CN107974438B - 一种微孢根霉来源的β-甘露聚糖酶及其编码基因与应用 - Google Patents

一种微孢根霉来源的β-甘露聚糖酶及其编码基因与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种微孢根霉来源的β‑甘露聚糖酶及其编码基因与应用。本发明构建出β‑甘露聚糖酶的大肠杆菌工程菌，实现了该β‑甘露聚糖酶基因的高效表达。RmMan134A的酶学性质优异，其最适pH为5.0，其最适温度为50℃。RmMan134A具有耐酸碱、热稳定性好和水解特性优异的特点，能在广泛的pH范围内稳定并发挥催化作用。将该β‑甘露聚糖酶用于水解魔芋粉和决明子胶，分别制备得到两种甘露寡糖——魔芋甘露寡糖和决明子甘露寡糖。该酶水解魔芋粉和决明子胶的水解率分别为91.6％和70.6％，两者的还原糖得率分别为68.9％和63.9％。本发明的β‑甘露聚糖酶在食品、饲料和石油开采等行业具有应用价值。

Description

一种微孢根霉来源的β-甘露聚糖酶及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及一种利用基因工程技术发现的来源于微孢根霉的β-甘露聚糖酶及其编码基因与应用。
背景技术
甘露聚糖是甘露糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的线性多聚糖，是半纤维素的第二大组分，广泛存在于自然界中，是多种植物细胞壁的主要组成成分和多种植物种子胚乳中主要贮能物质。根据其组成单体以及分支情况，甘露聚糖可以分为四类：线性甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖（Srivastava and Kapoor. BiotechnologyAdvances, 2017, 35: 1-19）。甘露聚糖结构复杂，需要多种酶的协同作用才能将其完全降解，如β-甘露聚糖酶（EC 3.2.1.78）、β-甘露糖苷酶（EC 3.2.1.25）、β-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.21）、α-半乳糖苷酶（EC 3.2.1.23）和甘露聚糖乙酰酯酶（EC 3.1.1.6）等（Moreiraet al. Applied Microbiology and Biotechnology, 2008, 79: 165-178）。β-甘露聚糖酶是其中最重要的糖苷水解酶，可以随机水解甘露聚糖主链中β-1,4-糖苷键，产生低分子量的甘露寡糖。因此，β-甘露聚糖酶可广泛应用于食品、饲料等行业中（Chauhan et al.Applied Microbiology and Biotechnology, 2012, 93: 1817-1830）。
根据氨基酸序列的相似性，β-甘露聚糖酶分属于糖苷水解酶5、26、113和134家族。迄今，绝大多数β-甘露聚糖酶属于糖苷水解酶5家族和26家族，少数β-甘露聚糖酶属于糖苷水解酶113家族（Srivastava and Kapoor. Biotechnology Advances, 2017, 35: 1-19）。近年来，发现了一个来源于构巢曲霉的β-甘露聚糖酶Man134A，经鉴定属于糖苷水解酶134家族，是一个新型的β-甘露聚糖酶（Ishihara et al. Journal of BiologicalChemistry, 2015, 46: 27914-27927）。与其他三个家族来源的β-甘露聚糖酶不同的是，糖苷水解酶134家族β-甘露聚糖酶的结构与溶菌酶类似，采取反转机制进行催化（Jin et al.ACS Central Science, 2016, 2: 896-903）。但是，上述β-甘露聚糖酶水解甘露聚糖的水解特性却较为相似，最终产物主要为聚合度在2-4之间的甘露寡糖，很少有聚合度大于4的甘露寡糖产生（Srivastava and Kapoor. Biotechnology Advances, 2017, 35: 1-19）。因此，发掘一种能够生产高聚合度甘露寡糖的新型β-甘露聚糖酶将具有重要的应用前景。
