CN116064509A

CN116064509A - 一种植物组成型启动子CEPro432及其应用

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Publication number: CN116064509A
Application number: CN202111555453.7A
Authority: CN
Inventors: 赵光苗; 欧阳超; 安保光; 赵惠敏; 陈思兰; 吴永忠; 黄培劲
Original assignee: Hainan Bolian Rice Gene Technology Co ltd
Current assignee: Hainan Bolian Rice Gene Technology Co ltd
Priority date: 2021-12-17
Filing date: 2021-12-17
Publication date: 2023-05-05
Anticipated expiration: 2041-12-17
Also published as: CN116064509B

Abstract

本发明涉及农业生物技术领域，尤其涉及一种植物组成型启动子CEPro432及其应用。所述CEPro432启动子包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。本发明在GRMZM2G090432基因中筛选发现了两个CEPro432启动子，其可以驱动各类基因在植物中表达，例如功能基因、功能基因的反义基因、或小RNA基因等的表达，且CEPro432‑1942启动子的表达略强于CEPro432‑1076启动子。本发明提供的CEPro432启动子在植物的基因工程领域有重要意义，可有效降低外源DNA引起的转基因植物的潜在安全风险。

Description

一种植物组成型启动子CEPro432及其应用

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，尤其涉及一种植物组成型启动子CEPro432及其应用。

背景技术

转基因基础一般是利用现代生物技术，将目标基因通过扩增、重组之后转化并整合到生物体的基因组中，从而改善生物原有的性状或是使其获得新的优良性状。目前，转基因技术已经成为基因功能研究等基础研究和应用研究领域不可或缺的技术之一。

启动子是RNA聚合酶识别、结合并开始转录的一段DNA序列，其是驱动基因表达的重要功能顺式作用元件，在转基因技术中占据重要地位。启动子按其表达方式可分为组成型启动子、诱导型启动子和时空特异型启动子三类。其中，诱导型启动子能够在某些物理或化学信号的刺激下启动或大幅提高基因表达量，它们具有增强子、沉默子或类似功能的序列结构，并表现出明显的专一性。时空特异型启动子只在特定的生长阶段或部位中启动基因表达。而组成型启动子则能够在所有或大多数组织中启动基因转录，使基因表达具有时空持续性和表达恒定性。深入研究启动子的表达模式既有利于理解基因的表达调控机制和生物学功能，又有助于有效控制外源基因的表达。

转基因技术是现代生物技术的核心技术之一，现有技术运用转基因培育高产、优质、多抗、高效的新品种，能够降低农药、肥料投入，对于缓解资源约束、保护生态环境、改善产品品质、拓展农业功能等具有重要作用。目前，在植物转化过程中应用较多的启动子主要是花椰菜花病毒的启动子(CaMV35Spro)和玉米多聚泛素蛋白基因启动子(ZmUbipro)。CaMV35Spro是植物DNA病毒的启动子，在植物转基因中的应用可能引起担忧；ZmUbipro虽然是植物来源的启动子，但在转化时频繁使用同一种启动子易导致转基因沉默。因此，挖掘新的高效的组成型启动子，尤其是挖掘植物本源的、生物安全低风险的启动子显得尤其重要。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本发明提供一种植物组成型启动子CEPro432及其应用。

本发明提供一种植物组成型启动子CEPro432，所述植物组成型启动子CEPro432包括如下任一核苷酸序列：

i)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

ii)与i)互补的核苷酸序列；

iii)如i)所示的核苷酸序列经取代、缺失、增加一个或多个核苷酸序列得到的具有同等启动子功能的核苷酸序列。

本发明进一步提供用于扩增权利要求1所述的植物组成型启动子CEPro432的引物对，包括：如SEQ ID NO.3-4所示的引物对，和/或如SEQ ID NO.5-6所示的引物对。

进一步地，如SEQ ID NO.3-4所示的引物对用于扩增如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列；如SEQ ID NO.5-6所示的引物对用于扩增如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。

本发明进一步提供包含所述植物组成型启动子CEPro432的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体或转基因细胞。

进一步地，当所述生物材料为表达盒时，所述表达盒还包括功能基因和终止子。

进一步，所述功能基因为植物农艺性状相关基因或标记基因。

标记基因，即可以起到特异性标记作用的基因，通常用于检验基因转化成功与否，优选为β-葡萄糖苷酸酶基因GUS、潮霉素磷酸转移酶基因Hn、乙酰乳酸合酶突变基因ALS、Bar基因、抗性EPSPS基因或NptII基因中的一种或多种。

植物农艺性状，即和农作物的生育期、株高、叶面积、果实重量、品质、除草剂抗性、病虫害抗性等可以代表作物品种特点的相关性状。相应的，植物农艺性状相关的基因即是和这些性状相关的基因。

