CN115747236A

CN115747236A - 一种α-葡萄糖苷酶、编码基因、载体、宿主及其应用

Info

Publication number: CN115747236A
Application number: CN202211523591.1A
Authority: CN
Inventors: 赵海; 易卓林; 靳艳玲; 方扬; 何开泽
Original assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Current assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Priority date: 2022-11-30
Filing date: 2022-11-30
Publication date: 2023-03-07

Abstract

本发明提供了来源于浓香型大曲未培养微生物的α‑葡萄糖苷酶编码基因，还提供了α‑葡萄糖苷酶，包含所述α‑葡萄糖苷酶编码基因的重组载体和宿主，以及制备所述α‑葡萄糖苷酶的方法，并证实了所述α‑葡萄糖苷酶对含α‑葡萄糖苷键的寡聚糖和淀粉中具有水解活性，因而所述α‑葡萄糖苷酶及包含α‑葡萄糖苷酶编码基因的宿主可在水解含α‑葡萄糖苷键的寡聚糖和淀粉中应用，具体可应用于洗涤、纺织及食品等行业，为可应用于洗涤、纺织及食品等行业的含α‑葡萄糖苷键的寡聚糖和淀粉的水解提供了新的选择。

Description

一种α-葡萄糖苷酶、编码基因、载体、宿主及其应用

技术领域

本发明属于生物工程和酶工程领域，涉及α-葡萄糖苷酶、编码基因、载体、宿主及其应用。

背景技术

α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)是参与淀粉及糖原代谢途径的重要功能酶。α-葡萄糖苷酶是一种外切碳水化合物降解酶，能从含α-D-葡萄糖基的麦芽低聚糖和α-葡聚糖等分子的非还原端切割α-糖苷键，释放葡萄糖。部分α-葡萄糖苷酶还具有转糖基作用，能将葡萄糖基转移至受体，形成低聚糖、糖脂或糖肽等。α-葡萄糖苷酶主要属于GH13和GH31，其中GH31家族中的成员偏好同质底物(如麦芽低聚糖)的降解，而GH13家族中的成员偏好异质底物(如蔗糖)的降解。更重要的是，GH31家族中α-葡萄糖苷酶的主要功能是降解α-1,4葡糖苷键，可与葡糖淀粉酶和α-淀粉酶一起高效协同降解淀粉。α-葡萄糖苷酶广泛存在于自然界不同物种，包括真菌、植物、细菌、动物、昆虫和古细菌。

中国白酒是世界上最古老的蒸馏酒之一，而大曲是白酒的糖化发酵剂，自古有“酒之骨”之说。大部分大曲以小麦等谷物为原料，通过开放式的固态发酵制作而成，人为富集了大量复杂的酶系网络，包括淀粉、蛋白质、葡聚糖、纤维素和半纤维素等降解酶系。而传统大曲酶资源研究，主要是基于纯培养法的功能筛选和基于宏基因组的随机筛选，均不能有效反映功能酶在大曲环境的作用。

发明内容

本发明的目的是提供α-葡萄糖苷酶、编码基因、载体、宿主及其应用。

本发明提供的α-葡萄糖苷酶编码基因，来源于浓香型大曲未培养微生物，该编码基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白质，或者编码与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列具有90％以上同源性且具有α-葡萄糖苷酶活性的蛋白质。

进一步地，该编码基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白质，或者编码与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列具有95％以上、优选98％以上同源性且具有α-葡萄糖苷酶活性的蛋白质。

更进一步地，该编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或者该编码基因与SEQ IDNO.1所示核苷酸序列具有90％以上、优选95％以上、更优选98％以上同源性的核苷酸序列。与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有90％以上、优选95％以上、更优选98％以上同源性的核苷酸序列，可通过对SEQ ID NO.1所示核苷酸序列进行一个或者多个碱基取代或/和缺失或/和添加而生成与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有90％以上、优选95％以上、更优选98％以上同源性的核苷酸序列。

本发明提供的α-葡萄糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或者该α-葡萄糖苷酶是氨基酸序列与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列具有90％以上同源性且具有α-葡萄糖苷酶活性的蛋白质。

