CN111471684A - 植物组成型启动子ALSpro及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及植物组成型启动子ALSpro及其应用。本发明的启动子ALSpro的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，为水稻内源的组成型启动子，能够驱动基因在愈伤组织及营养生长期的叶片等各组织及生殖器官中高效稳定的表达，可替代非植物源启动子，对水稻等植物的基因工程十分有利，可有效降低外源DNA引起的转基因植物的潜在安全风险。

Description

植物组成型启动子ALSpro及其应用

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及植物组成型启动子ALSpro及其应用。

背景技术

转基因技术已经成为基因功能研究等基础研究和应用研究领域不可或缺的技术之一。启动子作为驱动基因表达的重要功能顺式作用元件，在转基因技术中占据重要地位。启动子按其表达方式可分为组成型启动子、诱导型启动子和时空特异型启动子三类。组成型启动子能够在所有或大多数组织中启动基因转录，使基因表达具有时空持续性和表达恒定性。诱导型启动子能够在某些物理或化学信号的刺激下启动或大幅提高基因表达量，它们具有增强子、沉默子或类似功能的序列结构，并表现出明显的专一性。时空特异型启动子只在特定的生长阶段或部位中启动基因表达。深入研究启动子的表达模式既有利于理解基因的表达调控机制和生物学功能，又有助于有效控制外源基因的表达。

随着转基因产品的不断推广，人们对转基因产品的态度日趋客观和积极，但对转基因产品的争议仍甚嚣尘上，转基因产品潜在的安全风险问题仍受到普遍关切，因此，转基因产品仍受到严格的控制和监管。目前，在植物转化过程中应用较多的启动子主要是花椰菜花病毒的启动子(CaMV35Spro)和玉米多聚泛素蛋白基因启动子(ZmUbipro)。CaMV35Spro是植物DNA病毒的启动子，在植物转基因中的应用可能引起公众的担忧；ZmUbipro虽然是植物来源，但在转化时频繁使用同一种启动子易导致转基因沉默。因此，挖掘新的高效的组成型启动子，尤其是挖掘植物本源的、生物安全低风险的启动子显得尤其重要。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供植物组成型启动子ALSpro及其应用。

本发明提供的植物组成型启动子ALSpro来源于乙酰乳酸合成酶(acetolactatesynthase，ALS；EC2.2.1.6)编码基因的上游序列。ALS是催化植物体内支链氨基酸(异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸)合成起始步骤的关键酶(Herrera-Estrella L,Block M D,MessensE,et al.Chimeric genes as dominant selectable markers in plant cells.The EMBOJournal,1983,2(6):987-995.)，是植物氨基酸代谢的关键酶。本发明意外发现，水稻ALS基因的上游序列能够驱动基因在植物的愈伤组织和营养生长期的根、叶等主要组织中高效表达。

本发明提供植物组成型启动子ALSpro，其具有如下任一核苷酸序列：

(1)如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

(2)与如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列互补的序列；

(3)如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有同等启动子的功能、由(1)衍生的核苷酸序列。

其中，对于(2)中所述的与如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列互补的序列，本领域技术人员根据相同目的能够容易地鉴定并利用与启动子ALSpro核苷酸序列互补的DNA分子。所述核苷酸序列互补，是指在严格条件下能与启动子ALSpro杂交。因此，具有启动子活性并在严格条件下能够与启动子ALSpro或其片段杂交的DNA序列包括在本发明中。

严格条件是指探针将与其靶序列杂交至可探测程度超过与其它序列杂交(如至少2倍于背景)的条件。严格条件具有序列依赖性，且因实验其它条件的不同而不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。可选择地，可以调节严格条件以允许一些序列错配，使得探测到较低程度的相似性(异源探测)。通常，探针长度不超过1000个核苷酸，优选地短于500个核苷酸。

典型地，严格条件是在pH值7.0-8.3下盐浓度低于大约1.5M Na⁺，典型地大约0.01-1.0M Na⁺浓度(或其它盐类)，温度对短探针(如10-50个核苷酸)至少大约30℃，对长探针(如超过50个核苷酸)至少大约60℃。通过添加去稳定剂如甲酰胺也可获得严格条件。低严格条件，例如，包括在30-35％甲酰胺、1M NaCl、l％SDS(十二烷基磺酸钠)的缓冲溶液中37℃杂交，在1×至2×SSC(20×SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中50-55℃洗涤。中度严格条件，例如，包括在40-45％甲酰胺、1.0M NaCl、l％SDS的缓冲溶液中37℃杂交，在0.5×至1×SSC中55-60℃洗涤。高度严格条件，例如，包括在50％甲酰胺、1M NaCl、l％SDS的缓冲溶液中37℃杂交，在0.1×SSC中60-65℃洗涤。非必要地，洗涤缓冲液可含有大约0.1％-1％的SDS。杂交时间一般少于大约24小时，通常大约4-12小时。

特别典型地是杂交后洗涤的函数，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，Tm可以从Meinkoth和Wahl(Anal Biochem，1984，138：267-284)的方程估算:Tm＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸在DNA中的百分比，％form是甲酰胺在杂交溶液中的百分比，L是杂交体在碱基对中的长度。Tm是50％互补靶序列与完全配对探针杂交的温度(在规定的离子强度和pH下)。每1％的错配需Tm降低大约l℃；因此，Tm杂交和/或洗涤条件可被调节以与所需同一性的序列杂交。例如，如果探寻的序列具有≥90％的同一性，Tm可以降低10℃。一般地，选择的严格条件是低于特定序列的热解链温度(Tm)大约5℃，且其在规定的离子强度和pH下互补。但是，高度严格条件可以应用低于热解链温度(Tm)1、2、3或4℃的杂交和/或洗涤；中度严格条件可以应用低于热解链温度(Tm)6、7、8、9或10℃的杂交和/或洗涤；低度严格条件可以应用低于热解链温度(Tm)11、12、13、14、15或20℃的杂交和/或洗涤。本领域普通技术人员会理解杂交和/或洗涤溶液的条件随严格度的变化而变化，并应用此方程计算杂交和洗涤组合物和所需的Tm。如果所需的错配程度使Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，优选增加SSC浓度以能够使用较高的温度。核酸杂交的指南见于Tijssen(1993)生物化学和分子生物学实验室技术一用核酸探针杂交，第I部分，第2章(Elsevier，New York)；和Ausubel等人编辑(1995)分子生物学现代方法第2章(GreenePublishing and Wiley-Interscience,New York)。见Sambrook等人(1989)分子克隆:实验室手册(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,NewYork)。

所述严格条件优选为在6×SSC(柠檬酸钠)、0.5％SDS(十二烷基磺酸钠)的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜1次。

其中，(3)中所述的由(1)衍生的核苷酸序列为与(1)所述的核苷酸序列相比具有70％以上同源性、80％以上同源性、85％以上同源性、90％以上同源性、95％以上同源性、98％以上同源性或99％以上同源性，且具有同等功能的核苷酸序列。

本发明提供含有所述启动子ALSpro的表达盒。

所述表达盒在启动子ALSpro的下游连接有目的基因，所述目的基因可以是任意的已知功能或未知功能基因，用于驱动目的基因表达或鉴定基因功能。

所述表达盒包括以转录方向彼此功能性连接的启动子ALSpro、功能基因和终止子。

作为本发明的一种实施方式，所述表达盒为植物转基因筛选表达盒，所述功能基因为筛选标记基因，可为植物内源基因或外源基因，包括但不限于植物乙酰乳酸合酶突变基因ALS、植物抗性EPSPS基因、潮霉素磷酸转移酶基因Hn、Bar基因或NptII基因。

作为本发明的一种实施方式，所述植物转基因筛选表达盒包括以转录方向彼此功能性连接的启动子ALSpro、作为筛选标记基因的水稻乙酰乳酸合酶突变基因(ALS)以及Ubi终止子。对于上述筛选标记基因，采用启动子ALSpro和Ubi终止子配合调控基因转录，能够更好地控制筛选标记基因的高效、稳定、适度表达，更好地发挥筛选标记功能。

所述植物转基因筛选表达盒的核苷酸序列具体可为如SEQ ID NO.7或SEQ IDNO.8所示的核苷酸序列。

本发明还提供含有所述启动子ALSpro或所述表达盒的载体。

所述载体可为表达载体。

作为本发明的一种实施方式，所述载体为植物遗传转化筛选载体，具体为pC2180ALSm1或pC1600ALSm1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示。

本发明还提供含有所述启动子ALSpro或所述表达盒或所述载体的宿主细胞。

本发明还提供含有所述表达盒或所述载体的转基因植物。

本发明提供所述启动子ALSpro、含有所述启动子ALSpro的表达盒或所述载体或所述宿主细胞的如下任一应用：

(1)在驱动DNA在选自植物愈伤组织、营养生长期的组织和生殖器官中的一种或多种组织器官中表达的应用；

(2)在制备转基因植物中的应用。

具体地，所述DNA可为功能基因、功能基因的反义基因或能够干扰功能基因表达的小RNA基因。

所述功能基因包括但不限于植物农艺性状相关基因、筛选标记基因。

本发明所述植物为水稻、玉米、小麦、大麦、大豆、棉花、油菜、高粱或小米。

本发明还提供用于扩增所述启动子ALSpro的引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示或如SEQ ID NO.5-6所示。

