CN109112130B - 一种高盐及衰老特异诱导启动子、工程载体及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种高盐及衰老特异诱导启动子、工程载体及应用，所述启动子如SEQ ID NO:1的核苷酸序列所示，该工程载体具有启动子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明构建了SIS1启动子驱动IPT1基因表达载体，实现了IPT1基因在高盐条件下及叶片衰老时期特异高表达，一方面抑制了叶片在高盐条件加速衰老的进程；另外，又抑制了植物因年龄造成的衰老进程，即可以实现抵御高盐促进衰老的过程又使植物正常条件下延缓衰老。本发明可广泛用于植物IPT1基因表达抑制的相关理论以及植物抵御高盐、抑制衰老等应用研究。

Description

一种高盐及衰老特异诱导启动子、工程载体及应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种植物叶片相关特性具有诱导的启动子及工程载体，具体涉及一种高盐及衰老特异诱导启动子、工程载体及应用。

背景技术

植物生来具有被土壤固着的特性，因此，在植物的生命周期中不可避免会遭受来自环境的各种胁迫，如异常温度，病虫害等，其中高盐危害是影响作物产量、品质的主要危害之一；如何提高作物抗盐能力是众多农艺学家的奋斗目标。

高盐会加速植物叶片衰老进程，叶片早衰导致叶绿素降解加快，光合效率显著降低，有机物合成能力明显下降，抵御病虫害的能力下降，最终导致作物减产，品质降低。植物相应盐胁迫可以理解为植物对盐感应到对盐响应的转变，叶片衰老是植物处于高盐胁迫中产生不良反应的关键环节。因此，使植物能够有效抵抗高盐造成的早衰，是农业生产中提高产量、品质的有效手段之一。

发明内容

根据以上现有技术的不足，本发明提供一种高盐及衰老特异诱导启动子、工程载体及应用，使植物具有抵抗高盐及衰老的特性。

目前的研究主要集中的对盐感应的机理上，通过研究植物如何感应盐进而发现抗盐途径。而在本发明中，申请人将研究的方向放在了植物抵御高盐胁迫集中在植物对盐响应的步骤上，既然高盐导致植物降低产量和品质的原因之一是叶片的早衰，很容易理解，如果有能力在高盐条件下可以使叶片衰老延缓，抵抗高盐所带来的加速叶片衰老的效果，从这个角度也可使植物具备抗盐能力。一批参与叶片衰老和抗性相关的基因已经被研究，如JUB1,VNI2,NTL4等等，这些基因中多数是在高盐条件下表达升高，但同时又会加速叶片衰老。因此，申请人的策略是利用高盐和叶片衰老诱导的启动子，通过重组技术，将高盐及叶片衰老的启动子与叶片衰老负调控因子(过量表达时，会抑制叶片衰老)组装成新的核酸元件。

申请人发现了一个转录水平同时被高盐和衰老上调表达的基因SIS1基因(AT5G02020),该基因功能尚未被研究；通过PCR手段克隆到该基因的793bp启动子，对该启动子进行了表达分析，通过Qrt-PCR,gus及LUC鉴定，发现该启动子可以被高盐和衰老同时特异诱导的；因此，申请人制备了以该启动子序列为基础骨架的工程载体；利用该工程载体，将细胞分裂素合成关键酶编码基因IPT1(AT1G68460)重组到该载体中，形成了SIS1启动子驱动的IPT1基因表达；由于SIS1启动子特异的被高盐和衰老诱导，因此，IPT1基因能够在高盐和叶片衰老时期特异表达，已有报道，不同作物中IPT过表达可以延缓叶片衰老；因此，在拟南芥中实现了特异抵抗高盐及年龄诱导的衰老过程。

如上文所述，本发明所述的一种高盐及衰老特异诱导启动子，其特征在于：所述启动子如SEQIDNO:1的核苷酸序列所示。

优选的，所述启动子含有一段5’UTR序列，位于序列的592位～793位。在后续启动子应用中，为了保证SIS1启动子的驱动效果，在工程载体构建中包含这段5’UTR序列