本发明进一步提供包括所述植物组成型启动子CEPro432，或所述引物对，或所述生物材料的试剂盒。

本发明进一步提供所述植物组成型启动子CEPro432，或所述引物对，或所述生物材料，或所述试剂盒在制备转基因植物中的应用。

进一步地，所述应用为，将所述植物组成型启动子CEPro432构建至载体中后导入植物中制备转基因植物；或，将所述生物材料导入植物中制备转基因植物。

进一步地，在制备得到转基因植物后，通过标记基因进行筛选。

作为一种优选的具体实施方式，本发明提供一种制备转基因水稻的方法，包括：

通过农杆菌转化法将包括所述植物组成型启动子CEPro432的载体转化至水稻愈伤组织中；

将所述水稻愈伤组织经过抗性筛选和分化得到水稻幼苗；

将所述水稻幼苗进行生根培养得到转基因水稻。

进一步地，所述水稻愈伤组织通过如下方法制备得到：

水稻种子去壳消毒后，将成熟胚接种于诱导培养基中，诱导胚性愈伤组织，28～30℃暗培养30～50天；

进一步地，在将植物组成型启动子CEPro432转化至水稻愈伤组织中后，还包括共培养，所述共培养为在22～24℃暗培养至愈伤组织表面出现菌体；

进一步地，所述抗性筛选为将经过共培养的愈伤组织接种到添加潮霉素的筛选培养基中，28～30℃暗培养30-50天，进行抗性筛选；

进一步地，所述分化为将经过抗性筛选的愈伤组织添加至添加潮霉素的分化培养基上，28～30℃光照培养25-40天。

进一步地，所述生根培养为将水稻幼苗接种到添加潮霉素的生根培养基上生根，30～32℃光照培养5～20天。

进一步地，在生根培养后，包括PCR检测，选择检测为阳性的植株种植。

本发明进一步提供所述植物组成型启动子CEPro432或所述生物材料在驱动基因在植物中表达中的应用，例如在植物愈伤组织、营养生长期的组织或生殖器官中的一种或多种中表达的应用。

进一步地，所述基因包括：功能基因、功能基因的反义基因、或小RNA基因；

所述功能基因优选包括植物农艺性状相关基因或标记基因，所述小RNA基因优选为能够干扰功能基因表达的小RNA基因。

进一步地，所述植物为水稻、玉米、小麦、大麦、大豆、棉花、油菜、高粱或小米中的一种或多种。

本发明具备如下有益效果：

本发明筛选得到一种CEPro432启动子，该启动子为组成型启动子，来源于玉米中，其可以驱动基因在水稻、玉米或小麦的愈伤组织、营养生长期的主要功能组织(根、叶、花、幼苗、幼穗等)或生殖器官中高效表达，特别是别是3-5叶期幼苗中高效表达。

本发明提供的启动子CEPro432可与植物内源或外源筛选标记基因组成植物转基因筛选表达盒，或植物遗传转化筛选载体，并添加其他功能元件进行植物组织培养或植物遗传转化，为植物遗传转化的筛选提供了有效的工具和方法。

本发明提供的启动子CEPro432还可驱动基因在转化苗的营养生长期地上和地下部分的主要功能组织中高效表达。除此之外，启动子CEPro432为植物内源基因，在转基因过程中不引入菌源等外源基因片段，不仅丰富了植物转基因的启动子资源，还可有效降低外源基因引起的转基因植物的潜在安全风险以及公众对转基因植物安全性的担忧，有利于转基因植物的商业化应用，具有良好的市场价值和社会效益。

附图说明

图1为本发明实施例2提供的琼脂糖凝胶电泳结果；其中从左到右依次为启动子CEPro432-1076和CEPro432-1942的扩增片段以及载体1300gusplus酶切片段。

图2为本发明实施例2提供的1300gusplus载体图谱。

图3为本发明实施例2提供的1300gusplus-432pro-1076和1300gusplus-432pro-1942载体经BamHI和HindIII酶切的电泳图；其中，M为DL15000 Marker，ck1-ck3为未酶切的1300gusplus-432Pro-1076重组质粒，1-3为酶切的1300gusplus-432Pro-1076重组质粒；ck4-ck6为未酶切的1300gusplus-432Pro-1942重组质粒，4-6为酶切的1300gusplus-432Pro-1942重组质粒。

图4为本发明实施例2提供的1300gusplus-432Pro-1076载体图谱。

图5为本发明实施例2提供的1300gusplus-432Pro-1942载体图谱。

图6为本发明实施例3提供的转化后农杆菌的PCR检测电泳结果；其中，M为2000bpMarker，ck+为1300gusplus-432Pro-1076和1300gusplus-432Pro-1942对应重组质粒阳性对照，1-10为1300gusplus-432Pro-1076或者1300gusplus-432Pro-1942重组质粒农杆菌单克隆菌液样品。

图7为本发明实施例3提供的潮霉素筛选培养基筛选愈伤组织示意图。

图8为本发明实验例1提供的转基因样品植株PCR检测电泳图；其中，M为2000bpMarker，H₂O为空白对照，ck-为ZH11非转基因植株基因组DNA、ck+为1300gusplus-432Pro-1076重组质粒阳性对照，1-10为1300gusplus-432Pro-1076筛选获得的转基因植株基因组DNA；11-20为1300gusplus-432Pro-1942筛选获得的转基因植株基因组DNA。

图9为本发明实验例1提供的1300gusplus-432Pro-1076和1300gusplus-432Pro-1942转基因T0代株系愈伤组织、分化苗、苗期以及成熟期叶片和幼穗等各组织GUS染色结果；其中，Ck-为阴性对照(ZH11)各发育阶段染色结果，Ck+为阳性对照(pC1301)各发育阶段染色结果，Pro-1076为1300gusplus-432Pro-1076转基因株系染色结果，Pro-1942为1300gusplus-432Pro-1942转基因株系染色结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1启动子CEPro432的获得

本发明分别截取不同长度的GRMZM2G090432基因上游序列进行启动子活性鉴定，筛选得到启动子CEPro432，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，依据其长度并将其命名为CEPro432-1076和CEPro432-1942，CEPro432启动子能够驱动基因在水稻的愈伤组织和营养生长期的主要组织中高效表达。