本发明提供一种转基因植物的制备方法，包括：将所述表达盒或所述载体导入植物中，通过筛选得到转基因植物。

所述转基因植物的制备方法具体包括：将所述植物转基因筛选表达盒或所述植物遗传转化筛选载体转入植物愈伤组织后，在筛选阶段、分化阶段和生根阶段将愈伤组织或幼苗接种到添加除草剂的筛选培养基中，进行抗性筛选。所述除草剂可为嘧啶水杨酸类或咪唑啉酮类，例如：双草醚、灭草烟或咪唑乙烟酸等。优选地，所述培养基中，含有0.05～10μmol/L双草醚、25～1000mg/L灭草烟或25～1000mg/L咪唑乙烟酸。

以水稻为例，转基因水稻的制备方法具体包括如下步骤，其他转基因植物的制备方法可参考水稻：

1)诱导：水稻种子去壳消毒后，将成熟胚接种于诱导培养基中，诱导胚性愈伤组织，27℃暗培养30-50天；

2)侵染：将步骤1)所得愈伤组织与胚乳、芽分离，接种于携带所述植物遗传转化筛选载体的农杆菌的悬浮液(将携带所述植物遗传转化筛选载体的农杆菌悬浮于悬浮培养基中)中进行侵染，室温静置30分钟，之后晾干待用；

3)共培养：将晾干的愈伤组织转到共培养基中，22℃暗培养3天，至愈伤组织表面出现菌体；

4)筛选：将共培养后的愈伤组织清洗后接种到添加双草醚、灭草烟或咪唑乙烟酸的筛选培养基中，27℃暗培养30-50天，进行抗性筛选；

5)分化：将获得的抗性愈伤组织接种到添加双草醚、灭草烟或咪唑乙烟酸的分化培养基上，27℃光照培养25-40天至分化出幼苗；

6)生根：将幼苗接种到添加双草醚、灭草烟或咪唑乙烟酸的生根培养基上生根，30℃光照培养10-20天，并进行PCR检测，选择检测为阳性的植株种植；

以上转基因水稻的制备方法中涉及的培养基可为以现有技术公开的N6、MS、B5等培养基为基础的诱导培养基、继代培养基、筛选培养基、分化培养基、生根培养基等。

本发明的有益效果至少包括：本发明的启动子ALSpro是一个水稻来源的组成型启动子，其可驱动基因在水稻的愈伤组织和营养生长期的主要功能组织(根、叶、花、幼苗、幼穗等)中高效表达：一方面，本发明的启动子ALSpro可与植物内源或外源筛选标记基因组成植物转基因筛选表达盒和植物遗传转化筛选载体，并附加其他功能元件进行植物遗传转化，用于植物组织培养和植物遗传转化，为植物遗传转化的筛选提供了有效的工具和方法；另一方面，除可驱动基因在组培和转基因过程中高效表达外，启动子ALSpro还可驱动基因在后续转化苗的营养生长期地上和地下部分的主要功能组织中高效表达。启动子ALSpro为植物内源基因，在转基因过程中不引入菌源等外源基因片段，不仅丰富了植物转基因的启动子资源，还可有效降低外源基因引起的转基因植物的潜在安全风险以及公众对转基因植物安全性的担忧，有利于转基因植物的商业化应用，市场价值和社会效益均良好。

附图说明

图1为本发明实施例2中qPCR分析ALSpro启动子的组织表达情况；其中，Callus：继代15d愈伤组织；Seedlings：3-5叶期幼苗；Flag leaf：孕穗期剑叶；Root，分蘖期根；Youngpanicle：孕穗期5-10cm幼穗。

图2为本发明实施例3中pC0310载体图谱。

图3为本发明实施例3中pC2180ALSm1载体经NcoI和PstI酶切的电泳图；其中，M为Marker，CK为未酶切的pC2180ALSm1重组质粒，1-5为酶切的pC2180ALSm1重组质粒，可切出大小约为2.2kb片段。

图4为本发明实施例3中pC1600ALSm1载体经SpeI和NcoI酶切的电泳图；其中，M为Marker，ck为未酶切的pC1600ALSm1重组质粒，1-6为酶切的pC1600ALSm1重组质粒，可切出大小约为1.5kb片段。

图5为本发明实施例3中pC2180ALSm1载体图谱。

图6为本发明实施例3中pC1600ALSm1载体图谱。

图7为本发明实施例4中pC2180ALSm1转化后农杆菌的PCR检测电泳结果；其中，M为Marker，1为pC2180ALSm1重组质粒阳性对照，2-6为转pC2180ALSm1重组质粒农杆菌单克隆菌液样品。

图8为本发明实施例4中pC1600ALSm1转化后农杆菌的PCR检测电泳结果；其中，M为Marker，1为阴性对照，2为pC1600ALSm1重组质粒阳性对照，3-7为转pC1600ALSm1重组质粒农杆菌单克隆菌液样品。

图9为本发明实施例5中双草醚筛选培养基筛选愈伤组织40d结果，1为含pC0310载体农杆菌侵染后筛选的愈伤，2、3分别为包含pC2180ALSm1、pC1600ALSm1的农杆菌侵染后筛选的愈伤。

图10为本发明实施例6中pC2180ALSm1转基因样品植株PCR检测电泳图；其中，M为Marker，1为H₂O、2为ZH11非转基因植株基因组DNA，3为pC2180ALSm1重组质粒阳性对照，4-20为筛选获得的转基因植株基因组DNA。

图11为本发明实施例6中pC1600ALSm1转基因样品植株PCR检测电泳图；其中，M为Marker，1为ZH11非转基因植株基因组DNA，2为pC1600ALSm1重组质粒阳性对照，3-7为筛选获得的转基因植株基因组DNA。

图12为本发明实施例7中pC2180ALSm1转基因T0代株系4叶期除草剂抗性测试结果；图中WT表示野生型对照ZH11，T0表示转基因T0代株系，BS 20×表示喷施20×浓度双草醚，0d、7d及14d表示喷施除草剂0天、7天及14天。

图13为本发明实施例7中pC2180ALSm1转基因T0代株系7叶期除草剂抗性测试结果；图中WT表示野生型对照ZH11，T0表示转基因T0代株系，BS 20×表示喷施20×浓度双草醚，0d、7d及14d表示喷施除草剂0天、7天及14天。

图14为本发明实施例7中pC2180ALSm1转基因T0代株系初分蘖期除草剂抗性测试结果；其中，WT表示野生型对照ZH11，T0表示转基因T0代株系，BS 30×表示喷施30×浓度双草醚，0d、7d及14d表示喷施双草醚0天、7天及14天。

图15为本发明实施例7中pC1600ALSm1转基因T0代株系5-6叶期除草剂抗性测试结果；其中，白色尖头表示野生型对照ZH11，其余为转基因T0代株系，BS 20×表示喷施20×浓度双草醚，0d、7d及14d表示喷施双草醚0天、7天及14天。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1启动子ALSpro的获得

通过启动功能预测软件PlantCARE及PlantPAN等对乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase，ALS；EC2.2.1.6)编码基因的上游序列进行生物信息学分析发现，该序列富含多种与启动子相关的顺式作用元件如CAAT-box，TATA-box等，表明该序列具有植物细胞启动子的结构特征。且经PlantPAN分析，其1263-2180序列富含CpG岛，而CpG岛也是真核生物启动子的序列特征之一，推测该序列可能具有启动子活性，其核心序列为1263-2180区域。

分别截取不同长度的ALS基因上游序列进行启动子活性鉴定，经不断筛选和对比，最终确定将SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列作为启动子序列，并将其命名为ALSpro，启动子ALSpro能够驱动基因在水稻的愈伤组织和营养生长期的主要组织中高效表达。

启动子ALSpro可采用如下引物扩增得到：如SEQ ID NO.1所示的启动子的扩增引物序列如下：

SEQ ID NO.3：CGTTTTTAATGTATGCTCCACCATGttggCGTAA AGTCTTCACTCCTCCCCC；

SEQ ID NO.4：CGTAGCCATGGTGGGTGGTGGCGG。

如SEQ ID NO.2所示的启动子的扩增引物序列如下：

SEQ ID NO.5：CGTTTTTAATGTATGCTCCACCATGttggGCGA CTTGCTATTTGGTCGAGTC；

SEQ ID NO.6：CGTAGCCATGGTGGGTGGTGGCGG。

实施例2启动子ALSpro的表达分析

利用qPCR(荧光定量PCR)对ALSpro下游基因的表达模式进行鉴定，具体方法如下：

分别取ZH11的根、叶、幼穗、幼苗、愈伤，提取总RNA，并进行反转录获得cDNA。在Thermo PikoReal96实时荧光定量PCR系统中，以Actin基因为内参，检测ALSpro下游ALS基因的表达。

qPCR引物序列：

OsALSWT-qRtF2：GCACAATGAGTTGGACCAGCAG(SEQ ID NO.11)

