CN110628750B - 一种β-1,3-1,4-葡聚糖葡萄糖水解酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种β‑1,3‑1,4‑葡聚糖葡萄糖水解酶及其应用。本发明提供的β‑1,3‑1,4‑葡聚糖葡萄糖水解酶，为如下A1)、A2)或A3)：A1)氨基酸序列是序列2的第55‑656位的蛋白质；A2)将序列表中序列2的第55‑656位的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。本发明的β‑1,3‑1,4‑葡聚糖葡萄糖水解酶可用于水解含有β‑1,3糖苷键和/或β‑1,4糖苷键的化合物，也可以用来降解纤维素，制备葡萄糖，具有广泛的应用前景。

Description

一种β-1,3-1,4-葡聚糖葡萄糖水解酶及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，一种β-1,3-1,4-葡聚糖葡萄糖水解酶及其应用。

背景技术

纤维素是地球上最丰富的生物质，由β-1,4-糖苷键连接的葡萄糖链组成，由于 纤维素链间存在大量的氢键，导致纤维素形成高度有序的晶体结构，难以被纤维素酶 降解。有效降解纤维素至少需要三类纤维素酶，包括：内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)， 该酶可以随机的水解无定形区内的纤维素单链，造成更多的末端；纤维二糖水解酶或 外切葡聚糖酶(EC 3.2.1.91和3.2.1.176)，它们可以水解结晶区的纤维素，主要从 纤维素链的还原端和非还原端释放纤维二糖；β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21),该酶可 以水解纤维二糖或纤维糊精产生葡萄糖。

纤维素降解微生物是造成纤维素自然降解的主要原因。微生物(包括细菌和真菌)使用不同的策略利用纤维素。目前纤维素降解微生物主要使用两种机制来降解纤维素。 大多数好氧微生物采用非复合纤维素酶系统，它们分泌一组可溶性细胞外纤维素酶， 其中包含纤维素酶的完整酶系，它们在细胞外进行协同而降解纤维素；而大多数厌氧 微生物采用的是复合纤维素酶系统，它们产生的大部分的纤维素酶通过自身的 dockerin结构域与宿主细胞表面的脚手架蛋白的cohesin结构域结合，进而形成一个 巨大的多酶复合体，又称为纤维素酶体(cellulosome)。

发明内容

本发明提供一种具有β-1,3-1,4-葡聚糖葡萄糖水解酶活性的蛋白质，其名称为GGH。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了GGH在水解含有β-1,3糖苷键和/或β -1,4糖苷键的化合物中的应用；GGH为如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是序列2的第55-656位的蛋白质；

A2)将序列表中序列2的第55-656位的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列2的第55-656位的 氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列

上述A2)中的GGH蛋白质，为与序列2的第55-656位所示蛋白质的氨基酸序列 具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性 为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％ 或具有99％的同一性。

上述A2)中的GGH蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达 得到。

上述A2)中的GGH蛋白质的编码基因可通过将序列1的第163-1968位所示的DNA 序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突 变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，序列1 的第163-1968位所示的DNA分子编码序列2的第55-656位所示的GGH蛋白质。

上述应用中，A3)所述融合蛋白质可为序列表中序列2所示的蛋白质。

本发明还提供了与GGH相关的生物材料在水解含有β-1,3糖苷键和/或β-1,4糖 苷键的化合物中的应用；所述生物材料为下述B1)至B5)中的任一种：

B1)编码GGH的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的细胞系、或含有B2)所述表达盒的细胞系。

上述应用中，B1)所述核酸分子可为如下b11)或b12)或b13)或b14)：

b11)序列表中序列1的第163-1968位所示的DNA分子；

b12)序列表中序列1所示的DNA分子；

b13)与b11)或b12)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码GGH 的cDNA分子或DNA分子；

b14)在严格条件下与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列杂交，且编码GGH 的cDNA分子或DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分 子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码GGH蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有 与本发明分离得到的GGH蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编 码GGH蛋白质且具有GGH蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本 发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2的第55-656位的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或 更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以 用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以 用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述应用中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、 0.5MNaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗； 还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃， 1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA 的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％ SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS 中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交， 在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为： 2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC， 0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或 0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述应用中，B2)所述的含有编码GGH蛋白质的核酸分子的表达盒(GGH基因表 达盒)，是指能够在宿主细胞中表达GGH蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动GGH基 因转录的启动子，还可包括终止GGH基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包 括增强子序列。

可用现有的表达载体构建含有所述GGH基因表达盒的重组载体。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pET-30a(+)。

B3)所述重组载体具体可为pET-GGH。所述pET-GGH为在pET-30a(+)的SacI识 别序列后插入了1的第163-1968位得到的重组载体，pET-GGH含有序列表中序列1所 示的DNA片段，能表达序列表中序列2所示的含有GGH的融合蛋白质。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为大肠杆菌， 如E.coli Transetta(DE3)。

上述应用中，所述细胞系不包括繁殖材料。

上述应用中，所述化合物可为多糖或寡糖或pNPC或pNPG。

上述应用中，所述多糖可为纤维素或β葡聚糖，所述寡糖为纤维寡糖或海带二糖。

所述纤维寡糖具体可为纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖或纤维六糖。

所述β葡聚糖可为大麦葡聚糖。

本发明还提供了葡萄糖的制备方法，所述方法包括：以含有β-1,3糖苷键和/或 β-1,4糖苷键的化合物为底物，利用GGH进行催化反应，得到葡萄糖；所述化合物中 葡萄糖与其他部分以β-1,3糖苷键和/或β-1,4糖苷键相连。

上述方法中，所述化合物含有葡萄糖残基。

上述方法中，所述催化反应可在pH为5.5-7.5的环境中进行。进一步。所述催化 反应可在pH为6-7的环境中进行，如6.5。

所述催化反应可在20-35℃下进行。进一步。所述催化反应可在25-35℃下进行，如30-35℃。

本发明还提供了GGH在作为葡聚糖葡萄糖水解酶中的应用。

本发明还提供了GGH在作为β-1,3/1,4-葡聚糖葡萄糖水解酶中的应用。

GGH或所述生物材料，也属于本发明的保护范围。

本发明的GGH具有β-1,3/1,4-葡聚糖葡萄糖水解酶活性，可用于水解含有β-1,3糖苷键和/或β-1,4糖苷键的化合物，也可以用来降解纤维素，制备葡萄糖，具有广 泛的应用前景。