启动子CEPro432-1076可采用如下引物扩增得到：

SEQ ID NO.3:

5’-TCAGATCTACCATGGTACCGTGgatccGTCTACCGATCGAGTGATGGTCTGG-3’；

SEQ ID NO.4:

5’-TAAAACGACGGCCAGTGCCAagcttACACCGCCCCTCATCGGT-3’；

启动子CEPro432-1942可采用如下引物扩增得到：

SEQ ID NO.5:

5’-TCAGATCTACCATGGTACCGTGgatccGTCTACCGATCGAGTGATGG-3’；

SEQ ID NO.6:

5’-TAAAACGACGGCCAGTGCCAagcttGGTAACATGACTTGTGGGTAAAG-3’；

实施例2构建含启动子CEPro432的植物转基因表达盒和载体

1、含启动子CEPro432-1076的植物转基因表达盒的制备

本发明的植物转基因表达盒CEPro432-1076-GUS-nosT(序列如SEQ ID NO.7)的构建方法如下：

设计引物1300-432Pro-F1/1300-432Pro-Rv1从玉米B73基因组中扩增启动子CEPro432-1076片段。其中，引物1300-432Pro-F1的5’端有22个核苷酸序列与载体相应连接位置重复；引物1300-432Pro-Rv1的5’端有20个核苷酸序列与载体相应连接位置重复，以便后续利用Gibson Assembly重组连接。

上述引物序列如下：

1300-432Pro-F1:5’-TCAGATCTACCATGGTACCGTGgatccGTCTACCGATCGAGTGATGGTCTGG-3’(SEQ ID NO.3)；

1300-432Pro-Rv1:5’-TAAAACGACGGCCAGTGCCAagcttACACCGCCCCTCATCGGT-3’(SEQID NO.4)；

PCR扩增反应体系如下：

表1 PCR扩增启动子CEPro432-1076的反应体系

PCR扩增程序如下：94℃预变性3min；94℃变性30s，55-65℃退火30s，68℃延伸3min，35个循环；68℃延伸10min，16℃结束。

引物1300-432Pro-F1和1300-432Pro-Rv1扩增的PCR产物为CEPro432-1076片段，经1.2％琼脂糖凝胶电泳回收大小约为1076bp的条带(如图1所示)。

2、含启动子CEPro432-1942的植物转基因表达盒的制备

本发明的植物转基因表达盒CEPro432-1942-GUS-nosT(序列如SEQ ID NO.8)的构建方法如下：

设计引物1300-432Pro-F2/1300-432Pro-Rv2从玉米B73基因组中扩增启动子CEPro432-1942片段。其中，引物1300-432Pro-F2的5’端有22个核苷酸序列与载体相应连接位置重复；引物1300-432Pro-Rv2的5’端有20个核苷酸序列与载体相应连接位置重复；以便后续利用Gibson Assembly重组连接。

上述引物序列如下：

1300-432Pro-F2:TCAGATCTACCATGGTACCGTGgatccGTCTACCGATCGAGTGATGG(SEQ IDNO.5)；

1300-432Pro-Rv2:TAAAACGACGGCCAGTGCCAagcttGGTAACATGACTTGTGGGTAAAG(SEQID NO.6)。

PCR扩增反应体系如下：

表2 PCR扩增启动子CEPro432-1942的反应体系

引物1300-432Pro-F2和1300-432Pro-RV2扩增的PCR产物为CEPro432-1942片段，经1.2％琼脂糖凝胶电泳回收大小约为1942bp的条带(如图1所示)。

3、植物遗传转化载体的构建

本实施例使用Gibson Assembly方法，将上述步骤1中的扩增产物插入到1300gusplus载体(载体图谱见图2)，BamHI和HindIII双酶切位点间，具体方法如下：

(1)用BamHI+HindIII对载体质粒1300gusplus进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后，利用

Gel Extraction kit(Omega,下同)回收10kb左右大小条带，得到1300gusplus线性片段。

BamHI+HindIII双酶切反应体系如下：

表3双酶切反应体系

(2)2×Lightening Cloning Kit连接试剂盒

连接CEPro432-1076或CEPro432-1942片段到1300gusplus载体上，连接体系如下：

表4连接体系

连接程序：50℃，30min。

(3)转化：取上述连接产物3μl，加入到大肠杆菌感受态细胞中，轻微混匀，冰浴半小时；用电转仪1.8KV电击转化大肠杆菌感受态细胞；加入SOC培养基1ml，37℃220rpm振荡培养1h，5000rpm离心30s，弃800μl上清，将剩余菌体与培养基混匀，涂布于含卡那霉素的LB平板上。37℃培养16h左右，挑取单菌落，用特异性引物(1300-432Pro-test-F和1300-432Pro-test-R)做菌落PCR验证，挑选阳性菌落，37℃、220rpm摇菌过夜，利用高纯质粒小提试剂盒(中科瑞泰)提取质粒，酶切检测正确后(如图3)，保菌并送测序。命名为1300gusplus-432pro-1076和1300gusplus-432pro-1942，载体图谱见图4和图5。