OsALSWT-qRtR2：GTCAGCTCATCCAGCACCTGAA(SEQ ID NO.12)

Actin-F：AGCATGAAGATCAAGGTGGTC(SEQ ID NO.13)

Actin-R：GCCTTGGCAATCCACATC(SEQ ID NO.14)

ALS基因的qPCR反应体系及程序如下：

程序：94℃预变性7min，94℃变性15s，65℃退火15s，72℃延伸15s(荧光检测)，40个循环；60℃保温，30s。溶解曲线程序：60-95℃(每升高0.2℃，保持1s)；20℃保温，10s；结束。

Actin基因的qPCR反应体系及程序如下：

程序：94℃预变性7min，94℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸15s(荧光检测)，40个循环。溶解曲线程序：60-95℃(每升高0.2℃，保持1s)；20℃保温，10s；结束。

qPCR扩增结果显示，ALS基因和内参基因的熔解曲线峰均为单一峰形，形状锐利。提示各样品熔解温度均一，扩增产物特异性好，未见非特异的双链DNA产物或引物二聚体。扩增曲线光滑平稳，荧光吸收图谱的S形曲线形状完好，符合定量检测要求。采用比较阀值法(2^-△△Ct法)进行相对定量(Liva K J,Schmittgen T D.Analysis of relative geneexpression data using real-time quantitative PCR and 2(-Delta Delta C(T))Method[J].Methods,2001,25(4):402-408.)。结果如图1所示，在根、叶、花、幼苗、愈伤组织中，ALSpro驱动下游基因高效表达；其中，愈伤中表达量最高，根中表达量略低。

实施例3构建含启动子ALSpro的植物转基因表达盒和载体

1、含启动子ALSpro(2180，SEQ ID NO.1)的植物转基因表达盒的制备

本发明的植物转基因表达盒ALSpro2180-ALSm1-OsUbiT(序列如SEQ ID NO.7)的构建方法如下：

设计引物0310-AAU-F/0310-AAU-Rv1从水稻基因组中扩增启动子OsALSP片段；利用引物0310-AAU-F2/0310-AAU-Rv2从合成的水稻ALS突变基因(ALSm1)片段中扩增获得目的基因ALSm1片段；利用引物0310-AAU-F3/0310-AAU-Rv从水稻基因组中扩增获得终止子OsUbiT片段。其中，引物0310-AAU-F和0310-AAU-Rv的5’端均有15个左右核苷酸序列与载体相应连接位置重复；相邻片段的上下游引物5’端也有15bp重复(0310-AAU-Rv1与0310-AAU-F2，0310-AAU-Rv2与0310-AAU-F3)，以便后续利用Gibson Assembly重组连接。

上述引物序列如下：

0310-AAU-F:CGTTTTTAATGTATGCTCCACCATGttggCGTAAAGTCTTCACTCCTCCCCC(SEQID NO.3)；

0310-AAU-Rv1：CGTAGCCATGGTGGGTGGTGGCGG(SEQ ID NO.4)；

0310-AAU-F2：CACCCACCATGGCTACGACCGCCGC(SEQ ID NO.15)；

0310-AAU-Rv2：GGCTGAGGACAGGCCTTTAATACACAGTC CTGCCATCA(SEQ ID NO.16)；

0310-AAU-F3：ATTAAAGGCCTGTCCTCAGCCATAGAGCTG(SEQ ID NO.17)；

0310-AAU-Rv:TGCCCGGGCCTGCAgGACAAATTTGTTTGTCAGATCAAATTTTTAAGC(SEQ IDNO.18)。

PCR扩增反应体系如下：

PCR扩增程序如下：94℃预变性3min；94℃变性30s，55-65℃退火30s，68℃延伸3min，35个循环；68℃延伸10min，16℃结束。

引物0310-AAU-F和0310-AAU-Rv1扩增的PCR产物为ALSPro片段，经1％琼脂糖凝胶电泳回收大小为2180bp产物；引物0310-AAU-F2和0310-AAU-Rv2扩增的PCR产物为ALSm1片段，1％琼脂糖凝胶电泳回收大小为1941bp；引物0310-AAU-F3和0310-AAU-Rv扩增的PCR产物为OsUbiT片段，1％琼脂糖凝胶电泳回收大小为310bp。

2、含启动子ALSpro(1600，SEQ ID NO.2)的植物转基因表达盒的制备

本发明的植物转基因表达盒ALSpro1600-ALSm1-OsUbiT(序列如SEQ ID NO.8)的构建方法如下：

设计引物0310-AAU1600-F/0310-AAU1600-Rv1从水稻基因组中扩增启动子ALSpro1600片段；利用引物0310-AAU1600-F2/0310-AAU1600-Rv2从合成的水稻ALS突变基因(ALSm1)片段中扩增获得目的基因ALSm1片段；利用引物0310-AAU1600-F3/0310-AAU1600-Rv从水稻基因组中扩增获得终止子OsUbiT片段。其中，引物0310-AAU1600-F和0310-AAU1600-Rv的5’端均有15个左右核苷酸序列与载体相应连接位置重复；相邻片段的上下游引物5’端也有15bp重复(0310-AAU1600-Rv1与0310-AAU1600-F2，0310-AAU1600-Rv2与0310-AAU1600-F3)，以便后续利用Gibson Assembly重组连接。

上述引物序列如下：

0310-AAU1600-F:CGTTTTTAATGTATGCTCCACCATGttggGCGACTTGCTATTTGGTCGAGTC(SEQ ID NO.5)；

0310-AAU1600-Rv1:CGTAGCCATGGTGGGTGGTGGCGG(SEQ ID NO.6)；

0310-AAU1600-F2:CACCCACCATGGCTACGACCGCCGC(SEQ ID NO.21)；

0310-AAU1600-Rv2:GGCTGAGGACAGGCCTTTAATACACAGTC CTGCCATCA(SEQ IDNO.22)；

0310-AAU1600-F3:ATTAAAGGCCTGTCCTCAGCCATAGAGCTG(SEQ ID NO.23)；

0310-AAU1600-Rv:TGCCCGGGCCTGCAgGACAAATTTGTTTGTCAGATCAAATTTTTAAGC(SEQID NO.24)。

PCR扩增反应体系如下：

PCR扩增程序如下：94℃预变性3min；94℃变性30s，55-65℃退火30s，68℃延伸3min，35个循环；68℃延伸10min，16℃结束。

引物0310-AAU1600-F和0310-AAU1600-Rv1扩增的PCR产物为ALSpro片段，经1％琼脂糖凝胶电泳回收大小为1600bp产物；引物0310-AAU1600-F2和0310-AAU1600-Rv2扩增的PCR产物为ALSm1片段，1％琼脂糖凝胶电泳回收大小为1941bp；引物0310-AAU1600-F3和0310-AAU1600-Rv扩增的PCR产物为OsUbiT片段，1％琼脂糖凝胶电泳回收大小为310bp。

3、植物遗传转化载体的构建

使用Gibson Assembly方法，将上述1、2中的扩增产物插入到pC0310载体(pC0310为申请人依托pCAMBIA1300载体骨架，经过改造获得，其中主要删除了其潮霉素筛选元件及相邻区域不必要区域，以使得T-Border内部除多克隆位点外不含其它菌源序列。因此，在T-Border中后续连入植物源序列，转入植物时降低公众对转基因担忧，载体图谱见图2)BstXI和PstI双酶切位点间，具体方法如下：

(1)用BstXI+PstI对载体质粒pC0310进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后，利用E.Z.N.A.

