CN107245480A

CN107245480A - 具有除草剂抗性的乙酰乳酸合酶突变蛋白及其应用

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Publication number: CN107245480A
Application number: CN201710568511.7A
Authority: CN
Inventors: 胡茂龙; 浦惠明; 龙卫华; 高建芹; 张洁夫; 陈松; 彭琦; 陈锋; 付三雄; 周晓婴; 张维; 王晓东
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-07-13
Filing date: 2017-07-13
Publication date: 2017-10-13
Anticipated expiration: 2037-07-13
Also published as: CN111690625A; CN111690625B; CN107245480B

Abstract

本发明公开ALS突变蛋白，其ALS1氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，ALS3氨基酸序列如SEQ ID No：4所示。本发明还公开编码该突变蛋白的核酸，含有该核酸的表达盒、重组载体或细胞。本发明还公开该突变蛋白、核酸、表达盒、重组载体或细胞在植物抗除草剂方面的应用。本发明还公开了获得具有除草剂抗性植物的方法以及抗性植物鉴定方法。本发明是在我国油菜中首次发现的双基因双突变位点的ALS抑制剂类除草剂乙酰乳酸合酶突变体；在田间喷施ALS抑制剂类除草剂苯磺隆和甲基二磺隆实验结果表明，含有本发明的ALS突变蛋白的油菜DS3在3‑4叶期施用16倍的杂草防治推荐使用浓度后，植株仍然正常生长发育和结实。

Description

具有除草剂抗性的乙酰乳酸合酶突变蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及植物抗除草剂和分子育种领域，具体涉及具有除草剂抗性的乙酰乳酸合酶突变蛋白及其应用。更具体地，涉及甘蓝型油菜高抗除草剂的乙酰乳酸合酶编码基因的分离、载体构建、培育高抗除草剂植物的方法。

背景技术

油菜(Brassica napus L.)是我国第一大油料作物之一，为我国半数以上的人口提供食用油来源。近年来，随着我国油菜种植方式由传统的劳动密集型向规模化、机械化生产发展，杂草有效防治已成为油菜全程机械化生产、轻简化栽培的重要环节。化学除草是控制农田杂草经济有效手段。遗憾的是，由于缺少商业化的抗除草剂油菜品种，致使当前我国油菜生产化除面积非常有限。北美、欧洲等发达国家早以通过种植抗除草剂油菜实施化学除草。抗除草剂的品种类型主要有孟山都公司的抗草甘膦油菜、拜耳公司的抗草胺膦油菜和巴斯夫公司的抗咪唑啉酮油菜。这些抗性基因受国际知识产权保护，在我国商业化种植需要交纳昂贵的专利费，这将大幅度提高油菜生产成本，违背了种植抗除草剂作物的初衷。同时抗草甘膦油菜和抗草胺膦油菜均为转基因品种，在中国尚未批准商业化种植，无法在生产上应用。而咪唑啉酮类除草剂在土壤中残留期长，仅能在一熟制地区使用，在我国油菜主产区长江流域多熟制地区未能登记发放。因此，创制具有自主知识产权、适合我国生产需求的抗除草剂油菜新种质、挖掘抗性基因对油菜抗除草剂品种选育均具有十分重要的现实意义。

乙酰乳酸合酶(Acetolactate synthase，ALS)，也叫乙酰羟基酸合酶(Acetohydroxyacid synthase,AHAS)，是植物和微生物3种支链氨基酸生物合成过程中的关键酶(McCourt JA,Duggleby RG.Amino Acids,2006,31:173–210)。如果此酶的活力受到抑制或者丧失，会导致植物缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸合成受阻，影响蛋白质合成，最终导致植物生长受阻、直至死亡，因此以ALS为作用靶标开发了多种类型的高效除草剂，如磺酰脲类(sulfonylureas，SU)、咪唑啉酮类(imidazolinones，IMI)等。这些除草剂统称为ALS抑制剂类除草剂或ALS类除草剂，具有选择性强、杀草谱广、使用剂量低、对哺乳动物毒性小等优点，在生产上得到广泛应用，已成为继草甘膦后的第2大类除草剂。然而，商业化的ALS类除草剂对双子叶作物油菜具有强烈的生长抑制作用，使其仅能在水稻、小麦、玉米等单子叶作物中应用。为此，培育抗性油菜品种，拓宽现有ALS类除草剂的应用范围，可有效解决这一难题。但是，由于缺少生具有产应用价值的抗性种质或基因，国内至今还没有培育出商业化的抗性油菜品种。