引物序列：

1300-432pro-test-F:TCTTCCAGTCCTTTCCCGTAGT(SEQ ID NO.9)；

1300-432pro-test-R:GGAGGGAGGGATGGCAACC(SEQ ID NO.10)。

实施例3

本实施例将CEPro432启动子转化至植物中制备相应的转基因植物，具体流程如下：

1、农杆菌转化及鉴定

取-80℃保存的农杆菌EHA105感受态细胞加1μL实施例3中得到的测序正确1300gusplus-432Pro-1076和1300gusplus-432Pro-1942质粒，2.5KV电击转化。涂布于含有卡那霉素、利福平和链霉素的YEP培养板上，28℃培养48h左右，挑取单菌落摇菌过夜，用特异性引物(1300-432Pro-test-F和1300-432Pro-test-R)菌液PCR验证(图6)，可扩增得到约648bp目的片段，挑选阳性克隆(工程农杆菌)，摇菌36-48h，保存菌液用于侵染。

2、农杆菌介导遗传转化

诱导：将中花11(ZH11)的种子经次氯酸钠消毒后置于诱导培养基(N6+2.4-D 3mg/L+CH0.6g/L+Pro 0.5g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L)上，28℃常温暗培养30-40d，得到诱导的愈伤后继代培养30-40d；

筛选：将实施例4得到的工程农杆菌，通过农杆菌介导的遗传转化法转化上述愈伤组织，共培养3d后，清洗5-6遍，转移至含50mg/L潮霉素的筛选培养基上，30℃暗培养30-50d，结果如图7所示，1300gusplus-432pro-1076和1300gusplus-432pro-1942的农杆菌侵染后筛选的愈伤，可筛选获得抗性愈伤；

分化：筛选获得的抗性愈伤转移至含50mg/L潮霉素的分化培养基上，分化25-30d获得阳性苗；

生根：经分化获得的阳性苗转移至含50mg/L潮霉素的生根培养基上，生根7-15d最后获得阳性转基因植株；

炼苗及移栽：将根系生长旺盛的转化株系开启瓶口封口膜，加无菌水覆盖培养基1-2cm厚，置于室温下与空气接触进行炼苗2-3d后，移栽至温室栽培。

3、转基因株系鉴定

为了鉴定获得的株系是否为转基因株系，本实施例对经筛选培养、分化培养和生根培养获得的部分阳性转基因植株进行PCR验证。

首先提取样品DNA，DNA提取步骤如下：取约2cm长的水稻叶片置于2ml离心管中；在研钵中加入800μl 1.5×CTAB，研磨叶片至匀浆并倒回离心管内；65℃水浴20-30min，每5min颠倒混匀1次；12000rpm离心10min；吸取400μl上清液至新的离心管，加入2倍体积经冰预冷的无水乙醇，-20℃冰置20min；12000rpm离心10min；弃上清，加入500μl 75％乙醇，颠倒漂洗，8000rpm离心5min；弃上清，置于超净台吹干或自然晾干，加100μl ddH2O溶解DNA。

使用潮霉素引物(Hn-F/Hn-R)对转基因株系基因组DNA样品进行PCR扩增检测，该引物对以内源水稻基因组为模板无法扩增获得片段，以转基因苗扩增获得片段大小为561bp。

引物序列如下：

Hn-F:CTTAGCCAGACGAGCGGGTTC(SEQ ID NO.11)；

Hn-R:GCTTCTGCGGGCGATTTGT(SEQ ID NO.12)。

以ZH11基因组DNA作为阴性对照，水为空白对照。

PCR反应程序如下：94℃预变性5min，94℃变性45s，55-65℃退火45s；72℃延伸1.5min；30-35个循环；72℃再延伸10min；16℃结束。

PCR反应体系如下：

表5 PCR反应体系

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，结果如图8所示，结果表明，大部分转基因样品中含有561bp的转基因条带，与载体对照大小相同(1-19为转基因阳性植株，20没有扩增得到转基因条带)；而空白对照和阴性对照ZH11无法扩出条带。

实验例1

本实验例对实施例3得到的转基因株系进行进一步分析，具体如下：

1、植物组织GUS染色分析

使用GUS染色试剂盒(中科瑞泰，货号：RTU4032)进行染色分析，筛选阳性愈伤组织染色明显，获得的分化苗叶片和根染色也明显，后续对苗期以及成熟期叶片、幼穗进行GUS染色均染上色，且发现CEPro432-1076启动子与CEPro432-1942启动子驱动的GUS基因表达量较高。其中，阴性对照(ZH11)叶片各阶段组织均未染上色，阳性对照(转pC1301载体阳性株系)均染上色(图9)。

2、玉米中组织表达分析

利用水稻中类似的方法，获得玉米转基因植株，对各组织gus染色发现，玉米筛选阳性愈伤组织染色明显，获得的分化苗叶片、根、苗期叶片、种子进行GUS染色均染上色。可见CEPro432-1076和CEPro432-1942启动子也可驱动GUS基因在玉米愈伤组织水平、根、苗期、成熟期叶片和种子中稳定表达，是一个高效的组成型启动子。其中，CEPro432-1942启动子的表达略强于CEPro432-1076启动子。

3、小麦中组织表达分析

利用水稻中类似的方法，获得小麦转基因植株，对各组织gus染色发现，小麦筛选阳性愈伤组织染色明显，获得的分化苗叶片、根、苗期叶片、种子进行GUS染色均染上色。可见CEPro432-1076和CEPro432-1942启动子也可驱动GUS基因在小麦愈伤组织水平、根、苗期、成熟期叶片和种子中稳定表达，是一个高效的组成型启动子。