优选的，所述启动子具有两个真核生物启动子核心元件TATA-box，分别位于序列的561位～564位和582位～585位。

启动子的制备过程如下：提取野生型拟南芥col基因组DNA，利用SIS1启动子特异引物(proSISF:CGGTCATAGGTACGATTATGA；proSISR:TGGAATTCGTCGCTCGCTCT)进行PCR扩增；扩增程序：step1:95℃3min；step2:95℃30s,56℃40s,72℃30s，32个循环；step3:72℃10min。反应结束后，回收PCR片段并连接T载体，程序按照试剂公司说明进行；连接产物转化大肠杆菌DH5a，提取克隆并测序，得到SIS1启动子，即本发明所述的启动子。

本发明所述的启动子在启动拟南芥IPT1基因表达中的应用。

本发明所述的一种高盐及衰老特异诱导工程载体，其特征在于：该载体具有权利要求1所述的启动子序列，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。

工程载体的制备过程如下：以野生型拟南芥col基因组DNA为模板，利用SIS1启动子通用载体扩增引物(proSIS1-996F:ACATGATTACGAATTCCGGTCATAGGTACGATTATGA；proSIS1-996R:CGATCAATCAGGATCCTGGAATTCGTCGCTCGCTCT)，进行PCR扩增，扩增程序：step1:95℃3min；step2:95℃30s,58℃40s,72℃30s，33个循环；step3:72℃10min。片段回收后，通过infusion重组方法连接入载体p996；体系及方法为：SIS1启动子片段2μL；BamH1和EcoRI双酶切后的p996载体2μL；infusion酶1μL；50℃条件下反应15分钟，将连接产物转化入大肠杆菌DH5a中，测序选择阳性克隆并提取质粒，命名为proSIS1载体，即本发明所述的工程载体。

该工程载体具有以下特征：

(1)SIS1启动子自身含有一段5’UTR序列，可提高转录效率；

(2)该工程载体在使用过程中，只需要用BamH1单酶切载体；所有要连入的候选基因在设计引物时只需要加入固定接头：F向引物加接头ACGAATTCCAGGATCC+基因特异引物F向；R向引物加接头CGATCAATCAGGATCC+基因特异引物R向，利用infusion重组技术连入proSIS1载体即可使用，方便快捷，利于在实际操作中程序化连入其它相关基因；

(3)在多克隆位点后，连接有NOS终止子，该终止子具有广谱性，可广泛用于不同物种中；

(4)该工程载体植物抗性标记为抗除草剂基因，可通过简单高效的筛选方法获得阳性材料。

本发明所述的载体在在调控拟南芥IPT1基因表达中的应用。

优选的，将拟南芥IPT1基因全长CDS克隆到载体的BamH1位点处，获得重组载体，将该重组载体转化到农杆菌GV3301中，利用浸花的方法获得转基因拟南芥，该转基因拟南芥具有抗高盐及抗衰老的特性。除IPT1基因以外，其它具有相同功能特性的基因均可以利用此应用方法，均属于本发明保护范围内。

本发明中，IPT1基因是细胞素合成关键酶合成基因，已有报道，该基因在植物中过量表达能明显抑制叶片衰老过程，但该基因不是特异在高盐中表达的，基于此，申请人构建了SIS1启动子驱动IPT1基因表达载体，实现了IPT1基因在高盐条件下及叶片衰老时期特异高表达，一方面抑制了叶片在高盐条件加速衰老的进程；另外，又抑制了植物因年龄造成的衰老进程，即可以实现抵御高盐促进衰老的过程又使植物正常条件下延缓衰老。