ALS类除草剂的靶标ALS蛋白氨基酸位点的突变可以产生抗性植物，其中涉及氨基酸位点有Gly 95、Ala 96、Ala 122、Pro 171、Pro 196、Pro 197、Ala 205、Asp 376、Trp537、Trp548、Trp 552、Trp 557、Trp 563、Trp 574、Ser 621、Ser 627、Ser 638、Ser653、Gly654、Val 669等(以模式植物拟南芥的ALS氨基酸位置计算)，这在多种农作物(包括水稻、玉米、小麦、向日葵等)、模式植物拟南芥和杂草中均有报道(Tan et al.,2005,PestManagSci,61:246-257)。研究发现，抗性植物的抗性效应取决于ALS上氨基酸突变的位置、突变后的氨基酸种类以及突变氨基酸的数目(Yu et al.,2010,J Exp Botany,61:3925-3934)。同时不同遗传背景下相同位置的氨基酸变异产生的除草剂抗性效应也会存在显著差异，这很可能是由于不同遗传背景下植物中的不同微效基因参与了除草剂抗性的协同作用。所以，对于复杂遗传背景的作物(如油菜)，具有除草剂高度抗性的突变体及其确实能起决定性作用的物质(如蛋白、基因等)目前还没有理论来定向设计出，只能依赖于科研人员艰苦实践而获得，尤其是依赖长期筛选与鉴定，并且凭借运气才能获得。对于异源四倍体作物油菜来说，情况更为复杂，我们很难提前预测ALS蛋白氨基酸位点的突变是否会产生除草剂抗性，抗性突变位点的抗性水平是否具有育种利用价值，抗性种质或基因能否适合生产实用价值。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供具有除草剂抗性的乙酰乳酸合酶突变体。

本发明还要解决的技术问题是提供了编码该蛋白的核酸以及表达盒、载体和细胞等。

本发明还要解决的技术问题是提供了获得具有除草剂抗性的植物的方法和应用。

本发明还要解决的技术问题是提供了判断植物是否采用本发明方法获得的鉴定方法。

本发明人正是经过长期而艰苦的研究实践，凭借运气偶然地利用苯磺隆在油菜N131的两轮EMS诱变的突变体库中发现了一株高抗除草剂种质，该种质携带的乙酰乳酸合酶突变体属于双基因双位点突变，编码的蛋白具有对除草剂的高度抗性，从而赋予油菜具有对除草剂高度的抗性。截至本专利申请之前，此种类型油菜突变体在国内外均未见公开报道。

本发明所述的乙酰乳酸合酶突变体与其他野生型乙酰乳酸合酶相比具有双基因双位点突变，将编码该突变酶的基因转育或转化到植物中，可使油菜、拟南芥等植物具有高抗ALS抑制剂类除草剂的特性。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：本发明提供了使得植物具有除草剂抗性的ALS突变蛋白，其在ALS1氨基酸序列的第182位氨基酸由脯氨酸变为亮氨酸，在ALS3的第556位氨基酸由色氨酸变为亮氨酸。目前还没有报道表明，在来自甘蓝型油菜基因组中上述的双基因双突变，会使得油菜具有ALS抑制剂类除草剂高度抗性。

优选本发明的第一方面的ALS1蛋白带有Pro182Leu突变，ALS3蛋白带有Trp556Leu，除了本发明具有的实施方式所述的突变植株筛选或扩增方法之外，在蛋白质序列已知的情形下，本领域技术人员有能力通过改变已知蛋白质的编码基因序列并将其导入载体，就可以制备出取代、添加或缺失了氨基酸残基的蛋白质，这些方法均为常规手段。在本发明的具体实施方式中，具有除草剂抗性的ALS蛋白，其ALS1氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，ALS3氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。该蛋白经过证实为对SU类除草剂苯磺隆(2-[N-(4-甲氧基-6-甲基-1,3,5-三嗪-2-基)-N-甲基氨基甲酰胺基磺酰基]苯甲酸甲酯)和甲基二磺隆(甲基-2[3-(4，6-＝甲氧基嘧啶-2-基)一脲基磺酰基l-4-甲磺酰基氨基苯甲酸酯)不敏感的乙酰乳酸合酶。