上述结果表明，CEPro432-1076和CEPro432-1942启动子可驱动GUS基因在愈伤组织水平、根、苗期、成熟期叶片和幼穗中稳定表达，是一个高效的组成型启动子。由CEPro432-1076启动子所组成的转基因筛选表达盒、表达载体在转基因植物制备中具有较高的效率。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 海南波莲水稻基因科技有限公司

<120> 一种植物组成型启动子CEPro432及其应用

<130> KHP211125403.9

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1076

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtctaccgat cgagtgatgg tctggctgtt gggtggtgtt ctgcaaatcg atggatcgcg 60

agttggtggt tgtgtggcgc catccttcgt ggctgcatat atacacacac agggattcaa 120

acttgacaag gatctagtac aacttgaagt ataataaagt ttggcagaca attttgcaca 180

cgcagttgat gacgtacgtc cggagaggat ggttccggcc ggacgtatgc agcggtagta 240

tataggatct gcacgatatt tttctaagcc tgaccagtgt ctattatctt gttgcggctt 300

cgtggaggtt gccatccctc cctccatcgt cgcggctttt tcctggagtg gcaaagacca 360

acctgcactg cgaggtccgt cgtccgtgcg tcttggtctt gggaaacaag caattaaact 420

cgatcggtag gattagttaa tgcaaacagt gttgtgcagt tgatcctttc gcaagtaatt 480

aggttgggtg aacataaggt tcatagaaca aagtcaacgt tgcaaatgga atgggattgt 540

gtaacatgtt agggcgaaac tacgctatgg ttaggaggtg caacaaagtt gaataaaccg 600

gcagaaaccg ctcgtttttt ttaaaggatg gacggttttc accggttttt aaaattcgtt 660

taaaaatttt aaaaataaaa aattataaaa ctaatgaata attatgataa aagactaaat 720

atttttctag tatatctcat atttactttt atttttaaaa gtaacaagta tttttggttt 780

aaaacaatgg aagcctgtaa aacaacgaaa atcggtgaaa tgttggtttc tcgccgagaa 840

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ttttctgatt ctcatccgtt tctcgacgaa aaatggaaac cgatgagggg cggtgt 1076

<210> 2

<211> 1942

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtctaccgat cgagtgatgg tctggctgtt gggtggtgtt ctgcaaatcg atggatcgcg 60

agttggtggt tgtgtggcgc catccttcgt ggctgcatat atacacacac agggattcaa 120

acttgacaag gatctagtac aacttgaagt ataataaagt ttggcagaca attttgcaca 180

cgcagttgat gacgtacgtc cggagaggat ggttccggcc ggacgtatgc agcggtagta 240

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taaaaatttt aaaaataaaa aattataaaa ctaatgaata attatgataa aagactaaat 720

atttttctag tatatctcat atttactttt atttttaaaa gtaacaagta tttttggttt 780

aaaacaatgg aagcctgtaa aacaacgaaa atcggtgaaa tgttggtttc tcgccgagaa 840

atcttttaaa acattttatt ttaatttgaa atacaaaccg gtcaaaaatt ttaaaaacca 900

ctggaaacta gtttctcggt gaaatctagt ggtttttccg gtaggtttta ttggtttacc 960

gtctgttttt atcaggaaat cggttttaaa tttttattta agatgtcaaa ccaattgggt 1020

ttttctgatt ctcatccgtt tctcgacgaa aaatggaaac cgatgagggg cggtgtttga 1080

aattcaaaac gatatggtga actacgacgt gaaaatgcat cccttctctg ttttttcctt 1140

ttcccccttt tacttgcaaa aaaacagtga atttggttaa agttttatcg gatatactcc 1200

cacgatatat gcacccacga cacaagttca ctcactctaa tttgcttcag gttcatcact 1260

cataacatat caagagtata tttgtcacac ccggttttta ggggtccaaa gcccgggcgc 1320

gaacataatc accaggtgtg ctgggaccaa gtctcacgca tatgatgaat catggcacaa 1380

gatcgaatgt cacatcttta tatataacag gagttctata caaaataaat aaataattac 1440

attataagga gacaacggtc cagcaaccca aagttgactg ggagacgacg tcctagacct 1500

ctcacgaaca catcgcagca tcctccaaac gcctcatcct gtggtacctg ttcttgacct 1560

gtgggggggt gagacagcaa gagtgagctc acatacgttc atcgctcaac aagttgtggg 1620

gaataatgtg catgaactcg ccaaaggtgg gagatcacgt gaagtgtaag gcttaccaat 1680

gaggatggtt agagctgagc attgctttta aagttggtca aaattttatt agcagttact 1740

aagtataagt aaataccaac ccaattaagt agtagaacaa aagtaacatc atcacctgcg 1800

atgtagtgca tatgacaaat tgaatttagt tccataaatt aatcatcaga gagtcctgag 1860

ctgctcatga ccgtgagctc ggctagtata ccagttttac actctgcaga ggtggtaccc 1920

tttacccaca agtcatgtta cc 1942

<210> 3

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcagatctac catggtaccg tggatccgtc taccgatcga gtgatggtct gg 52

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

taaaacgacg gccagtgcca agcttacacc gcccctcatc ggt 43

<210> 5

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcagatctac catggtaccg tggatccgtc taccgatcga gtgatgg 47