附图说明

图1为pET-GGH的酶切电泳图谱。

图2为纯化的GGH重组蛋白溶液的SDS-PAGE电泳图。

图3为GGH重组蛋白水解海带二糖、龙胆二糖、槐二糖HPLC检测结果。a：龙胆 二糖(β-1,6)；b：GGH重组蛋白作用龙胆二糖后的水解产物；c：槐二糖(β-1,2)； d：GGH重组蛋白作用槐二糖后的水解产物；e：海带二糖(β-1,3)；f：GGH重组蛋白 作用海带二糖后的水解产物；g：葡萄糖标准品。

图4为GGH重组蛋白水解糖的产物的HPLC检测结果。a：糖的标准品，G1-G6分 别为葡萄糖、纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖、纤维六糖；b-g：葡萄糖、 纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖、纤维六糖分别被GGH重组蛋白水解后的 水解产物；h：GGH重组蛋白水解大麦葡聚糖的水解产物。

图5为GGH重组蛋白水解纤维五糖不同时间点的HPLC检测结果。G2-G5分别为纤 维二糖、纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖，Glucose为葡萄糖。

图6为GGH重组蛋白对p-NPC的TLC薄层层析检测结果。G1和G2分别为葡萄糖 和纤维二糖；M：标准样品，1-8分别为pNPC被GGH重组蛋白作用0、1分钟、5分钟、 30分钟、1小时、4小时、12小时和24小时的水解产物。

图7为GGH重组蛋白对葡萄糖耐受性检测结果。

图8为GGH重组蛋白最适pH检测结果。

图9为GGH重组蛋白最适温度检测结果。

图10为GGH重组蛋白pH耐受性检测结果。

图11为GGH重组蛋白温度耐受性检测结果。

图12为GGH重组蛋白温度耐受性检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊 说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明， 均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均 值。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。下述实施例中，如无特殊 说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均 为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-NPG)、和对硝基苯基纤维二糖苷(p-NPC)、 均为SIGMA公司产品，货号分别为N8700、N5759。

羧甲基纤维素(Carboxymethyl cellulose，CMC)、、微晶纤维素(Avicel)、羟乙 基纤维素(2-Hydroxyethyl cellulose)均为SIGMA公司产品，货号分别为C5678、 11356、09368。

大麦葡聚糖(barley glucan)、地衣多糖(Lichenan)、山毛榉木聚糖(beechwoodxylan)、甘露聚糖(Mannan)、木葡聚糖(Xyloglucan)、海带多糖(laminarin)均为 Megazyme公司产品，货号分别为、I-AZBGL、P-LICHN、I-AZXBE、I-AZGMA、I-AZXYG、 L8030。

酸膨胀纤维素(Acid-swollen cellulose，ASC)按照如下方法制备而成：

(1)10克微晶纤维素悬浮在85％的H₃PO₄水溶液中，1℃搅拌1小时，得到混合物。

(2)将混合物倒入4L冰冷(温度范围2-8℃)的水中，放置30min。

(3)先用预冷的水(温度范围2-8℃)洗涤步骤(2)处理后的微晶纤维素几次， 然后用1％的NaHCO₃水溶液洗涤，再用预冷的水(温度范围2-8℃)洗涤至酸碱平衡， 得到酸膨胀纤维素。

(4)将酸膨胀纤维素储存在5mM NaN₃水溶液中，1℃保存。

实施例1、GGH重组蛋白的制备

本发明提供了一种具有β-1,3-1,4-葡聚糖葡萄糖水解酶活性的蛋白质，其名称为GGH，其氨基酸序列为序列表中序列2的第55-656位，预计分子量为66.5Kda，可由 序列表中序列1的第163-1968位所示GGH基因的编码。

一、GGH基因片段的制备

人工合成序列1的第163-1968位所示的DNA分子，即GGH基因。

二、pET-GGH重组质粒的构建和鉴定

1、pET-GGH的构建

(1)以序列1的第163-1968位所示的DNA分子为模板，用引物1和引物2组成 的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物丙。

引物1：5’-CGGATCCGAATTCGAGCTCTACAGTACCCCTGTGACACTGGACG-3’；

引物2：5’-GGCCGCAAGCTTGTCGACGCGGTGCTGCCGGAGGGG-3’。

引物中有下划线的序列来自于在载体pET-30a的序列，用于同源重组。

(2)将PCR扩增得到的产物丙，电泳后进行胶回收纯化，得到纯化产物。

(3)用限制性内切酶SacI酶切质粒pET-30a(+)(Novagen公司产品)，回收载体 骨架。

(4)将步骤(2)的纯化产物和步骤(3)的载体骨架，利用重组酶ExnaseⅡ(VazymeBiotech公司产品)进行重组，将最终得到的序列正确的重组质粒命名为pET-GGH。

2、重组质粒的鉴定

将提取pET-GGH的重组质粒用NdeⅠ和XhoⅠ进行双酶切，酶切电泳图谱如图1 所示。

图1中，泳道M为DNA分子量标准(片段大小从大到小依次为：10.0kb，8.0kb，6.0kb，5.0kb，4.0kb，3.5kb，3.0kb,2.5kb,2.0kb,1.5kb，1kb，0.75kb， 0.5kb)；泳道1为pET-GGH用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后的酶切产物，其中标号为1的 条带为大小为5.2kb左右的条带，该条带是载体骨架，标号为2的条带为大小为2.0 kb左右的条带，该条带含有GGH基因与部分载体序列。

pET-GGH中，起始密码子和终止密码子由pET-30a(+)提供，表达的融合蛋白质的氨基端有一个由表达载体pET-30a(+)提供的His标签(6×His Tag)。具体的，pET-GGH 为在pET-30a(+)的SacI识别序列后插入了GGH基因序列得到的重组载体，pET-GGH 含有序列表中序列1所示的DNA片段，能表达序列表中序列2所示的含有GGH的融合 蛋白质。

其中，序列1的第1-162位和第1969-2031位为pET-30a(+)上的DNA序列，序列 1所示的DNA片段表达序列2所示的蛋白质(即GGH与载体上DNA序列编码多肽的融 合蛋白质，记为GGH重组蛋白,预计大小为74.6kDa(GGH重组蛋白为66.5kDa加上 载体序列编码的8.1kDa的氨基酸序列))，序列2的第1-54位和第657-676位为 pET-30a(+)上的DNA序列编码的氨基酸序列。

三、重组蛋白的表达和纯化

1、制备重组菌

将步骤二得到的重组质粒pET-GGH导入E.coli Transetta(DE3)(TransGenBiotech公司)中，得到重组菌Transetta(DE3)/pET-GGH。