本发明的第二方面提供了核酸，其编码本发明第一方面的蛋白质。在本发明中，核酸可以是DNA、RNA，其中优选为DNA。在已知晓所编码蛋白序列或核酸序列的前提下，通过常规的密码子对应关系和宿主表达频率，运用PCR方法、DNA重组法或人工合成的方法，本领域技术人员有能力获得并优化编码本发明第一方面的蛋白质的核酸。一旦获得该核酸，就可以将其克隆入载体，再转化或转染入相应的细胞，然后通过常规的宿主细胞进行增殖，从中分离得到大量的核酸。优选本发明第二方面的核酸，其ALS1核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，ALS3核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。具体的，本发明的DNA序列，其ALS1核苷酸序列在第+545处发生点突变，核苷酸由C突变为T，其ALS3核苷酸在第+1667处发生点突变，核苷酸由G变为T。

此外，本发明突变前的野生型甘蓝型油菜为野生型油菜品系N131，在甘蓝型油菜基因组内共存在3个具有功能的ALS基因(Genebank登录号Z11524、Z11525、Z11526)。

本发明的第三方面的内容包括表达盒、重组载体或细胞，其含有上述的第二方面的核酸。

本发明第四方面内容还包括上述的具有除草剂抗性的ALS蛋白、核酸、表达盒、重组载体或细胞在植物抗除草剂方面的应用。

其中，上述植物为油菜或拟南芥等。

本发明第五方面的内容还包括获得具有除草剂抗性的植物的方法，包括如下步骤：

1)使植物包含本发明所述的核酸；或

2)使植物表达所述的蛋白。

其中，上述的方法，包括转基因、杂交、回交或无性繁殖等步骤。

本发明第六方面的内容包括鉴定植物的方法，其中植物是包含所述的核酸的植物、表达所述的蛋白的植物或所述的方法获得的植物，具体包括以下步骤：

1)测定所述植物是否包含所述的核酸；或，

2)测定所述植物是否表达所述的蛋白。

本发明内容还包括具体地将本发明编码乙酰乳酸合酶的基因通过杂交转育到野生型油菜中，在转育的油菜和野生型油菜苗期喷施ALS抑制剂类除草剂，处理3周后，野生型油菜植株全部死亡，而转育含有本发明编码乙酰乳酸合酶的突变基因油菜植株全部存活；将编码乙酰乳酸合酶的基因转化到拟南芥中，在转基因拟南芥和野生型拟南芥苗期喷施ALS抑制剂类除草剂，处理3周后，野生型拟南芥植株全部死亡，而转基因拟南芥植株全部存活。因此，含有本发明编码乙酰乳酸合酶基因的植物具有抗ALS抑制剂类除草剂的特性。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有下列优点和效果：

1)本发明是在我国油菜中首次发现的双基因双突变位点的甘蓝型油菜高抗ALS抑制剂类除草剂乙酰乳酸合酶突变体，本发明的乙酰乳酸合酶突变体编码基因的核酸序列，可以显著提高其它对ALS抑制剂类除草剂无抗性的植物对ALS抑制剂类除草剂的耐受性；

2)在田间喷施ALS抑制剂类除草剂苯磺隆甲基二磺隆的实验结果表明，含有本发明的ALS突变蛋白的油菜DS3在3-4叶期施用16倍的杂草防治推荐使用浓度(苯磺隆为360ga.i.ha^–1、甲基二磺隆为180g a.i.ha^–1)后，植株仍然正常生长发育和结实，而野生型油菜在3-4叶期施用1倍的杂草防治推荐使用浓度(苯磺隆为22.5g a.i.ha^–1、甲基二磺隆为11.25g a.i.ha^–1)3周后表现为整株死亡。

附图说明

图1在油菜田中发现了本发明的抗ALS抑制剂类除草剂油菜突变植株DS3；

图2不同浓度的苯磺隆对野生型和突变型的ALS酶活性体外抑制；

图3不同浓度的甲基二磺隆对野生型和突变体的ALS酶活性体外抑制；

图4PCR扩增油菜ALS1基因；泳道1，DNA分子量标准，片段从小到大依次为500bp、800bp、1200bp、2000bp、3000bp、4500bp；泳道2至4为N131的DNA，泳道5至7为EM28的DNA，泳道8至10为DS3的DNA，每个样品3个重复；泳道11为对照水。

图5PCR扩增油菜ALS2基因；泳道1，DNA分子量标准，片段从小到大同图4；泳道2至4为N131的DNA，泳道5至7为EM28的DNA，泳道8至10为DS3的DNA，每个样品3个重复；泳道11为对照水；

图6PCR扩增油菜ALS3基因；泳道1，DNA分子量标准，片段从小到大同图4；泳道2至4为N131的DNA，泳道5至7为EM28的DNA，泳道8至10为DS3的DNA，每个样品3个重复；泳道11为对照水。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：高抗除草剂的甘蓝型油菜乙酰乳酸合酶突变体的创制过程