魔芋粉中的甘露聚糖主要是葡甘露聚糖，其甘露糖与葡萄糖的比值约为1.6:1；而决明子胶中的甘露聚糖则主要为半乳甘露聚糖，其甘露糖与半乳糖的比值约为5:1。这两种原料中甘露聚糖均含有较少的侧链，适合用于生产高聚合度甘露寡糖。生产甘露寡糖的方法有很多，如酸解、超声裂解和酶解等。其中，利用β-甘露聚糖酶水解富含甘露聚糖的底物生产甘露寡糖是目前最经济与高效的方法。槐豆胶、魔芋粉、瓜尔胶等植物胶均是生产甘露寡糖的优良原料，其中魔芋粉和瓜尔胶是目前使用最广泛的两种原料（Zang et al.Enzyme and Microbial Technology, 2015, 78: 1-9; Kurakake et al. Journal ofAgriculture and Food Chemistry, 2006, 54: 7885-7889）。
利用魔芋粉为原料生产甘露寡糖的研究相对较多，但其所使用的魔芋粉浓度大多很低（<5%）（Chen et al. International Journal of Biological Macromolecules,2016, 82: 1-6; Liu et al. Carbohydrate Polymers, 2015. 130: 398-404）。关于利用魔芋粉生产甘露寡糖的专利报道也较多，例如：中国专利申请号200910014349.X、201310428885.0和201510465107.8中公开的生产甘露寡糖所用的原料均为魔芋粉，但其所用的原料浓度仍然较低，一般小于20%，应用性较差。目前，尚未见到利用决明子胶为原料生产甘露寡糖的文献报道及专利公开。
微孢根霉F518是一株能够产多种糖苷水解酶和蛋白酶的丝状真菌（Sun et al.Appllied Biochemstry and Biotechnology, 2014, 174: 174-185）。本发明利用基因工程技术从微孢根霉F518克隆一个糖苷水解酶134家族的β-甘露聚糖酶基因，并将其导入大肠杆菌BL21中进行异源表达。新发明的β-甘露聚糖酶具有良好的耐酸性、耐热性和优异的水解特性，与以前所报道的β-甘露聚糖酶相比，在食品、饲料等行业中具有更大的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种微孢根霉来源的β-甘露聚糖酶及其编码基因与应用，本发明所述的β-甘露聚糖酶在食品、饲料和石油开采等行业具有应用的潜力。
本发明提供一种蛋白质。
本发明提供的蛋白质，命名为RmMan134A，具体是如下A1）或A2）或A3）的蛋白质：
A1） 由序列表中序列1所示的第20-181位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
A2） 由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
A3） 将A1）或A2）的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有β-甘露聚糖酶活性的由A1）或A2）衍生的蛋白质。
序列表中的序列1由181个氨基酸残基组成，自氨基端（N端）第1-19位氨基酸残基为信号肽，自氨基端第20-181位氨基酸残基为成熟蛋白。
为了使A1）中的蛋白便于纯化，可在由序列表中A1）的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1.标签的序列
Figure 119072DEST_PATH_IMAGE001
上述A3）中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述A3）中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2的第1-546位或第58-546位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
上述蛋白质的编码基因（命名为RmMan134A）也属于本发明的保护范围之内。
上述编码基因具体可为如下B1）-B5）中任一所述的基因：
B1） 其编码序列是序列表中序列2所示的自5′末端第58-546位；
B2） 其核苷酸序列是序列表中序列2所示的自5′末端第1-546位；
B3） 序列表中序列2所示的基因；
B4） 在严格条件下与B1）或B2）或B3）的基因杂交且编码所述蛋白质的基因；
B5） 与B1）或B2）或B3）的基因具有90％以上的同源性且编码所述蛋白质的基因。
上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％ SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。
序列表中的序列2由546个碱基组成，编码序列为自5′端第1-546位碱基，编码具有序列表中序列1的氨基酸序列的蛋白质，自5′端第1-57位碱基为信号肽编码序列，自5′端第58-546位碱基为成熟蛋白编码序列。