Extraction kit(Omega，下同)回收7kb左右大小条带，得到pC0310线性片段。

BstXI+PstI双酶切反应体系如下：

(2)2×Lightening Cloning Kit连接试剂盒

连接ALSpro2180-ALSm1-OsUbiT表达盒或ALSpro1600-ALSm1-OsUbiT表达盒到pC0310载体上，连接体系如下：

连接程序：50℃，30min。

(3)转化：取上述连接产物2μl，加入到大肠杆菌感受态细胞中，轻微混匀，冰浴半小时；用电转仪1.8KV电击转化大肠杆菌感受态细胞；加入LB培养基1ml，37℃、220rpm振荡培养1h，5000rpm离心30s，弃800μl上清，将剩余菌体与培养基混匀，涂布于含卡那霉素的LB平板上。37℃培养16h左右，挑取单菌落，用特异性引物(0310-F2和0310-R2)做菌落PCR验证，挑选阳性菌落，37℃、220rpm摇菌过夜，利用高纯质粒小提试剂盒(中科瑞泰)提取质粒，酶切检测正确后(图3和图4)，保菌并送测序。将测序正确的质粒命名为pC2180ALSm1和pC1600ALSm1，载体图谱见图5和图6，测序得到其核苷酸序列如SEQ ID NO.9和10所示。

引物序列：

0310-F2:GGGCCATACTTGTTGGATATCAT(SEQ ID NO.19)；

0310-R2:TTGTTCATGGCGTAATGTCTCC(SEQ ID NO.20)。

实施例4农杆菌转化及鉴定

取-80℃保存的农杆菌EHA105感受态细胞加1μl实施例3中得到的测序正确pC2180ALSm1和pC1600ALSm1质粒，1.8KV电击转化。涂布于含有卡那霉素、利福平和链霉素的YEP培养板上，28℃培养48h左右，挑取单菌落摇菌过夜，用特异性引物(0310-F2和0310-R2)菌液PCR验证(图7和图8)，可扩增得到约900bp目的片段，挑选阳性克隆(工程农杆菌)，摇菌36-48h，保存菌液用于侵染。

实施例5农杆菌介导遗传转化

诱导：将中花11(ZH11)的种子经次氯酸钠消毒后置于诱导培养基(N6+2.4-D 3mg/L+CH 0.6g/L+Pro 0.5g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L)上，28℃常温暗培养30-40d，得到诱导的愈伤后继代培养30-40d；

筛选：将实施例4得到的工程农杆菌，通过农杆菌介导的遗传转化法转化上述愈伤组织，共培养3d后，清洗5-6遍，转移至含0.8μmol双草醚筛选培养基上，30℃暗培养30-50d，结果如图9所示，其中1为含pC0310载体的农杆菌侵染后筛选的愈伤，愈伤全部褐化死亡；2和3分别为包含pC2180ALSm1、pC1600ALSm1的农杆菌侵染后筛选的愈伤，可筛选获得抗性愈伤；

分化：筛选获得的抗性愈伤转移至含0.5μmol双草醚的分化培养基上，分化25-30d获得阳性苗；

生根：经分化获得的阳性苗转移至含0.5μmol双草醚的生根培养基上，生根7-15d最后获得阳性转基因植株；

炼苗及移栽：将根系生长旺盛的转化株系开启瓶口封口膜，加无菌水覆盖培养基1-2cm厚，置于室温下与空气接触进行炼苗2-3d后，移栽至温室栽培。

实施例6转基因株系鉴定

为了鉴定实施例5获得的株系是否为转基因株系，本实施例对经筛选培养、分化培养和生根培养获得的部分阳性转基因植株进行PCR验证。

首先提取样品DNA，DNA提取步骤如下：取约2cm长的水稻叶片置于2ml离心管中；在研钵中加入800μl1.5×CTAB，研磨叶片至匀浆并倒回离心管内；65℃水浴20-30min，每5min颠倒混匀1次；12000rpm离心10min；吸取400μl上清液至新的离心管，加入2倍体积经冰预冷的无水乙醇，-20℃冰置20min；12000rpm离心10min；弃上清，加入500μl 75％乙醇，颠倒漂洗，8000rpm离心5min；弃上清，置于超净台吹干或自然晾干，加100μl ddH₂O溶解DNA。

为了区分水稻内源基因，设计一对引物(0310-F3/0310-R3)对转基因株系基因组DNA样品进行PCR扩增检测，该引物对以内源水稻基因组为模板无法扩增获得片段，以转基因表达盒为模板扩增获得片段大小为875bp。

引物序列如下：

0310-F3:TGCTTCTGTGGCTAACCCAGGT(SEQ ID NO.25)；

0310-R3:AGGCGGGAAACGACAATCTAAG(SEQ ID NO.26)。

以转化用质粒DNA作为阳性对照，ZH11基因组DNA作为阴性对照。

PCR反应程序如下：94℃预变性5min，94℃变性45s，55-65℃退火45s；72℃延伸1.5min；30-35个循环；72℃再延伸10min；16℃结束。

PCR反应体系如下：

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，结果如图10和图11所示，结果表明，pC2180ALSm1和pC1600ALSm1的大部分转基因样品中含有875bp的转基因条带，与载体对照大小相同；而阴性对照ZH11无法扩出条带。

实施例7抗性表型鉴定

对实施例6鉴定的转基因株系进行抗性表型鉴定，具体如下：

选取pC2180ALSm1转基因部分生根材料在移栽7-14天后(4叶期)，喷施20×(60mg/m²)双草醚。7天后，野生型对照WT(ZH11)叶片已枯黄，转基因T0代植株多数正常生长，未出现黄化。14天后，野生型对照WT(ZH11)及转基因敏感株系已濒死，存活株系为双草醚抗性株系(图12)。

选取pC2180ALSm1转基因部分生根材料在移栽几周后(7叶期)，喷施20×(60mg/m²)双草醚。7天后，野生型对照WT(ZH11)叶片已枯黄，转基因T0代植株多数正常生长，未出现黄化。14天后，野生型对照WT(ZH11)出现不同程度的枯黄、枯萎或死亡，但转基因阳性株系生长正常，存活株系为双草醚抗性株系(图13)。

选取pC2180ALSm1转基因部分生根材料在移栽1个月后(初分蘖期)，喷施30×(90mg/m²)双草醚。7天后，野生型对照WT(ZH11)叶片已枯黄，转基因T0代植株多数正常生长，未出现黄化。14天后，野生型对照WT(ZH11)出现不同程度的枯黄、枯萎或死亡，但转基因阳性株系生长正常，存活株系为双草醚抗性株系(图14)。

选取pC1600ALSm1转基因部分生根材料在移栽2周后(5-6叶期)，喷施20×(60mg/m²)双草醚。14天后，野生型对照ZH11(白色尖头所指)叶片已枯黄，转基因T0代植株多数正常生长，未出现黄化。21天后，野生型对照ZH11及转基因敏感株系已濒死，存活株系为双草醚抗性株系(图15)。

上述结果表明，通过筛选获得的导入ALSpro启动子驱动的ALS突变基因的转基因水稻株系高抗双草醚。ALSpro启动子可驱动目的基因在愈伤组织水平，根中，苗期、分蘖期叶片中稳定表达，是一个高效的组成型启动子。由ALSpro启动子所组成的转基因筛选表达盒、表达载体在转基因植物制备中具有较高的效率。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 海南波莲水稻基因科技有限公司

<120> 植物组成型启动子ALSpro及其应用

<130> KHP201111235.6

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2180

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgtaaagtct tcactcctcc ccctttctct ctagttagcg gagacatgac aaccagtcat 60