油菜播种前，对野生型油菜品系N131(公知公用，见浦惠明等，江苏农业学报，2010，26(6)：1432-1434)进行甲磺酸乙酯(EMS)诱变处理，具体处理过程如下：播种前1天，将0.5kg的N131种子装入尼龙网袋，放入盛满清水的容器中浸泡12h，将尼龙网袋挂于高处待水份基本沥干后，置于0.4％EMS溶液(v/v)中处理8h，将处理种子用流水冲洗4h后，再次将尼龙网袋挂于高处将水沥干后，立即将种子(Mo)撒播于具有隔离条件的6×50m隔离大棚内。当年春，油菜开花后用尼龙网罩隔离保纯，5月底收获成熟的M₁种子。10月初，采用集团混合法将M₁种子播种于具有隔离条件的6×50m隔离大棚内。次年春油菜开花后用尼龙网罩隔离保纯，夏收M₂代种子。秋播M₂代，待菜苗长至3-4叶期时，喷施磺酰脲类除草剂苯磺隆(2倍的杂草防治推荐使用浓度)进行抗除草剂突变体的筛选。处理3周后，田间发现有20多株菜苗存活，其余油菜均死亡。待存活菜苗生长至5-6叶期后，移至油菜育种大田，套袋自交收获得M₃种子。在光照培养室内，对M₃种子苗期进行抗性效应鉴定，发现其中编号为EM28(保藏编号：CGMCC No.14299)的株系抗性稳定，且其他性状表现与野生型N131相似。我们将该EM28植株种子于2017年06月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为CGMCCNo.14299，该菌株的分类命名为：甘蓝型油菜(Brassica napus)。遗传研究发现，EM28的抗性性状是由1个核基因控制的不完全显性性状，当EM28中的抗性基因表现纯合型时，它的抗性效应是苯磺隆除草剂杂草防治的推荐使用浓度3-4倍，因为在4倍的杂草防治推荐使用浓度处理后，EM28叶片表现出生长受到抑制症状(表1)。后续在杂交油菜品种选育中研究发现，当通过常规育种手段将EM28的抗性性状导入到CMS恢复系中，然后与不育系进行配组，选育的抗性杂交组合F₁抗性基因型表现为杂合型，其抗性效应是除草剂杂草防治推荐使用浓度1.5-2倍之间，这造成选育的抗除草剂杂交油菜品种在生产上推广应用存在较大风险，因为当农户使用除草剂进行田间杂草防治时，如果除草剂喷施浓度使用不当或喷施不均匀极易导致实际使用的除草剂浓度超出杂种F₁的抗性效应范围，造成油菜产生除草剂药害症状。因此，EM28的抗性性状在抗除草剂油菜品种选育中的应用具有一定的局限性。

为此，期望获得更高抗性效应的抗除草剂油菜种质或资源才能满足抗除草剂油菜品种选育的需求。我们扩繁了EM28种子，再次对抗性材料EM28种子进行EMS诱变并结合高浓度的除草剂筛选，田间除草剂喷施浓度为8倍的苯磺隆杂草防治推荐使用浓度，具体EMS诱变流程和筛选、鉴定过程同上。我们很幸运的发现，高浓度的苯磺隆除草剂处理3周后，编号为DS3的菜苗田间长势良好(图1)，待植株种子成熟后，收获保存。至此，我们获得了高抗除草剂的甘蓝型油菜乙酰乳酸合酶突变体DS3，我们将该甘蓝型油菜乙酰乳酸合酶突变体DS3于2017年06月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为CGMCC No.14298，该菌株的分类命名为：甘蓝型油菜(Brassica napus)。

实施例2：除草剂抗性鉴定

抗性鉴定试验分别采用田间鉴定和温室盆栽试验两种方法对抗性突变体EM28、DS3的抗性效应进行鉴定与评价。油菜田间鉴定试验在江苏省农业科学院油菜隔离繁殖区进行，温室盆栽试验在恒温培养室中进行。待处理对照材料野生型N131(公知公用，见浦惠明等，江苏农业学报，2010，26(6)：1432-1434)、本发明的EM28、DS3播种出苗生长至3-4叶苗龄，分别喷施不同浓度的SU类除草剂苯磺隆(2-[N-(4-甲氧基-6-甲基-1,3,5-三嗪-2-基)-N-甲基氨基甲酰胺基磺酰基]苯甲酸甲酯)甲基二磺隆(甲基-2[3-(4，6-＝甲氧基嘧啶-2-基)一脲基磺酰基l-4-甲磺酰基氨基苯甲酸酯)。喷药3周后，根据菜苗的生长表现确定它们的在不同用药浓度下的抗性效应，结果如表1所示。从表1可以看出，抗性材料DS3对SU类除草剂苯磺隆和甲基二磺隆抗性最强，抗性效应浓度在除草剂杂草防治的推荐使用浓度12-16倍之间，远远超过EM28对以上两种除草剂的抗性效应，EM28抗性效应浓度在除草剂杂草防治的推荐使用浓度3-4倍之间。因此，我们认为高抗材料DS3比EM28在油菜育种中更具有利用价值。

