CN108949764B - 一种黑暗及衰老特异诱导启动子、工程载体及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种黑暗及衰老特异诱导启动子、工程载体及应用，所述启动子如SEQ ID NO:1的核苷酸序列所示，该工程载体具有启动子序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明构建了SLC1启动子驱动IPT1基因表达载体，实现了IPT1基因在黑暗条件下及叶片衰老时期特异高表达，一方面抑制了叶片在黑暗条件加速衰老的进程；另外，又抑制了植物因年龄造成的衰老进程，即可以实现抵御黑暗促进衰老的过程又使植物正常条件下延缓衰老。本发明可广泛用于植物IPT1基因表达抑制的相关理论以及植物抵御黑暗、抑制衰老等应用研究。

Description

一种黑暗及衰老特异诱导启动子、工程载体及应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种植物叶片相关特性具有诱导的启动子及工程载体，具体涉及一种黑暗及衰老特异诱导启动子、工程载体及应用。

背景技术

衰老是植物叶片发育最后一个阶段，在此过程中会发生一系列的生理生化反应，包括叶绿素降解、细胞结构坍塌、营养物质再利用等；植物在生长过程中会面临来自环境的生物或非生物胁迫，如病虫害、长时间弱光/黑暗、干旱、异常温度等，植物在遭受这些胁迫后，会加速叶片衰老进程，营养物质从衰老组织重新分配到果实或幼嫩器官，一定程度上增强了植物适应性，因此，叶片衰老对植物而言又具有积极意义；但是，不正常的叶片衰老(早衰或晚衰)影响作物产量及品质；早衰使植物不能更充分的完成光合作用，有机物积累收到限制；可能造成作物的减产降质；理解并实现人工可控的叶片衰老过程在农业生产中具有重要意义；

叶片衰老是一个受内因和外因共同作用的结果，其中弱光或者黑暗能够加速叶片衰老进程，也是重要的影响因素之一；已有研究表明，在光影响的植物衰老过程中，光受体phyB-PIF 途径参与其中，另外植物激素如茉莉酸也参与了弱光/黑暗诱导的叶片衰老过程；在实际农业生产中，作物株距或行距较小，作物叶片间相互遮挡，容易产生避荫性效应，叶片早衰脱落，影响产量、品质。因此，使植物能够有效抵抗弱光/黑暗造成的早衰，是农业生产中提高产量、品质的有效手段之一。

发明内容

根据以上现有技术的不足，本发明提供一种黑暗及衰老特异诱导启动子、工程载体及应用，使植物具有抵抗黑暗及衰老的特性。

申请人发现了一个转录水平同时被黑暗和衰老上调表达的基因SLC1(AT1G14200),该基因功能尚未被研究；通过PCR手段克隆到该基因的461bp启动子，对该启动子进行了表达分析，通过Qrt-PCR,gus及LUC鉴定，发现该启动子可以被黑暗和衰老同时特异诱导的；因此，申请人制备了以该启动子序列为基础骨架的工程载体；利用该工程载体，将细胞分裂素合成关键酶编码基因IPT1(AT1G68460)重组到该载体中，形成了SLC1启动子驱动的IPT1 基因表达；由于SLC1启动子特异的被黑暗和衰老诱导，因此，IPT1基因能够在黑暗和叶片衰老时期特异表达，已有报道，不同作物中IPT过表达可以延缓叶片衰老；因此，在拟南芥中实现了特异抵抗黑暗及年龄诱导的衰老过程。

如上文所述，本发明所述的一种黑暗及衰老特异诱导启动子，其特征在于：所述启动子如SEQIDNO:1的核苷酸序列所示。

优选的，所述启动子含有一段5’UTR序列，位于序列的333位～461位。在后续启动子应用中，为了保证SLC1启动子的驱动效果，在工程载体构建中包含这段5’UTR序列