本发明的优点在于：可广泛用于植物IPT1基因表达抑制的相关理论以及植物抵御高盐、抑制衰老等应用研究。

附图说明

图1为实施例2中拟南芥叶片在盐水浸泡不同时长内SIS1基因表达指数图；

图2为实施例2中拟南芥叶片在不同生长时期内SIS1基因表达指数图；

图3为实施例3中对拟南芥叶片分别进行盐水处理和空白处理后GUS染色对比图；

图4为实施例3中对拟南芥叶片在不同衰老时长后GUS染色对比图；

图5为实施例3中拟南芥叶片在不同盐度浸泡利用多功能酶标仪测定LUC活性指数图；

图6为实施例3中拟南芥叶片在不同生长时长内利用多功能酶标仪测定LUC活性指数图；

图7为实施例4中工程载体图谱；

图8为实施例5中col及proSIS1::IPT1转基因材料在相同盐度处理后的离体叶片表型图；

图9为实施例5中col及proSIS1::IPT1转基因材料在相同盐度处理后的叶绿素含量测定对比图；

图10为实施例5中col及proSIS1::IPT1转基因材料在相同盐度处理后的离子渗透率测定对比图；

图11为实施例5中col及proSIS1::IPT1转基因植株在相同盐度处理后的表型图；

图12为实施例5中col及proSIS1::IPT1转基因植株在相同盐度处理后的叶绿素含量测定对比图；

图13为实施例5中col及proSIS1::IPT1转基因植株在相同盐度处理后的离子渗透率测定对比图；

图14为实施例5中col及proSIS1::IPT1转基因植株在相同生长周期后的表型图；

图15为实施例5中col及proSIS1::IPT1转基因植株在相同生长周期后的叶绿素含量测定对比图；

图16为实施例5中col及proSIS1::IPT1转基因植株在相同生长周期后的离子渗透率测定对比图；

具体实施方式

以下结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

实施例1：

一种高盐及衰老特异诱导启动子，所述启动子如SEQIDNO:1的核苷酸序列所示。

所述启动子含有一段5’UTR序列，位于序列的592位～793位。在后续启动子应用中，为了保证SIS1启动子的驱动效果，在工程载体构建中包含这段5’UTR序列

优选的，所述启动子具有两个真核生物启动子核心元件TATA-box，分别位于序列的561位～564位和582位～585位。

启动子的制备过程如下：提取野生型拟南芥col基因组DNA，利用SIS1启动子特异引物(proSISF:CGGTCATAGGTACGATTATGA；proSISR:TGGAATTCGTCGCTCGCTCT)进行PCR扩增；扩增程序：step1:95℃3min；step2:95℃30s,56℃40s,72℃30s，32个循环；step3:72℃10min。反应结束后，回收PCR片段并连接T载体，程序按照试剂公司说明进行；连接产物转化大肠杆菌DH5a，提取克隆并测序，得到SIS1启动子，即本发明所述的启动子。

实施例2：

qRT-PCR鉴定SIS1启动子可特异性的被高盐和衰老所诱导：

选取持续光照条件下生长35天的野生型拟南芥col第6片莲座叶，用150mM的NaCl处理8小时；分别在0小时，3小时，6小时，8小时取材料，提取叶片总RNA,反转录为cDNA后，以此为模板，利用引物：SIS1-qRTF:GTAATGTTGATAGAAACAGG，SIS1-qRTR：GCTGGTGGAATTTTGAGGCT，进行qRT-PCR分析；结果表明，如图1所示，SIS1基因在转录水平可被高盐所诱导；另外，我们选取不同生长时期的拟南芥叶片(YL:幼叶；NS:叶片完全伸展，衰老表型不可见；ES：早起衰老叶片；LS:衰老后期叶片；)分别提取RNA，反转录为cDNA，进行qRT-PCR分析(引物:SIS1-qRTF：GTAATGTTGATAGAAACAGG，SIS1-qRTR：GCTGGTGGAATTTTGAGGCT)，结果表明，如图2所示，SIS1基因转录水平具有衰老诱导的特性，说明SIS1基因启动子proSIS1同时被高盐和衰老所诱导。

实施例3：

组织化学染色(GUS染色)及荧光素酶法(LUC)鉴定SIS1启动子可以被高盐和衰老所诱导：

(1)组织化学染色(GUS):设计克隆SIS1启动子并带有接头的特异性引物(proSIS1-GUSF:GCAGGCATGCAAGCTTCGGTCATAGGTACGATTATGA；proSIS1-GUSR:CTCAGATCTACCATGGTGGAATTCGTCGCTCGCTCT)，提取野生型col拟南芥基因组DNA，以此为模板进行扩增，扩增程序：step1:95℃3min；step2:95℃30s,56℃30s,72℃30s，33个循环；step3:72℃10min。