扩增上述基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
含有上述基因的表达盒或重组载体或转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围之内。
上述重组载体具体可以是在pET28A中插入上述基因得到的重组表达载体。
上述重组菌是将上述的重组载体导入大肠杆菌得到的重组大肠杆菌。
上述大肠杆菌可以是BL21。
本发明保护上述蛋白质、编码基因及重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备β-甘露聚糖酶中的应用。
所述在制备β-甘露聚糖酶中的应用具体可为一种制备β-甘露聚糖酶的方法，包括如下步骤：发酵培养所述重组菌，得到β-甘露聚糖酶；所述重组菌具体可为含有所述重组载体的大肠杆菌BL21。
本发明保护上述蛋白质在水解具有β-1,4糖苷键连接的甘露聚糖中的应用，或上述蛋白质作为β-甘露聚糖酶的应用。
所述具有β-1,4糖苷键连接的甘露聚糖具体可为槐豆胶、魔芋粉或决明子胶。
在上述应用中，所述水解的pH值可为3—8.5；具体可为3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5；或上述任两个所述点值间的范围值如3—8；或3.5—7.5；或4—7；或4—6.5；或4—4.5；或4.5—5内的pH值；
和/或，所述水解的温度为30—80℃；具体可为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃；或上述任两个所述点值间的范围值如30—65℃；或65—80℃；或45—75℃；或55—65℃；或65—70℃；或30—60℃；或30—50℃内的温度。
在上述应用中，所述应用具体可为在制备甘露寡糖中的应用。
在上述应用中，所述制备甘露寡糖为以魔芋胶或决明子胶为原料。
本发明提供了一种微孢根霉F518来源的β-甘露聚糖酶RmMan134A及其编码基因与应用。本发明构建出β-甘露聚糖酶的大肠杆菌工程菌，实现了该β-甘露聚糖酶基因的高效表达。RmMan134A的酶学性质优异，其最适pH为5.0，其最适温度为50℃。RmMan134A具有耐酸碱、热稳定性好和水解特性优异的特点，能在广泛的pH范围内稳定并发挥催化作用。本发明的β-甘露聚糖酶在食品、饲料和石油开采等行业具有应用的潜力。
附图说明
本发明有如下附图：
图1为β-甘露聚糖酶的纯化电泳图。
图2为β-甘露聚糖酶的最适pH测定曲线图。其中（■）柠檬酸磷酸缓冲液（pH3.0-7.0）、（□）柠檬酸缓冲液（pH3.0-5.0）、（●）磷酸缓冲液（pH6.0-8.0）、（○）Tris-HCl缓冲液（pH7.0-9.0）、（◆）甘氨酸-氢氧化钠缓冲液（pH9.0-10.5）、（◇）CAPS缓冲液（pH10.0-11.0）。
图3为β-甘露聚糖酶的pH稳定性测定曲线图。其中（■）柠檬酸磷酸缓冲液（pH3.0-7.0）、（□）柠檬酸缓冲液（pH3.0-5.0）、（●）磷酸缓冲液缓冲液（pH6.0-8.0）、（○）Tris-HCl缓冲液（pH7.0-9.0）、（◆）甘氨酸-氢氧化钠缓冲液（pH9.0-10.5）、（◇）CAPS缓冲液（pH10.0-11.0）。
图4为β-甘露聚糖酶的最适温度测定曲线图。
图5为β-甘露聚糖酶的温度稳定性测定曲线图。
图6为β-甘露聚糖酶水解线性甘露聚糖产物薄层层析图。
图7为魔芋甘露寡糖高效液相色谱图。
图8为决明子甘露寡糖高效液相色谱图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步详细说明。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中β-甘露聚糖酶酶活测定方法如下：
取0.1mL适当稀释的酶液，加入到0.9mL 0.5%（质量体积比）的槐豆胶底物溶液中（用50mM，pH5.0的柠檬酸磷酸缓冲液配制），50℃水浴反应10min，采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定所释放的还原糖量，以甘露糖作为标准。
甘露聚糖酶的活力单位定义为：在上述反应条件下，每分钟反应生成1μmol的还原糖（以甘露糖计）所需要的酶量为一个酶活力单位（1U）。
比酶活定义为1mg蛋白所具有的酶活力单位，表示为U/mg。