表1不同浓度的除草剂处理3个油菜后的抗性表现

表注：1X代表除草剂杂草防治的推荐使用浓度1倍，依次类推，其中苯磺隆除草剂杂草防治的推荐使用浓度1倍是22.5g a.i.ha^–1，甲基二磺隆除草剂杂草防治的推荐使用浓度1倍是11.25g a.i.ha^–1；R代表除草剂处理后油菜植株生长良好，无药害表现；R^-代表除草剂处理后油菜植株生长受到一定的抑制，但是植株不会死亡，能正常结实；S代表除草剂处理后油菜植株生长受到严重抑制，药害表现明显，最终植株死亡(以下同)。

实施例3：ALS酶活性离体测定

DS3在表型上表现对SU类除草剂具有高度抗性，所以选用这类除草剂在体外进行酶活性离体测定试验，比较DS3、EM28和原始野生型N131对除草剂的抗性差异。测定参照Singh等的方法(Singh BK,et al.,Analytical Biochemistry,1988,171:173-179)。具体的，分别取0.2g叶片样品，在研钵中用液氮研磨粉碎，将磨好的样品加入含有4.5ml的初酶提取液[100mM K₂HPO₄、0.5mM MgCl₂、0.5mM硫胺素焦磷酸(TPP)、10μM黄素腺嘌呤双核苷酸(FAD)、10mM丙酮酸钠、10％(v/v)丙三醇、1mM二硫苏糖醇、1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)、0.5％(w/v)聚乙烯基吡咯烷酮]中，于4℃、12000rpm离心20min。取上清液，加入等体积的饱和(NH₄)₂SO₄，于冰上放置30min后，4℃、12000rpm离心20min，弃上清液，加入1mL初酶提取液，振荡溶解，获得每个样品的ALS酶液。取200μL提取好的ALS酶液，分别加入360μL50mMHepes-NaOH(PH＝7.5)酶反应缓冲液、80μL 20mM TPP、80μL200μMFAD、80μL2M丙酮酸钠+200mM MgCl₂和不同浓度的苯磺隆和甲基二磺隆除草剂，混匀、放入37℃反应1h后，加入160μL 3M H₂SO₄终止反应，60℃脱羧15min。然后加入780μL5.5％α-萘酚溶液和780μL0.55％肌酸，65℃显色15min，在530nm比色，读取吸光值，根据标准曲线计算酶活性。将未加入除草剂对照的ALS酶活性分别记为100％，计算苯磺隆和甲基二磺隆除草剂对DS3、EM28和原始野生型N131的ALS酶活性的影响。

结果如图2和3所示，当把SU类除草剂苯磺隆和甲基二磺隆添加到酶促反应中，与野生型N131比较，DS3和EM28的ALS酶都表现为对除草剂具有抗性，但它们对除草剂的抗性存在显著差异，表现为随除草剂浓度增加二者下降的趋势不同。如当苯磺隆除草剂浓度为10μmol L^-1时，DS3中的ALS酶活性为对照(未用除草剂处理)的83％左右，EM28的ALS酶活性是对照的51％左右；当苯磺隆除草剂浓度为20μmol L^-1时，DS3中的ALS酶活性是对照的80％左右，此时EM28的ALS酶活性仅是对照的46％左右；当甲基二磺隆除草剂浓度达到10μmolL^-1时，DS3的ALS酶活性是对照的72％左右，而此时EM28的ALS酶活性下降到44％左右。以上结果表明，突变体DS3中的ALS酶对除草剂的敏感性显著低于EM28中ALS酶，从而赋予了DS3比EM28更高的除草剂抗性。