<210> 6

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

taaaacgacg gccagtgcca agcttggtaa catgacttgt gggtaaag 48

<210> 7

<211> 3387

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aatgtataat tgcgggactc taatcataaa aacccatctc ataaataacg tcatgcatta 60

catgttaatt attacatgct taacgtaatt caacagaaat tatatgataa tcatcgcaag 120

accggcaaca ggattcaatc ttaagaaact ttattgccaa atgtttgaac gatcggggaa 180

attcgagctc ggtagcaatt cccgaggctg tagccgacga tggtgcgcca ggagagttgt 240

tgattcacac gtgatggtga tggtgatggc tagcgttctt gtagccgaaa tctggaatgt 300

tggtccagcg ctcgcgaaag acgtgcgcgg cgagcttcgg cttgcggtca cgagtgaaca 360

cgcccttctt gtttccttgg acgcgcatca cgccctgaga ggtcgcgaag tccgcgaagt 420

tccacgcttg ctcacccacg aagttctcaa actcatcgaa cacgacgtgg ttcgcctggt 480

agtactcgac ttgatattcc tcggtgaaca tcactggatc aatgtcgtga aagcccgcaa 540

cggtgtctgc gccgtactca gtgatcatga tcggctttcc tgggcaacgc ttgttccacg 600

cgtgaaattc ctggcggaga tggactttgg ccgcttcgag atcaccgcca tcgaagtacc 660

atccgttata gcgattgagc gcgatgacgt caatcagttc ggcgactttg tccgtctccg 720

gggtagccat cacaaacagc acgatcgtga ccggacgctt ctgtgggtcg agttccttgg 780

tcagctccac caacggcttg aagtactcgt acgcgccctc ttcctcagtc gccgcctcgt 840

tggcgatgct ccacatcacg acgcttggat ggttcttgtc acgagacacc agttcacgga 900

gaacgtcttg atggtgctca aacgtccgaa tcttctccca ggtactgacg cgctcgctgc 960

cttcgccgag tcccgtggtg gccatgaagt tgaggtgcac gccaactgcc ggagtctcgt 1020

cgatcacgac cagaccctcg cgatccgcaa gacgcatcaa ctcttcagag tacggatagt 1080

gtgcggtccg gaagctgttg gcgccgatcc atttgaggat attgaaatcc atcacattgc 1140

tcgcttcgtt aaagccacgg ccgttgatag gagtgtcctc atgtttgcca aagcccttga 1200

agtagaacgg tttgttgttg atgaggaact tgccgtcgtt gacttccacg gtccgcacgc 1260

cgaacggctc ttcatagaca tcgatggtca gtccgtcgtt caccagttcc actttgatct 1320

ggtagagata cgtgttcagt ggttcccaga ggatgacatt cggaatctcc acgttaccgc 1380

tcaggccctc ggtgcttgcg accactttgc cttcctcatc cacgaccgac actttcacgg 1440

tctcggcttt gccttgaaag tccaccgtat aggtcacagt cccggttggg ccattgaagt 1500

cggtcacaac cgagatgtcc tcgacgtacg taaacggggt cgtgtagatt ttcaccggac 1560

ggtgcaggcc tgcatagttg aagaagtcga agttcggctt gttacgaatg acttttccga 1620

ggccctcttc gtggcgctcg ctgtacagcc ccaccgggag ggtgctatcg tcgaggatgt 1680

tgtccacggc gacggtgacg cgattcatgc catcacgcag cgagttgttg atttccgctt 1740

cgaatggcag gaatccgccc ttgtgctcca cgaccagctc accattgaca tagacaattg 1800

ctttgtgagt tgcagagccg aagcggagca cgatacgctg atccttcaga taggccggca 1860

ccgtgaactc acgttcgtac cagacatatc cgatatggtt gcggatttcc ttggtcacgc 1920

caatgtcatt gtaactgctt gggacggcca tactaatagt gtcggtcagc ttgctttcgt 1980

accacttctc ttccagtcct ttcccgtagt ccagcttgaa gttccagacg ccattgaggt 2040

cgaagacgcc acgggtctcg gtgttgatcg ggtacagact agttcgtcgg ttctgtaact 2100

atcatcatca tcatagacac acgaaataaa gtaatcagat tatcagttaa agctatgtaa 2160

tatttacacc ataaccaatc aattaaaaaa tagatcagtt taaagaaaga tcaaagctca 2220

aaaaaataaa aagagaaaag ggtcctaacc aagaaaatga aggagaaaaa ctagaaattt 2280

accctcagat ctaccatggt accgtggatc cgtctaccga tcgagtgatg gtctggctgt 2340

tgggtggtgt tctgcaaatc gatggatcgc gagttggtgg ttgtgtggcg ccatccttcg 2400

tggctgcata tatacacaca cagggattca aacttgacaa ggatctagta caacttgaag 2460

tataataaag tttggcagac aattttgcac acgcagttga tgacgtacgt ccggagagga 2520

tggttccggc cggacgtatg cagcggtagt atataggatc tgcacgatat ttttctaagc 2580

ctgaccagtg tctattatct tgttgcggct tcgtggaggt tgccatccct ccctccatcg 2640

tcgcggcttt ttcctggagt ggcaaagacc aacctgcact gcgaggtccg tcgtccgtgc 2700

gtcttggtct tgggaaacaa gcaattaaac tcgatcggta ggattagtta atgcaaacag 2760

tgttgtgcag ttgatccttt cgcaagtaat taggttgggt gaacataagg ttcatagaac 2820

aaagtcaacg ttgcaaatgg aatgggattg tgtaacatgt tagggcgaaa ctacgctatg 2880

gttaggaggt gcaacaaagt tgaataaacc ggcagaaacc gctcgttttt tttaaaggat 2940

ggacggtttt caccggtttt taaaattcgt ttaaaaattt taaaaataaa aaattataaa 3000

actaatgaat aattatgata aaagactaaa tatttttcta gtatatctca tatttacttt 3060

tatttttaaa agtaacaagt atttttggtt taaaacaatg gaagcctgta aaacaacgaa 3120

aatcggtgaa atgttggttt ctcgccgaga aatcttttaa aacattttat tttaatttga 3180

aatacaaacc ggtcaaaaat tttaaaaacc actggaaact agtttctcgg tgaaatctag 3240

tggtttttcc ggtaggtttt attggtttac cgtctgtttt tatcaggaaa tcggttttaa 3300

atttttattt aagatgtcaa accaattggg tttttctgat tctcatccgt ttctcgacga 3360

aaaatggaaa ccgatgaggg gcggtgt 3387

<210> 8

<211> 4253

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aatgtataat tgcgggactc taatcataaa aacccatctc ataaataacg tcatgcatta 60