进一步地，该α-葡萄糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或者该α-葡萄糖苷酶是氨基酸序列与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列具有90％以上、优选95％以上、更优选98％以上同源性且具有α-葡萄糖苷酶活性的蛋白质。与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列具有90％以上、优选95％以上、更优选98％以上同源性且具有α-葡萄糖苷酶活性的蛋白质，可通过对SEQ IDNO.2所示氨基酸序列进行一个或者几个氨基酸的取代或/和缺失或/和添加而衍生得到与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列具有90％以上、优选95％以上、更优选98％以上同源性且具有α-葡萄糖苷酶活性的蛋白质。

本发明还提供了包含上述α-葡萄糖苷酶编码基因的重组载体。

本发明还提供了包含上述α-葡萄糖苷酶编码基因的宿主。

进一步地，所述的重组载体为将上述α-葡萄糖苷酶编码基因或上述α-葡萄糖苷酶的编码基因插入到载体中形成的，所述的载体是指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、动物细胞病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定保留，任何载体都可以采用，并无其他特定要求。作为示例，本发明选用了pET-28a+质粒，该质粒的主要宿主菌是原核细胞，如Escherichia coli、Bacillus等。

本发明还提供了一种制备上述α-葡萄糖苷酶的方法，该方法包括：在适合上述宿主产生α-葡萄糖苷酶的条件下培养该宿主；以及分离纯化所述宿主产生的α-葡萄糖苷酶。此处所述的宿主是指包含上述α-葡萄糖苷酶编码基因的宿主，或包含上述α-葡萄糖苷酶的编码基因宿主，或包含上述重组载体的宿主。

该制备方法对重组载体的构建方法、以及将所构建的重组载体转化、转染或转导至宿主中的方法无特定要求；该方法对宿主产生的α-葡萄糖苷酶的分离纯化方法，无特定要求，如Ni柱纯化法、离子交换柱法、分子筛法等都是可行的。

本发明提供的α-葡萄糖苷酶为中温真菌葡萄糖苷酶，本发明通过实验证实了该α-葡萄糖苷酶对多种含α-葡萄糖苷键的寡聚糖和淀粉具有水解活性。基于此，本发明还提供了上述α-葡萄糖苷酶及上述宿主在水解α-葡萄糖基寡聚糖或淀粉中的应用。

进一步地，所述含α-葡萄糖苷键的寡聚糖包括黑曲霉二糖、曲二糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖以及麦芽五糖中的至少一种。

进一步地，应用上述α-葡萄糖苷酶或上述宿主水解α-葡萄糖基寡聚糖或淀粉时，使上述α-葡萄糖苷酶或上述宿主与含有待水解的含α-葡萄糖苷键的寡聚糖或淀粉的反应体系接触，并在适宜α-葡萄糖苷酶进行水解反应的条件下进行水解反应。

更进一步地，控制所述反应体系的pH值为6.0～8.5、优选为6.5～7.5、进一步优选为7.0左右，控制进行水解反应的温度为30～75℃、优选为30～50℃、进一步优选为45℃。

本发明通过实验发现，本发明提供的α-葡萄糖苷酶对含α-(1→4)糖苷键的可溶性淀粉和寡聚麦芽糖、含α-(1→3)糖苷键的黑曲霉二糖、含α-(1→2)糖苷键的曲二糖、含α-(1→6)糖苷键的异麦芽糖、含α-葡萄糖苷的人工底物-对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖都具有良好的水解活性，尤其对可溶性淀粉的水解活性更高。基于此，本发明提供的α-葡萄糖苷酶特别适用于在淀粉水解中应用，该α-葡萄糖苷酶可应用于洗涤行业、纺织行业及食品行业等。

本发明的技术方案产生的有益技术效果：本发明提供了一种α-葡萄糖苷酶编码基因，以及该编码基因编码的α-葡萄糖苷酶，包含所述α-葡萄糖苷酶编码基因的重组载体，包含所述编码基因的宿主，并证实了该α-葡萄糖苷酶对多种α-葡萄糖苷寡聚糖和淀粉底物具有水解活性，可应用于洗涤行业、纺织行业及食品行业等，为可应用于洗涤、纺织及食品等行业的淀粉水解提供了新的选择。