将扩增产物回收纯化后，利用infusion重组技术连接进入pCAMBIA3301-GUS载体，方法及体系为：SIS1启动子片段2μL,pCAMBIA3301-GUS(HindIII与NcoI双酶切后)2μL，infusion酶1μL；50℃反应15min，连接产物转化大肠杆菌DH5a，测序提取阳性菌液质粒，命名为proSIS1-GUS，将此载体转化进入农杆菌GV3101中，并利用浸花法获得转基因拟南芥材料，对获得的转基因材料进行不同处理的GUS染色，方法为(1)生长32天转基因材料第6片叶片分别在NaCl处理液(0.5x MS,100mMNaCl,3mMMES,PH 5.8)及对照(0.5xMS,3mMMES,PH5.8)中浸泡8小时，结果如图3所示；(2)转基因材料在生长21天(未见衰老)和35天及48天(已有衰老特征)进行GUS染色，结果如图4所示。

(2)荧光素酶检测：设计克隆SIS1启动子并带有接头的特异性引物(proSIS1-LUCF:ATGATTACGAATTCGAGCTCCGGTCATAGGTACGATTATGA；proSIS1-LUCR:ATGGGTACATACTAGTTGGAATTCGTCGCTCGCTCT)，以野生型col拟南芥基因组DNA为模板进行扩增，扩增程序与(1)相同；将扩增产物回收纯化后，利用infusion重组技术连接进入pCAMBIA3301-LUC载体，方法及体系为：SIS1启动子片段2μL,pCAMBIA3301-LUC(SacI与SpeI双酶切后)2μL，infusion酶1μL；进行重组反应；反应产物转化大肠杆菌DH5a并测序；提取测序正确的阳性质粒并命名为proSIS1-LUC；将此载体转化进入农杆菌GV3101中，并利用浸花法获得转基因拟南芥材料，对获得的转基因材料进行不同处理的LUC活性检测；方法为(1)生长32天转基因材料第6片叶片分别在NaCl处理液(0.5x MS,100mMNaCl,3mMMES,PH 5.8)及对照(0.5xMS,3mMMES,PH 5.8)中浸泡8小时，结果如图5所示；(2)转基因材料在生长21天(未见衰老)和35天及48天(已有衰老特征)时，用酶标仪进行荧光素酶量化检测，结果如图6所示。

通过组织化学及荧光素酶活性检测，进一步鉴定了SIS1启动子是特异性的被高盐和衰老所诱导。

实施例4：

一种高盐及衰老特异诱导工程载体，该载体具有所述的启动子序列，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，该载体图谱如图7所示。

工程载体的制备过程如下：以野生型拟南芥col基因组DNA为模板，利用SIS1启动子通用载体扩增引物(proSIS1-996F:ACATGATTACGAATTCCGGTCATAGGTACGATTATGA；proSIS1-996R:CGATCAATCAGGATCCTGGAATTCGTCGCTCGCTCT)，进行PCR扩增，扩增程序：step1:95℃3min；step2:95℃30s,58℃40s,72℃30s，33个循环；step3:72℃10min。片段回收后，通过infusion重组方法连接入载体p996；体系及方法为：SIS1启动子片段2μL；BamH1和EcoRI双酶切后的p996载体2μL；infusion酶1μL；50℃条件下反应15分钟，将连接产物转化入大肠杆菌DH5a中，测序选择阳性克隆并提取质粒，命名为proSIS1载体，即本发明所述的工程载体。

该工程载体具有以下特征：

(1)SIS1启动子自身含有一段5’UTR序列，可提高转录效率；

(2)该工程载体在使用过程中，只需要用BamH1单酶切载体；所有要连入的候选基因在设计引物时只需要加入固定接头：F向引物加接头ACGAATTCCAGGATCC+基因特异引物F向；R向引物加接头CGATCAATCAGGATCC+基因特异引物R向，利用infusion重组技术连入proSIS1载体即可使用，方便快捷，利于在实际操作中程序化连入其它相关基因；