ccgattaggt ttatagtggc attgcaagca gtcagcaaat gaataaatga aagaggcaat 120

cttcatggtc ctcttcatct tgtctcacat gcgagttgat tttagaccaa cacggtaact 180

caggggataa aatagatttg ttacaaattt ccaataagta agattccatg aaattggtga 240

tagtatataa tgattttatt gcacaagcta tgcattgcag ctactgattc aacactattc 300

agaaaaaaaa agaacaagtg tatttctggt aaaactgttc cattcaaaat ctagtccacg 360

actagtccat gatttggtcg tgtgaaaaca atggatgcac tatatagtct ctagtactat 420

tctattgtac taagcactat atatagtatt ataaactacg gtttatggag tagccagcaa 480

gacaataagt taacaagaaa taaatttaaa gtactaaaca caataagcca attagcatgg 540

tgaaatgatg atttgctatg actaatctac gactaattgt gcgacttgct atttggtcga 600

gtcgtagccc tctagtcgtc tgacttgact gacgttatga ctagtctacg acttgataac 660

agcgatccag atgtcttaag tgatgaggag aagaaagaac taccagaaag taaaccttat 720

atgcatagtt acatacacag gtacacttcc gaaggcccca atcaatggaa taccatatgc 780

tcttattagg ctattatatg gttctgggta acaattaaat atatcatggg tgtaccgcca 840

atgtgaaatt gagaactgca tacacatagc cacattataa aatataaatg cactatgctc 900

ctgatcatgg aatgccaacc ccttattatc aaacccaaag aagggaaatc cctttctatc 960

tcaagcatgc acaattacct ttgtttagca taaatctatc aaatattgca atgcaaacct 1020

taagcacaga tgtcctccct cttaaatatt aatcataatc ctcagtaaat ggacatacag 1080

cataaagtac tttaaattac cataggttga attggaaata ttctttttag tagctcacag 1140

aaaaatgggt actaaaacta actattagta aacataaaag ccccttaatg ataggagggc 1200

tctacacaag acagtcagta gcatgataac cacctacaat gttgttccta caaataaaaa 1260

tactgtagca atctcttact aagttaaaac atactgaggt tctagggttt aaccataagt 1320

aattagaata tcaaaatagc tcaagattag agaaggtcct acagaaaaac acggttatct 1380

gcttctcaaa tggcctagct acaccgggca ctagcaggat cttaaacagc actaaaataa 1440

gtatctccct tggtcatcaa atcgaaaaga aaatcctaca gagtccacgc ctttccttcc 1500

ccccactaat taacgaaaag aaacgcagag ttccaattaa ggagaaagag atacggggta 1560

caacaaacat cgcattcgtc tcgtgctagg gttttcggga ggcgggtcta gggttgaggc 1620

aaaaaggggg agggaattga gcagggggtt accgcggtag tcgacgccgg agttgagctt 1680

gacgacgacg gggcgccccc tgatggactt gaggaagtcg gagggcgtct tcaccgcccc 1740

gccgccgccg ccaccgccgc cgccgcccga gccggacttc tcgccgccac tgctcatctt 1800

gcgctgcgtt tgtgcgggtg cgggtgcggg tgctagactg ctaggtctcg cggttgcatc 1860

cgcatccgac tttgagatcg attttttatc gggttctgta ccctccaccc gttattggga 1920

ctgacccacc tgtcatcctc atccaatcga ctgacacgcg ggcccagatc gaccccgacg 1980

tggctgtgtg tcatcctatc ccaccgacat atggggccca ctgtgacgtg gccccacacg 2040

atcccatccg agccacacat cgcctcacgc tgcgtcaccg cgcgcggaca aaacacccac 2100

acccccacac tctccacccc tctctccctc tcgcccaaac ccagaaaccc tcgccgccgc 2160

cgccgccgcc accacccacc 2180

<210> 2

<211> 1600

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcgacttgct atttggtcga gtcgtagccc tctagtcgtc tgacttgact gacgttatga 60

ctagtctacg acttgataac agcgatccag atgtcttaag tgatgaggag aagaaagaac 120

taccagaaag taaaccttat atgcatagtt acatacacag gtacacttcc gaaggcccca 180

atcaatggaa taccatatgc tcttattagg ctattatatg gttctgggta acaattaaat 240

atatcatggg tgtaccgcca atgtgaaatt gagaactgca tacacatagc cacattataa 300

aatataaatg cactatgctc ctgatcatgg aatgccaacc ccttattatc aaacccaaag 360

aagggaaatc cctttctatc tcaagcatgc acaattacct ttgtttagca taaatctatc 420

aaatattgca atgcaaacct taagcacaga tgtcctccct cttaaatatt aatcataatc 480

ctcagtaaat ggacatacag cataaagtac tttaaattac cataggttga attggaaata 540

ttctttttag tagctcacag aaaaatgggt actaaaacta actattagta aacataaaag 600

ccccttaatg ataggagggc tctacacaag acagtcagta gcatgataac cacctacaat 660

gttgttccta caaataaaaa tactgtagca atctcttact aagttaaaac atactgaggt 720

tctagggttt aaccataagt aattagaata tcaaaatagc tcaagattag agaaggtcct 780

acagaaaaac acggttatct gcttctcaaa tggcctagct acaccgggca ctagcaggat 840

cttaaacagc actaaaataa gtatctccct tggtcatcaa atcgaaaaga aaatcctaca 900

gagtccacgc ctttccttcc ccccactaat taacgaaaag aaacgcagag ttccaattaa 960

ggagaaagag atacggggta caacaaacat cgcattcgtc tcgtgctagg gttttcggga 1020

ggcgggtcta gggttgaggc aaaaaggggg agggaattga gcagggggtt accgcggtag 1080

tcgacgccgg agttgagctt gacgacgacg gggcgccccc tgatggactt gaggaagtcg 1140

gagggcgtct tcaccgcccc gccgccgccg ccaccgccgc cgccgcccga gccggacttc 1200

tcgccgccac tgctcatctt gcgctgcgtt tgtgcgggtg cgggtgcggg tgctagactg 1260

ctaggtctcg cggttgcatc cgcatccgac tttgagatcg attttttatc gggttctgta 1320

ccctccaccc gttattggga ctgacccacc tgtcatcctc atccaatcga ctgacacgcg 1380

ggcccagatc gaccccgacg tggctgtgtg tcatcctatc ccaccgacat atggggccca 1440

ctgtgacgtg gccccacacg atcccatccg agccacacat cgcctcacgc tgcgtcaccg 1500

cgcgcggaca aaacacccac acccccacac tctccacccc tctctccctc tcgcccaaac 1560

ccagaaaccc tcgccgccgc cgccgccgcc accacccacc 1600

<210> 3

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgtttttaat gtatgctcca ccatgttggc gtaaagtctt cactcctccc cc 52

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgtagccatg gtgggtggtg gcgg 24

<210> 5

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgtttttaat gtatgctcca ccatgttggg cgacttgcta tttggtcgag tc 52

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgtagccatg gtgggtggtg gcgg 24

<210> 7

<211> 4431

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgtaaagtct tcactcctcc ccctttctct ctagttagcg gagacatgac aaccagtcat 60