实施例4：ALS基因克隆

在甘蓝型油菜基因组内共存在3个具有功能的ALS基因(Genebank登录号Z11524、Z11525、Z11526)，根据这3个ALS基因序列，分别设计3对PCR引物。ALS1引物1：GTGGATCTAACTGTTCTTGA和引物2：AGAGATGAAGCTGGTGATC。ALS2引物1：GAGTGTTGCGAGAAATTGCTT和引物2：TTGATTATTCTATGCTCTCTTCTG。ALS3引物1：ATGGTTAGATGAGAGAGAGAGAG和引物2：

GGTCGCACTAAGTACTGAGAG。采用CTAB法提取叶片基因组DNA(胡茂龙等，中国油料作物学报，2011，33(4):331-337)，PCR克隆野生型与突变体ALS1、ALS2和ALS3基因。按东洋纺(上海)生物科技有限公司高保真性DNA聚合酶KOD-Plus试剂盒说明书配制50μL PCR反应体系。在MJ Research PTC-200型PCR仪上进行扩增，反应程序为94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2.5min，共35个循环。产物经平末端加A后，在1.2％(V/W)琼脂糖凝胶电泳分离后(图4、图5、图6)，用北京Tiangen公司生产的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(目录号：DP209)纯化回收，连接于克隆载体pEASY-T1(购自北京TransGen生物技术有限公司)，热激转化DH5α。通过蓝白斑筛选和菌落PCR鉴定，将阳性克隆送于南京金斯瑞生物有限公司测序。测序结果表明，突变体DS3中ALS2基因未发生任何碱基突变，但ALS1和ALS3基因都发生了点突变，其中ALS1基因的第+545处发生点突变，核苷酸由C突变为T，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，导致相应编码蛋白的第182位脯氨酸(P)突变为亮氨酸(L)，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；ALS3基因的第+1667处发生点突变，核苷酸由G变为T，核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，导致相应编码蛋白的第556位由色氨酸(W)变为亮氨酸(L)，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，即突变株DS3中在ALS1的Pro182Leu和ALS3的Trp556Leu发生双基因的氨基酸替换，比EM28多了1处位点突变(P182L)。

实施例5：乙酰乳酸合酶突变体编码基因在野生型油菜中的表达分析

应用杂交转育方法将该DS3中的乙酰乳酸合酶突变体编码基因导入其它对ALS类除草剂无抗性的野生型油菜品种或品系。过程简言之，用DS3分别与恢复系3075R(浦惠明等，2002，江苏农业科学，4：33-34)和3018R(浦惠明等，1999，江苏农业科学，6：32-33)配制杂交组合，当年收获2个F₁种子在油菜春化/培养室进行加代种植，花期选生长一致的单株套袋自交，收获F₂种子在南京江苏省农科院溧水植物科学基地播种，每个F₂群体播种20行，苗期取F₂群体单株叶片，提取DNA，PCR扩增ALS1和ALS3基因，产物按实例4步骤纯化、回收、测序。根据测序结果，筛选具有DS3中的乙酰乳酸合酶突变体编码基因的纯合型F₂单株，即该单株的ALS1序列如SEQ ID NO：2所示，ALS3的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。于油菜花期对每个入选的F₂单株套袋自交，收获F₃种子。按实施例2方法，采用田间鉴定和温室盆栽试验对F₃苗期抗性进行鉴定。结果发现，经过浓度在12X以下的苯磺隆和甲基二磺隆除草剂处理3周后，所有入选F₃菜苗生长状态良好，16X处理后的油菜生长受到一定的抑制，表现为生长受抑，但植株不会死亡，而所有对照材料全部死亡，表明携带DS3中的乙酰乳酸合酶突变体的编码基因纯合型F₃株系对两种ALS类除草剂抗性效应浓度在除草剂杂草防治的推荐使用浓度12-16倍之间(表2)。

表2不同浓度的除草剂处理入选的油菜F3株系后的抗性表现

实施例6：乙酰乳酸合酶突变体编码基因在拟南芥中的表达

采用常规的农杆菌介导法将上述DS3中两个突变酶的编码基因分别转入野生型拟南芥植株，然后通过两个转基因系杂交，在后代中选择具有DS3中两个突变酶的编码基因同时纯合的转基因拟南芥株系进行除草剂表型鉴定。过程简言之，根据ALS1和ALS3基因序列分别设计特异引物，ALS1引物3：

5'CGCGGTACCTCATCTCTCTCTCCTCTAACC 3'(下划线序列为KpnI酶识别位点，以下同)和ALS1引物4：5'CGCACTAGTGATCACCAGCTTCATCTCTC 3'(下划线序列为SpeI酶识别位点，以下同)；ALS3引物3：