附图说明

图1是纯的α-葡萄糖苷酶NFAg31A的SDS-PAGE凝胶电泳图。

图2是不同反应pH对α-葡萄糖苷酶NFAg31A的酶活影响曲线。

图3是不同反应温度对α-葡萄糖苷酶NFAg31A的酶活影响曲线。

图4是α-葡萄糖苷酶NFAg31A的pH稳定性曲线。

图5是α-葡萄糖苷酶NFAg31A的热稳定性曲线。

图6是α-葡萄糖苷酶NFAg31A的热失活时间曲线。

图7是不同单糖对α-葡萄糖苷酶NFAg31A酶活的抑制作用。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明提供的α-葡萄糖苷酶、编码基因、载体、宿主及其应用作进一步说明。下述各实施例中所使用的试验方法，如无特殊说明，均为本技术领域的常规方法。下述各实施例中所采用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得，所述浓香型大曲采集自中国四川省宜宾市。

下述各实施例中，SEQ ID NO.1所示序列为不含编码信号肽的NFAg31A基因的核苷酸序列，SEQ ID NO.2所示序列为α-葡萄糖苷酶NFAg31A的氨基酸序列，SEQ ID NO.3所示序列为含编码信号肽的NFAg31A基因的核苷酸序列，SEQ ID NO.4所示序列为含信号肽的α-葡萄糖苷酶NFAg31A的氨基酸序列，SEQ ID NO.5所示序列为信号肽的氨基酸序列。

实施例1：NFAg31A基因的获取

在浓香型大曲高温阶段(62℃)取样，提取总RNA。具体方法如下，在预冷的研钵中将1g浓香型大曲样品磨成细粉。将样品与4mL pH＝9.0的硼酸盐缓冲液(200mM硼酸钠，30mM乙二醇四乙酸(EGTA)，1％(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)，4％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，0.5％(v/v)Nonidet-40(NP-40)，10mMβ-巯基乙醇和0.03％(v/v)RNase抑制剂)以及280μL蛋白酶K(20mg/mL)混合并在室温保持2min。然后将所得粗裂解物的RNA离心，用70％乙醇沉淀，并根据RNeasy Midi Kit(Qiagen，Valencia，CA)说明书进行洗涤。此外，根据说明书对RNA混合物进行DNase I(Fermentas，USA)处理。使用3μL总RNA(约1μg)作为用MMLV逆转录酶进行第一链合成的模板，之后使用

cDNA库构建试剂盒(Clontech，Mountain View，CA)通过20个长距离PCR(LD-PCR)循环扩增cDNA。cDNA文库构建后，对其进行宏转录组分析，编号为15963的开放阅读框被预测为编码一种含DUF5110未知功能区域的α-葡萄糖苷酶编码基因。由于该编码基因来源于浓香型大曲，且为糖苷水解酶31家族成员，故命名为NFAg31A基因。其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其开放阅读框为从5’端的第1位到2883位碱基。

实施例2：α-葡萄糖苷酶NFAg31A的生物信息学分析

将实施例1所获得的NFAg31A基因所表达的蛋白质，命名为含信号肽的α-葡萄糖苷酶NFAg31A，具有960个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。根据SignalP-6.0Server(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP)对NFAg31A基因的核苷酸序列进行预测，表明其有明显信号肽(从氨基酸第1位到第30位，信号肽的氨基酸序列如SEQID NO.5所示)。去掉信号肽，预测的蛋白大小为105.3kDa，去掉信号肽后的蛋白命名为α-葡萄糖苷酶NFAg31A，具有930个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。根据基因库序列比对表明，与α-葡萄糖苷酶NFAg31A的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)相似度最高的酶为来源于Paecilomyces variotii的假定α-葡萄糖苷酶(GenBank编号：XP_028489865.1)，其相似度为86.3％，该葡萄糖苷酶来源于基因组信息分析，未进行酶学性质分析。其次与来源于Chaetomium thermophilum的已进行酶学性质分析的真菌葡萄糖苷酶AGII(GenBank编号：5DKX)相似度为66.9％。根据进化树分析表明，SEQ ID NO.2所示α-葡萄糖苷酶NFAg31A属于糖苷水解酶31家族的1亚家族(GH31_1)。因此，它是一种从浓香型大曲中挖掘到的属于GH31_1亚家族的未被研究的真菌α-葡萄糖苷酶。