1个β-甘露聚糖酶酶活单位的定义：在pH5.0、50℃条件下，每分钟分解0.5%槐豆胶底物释放1μmol的甘露糖所需要的酶量，酶活计算公式为：H=Cx×n/（T×V），其中，H代表酶活力（U/mL），Cx代表生成甘露糖物质的量（μmol），n代表酶液的稀释倍数，T代表反应时间（min），V代表加入稀释后的酶液体积（mL）。
实施例1、β-甘露聚糖酶基因的克隆与高效表达
1、β-甘露聚糖酶基因的克隆
根据GenBanK中公布的微孢根霉（Rhizopus microsporus）来源的β-甘露聚糖酶的基因序列设计特异性引物。引物序列如下：
上游引物：5ʹ-ATGAATCTCAAAGTTCTCGGTCTTCT-3ʹ
下游引物：5ʹ-CTAGATAGCAGTGACATCAACCCAG-3ʹ
PCR反应以微孢根霉F518（Sun et al. Appllied Biochemstry andBiotechnology, 2014, 174: 174-185）总DNA为模板，上述引物对为引物，使用Ex taq DNA聚合酶(Takara公司)扩增。程序为：95℃预变性5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，30个循环扩增；总延伸10min。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，回收连接到pMD-18T载体(Takara公司)，热激法转化大肠杆菌，挑选单菌落测序。
经分析，β-甘露聚糖酶基因全长为546bp，含有546bp的开放阅读框，不含内含子，编码181个氨基酸。经SignalP 3.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测自氨基端（N端）第1-19位氨基酸残基为信号肽，自氨基端第20-181位氨基酸残基为成熟蛋白。
2、β-甘露聚糖酶表达工程菌的构建
根据大肠杆菌表达载体和β-甘露聚糖酶的序列设计表达引物，上下游引物分别添加上EcoRI和NotI酶切位点上下游引物分别如下：
上游引物：
5ʹ-CCGGAATTCGCTGACAGAGGTACTGAAACTGTTC-3ʹ
下游引物：
5ʹ-AAAGCGGCCGCCTAGATAGCAGTGACATCAACCCAG-3ʹ
用上述引物对以微孢根霉F518总DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，回收连接到pMD-18T载体，转化到E. coli DH5α中，挑选单菌落测序，扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列2的第58-546位所示，其可编码序列表中序列1的第20-181位所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
将序列正确的转化子，酶切（EcoRI/NotI）后连接到预先相应酶切过的pET28a载体上。使用PCR和双酶切验证序列，将已经正确的连接到大肠杆菌表达载体命名为pET28a-RmMan134A。将重组表达载体转化大肠杆菌BL21，得到重组菌甲。
实施例2、β-甘露聚糖酶的制备及其酶学性质测定
1、β-甘露聚糖酶的诱导表达
将重组菌甲或对照菌接种至液体LB培养基（含有50μg/mL卡那霉素）振荡培养（37℃，200rpm），至OD600达到0.6-0.8之间，加入IPTG至终浓度1mmol/L，30℃诱导培养过夜，10000×g收集菌体，重悬后超声破碎，10000×g离心10min，收集上清液即为粗酶液。
2、β-甘露聚糖酶的纯化
使用琼脂糖Ni-IDA亲和柱纯化重组蛋白。具体步骤如下：
用缓冲液A平衡Ni-IDA亲和柱5-10个柱体积，将步骤1得到的重组菌甲或对照菌的粗酶液以0.5mL/min流速上样，分别用缓冲液A和缓冲液B以1mL/min流速洗脱至OD280<0.05，最后以缓冲液C洗脱并收集目的蛋白质，得到纯化产物。
其中，缓冲液A为含有NaCl（300mM）和咪唑（20mM）的磷酸缓冲液（pH 8.0）；
缓冲液B为含有NaCl（300mM）和咪唑（50mM）的磷酸缓冲液（pH 8.0）；
缓冲液C为含有NaCl（300mM）和咪唑（200mM）的磷酸缓冲液（pH 8.0）。
重组菌甲的粗酶液得到的纯化产物为重组蛋白RmMan134A（其氨基酸序列为在序列表序列1中第20至181位所示氨基酸序列的氨基末端添加了
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGS）。