2、重组蛋白的表达

培养重组菌Transetta(DE3)/pET-GGH并诱导重组蛋白表达，得到具有表达产物GGH重组蛋白的菌液，并制备粗蛋白液。

具体步骤如下：

(1)重组菌的培养和诱导表达

将重组菌Transetta(DE3)/pET-GGH接种到10ml含有25μg/ml卡那霉素的LB培 养基中，37℃、200rpm培养过夜；取2ml过夜培养物接种到200ml含有25μg/ml卡 那霉素的LB培养基中，37℃、200rpm培养至OD₆₀₀为0.6时，加入IPTG至终浓度为 1mM，16℃下继续培养20个小时，8000rpm离心收集菌体。

(2)制备粗蛋白液

向步骤(1)收集的菌体中加入30ml咪唑浓度为10mM的裂解缓冲液(50mM NaH₂PO₄,300mM NaCl,10mM咪唑，pH8.0，余量为水)中，重悬菌体，置冰上30分钟。用超 声波破碎细胞，300w作用30min，每次作用时间5s，每次作用间隔5s。8000rpm离心 15分钟，收集上清即为GGH重组蛋白粗蛋白液。

3、重组蛋白的纯化及纯度检测

将步骤2得到的GGH重组蛋白粗蛋白液用Clontech公司的TALON Metal AffinityResins试剂盒(方法参照试剂盒说明书)进行纯化，得到GGH重组蛋白溶液。纯化步骤 如下：

(1)将试剂盒中TALON树脂完全悬浮，快速吸取2ml的树脂到一个约10ml的吸 附柱中，让吸附柱中的液体自然流尽。

(2)在吸附柱中加一个柱体积的去离子水，让吸附柱中的液体自然流尽。

(3)重复步骤(2)。

(4)在吸附柱中加一个柱体积的咪唑浓度为10mM的裂解缓冲液，让吸附柱中的 液体自然流尽。

(5)取一个灭好菌50ml的离心管，将GGH重组蛋白粗蛋白液和步骤(4)中处理 好的树脂混合于离心管中，在室温置于脱色摇床上80rpm摇动30分钟，使GGH重组蛋 白和树脂充分结合，将混合液倒回吸附柱中，让吸附柱中的液体自然流尽。

(6)加入2个柱体积咪唑浓度为20mM的洗涤缓冲液(50mM NaH₂PO₄,300mM NaCl,20mM咪唑，pH8.0，余量为水)到吸附柱中，让液体自然流尽。

(7)重复步骤(6)

(8)依次向吸附柱中加入咪唑浓度分别为40mM、60mM、80mM、100mM、150 mM、250mM的洗涤缓冲液(50mM NaH₂PO₄,300mM NaCl,咪唑浓度分别为40mM、60mM、 80mM、100mM、150mM、250mM，pH8.0，余量为水)各2mL,每次加入1mL，让液 体自然流下，分别收集各流出液。

(9)向吸附柱中加6ml咪唑浓度为250mM的洗脱液(50mM NaH₂PO₄,300mM NaCl,250mM咪唑，pH8.0，余量为水)到吸附柱中，每次加入1mL，分管(1ml/管)收集 流出液。

注：步骤(8)和(9)收集的流出液中均含有目的蛋白GGH重组蛋白，可选取较 纯的流出液(步骤(8)或(9)收集的流出液)作为纯化的GGH重组蛋白溶液进行后 续实验。

将纯化的GGH重组蛋白溶液进行SDS-PAGE电泳，检测其纯度，电泳图如图2所示。

图2中，泳道M为蛋白质分子量标准(marker)；2为TALON树脂纯化的GGH重组 蛋白溶液。

图2表明，经TALON树脂纯化后GGH重组蛋白已达到SDS-PAGE单条带纯(如箭 头所示)，与预计大小74.6kDa比较一致。

将纯化的GGH重组蛋白溶液用截流为3kDa的超滤管(MILLIPORE公司)置换缓 冲液，使GGH重组蛋白处于pH 6.5的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液中，置换缓冲液后浓缩蛋 白溶液，使蛋白浓度为1.0μg/μL，将浓缩后的蛋白溶液记为酶液，用所得酶液进行 后续实验。

实施例2、GGH的底物特异性检测

一、底物

p-NPG、p-NPC；大麦葡聚糖、羧甲基纤维素、微晶纤维素、地衣多糖、酸膨胀纤 维素、甘露聚糖、木葡聚糖、山毛榉木聚糖、海带多糖、羟乙基纤维素；滤纸。

二、GGH重组蛋白对不同底物的酶活测定

1、测定GGH重组蛋白对p-NPC和p-NPG的酶活

(1)用水溶解p-NPG和p-NPC，分别得到p-NPG浓度为25mM的p-NPG溶液和p-NPC 浓度为的25mM p-NPC溶液。

(2)用移液枪吸取116μL实验所需的pH 6.5的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液至EP管 中，然后加入14μL的p-NPC溶液，混匀后放到30℃的水浴锅中进行预热，设置两组， 一组为实验组，一组为对照组。

(3)向实验组的EP管内加入实施例1的10μL(1μg/μl)的酶液，向对照组的 EP管内加入10μL灭活的酶液，30℃的水浴锅中进行反应，反应10分钟。期间不断 摇晃离心管架，使酶液和底物充分混合。

(4)反应结束后，每组快速加入70μL的0.4M Na₂CO₃水溶液，终止反应。

(5)用移液枪吸取各组的反应溶液，分别加入到96孔酶标板中，测定其OD₄₁₀。

按照步骤(2)-(5)的方法，将p-NPG溶液替换为p-NPC溶液，其他步骤均不变， 测定以p-NPC为底物的反应溶液的OD₄₁₀。

pNP标准曲线的制备：

(1)用pH 6.5的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液配制10mM的p-NP标准溶液。

(2)按下表将各试剂加入EP管中，吹打混匀，制成不同浓度的p-NP溶液，缓冲 液是指pH 6.5的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液。

EP管编号	0	1	2	3	4	5	6	7
									p-NP标准溶液μL)	0	10	20	30	40	50	60	70
缓冲液(μL)	1000	990	980	970	960	950	940	930
									p-NP浓度(mM)	0	0.1	0.2	0.3	0.4	0.5	0.6	0.7

(3)分别吸取140μL不同EP管中的溶液于新的EP管中，再分别加入70μL的0.4MNa₂CO₃溶液，吹打混匀，避免出现气泡，每组三个平行。

(4)吸取上述步骤(3)EP管中得到的溶液200μL到酶标板里，测量波长410nm 处的吸光值，并绘制得到pNP标准曲线。

2、测定GGH重组蛋白对多糖的酶活

待测多糖有：大麦葡聚糖、羧甲基纤维素、微晶纤维素、地衣多糖、酸膨胀纤维 素、甘露聚糖、木葡聚糖、山毛榉木聚糖、海带多糖、羟乙基纤维素。

(1)每种待测多糖均按照如下方法制备底物溶液：将待测多糖溶解在pH 6.5的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液中，得到多糖质量百分比浓度为1％的底物溶液。

