地描述了所有三种特定的突变方式；相应的教导适用于核酸序列，使得“氨基酸”被“核苷酸”替换。

“取代”通过提供原始氨基酸，然后是氨基酸序列内的位置编号，接着是取代的氨基酸来描述。例如，位置120处的组氨酸被丙氨酸取代被指定为“His120Ala”或“H120A”。

“缺失”通过提供原始氨基酸，然后是氨基酸序列内的位置编号，接着是“*”或“-”来描述。因此，位置150处的甘氨酸的缺失被指定为“Gly150*”、“G150*”、“Gly150-”或“G150-”。或者，缺失由例如“D183和G184的缺失”表示。

“插入”通过提供原始氨基酸，然后是氨基酸序列内的位置编号，接着是原始氨基酸和另外的氨基酸来描述。例如，在位置180处插入紧邻甘氨酸的赖氨酸将被指定为“Gly180GlyLys”或“G180GK”。插入多于一个氨基酸残基时，如，例如在Gly180后插入Lys和Ala，这可以表示为：Gly180GlyLysAla或G180GKA。在取代和插入发生在相同位置的情况下，这可以表示为S99SD+S99A或简称为S99AD。在插入与现有氨基酸残基相同的氨基酸残基的情况下，显然出现命名法中的简并性。如果例如在上述实例中在甘氨酸后插入甘氨酸，则这将由G180GG来表示。

包含多个改变的变体由“+”分开，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”表示在位置170和195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。或者，多个改变可以通过空格或逗号分开，例如分别为R170Y G195E或R170Y，G195E。

可以在一个位置处引入不同的改变的情况下，不同的改变由逗号分开，例如“Arg170Tyr，Glu”表示在位置170处的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。或者，不同的改变或任选的取代可以在括号中指示，例如Arg170[Tyr，Gly]或Arg170{Tyr，Gly}或简称R170[Y，G]或R170{Y，G}。

关于氨基酸取代的一个特殊方面是保守突变，其通常似乎对蛋白质折叠具有最小的影响，导致与亲本肽或多肽的肽或多肽性质相比，基本上保持了相应肽或多肽变体的肽或多肽性质。保守突变是其中一个氨基酸被替换为相似氨基酸的突变。对于％相似性的确定，以下适用，其也根据BLOSUM62矩阵，其是用于数据库搜索和序列比对的最常用的氨基酸相似性矩阵之一：

氨基酸A与氨基酸S相似

氨基酸D与氨基酸E、N相似

氨基酸E与氨基酸D、K和Q相似

氨基酸F与氨基酸W、Y相似

氨基酸H与氨基酸N、Y相似

氨基酸I与氨基酸L、M和V相似

氨基酸K与氨基酸E、Q和R相似

氨基酸L与氨基酸I、M和V相似

氨基酸M与氨基酸I、L和V相似

氨基酸N与氨基酸D、H和S相似

氨基酸Q与氨基酸E、K和R相似

氨基酸R与氨基酸K和Q相似

氨基酸S与氨基酸A、N和T相似

氨基酸T与氨基酸S相似

氨基酸V与氨基酸I、L和M相似

氨基酸W与氨基酸F和Y相似

氨基酸Y与氨基酸F、H和W相似

保守氨基酸取代可以在功能性蛋白质(如肽或多肽)的多肽序列的全长序列上发生。优选，此类突变不属于肽或多肽的功能结构域。根据本发明，Myb41基因是编码Myb41多肽的基因。

在与SEQ ID NO.2的比对中，本发明的Myb41蛋白优选在以下不同：

-在位置89、90、92、93、96、97、99、100、102、103、105、106、108、114和170中的任意处与SEQ ID NO.2的相应氨基酸在3个或更少，更优选在2个或更少，甚至更优选在1个且甚至更优选在0个位置处不同，

-在位置15、17、21、22、25、28、29、33、37、40、44、45、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、59、60、61、62、63、64、74、78、81、82、86、87、89、90、92、93、96、97、99、100、101、102、103、104、105、106、108、109、114和170处与SEQ ID NO.2的相应氨基酸更优选在3个或更少，甚至更优选在2个或更少，甚至更优选1个并且甚至更优选0个位置处不同，

-在位置2、15、17、18、21、22、25、28、29、33、35、37、40、41、44、45、46、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、59、60、61、62、63、64、67、68、74、75、78、81、82、86、87、89、90、92、93、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、108、109、110、111、112、114、123、125、128和170处与SEQ ID NO.2的相应氨基酸更优选在3个或更少，甚至更优选在2个或更少，甚至更优选1个并且甚至更优选0个位置处不同，

-或，在位置2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、13、14、15、16、17、18、20、21、22、24、25、28、29、32、33、35、37、38、40、41、44、45、46、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、70、71、73、74、75、78、79、80、81、82、83、86、87、89、90、91、92、93、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、108、109、110、111、112、113、114、115、116、120、121、122、123、125、126、128、129、130、131、132、133、134、136、137、139、146、158、166、170、171、191、243、248、258、269和272处与SEQ ID NO.2的相应氨基酸更优选在5个或更少，甚至更优选在4个或更少，甚至更优选在3个或更少，甚至更优选在2个或更少，甚至更优选1个并且甚至更优选0个位置处不同，只要位置89、90、92、93、96、97、99、100、102、103、105、106、108、114和170处的氨基酸是保守的。

因此，在本发明的Myb41蛋白与SEQ ID NO.2的比对中，优选保留SEQ ID NO.2的至少以下位置：89、90、92、93、96、97、99、100、102、103、105、106、108、114和170。此外，本发明的Myb41蛋白优选包含最小共有序列SEQ ID NO.4。更优选，保留SEQ ID NO.2的至少以下位置:15、17、21、22、25、28、29、33、37、40、44、45、46、48、50、51、52、53、54、55、56、57、59、60、61、62、63、64、74、78、81、82、86、87、89、90、92、93、96、97、99、100、101、102、103、104、105、106、108、109、114和170。甚至更优选，保留SEQ ID NO.2的至少以下位置：2、15、17、18、21、22、25、28、29、33、35、37、40、41、44、45、46、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、59、60、61、62、63、64、67、68、74、75、78、81、82、86、87、89、90、92、93、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、108、109、110、111、112、114、

123、125、128和170。并且最优选保留SEQ ID NO.2的至少以下位置：2、3、5、6、7、8、9、10、11、13、14、15、16、17、18、20、21、22、24、25、28、29、32、33、35、37、38、40、41、44、45、46、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、70、71、73、74、75、78、79、80、81、82、83、86、87、89、90、91、92、93、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、108、109、110、111、112、113、114、115、116、120、121、122、123、125、126、128、129、130、131、132、133、134、136、137、139、146、158、166、170、171、191、243、248、258、269和272。

在比对中在本发明的Myb41蛋白不同于SEQ ID NO.2或5的那些位置处，即，在根据SEQ ID NO.2的编号中的位置未被保留的情况下，差异优选是根据图3中在相应位置处描绘的氨基酸或空位和/或是拟磷取代。因此，优选根据图3提供的氨基酸或空位选择SEQ IDNO.2的氨基酸的任何缺失或替换。

除了在上述位置选择氨基酸或缺失之外，Myb41蛋白还可以包含一个插入。可接受的插入的实例在图4中给出。优选在Myb41蛋白包含插入的情况下，该插入在根据SEQ IDNO.2的编号中仅在根据图4发现插入的那些氨基酸之间。插入可以是任何长度，优选1至70个氨基酸，甚至更优选1至50个氨基酸，且最优选1至28个氨基酸。

在本发明的Myb41蛋白包含拟磷突变的特殊情况下，该突变优选是或包含根据SEQID NO.2编号的取代S251E或S251D。包含这种拟磷取代的相应的优选Myb41氨基酸序列由SEQ ID NO.6、7、8或9表示。拟磷突变使得本发明的Myb41蛋白处于与Myb41的磷酸化形式相似的状态，从而避免了对磷酸化步骤的需要并增加了激活形式的Myb41的组成型可用性。这又降低了Myb41产生与真菌抗性发生之间的延迟。