优选的，所述启动子具有真核生物启动子核心元件TATA-box和CAAT-box，分别位于序列的300位～303位和326位～329位。

启动子的制备过程如下：提取野生型拟南芥col基因组DNA，利用SLC1启动子特异引物(proSLC1F:GAATTTAATCAAACACCTTCT；proSLC1R:CACGCTAGTACCCAAAAC)进行PCR扩增；扩增程序：step1:95℃3min；step2:95℃30s,57℃30s,72℃30s，32个循环； step3:72℃10min。反应结束后，回收PCR片段并连接T载体，程序按照试剂公司说明进行；连接产物转化大肠杆菌DH5a，提取克隆并测序，得到SLC1启动子，即本发明所述的启动子。

本发明所述的启动子在启动拟南芥IPT1基因表达中的应用。

本发明所述的一种黑暗及衰老特异诱导工程载体，其特征在于：该载体具有权利要求1 所述的启动子序列，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。

工程载体的制备过程如下：以野生型拟南芥col基因组DNA为模板，利用SLC1启动子通用载体扩增引物pro SLC1-996F:ACATGATTACGAATTCGAATTTAATCAAACACCTTCT； proSLC1-996R:CGATCAATCAGGATCCCACGCTAGTACCCAAAAC)，进行PCR扩增，扩增程序：step1:95℃3min；step2:95℃30s,58℃40s,72℃30s，33个循环；step3:72℃10min。片段回收后，通过infusion重组方法连接入载体p996；体系及方法为：SLC1启动子片段2μL； BamH1和EcoRI双酶切后的p996载体2μL；infusion酶1μL；50℃条件下反应15分钟，将连接产物转化入大肠杆菌DH5a中，测序选择阳性克隆并提取质粒，命名为proSLC1载体，即本发明所述的工程载体。

该工程载体具有以下特征：

(1)SLC1启动子自身含有一段5’UTR序列，可提高转录效率；

(2)该工程载体在使用过程中，只需要用BamH1单酶切载体；所有要连入的候选基因在设计引物时只需要加入固定接头：F向引物加接头ACGAATTCCAGGATCC+基因特异引物F向；R向引物加接头CGATCAATCAGGATCC+基因特异引物R向，利用infusion重组技术连入proSLC1工程载体即可使用，方便快捷，利于在实际操作中程序化连入其它相关基因；

(3)在多克隆位点后，连接有NOS终止子，该终止子具有广谱性，可广泛用于不同物种中；

(4)该工程载体植物抗性标记为抗除草剂基因，可通过简单高效的筛选方法获得阳性材料。

本发明所述的载体在在调控拟南芥IPT1基因表达中的应用。

优选的，将拟南芥IPT1基因全长CDS克隆到载体的BamH1位点处，获得重组载体，将该重组载体转化到农杆菌GV3301中，利用浸花的方法获得转基因拟南芥，该转基因拟南芥具有抗黑暗及抗衰老的特性。

本发明中，IPT1基因是细胞素合成关键酶合成基因，已有报道，该基因在植物中过量表达能明显抑制叶片衰老过程，但该基因不是特异在黑暗中表达的，基于此，申请人构建了SLC1 启动子驱动IPT1基因表达载体，实现了IPT1基因在黑暗条件下及叶片衰老时期特异高表达，一方面抑制了叶片在黑暗条件加速衰老的进程；另外，又抑制了植物因年龄造成的衰老进程，即可以实现抵御黑暗促进衰老的过程又使植物正常条件下延缓衰老。