(2)吸取200μL底物溶液加入离心管中作为反应底物，在水浴锅(30℃)中预 热五分钟，每种待测多糖均设置实验组和对照组。

(3)向实验组的离心管中加入适当实施例1的酶液，向对照组的离心管中加入等体积灭活的酶液，30℃的水浴锅中进行反应，作用相应时间后分别加入1mL的DNS 终止反应，然后分别加入去离子水补足500μL体积，煮沸显色5到10分钟，放入冰 水中冷却。

作用时间分别为大麦葡聚糖、羧甲基纤维素：3h；微晶纤维素、地衣多糖、酸膨 胀纤维素、甘露聚糖、木葡聚糖、山毛榉木聚糖、海带多糖、羟乙基纤维素：12h。酶 液用量分别为：大麦葡聚糖、羧甲基纤维素：30μl；微晶纤维素、地衣多糖、酸膨胀 纤维素、甘露聚糖、木葡聚糖、山毛榉木聚糖、海带多糖、羟乙基纤维素：50μl。

(4)步骤(3)完成后，实验组和对照组各吸取200μL作为待测溶液，测定OD₅₄₀。

葡萄糖标准曲线的制备：

(1)将少许分析葡萄糖放到烘箱里烘至恒重。

(2)称取0.1g烘至恒重的葡萄糖，加入少量去离子水使其溶解后，将溶液转移到100mL的容量瓶中，去离子水定容至100mL，得到葡萄糖标准液，葡萄糖标准液的浓度 为10mg/mL。

(3)按照下述表格将各试剂加到离心管中，每组三个平行，沸水浴10分钟，冷却 至室温后吸取200μL溶液到96孔酶标板中，测定波长540m处的吸光值，并绘制得到 葡萄糖标准曲线。其中，缓冲液是指pH 6.5的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液。

EP管编号	0	1	2	3	4	5	6	7
									葡萄糖标准液(μL)	0	100	200	300	400	500	600	700
缓冲液(μL)	1000	900	800	700	600	500	400	300
									DNS(μL)	2000	2000	2000	2000	2000	2000	2000	2000

3、测定GGH重组蛋白对滤纸的酶活

(1)将折好的1×6cm大小的滤纸条放入10mL离心管中，吸取1mL的pH 6.5 的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液加入试管中，浸湿滤纸条，盖盖子，置于一定温度的水浴锅 (30℃)中预热5min,设置两组，一组为实验组，一组为对照组。

(2)向实验组中加入实施例1的酶液500μL，向对照组中加入灭活的酶液，30℃ 的水浴锅中进行反应，反应12h，期间间断摇晃离心管，使酶液和底物充分混合起反 应。反应结束后加入3mL DNS终止反应，在离心管盖子上扎孔后，放入沸水中煮沸 10min。

(3)步骤(2)完成后，实验组和对照组各吸取200μL作为待测溶液，测其OD₅₄₀。

三、根据葡萄糖和pNP标准曲线计算反应产生的葡萄糖和pNP浓度以及酶活力

对多糖和滤纸的一个酶活力单位定义为：一定条件(pH 6.5，30℃)下，1min 内催化水解生成1μmol葡萄糖所需的酶量，即1U。

对pNPC及pNPG的一个酶活力单位定义为：一定条件(pH 6.5，30℃)下，1min 内催化水解生成1μmol pNP所需的酶量，即1U。

表1、GGH重组蛋白对不同底物特异性分析

底物	比活力(μmol产物/min/μmolGGH)
		羧甲基纤维素	0.278±0.083
地衣多糖	0.851±0.013
		酸膨胀纤维素	0
大麦葡聚糖	5.348±0.253
		山毛榉木聚糖	0
微晶纤维素	0.284±0.356
		甘露聚糖	0.100±0.077
羟乙基纤维素	0.089±0.005
		海带多糖	0.156±0.010
木葡聚糖	0
		滤纸	0.005±0.005
对硝基苯基纤维二糖苷	19.080±0.301
		对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷	21.141±0.287

表1结果显示，在各种多糖底物当中，GGH重组蛋白对大麦葡聚糖具有最高活性，对其他多糖如羧甲基纤维素、地衣多糖、微晶纤维素、甘露聚糖、羟乙基纤维素、海 带多糖以及滤纸的酶活性相对较低，没有表现出对酸膨胀纤维素、山毛榉木聚糖和木 葡聚糖的酶活性。GGH重组蛋白对人工底物p-NPC和p-NPG具有相当高的酶活性。GGH 重组蛋白对p-NPG具有活性显示了该酶具有β-葡萄糖苷酶活性，但是它又可以水解长 链的多糖如大麦葡聚糖，说明它也属于葡聚糖葡萄糖水解酶。

实施例3、GGH对二糖水解情况的HPLC分析

待测二糖为海带二糖(阿拉丁，L130922)、龙胆二糖(阿拉丁，G120980)、槐二 糖(EXTRASYNTHESE，4278)。

检测步骤如下：

(1)称取适量的待测二糖，加入pH 6.5的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液，配制成1％ 的二糖溶液，在磁力搅拌器上搅拌均匀。

(2)取配置好的1％的二糖溶液30μL与实施例1的酶液(GGH重组蛋白的添加 量为10μg)充分混匀，30℃水浴作用12h，煮沸5分钟终止反应，离心，取上清液进 行HPLC检测水解产物，根据标准品——葡萄糖、海带二糖、龙胆二糖、槐二糖的保留 时间确定水解产物组分。

(3)水解产物的HPLC检测是通过Waters高效液相色谱(high performance liquidchromatography，HPLC)来进行分析的。高效液相色谱系统的配置是Waters e2659Separations Module，2414RI Detector，使用的分离柱是Hypersil NH2(大连依利 特公司产，4.6mm×250mm)，流动相为CH₃CN:H₂O(体积比为73:27)，即73％(v/v) 的乙腈，流速为1.0mL/min，柱温设置为30℃，检测器温度设置为45±5℃，样品 进样量为20μL。)

结果如图3所示，GGH重组蛋白不能将由β-1,2键连接的槐二糖和由β-1,6键 连接的龙胆二糖水解成葡萄糖，但是能将含有β-1,3键的海带二糖水解成少量的葡萄 糖，说明GGH重组蛋白不能水解β-1,2键和β-1,6键，但是对β-1,3键有微弱的水 解作用。