实施例3：α-葡萄糖苷酶基因的表达

以浓香型大曲cDNA文库中含15963开放阅读框的cDNA为模板，通过分别含NdeI与HindIII位点的正向引物NFAg31Af(5’CATATGGTGAAGCATGAAAACTTCAAGAAATG3’)和反向引物NFAg31Ar(5’AAGCTTCTAGATCCTCCACTCCCTG3’)扩增获得不含编码信号肽的NFAg31A基因，该不含编码信号肽的NFAg31A基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。具体PCR反应体系为：47μL Mix(green)(TsingKe，北京)，10μM的正反向引物各1μL，DNA模板1μL。PCR扩增条件为：98℃预变性2min，98℃变性10s，50℃退火15s，72℃延伸30s，跳到第2步循环30次，72℃保温5min。琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物约3.0kb，与预期不含编码信号肽的NFAg31A基因含有2793个碱基相符。分别将约1000ng扩增产物和pET28a+质粒进行NdeI与HindIII限制性酶(New England Biolabs)的切割，凝胶电泳后回收已完成限制性酶切的DNA片段，然后将含50～100ng的基因和质粒纯化片段在16℃连接反应1h，构建成重组表达载体。

将重组表达载体与E.coli DH5α感受态细胞轻轻混匀，冰上静置25min。然后将混合液于42℃热激30～45s，迅速转移至冰浴中，静置2min。加入500μL无菌LB于37℃、200rpm条件下培养1h后在含50μg/mL卡那霉素的LB平板中进行抗性筛选。挑取克隆子进行PCR菌液验证，将验证呈阳性的克隆子送公司测序。将测序正确的克隆子进行菌液培养并提取质粒，然后将质粒转入E.coli BL21(DE3)中进行异源表达。具体异源表达方法如下：

先挑取单克隆到3mL含50μg/mL卡那霉素的LB培养基，接着在温度37℃和转速200rpm条件下过夜培养约16h。取1mL过夜培养种子液，接种于同样含50μg/mL卡那霉素的1升LB中在上述条件下培养。待菌体的OD_600nm值达0.6后，加入0.05mM IPTG进行诱导表达，此时温度降低至25℃，其它培养条件不变。48h后，将培养液在6000rpm和4℃下离心3min，弃澄清培养基，保留菌体沉淀。

实施例4：α-葡萄糖苷酶的纯化

将实施例3中收集的菌体重悬于结合缓冲液(50mM Tris-HCl，300mM NaCl，pH7.5)中，用超声破碎仪对菌悬液进行破碎。充分破碎后，对破碎液进行离心，条件为8000rpm、4℃下离心10min，保留上清液备用。将上清液与Ni柱孵育结合，先用结合缓冲液冲洗未与Ni柱结合的杂蛋白，再用含20mM咪唑的结合缓冲液清洗结合力弱的杂蛋白，最后用洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl，300mM NaCl，250mM咪唑，pH 7.5)洗脱与Ni柱结合的目的蛋白，等体积约500μL收集流出液。将不同收集液进行SDS-PAGE凝胶电泳(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析，根据跑胶结果确定含目的蛋白的流出液。将所有含目的蛋白的收集液集中起来，并用

Ultra-15离心过滤管浓缩，然后用存储缓冲液(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7.5)代替结合缓冲液。最后，将获得纯蛋白跑SDS-PAGE胶进行验证，结果如图1所示，有大于100kDa附近有单一条带，这与预测蛋白大小105.3kDa是相符的。本实施例纯化得到的蛋白即为α-葡萄糖苷酶NFAg31A(不含信号肽)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例5：α-葡萄糖苷酶的底物谱分析

将0.25μMα-葡萄糖苷酶NFAg31A与2mM对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖，2mM寡聚糖(包括麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、黑曲霉二糖或曲二糖)，或2mg/mL可溶淀粉，或则将4μMα-葡萄糖苷酶NFAg31A与2mM异麦芽糖或蔗糖，分别在pH 7.0的磷酸盐缓冲液(50mM NaH₂PO₄，150mM NaCl)中于45℃孵育15min。然后通过410nm吸光度读数获取检测产物对硝基苯酚的量，从而计算α-葡萄糖苷酶NFAg31A对合成底物对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖(pNPαG)的降解活性。对其它天然底物的降解产物利用高效离子色谱仪(HPAEC-PAD)进行分离检测。采用高效离子色谱仪进行检测时，分析柱采用Dionex CarboPac PA20(3×150mm)，保护柱采用Dionex CarboPac PA20(3×30mm)；流动相为250mmol/L NaOH(组分1)，10mmol/L NaOH和500mmol/L NaOAc的混合液(组分2)；标准品为葡萄糖(G1)，麦芽糖(M2)，麦芽三糖(M3)，麦芽四糖(M4)和麦芽五糖(M5)。一个酶活单位(U)定义为：在pH 7.0和45℃下，每分钟释放1μmol葡萄糖当量产物所需要的α-葡萄糖苷酶NFAg31A量。