重组菌甲的粗酶液及其得到的纯化产物（重组蛋白RmMan134A）的SDS-PAGE纯化图如图1所示。图1中，泳道M为分子量标准，1为重组菌甲的粗酶液，2为重组菌甲的粗酶液的纯化产物即重组蛋白RmMan134A。图1的结果表明，重组蛋白mRmMan5A的大小为18kDa，与预期大小一致。
3、最适pH的测定
将上述制备得到的RmMan134A作为待测酶液，将其分别在不同缓冲液体系中，于45℃下进行酶活测定，以最高酶活力为100%计算相对酶活。各种缓冲如下：
1）柠檬酸磷酸缓冲液（pH3.0-7.0）；
2）柠檬酸缓冲液（pH3.0-5.0）；
3）磷酸缓冲液（pH6.0-8.0）；
4）Tris-HCl（三羟甲基氨基甲烷-盐酸）缓冲液（pH7.0-9.0）；
5）甘氨酸-氢氧化钠缓冲液（pH9.5-10.5）。
6）CAPS（3-(环己氨基)-1-丙磺酸）（pH10.0-11.0）
结果见图2：RmMan134A的最适pH为5.0。
4、pH稳定性测定
将RmMan134A用上述缓冲液进行稀释，置于50℃水浴锅中处理30min，将其迅速置于冰水中冷却30min，然后测定酶活力。以未经处理的β-甘露聚糖酶的酶活力作为100%，计算经过不同pH处理后RmMan134A的相对酶活力。
结果如图3所示：RmMan134A具有良好的pH稳定性，在pH4.0-10.0范围内保温30min后仍残留90%以上的酶活力。
5、最适温度的测定
将RmMan134A用50mM柠檬酸磷酸缓冲液（pH5.0）适当稀释后，分别在不同温度（30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85℃）测定酶活力。以最高酶活力为100%，计算相对酶活力。
结果见图4：RmMan134A的最适温度为50℃。
6、温度稳定性的测定
将RmMan134A用50mM柠檬酸磷酸缓冲液（pH5.0）适当稀释后，分别在不同温度（30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85℃）保温30min，将其迅速置于冰水中冷却30min，然后测定酶活力。以未经处理的β-甘露聚糖酶的酶活力作为100%，计算经过不同pH处理后RmMan134A的相对酶活力。
结果见图5：RmMan134A在50℃以下具有良好的稳定性。
7、水解线性甘露聚糖
将线性甘露聚糖（5%，w/v）溶于50mM柠檬酸磷酸缓冲液（pH5.0），加入RmMan134A（5U/mL），置于40℃下水解8h，间隔取样，所有样品与沸水浴中灭活10min。将所有样品进行薄层层析色谱分析。上样量2μL，展层剂为正丁醇：乙酸：水（2：1：1），显色剂为甲醇：硫酸（95：5）。薄层层析结果如图6所示。可以看出，RmMan134A水解线性甘露聚糖主要产生甘露三糖、甘露四糖和甘露五糖，不产生甘露糖和甘露二糖。
实施例3、利用β-甘露聚糖酶水解魔芋粉制备甘露寡糖
称取100mL蒸馏水（蒸馏水亦可换为pH5.0的柠檬酸磷酸缓冲液），加入20g魔芋粉充分搅拌，按照与魔芋粉的比例分别为250U/g、500U/g、750U/g、1000U/g加入β-甘露聚糖酶，置于50℃下水解8h，酶解后沸水浴灭活20min，得到水解液。所得水解液于10000rpm离心10min后，收集上清液，即粗糖液。用3,5-二硝基水杨酸法测定粗糖液中还原糖的含量并计算还原糖得率。沉淀用纯水冲洗两遍后烘干称重，计算魔芋粉的水解率。水解率及还原糖得率计算方法如下：
水解率=（原料干重-水解残渣干重）/原料干重×100%；
还原糖得率=（粗糖液还原糖浓度×体积）/原料干重×100%。
不同加酶量水解魔芋粉后，水解率和还原糖得率如表2所示。
表2.不同加酶量水解魔芋粉水解率和还原糖得率
加酶量（U/g魔芋粉） 水解率（%） 还原糖得率（%）
250 86.2 61.0
500 89.6 65.1
750 91.5 68.2
1000 91.6 68.9
从表2中可知，随着加酶量逐渐增大，魔芋粉的水解率逐渐升高，同时粗糖液中还原糖得率逐渐上升。魔芋粉经750U/g的β-甘露聚糖酶酶解8h后，魔芋粉的水解率为91.5%，粗糖液中还原糖得率为68.2%。随后加酶量的增大则无法明显提高魔芋粉的水解率和粗糖液的还原糖得率。
实施例4、利用β-甘露聚糖酶水解决明子胶制备甘露寡糖
称取100mL蒸馏水（蒸馏水亦可换为pH5.0的柠檬酸磷酸缓冲液），加入10g决明子胶充分搅拌，按照与决明子胶的比例分别为250U/g、500U/g、750U/g、1000U/g加入β-甘露聚糖酶，置于50℃下水解8h，酶解后沸水浴灭活20min，得到酶解液。所得酶解液于10000rpm离心10min后，收集上清液，即粗糖液。用3,5-二硝基水杨酸法测定粗糖液中还原糖的含量并计算还原糖得率。沉淀用纯水冲洗两遍后烘干称重，计算决明子胶的水解率。水解率及还原糖得率计算方法如下：