实施例4、GGH对纤维寡糖和大麦葡聚糖的水解产物的HPLC分析

待测糖为纤维二糖、纤维寡糖-纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖、纤维六糖、大 麦葡聚糖。利用葡萄糖作为对照。

检测步骤如下：

(1)用pH 6.5的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液溶解待测糖，配制1％(质量百分比)待 测糖溶液。

(2)取配置好的30μL待测糖溶液与实施例1的酶液(GGH重组蛋白的添加量为 10μg)于1.5mLEP管中混匀，在30℃水浴锅中过夜反应12h进行水解，沸水煮5min 后快速离心，取上清液进行HPLC检测水解产物，根据标准品——葡萄糖、纤维二糖、 纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖、纤维六糖的保留时间确定水解产物组分。

(3)水解产物的HPLC检测是通过Waters高效液相色谱(high performance liquidchromatography，HPLC)来进行分析的。高效液相色谱系统的配置是Waters e2659Separations Module，2414RI Detector，使用的分离柱是Hypersil NH2(大连依利 特公司产，4.6mm×250mm)，流动相为CH₃CN:H₂O(体积比为73:27)，即73％(v/v) 的乙腈，流速为1.0mL/min，柱温设置为30℃，检测器温度设置为45±5℃，样品 进样量为20μL。

结果如图4所示，GGH重组蛋白能把纤维二糖和纤维五糖完全降解成葡萄糖，把 纤维三糖、纤维四糖和纤维六糖分别降解成葡萄糖和极少量的纤维二糖。GGH重组蛋 白和葡萄糖混合过夜，未见有更高聚合度的寡糖产生，说明其不具有转糖基作用。GGH 重组蛋白水解多糖大麦葡聚糖的水解产物也是葡萄糖。以上结果说明GGH重组蛋白可 以将纤维二糖、纤维寡糖和长链多糖降解成葡萄糖。

实施例5、GGH水解纤维五糖不同时间梯度的HPLC分析

以纤维五糖作为待测糖，按照实施例4中(1)-(3)的方法，通过HPLC分析GGH 重组蛋白水解纤维五糖不同时间的水解产物，水解时间分别为0s,10s,20s,40s, 1min,2min,5min,30min,1h,2h,4h,12h,24h,48h,72h。

结果见图5，在0至40s内，GGH重组蛋白将纤维五糖降解为葡萄糖和纤维四糖， 此时，没有产生纤维三糖；随着纤维四糖量的增加，到1分钟时产生纤维三糖，此时 间点还没有纤维二糖产生；随着纤维三糖量的增加，纤维二糖开始产生。这些结果表 明GGH重组蛋白以非连续水解的方式每次水解1个葡萄糖。

实施例6、GGH水解p-NPC不同时间梯度的TLC检测结果

通过TLC方法检测GGH水解的pNPC方式，并使用pNPC作为底物。

检测步骤如下：

(1)利用pH 6.5的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液溶解pNPC得到pNPC浓度为25mM的 pNPC溶液。

(2)在116μl的pH 6.5的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液中，加入14μl步骤(1)的浓 度为25mM的pNPC溶液，再加入实施例1的酶液(GGH重组蛋白的添加量为3μg)，35℃ 下进行反应，反应时间设置0分钟、1分钟、5分钟、30分钟、1小时、4小时、12 小时和24小时，反应结束后沸水浴5分钟终止反应。

(3)将硅胶板(青岛海洋化工有限公司)置于100℃的烘箱中活化30分钟，然 后取出点样：将(2)中所得不同反应时间的样品逐个点在活化的硅胶板上，并置于装 有展层剂(各物质的体积比为正丁醇：乙醇：水＝5：3：2)的层析缸中展层3小时。

(4)层析结束后，将硅胶板自然风干，用显色剂(浓硫酸：乙醇＝1：9)均匀喷 于板上，然后置于100℃的烘箱中5分钟显色，观察结果。

从图6结果中可以看出，GGH重组蛋白首先将pNPC水解为pNPG和葡萄糖，到30 分钟，pNPC完全水解为pNPG和葡萄糖，该过程无纤维二糖产生，随时间延长只是将 少量pNPG水解成葡萄糖。这说明GGH重组蛋白是从pNPC的非还原端水解葡萄糖。

实施例7、GGH对葡萄糖的耐受性检测

检测葡萄糖耐受性的反应底物p-NPG，测试GGH重组蛋白在不同的葡萄糖浓度下的酶活。

反应体系为：含不同葡萄糖浓度的116μl葡萄糖溶液、14μl的10mM的p-NPG溶 液、10μl实施例1的酶液(1μg/μl)。反应在35℃下进行，反应为时间15min，反应 体系中葡萄糖的浓度分别为0、1、5、10、15、20、40、60、80、100和120mM，每种 体系一种葡萄糖浓度。其中，葡萄糖溶液由将葡萄糖溶解在pH 6.5的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液中得到，p-NPG溶液由将p-NPG溶解在pH 6.5的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液中得到。

反应结束后测定反应体系的OD₄₁₀，将反应体系中不加葡萄糖底物时GGH重组蛋白的酶活作为100％，其他的不同浓度葡萄糖下的酶活换算成相对百分比，得到各反应体 系中GGH重组蛋白的相对酶活力。

以反应体系中葡萄糖浓度为横坐标，不同葡萄糖浓度下GGH重组蛋白的相对酶活力作为纵坐标作图(如图7所示)。

结果表明，随着葡萄糖添加浓度的增加，GGH重组蛋白的活性逐渐降低。当添加 的葡萄糖浓度达到15mM时，GGH重组蛋白的相对酶活为75％。

实施例8、GGH最适温度、最适pH特性

一、样品

实施例1的酶液。

二、GGH最适pH的检测

以不同pH的缓冲液配置的p-NPC为底物的反应体系测定GGH重组蛋白的最适pH，反应温度为30℃。

缓冲液选取的pH值为4.0～8.0，以每0.5个单位进行依次递增，选取了不同的 缓冲液组分来配制相关的pH缓冲液。其中pH为4.0～6.5的缓冲液为柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液，pH为6.5～7.5的缓冲液为Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液，pH为7.5～8.0的缓冲 液为0.1M的Tris-HCl缓冲液。

测定所用的反应体系为：缓冲液116μl,14μl的25mM的pNPC溶液,10μl待测酶液 (1μg/μl)。

pNPC溶液通过利用相应的缓冲液溶解得到，待测酶液利用截流为3kDa的超滤管(MILLIPORE公司)将实施例1的酶液中的液体置换为相应的缓冲液得到。

各反应体系配制好后于30℃水浴锅中反应15分钟，然后向反应体系中加入70μL0.4M Na₂CO₃水溶液终止反应，用移液枪吸取200μL的反应溶液，分别加入到96孔酶 标板中，测定其OD₄₁₀。