5'CGCGGTACCCTCTCTCTCTCTCATCTAACCAT3'和ALS3引物4：

5'CGCACTAGTCTCTCAGTACTTAGTGCGACC3'。以突变体DS3的基因组DNA为模板，PCR扩增获得目的突变酶编码基因P182L和W556L。PCR产物按实施例4方法经回收、克隆、测序，获得带有突变酶编码基因的重组T载体。用KpnI和SpeI双酶切T载体获得含目的基因的片段回收、连接到同样经双酶切的pCAMBIA1390载体上(购自澳大利亚CAMBI公司)，得到重组的植物表达载体。将构建好的重组载体转化大肠杆菌DH5α，提取质粒用于酶切和测序检测。将检测表明正确的含有目的基因的重组载体转化农杆菌EH105α菌株，提取质粒进行PCR和酶切鉴定。培养获得的重组菌株，利用农杆菌侵染花序法(flower dipping)转化拟南芥。T0代中在培养基上经抗生素筛选后，获得T1代植株移栽到盆钵中，置于人工培养箱中生长，PCR筛选、扩繁获得每个基因的T3代的纯合转基因株系。在T3代株系花期配制杂交组合，收获2个F₁种子，PCR筛选、扩繁获得具有DS3中突变酶编码基因纯合转基因株系F₃。按实施例2方法，采用田间鉴定和温室盆栽试验对F₃苗期抗性进行鉴定。经过浓度在12X以下的苯磺隆和甲基二磺隆除草剂处理3周后，所有转基因拟南芥F₃幼苗生长状态良好，16X处理后的幼苗生长受到一定抑制，但是植株不会死亡，而所有未转基因的拟南芥(WT)幼苗全部死亡，表明携带DS3中乙酰乳酸合酶突变体的编码基因纯合型转基因拟南芥F₃家系对两种SU类除草剂抗性效应浓度在除草剂杂草防治的推荐使用浓度12-16倍之间(表3)。

表3不同浓度除草剂处理的转基因拟南芥杂交的F3株系后的抗性表现

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些均在本发明的保护范围内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 具有除草剂抗性的乙酰乳酸合酶突变蛋白及其应用

<130> SG20170623001

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1968

<212> DNA

<213> ALS1突变型基因

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1968)

<400> 1

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1 5 10 15

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Ser Ser Lys Ser Pro Leu Pro Ile Ser Arg Phe Ser Leu Pro Phe Ser

20 25 30

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Leu Thr Pro Gln Lys Asp Ser Ser Arg Leu His Arg Pro Leu Ala Ile

35 40 45

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Ser Ala Val Leu Asn Ser Pro Val Asn Val Ala Pro Pro Ser Pro Glu

50 55 60

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Gln Ala Leu Thr Arg Ser Ser Thr Ile Arg Asn Val Leu Pro Arg His

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Glu Gln Gly Gly Val Phe Ala Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ser Ser Gly

130 135 140

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Val Ser Gly Leu Ala Asp Ala Met Leu Asp Ser Val Pro Leu Val Ala

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Ile Thr Gly Gln Val Leu Arg Arg Met Ile Gly Thr Asp Ala Phe Gln

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195 200 205

ttg gtg atg gat gtt gat gac ata cct agg atc gtt caa gaa gct ttc 672

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aag gat att cag cag cag ctt gcg att cct aac tgg gat caa cct atg 768

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Gln Leu Gly Gln Ile Val Arg Leu Ile Ser Glu Ser Lys Arg Pro Val

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ttg tac gtt ggt ggt gga agc ttg aac tcg agt gaa gaa ctg ggg aga 912

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Leu Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Glu

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Glu Ile Gly Lys Asn Lys Thr Pro His Val Ser Val Cys Gly Asp Val

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<213> ALS1突变型基因

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<212> DNA

<213> ALS3突变型基因

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<221> CDS

<222> (1)..(1959)

<400> 3

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Thr Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Val Pro Lys Asp Ile

225 230 235 240

Gln Gln Gln Leu Ala Ile Pro Asn Trp Asp Gln Pro Met Arg Leu Pro

245 250 255

Gly Tyr Met Ser Arg Leu Pro Gln Pro Pro Glu Val Ser Gln Leu Gly

260 265 270

Gln Ile Val Arg Leu Ile Ser Glu Ser Lys Arg Pro Val Leu Tyr Val

275 280 285

Gly Gly Gly Ser Leu Asn Ser Ser Glu Glu Leu Gly Arg Phe Val Glu

290 295 300

Leu Thr Gly Ile Pro Val Ala Ser Thr Leu Met Gly Leu Gly Ser Tyr

305 310 315 320

Pro Cys Asn Asp Glu Leu Ser Leu Gln Met Leu Gly Met His Gly Thr

325 330 335

Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Glu His Ser Asp Leu Leu Leu Ala Phe