以下UniProt条目基于其在2019年11月5日的相应序列描述了拟南芥的Myb41蛋白及其同源物：Q9M0J5(MYB41_ARATH)、K7LU39(K7LU39_SOYBN)、A0A445HNS7(A0A445HNS7_GLYSO)、A0A445KFX1(A0A445KFX1_GLYSO)、I1KQR0(I1KQR0_SOYBN)、R0GQH1(R0GQH1_9BRAS)、D7MDM8(D7MDM8_ARALL)、V4LUX5(V4LUX5_EUTSA)、A0A0D3A772(A0A0D3A772_BRAOL)、M4EBX2(M4EBX2_BRARP)、A0A398AMS3(A0A398AMS3_BRACM)、A0A078G2Y0(A0A078G2Y0_BRANA)、A0A0D3DGI8(A0A0D3DGI8_BRAOL)、A0A078JP44(A0A078JP44_BRANA)、A0A397KYM7(A0A397KYM7_BRACM)、A0A3S3NZN7(A0A3S3NZN7_9MAGN)、M4E620(M4E620_BRARP)、A0A078GXG4(A0A078GXG4_BRANA)、A0A1P8B402(A0A1P8B402_ARATH)、A0A2U1Q9L5(A0A2U1Q9L5_ARTAN)、A0A2U1LGR0(A0A2U1LGR0_ARTAN)、A0A3Q7JEJ1(A0A3Q7JEJ1_SOLLC)、A0A3N7G9J4(A0A3N7G9J4_POPTR)和A0A498JL09(A0A498JL09_MALDO)。优选，本发明的Myb41蛋白是任何上述同源物，或与SEQ ID NO.2比对时，仅通过根据图3的氨基酸、缺口或缺失和/或根据图4的位置处的插入而与相应的同源物序列不同。甚至更优选，本发明的Myb41蛋白是任何上述同源物，或与SEQ ID NO.2比对时，仅通过根据图3的氨基酸、缺口或缺失而与相应的同源物序列不同。

最优选，本发明的Myb41蛋白包含以下蛋白或由以下蛋白组成：SEQ ID NO.2的蛋白质。

本发明的Myb41基因优选是

(i)与SEQ ID NO.1或其功能性片段或其剪接变体具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性的核酸序列；

(ii)编码与SEQ ID NO.2或5具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性的蛋白质或其功能性片段的核酸序列；

(iii)能够在严格条件下与根据(i)或(ii)的任何核酸的互补序列杂交的核酸；或

(iv)与上述(i)至(iii)的核酸编码相同的Myb41蛋白，但由于遗传密码的简并性而不同于上述(i)至(iii)的核酸的核酸。

与亲本蛋白质或核酸相比时，蛋白质或核酸变体可以通过它们的序列同一性来定义。序列同一性通常以“％序列同一性”或“％同一性”提供。为了在第一步中确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比，在这两个序列之间产生成对序列比对，其中两个序列在其完整长度上比对(即，成对全局比对)。用实施Needleman和Wunsch算法的程序(J.Mol.Biol.(1979)48，第443-453页)产生比对，优选通过使用程序“NEEDLE”(The European MolecularBiology Open Software Suite(EMBOSS))，其具有程序默认参数(gapopen＝10.0，gapextend＝0.5和matrix＝EBLOSUM62)。出于本发明的目的，优选的比对是可以确定最高序列同一性的比对。

以下实施例旨在说明两个核苷酸序列，但相同的计算适用于蛋白质序列：

SEQ A：AAGATACTG长度：9个碱基

SEQ B：GATCTGA长度：7个碱基

因此，较短的序列是序列B。

产生显示两个序列在其完整长度上的成对全局比对导致

比对中的“|”符号表示相同的残基(其意指DNA的碱基或蛋白质的氨基酸)。相同残基的数目为6。

比对中的符号“-”指示缺口。通过序列B内的比对引入的缺口数为1。在序列B的边界处通过比对引入的缺口数为2，并且在序列A的边界处为1。

显示比对序列在其整个长度上的比对长度为10。

因此根据本发明产生在其整个长度上显示较短序列的成对比对导致：

因此根据本发明产生在其整个长度上显示序列A的成对比对导致：

因此根据本发明产生在其整个长度上显示序列B的成对比对导致：

显示较短序列在其整个长度上的比对长度为8(存在一个缺口，其在较短序列的比对长度中是考虑因素)。

因此，在其整个长度上显示序列A的比对长度将为9(意味着序列A是本发明的序列)，在其整个长度上显示序列B的比对长度将为8(意味着序列B是本发明的序列)。

在比对两个序列后，在第二步中，应从比对中确定同一性值。因此，根据本说明书，以下同一性百分比的计算适用：

％-同一性＝(相同残基/在其完整长度上显示本发明的相应序列的比对区域的长度)*100。因此，与根据本发明的两个氨基酸序列的比较相关的序列同一性通过将相同残基数除以比对区域的长度来计算，所述比对区域在其完整长度上显示本发明的相应序列。将该值乘以100以给出“％-同一性”。根据上文提供的实例，％-同一性为：对于作为本发明序列的序列A(6/9)*100＝66.7％；对于序列B，本发明的序列(6/8)*100＝75％。

如本文所定义的术语“杂交”是其中基本上互补的核苷酸序列彼此退火的过程。杂交过程可以完全在溶液中发生，即两种互补核酸都在溶液中。杂交过程也可以在互补核酸之一固定于基质(如磁珠、琼脂糖珠或任何其他树脂)的情况下发生。杂交过程还可以在互补核酸之一固定于固体支持物(如硝酸纤维素或尼龙膜)或通过例如光刻法固定于例如硅质玻璃支持物(后者称为核酸阵列或微阵列或核酸芯片)的情况下发生。为了允许杂交发生，通常将核酸分子热变性或化学变性以将双链解链成两条单链和/或从单链核酸中除去发夹或其他二级结构。

术语“严格性”是指发生杂交的条件。杂交的严格性受诸如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组成的条件影响。通常，选择低严格性条件为在限定的离子强度和pH下比特定序列的热解链点(Tm)低约30℃。中等严格条件是温度比Tm低20℃时，并且高严格条件是温度比Tm低10℃时。高严格杂交条件通常用于分离与靶核酸序列具有高序列相似性的杂交序列。然而，由于遗传密码的简并性，核酸可能在序列上偏离并且仍然编码基本上相同的多肽。因此，有时可能需要中等严格性杂交条件来鉴定此类核酸分子。

“Tm”是在限定的离子强度和pH下的温度，在该温度下50％的靶序列与完全匹配的探针杂交。Tm取决于溶液条件以及探针的碱基组成和长度。例如，较长的序列在较高温度下特异性地杂交。从低于Tm约16℃至32℃获得最大杂交速率。杂交溶液中一价阳离子的存在降低了两条核酸链之间的静电排斥，从而促进杂合体形成；对于高达0.4M的钠浓度，这种效应是明显的(对于较高浓度，这种效应可以忽略)。甲酰胺降低DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度，每百分比甲酰胺降低0.6至0.7℃，并且添加50％甲酰胺允许杂交在30至45℃下进行，尽管杂交速率将降低。碱基对错配降低了双链体的杂交速率和热稳定性。平均而言，且对于大的探针，每％碱基错配，Tm降低约1℃。根据杂合体的类型，可以使用以下等式计算Tm：

·DNA-DNA杂合体(Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138：267-284，198 4)：

Tm＝81.5℃+16.6xlog([Na+]{a})+0.41x％[G/C{b}]-500×[L{c}]-1-0.61x％甲酰胺

·DNA-RNA或RNA-RNA杂合体：

Tm＝79.8+18.5(log10[Na+]{a})+0.58(％G/C{b})+11.8(％G/C{b})2-820/L{c}

·寡-DNA或寡-RNAd杂合体：

对于<20个核苷酸：Tm＝2({In})

对于20-35个核苷酸：Tm＝22+1.46({In})

其中：

{a}或对于其它一价阳离子，但仅在0.01-0.4M范围内准确

{b}仅在30％至75％范围内对％GC准确

{c}L＝碱基对中双链体的长度

{g}寡，寡核苷酸

{In}引物的有效长度＝2×(G/C的数量)+(A/T的数量)

可以使用许多已知技术中的任何一种来控制非特异性结合，如，例如用含蛋白质的溶液封闭膜，向杂交缓冲液中添加异源RNA、DNA和SDS，以及用RNA酶处理。

对于非相关探针，可以通过改变(i)逐渐降低退火温度(例如从68℃至42℃)或(ii)逐渐降低甲酰胺浓度(例如从50％至0％)中的一种来进行一系列杂交。本领域技术人员知道可以在杂交期间改变的各种参数并且所述参数将维持或改变严格条件。

除了杂交条件外，杂交的特异性通常还取决于杂交后洗涤的功能。为了去除由非特异性杂交产生的背景，用稀盐溶液洗涤样品。这种洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度和温度：盐浓度越低和洗涤温度越高，洗涤的严格性越高。洗涤条件通常在杂交严格性下或低于杂交严格性下进行。阳性杂交产生的信号至少是背景信号的两倍。

通常，用于核酸杂交测定或基因扩增检测程序的合适的严格条件如上所述。也可以选择更严格或更不严格的条件。本领域技术人员知道可以在洗涤期间改变并且将维持或改变严格条件的各种参数。

例如，长于50个核苷酸的DNA杂合体的典型高严格性杂交条件包括在65℃下在1×SSC中或在42℃下在1×SSC和50％甲酰胺中杂交，然后在65℃下在0.3×SSC中洗涤。长于50个核苷酸的DNA杂合体的中等严格杂交条件的实例包括在50℃下在4×SSC中或在40℃下在6×SSC和50％甲酰胺中杂交，然后在50℃下在2×SSC中洗涤。杂合体的长度是杂交核酸的预期长度。杂交已知序列的核酸时，可以通过比对序列并鉴定本文所述的保守区域来确定杂合体长度。1×SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠；杂交溶液和洗涤溶液可以另外包括5×Denhardt’s试剂、0.5-10％SDS、100μg/ml变性的片段化鲑鱼精子DNA、0.5％焦磷酸钠。高严格条件的另一个实例是在65℃下在包含0.1×SDS和任选的5×Denhardt’s试剂、100μg/ml变性的片段化鲑鱼精子DNA、0.5％焦磷酸钠的0.1×SSC中杂交，然后在65℃下在0.3×SSC中洗涤。