将选取的pH值中最高的酶活力定为100％，其他的pH值下的酶活分别换算成最 高酶活的相对百分比，即相对酶活力。以pH为横坐标，不同pH下的相对酶活力作为 纵坐标作图(如图8所示)。

结果显示，GGH重组蛋白的最适pH为6.5。

三、GGH最适温度的检测

反应体系为：pH 6.5的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液116μl,14μl的25mM的pNPC溶 液,10μl实施例1的酶液(1μg/μl)。其中，pNPC溶液通过将pNPC溶解在pH 6.5的 Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液中得到。

反应温度选取的范围为10℃～50℃，以每5℃作为一个单位依次递增。

将配制好的反应体系分别在相应的温度下反应15分钟，然后向反应体系中加入70μL 0.4M Na₂CO₃水溶液终止反应，用移液枪吸取200μL的反应溶液，分别加入到 96孔酶标板中，测定其OD₄₁₀。

将选取的温度范围中最高的酶活力定为100％，其他温度下的酶活分别换算成最高酶活的相对百分比，即相对酶活力。以温度为横坐标，不同温度下的相对酶活力作 为纵坐标作图(如图9所示)。

结论是GGH重组蛋白的最适温度为35℃。

实施例9、GGH温度耐受性、pH耐受性研究

用实施例1的酶液进行如下实验。

一、pH耐受性的研究

缓冲液选取的pH值为3.0～10，以每0.5个单位进行依次递增，选取了不同的缓 冲液组分来配制相关的pH缓冲液。其中pH为3.0～6.5的缓冲液为柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液，pH为6.5～7.5的缓冲液为Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液，pH为7.5～9.0的缓冲 液为0.1M的Tris-HCl缓冲液，pH为8.5～10的缓冲液为0.1M的甘氨酸-NaOH缓冲 液。

将实施例1的酶液浓缩至浓度为10μg/μl后，按照酶液与缓冲液的体积比为1:9 混合，混合后放置4℃冰箱保存24小时，然后各取10μl用作待测酶液，获得不同pH 环境中存放24小时的待测酶液。

配制如下反应体系：pH 6.5的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液116μl,14μl的25mM的pNPC溶液,10μl待测酶液(1μg/μl)。其中，pNPC溶液通过将pNPC溶解在pH 6.5的 Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液中得到。每种pH下存放的酶液一个反应体系。

将各反应体系在35℃下中反应15分钟，然后向反应体系中加入70μL 0.4M Na₂CO₃水溶液终止反应，用移液枪吸取200μL的反应溶液，分别加入到96孔酶标板中，测 定其OD₄₁₀。

将选取的pH值中最高的酶活力定为100％，其他的pH值下的酶活分别换算成最 高酶活的相对百分比，即相对酶活力。以pH为横坐标，不同pH保存条件下的相对酶 活力作为纵坐标作图(如图10所示)。

结论是GGH重组蛋白在pH 5.0～9.0之间具有较好的稳定性。

二、温度耐受性的研究

方法1：将实施例1的GGH酶液(1μg/μl)分别放在不同温度下的水浴锅里1h 进行孵育，温度范围为10℃～60℃(每隔5℃取值)，孵育1h后得到不同温度处理 的待测酶液。将未经温度处理的GGH酶液于4℃存放1h，得到对照酶液，作为对照。

配制如下反应体系：pH 6.5的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液116μl,14μl的25mM的pNPC溶液,10μl待测酶液或对照酶液。其中，pNPC溶液通过将pNPC溶解在pH 6.5的 Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液中得到。每种温度下存放的酶液一个反应体系。

将各反应体系在35℃下中反应15分钟，然后向反应体系中加入70μL 0.4M Na₂CO₃水溶液终止反应，用移液枪吸取200μL的反应溶液，分别加入到96孔酶标板中，测 定其OD₄₁₀。

将对照酶液酶活力定为100％，其他的温度下的酶活分别换算成其相对百分比，即相对酶活力。以温度为横坐标，不同温度保存条件下的相对酶活力作为纵坐标作图 (如图11所示)。

结论是GGH重组蛋白在保存温度30℃以下时，均保持80％以上的酶活力，在35℃放置1小时，酶活力迅速下降至20％以下，温度大于40℃时已经完全失活。

方法2：将实施例1的酶液分别于30℃、35℃和40℃的水浴锅中进行孵育，每隔30min从三个温度的水浴锅里取出酶液，作为待测酶液，检测酶活。

按照方法1的反应体系与方法测定酶活，将所得酶活中的最高酶活力定为100％，其他酶活分别换算成其相对百分比，即相对酶活力。以孵育时间为横坐标，相对酶活 力作为纵坐标作图(如图12所示)。

从图中可知，GGH重组蛋白在30℃的水浴条件下处理3h，仍然有80％以上的酶活力；在35℃的水浴条件下处理30分钟，就已经丧失了60％的酶活力；在40℃的水浴 条件下，其酶活力稳定性最差，水浴30分钟后酶活力几乎为零。由此可知GGH重组蛋 白在30℃及30℃以下的酶活力最稳定，超过30℃之后，酶活力稳定性下降，说明此 酶不耐高温。

本实施例实验结果表明GGH重组蛋白在pH 5.0～9.0之间具有较好的稳定性；GGH重组蛋白在30℃及30℃以下的酶活力最稳定，超过30℃之后，酶活力稳定性下降， 说明此酶不耐高温。

实施例10、不同金属离子、螯合剂、化学试剂对GGH酶活力的影响

利用pH 6.5的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液作为溶剂，表2中各化学试剂分别作为溶质，配制得到各化学试剂溶液，所得各溶液中表1中各化学试剂的浓度均为100mM。

配制如下反应体系：pH 6.5的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液109μl,7μl化学试剂溶液，14μl的25mM的pNPC溶液,10μl实施例1的酶液。其中，pNPC溶液通过将pNPC溶解 在pH 6.5的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液中得到。每种反应体系中含有一种表2中的化学 试剂。

配制如下对照体系：pH 6.5的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液116μl,14μl的25mM的pNPC溶液,10μl实施例1的酶液。

将各反应体系在35℃下中反应15分钟，然后向反应体系中加入70μL 0.4M Na₂CO₃水溶液终止反应，用移液枪吸取200μL的反应溶液，分别加入到96孔酶标板中，测 定其OD₄₁₀。