本发明的优点在于：可广泛用于植物IPT1基因表达抑制的相关理论以及植物抵御黑暗、抑制衰老等应用研究。

附图说明

图1为实施例2中拟南芥叶片在不同黑暗时长内SLC1基因表达指数图；

图2为实施例2中拟南芥叶片在不同衰老时长内SLC1基因表达指数图；

图3为实施例3中对拟南芥叶片分别进行光处理和黑暗处理后GUS染色对比图；

图4为实施例3中对拟南芥叶片在不同衰老时长后GUS染色对比图；

图5为实施例3中拟南芥叶片在不同黑暗时长内利用多功能酶标仪测定LUC活性指数图；

图6为实施例3中拟南芥叶片在不同衰老时长内利用多功能酶标仪测定LUC活性指数图；

图7为实施例4中工程载体图谱；

图8为实施例5中col及proSLC1::IPT1转基因材料在相同黑暗处理后的离体叶片表型图；

图9为实施例5中col及proSLC1::IPT1转基因材料在相同黑暗处理后的叶绿素含量测定对比图；

图10为实施例5中col及proSLC1::IPT1转基因材料在相同黑暗处理后的电导率测定对比图；

图11为实施例5中col及proSLC1::IPT1转基因植株黑暗处理6天后表型图；

图12为实施例5中col及proSLC1::IPT1转基因植株正常生长48天后表型图；

图13为实施例5中col及proSLC1::IPT1转基因材料在黑暗处理6天后的叶绿素含量测定对比图；

图14为实施例5中col及proSLC1::IPT1转基因材料在正常生长48天后的叶绿素含量测定对比图。

具体实施方式

以下结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

实施例1：

一种黑暗及衰老特异诱导启动子，所述启动子如SEQIDNO:1的核苷酸序列所示。

所述启动子含有一段5’UTR序列，位于序列的333位～461位。在后续启动子应用中，为了保证SLC1启动子的驱动效果，在工程载体构建中包含这段5’UTR序列

所述启动子具有真核生物启动子核心元件TATA-box和CAAT-box，分别位于序列的300 位～303位和326位～329位。

启动子的制备过程如下：提取野生型拟南芥col基因组DNA，利用SLC1启动子特异引物(proSLC1F:GAATTTAATCAAACACCTTCT；proSLC1R:CACGCTAGTACCCAAAAC)进行PCR扩增；扩增程序：step1:95℃3min；step2:95℃30s,57℃30s,72℃30s，32个循环； step3:72℃10min。反应结束后，回收PCR片段并连接T载体，程序按照试剂公司说明进行；连接产物转化大肠杆菌DH5a，提取克隆并测序，得到SLC1启动子，即本发明所述的启动子。

实施例2：

qRT-PCR鉴定SLC1启动子可被黑暗和衰老所诱导：

为了明确SLC1启动子表达特征，申请人利用qRT-PCR技术检测了SLC1基因在转录水平的表达情况，实验中，将生长28天的野生型拟南芥col第6片莲座叶进行12小时的黑暗处理，分别在0，3，6，12小时取材料并提取RNA，反转录为cDNA后，以此为模板，利用引物：SLC1-qRTF:CACTCAAAGTGTGTGGAGGA， SLC1-qRTR:CTGTCGCCGGCGTTAATGGAG进行qRT-PCR分析；结果表明，如图1所示， SLC1基因转录水平可以被黑暗所诱导，说明SLC1启动子具有被黑暗诱导的特性；另外，我们检测了SLC1转录水平随叶片衰老进程的变化情况，分别提取生长14天，28天，42天， 56天第6叶位的莲座叶RNA，反转录为cDNA，进行qRT-PCR分析，结果表明，如图2所示，SLC1基因转录水平可以随着叶片衰老进程的进行而逐步提高，因此，SLC1基因启动子同时又是被叶片衰老所诱导的。

实施例3：

组织化学染色(GUS染色)及荧光素酶法(LUC)鉴定SLC1启动子可以被黑暗和衰老所诱导：

(1)组织化学染色(GUS):设计克隆SLC1启动子并带有接头的特异性引物(proSLC1-GUSF:GCAGGCATGCAAGCTTGAATTTAATCAAACACCTTCT；proSLC1-GUSR: CTCAGATCTACCATGGCACGCTAGTACCCAAAACA)，提取野生型col拟南芥基因组DNA，以此为模板进行扩增，扩增程序：step1:95℃3min；step2:95℃30s,56℃30s,72℃30s，32 个循环；step3:72℃10min。

将扩增产物回收纯化后，利用infusion重组技术连接进入pCAMBIA3301-GUS载体，方法及体系为：SLC1启动子片段2μL,pCAMBIA3301-GUS(HindIII与NcoI双酶切后)2μL，infusion酶1μL；50℃反应15min，连接产物转化大肠杆菌DH5a，测序提取阳性菌液质粒，命名为proSLC1-GUS，将此载体转化进入农杆菌GV3101中，并利用浸花法获得转基因拟南芥材料，对获得的转基因材料进行不同处理的GUS染色，方法为(1)生长28天转基因材料第5片叶片分别在光下处理12小时和黑暗中处理12小时并染色，结果如图3所示；(2)转基因材料在生长21天(未见衰老)和35天及48天(已有衰老特征)进行GUS染色，结果如图4所示。