水解率=（原料干重-水解残渣干重）/原料干重×100%；
还原糖得率=（粗糖液还原糖浓度×体积）/原料干重×100%。
不同加酶量水解决明子胶后，水解率和还原糖得率如表3所示。
表3.不同加酶量水解决明子胶水解率和还原糖得率
加酶量（U/g决明子胶） 水解率（%） 还原糖得率（%）
250 66.2 55.6
500 68.4 59.1
750 70.1 62.8
1000 70.6 63.9
从表3中可知，随着加酶量逐渐增大，决明子胶的水解率逐渐升高，同时粗糖液中还原糖得率逐渐上升。当加酶量达到750U/g决明子胶时，决明子胶的水解率为70.1%，粗糖液中还原糖得率为62.8%,；当加酶量达到1000U/g决明子胶时，决明子胶的水解率为70.6%，粗糖液中的还原糖得率为63.9%。
实施例5、甘露寡糖高效液相色谱分析
称取魔芋粉20g、决明子胶10g，分别溶于100mL蒸馏水中，加入750U/g底物的β-甘露聚糖酶，置于50℃下水解8h，酶解结束后沸水浴灭活20min，得到酶解液，于10000rpm离心10min后，收集上清液，即粗糖液。粗糖液经过真空冷冻干燥后，得到粉末状产品，即为两种甘露寡糖——魔芋甘露寡糖和决明子甘露寡糖。
称取两种甘露寡糖样品6mg，分别溶于3mL蒸馏水后，用0.22μm滤膜过滤后，进行高效液相色谱分析。色谱柱为Shodex Sugar KS802，柱温80℃，流动相为纯水，流速0.6min/mL。以甘露糖、甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖、甘露五糖和甘露六糖为标准品。
魔芋甘露寡糖的高效液相色谱图如7所示。从图中可以看出，样品中聚合度小于等于6的甘露寡糖的峰面积占总峰面积的40%左右，说明该产品中聚合度大于6的组分占绝大多数。
决明子甘露寡糖的高效液相色谱图如图8所示。从图中可以看出，产品主要为甘露三糖、甘露四糖、甘露五糖及少量未知甘露寡糖。
以上，仅为本发明较佳的具体实施方式，但发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。
<110> 中国农业大学
<120> 一种微孢根霉来源的β-甘露聚糖酶及其编码基因与应用
<160> 2
<210> 1
<211> 181
<212> PRT
<213> 微孢根霉（Rhizopus microsporus）
<400> 1
Met Asn Leu Lys Val Leu Gly Leu Leu Leu Val Ala Thr Val Ala Ser
1 5 10 15
Val Ser Ala Ala Asp Arg Gly Thr Glu Thr Val Pro Gly Leu Gly Gln
20 25 30
Arg Lys Gln Gln Ile Leu Asn Ser Gly Gly Gly Val Trp Asp Leu Ala
35 40 45
Ile Ala Met Leu Glu Thr Lys Asn Leu Gly Thr Asp Tyr Val Tyr Gly
50 55 60
Asp Gly Lys Thr Tyr Asp Ser Ala Asn Phe Gly Ile Phe Lys Gln Asn
65 70 75 80
Trp Phe Met Leu Arg Thr Ser Thr Ser Gln Phe Lys Gly Gln Thr Thr
85 90 95
Asn Gln Trp Asn Asn Gly Ala Val Leu Asn Ser Asn Leu Gln Gln Asp
100 105 110
Ile Lys Ala Arg Gln Glu Ser Gln Asn Tyr Tyr Gly Pro Asp Lys Trp
115 120 125
Phe Ala Gly His Arg Asn Gly Glu Ser Gly Leu Ser Asn Pro Tyr Thr
130 135 140
Gln Asp Ile Thr Asn Tyr Lys Asp Ala Val Asn Trp Ile His Asp Gln
145 150 155 160
Leu Ala Ser Asp Pro Lys Tyr Leu Ser Asp Asp Thr Arg Phe Trp Val
165 170 175
Asp Val Thr Ala Ile
180
<210> 2
<211> 546
<212> DNA
<213> 微孢根霉（Rhizopus microsporus）