catgttaatt attacatgct taacgtaatt caacagaaat tatatgataa tcatcgcaag 120

accggcaaca ggattcaatc ttaagaaact ttattgccaa atgtttgaac gatcggggaa 180

attcgagctc ggtagcaatt cccgaggctg tagccgacga tggtgcgcca ggagagttgt 240

tgattcacac gtgatggtga tggtgatggc tagcgttctt gtagccgaaa tctggaatgt 300

tggtccagcg ctcgcgaaag acgtgcgcgg cgagcttcgg cttgcggtca cgagtgaaca 360

cgcccttctt gtttccttgg acgcgcatca cgccctgaga ggtcgcgaag tccgcgaagt 420

tccacgcttg ctcacccacg aagttctcaa actcatcgaa cacgacgtgg ttcgcctggt 480

agtactcgac ttgatattcc tcggtgaaca tcactggatc aatgtcgtga aagcccgcaa 540

cggtgtctgc gccgtactca gtgatcatga tcggctttcc tgggcaacgc ttgttccacg 600

cgtgaaattc ctggcggaga tggactttgg ccgcttcgag atcaccgcca tcgaagtacc 660

atccgttata gcgattgagc gcgatgacgt caatcagttc ggcgactttg tccgtctccg 720

gggtagccat cacaaacagc acgatcgtga ccggacgctt ctgtgggtcg agttccttgg 780

tcagctccac caacggcttg aagtactcgt acgcgccctc ttcctcagtc gccgcctcgt 840

tggcgatgct ccacatcacg acgcttggat ggttcttgtc acgagacacc agttcacgga 900

gaacgtcttg atggtgctca aacgtccgaa tcttctccca ggtactgacg cgctcgctgc 960

cttcgccgag tcccgtggtg gccatgaagt tgaggtgcac gccaactgcc ggagtctcgt 1020

cgatcacgac cagaccctcg cgatccgcaa gacgcatcaa ctcttcagag tacggatagt 1080

gtgcggtccg gaagctgttg gcgccgatcc atttgaggat attgaaatcc atcacattgc 1140

tcgcttcgtt aaagccacgg ccgttgatag gagtgtcctc atgtttgcca aagcccttga 1200

agtagaacgg tttgttgttg atgaggaact tgccgtcgtt gacttccacg gtccgcacgc 1260

cgaacggctc ttcatagaca tcgatggtca gtccgtcgtt caccagttcc actttgatct 1320

ggtagagata cgtgttcagt ggttcccaga ggatgacatt cggaatctcc acgttaccgc 1380

tcaggccctc ggtgcttgcg accactttgc cttcctcatc cacgaccgac actttcacgg 1440

tctcggcttt gccttgaaag tccaccgtat aggtcacagt cccggttggg ccattgaagt 1500

cggtcacaac cgagatgtcc tcgacgtacg taaacggggt cgtgtagatt ttcaccggac 1560

ggtgcaggcc tgcatagttg aagaagtcga agttcggctt gttacgaatg acttttccga 1620

ggccctcttc gtggcgctcg ctgtacagcc ccaccgggag ggtgctatcg tcgaggatgt 1680

tgtccacggc gacggtgacg cgattcatgc catcacgcag cgagttgttg atttccgctt 1740

cgaatggcag gaatccgccc ttgtgctcca cgaccagctc accattgaca tagacaattg 1800

ctttgtgagt tgcagagccg aagcggagca cgatacgctg atccttcaga taggccggca 1860

ccgtgaactc acgttcgtac cagacatatc cgatatggtt gcggatttcc ttggtcacgc 1920

caatgtcatt gtaactgctt gggacggcca tactaatagt gtcggtcagc ttgctttcgt 1980

accacttctc ttccagtcct ttcccgtagt ccagcttgaa gttccagacg ccattgaggt 2040

cgaagacgcc acgggtctcg gtgttgatcg ggtacagact agttcgtcgg ttctgtaact 2100

atcatcatca tcatagacac acgaaataaa gtaatcagat tatcagttaa agctatgtaa 2160

tatttacacc ataaccaatc aattaaaaaa tagatcagtt taaagaaaga tcaaagctca 2220

aaaaaataaa aagagaaaag ggtcctaacc aagaaaatga aggagaaaaa ctagaaattt 2280

accctcagat ctaccatggt accgtggatc cgtctaccga tcgagtgatg gtctggctgt 2340

tgggtggtgt tctgcaaatc gatggatcgc gagttggtgg ttgtgtggcg ccatccttcg 2400

tggctgcata tatacacaca cagggattca aacttgacaa ggatctagta caacttgaag 2460

tataataaag tttggcagac aattttgcac acgcagttga tgacgtacgt ccggagagga 2520

tggttccggc cggacgtatg cagcggtagt atataggatc tgcacgatat ttttctaagc 2580

ctgaccagtg tctattatct tgttgcggct tcgtggaggt tgccatccct ccctccatcg 2640

tcgcggcttt ttcctggagt ggcaaagacc aacctgcact gcgaggtccg tcgtccgtgc 2700