(2)荧光素酶检测：设计克隆SLC1启动子并带有接头的特异性引物 (proSLC1-LUCF:ATGATTACGAATTCGAGCTCGAATTTAATCAAACACCTTCT；proSLC1-L UCR:ATGGGTACATACTAGTCACGCTAGTACCCAAAACA)，以野生型col拟南芥基因组 DNA为模板进行扩增，扩增程序与(1)相同；将扩增产物回收纯化后，利用infusion重组技术连接进入pCAMBIA3301-LUC载体，方法及体系为：SLC1启动子片段2μL, pCAMBIA3301-LUC(SacI与SpeI双酶切后)2μL，infusion酶1μL；进行重组反应；反应产物转化大肠杆菌DH5a并测序；提取测序正确的阳性质粒并命名为proSLC1-LUC；将此载体转化进入农杆菌GV3101中，并利用浸花法获得转基因拟南芥材料，对获得的转基因材料进行不同处理的LUC活性检测；方法为(1)将转基因材料置于黑暗中24小时，分别在 0,0.5,1,3,6,8,12,24小时时，利用多功能酶标仪测定LUC活性，结果如图5所示；(2)对生长14,28,35,48天的转基因材料第5片莲座叶进行LUC活性检测，结果如图6所示。

通过组织化学及荧光素酶活性检测，进一步鉴定了SLC1启动子是特异性的被黑暗和衰老所诱导。

实施例4：

一种黑暗及衰老特异诱导工程载体，该载体具有所述的启动子序列，其核苷酸序列如 SEQIDNO:2所示，该载体图谱如图7所示。

工程载体的制备过程如下：以野生型拟南芥col基因组DNA为模板，利用SLC1启动子通用载体扩增引物pro SLC1-996F:ACATGATTACGAATTCGAATTTAATCAAACACCTTCT； proSLC1-996R:CGATCAATCAGGATCCCACGCTAGTACCCAAAAC)，进行PCR扩增，扩增程序：step1:95℃3min；step2:95℃30s,58℃40s,72℃30s，33个循环；step3:72℃10min。片段回收后，通过infusion重组方法连接入载体p996；体系及方法为：SLC1启动子片段2μL； BamH1和EcoRI双酶切后的p996载体2μL；infusion酶1μL；50℃条件下反应15分钟，将连接产物转化入大肠杆菌DH5a中，测序选择阳性克隆并提取质粒，命名为proSLC1载体，即图7 中的JRH0996-SLC1载体。

该工程载体具有以下特征：

(1)SLC1启动子自身含有一段5’UTR序列，可提高转录效率；

(2)该工程载体在使用过程中，只需要用BamH1单酶切载体；所有要连入的候选基因在设计引物时只需要加入固定接头：F向引物加接头ACGAATTCCAGGATCC+基因特异引物 F向；R向引物加接头CGATCAATCAGGATCC+基因特异引物R向，利用infusion重组技术连入proSLC1工程载体即可使用，方便快捷，利于在实际操作中程序化连入其它相关基因；

(3)在多克隆位点后，连接有NOS终止子，该终止子具有广谱性，可广泛用于不同物种中；

(4)该工程载体植物抗性标记为抗除草剂基因，可通过简单高效的筛选方法获得阳性材料。

实施例5：

SLC1启动子及工程载体的应用：

将拟南芥IPT1(AT1G68460)基因全长CDS克隆到proSLC1工程载体的BamH1位点处，获得重组载体proSLC1::IPT1，将该载体转化到农杆菌GV3301中，利用浸花的方法获得转基因拟南芥，观察黑暗处理条件下转基因材料与野生型叶片衰老进程变化。