为了确定严格性水平，可以参考Sambrook等(2001)Molecular Cloning:ALaboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，CSH，New York或Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989和年度更新)。

如本文所用的，术语“分离的DNA分子”是指至少部分地与通常在其天然或自然状态下与其结合的其他分子分离的DNA分子。术语“分离的”优选是指至少部分地与通常在其天然或自然状态下位于DNA分子侧翼的一些核酸分离的DNA分子。因此，在本文中认为与其通常不相关的调节或编码序列融合的DNA分子(例如作为重组技术的结果)是分离的。当整合到宿主细胞的染色体中或与其他DNA分子一起存在于核酸溶液中时，此类分子被认为是分离的，因为它们不处于其天然状态中。

可以使用本领域技术人员熟知的任意数量的方法来分离和操纵如本文所公开的多核苷酸或其片段。例如，聚合酶链式反应(PCR)技术可用于扩增特定的起始多核苷酸分子和/或产生原始分子的变体。多核苷酸分子或其片段也可以通过其他技术获得，如通过化学方法直接合成片段，如通常通过使用自动化寡核苷酸合成仪来实施。多核苷酸可以是单链(ss)或双链(ds)。“双链”是指在充分互补、反向平行的核酸链之间发生的碱基配对，以形成双链核酸结构，通常在生理相关条件下进行。该方法的实施方案包括其中多核苷酸是选自有义单链DNA(ssDNA)、有义单链RNA(ssRNA)、双链RNA(dsRNA)、双链DNA(dsDNA)、双链DNA/RNA杂合体、反义ssDNA或反义ssRNA中的至少一种；可以使用这些类型中的任何一种的多核苷酸的混合物。

如本文所用的，提及核酸或多肽时，“重组”表示由于人类应用重组技术，如通过多核苷酸限制和连接，通过多核苷酸重叠-延伸，或通过基因组插入或转化，这种材料已被改变。如果(a)该核苷酸序列存在于除其天然环境外的环境中，例如由于(i)克隆至任何类型的人工核酸载体中或(ii)移动或拷贝到原始基因组的另一个位置，或者如果(b)该核苷酸序列被诱变以使其不同于野生型序列，则基因序列开放阅读框是重组的。术语重组还可以指具有重组材料的生物体，例如包含重组核酸的植物是重组植物。

术语“遗传修饰的”或“转基因的”在本文中可互换使用，并且是指生物体，优选植物或其部分，或包含异源多核苷酸的核酸。优选，异源多核苷酸在基因组内稳定地整合，使得多核苷酸传递给连续世代。异源多核苷酸可以单独或作为重组表达盒的一部分整合到基因组中。异源多核苷酸优选是顺式基因的或基因内的。“转基因的”和“遗传修饰的”在本文中用于指其基因型已被异源核酸的存在如此改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括最初如此改变的那些转基因生物体或细胞，以及通过杂交或无性繁殖从初始转基因生物体或细胞产生的那些。“重组”生物体优选是“转基因”生物体。如本文所用的术语“转基因”不旨在涵盖通过常规植物育种方法(例如杂交)或通过天然发生的事件(如，例如自花受精、随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变)来改变基因组(染色体或额外的染色体)。

如本文所用的，“诱变的”是指与相应的野生型生物体或核酸的遗传物质的序列相比，在其天然遗传物质的生物分子序列中具有改变的生物体或其核酸，其中遗传物质中的改变是通过人类行为来诱导和/或选择。可用于产生诱变的生物体或DNA的人类行为的实例包括但不限于用化学诱变剂(如EMS)处理并随后用除草剂选择；或通过用x-射线处理植物细胞并随后用除草剂选择。本领域已知的任何方法可用于诱导突变。诱导突变的方法可以在遗传物质中的随机位置诱导突变，或可以在遗传物质中的特定位置诱导突变(即，可以是定向诱变技术)，如通过使用基因成形技术。除了非特异性突变之外，根据本发明，还可以通过使用对特定位点具有偏好性或甚至特异性的诱变手段来诱变核酸，从而产生根据本发明的人工诱导的可遗传等位基因。此类意指例如位点特异性核酸酶，包括例如锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(TALENS)(Malzahn等，Cell Biosci，2017，7:21)和具有工程化的crRNA/tracrRNA(例如，作为单向导RNA，或作为修饰的crRNA和tracrRNA分子，其形成双分子向导)的成簇规则间隔的短回文重复序列/CRISPR相关核酸酶(CRISPR/Cas)，以及使用这种核酸酶靶向已知基因组位置的方法，是本领域公知的(参见Bortesi和Fischer，2015，Biotechnology Advances 33：41-52；以及Chen和Gao，2014，Plant Cell Rep 33：575-583的综述，以及其中的参考文献)。

如本文所用的，“遗传修饰的生物体”(GMO)是其遗传特征含有由人类努力产生的改变的生物体，所述改变引起转染，所述转染导致用来自另一种或“源”生物体的遗传物质或用合成的或修饰的天然遗传物质转化靶生物体，或保留插入的遗传物质的作为其后代的生物体。源生物体可以是不同类型的生物体(例如，GMO植物可以含有细菌遗传物质)或来自相同类型的生物体(例如，GMO植物可以含有来自另一种植物的遗传物质)。

如本文所用的，“野生型”或“相应的野生型植物”意指生物体或其遗传物质的典型形式，如其通常存在的，区别于例如诱变和/或重组形式。类似地，“对照细胞”或“类似的野生型植物、植物组织、植物细胞或宿主细胞”分别意指缺乏本文公开的本发明的特定多核苷酸的植物、植物组织、植物细胞或宿主细胞。因此，术语“野生型”的使用不旨在暗示植物、植物组织、植物细胞或其他宿主细胞在其基因组中缺乏重组DNA，和/或不具有与本文公开的那些不同的真菌抗性特征。

如本文所用的，“后代”是指任何一代植物。后代或后代植物可以来自任何子代，例如F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7等。在一些实施方案中，后代或后代植物是第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十代植物。

术语“植物”在本文中以其最广泛的含义使用，因为它涉及有机材料，并且旨在涵盖作为植物分类界成员的真核生物，其实例包括但不限于单子叶和双子叶植物、维管植物、蔬菜、谷物、花、树、草本植物、灌木、草、藤本植物、蕨类植物、苔藓、真菌和藻类等，以及用于无性繁殖的克隆、吸芽和植物部分(例如插条、管道、芽、根茎、地下茎、丛、冠、鳞茎、球茎、块茎、根茎、组织培养中产生的植物/组织等)。除非另有说明，否则术语“植物”是指完整植物、其任何部分或衍生自植物的细胞或组织培养物，包括以下的任何一种：完整植物、植物组分或器官(例如叶、茎、根等)、植物组织、种子、植物细胞和/或其后代。植物细胞是植物的生物细胞，其取自植物或通过培养取自植物的细胞而衍生。

本发明特别涉及一般的植物，并且优选涉及作物植物，即选自分类科蝶形花科、十字花科和禾本科成员的植物，最优选大豆。更优选，作物植物选自以下：

-分类学菜豆族(Phaseoleae)，更优选木豆属(Cajanus)、刀豆属(Canavalia)、大豆属(Glycine)、菜豆属(Phaseolus)、豆果属(Psophocarpus)、葛属(Pueraria)或豇豆属(Vigna)，甚至更优选物种木豆(Cajanus cajan)、巴西刀豆(Canavalia brasiliensis)、直生刀豆(Canavalia ensiformis)、蔓生刀豆(Canavalia gladiata)、半野生大豆(Glycinegracilis)、大豆(Glycine max)、野大豆(Glycine soja)、宽叶菜豆(Phaseolusacutifolius)、大白芸豆(Phaseolus lunatus)、Phaseolus maculatus、四棱豆(Psophocarpus tetragonolobus)、越南葛藤(Pueraria montana)、红小豆(Vignaangularis)、黑吉豆(Vigna mungo)、绿豆(Vigna radiata)或豇豆(Vigna unguiculata)，甚至更优选以下种：半野生大豆(Glycine gracilis)、大豆(Glycine max)或野大豆(Glycine soja)，甚至更优选大豆(Glycine max)种；或

-分类学蚕豆族(Fabeae)，更优选山黧豆属(Lathyrus)、兵豆属(Lens)、豌豆属(Pisum)或野豌豆属(Vicia)，甚至更优选物种山黧豆(Lathyrus aphaca)、鹰嘴山黧豆(Lathyrus cicera)、多毛山黧豆(Lathyrus hirsutus)、赭石山黧豆(Lathyrus ochrus)、臭山黧豆(Lathyrus odoratus)、球山黧豆(Lathyrus sphaericus)、刺山黧豆(Lathyrustingitanus)、小扁豆(Lens culinaris)、豌豆(Pisum sativum)、广布野豌豆(Viciacracca)、蚕豆(Vicia faba)或长柔毛野豌豆(Vicia vellosa)；或