(3)在多克隆位点后，连接有NOS终止子，该终止子具有广谱性，可广泛用于不同物种中；

(4)该工程载体植物抗性标记为抗除草剂基因，可通过简单高效的筛选方法获得阳性材料。

实施例5：

SIS1启动子及工程载体的应用：

将拟南芥IPT1(AT1G68460)基因全长CDS克隆到proSIS1工程载体的BamH1位点处，获得重组载体proSIS1::IPT1，将该载体转化到农杆菌GV3301中，利用浸花的方法获得转基因拟南芥，观察高盐处理条件下转基因材料与野生型叶片衰老进程变化。

如图8～图10所示，转基因植株与野生型col材料生长在持续光照条件下，28天后，选取第6片莲座叶进行盐耐受性实验；将离体叶片放置在NaCl处理液(150mMNaCl,3mMMES,0.5Xms,PH 5.8)浸透的两层滤纸上,将其放入培养皿中，处理5天，并观察表型，测定生理参数；其中高含量的叶绿素及低的离子渗透率都能够提高作物对盐的耐受性，并抑制衰老；结果显示，在刚开始处理时，野生型col及转基因材料离体叶片状态一致，叶绿素含量及离子渗透率也几乎一致；但，处理5天后，col较转基因材料明显萎蔫；同时，col的叶绿素含量较转基因低；另外，转基因材料的离子渗透率低；这些结果都表明，在SIS1启动子驱动下，高盐条件下proSIS::IPT1转基因材料对盐胁迫更具有适应性。

如图11～图13所示，转基因材料活体植株盐胁迫耐受性提高。为了进一步明确SIS1启动子在植物盐胁迫耐受性中的可用性，我们将转基因材料与col同时种植在相同条件下(持续光照)，3周后，用300mM的NaCl溶液进行一次浇灌；5天后观察表型；结果表明，col叶片已经明显萎蔫，但转基因材料仍有肉眼可见的绿色；选取第片莲座叶进行叶绿素及离子渗透率测定；结果表明，转基因材料叶绿素含量明显高于col；同时，col的离子渗透率明显高于转基因，这些结果都进一步说明了proSIS1::IPT1转基因材料能够明显改善植物对盐的耐受性。

如图14～图16所示，转基因材料能够延缓叶片衰老。col及转基因材料在正常条件下生长56天，表型显示col已能观察到多个衰老的莲座叶，但转基因材料还未见衰老；同时选取col及转基因材料的第6片莲座叶进行叶绿素及离子渗透率的测定；结果表明，转基因的叶绿素含量明显高于对照；另外，转基因材料的离子渗透率又低于col。综上结果，ProSIS1::IPT1材料在正常条件下能够延缓叶片衰老进程。

序列表

<110> 中国农业科学院烟草研究所

<120> 一种高盐及衰老特异诱导启动子、工程载体及应用

<141> 2018-09-03

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 793

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cggtcatagg tacgattatg acattgacat gaaatcatat tccaactatc aacgttagtg 60