将对照体系中GGH重组蛋白的酶活力定为100％，其他体系中GGH重组蛋白的酶 活力分别换算成其相对百分比，即相对酶活力(如表2所示)。

表2、不同的金属离子、螯合剂及表面活性剂处理后GGH重组蛋白的相对酶活力

化学试剂	相对酶活力(％)
		对照	100
CoCl<sub>2</sub>	98.27±1.54
		HgCl<sub>2</sub>	0
AlCl<sub>3</sub>	89.39±5.44
		PbCl<sub>2</sub>	96.16±3.31
NiCl<sub>2</sub>	94.50±1.41
		FeCl<sub>3</sub>	95.76±2.01
AgNO<sub>3</sub>	5.82±0.35
		CrCl<sub>3</sub>	97.61±4.61
MgCl<sub>2</sub>	103.27±0.91
		RbCl	105.38±0.64
KCl	102.34±4.16
		NaCl	100.17±2.15
ZnCl<sub>2</sub>	88.84±5.02
		CsCl<sub>2</sub>	102.01±1.42
LiCl	106.07±4.34
		CaCl<sub>2</sub>	89.26±0.56
FeCl<sub>2</sub>	67.02±0.28
		MnCl<sub>2</sub>	99.69±1.2
EDTA-Na<sub>2</sub>	102.30±2.54
		Triton-X-100	81.72±5.09
CuCl<sub>2</sub>	19.90±2.77
		SDS	8.13±0.76

结果表明，Cu²⁺(相对酶活力为19.90％)、SDS(相对酶活力为8.13％)Ag⁺(相对 酶活力为5.82％)对GGH重组蛋白的酶活力具有较强的抑制作用，Hg²⁺可以使GGH重 组蛋白完全失活，没有明显能促进GGH重组蛋白的酶活性的金属离子。

综上所述，GGH重组蛋白能将纤维二糖、纤维寡糖水解成葡萄糖，说明它是β-葡 萄糖苷酶或葡聚糖葡萄糖水解酶，但由于GGH重组蛋白还能降解长链多糖如大麦葡聚 糖，而β-葡萄糖苷酶一般只能水解二糖或纤维寡糖，不能水解长链多糖，再加上β- 葡萄糖苷酶一般对纤维寡糖的催化效率随着寡糖聚合度的增加而降低，而葡聚糖葡萄 糖水解酶的表现刚好相反，所以GGH重组蛋白应该是葡聚糖葡萄糖水解酶。GGH重组 蛋白的底物如大麦葡聚糖含有β-1,3/1,4糖苷键，海带多糖含有β-1,3/1,6糖苷键， 海带二糖的键β-1,3糖苷键，所以可以将GGH重组蛋白定义为β-1,3/1,4-葡聚糖葡 萄糖水解酶。

<110> 广西大学

<120> 一种β-1,3-1,4-葡聚糖葡萄糖水解酶及其应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2031