如图8～图10所示，col及proSLC1::IPT1转基因材料正常条件下(持续光照)生长28天，取第6片莲座叶整齐放在两层滤纸上，滤纸被处理液(0.5xMS,3mMMES,PH 5.8)完全浸湿,将其放入培养皿中，黑暗处理7天，表型观察并测定叶绿素及细胞膜电导率；结果表明proSLC1::IPT1转基因材料在黑暗条件下较col明显晚衰；

如图11和图13所示，将col及proSLC1::IPT1转基因材料在正常条件下生长32天，同时将其放入黑暗中6天，整体活体材料与离体叶片表现类似，proSLC1::IPT1材料明显抵御了黑暗造成了早衰；选取第5片莲座叶进行叶绿素测定，proSLC1::IPT1材料叶绿素含量明显高于对照；如图12和图14所示，将col及proSLC1::IPT1转基因材料在正常条件下生长56天，直接观察叶片衰老表型，结果表明proSLC1::IPT1材料明显延缓了叶片衰老，取第6片莲座叶进行叶绿素含量测定，结果表明proSLC1::IPT1材料叶绿素含量明显高于对照。

序列表

<110> 中国农业科学院烟草研究所

<120> 一种黑暗及衰老特异诱导启动子、工程载体及应用

<141> 2018-09-03

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 461

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaatttaatc aaacaccttc tgtgcaggaa taatctctgg gggttttatc aacactccaa 60

aaaaactgga actttgtaaa taaaattata aatgttcgta cctttatgca aaatttctca 120

cagcgtaatt atctatttcc tttttgtcct ttatgaaaga ggataaggtt tttaaataat 180

aaatactaaa ttgtttttaa aagaaactaa aaataaatgg aaagtcttaa gcgtcgtcaa 240

tggttctaga gtcttctgca actttctttt catgaaacta ctgtaatctt ctgctaacat 300

atataatctc aaacactatc ttctccaatt tcaattgtct tatctttcga cttttcttct 360

tcttcttctt aagagatttt tctccaagaa agttcgctcc ttttctctgt tcttaacaaa 420

aaagtctcgg tttttttctc tttgttttgg gtactagcgt g 461

<210> 2

<211> 9149

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aactatcagt gtttgacagg atatattggc gggtaaacct aagagaaaag agcgtttatt 60

agaataacgg atatttaaaa gggcgtgaaa aggtttatcc gttcgtccat ttgtatgtgc 120

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cggcaccagg cgcgaccgcc cggagctggc caggatgctt gaccacctac gccctggcga 540

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gcgttcccta atcatcgacc gcacccggag cgggcgcgag gccgccaagg cccgaggcgt 780

gaagtttggc ccccgcccta ccctcacccc ggcacagatc gcgcacgccc gcgagctgat 840

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cgctggccgg gtacgagctg cccattcttg agtcccgtat cacgcagcgc gtgagctacc 1860

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ccaaagccgt acattgggaa ccggtcacac atgtaagtga ctgatataaa agagaaaaaa 3660

ggcgattttt ccgcctaaaa ctctttaaaa cttattaaaa ctcttaaaac ccgcctggcc 3720

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tcgctgcgct ccctacgccc cgccgcttcg cgtcggccta tcgcggccgc tggccgctca 3840

aaaatggctg gcctacggcc aggcaatcta ccagggcgcg gacaagccgc gccgtcgcca 3900

ctcgaccgcc ggcgcccaca tcaaggcacc ctgcctcgcg cgtttcggtg atgacggtga 3960

aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg 4020

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gacccagtca cgtagcgata gcggagtgta tactggctta actatgcggc atcagagcag 4140

attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa 4200

taccgcatca ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg 4260

ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg 4320

gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag 4380

gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga 4440

cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct 4500

ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc 4560

tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg 4620

gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc 4680

tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca 4740

ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag 4800

ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct 4860

ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc 4920

accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 4980

tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca 5040

cgttaaggga ttttggtcat gcattctagg tactaaaaca attcatccag taaaatataa 5100

tattttattt tctcccaatc aggcttgatc cccagtaagt caaaaaatag ctcgacatac 5160

tgttcttccc cgatatcctc cctgatcgac cggacgcaga aggcaatgtc ataccacttg 5220

tccgccctgc cgcttctccc aagatcaata aagccactta ctttgccatc tttcacaaag 5280

atgttgctgt ctcccaggtc gccgtgggaa aagacaagtt cctcttcggg cttttccgtc 5340

tttaaaaaat catacagctc gcgcggatct ttaaatggag tgtcttcttc ccagttttcg 5400

caatccacat cggccagatc gttattcagt aagtaatcca attcggctaa gcggctgtct 5460

aagctattcg tatagggaca atccgatatg tcgatggagt gaaagagcct gatgcactcc 5520

gcatacagct cgataatctt ttcagggctt tgttcatctt catactcttc cgagcaaagg 5580

acgccatcgg cctcactcat gagcagattg ctccagccat catgccgttc aaagtgcagg 5640

acctttggaa caggcagctt tccttccagc catagcatca tgtccttttc ccgttccaca 5700

tcataggtgg tccctttata ccggctgtcc gtcattttta aatataggtt ttcattttct 5760

cccaccagct tatatacctt agcaggagac attccttccg tatcttttac gcagcggtat 5820

ttttcgatca gttttttcaa ttccggtgat attctcattt tagccattta ttatttcctt 5880

cctcttttct acagtattta aagatacccc aagaagctaa ttataacaag acgaactcca 5940

attcactgtt ccttgcattc taaaacctta aataccagaa aacagctttt tcaaagttgt 6000

tttcaaagtt ggcgtataac atagtatcga cggagccgat tttgaaaccg cggtgatcac 6060

aggcagcaac gctctgtcat cgttacaatc aacatgctac cctccgcgag atcatccgtg 6120

tttcaaaccc ggcagcttag ttgccgttct tccgaatagc atcggtaaca tgagcaaagt 6180

ctgccgcctt acaacggctc tcccgctgac gccgtcccgg actgatgggc tgcctgtatc 6240

gagtggtgat tttgtgccga gctgccggtc ggggagctgt tggctggctg gtggcaggat 6300

atattgtggt gtaaacaaat tgacgcttag acaacttaat aacacattgc ggacgttttt 6360

aatgtactga attaacgccg aattaattcg ggggatctgg attttagtac tggattttgg 6420

ttttaggaat tagaaatttt attgatagaa gtattttaca aatacaaata catactaagg 6480

gtttcttata tgctcaacac atgagcgaaa ccctatagga accctaattc ccttatctgg 6540

gaactactca cacattatta tggagaaact cgagtcaaat ctcggtgacg ggcaggaccg 6600

gacggggcgg taccggcagg ctgaagtcca gctgccagaa acccacgtca tgccagttcc 6660

cgtgcttgaa gccggccgcc cgcagcatgc cgcggggggc atatccgagc gcctcgtgca 6720

tgcgcacgct cgggtcgttg ggcagcccga tgacagcgac cacgctcttg aagccctgtg 6780

cctccaggga cttcagcagg tgggtgtaga gcgtggagcc cagtcccgtc cgctggtggc 6840

ggggggagac gtacacggtc gactcggccg tccagtcgta ggcgttgcgt gccttccagg 6900

ggcccgcgta ggcgatgccg gcgacctcgc cgtccacctc ggcgacgagc cagggatagc 6960