ccgattaggt ttatagtggc attgcaagca gtcagcaaat gaataaatga aagaggcaat 120

cttcatggtc ctcttcatct tgtctcacat gcgagttgat tttagaccaa cacggtaact 180

caggggataa aatagatttg ttacaaattt ccaataagta agattccatg aaattggtga 240

tagtatataa tgattttatt gcacaagcta tgcattgcag ctactgattc aacactattc 300

agaaaaaaaa agaacaagtg tatttctggt aaaactgttc cattcaaaat ctagtccacg 360

actagtccat gatttggtcg tgtgaaaaca atggatgcac tatatagtct ctagtactat 420

tctattgtac taagcactat atatagtatt ataaactacg gtttatggag tagccagcaa 480

gacaataagt taacaagaaa taaatttaaa gtactaaaca caataagcca attagcatgg 540

tgaaatgatg atttgctatg actaatctac gactaattgt gcgacttgct atttggtcga 600

gtcgtagccc tctagtcgtc tgacttgact gacgttatga ctagtctacg acttgataac 660

agcgatccag atgtcttaag tgatgaggag aagaaagaac taccagaaag taaaccttat 720

atgcatagtt acatacacag gtacacttcc gaaggcccca atcaatggaa taccatatgc 780

tcttattagg ctattatatg gttctgggta acaattaaat atatcatggg tgtaccgcca 840

atgtgaaatt gagaactgca tacacatagc cacattataa aatataaatg cactatgctc 900

ctgatcatgg aatgccaacc ccttattatc aaacccaaag aagggaaatc cctttctatc 960

tcaagcatgc acaattacct ttgtttagca taaatctatc aaatattgca atgcaaacct 1020

taagcacaga tgtcctccct cttaaatatt aatcataatc ctcagtaaat ggacatacag 1080

cataaagtac tttaaattac cataggttga attggaaata ttctttttag tagctcacag 1140

aaaaatgggt actaaaacta actattagta aacataaaag ccccttaatg ataggagggc 1200

tctacacaag acagtcagta gcatgataac cacctacaat gttgttccta caaataaaaa 1260

tactgtagca atctcttact aagttaaaac atactgaggt tctagggttt aaccataagt 1320

aattagaata tcaaaatagc tcaagattag agaaggtcct acagaaaaac acggttatct 1380

gcttctcaaa tggcctagct acaccgggca ctagcaggat cttaaacagc actaaaataa 1440

gtatctccct tggtcatcaa atcgaaaaga aaatcctaca gagtccacgc ctttccttcc 1500

ccccactaat taacgaaaag aaacgcagag ttccaattaa ggagaaagag atacggggta 1560

caacaaacat cgcattcgtc tcgtgctagg gttttcggga ggcgggtcta gggttgaggc 1620

aaaaaggggg agggaattga gcagggggtt accgcggtag tcgacgccgg agttgagctt 1680

gacgacgacg gggcgccccc tgatggactt gaggaagtcg gagggcgtct tcaccgcccc 1740

gccgccgccg ccaccgccgc cgccgcccga gccggacttc tcgccgccac tgctcatctt 1800

gcgctgcgtt tgtgcgggtg cgggtgcggg tgctagactg ctaggtctcg cggttgcatc 1860

cgcatccgac tttgagatcg attttttatc gggttctgta ccctccaccc gttattggga 1920

ctgacccacc tgtcatcctc atccaatcga ctgacacgcg ggcccagatc gaccccgacg 1980

tggctgtgtg tcatcctatc ccaccgacat atggggccca ctgtgacgtg gccccacacg 2040

atcccatccg agccacacat cgcctcacgc tgcgtcaccg cgcgcggaca aaacacccac 2100

acccccacac tctccacccc tctctccctc tcgcccaaac ccagaaaccc tcgccgccgc 2160

cgccgccgcc accacccacc atggctacga ccgccgcggc cgcggccgcc gccctgtccg 2220

ccgccgcgac ggccaagacc ggccgtaaga accaccagcg acaccacgtc cttcccgctc 2280

gaggccgggt gggggcggcg gcggtcaggt gctcggcggt gtccccggtc accccgccgt 2340

ccccggcgcc gccggccacg ccgctccggc cgtgggggcc ggccgagccc cgcaagggcg 2400

cggacatcct cgtggaggcg ctggagcggt gcggcgtcag cgacgtgttc gcctacccag 2460

gcggcgcgtc gatggagatc caccaggcgc tgacgcgctc cccggtcatc accaaccacc 2520

tcttccgcca cgagcagggc gaggcgttcg cggcgtccgg gtacgcgcgc gcgtccggcc 2580

gcgtcggggt ctgcgtcgcc acctccggcc ccggcgcaac caacctcgtg tccgcgctcg 2640

ccgacgcgct gctcgactcc gtcccgatgg tcgccatcac gggccaggtc ccccgccgca 2700

tgatcggcac cgacgccttc caggagacgc ccatagtcga ggtcacccgc tccatcacca 2760

agcacaatta ccttgtcctt gatgtggagg acatcccccg cgtcatacag gaagccttct 2820

tcctcgcgtc ctcgggccgt cctggcccgg tgctggtgga catccccaag gacatccagc 2880

agcagatggc cgtgccggtc tgggacacct cgatgaatct accagggtac atcgcacgcc 2940

tgcccaagcc acccgcgaca gaattgcttg agcaggtctt gcgtctggtt ggcgagtcac 3000

ggcgcccgat tctctatgtc ggtggtggct gctctgcatc tggtgacgaa ttgcgctggt 3060

ttgttgagct gactggtatc ccagttacaa ccactctgat gggcctcggc aatttcccca 3120

gtgacgaccc gttgtccctg cggatgcttg ggatgcatgg cacggtgtac gcaaattatg 3180

ccgtggataa ggctgacctg ttgcttgcgt ttggtgtgcg gtttgatgat cgtgtgacag 3240

ggaaaattga ggcttttgca agcagggcca agattgtgca cattgacatt gatccagcag 3300

agattggaaa gaacaagcaa ccacatgtgt caatttgcgc agatgttaag ctcgctttac 3360

agggcttgaa tgctctgcta caacagagca caacaaagac aagttctgat tttagtgcat 3420

ggcacaatga gttggaccag cagaagaggg agtttcctct ggggtacaaa acttttggtg 3480

aagagatccc accgcaatat gccattcagg tgctggatga gctgacgaaa ggtgaggcaa 3540

tcatcgctac tggtgttggg cagcaccaga tgtgggcggc acaatattac acctacaagc 3600

ggccacggca gtggctgtct tcggctggtc tgggcgcaat gggatttggg ctgcctgccg 3660

cagctggtgc ttctgtggct aacccaggtg tcacagttgt tgatattgat ggggatggta 3720

gcttcctcat gaacattcag gagctggcat tgatccgcat tgagaacctc cctgtgaagg 3780

tgatggtgtt gaacaaccaa catttgggta tggtggtgca attggaggat aggttttaca 3840

aggcgaatag ggcgcataca tacttgggca acccggaatg tgagagcgag atatatccag 3900

attttgtgac tattgctaag gggttcaata ttccggcagt ccgtgtaaca aagaagagtg 3960

aagtccgtgc cgccatcaag aagatgctcg agactccagg gccatacttg ttggatatca 4020

tcgtcccgca ccaggagcat gtgctgccta tgatcccaat tgggggcgca ttcaaggaca 4080

tgatcctgga tggtgatggc aggactgtgt attaaaggcc tgtcctcagc catagagctg 4140

ctgctgttct agggttcaca agtctgccta tttgtcttcc ccaatggagc tatggttgtc 4200

tggtctggtc cttggtcgtg tcccgtttca ttgtgtacta tttacctgta atgtgtatcc 4260

ttaagtctgg tttgatggtg tctgaaacgt tttgctgtgg tagagcagca tggaagaact 4320

ataatgaata agtgatccct aatcattgtg tccaaatttt gcttctgcta tacccttttg 4380

tgctgtttct tatgttttgc ttaaaaattt gatctgacaa acaaatttgt c 4431

<210> 8

<211> 3851

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcgacttgct atttggtcga gtcgtagccc tctagtcgtc tgacttgact gacgttatga 60

ctagtctacg acttgataac agcgatccag atgtcttaag tgatgaggag aagaaagaac 120

taccagaaag taaaccttat atgcatagtt acatacacag gtacacttcc gaaggcccca 180

atcaatggaa taccatatgc tcttattagg ctattatatg gttctgggta acaattaaat 240

atatcatggg tgtaccgcca atgtgaaatt gagaactgca tacacatagc cacattataa 300

aatataaatg cactatgctc ctgatcatgg aatgccaacc ccttattatc aaacccaaag 360

aagggaaatc cctttctatc tcaagcatgc acaattacct ttgtttagca taaatctatc 420

aaatattgca atgcaaacct taagcacaga tgtcctccct cttaaatatt aatcataatc 480

ctcagtaaat ggacatacag cataaagtac tttaaattac cataggttga attggaaata 540

ttctttttag tagctcacag aaaaatgggt actaaaacta actattagta aacataaaag 600

ccccttaatg ataggagggc tctacacaag acagtcagta gcatgataac cacctacaat 660

gttgttccta caaataaaaa tactgtagca atctcttact aagttaaaac atactgaggt 720

tctagggttt aaccataagt aattagaata tcaaaatagc tcaagattag agaaggtcct 780

acagaaaaac acggttatct gcttctcaaa tggcctagct acaccgggca ctagcaggat 840

cttaaacagc actaaaataa gtatctccct tggtcatcaa atcgaaaaga aaatcctaca 900

gagtccacgc ctttccttcc ccccactaat taacgaaaag aaacgcagag ttccaattaa 960

ggagaaagag atacggggta caacaaacat cgcattcgtc tcgtgctagg gttttcggga 1020

ggcgggtcta gggttgaggc aaaaaggggg agggaattga gcagggggtt accgcggtag 1080

tcgacgccgg agttgagctt gacgacgacg gggcgccccc tgatggactt gaggaagtcg 1140

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ctgcaggccc gggcagcgct gaagaacttc cctaggcacg tgtacgtatt ttttaccagg 60