340 345 350

Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Glu Ala Phe Ala

355 360 365

Ser Arg Ala Lys Ile Val His Ile Asp Ile Asp Ser Ala Glu Ile Gly

370 375 380

Lys Asn Lys Thr Pro His Val Ser Val Cys Gly Asp Val Lys Leu Ala

385 390 395 400

Leu Gln Gly Met Asn Lys Val Leu Glu Asn Arg Ala Glu Glu Leu Lys

405 410 415

Leu Asp Phe Gly Val Trp Arg Ser Glu Leu Ser Glu Gln Lys Gln Lys

420 425 430

Phe Pro Leu Ser Phe Lys Thr Phe Gly Glu Ala Ile Pro Pro Gln Tyr

435 440 445

Ala Ile Gln Val Leu Asp Glu Leu Thr Gln Gly Lys Ala Ile Ile Ser

450 455 460

Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met Trp Ala Ala Gln Phe Tyr Lys Tyr

465 470 475 480

Arg Lys Pro Arg Gln Trp Leu Ser Ser Ser Gly Leu Gly Ala Met Gly

485 490 495

Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ile Gly Ala Ser Val Ala Asn Pro Asp Ala

500 505 510

Ile Val Val Asp Ile Asp Gly Asp Gly Ser Phe Ile Met Asn Val Gln

515 520 525

Glu Leu Ala Thr Ile Arg Val Glu Asn Leu Pro Val Lys Ile Leu Leu

530 535 540

Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met Val Met Gln Leu Glu Asp Arg Phe

545 550 555 560

Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr Tyr Leu Gly Asp Pro Ala Arg Glu

565 570 575

Asn Glu Ile Phe Pro Asn Met Leu Gln Phe Ala Gly Ala Cys Gly Ile

580 585 590

Pro Ala Ala Arg Val Thr Lys Lys Glu Glu Leu Arg Glu Ala Ile Gln

595 600 605

Thr Met Leu Asp Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Val Ile Cys Pro

610 615 620

His Gln Glu His Val Leu Pro Met Ile Pro Ser Gly Gly Thr Phe Lys

625 630 635 640

Asp Val Ile Thr Glu Gly Asp Gly Arg Thr Lys Tyr

645 650

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> BnALS1引物1

<400> 5

gtggatctaa ctgttcttga 20

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> BnALS1引物2

<400> 6

agagatgaag ctggtgatc 19

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> BnALS2引物1

<400> 7

gagtgttgcg agaaattgct t 21

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> BnALS2引物2

<400> 8

ttgattattc tatgctctct tctg 24

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> BnALS3引物1

<400> 9

atggttagat gagagagaga gag 23

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> BnALS3引物2

<400> 10

ggtcgcacta agtactgaga g 21

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> BnALS1引物3

<400> 11

cgcggtacct catctctctc tcctctaacc 30

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> BnALS1引物4

<400> 12

cgcactagtg atcaccagct tcatctctc 29

<210> 13

<211> 32

<212> DNA

<213> BnALS3引物3

<400> 13

cgcggtaccc tctctctctc tcatctaacc at 32

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> BnALS3引物4

<400> 14

cgcactagtc tctcagtact tagtgcgacc 30

Claims

1.ALS突变蛋白，其ALS1氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，ALS3氨基酸序列如SEQ IDNo：4所示。

2.核酸，其编码权利要求1所述的ALS突变蛋白。

3.根据权利要求2所述的核酸，其ALS1核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，ALS3核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

4.表达盒、重组载体或细胞，其含有权利要求2或3所述的核酸。

5.权利要求1所述的蛋白，权利要求2或3所述的核酸，权利要求4所述的表达盒、重组载体或细胞在植物抗除草剂方面的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物为油菜或拟南芥。

7.获得具有除草剂抗性的植物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）使植物包含权利要求2或3所述的核酸；或

2）使植物表达权利要求1所述的突变蛋白。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，其包括转基因、杂交、回交或无性繁殖等步骤。

9.鉴定抗性植物的方法，其中植物是包含权利要求2或3所述的核酸的植物、表达权利要求1所述的蛋白的植物或权利要求7~8之任一所述的方法获得的植物，其特征在于，包括以下步骤：

1) 测定所述植物是否包含权利要求2或3所述的核酸；或，

2) 测定所述植物是否表达权利要求1所述的蛋白。