gctcccgcag acggacgagg tcgtccgtcc actcctgcgg ttcctgcggc tcggtacgga 7020

agttgaccgt gcttgtctcg atgtagtggt tgacgatggt gcagaccgcc ggcatgtccg 7080

cctcggtggc acggcggatg tcggccgggc gtcgttctgg gctcatggta gactcgagag 7140

agatagattt gtagagagag actggtgatt tcagcgtgtc ctctccaaat gaaatgaact 7200

tccttatata gaggaaggtc ttgcgaagga tagtgggatt gtgcgtcatc ccttacgtca 7260

gtggagatat cacatcaatc cacttgcttt gaagacgtgg ttggaacgtc ttctttttcc 7320

acgatgctcc tcgtgggtgg gggtccatct ttgggaccac tgtcggcaga ggcatcttga 7380

acgatagcct ttcctttatc gcaatgatgg catttgtagg tgccaccttc cttttctact 7440

gtccttttga tgaagtgaca gatagctggg caatggaatc cgaggaggtt tcccgatatt 7500

accctttgtt gaaaagtctc aatagccctt tggtcttctg agactgtatc tttgatattc 7560

ttggagtaga cgagagtgtc gtgctccacc atgttcacat caatccactt gctttgaaga 7620

cgtggttgga acgtcttctt tttccacgat gctcctcgtg ggtgggggtc catctttggg 7680

accactgtcg gcagaggcat cttgaacgat agcctttcct ttatcgcaat gatggcattt 7740

gtaggtgcca ccttcctttt ctactgtcct tttgatgaag tgacagatag ctgggcaatg 7800

gaatccgagg aggtttcccg atattaccct ttgttgaaaa gtctcaatag ccctttggtc 7860

ttctgagact gtatctttga tattcttgga gtagacgaga gtgtcgtgct ccaccatgtt 7920

ggcaagctgc tctagccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa 7980

tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat 8040

gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg 8100

ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga catgattacg 8160

aattcgaatt taatcaaaca ccttctgtgc aggaataatc tctgggggtt ttatcaacac 8220

tccaaaaaaa ctggaacttt gtaaataaaa ttataaatgt tcgtaccttt atgcaaaatt 8280

tctcacagcg taattatcta tttccttttt gtcctttatg aaagaggata aggtttttaa 8340

ataataaata ctaaattgtt tttaaaagaa actaaaaata aatggaaagt cttaagcgtc 8400

gtcaatggtt ctagagtctt ctgcaacttt cttttcatga aactactgta atcttctgct 8460

aacatatata atctcaaaca ctatcttctc caatttcaat tgtcttatct ttcgactttt 8520

cttcttcttc ttcttaagag atttttctcc aagaaagttc gctccttttc tctgttctta 8580

acaaaaaagt ctcggttttt ttctctttgt tttgggtact agcgtgggat cctgattgat 8640

cgatagagct cgaatttccc cgatcgttca aacatttggc aataaagttt cttaagattg 8700

aatcctgttg ccggtcttgc gatgattatc atataatttc tgttgaatta cgttaagcat 8760

gtaataatta acatgtaatg catgacgtta tttatgagat gggtttttat gattagagtc 8820

ccgcaattat acatttaata cgcgatagaa aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa 8880

ttatcgcgcg cggtgtcatc tatgttacta gatcggacta gtaggcctac gcgtaagctt 8940

ggcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa 9000

tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga 9060

tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgc tagagcagct tgagcttgga 9120

tcagattgtc gtttcccgcc ttcagttta 9149

Claims (8)

1.一种黑暗及衰老特异诱导启动子，其特征在于：所述启动子如SEQIDNO:1的核苷酸序列所示。

2.根据权利要求1所述的一种黑暗及衰老特异诱导启动子，其特征在于：所述启动子含有一段5’UTR序列，位于序列SEQIDNO:1的333位～461位。

3.根据权利要求1所述的一种黑暗及衰老特异诱导启动子，其特征在于：所述启动子具有真核生物启动子核心元件TATA-box和CAAT-box，分别位于序列SEQIDNO:1的300位～303位和326位～329位。

4.一种权利要求1～3任一项所述的启动子在启动拟南芥IPT1基因表达中的应用。

5.一种黑暗及衰老特异诱导工程载体，其特征在于：该载体具有权利要求1所述的启动子序列，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。

6.根据权利要求5所述的一种黑暗及衰老特异诱导工程载体，其特征在于：所述载体在多克隆位点后，连接有NOS终止子。

7.一种权利要求5～6任一项所述的载体在调控拟南芥IPT1基因表达中的应用。

8.根据权利要求7所述的载体的应用，其特征在于：将拟南芥IPT1基因全长CDS克隆到载体的BamH1位点处，获得重组载体，将该重组载体转化到农杆菌GV3301中，利用浸花的方法获得转基因拟南芥，该转基因拟南芥具有抗黑暗及抗衰老的特性。

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