tgaactccaa gtcctggacc cttttttaag cttagattgt cgtttcccgc cttcagttta 120

aactatcagt gtttgacagg atatattggc gggtaaacct aagagaaaag agcgtttatt 180

agaataacgg atatttaaaa gggcgtgaaa aggtttatcc gttcgtccat ttgtatgtgc 240

atgccaacca cagggttccc ctcgggatca aagtactttg atccaacccc tccgctgcta 300

tagtgcagtc ggcttctgac gttcagtgca gccgtcttct gaaaacgaca tgtcgcacaa 360

gtcctaagtt acgcgacagg ctgccgccct gcccttttcc tggcgttttc ttgtcgcgtg 420

ttttagtcgc ataaagtaga atacttgcga ctagaaccgg agacattacg ccatgaacaa 480

gagcgccgcc gctggcctgc tgggctatgc ccgcgtcagc accgacgacc aggacttgac 540

caaccaacgg gccgaactgc acgcggccgg ctgcaccaag ctgttttccg agaagatcac 600

cggcaccagg cgcgaccgcc cggagctggc caggatgctt gaccacctac gccctggcga 660

cgttgtgaca gtgaccaggc tagaccgcct ggcccgcagc acccgcgacc tactggacat 720

tgccgagcgc atccaggagg ccggcgcggg cctgcgtagc ctggcagagc cgtgggccga 780

caccaccacg ccggccggcc gcatggtgtt gaccgtgttc gccggcattg ccgagttcga 840

gcgttcccta atcatcgacc gcacccggag cgggcgcgag gccgccaagg cccgaggcgt 900

gaagtttggc ccccgcccta ccctcacccc ggcacagatc gcgcacgccc gcgagctgat 960

cgaccaggaa ggccgcaccg tgaaagaggc ggctgcactg cttggcgtgc atcgctcgac 1020

cctgtaccgc gcacttgagc gcagcgagga agtgacgccc accgaggcca ggcggcgcgg 1080

tgccttccgt gaggacgcat tgaccgaggc cgacgccctg gcggccgccg agaatgaacg 1140

ccaagaggaa caagcatgaa accgcaccag gacggccagg acgaaccgtt tttcattacc 1200

gaagagatcg aggcggagat gatcgcggcc gggtacgtgt tcgagccgcc cgcgcacgtc 1260

tcaaccgtgc ggctgcatga aatcctggcc ggtttgtctg atgccaagct ggcggcctgg 1320

ccggccagct tggccgctga agaaaccgag cgccgccgtc taaaaaggtg atgtgtattt 1380

gagtaaaaca gcttgcgtca tgcggtcgct gcgtatatga tgcgatgagt aaataaacaa 1440

atacgcaagg ggaacgcatg aaggttatcg ctgtacttaa ccagaaaggc gggtcaggca 1500

agacgaccat cgcaacccat ctagcccgcg ccctgcaact cgccggggcc gatgttctgt 1560

tagtcgattc cgatccccag ggcagtgccc gcgattgggc ggccgtgcgg gaagatcaac 1620

cgctaaccgt tgtcggcatc gaccgcccga cgattgaccg cgacgtgaag gccatcggcc 1680

ggcgcgactt cgtagtgatc gacggagcgc cccaggcggc ggacttggct gtgtccgcga 1740

tcaaggcagc cgacttcgtg ctgattccgg tgcagccaag cccttacgac atatgggcca 1800

ccgccgacct ggtggagctg gttaagcagc gcattgaggt cacggatgga aggctacaag 1860

cggcctttgt cgtgtcgcgg gcgatcaaag gcacgcgcat cggcggtgag gttgccgagg 1920

cgctggccgg gtacgagctg cccattcttg agtcccgtat cacgcagcgc gtgagctacc 1980

caggcactgc cgccgccggc acaaccgttc ttgaatcaga acccgagggc gacgctgccc 2040

gcgaggtcca ggcgctggcc gctgaaatta aatcaaaact catttgagtt aatgaggtaa 2100

agagaaaatg agcaaaagca caaacacgct aagtgccggc cgtccgagcg cacgcagcag 2160

caaggctgca acgttggcca gcctggcaga cacgccagcc atgaagcggg tcaactttca 2220

gttgccggcg gaggatcaca ccaagctgaa gatgtacgcg gtacgccaag gcaagaccat 2280

taccgagctg ctatctgaat acatcgcgca gctaccagag taaatgagca aatgaataaa 2340

tgagtagatg aattttagcg gctaaaggag gcggcatgga aaatcaagaa caaccaggca 2400

ccgacgccgt ggaatgcccc atgtgtggag gaacgggcgg ttggccaggc gtaagcggct 2460

gggttgtctg ccggccctgc aatggcactg gaacccccaa gcccgaggaa tcggcgtgac 2520

ggtcgcaaac catccggccc ggtacaaatc ggcgcggcgc tgggtgatga cctggtggag 2580

aagttgaagg ccgcgcaggc cgcccagcgg caacgcatcg aggcagaagc acgccccggt 2640

gaatcgtggc aagcggccgc tgatcgaatc cgcaaagaat cccggcaacc gccggcagcc 2700

ggtgcgccgt cgattaggaa gccgcccaag ggcgacgagc aaccagattt tttcgttccg 2760

atgctctatg acgtgggcac ccgcgatagt cgcagcatca tggacgtggc cgttttccgt 2820

ctgtcgaagc gtgaccgacg agctggcgag gtgatccgct acgagcttcc agacgggcac 2880

gtagaggttt ccgcagggcc ggccggcatg gccagtgtgt gggattacga cctggtactg 2940

atggcggttt cccatctaac cgaatccatg aaccgatacc gggaagggaa gggagacaag 3000

cccggccgcg tgttccgtcc acacgttgcg gacgtactca agttctgccg gcgagccgat 3060

ggcggaaagc agaaagacga cctggtagaa acctgcattc ggttaaacac cacgcacgtt 3120

gccatgcagc gtacgaagaa ggccaagaac ggccgcctgg tgacggtatc cgagggtgaa 3180

gccttgatta gccgctacaa gatcgtaaag agcgaaaccg ggcggccgga gtacatcgag 3240

atcgagctag ctgattggat gtaccgcgag atcacagaag gcaagaaccc ggacgtgctg 3300

acggttcacc ccgattactt tttgatcgat cccggcatcg gccgttttct ctaccgcctg 3360

gcacgccgcg ccgcaggcaa ggcagaagcc agatggttgt tcaagacgat ctacgaacgc 3420

agtggcagcg ccggagagtt caagaagttc tgtttcaccg tgcgcaagct gatcgggtca 3480

aatgacctgc cggagtacga tttgaaggag gaggcggggc aggctggccc gatcctagtc 3540

atgcgctacc gcaacctgat cgagggcgaa gcatccgccg gttcctaatg tacggagcag 3600

atgctagggc aaattgccct agcaggggaa aaaggtcgaa aaggtctctt tcctgtggat 3660

agcacgtaca ttgggaaccc aaagccgtac attgggaacc ggaacccgta cattgggaac 3720

ccaaagccgt acattgggaa ccggtcacac atgtaagtga ctgatataaa agagaaaaaa 3780

ggcgattttt ccgcctaaaa ctctttaaaa cttattaaaa ctcttaaaac ccgcctggcc 3840

tgtgcataac tgtctggcca gcgcacagcc gaagagctgc aaaaagcgcc tacccttcgg 3900

tcgctgcgct ccctacgccc cgccgcttcg cgtcggccta tcgcggccgc tggccgctca 3960

aaaatggctg gcctacggcc aggcaatcta ccagggcgcg gacaagccgc gccgtcgcca 4020

ctcgaccgcc ggcgcccaca tcaaggcacc ctgcctcgcg cgtttcggtg atgacggtga 4080

aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg 4140

gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg gcgcagccat 4200

gacccagtca cgtagcgata gcggagtgta tactggctta actatgcggc atcagagcag 4260

attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa 4320

taccgcatca ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg 4380

ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg 4440

gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag 4500

gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga 4560

cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct 4620

ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc 4680

tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg 4740

gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc 4800

tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca 4860

ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag 4920

ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct 4980

ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc 5040

accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 5100

tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca 5160

cgttaaggga ttttggtcat gcattctagg tactaaaaca attcatccag taaaatataa 5220

tattttattt tctcccaatc aggcttgatc cccagtaagt caaaaaatag ctcgacatac 5280

tgttcttccc cgatatcctc cctgatcgac cggacgcaga aggcaatgtc ataccacttg 5340

tccgccctgc cgcttctccc aagatcaata aagccactta ctttgccatc tttcacaaag 5400

atgttgctgt ctcccaggtc gccgtgggaa aagacaagtt cctcttcggg cttttccgtc 5460

tttaaaaaat catacagctc gcgcggatct ttaaatggag tgtcttcttc ccagttttcg 5520

caatccacat cggccagatc gttattcagt aagtaatcca attcggctaa gcggctgtct 5580

aagctattcg tatagggaca atccgatatg tcgatggagt gaaagagcct gatgcactcc 5640

gcatacagct cgataatctt ttcagggctt tgttcatctt catactcttc cgagcaaagg 5700

acgccatcgg cctcactcat gagcagattg ctccagccat catgccgttc aaagtgcagg 5760

acctttggaa caggcagctt tccttccagc catagcatca tgtccttttc ccgttccaca 5820

tcataggtgg tccctttata ccggctgtcc gtcattttta aatataggtt ttcattttct 5880

cccaccagct tatatacctt agcaggagac attccttccg tatcttttac gcagcggtat 5940

ttttcgatca gttttttcaa ttccggtgat attctcattt tagccattta ttatttcctt 6000

cctcttttct acagtattta aagatacccc aagaagctaa ttataacaag acgaactcca 6060

attcactgtt ccttgcattc taaaacctta aataccagaa aacagctttt tcaaagttgt 6120

tttcaaagtt ggcgtataac atagtatcga cggagccgat tttgaaaccg cggtgatcac 6180

aggcagcaac gctctgtcat cgttacaatc aacatgctac cctccgcgag atcatccgtg 6240

tttcaaaccc ggcagcttag ttgccgttct tccgaatagc atcggtaaca tgagcaaagt 6300

ctgccgcctt acaacggctc tcccgctgac gccgtcccgg actgatgggc tgcctgtatc 6360