<400> 2
atgaatctca aagttctcgg tcttctcctt gttgctactg ttgcttctgt ttctgctgct 60
gacagaggta ctgaaactgt tcctggcttg ggtcaaagaa agcaacaaat tctcaatagc 120
ggtggtggtg tctgggacct tgctattgcc atgcttgaaa caaaaaactt gggtacggat 180
tacgtctatg gtgatggcaa gacgtatgat tctgccaact ttggtatctt taagcaaaac 240
tggttcatgc ttcgtacctc tacttctcaa ttcaagggcc agacgacgaa tcaatggaac 300
aatggtgctg tccttaactc taatcttcaa caagatatca aggctcgtca agaatctcaa 360
aactattatg gtcccgacaa gtggtttgct ggccatagaa acggtgagag tggtttgagc 420
aacccttaca ctcaagatat caccaactat aaggatgctg tcaattggat tcatgatcag 480
cttgctagtg accccaagta cttgtctgat gacactcgat tctgggttga tgtcactgct 540
atctag 546

Claims (5)

1.一种重组蛋白在制备魔芋甘露寡糖或决明子甘露寡糖中的应用，其特征在于，所述重组蛋白是由序列表中序列1自N末端第20至181位氨基酸残基的氨基末端添加了
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGS的蛋白质；
制备魔芋甘露寡糖的应用具体为：所述重组蛋白水解魔芋粉溶液，水解的pH值为5.0，水解的温度为50℃；
制备决明子甘露寡糖的应用具体为：所述重组蛋白水解决明子胶溶液，水解的pH值为5.0，水解的温度为50℃。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：制备魔芋甘露寡糖的应用具体为：称取100mL蒸馏水，加入20g魔芋粉充分搅拌，按照与魔芋粉的比例分别为250U/g、500U/g、750U/g、1000U/g加入β-甘露聚糖酶，置于50℃下水解8h，酶解后沸水浴灭活20min，得到水解液，所得水解液于10000rpm离心10min后，收集上清液，即粗糖液，用3,5-二硝基水杨酸法测定粗糖液中还原糖的含量并计算还原糖得率，沉淀用纯水冲洗两遍后烘干称重，计算魔芋粉的水解率，
随着加酶量逐渐增大，魔芋粉的水解率逐渐升高，同时粗糖液中还原糖得率逐渐上升，魔芋粉经750U/g的β-甘露聚糖酶酶解8h后，魔芋粉的水解率为91.5%，粗糖液中还原糖得率为68.2%，随后加酶量的增大则无法明显提高魔芋粉的水解率和粗糖液的还原糖得率；
β-甘露聚糖酶为权利要求1所述的重组蛋白。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：魔芋甘露寡糖中以质量百分比计，甘露二糖至甘露六糖含量为40%。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于：制备决明子甘露寡糖的应用具体为：称取100mL蒸馏水，加入10g决明子胶充分搅拌，按照与决明子胶的比例分别为250U/g、500U/g、750U/g、1000U/g加入β-甘露聚糖酶，置于50℃下水解8h，酶解后沸水浴灭活20min，得到酶解液，所得酶解液于10000rpm离心10min后，收集上清液，即粗糖液，用3,5-二硝基水杨酸法测定粗糖液中还原糖的含量并计算还原糖得率，沉淀用纯水冲洗两遍后烘干称重，计算决明子胶的水解率，
随着加酶量逐渐增大，决明子胶的水解率逐渐升高，同时粗糖液中还原糖得率逐渐上升，当加酶量达到750U/g决明子胶时，决明子胶的水解率为70.1%，粗糖液中还原糖得率为62.8%；当加酶量达到1000U/g决明子胶时，决明子胶的水解率为70.6%，粗糖液中的还原糖得率为63.9%；
β-甘露聚糖酶为权利要求1所述的重组蛋白。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，决明子甘露寡糖中主要成分为甘露三糖、甘露四糖以及甘露五糖。
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