tccttgtttt tatcccctgt aattcagtca attaagccat cgtaccaggt gagtctttga 120

tattgttgtt gtctacgaaa aaccattaga tgatctctaa ttgatatttg attcaaccta 180

tggtaaaatt atcccaaaac tcaaatatta cttcaattga tatcatccca aatattacct 240

agagaggatc aagcttttta atcgtcaatt ttggttatac aaaacgataa aaaaaaaatt 300

gtaagccaaa aataaaaagt aaaacgaaat tgtgaatttt taataattct tttgcataat 360

acacaaaaga aaaaaaactc atactccaca tgtcaagtga tgacacaata aatgtctaaa 420

tttttacaat caaaaacaaa aaaatgtata aaaaattcgt gtaacctttt ttttttgttg 480

tctaaaaaaa tgacatgatt ttggtaaata gccaacaaat ttgtagtaga gtagtaaagt 540

taggtttcat catccatctc tataaattct caagaccgac ctatacattt tacttcccct 600

ttcctctccc aaatattttc acaattctct ctataacttc acccttcgta taaaccgata 660

catacaccca cacccacata tatatatata tatatctctc cgtatttaca catacgtata 720

tagacacata catcatacat atacgtataa tagctgaaag agtgtttttt tttagagcga 780

gcgacgaatt cca 793

<210> 2

<211> 9481

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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aagttgaagg ccgcgcaggc cgcccagcgg caacgcatcg aggcagaagc acgccccggt 2520

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ggtgcgccgt cgattaggaa gccgcccaag ggcgacgagc aaccagattt tttcgttccg 2640

atgctctatg acgtgggcac ccgcgatagt cgcagcatca tggacgtggc cgttttccgt 2700

ctgtcgaagc gtgaccgacg agctggcgag gtgatccgct acgagcttcc agacgggcac 2760

gtagaggttt ccgcagggcc ggccggcatg gccagtgtgt gggattacga cctggtactg 2820

atggcggttt cccatctaac cgaatccatg aaccgatacc gggaagggaa gggagacaag 2880

cccggccgcg tgttccgtcc acacgttgcg gacgtactca agttctgccg gcgagccgat 2940

ggcggaaagc agaaagacga cctggtagaa acctgcattc ggttaaacac cacgcacgtt 3000

gccatgcagc gtacgaagaa ggccaagaac ggccgcctgg tgacggtatc cgagggtgaa 3060

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gcacgccgcg ccgcaggcaa ggcagaagcc agatggttgt tcaagacgat ctacgaacgc 3300

agtggcagcg ccggagagtt caagaagttc tgtttcaccg tgcgcaagct gatcgggtca 3360

aatgacctgc cggagtacga tttgaaggag gaggcggggc aggctggccc gatcctagtc 3420

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atgctagggc aaattgccct agcaggggaa aaaggtcgaa aaggtctctt tcctgtggat 3540