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

atgcaccatc atcatcatca ttcttctggt ctggtgccac gcggttctgg tatgaaagaa 60

accgctgctg ctaaattcga acgccagcac atggacagcc cagatctggg taccgacgac 120

gacgacaagg ccatggctga tatcggatcc gaattcgagc tctacagtac ccctgtgaca 180

ctggacgatg tgaccgtggg tgaccctatt gcaaacgttc cggccacccc gggtaatatt 240

gttctgaacc aagtgggtta cgaactgaca ggcgctaaaa aagcaattta tacccacaca 300

agcaacacac tgagcgccac aaccttcgac attctgaccg ccagcaacgc cgttgtgtat 360

acaggcacca tcgtgagcaa aggcgccgtt accggctgga ccaacaaata tttttgggaa 420

ctgaacttta gcgattttca gaccccgggc acatataaaa tccgcgtggg caccaaagtt 480

tcttacgcat tcgatatcgc ccagaacgtg ctgttcaaca agaccgcctt cagtgttgtg 540

gacttcttta aaggtatgcg tagcaccaac aacgcagaca agacactgag cttcaacggc 600

ccgcgtaatg accaggttaa tgtttacggt ggctggatcg atgccacagg tgatccgggt 660

aagcacatga gccacctgag ctacgcaaat tactttaatc ctcagcaaat tccgtttgtt 720

gtgtggagct tactgaaaag ctacgaaatc agccaggcaa gctttaccgc caagagtacc 780

gatttactga atgaaagtaa gtggggcgca gactatctgc tgcgtaacat tgataagcag 840

cagaactatt tatatttagc catttttgac aactggggca atagcccggg tagccgcgaa 900

atctgtgaat ggggtcaggc aggcgcaggt aatgacggtg cacgcacccc gaattttcag 960

gcaggcatgc gcgagggtgc cggcatggca attgcagcct tagcccgtgc ctaccgcatg 1020

aacctgaatg gcgatagtac caaagcccaa tacctgaacg gcgccattcg cttatatacc 1080

aacctgaagg ccccgggcac cggctatgcc acaaagaatc tggagtactg caatgaccat 1140

accgaaaaca tcattgattt ctattgtggc ttactggcca caatcgagct gtataaggcc 1200

accaacaatg ccgcctatct ggcagacgca agtgtttatg cagacaagtt aatcggcatg 1260

ttagatccgc aaggctggtt tcgtagtgac gtggccggca cacgtccgtt ttatcacgca 1320

gcagacgaag gtctgcctct ggttagcctg atggagtaca tggatgttga cgttagtaaa 1380

aacgcagcca ttacacaggt gctgagcaag aatattgcat ggtatatgag tattagcaag 1440

gaagtgaaca atccgtttaa ttacatgcgc gagtactata aaccgtatgt taatggcagc 1500

ctgggtaccg ccaagaaagc cttttttgtg cctcacgata atgaaaccgg ttattggtgg 1560

cagggcgaaa atgcccgcct ggccagcatg agcaccgcac tgctgctggc agcacgcaag 1620

ctgaacgccc aatttaccat cggtaccgat agcatcagca catttggtct ggcccagctg 1680

gattggatcc tgggtaagaa tccgtttgat gtgtgtatga tgaccggcgc aggcacaaca 1740

acctatcaga actacccggt ggccagtgca attccgaatg tgaagggcgg catctgcaat 1800

ggtatcacag gtaaagatac agaggaaacc aatattgact ggaaaccgta cgccagcgat 1860

gactggcaaa actggcgctg gatcgaacag tggctgccgc atgacgcctg gttcctgctg 1920

gccgttagca gcttagacgt tgccaacaca ccccctccgg cagcaccgcg tcgacaagct 1980

tgcggccgca ctcgagcacc accaccacca ccactgagat ccggctgcta a 2031

<210> 2

<211> 676

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser

1 5 10 15

Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp

20 25 30

Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met Ala Asp Ile

35 40 45

Gly Ser Glu Phe Glu Leu Tyr Ser Thr Pro Val Thr Leu Asp Asp Val

50 55 60

Thr Val Gly Asp Pro Ile Ala Asn Val Pro Ala Thr Pro Gly Asn Ile

65 70 75 80

Val Leu Asn Gln Val Gly Tyr Glu Leu Thr Gly Ala Lys Lys Ala Ile

85 90 95

Tyr Thr His Thr Ser Asn Thr Leu Ser Ala Thr Thr Phe Asp Ile Leu

100 105 110

Thr Ala Ser Asn Ala Val Val Tyr Thr Gly Thr Ile Val Ser Lys Gly

115 120 125

Ala Val Thr Gly Trp Thr Asn Lys Tyr Phe Trp Glu Leu Asn Phe Ser

130 135 140

Asp Phe Gln Thr Pro Gly Thr Tyr Lys Ile Arg Val Gly Thr Lys Val

145 150 155 160

Ser Tyr Ala Phe Asp Ile Ala Gln Asn Val Leu Phe Asn Lys Thr Ala

165 170 175

Phe Ser Val Val Asp Phe Phe Lys Gly Met Arg Ser Thr Asn Asn Ala

180 185 190

Asp Lys Thr Leu Ser Phe Asn Gly Pro Arg Asn Asp Gln Val Asn Val

195 200 205

Tyr Gly Gly Trp Ile Asp Ala Thr Gly Asp Pro Gly Lys His Met Ser

210 215 220

His Leu Ser Tyr Ala Asn Tyr Phe Asn Pro Gln Gln Ile Pro Phe Val

225 230 235 240

Val Trp Ser Leu Leu Lys Ser Tyr Glu Ile Ser Gln Ala Ser Phe Thr

245 250 255

Ala Lys Ser Thr Asp Leu Leu Asn Glu Ser Lys Trp Gly Ala Asp Tyr

260 265 270

Leu Leu Arg Asn Ile Asp Lys Gln Gln Asn Tyr Leu Tyr Leu Ala Ile

275 280 285

Phe Asp Asn Trp Gly Asn Ser Pro Gly Ser Arg Glu Ile Cys Glu Trp

290 295 300

Gly Gln Ala Gly Ala Gly Asn Asp Gly Ala Arg Thr Pro Asn Phe Gln

305 310 315 320

Ala Gly Met Arg Glu Gly Ala Gly Met Ala Ile Ala Ala Leu Ala Arg

325 330 335

Ala Tyr Arg Met Asn Leu Asn Gly Asp Ser Thr Lys Ala Gln Tyr Leu

340 345 350

Asn Gly Ala Ile Arg Leu Tyr Thr Asn Leu Lys Ala Pro Gly Thr Gly

355 360 365

Tyr Ala Thr Lys Asn Leu Glu Tyr Cys Asn Asp His Thr Glu Asn Ile

370 375 380

Ile Asp Phe Tyr Cys Gly Leu Leu Ala Thr Ile Glu Leu Tyr Lys Ala

385 390 395 400

Thr Asn Asn Ala Ala Tyr Leu Ala Asp Ala Ser Val Tyr Ala Asp Lys

405 410 415

Leu Ile Gly Met Leu Asp Pro Gln Gly Trp Phe Arg Ser Asp Val Ala

420 425 430

Gly Thr Arg Pro Phe Tyr His Ala Ala Asp Glu Gly Leu Pro Leu Val

435 440 445

Ser Leu Met Glu Tyr Met Asp Val Asp Val Ser Lys Asn Ala Ala Ile

450 455 460

Thr Gln Val Leu Ser Lys Asn Ile Ala Trp Tyr Met Ser Ile Ser Lys

465 470 475 480

Glu Val Asn Asn Pro Phe Asn Tyr Met Arg Glu Tyr Tyr Lys Pro Tyr

485 490 495

Val Asn Gly Ser Leu Gly Thr Ala Lys Lys Ala Phe Phe Val Pro His

500 505 510

Asp Asn Glu Thr Gly Tyr Trp Trp Gln Gly Glu Asn Ala Arg Leu Ala

515 520 525

Ser Met Ser Thr Ala Leu Leu Leu Ala Ala Arg Lys Leu Asn Ala Gln

530 535 540

Phe Thr Ile Gly Thr Asp Ser Ile Ser Thr Phe Gly Leu Ala Gln Leu

545 550 555 560

Asp Trp Ile Leu Gly Lys Asn Pro Phe Asp Val Cys Met Met Thr Gly

565 570 575

Ala Gly Thr Thr Thr Tyr Gln Asn Tyr Pro Val Ala Ser Ala Ile Pro

580 585 590

Asn Val Lys Gly Gly Ile Cys Asn Gly Ile Thr Gly Lys Asp Thr Glu

595 600 605

Glu Thr Asn Ile Asp Trp Lys Pro Tyr Ala Ser Asp Asp Trp Gln Asn

610 615 620

Trp Arg Trp Ile Glu Gln Trp Leu Pro His Asp Ala Trp Phe Leu Leu

625 630 635 640

Ala Val Ser Ser Leu Asp Val Ala Asn Thr Pro Pro Pro Ala Ala Pro

645 650 655

Arg Arg Gln Ala Cys Gly Arg Thr Arg Ala Pro Pro Pro Pro Pro Leu

660 665 670

Arg Ser Gly Cys

675

Claims (4)

1.蛋白质在作为β-1,3和1,4-葡聚糖葡萄糖水解酶中的应用；所述蛋白质为如下A1）或A2）：

A1）氨基酸序列是序列2的第55-656位的蛋白质；

A2）在A1）的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

所述蛋白质作为β-1,3和1,4-葡聚糖葡萄糖水解酶的底物包括p-NPC、p-NPG、大麦葡聚糖、纤维寡糖或海带二糖，所述纤维寡糖为纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖、纤维六糖。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：A2）所述融合蛋白质为序列表中序列2所示的蛋白质。

3.与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料在水解含有β-1,3糖苷键和β-1,4糖苷键的化合物中的应用；所述生物材料为下述B1）至B5）中的任一种：

B1）编码权利要求1或2中所述蛋白质的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；

B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B2）所述表达盒的重组载体；

B4）含有B1）所述核酸分子的重组微生物、或含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物；

B5）含有B1）所述核酸分子的细胞系、或含有B2）所述表达盒的细胞系；

所述化合物包括p-NPC、p-NPG、大麦葡聚糖、纤维寡糖或海带二糖，所述纤维寡糖为纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖、纤维六糖。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：B1）所述核酸分子为如下b11）或b12）：

b11）序列表中序列1的第163-1968位所示的DNA分子；

b12）序列表中序列1所示的DNA分子。

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