-分类学芸薹族(Brassiceae)，更优选芸薹属(Brassica)、两节芥属(Crambe)，萝卜属(Raphanus)或白芥属(Sinapis)，甚至更优选物种欧洲芸薹(Brassica aucheri)、巴耳氏芸薹(Brassica balearica)、巴氏芸薹(Brassica barrelieri)、波尔氏芸薹(Brassicabourgeaui)、埃塞俄比亚芸薹(Brassica carinata)、花椰菜(Brassica cretica)、Brassica deflexa、德氏芸薹(Brassica desnottesii)、Brassica drepanensis、长体芸薹(Brassica elongata)、果芸薹(Brassica fruticulosa)、葡萄汁芸薹(Brassicagravinae)、希拉里奥利芸薹(Brassica hilarionis)、加纳芸薹(Brassica incana)、岛芥菜(Brassica insularis,)、芥菜(Brassica juncea)、大果芸薹(Brassica macrocarpa)、莫氏芸薹(Brassica maurorum)、蒙大拿芸薹(Brassica montana)、欧洲油菜(Brassicanapus)、黑芸薹(Brassica nigra)、甘蓝(Brassica oleracea)、氧化型芸薹(Brassicaoxyrrhina)、平卧芸薹(Brassica procumbens)、芜菁(Brassica rapa)、Brassicarepanda、Brassica rupestris、Brassica souliei、Brassica spinescens、Brassicatournefortii、Brassica villosa或任何这些物种的杂交物种，甚至更优选欧洲油菜(Brassica napus)、黑芸薹(黑芥)、甘蓝(wild cabbage)、芜菁(田芥菜)或任何这些物种的杂交物种，甚至更优选欧洲油菜(Brassica napus)、

物种萝卜(Raphanus sativus)、

物种白芥(Sinapis alba)；或

-分类学高粱族(Tribus Andropogoneae)，簕竹族(Bambuseae)，稻族(Oryzeae)、早熟禾族(Poeae)，小麦族(Triticeae)，更优选甘蔗属(Saccharum)、玉米属(Zea)、稻属(Oryza)、燕麦属(Avena)、大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、小麦属(Triticum)，甚至更优选物种玉米(Zea mays)、水稻(Oryza sativa)、燕麦(Avena sativa)、糙伏毛燕麦(Avenastrigosa)、碱大麦(Hordeum marinum)、大麦(Hordeum vulgare)、黑麦(Secale cereale)或小麦(Triticum aestivum)，

并且优选植物是大豆。

术语“种子”包括所有类型的种子，如，例如，真种子、颖果、瘦果、果实、块茎、幼苗和类似形式。优选，“种子”是指真正的种子，除非另有说明。例如，种子可以是转基因植物或通过位点特异性诱变、通过位点偏好诱变或通过传统育种方法获得的植物的种子。传统育种方法的实例是杂交育种、自交、回交、胚拯救、内交、外交、近交、选择、无性繁殖和本领域已知的其他传统技术。

本发明特别可用于对抗植物病原真菌。根据本发明，待对抗的真菌优选是活体营养型、半活体营养型或半死体营养型真菌，更优选锈菌、霜霉病、白粉病、叶斑病、晚疫病、镰孢属和/或壳针孢属，并且甚至更优选选自以下的锈菌：

-担子菌门(Basidiomycota)，更优选分类学柄锈菌纲(Pucciniomycetes)，更优选分类学柄锈菌目(Pucciniales)，更优选分类学柄锈菌科(Pucciniaceae)，更优选分类学柄锈菌属(Pucciniaceae)，更优选分类学种禾柄锈菌(Puccinia graminis)；或

-担子菌门(Basidiomycota)，更优选分类学柄锈菌纲(Pucciniomycetes)，更优选分类学柄锈菌目(Pucciniales)，更优选分类学层锈菌科(Phakopsoraceae)，更优选分类学层锈菌属(Phakopsora)，更优选分类学种豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)或山梨层锈菌(Phakopsora meibomiae)；或

-子囊菌门(Ascomycota)，更优选分类学粪壳菌纲(Sordariomycetes)，更优选分类学肉座菌目(Hypocreales)，更优选分类学赤壳菌科(Nectriaceae)，更优选分类学镰刀菌属(Fusarium)，更优选分类学种禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)或轮枝镰刀菌(Fusarium verticillioides)。

特别优选的优点是本发明的材料和方法可用于对抗层锈菌属，特别是且最优选豆薯层锈菌的锈菌。当不处理大豆植物时，这些真菌病原体是造成大豆巨大损失的原因。因此，本发明允许通过降低真菌病原体压力来减少杀真菌剂处理的次数。

本发明特别提供了增加真菌抗性的材料，优选植物、植物部分或植物细胞，或方法。根据本发明，优选通过与相应的野生型相比降低感染速度或感染程度或延迟真菌最早感染的日子来实现真菌抗性的增加。因此，本发明的Myb41蛋白和基因适用于赋予、增强或稳定植物、植物部分或植物细胞对抗真菌病原体感染的抗性，特别是对抗活体营养型、半活体营养型或半死体营养型真菌的抗性，并且优选对抗如本文所述的真菌的抗性。此外，通过如本段所述的增加真菌抗性，本发明的Myb41蛋白和基因适用于防止、减少或延迟真菌孢子向其他田地的扩散，从而还降低种植了表达本发明的Myb41蛋白的植物的更广区域中的病原体压力。并且，通过如本段所述的增加真菌抗性，本发明的Myb41蛋白和基因适用于减少保护生长中的植物所需的杀真菌剂处理的次数。

本发明相应地提供了在植物、植物部分或植物细胞中赋予或增加真菌抗性的方法，其中所述方法包括与相应的野生型植物、野生型植物部分或野生型植物细胞相比增加所述植物、植物部分或植物细胞中Myb41的产生和/或积累的步骤。如上所述，令人惊讶的是，已知仅在控制渗透胁迫中起作用的基因可能具有增加真菌抗性的有益效果，特别是在拟南芥属之外的其他物种中。

本发明还提供了在植物、植物部分或植物细胞中赋予或增加真菌抗性的方法，其中所述方法包括与相应的野生型植物、野生型植物部分或野生型植物细胞相比，增加所述植物、植物部分或植物细胞中Myb41蛋白的表达和/或生物活性，其中所述Myb41蛋白由以下编码：

(i)与SEQ ID NO.1或其功能性片段或其剪接变体具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％同一性的外源核酸；

(iv)与上述(i)至(iii)的核酸编码相同的Myb41蛋白的外源核酸，但由于遗传密码的简并性而不同于上述(i)至(iii)的核酸。再次，该方法令人惊讶地且有益地增加了如本文所述的真菌抗性。

优选地，该方法包括以下步骤：

(a)用至少一个包含编码Myb41蛋白的外源核酸的表达盒稳定地转化植物细胞，

(b)从植物细胞再生植物；和

(c)表达所述Myb41蛋白。本发明的Myb41蛋白的表达令人惊讶地赋予或增加如本文所述的植物的真菌抗性。

优选，本发明的上述方法包括在相应的植物、植物部分或植物细胞中磷酸化Myb41蛋白的步骤，优选在SEQ ID NO.2的251位的丝氨酸处。不受任何特定理论的束缚，预期磷酸化增加功能性Myb41蛋白对植物细胞的有效性。相应地，上文描述了本发明的Myb41蛋白的拟磷形式，特别是关于SEQ ID NO.6、7、8或9。

术语“功能性”意指相应的植物、植物部分或植物细胞更可能承受病原性真菌(优选豆薯层锈菌)的企图感染。

本发明还提供了一种重组载体构建体，其包含编码Myb41蛋白的核酸，所述核酸选自：

(i)与SEQ ID NO.1或其功能性片段或其剪接变体具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性的核酸；

(ii)编码与SEQ ID NO.2或5具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性的蛋白质或其功能性片段的核酸；

(iv)与上述(i)至(iii)的核酸编码相同的Myb41蛋白，但由于遗传密码的简并性而不同于上述(i)至(iii)的核酸的核酸；

所述核酸可操作地连接启动子和转录终止序列，并且其中所述核酸不编码氨基酸序列SEQ ID NO.2的蛋白质。此类载体特别可用于转化植物以表达本发明的Myb41基因，从而赋予或增加植物、植物部分或植物细胞中的真菌抗性。

启动子优选是组成型、病原体诱导型启动子、叶肉特异性启动子或表皮特异性启动子。这些启动子中的任一种的选择允许在植物细胞中分别产生组成型增加的Myb41蛋白水平，或响应病原体感染(优选真菌病原体)而增加的水平，或特异性地增加叶肉或植物表皮细胞中的Myb41水平。

相应地，本发明提供了用根据本发明所述的一种或多种重组载体构建体转化的转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞。