gtcttggtct tgggaaacaa gcaattaaac tcgatcggta ggattagtta atgcaaacag 2760

tgttgtgcag ttgatccttt cgcaagtaat taggttgggt gaacataagg ttcatagaac 2820

aaagtcaacg ttgcaaatgg aatgggattg tgtaacatgt tagggcgaaa ctacgctatg 2880

gttaggaggt gcaacaaagt tgaataaacc ggcagaaacc gctcgttttt tttaaaggat 2940

ggacggtttt caccggtttt taaaattcgt ttaaaaattt taaaaataaa aaattataaa 3000

actaatgaat aattatgata aaagactaaa tatttttcta gtatatctca tatttacttt 3060

tatttttaaa agtaacaagt atttttggtt taaaacaatg gaagcctgta aaacaacgaa 3120

aatcggtgaa atgttggttt ctcgccgaga aatcttttaa aacattttat tttaatttga 3180

aatacaaacc ggtcaaaaat tttaaaaacc actggaaact agtttctcgg tgaaatctag 3240

tggtttttcc ggtaggtttt attggtttac cgtctgtttt tatcaggaaa tcggttttaa 3300

atttttattt aagatgtcaa accaattggg tttttctgat tctcatccgt ttctcgacga 3360

aaaatggaaa ccgatgaggg gcggtgtttg aaattcaaaa cgatatggtg aactacgacg 3420

tgaaaatgca tcccttctct gttttttcct tttccccctt ttacttgcaa aaaaacagtg 3480

aatttggtta aagttttatc ggatatactc ccacgatata tgcacccacg acacaagttc 3540

actcactcta atttgcttca ggttcatcac tcataacata tcaagagtat atttgtcaca 3600

cccggttttt aggggtccaa agcccgggcg cgaacataat caccaggtgt gctgggacca 3660

agtctcacgc atatgatgaa tcatggcaca agatcgaatg tcacatcttt atatataaca 3720

ggagttctat acaaaataaa taaataatta cattataagg agacaacggt ccagcaaccc 3780

aaagttgact gggagacgac gtcctagacc tctcacgaac acatcgcagc atcctccaaa 3840

cgcctcatcc tgtggtacct gttcttgacc tgtggggggg tgagacagca agagtgagct 3900

cacatacgtt catcgctcaa caagttgtgg ggaataatgt gcatgaactc gccaaaggtg 3960

ggagatcacg tgaagtgtaa ggcttaccaa tgaggatggt tagagctgag cattgctttt 4020

aaagttggtc aaaattttat tagcagttac taagtataag taaataccaa cccaattaag 4080

tagtagaaca aaagtaacat catcacctgc gatgtagtgc atatgacaaa ttgaatttag 4140

ttccataaat taatcatcag agagtcctga gctgctcatg accgtgagct cggctagtat 4200

accagtttta cactctgcag aggtggtacc ctttacccac aagtcatgtt acc 4253

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcttccagtc ctttcccgta gt 22

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggagggaggg atggcaacc 19

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cttagccaga cgagcgggtt c 21

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gcttctgcgg gcgatttgt 19

Claims

1.一种植物组成型启动子CEPro432，其特征在于，所述植物组成型启动子CEPro432包括如下任一核苷酸序列：

i)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列和/或如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

ii)与i)互补的核苷酸序列；

2.一种引物对，其特征在于，所述引物对用于扩增权利要求1所述的植物组成型启动子CEPro432，所述引物对包括：如SEQ ID NO.3-4所示的引物对，和/或如SEQ ID NO.5-6所示的引物对。

3.一种生物材料，其特征在于，所述生物材料包括权利要求1所述植物组成型启动子CEPro432，所述生物材料为表达盒、载体或转基因细胞。

4.根据权利要求3所述生物材料，其特征在于，当所述生物材料为表达盒时，所述表达盒还包括功能基因和终止子；

所述功能基因优选为标记基因或植物农艺性状相关基因。

5.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述植物组成型启动子CEPro432、权利要求2所述引物对、或权利要求3所述生物材料中的一种或多种。

6.权利要求1所述植物组成型启动子CEPro432，或权利要求2所述引物对，或权利要求3或4所述生物材料，或权利要求5所述试剂盒在制备转基因植物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用为将权利要求1所述植物组成型启动子CEPro432构建至载体上，后转化至植物中。

8.权利要求1所述植物组成型启动子CEPro432，或权利要求3或4所述生物材料在驱动基因在植物中表达中的应用。

9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述基因为功能基因、功能基因的反义基因、或小RNA基因；

所述功能基因优选为植物农艺性状相关基因或标记基因。

10.根据权利要求6-10任一项所述的应用，其特征在于，所述植物包括水稻、玉米、小麦、大麦、大豆、棉花、油菜、高粱或小米中的一种或多种。