agcacgtaca ttgggaaccc aaagccgtac attgggaacc ggaacccgta cattgggaac 3600

ccaaagccgt acattgggaa ccggtcacac atgtaagtga ctgatataaa agagaaaaaa 3660

ggcgattttt ccgcctaaaa ctctttaaaa cttattaaaa ctcttaaaac ccgcctggcc 3720

tgtgcataac tgtctggcca gcgcacagcc gaagagctgc aaaaagcgcc tacccttcgg 3780

tcgctgcgct ccctacgccc cgccgcttcg cgtcggccta tcgcggccgc tggccgctca 3840

aaaatggctg gcctacggcc aggcaatcta ccagggcgcg gacaagccgc gccgtcgcca 3900

ctcgaccgcc ggcgcccaca tcaaggcacc ctgcctcgcg cgtttcggtg atgacggtga 3960

aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg 4020

gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg gcgcagccat 4080

gacccagtca cgtagcgata gcggagtgta tactggctta actatgcggc atcagagcag 4140

attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa 4200

taccgcatca ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg 4260

ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg 4320

gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag 4380

gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga 4440

cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct 4500

ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc 4560

tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg 4620

gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc 4680

tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca 4740

ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag 4800

ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct 4860

ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc 4920

accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 4980

tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca 5040

cgttaaggga ttttggtcat gcattctagg tactaaaaca attcatccag taaaatataa 5100

tattttattt tctcccaatc aggcttgatc cccagtaagt caaaaaatag ctcgacatac 5160

tgttcttccc cgatatcctc cctgatcgac cggacgcaga aggcaatgtc ataccacttg 5220

tccgccctgc cgcttctccc aagatcaata aagccactta ctttgccatc tttcacaaag 5280

atgttgctgt ctcccaggtc gccgtgggaa aagacaagtt cctcttcggg cttttccgtc 5340

tttaaaaaat catacagctc gcgcggatct ttaaatggag tgtcttcttc ccagttttcg 5400

caatccacat cggccagatc gttattcagt aagtaatcca attcggctaa gcggctgtct 5460

aagctattcg tatagggaca atccgatatg tcgatggagt gaaagagcct gatgcactcc 5520

gcatacagct cgataatctt ttcagggctt tgttcatctt catactcttc cgagcaaagg 5580

acgccatcgg cctcactcat gagcagattg ctccagccat catgccgttc aaagtgcagg 5640

acctttggaa caggcagctt tccttccagc catagcatca tgtccttttc ccgttccaca 5700

tcataggtgg tccctttata ccggctgtcc gtcattttta aatataggtt ttcattttct 5760

cccaccagct tatatacctt agcaggagac attccttccg tatcttttac gcagcggtat 5820

ttttcgatca gttttttcaa ttccggtgat attctcattt tagccattta ttatttcctt 5880

cctcttttct acagtattta aagatacccc aagaagctaa ttataacaag acgaactcca 5940

attcactgtt ccttgcattc taaaacctta aataccagaa aacagctttt tcaaagttgt 6000

tttcaaagtt ggcgtataac atagtatcga cggagccgat tttgaaaccg cggtgatcac 6060

aggcagcaac gctctgtcat cgttacaatc aacatgctac cctccgcgag atcatccgtg 6120

tttcaaaccc ggcagcttag ttgccgttct tccgaatagc atcggtaaca tgagcaaagt 6180

ctgccgcctt acaacggctc tcccgctgac gccgtcccgg actgatgggc tgcctgtatc 6240

gagtggtgat tttgtgccga gctgccggtc ggggagctgt tggctggctg gtggcaggat 6300

atattgtggt gtaaacaaat tgacgcttag acaacttaat aacacattgc ggacgttttt 6360

aatgtactga attaacgccg aattaattcg ggggatctgg attttagtac tggattttgg 6420

ttttaggaat tagaaatttt attgatagaa gtattttaca aatacaaata catactaagg 6480

gtttcttata tgctcaacac atgagcgaaa ccctatagga accctaattc ccttatctgg 6540

gaactactca cacattatta tggagaaact cgagtcaaat ctcggtgacg ggcaggaccg 6600

gacggggcgg taccggcagg ctgaagtcca gctgccagaa acccacgtca tgccagttcc 6660

cgtgcttgaa gccggccgcc cgcagcatgc cgcggggggc atatccgagc gcctcgtgca 6720

tgcgcacgct cgggtcgttg ggcagcccga tgacagcgac cacgctcttg aagccctgtg 6780

cctccaggga cttcagcagg tgggtgtaga gcgtggagcc cagtcccgtc cgctggtggc 6840