并且对于真菌抗性特别有益的是，本发明提供了过表达Myb41蛋白的作物植物、作物植物部分或作物植物细胞，其中所述Myb41蛋白由以下编码：

其中根据(i)-(iv)任一个的核酸与启动子和转录终止序列可操作地连接，并且优选地其中

(a)作物植物、作物植物部分或作物植物细胞是转基因作物植物、作物植物部分或作物植物细胞，或过表达导致形成野生型基因组的人工诱导的可遗传突变；和/或

(b)其中编码Myb41的基因整合在植物、植物部分或植物细胞的基因组中，和/或

(c)其中植物或植物部分对于编码Myb41的基因是纯合的或对于编码Myb41的基因是杂合的，和/或

(d)其中处于减数分裂时，植物或植物部分对于编码Myb41的基因是非分离的或分离的，和/或

(e)其中所述编码Myb41的基因可操作地连接异源启动子，和/或

(f)其中编码Myb41的基因在植物或植物部分的基因组中在与相应的野生型Myb41基因不同的基因座处整合。

CRISPR(成簇规律间隔短回文重复序列)技术可用于修饰靶生物体的基因组，例如将任何给定的DNA片段引入基因组的几乎任何位点，用所需序列替换基因组的部分或精确缺失靶生物体基因组中的给定区域。这允许前所未有的基因组操作的精确度。

CRISPR系统最初被鉴定为属于链球菌属的细菌的适应性防御机制(WO2007/025097)。那些细菌CRISPR系统依赖于与切割蛋白复合的指导RNA(gRNA)来指导入侵病毒DNA内存在的互补序列的降解。已经显示了CRISPR系统用于各种真核生物中的遗传操作的应用(WO2013/141680、WO2013/176772、WO2014/093595)。Cas9(CRISPR/Cas系统的第一个鉴定的蛋白质)是通过两种非编码RNA：CRSIPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)的复合物引导至与PAM(前间区序列邻近基序)序列基序相邻的DNA靶序列的大单体DNA核酸酶。

此外，通过将crRNA与tracrRNA融合产生的合成RNA嵌合体(单指导RNA或sgRNA)显示出同等功能(WO2013/176772)。已经描述了来自其他来源的CRISPR系统，其包含与Cas9不同的DNA核酸酶，如Cpf1、C2c1p或C2c3p，其具有相同的功能(WO2016/0205711、WO2016/205749)。其他作者描述了其中核酸酶由DNA分子而不是RNA分子引导的系统。这种系统例如是US2016/0046963中公开的AGO系统。

几个研究小组已经发现了CRISPR切割特性可以以以前所未有的容易用于破坏几乎任何生物体基因组中的靶区域。最近变得清楚的是，提供用于修复的模板允许在几乎任何位点用几乎任何所需序列编辑基因组，将CRISPR转化为强大的基因编辑工具(WO2014/150624、WO2014/204728)。用于修复的模板被称为供体核酸，其在3'和5'端包含与靶区域互补的序列，允许在通过相应的核酸酶在靶核酸中引入双链断裂后在相应的模板中同源重组。

在给定基因组中选择靶区域的主要限制是在CRISPR相关核酸酶引入双链断裂的区域附近存在PAM序列基序的必要性。然而，各种CRISPR系统识别不同的PAM序列基序。这允许为相应的靶区域选择最合适的CRISPR系统。此外，AGO系统根本不需要PAM序列基序。

该技术可以例如应用于改变任何生物体中的基因表达，例如通过用不同强度或特异性的启动子交换靶基因上游的启动子。现有技术中公开的其他方法描述了激活或抑制转录因子与核酸酶减去CRISPR核酸酶蛋白的融合。此类融合蛋白可以与一种或多种指导核酸一起在靶生物体中表达，所述指导核酸将融合蛋白的转录因子部分指导至靶生物体中的任何所需启动子(WO2014/099744；WO2014/099750)。通过将点突变或缺失引入相应的靶基因中，例如通过诱导通常导致基因破坏的非同源末端连接(NHEJ)，可以容易地实现基因的敲除(WO2013/176772)。

因此，本发明还提供了至少50株根据本发明的作物植物的集合，更优选至少100株植物，甚至更优选至少1000株植物，甚至更优选至少100000株植物。根据本发明，优选每公顷生长至少100000株植物，更优选每公顷生长200000至800000株植物，甚至更优选每公顷生长至少250000至650000株植物。这样的植物数量优选在一公顷内观察到；因此，本发明特别有利于在每个生长季节减少使用杀真菌剂的生态周到的集约化农业。根据本发明的植物优选在田地或温室中生长。优选，作物植物是大豆植物。

根据本发明，不要求在同一田地或温室中生长的一个物种的所有作物植物都是本发明的植物。相反，如果至少约25％的一个物种的植物属于本发明，更优选至少50％，甚至更优选25％-75％，且最优选45％-70％，特别是与携带其他抗性基因或机制的植物混合或组合时，在单一栽培种植园中就足够了。与具有其他抗性基因的植物的组合可以通过间作(混合)、行式或块式进行。例如，在大豆田中，如果大约每隔一株植物是本发明的植物，则可以减少杀真菌剂处理的次数。特别优选至少25％，更优选50％-100％，甚至更优选75％-100％的不是根据本发明植物的相同田地上的那些植物包含至少一种用于增强真菌抗性的其他生物学手段，最优选其他手段选自如上所述的病原体抗性多肽的列表。

本发明还提供了用于产生与相应的野生型植物、植物部分或植物细胞相比具有增加的真菌抗性的转基因作物植物、转基因作物植物部分或转基因作物植物细胞的方法，其包括

(b)从植物、植物部分或植物细胞产生转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞；和

(c)在转基因植物、转基因植物部分或来自植物的转基因植物细胞中表达所述Myb41蛋白，

其中所述Myb41蛋白由以下编码：

所述核酸可操作地连接启动子和转录终止序列。如上所述，这种方法特别适用于在植物、植物部分或植物细胞中赋予或增加真菌抗性。

本发明还提供了一种测定植物对抗真菌的抗性的方法，包括筛选所述植物细胞中Myb41基因的过表达。如本文所述的，Myb41的过表达增加了对抗真菌感染的抗性，特别是作物植物对抗真菌感染的抗性，特别是对抗豆薯层锈菌的真菌感染的抗性。在没有渗透胁迫的情况下制备待筛选的植物是有用的，以防止不必要的Myb41表达水平的意外增加。

本发明还提供了一种用于育种真菌抗性作物植物的方法，其包括

(b)从步骤(a)的杂交获得种子；

(c)种植所述种子并使种子生长成植物；和

(d)从所述植物选择表达如上定义的Myb41蛋白的植物。除了通过转化或其他直接干扰(例如通过CRISPR介导的方法)外，这种方法有利地允许将根据本发明实现的增加的真菌抗性的性状赋予植物。因此，该育种方法有利地允许高速的植物繁殖。

在所附的实施例和附图中描述了本发明的其他优点和有益效果。

实施例

以下实施例不旨在将权利要求的范围限制于本发明，而是旨在示例性地说明某些实施方案。本领域技术人员想到的示例性方法的任何变化旨在落入本发明的范围内。

实施例1：一般方法

寡核苷酸的化学合成可以例如以已知的方式使用亚磷酰胺方法(Voet，Voet，第2版，Wiley Press New York，第896-897页)进行。为了本发明的目的进行的克隆步骤，如，例如限制性切割、琼脂糖凝胶电泳、DNA片段的纯化、核酸转移至硝酸纤维素和尼龙膜、连接DNA片段、大肠杆菌细胞的转化、细菌培养、噬菌体增殖和重组DNA的序列分析，如Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)，ISBN 0-87969-309-6所述的进行。重组DNA分子的测序用MWG-Licor激光荧光DNA测序仪按照Sanger的方法(Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74，546 3(1977))进行。

实施例2：过表达载体构建体的克隆

本申请中提及的Myb41基因的cDNA序列通过DNA合成(Geneart，Thermo FisherScientific，Waltham，Massachusetts，USA)产生。

以AscI限制性位点位于起始ATG前面并且SbfI限制性位点位于终止密码子下游的方式合成Myb41 cDNA(如SEQ ID NO.1所示)。使用限制酶SbfI和AscI(NEB Biolabs)消化合成的DNA，并以全长片段以有义方向位于欧芹泛素启动子和根癌农杆菌衍生的胭脂碱合酶终止子(t-nos)之间的方式连接到SbfI/AscI消化的二元植物转化载体中。PcUbi启动子调节欧芹ubi4-2基因(EMBL登录号X64345)的组成型表达(Kawalleck等，1993PlantMolecular Biology 21(4)：673-684)。

在本申请中使用的双元植物转化载体由以下组成：(1)用于细菌选择的卡那霉素抗性盒；(2)农杆菌中的pVS1复制起点；(3)用于在大肠杆菌中稳定维持的ColE1复制起点；和(4)在右边界和左边界之间的双突变AHAS(乙酰羟酸合酶大亚基)选择标记，其以在其天然启动子的控制下源自拟南芥(P-AtAHASL5’，参见图2)。将连接反应物转化到大肠杆菌(DH5α)中，微量制备并通过特异性限制性消化进行筛选。对阳性克隆进行测序并进行大豆转化。