gagtggtgat tttgtgccga gctgccggtc ggggagctgt tggctggctg gtggcaggat 6420

atattgtggt gtaaacaaat tgacgcttag acaacttaat aacacattgc ggacgttttt 6480

aatgtatgct ccaccatgtt gggcgacttg ctatttggtc gagtcgtagc cctctagtcg 6540

tctgacttga ctgacgttat gactagtcta cgacttgata acagcgatcc agatgtctta 6600

agtgatgagg agaagaaaga actaccagaa agtaaacctt atatgcatag ttacatacac 6660

aggtacactt ccgaaggccc caatcaatgg aataccatat gctcttatta ggctattata 6720

tggttctggg taacaattaa atatatcatg ggtgtaccgc caatgtgaaa ttgagaactg 6780

catacacata gccacattat aaaatataaa tgcactatgc tcctgatcat ggaatgccaa 6840

ccccttatta tcaaacccaa agaagggaaa tccctttcta tctcaagcat gcacaattac 6900

ctttgtttag cataaatcta tcaaatattg caatgcaaac cttaagcaca gatgtcctcc 6960

ctcttaaata ttaatcataa tcctcagtaa atggacatac agcataaagt actttaaatt 7020

accataggtt gaattggaaa tattcttttt agtagctcac agaaaaatgg gtactaaaac 7080

taactattag taaacataaa agccccttaa tgataggagg gctctacaca agacagtcag 7140

tagcatgata accacctaca atgttgttcc tacaaataaa aatactgtag caatctctta 7200

ctaagttaaa acatactgag gttctagggt ttaaccataa gtaattagaa tatcaaaata 7260

gctcaagatt agagaaggtc ctacagaaaa acacggttat ctgcttctca aatggcctag 7320

ctacaccggg cactagcagg atcttaaaca gcactaaaat aagtatctcc cttggtcatc 7380

aaatcgaaaa gaaaatccta cagagtccac gcctttcctt ccccccacta attaacgaaa 7440

agaaacgcag agttccaatt aaggagaaag agatacgggg tacaacaaac atcgcattcg 7500

tctcgtgcta gggttttcgg gaggcgggtc tagggttgag gcaaaaaggg ggagggaatt 7560

gagcaggggg ttaccgcggt agtcgacgcc ggagttgagc ttgacgacga cggggcgccc 7620

cctgatggac ttgaggaagt cggagggcgt cttcaccgcc ccgccgccgc cgccaccgcc 7680

gccgccgccc gagccggact tctcgccgcc actgctcatc ttgcgctgcg tttgtgcggg 7740

tgcgggtgcg ggtgctagac tgctaggtct cgcggttgca tccgcatccg actttgagat 7800

cgatttttta tcgggttctg taccctccac ccgttattgg gactgaccca cctgtcatcc 7860

tcatccaatc gactgacacg cgggcccaga tcgaccccga cgtggctgtg tgtcatccta 7920

tcccaccgac atatggggcc cactgtgacg tggccccaca cgatcccatc cgagccacac 7980

atcgcctcac gctgcgtcac cgcgcgcgga caaaacaccc acacccccac actctccacc 8040

cctctctccc tctcgcccaa acccagaaac cctcgccgcc gccgccgccg ccaccaccca 8100

ccatggctac gaccgccgcg gccgcggccg ccgccctgtc cgccgccgcg acggccaaga 8160

ccggccgtaa gaaccaccag cgacaccacg tccttcccgc tcgaggccgg gtgggggcgg 8220

cggcggtcag gtgctcggcg gtgtccccgg tcaccccgcc gtccccggcg ccgccggcca 8280

cgccgctccg gccgtggggg ccggccgagc cccgcaaggg cgcggacatc ctcgtggagg 8340

cgctggagcg gtgcggcgtc agcgacgtgt tcgcctaccc aggcggcgcg tcgatggaga 8400

tccaccaggc gctgacgcgc tccccggtca tcaccaacca cctcttccgc cacgagcagg 8460

gcgaggcgtt cgcggcgtcc gggtacgcgc gcgcgtccgg ccgcgtcggg gtctgcgtcg 8520

ccacctccgg ccccggcgca accaacctcg tgtccgcgct cgccgacgcg ctgctcgact 8580

ccgtcccgat ggtcgccatc acgggccagg tcccccgccg catgatcggc accgacgcct 8640

tccaggagac gcccatagtc gaggtcaccc gctccatcac caagcacaat taccttgtcc 8700

ttgatgtgga ggacatcccc cgcgtcatac aggaagcctt cttcctcgcg tcctcgggcc 8760

gtcctggccc ggtgctggtg gacatcccca aggacatcca gcagcagatg gccgtgccgg 8820

tctgggacac ctcgatgaat ctaccagggt acatcgcacg cctgcccaag ccacccgcga 8880

cagaattgct tgagcaggtc ttgcgtctgg ttggcgagtc acggcgcccg attctctatg 8940

tcggtggtgg ctgctctgca tctggtgacg aattgcgctg gtttgttgag ctgactggta 9000

tcccagttac aaccactctg atgggcctcg gcaatttccc cagtgacgac ccgttgtccc 9060

tgcggatgct tgggatgcat ggcacggtgt acgcaaatta tgccgtggat aaggctgacc 9120

tgttgcttgc gtttggtgtg cggtttgatg atcgtgtgac agggaaaatt gaggcttttg 9180

caagcagggc caagattgtg cacattgaca ttgatccagc agagattgga aagaacaagc 9240

aaccacatgt gtcaatttgc gcagatgtta agctcgcttt acagggcttg aatgctctgc 9300

tacaacagag cacaacaaag acaagttctg attttagtgc atggcacaat gagttggacc 9360

agcagaagag ggagtttcct ctggggtaca aaacttttgg tgaagagatc ccaccgcaat 9420

atgccattca ggtgctggat gagctgacga aaggtgaggc aatcatcgct actggtgttg 9480

ggcagcacca gatgtgggcg gcacaatatt acacctacaa gcggccacgg cagtggctgt 9540

cttcggctgg tctgggcgca atgggatttg ggctgcctgc cgcagctggt gcttctgtgg 9600

ctaacccagg tgtcacagtt gttgatattg atggggatgg tagcttcctc atgaacattc 9660

aggagctggc attgatccgc attgagaacc tccctgtgaa ggtgatggtg ttgaacaacc 9720

aacatttggg tatggtggtg caattggagg ataggtttta caaggcgaat agggcgcata 9780

catacttggg caacccggaa tgtgagagcg agatatatcc agattttgtg actattgcta 9840

aggggttcaa tattccggca gtccgtgtaa caaagaagag tgaagtccgt gccgccatca 9900

agaagatgct cgagactcca gggccatact tgttggatat catcgtcccg caccaggagc 9960

atgtgctgcc tatgatccca attgggggcg cattcaagga catgatcctg gatggtgatg 10020

gcaggactgt gtattaaagg cctgtcctca gccatagagc tgctgctgtt ctagggttca 10080

caagtctgcc tatttgtctt ccccaatgga gctatggttg tctggtctgg tccttggtcg 10140

tgtcccgttt cattgtgtac tatttacctg taatgtgtat ccttaagtct ggtttgatgg 10200

tgtctgaaac gttttgctgt ggtagagcag catggaagaa ctataatgaa taagtgatcc 10260

ctaatcattg tgtccaaatt ttgcttctgc tatacccttt tgtgctgttt cttatgtttt 10320

gcttaaaaat ttgatctgac aaacaaattt gtc 10353

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gcacaatgag ttggaccagc ag 22

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gtcagctcat ccagcacctg aa 22

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

agcatgaaga tcaaggtggt c 21

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gccttggcaa tccacatc 18

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cacccaccat ggctacgacc gccgc 25

<210> 16

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ggctgaggac aggcctttaa tacacagtcc tgccatca 38

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

attaaaggcc tgtcctcagc catagagctg 30

<210> 18

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tgcccgggcc tgcaggacaa atttgtttgt cagatcaaat ttttaagc 48

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gggccatact tgttggatat cat 23

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ttgttcatgg cgtaatgtct cc 22

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cacccaccat ggctacgacc gccgc 25

<210> 22

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ggctgaggac aggcctttaa tacacagtcc tgccatca 38

<210> 23

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

attaaaggcc tgtcctcagc catagagctg 30

<210> 24

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tgcccgggcc tgcaggacaa atttgtttgt c 31

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

tgcttctgtg gctaacccag gt 22

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

aggcgggaaa cgacaatcta ag 22

Claims (10)

1.植物组成型启动子ALSpro，其特征在于，其具有如下任一核苷酸序列：

(1)如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

(2)与如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列互补的序列；

(3)如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有同等启动子的功能、由(1)衍生的核苷酸序列。

2.含有权利要求1所述的启动子ALSpro的表达盒。

3.根据权利要求2所述的表达盒，其特征在于，所述表达盒包括以转录方向彼此功能性连接的启动子ALSpro、功能基因和终止子；

优选地，所述功能基因为筛选标记基因；所述筛选标记基因包括潮霉素磷酸转移酶基因Hn、水稻乙酰乳酸合酶突变基因ALS、Bar基因、抗性EPSPS基因或NptII基因。

4.含有权利要求1所述的启动子ALSpro或权利要求2或3所述的表达盒的载体。

5.含有权利要求1所述的启动子ALSpro或权利要求2或3所述的表达盒或权利要求4所述的载体的宿主细胞。

6.权利要求1所述的启动子ALSpro或权利要求2或3所述的表达盒或权利要求4所述的载体或权利要求5所述的宿主细胞的如下任一应用：

(1)在驱动DNA在选自植物愈伤组织、营养生长期的组织和生殖器官中的一种或多种组织器官中表达的应用；

(2)在制备转基因植物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述DNA为功能基因、功能基因的反义基因或能够干扰功能基因表达的小RNA基因；

所述功能基因包括植物农艺性状相关基因或筛选标记基因。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述植物为水稻、玉米、小麦、大麦、大豆、棉花、油菜、高粱或小米。

9.扩增权利要求1所述的启动子ALSpro的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示或如SEQ ID NO.5-6所示。

10.一种转基因植物的制备方法，其特征在于，将权利要求2或3所述的表达盒或权利要求4所述的载体导入植物中，通过筛选得到转基因植物。

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