ggggggagac gtacacggtc gactcggccg tccagtcgta ggcgttgcgt gccttccagg 6900

ggcccgcgta ggcgatgccg gcgacctcgc cgtccacctc ggcgacgagc cagggatagc 6960

gctcccgcag acggacgagg tcgtccgtcc actcctgcgg ttcctgcggc tcggtacgga 7020

agttgaccgt gcttgtctcg atgtagtggt tgacgatggt gcagaccgcc ggcatgtccg 7080

cctcggtggc acggcggatg tcggccgggc gtcgttctgg gctcatggta gactcgagag 7140

agatagattt gtagagagag actggtgatt tcagcgtgtc ctctccaaat gaaatgaact 7200

tccttatata gaggaaggtc ttgcgaagga tagtgggatt gtgcgtcatc ccttacgtca 7260

gtggagatat cacatcaatc cacttgcttt gaagacgtgg ttggaacgtc ttctttttcc 7320

acgatgctcc tcgtgggtgg gggtccatct ttgggaccac tgtcggcaga ggcatcttga 7380

acgatagcct ttcctttatc gcaatgatgg catttgtagg tgccaccttc cttttctact 7440

gtccttttga tgaagtgaca gatagctggg caatggaatc cgaggaggtt tcccgatatt 7500

accctttgtt gaaaagtctc aatagccctt tggtcttctg agactgtatc tttgatattc 7560

ttggagtaga cgagagtgtc gtgctccacc atgttcacat caatccactt gctttgaaga 7620

cgtggttgga acgtcttctt tttccacgat gctcctcgtg ggtgggggtc catctttggg 7680

accactgtcg gcagaggcat cttgaacgat agcctttcct ttatcgcaat gatggcattt 7740

gtaggtgcca ccttcctttt ctactgtcct tttgatgaag tgacagatag ctgggcaatg 7800

gaatccgagg aggtttcccg atattaccct ttgttgaaaa gtctcaatag ccctttggtc 7860

ttctgagact gtatctttga tattcttgga gtagacgaga gtgtcgtgct ccaccatgtt 7920

ggcaagctgc tctagccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa 7980

tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat 8040

gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg 8100

ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga catgattacg 8160

aattccggtc ataggtacga ttatgacatt gacatgaaat catattccaa ctatcaacgt 8220

tagtgtcctt gtttttatcc cctgtaattc agtcaattaa gccatcgtac caggtgagtc 8280

tttgatattg ttgttgtcta cgaaaaacca ttagatgatc tctaattgat atttgattca 8340

acctatggta aaattatccc aaaactcaaa tattacttca attgatatca tcccaaatat 8400

tacctagaga ggatcaagct ttttaatcgt caattttggt tatacaaaac gataaaaaaa 8460

aaattgtaag ccaaaaataa aaagtaaaac gaaattgtga atttttaata attcttttgc 8520

ataatacaca aaagaaaaaa aactcatact ccacatgtca agtgatgaca caataaatgt 8580

ctaaattttt acaatcaaaa acaaaaaaat gtataaaaaa ttcgtgtaac cttttttttt 8640

tgttgtctaa aaaaatgaca tgattttggt aaatagccaa caaatttgta gtagagtagt 8700

aaagttaggt ttcatcatcc atctctataa attctcaaga ccgacctata cattttactt 8760

cccctttcct ctcccaaata ttttcacaat tctctctata acttcaccct tcgtataaac 8820

cgatacatac acccacaccc acatatatat atatatatat ctctccgtat ttacacatac 8880

gtatatagac acatacatca tacatatacg tataatagct gaaagagtgt ttttttttag 8940

agcgagcgac gaattccagg atcctgattg atcgatagag ctcgaatttc cccgatcgtt 9000

caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt gcgatgatta 9060

tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt 9120

tatttatgag atgggttttt atgattagag tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag 9180

aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca tctatgttac 9240

tagatcggac tagtaggcct acgcgtaagc ttggcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt 9300

gactgggaaa accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc 9360

agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg 9420

aatggcgaat gctagagcag cttgagcttg gatcagattg tcgtttcccg ccttcagttt 9480

a 9481

Claims (8)

1.一种高盐及衰老特异诱导启动子，其特征在于：所述启动子如SEQ ID NO:1的核苷酸序列所示。

2.根据权利要求1所述的一种高盐及衰老特异诱导启动子，其特征在于：所述启动子含有一段5’UTR序列，位于序列SEQ ID NO:1的592位～793位。

3.根据权利要求1所述的一种高盐及衰老特异诱导启动子，其特征在于：所述启动子具有两个真核生物启动子核心元件TATA-box，分别位于序列SEQ ID NO:1的561位～564位和582位～585位。

4.一种权利要求1～3任一项所述的启动子在启动拟南芥IPT1基因表达中的应用。

5.一种高盐及衰老特异诱导工程载体，其特征在于：该载体具有权利要求1所述的启动子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

6.根据权利要求5所述的一种高盐及衰老特异诱导工程载体，其特征在于：所述载体在多克隆位点后，连接有NOS终止子。

7.一种权利要求5～6任一项所述的载体在调控拟南芥IPT1基因表达中的应用。

8.根据权利要求7所述的载体的应用，其特征在于：将拟南芥IPT1基因全长CDS克隆到载体的BamH1位点处，获得重组载体，将该重组载体转化到农杆菌GV3301中，利用浸花的方法获得转基因拟南芥，该转基因拟南芥具有抗高盐及抗衰老的特性。

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