实施例3：大豆转化

将表达载体构建体(参见实施例2)转化到大豆中。

3.1大豆种子的灭菌和萌发

实际上，任何大豆品种的任何种子都可以用于本发明的方法中。多种大豆栽培种(包括Jack、Wiliams 82、Jake、Stoddard和Resnik)适合于大豆转化。将大豆种子在具有氯气的密室中灭菌，所述氯气通过将3.5ml 12N HCl逐滴加入到具有紧密配合的盖子的干燥器中的100ml漂白剂(5.25％次氯酸钠)中产生。在密室中24至48小时后，取出种子，并将大约18至20粒种子涂布在100mm培养皿中的含有或不含5μM 6-苄基-氨基嘌呤(BAP)的固体GM培养基上。没有BAP的幼苗更长，并且根发育，特别是次生根和侧根形成。BAP通过形成更短且更粗壮的幼苗来增强幼苗。

将在25℃下在光照(>100μEinstein/m²s)下生长的七日龄幼苗用作三种外植体类型的外植体材料。此时，种皮裂开，并且上胚轴连同单身复叶已经长出到至少子叶的长度。上胚轴应为至少0.5cm以避开子叶-茎节组织(因为大豆栽培品种和种子批次在发育时间上可能不同，所以萌发阶段的描述比特定的萌发时间更准确)。

对于整株幼苗的接种，参见方法A(实施例3.3和3.3.2)，或叶外植体的接种，参见方法B(实施例3.3.3)。

对于方法C(参见实施例3.3.4)，从每个幼苗移除下胚轴和一个半子叶或者两片子叶的一部分。然后将幼苗置于繁殖培养基上2至4周。幼苗产生若干分枝的芽以从其获得外植体。大多数外植体源自从顶芽生长的小植株。这些外植体优选用作靶组织。

3.2-农杆菌培养物的生长和制备

通过将携带所需二元载体(例如H.Klee.R.Horsch和S.Rogers 1987Agrobacterium-Mediated Plant Transformation and its further Applications toPlant Biology；Annual Review of Plant Physiology Vol.38：467-486)的农杆菌(例如根癌农杆菌或发根农杆菌)划线到固体YEP生长培养基(YEP培养基：10g酵母提取物，10g细菌蛋白胨，5g NaCl。调节pH至7.0，并且用H₂O调节至最终体积1升，对于YEP琼脂平板，加入20g琼脂，高压灭菌)上并在25℃孵育直至出现菌落(约2天)制备农杆菌培养物。根据Ti或Ri质粒、二元载体和细菌染色体上存在的选择标记基因，在YEP固体和液体培养基中使用不同的选择化合物进行根癌农杆菌和发根农杆菌选择。各种农杆菌菌株可用于转化方法。

大约两天后，挑取单个菌落(用无菌牙签)，并接种到有抗生素的50mL液体YEP，并以175rpm(25℃)振荡直至OD₆₀₀达到0.8-1.0之间(大约2d)。制备用于转化的工作甘油储备液(15％)，并将1ml农杆菌储液等分到1.5ml Eppendorf管中，然后储存在-80℃。

在外植体接种前一天，将200ml YEP用5μl至3ml工作农杆菌储液于500ml锥形烧瓶中接种。将烧瓶在25℃下振荡过夜，直到OD₆₀₀在0.8和1.0之间。在制备大豆外植体之前，通过在20℃下以5,500×g离心10min使农杆菌沉淀。将沉淀重悬于液体CCM中至所需密度(OD₆₀₀ 0.5-0.8)，并在使用前置于室温下至少30min。

3.3-外植体制备和共培养(接种)

3.3.1方法A：转化当日外植体制备。

此时的幼苗具有至少0.5cm但通常在0.5-2cm之间的伸长的上胚轴。已经成功地使用了长至4cm的伸长的上胚轴。随后在i)具有或没有一些根的情况下，ii)具有部分、一片或两片子叶的情况下制备外植体，去除所有预形成的叶，包括顶端分生组织，并且使用锋利的解剖刀用几次切割损伤位于第一组叶处的节。

在茎节处的这种切割不仅诱导农杆菌感染，而且使腋生分生组织细胞分散并损害预形成的芽。创伤和制备后，将外植体置于培养皿中，并随后与液体CCM/农杆菌混合物共培养30分钟。然后从液体培养基中取出外植体，并铺在具有固体共培养培养基的15×100mm培养皿上的无菌滤纸上。将受伤的靶组织放置成使得它们与培养基直接接触。

3.3.2改进的方法A：上胚轴外植体制备

将从4至8天龄幼苗制备的大豆上胚轴片段用作用于再生和转化的外植体。将大豆栽培品种(cv.)L00106CN、93-41131和Jack的种子在具有或不具有细胞分裂素的1/10MS盐或类似组成的培养基中萌发芽4至8天。通过从茎切片中除去子叶节和茎节来制备上胚轴外植体。将上胚轴切成2至5个片段。特别优选的是连接到包含腋生分生组织的初生或更高节的节段。

将外植体用于农杆菌感染。将携带具有目的基因(GOI)和AHAS、bar或dsdA选择标记基因的质粒的农杆菌AGL1在含有适当抗生素的LB培养基中培养过夜，收获并重悬于含有乙酰丁香酮的接种培养基中。将新鲜制备的上胚轴片段在农杆菌悬浮液中浸泡30至60min，然后将外植体在无菌滤纸上吸干。然后将接种的外植体在具有L-半胱氨酸和TTD以及用于增加T-DNA递送的其他化学品(如乙酰丁香酮)的共培养基上培养2至4天。然后将感染的上胚轴外植体置于含有选择剂如灭草烟(用于AHAS基因)、草铵膦(用于bar基因)或D-丝氨酸(用于dsdA基因)的芽诱导培养基上。将再生的芽在具有选择剂的伸长培养基上传代培养。

为了再生转基因植物，然后将片段在含有细胞分裂素(如BAP、TDZ和/或激动素)的培养基上培养以诱导芽。4至8周后，将培养的组织转移到具有较低浓度细胞的分裂素的培养基中用于芽伸长。将伸长的芽转移到具有生长素的培养基中用于生根和植物发育。再生多个芽。

收集了许多显示强cDNA表达的稳定转化区段。大豆植株由上胚轴外植体再生。证明了有效的T-DNA递送和稳定的转化区段。

3.3.3方法B：叶外植体

为了制备叶外植体，从下胚轴中取出子叶。将子叶彼此分离并除去上胚轴。通过在托叶基部小心切割从上胚轴取下由叶片、叶柄和托叶组成的初生叶，使得腋生分生组织包括在外植体上。为了创伤外植体以及刺激新芽形成，移除任何预形成的芽，并用锋利的解剖刀切割托叶之间的区域3至5次。

在外植体制备后立即将外植体完全浸入农杆菌悬浮液中或将受伤的叶柄末端浸入农杆菌悬浮液中。接种后，将外植体在无菌滤纸上蘸干以除去过量的农杆菌培养物，并将外植体放置成使受伤侧与覆盖固体CCM培养基的圆形7cm Whatman纸接触(参见上文)。该滤纸防止根癌农杆菌在大豆外植体上过度生长。用Parafilm.TM.“M”(American NationalCan，Chicago，III.，USA)包裹五个平板，并在黑暗或光照下在25℃下孵育3至5天。

3.3.4方法C：繁殖的腋生分生组织

为了制备繁殖的腋生分生组织外植体，使用繁殖的3-4周龄的小植株。可以从第一节到第四节制备腋生分生组织外植体。每个幼苗平均可获得3-4个外植体。通过在节间的腋生节下0.5-1.0cm切割并从外植体除去叶柄和叶，从小植株制备外植体。用解剖刀切割腋生分生组织所在的尖端以诱导新梢生长并允许靶细胞接近农杆菌。因此，0.5cm外植体包括茎和芽。

一旦切割，立即将外植体置于农杆菌悬浮液中20至30分钟。接种后，将外植体在无菌滤纸上蘸干以除去过量的农杆菌培养物，然后几乎完全浸入固体CCM中或置于覆盖固体CCM的圆形7cm滤纸的顶部，这取决于农杆菌菌株。该滤纸防止农杆菌在大豆外植体上过度生长。用Parafilm.TM.“M”(American National Can，Chicago，III.，USA)包裹平板，并在黑暗中在25℃下孵育2至3天。

3.4-芽诱导

在25℃下在黑暗中共培养3至5天后，将外植体在液体SIM培养基中冲洗(以除去过量的农杆菌)(SIM，参见Olhoft等2007 A novel Agrobacterium rhizogenes-mediatedtransformation method of soy using primary-node explants from serlings invitro cell.Dev.Biol.-Plant(2007)43:536-549；为了除去过量的农杆菌)或Modwash培养基(1×B5主要盐，1×B5次要盐，1×MSI11铁，3％蔗糖，1×B5维生素，30mM MES，350mg/LTimentin pH 5.6，WO 2005/121345)中，并在无菌滤纸上吸干(以防止损害，特别是在叶片上)，然后置于固体SIM培养基上。放置约5个外植体(方法A)或10至20个外植体(方法B和C)，使得靶组织与培养基直接接触。在前2周期间，可以在有或没有选择培养基的情况下培养外植体。优选，将外植体转移到不含选择剂的SIM上1周。

对于叶外植体(方法B)，应将外植体置于培养基中，使得其垂直于培养基的表面，其中叶柄嵌入培养基中并且叶片伸出培养基。

对于繁殖的腋生分生组织(方法C)，将外植体置于培养基中，使得其平行于培养基表面(基部)，外植体部分包埋在培养基中。

将Scotch 394透气胶带(3M，St.Paul，Minn.，USA)包裹平板并在生长室中放置两周，温度平均为25℃，以70-100μE/m²s在18h光/6h暗循环下。外植体在有或没有选择的情况下保持在SIM培养基上，直到在目标区域(例如，上胚轴上方的第一节处的腋生分生组织)发生新芽生长。在此期间可以转移到新鲜培养基中。大约一星期后将外植体从具有或不具有选择的SIM转移到具有选择的SIM。此时，在各种SIM中的叶外植体的叶柄基部(方法B)，在幼苗外植体的初级节处(方法A)，以及在繁殖的外植体的腋生节处(方法C)，存在相当多的新芽发育。

优选，在共培养后最多2周取出转化前形成的所有芽，以刺激分生组织的新生长。这有助于减少初级转化体中的嵌合性并增加转基因分生组织细胞的扩增。在此期间，外植体可以切成或可以不切成更小的块(即通过切割上胚轴将节与外植体分离)。

3.5-芽伸长

在SIM培养基(优选含选择剂)上2至4周(或直至形成大量芽)后，将外植体转移至刺激芽原基的芽伸长的SEM培养基(芽伸长培养基，参见Olhoft等，a novel Agrobacteriumrhizogenes-mediated transformation method of soy using primary-node explantsfrom sidelings.In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant(2007)43:536-549)。这个培养基可以含有或不含有选择化合物。

每2至3周后，在小心去除死组织后，将外植体转移到新鲜的SEM培养基(优选含有选择剂)中。外植体应当聚拢在一起并且不分散成小片并保持一定程度的健康。继续转移外植体直至外植体死亡或芽伸长。取出>3cm的伸长芽并置于RM培养基中约1周(方法A和B)，或约2至4周，这取决于栽培种(方法C)，此时根开始形成。在具有根的外植体的情况下，将它们直接转移到土壤中。将生根的芽转移到土壤中并在生长室中硬化2至3周，然后转移到温室中。使用这种方法获得的再生植物是可育的，并且每株植物平均产生500粒种子。

在与根癌农杆菌共培养5天后，目的基因(GOI)的瞬时表达在幼苗腋生分生组织外植体上广泛分布，特别是在外植体制备期间受伤的区域中(方法A)。将外植体置于没有选择剂的芽诱导培养基中，以观察初生节如何响应芽诱导和再生。到目前为止，超过70％的外植体在该区域形成新芽。在SIM上14天后，GOI的表达是稳定的，这意味着T-DNA整合到了大豆基因组中。此外，初步实验导致在SIM上3周后形成表达cDNA的芽的形成。

对于方法C，使用繁殖的腋生分生组织方案的大豆小植株的平均再生时间为从外植体接种起14周。因此，这种方法具有快速的再生时间，其导致可育的、健康的大豆植物。

实施例4：病原体测定

4.1.植物的生长

将每个事件10株T1植物在植物室中盆栽并生长3-4周(16小时-白天-和8小时-夜晚-节律，温度为16℃和22℃，湿度为75％)，直至头2片三叶完全展开。

4.2接种

用豆薯层锈菌的孢子接种植物。为了获得用于接种的适当孢子材料，在接种前2-3天取出15-20天前已被锈病感染的大豆叶，并转移到琼脂平板(H₂O中1％琼脂)中。将叶片以其上侧放置在琼脂上，这允许真菌通过组织生长并产生非常幼小的孢子。对于接种溶液，将孢子从叶子上敲落并加入Tween-H₂O溶液中。通过Thoma计数室在光学显微镜下进行孢子计数。为了接种植物，将孢子悬浮液加入压缩空气驱动的喷雾烧瓶中，并均匀地施用于植物或叶子上，直至叶子表面充分湿润。对于宏观测定，我们使用1-5×10⁶孢子/ml的孢子密度。对于显微镜，使用>5×10⁵孢子/ml的密度。将接种的植物在平均22℃和>90％空气湿度的温室中放置24小时。在平均25℃和70％空气湿度的室中进行后续培养。

实施例5：显微镜筛选：

为了评估病原体发育，在感染后48小时用苯胺蓝染色接种的植物叶片。

苯胺蓝染色用于检测荧光物质。在宿主相互作用和非宿主相互作用中的防御反应期间，积累或产生诸如酚、胼胝质或木质素的物质，并且在乳突中局部或在完整细胞中掺入细胞壁处(超敏反应，HR)。与苯胺蓝结合形成复合物，其例如在胼胝质的情况下导致黄色荧光。将叶材料转移到含有脱色溶液II(乙醇/乙酸6/1)的falcon管或培养皿中，并在90℃水浴中温育10-15分钟。其后立即除去脱色溶液II，并将叶子用水洗涤2次。对于染色，将叶片在染色溶液II(0.05％苯胺蓝＝甲基蓝，0.067M磷酸氢二钾)中孵育1.5-2小时，并在此之后立即通过显微镜分析。

通过显微镜评估(计数)不同的相互作用类型。使用Olympus UV显微镜BX61(入射光)和UV长程滤波器(激发：375/15，分束器：405LP)。在苯胺蓝染色后，孢子在UV光下呈现蓝色。通过绿色/黄色染色可以识别真菌附着壁下的乳突。通过全细胞荧光表征超敏反应(HR)。

实施例6：评估对大豆锈病的易感性

在接种后14天(参见实施例4)，通过估计叶近轴面上的患病面积(被孢子化的锈菌覆盖的面积)，对大豆锈病的进展进行评分。另外，考虑了叶片的黄化(方案参见图1)。

将代表9个独立转化事件(每个事件11-12株植物)并表达Myb41蛋白的所有107株T1大豆植物用豆薯层锈菌的孢子接种(参见实施例4)。接种14d后对豆薯层锈菌感染大豆后的宏观病害症状进行评分。使植物生长并保持在实施例4中描述的条件下。

显示真菌菌落或强黄化/褐变的叶面积百分比的平均值被认为是患病叶面积。使表达Myb41(通过RT-PCR检查表达)的所有107株转基因T1大豆植物生长并与具有与用于转化的相同遗传背景的非转基因对照植物平行评估(参见实施例3)。

表达重组Myb41蛋白的植物和相应的野生型对照植物的患病叶面积的平均值显示在图5中。表达Myb41的转基因T1大豆植物和非转基因野生型对照植物都基于相同的遗传背景。

与非转基因对照植物相比，Myb41蛋白的过表达在所有事件和产生的植物中使患病叶面积平均减少33.5％。这种差异在p<0.001水平上是统计学上显著的(双侧student'st-检验)。数据清楚地显示了与野生型对照相比，Myb41表达载体构建体的植物内表达(参见图2)导致转基因植物中的病害较低。因此，大豆中Myb41蛋白(如SEQ ID NO.2所示)的表达增加了大豆对抗大豆锈病的抗性。

Claims

1.一种用于赋予或增加植物、植物部分或植物细胞中的真菌抗性的方法，其中所述方法包括与相应的野生型植物、野生型植物部分或野生型植物细胞相比增加所述植物、植物部分或植物细胞中Myb41的产生和/或积累的步骤。

2.根据权利要求1的方法，其包括使相应植物、植物部分或植物细胞中的Myb41蛋白磷酸化的步骤，或其中Myb41蛋白包含拟磷突变。

3.一种赋予或增加植物、植物部分或植物细胞中的真菌抗性的方法或权利要求1或2的方法，其中所述方法包括与相应的野生型植物、野生型植物部分或野生型植物细胞相比，增加所述植物、植物部分或植物细胞中Myb41蛋白的表达和/或生物活性，其中所述Myb41蛋白由以下编码：

(i)与SEQ ID NO.1或其功能性片段或其剪接变体具有至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性的外源核酸；

(iv)与上述(i)至(iii)的核酸编码相同的Myb41蛋白，但由于遗传密码的简并性而不同于上述(i)至(iii)的核酸的外源核酸。

4.根据权利要求3的方法，包括步骤：

(b)从植物细胞再生植物；和

(c)表达所述Myb41蛋白。

5.根据权利要求3或4所述的方法，进一步包括磷酸化相应的植物、植物部分或植物细胞中的Myb41蛋白的步骤，或其中Myb41蛋白包含拟磷突变。

6.一种重组载体构建体，其包含选自以下的编码Myb41蛋白的核酸：

其可操作地连接至启动子和转录终止序列，并且其中所述核酸不编码氨基酸序列SEQID NO.2的蛋白。

7.根据权利要求6的重组表达载体，其中启动子是组成型、病原体诱导型启动子、叶肉特异性启动子或表皮特异性启动子。

8.一种用根据权利要求6或7的一种或多种重组载体构建体转化的遗传修饰的植物、遗传修饰的植物部分或遗传修饰的植物细胞。

9.一种过表达Myb41蛋白的作物植物、作物植物部分或作物植物细胞，其中所述Myb41蛋白由以下编码：

其中根据(i)-(iv)任一项的核酸与启动子和转录终止序列可操作地连接，并且优选其中

(a)作物植物、作物植物部分或作物植物细胞是遗传修饰的作物植物、作物植物部分或作物植物细胞，或者过表达导致形成野生型基因组的人工诱导的可遗传突变；和/或

(e)其中编码Myb41的基因可操作地连接异源启动子，和/或

(f)其中编码Myb41的基因在植物或植物部分的基因组中整合在与相应的野生型Myb41基因不同的基因座处。

10.一种用于生产与相应的野生型植物、植物部分或植物细胞相比具有增加的真菌抗性的遗传修饰的作物植物、遗传修饰的作物植物部分或遗传修饰的作物植物细胞的方法，其包括

(b)从所述植物、植物部分或植物细胞产生遗传修饰的植物、遗传修饰的植物部分或遗传修饰的植物细胞；和

(c)在来自植物的遗传修饰的植物细胞、遗传修饰的植物部分或遗传修饰的植物中表达Myb41蛋白，

其中Myb41蛋白由以下编码：

其可操作地连接到启动子和转录终止序列。

11.Myb41蛋白或编码Myb41蛋白的核酸用于增加植物中的真菌抗性的用途，优选其中真菌抗性的增加包括延迟或减少真菌对植物的感染。

12.一种优选通过减少或延迟田地中植物的感染和/或减少或延迟真菌孢子从田地中排放来控制田地中的真菌的方法，包括以下步骤：

(a)种植来自权利要求8或9中所述的任何植物的种子，和/或

(b)增加植物叶中的木栓素片层形成。

13.根据权利要求8或权利要求9所述的植物的可收获部分，其中植物的可收获部分包含编码Myb41蛋白的外源核酸，优选其中可收获部分是遗传修饰植物的遗传修饰种子。

14.源自权利要求8或权利要求9所述的植物、源自通过权利要求10的方法可生产的植物或源自根据权利要求13的植物的可收获部分的产品，其中产品包含如权利要求10中所定义的Myb41蛋白和/或编码Myb41蛋白的外源核酸，

其中产品优选为大豆产品，更优选大豆、大豆油或大豆粉。

15.一种用于生产产品的方法，其包括：

a)使权利要求8或9的植物或通过权利要求10的方法可获得的植物生长，和

b)从或通过植物和/或植物部分、优选种子生产所述产品，其中所述产品包含编码所述Myb41蛋白的外源核酸和/或如权利要求10中所定义的Myb41蛋白，和

其中所述产品优选是大豆产品，更优选大豆、大豆油或大豆粉。

16.根据权利要求15的方法，包括

a)使权利要求8或9的植物或通过权利要求10的方法可获得的植物生长，并从植物移除如权利要求13中所定义的可收获部分，和

b)从植物的可收获部分或通过植物的可收获部分生产所述产品。

17.测定植物对抗真菌的抗性的方法，包括在所述植物的细胞中筛选Myb41基因的过表达，其中优选Myb41基因包含拟磷突变和/或其中优选所述Myb41蛋白由以下编码：

18.根据权利要求1至5、10、12、15或16任一项的方法或根据权利要求11的用途，其中真菌抗性是针对活体营养型或半活体营养型或半死体营养型真菌的抗性，优选针对锈菌、霜霉病、白粉病、叶斑病、晚疫病、镰刀菌属和/或壳针孢属，更优选针对以下的锈菌：

-分类学担子菌门(Basidiomycota)，更优选分类学柄锈菌纲(Pucciniomycetes)，更优选分类学柄锈菌目(Pucciniales)，更优选分类学柄锈菌科(Pucciniaceae)或层锈菌科(Phakopsoraceae)；或

-分类学子囊菌门(Ascomycota)，更优选分类学粪壳菌纲(Sordariomycetes)，更优选分类学肉座菌目(Hypocreales)，更优选分类学赤壳菌科(Nectriaceae)，

甚至更优选层锈菌属(Phakopsora)的真菌，最优选豆薯层锈菌(Phakopsorapachyrhizi)。

19.根据权利要求1至5、10、12、15、16、17或18任一项的方法，或根据权利要求8或9的植物、植物部分或植物细胞，或根据权利要求11的用途，根据权利要求13的可收获部分，或根据权利要求14的产品，其中植物选自分类学蝶形花科、十字花科和禾本科的成员，最优选大豆。优选

-分类学菜豆族(Phaseoleae)，更优选木豆属(Cajanus)、刀豆属(Canavalia)、大豆属(Glycine)、菜豆属(Phaseolus)、豆果属(Psophocarpus)、葛属(Pueraria)或豇豆属(Vigna)，甚至更优选物种木豆(Cajanus cajan)、巴西刀豆(Canavalia brasiliensis)、直生刀豆(Canavalia ensiformis)、蔓生刀豆(Canavalia gladiata)、半野生大豆(Glycinegracilis)、大豆(Glycine max)、野大豆(Glycine soja)、宽叶菜豆(Phaseolusacutifolius)、大白芸豆(Phaseolus lunatus)、Phaseolus maculatus、四棱豆(Psophocarpus tetragonolobus)、越南葛藤(Pueraria montana)、红小豆(Vignaangularis)、黑吉豆(Vigna mungo)、绿豆(Vigna radiata)或豇豆(Vigna unguiculata)，甚至更优选以下种：半野生大豆(Glycine gracilis)、大豆(Glycine max)或野大豆(Glycine soja)，甚至更优选大豆(Glycine max)种；

-分类学蚕豆族(Fabeae)，更优选山黧豆属(Lathyrus)、兵豆属(Lens)、豌豆属(Pisum)或野豌豆属(Vicia)，甚至更优选物种山黧豆(Lathyrus aphaca)、鹰嘴山黧豆(Lathyruscicera)、多毛山黧豆(Lathyrus hirsutus)、赭石山黧豆(Lathyrus ochrus)、臭山黧豆(Lathyrus odoratus)、球山黧豆(Lathyrus sphaericus)、刺山黧豆(Lathyrustingitanus)、小扁豆(Lens culinaris)、豌豆(Pisum sativum)、广布野豌豆(Viciacracca)、蚕豆(Vicia faba)或长柔毛野豌豆(Vicia vellosa)；

-分类学芸薹族(Brassiceae)，更优选芸薹属(Brassica)、两节芥属(Crambe)，萝卜属(Raphanus)或白芥属(Sinapis)，甚至更优选物种欧洲芸薹(Brassica aucheri)、巴耳氏芸薹(Brassica balearica)、巴氏芸薹(Brassica barrelieri)、波尔氏芸薹(Brassicabourgeaui)、埃塞俄比亚芸薹(Brassica carinata)、花椰菜(Brassica cretica)、Brassica deflexa、德氏芸薹(Brassica desnottesii)、Brassica drepanensis、长体芸薹(Brassica elongata)、果芸薹(Brassica fruticulosa)、葡萄汁芸薹(Brassicagravinae)、希拉里奥利芸薹(Brassica hilarionis)、加纳芸薹(Brassica incana)、岛芥菜(Brassica insularis,)、芥菜(Brassica juncea)、大果芸薹(Brassica macrocarpa)、莫氏芸薹(Brassica maurorum)、蒙大拿芸薹(Brassica montana)、欧洲油菜(Brassicanapus)、黑芸薹(Brassica nigra)、甘蓝(Brassica oleracea)、氧化型芸薹(Brassicaoxyrrhina)、平卧芸薹(Brassica procumbens)、芜菁(Brassica rapa)、Brassicarepanda、Brassica rupestris、Brassica souliei、Brassica spinescens、Brassicatournefortii、Brassica villosa或任何这些物种的杂交物种，甚至更优选欧洲油菜(Brassica napus)、黑芸薹(黑芥)、甘蓝(wild cabbage)、芜菁(田芥菜)或任何这些物种的杂交物种，甚至更优选欧洲油菜(Brassica napus)、物种萝卜(Raphanus sativus)、物种白芥(Sinapis alba)；

最优选其中植物是大豆。

20.一种用于育种真菌抗性作物植物的方法，其包括

(a)使权利要求8或9的植物或通过权利要求10的方法可获得的植物与第二植物杂交；

(b)从步骤(a)的杂交获得种子；

(c)种植所述种子并使种子生长成植物；和

(d)从所述植物选择如权利要求10所定义的表达Myb41蛋白的植物。