结果如表1所示，α-葡萄糖苷酶NFAg31A对多种含α-葡萄糖苷的底物有水解作用，对可溶性淀粉的水解能力最高；α-葡萄糖苷酶NFAg31A对于二糖的降解中，降解黑曲霉二糖的效率最高，降解曲二糖和麦芽糖的效率其次，降解异麦芽糖的效率十分低，完全不能降解蔗糖；α-葡萄糖苷酶NFAg31A降解寡聚麦芽糖的效率，依次为麦芽三糖>麦芽四糖>麦芽二糖(即麦芽糖)>麦芽五糖。

表1α-葡萄糖苷酶NFAg31A对不同底物的水解比活

实施例6：α-葡萄糖苷酶的最适反应条件分析

在pH 5.5～9.5的缓冲液(pH 5.5～6.0：50mM C₆H₅Na₃O₇·2H₂O，150mM NaCl；pH6.0～8.0：50mM NaH₂PO₄，150mM NaCl；pH 8.0～9.5：50mM tris-HCl，150mM NaCl)中，测定α-葡萄糖苷酶NFAg31A的最适反应pH值。具体反应条件为，将0.25μMα-葡萄糖苷酶NFAg31A和2mM对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖，在不同pH值和45℃条件下，反应30min。反应结束后，通过测定产物在410nm的吸光值，计算对硝基苯酚的浓度。结果如图2所示，α-葡萄糖苷酶NFAg31A在pH 6.5～7.5都能保持在较高的活性(>90％)，且最适反应pH值为7.0。

在31～85℃测定α-葡萄糖苷酶NFAg31A的最适反应温度。具体反应条件为，将0.25μM的α-葡萄糖苷酶NFAg31A和2mM对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖，在pH 7.0磷酸盐缓冲液(50mM NaH₂PO₄，150mM NaCl)中，在不同温度条件下，反应30min。反应结束后通过检测410nm的吸光值，计算对硝基苯酚的浓度。结果如图3所示，α-葡萄糖苷酶NFAg31A在31～55℃都能保持在较高的活性(>60％)，且最适反应温度为45℃。

实施例7：α-葡萄糖苷酶的稳定性分析

α-葡萄糖苷酶NFAg31A的pH稳定性于pH 3.0～12.0(pH 3.0～6.0：50mMC₆H₅Na₃O₇·2H₂O，150mM NaCl；pH 6.0～8.0：50mM NaH₂PO₄，150mM NaCl；pH 8.0～9.5：50mMtris-HCl，150mM NaCl；pH 9.5～11.0：25mM Na₂CO₃-NaOH，pH 11.0～12.0：25mM Na₂HPO₄-NaOH)的缓冲液中进行检测。将7.5μMα-葡萄糖苷酶NFAg31A在pH 3.0～12.0的缓冲液中于20℃处理1h后，测定残余酶活。测定残余酶活的反应条件为，将0.25μMα-葡萄糖苷酶NFAg31A和2mM对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖，在pH 7.0和45℃条件下，反应30min，结束后通过检测410nm的吸光值，计算对硝基苯酚的浓度。将未处理的α-葡萄糖苷酶NFAg31A在相同条件下反应的酶活定义为相对酶活100％。结果如图4所示，α-葡萄糖苷酶NFAg31A在pH 6.0～10.0的条件下极其稳定(残余酶活>90％)，可见α-葡萄糖苷酶NFAg31A可在较宽的pH范围内使用，尤其在极碱性条件下仍保持较高的酶活。

α-葡萄糖苷酶NFAg31A的热稳定性分析在35～51℃进行。将7.5μMα-葡萄糖苷酶NFAg31A在上述温度和pH 7.0条件下热处理30min后，测定残余酶活。测定残余酶活的反应条件为，将0.25μMα-葡萄糖苷酶NFAg31A和2mM对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖，在pH 7.0和45℃条件下，反应30min，结束后通过检测410nm的吸光值，计算对硝基苯酚的浓度。将未进行热处理的α-葡萄糖苷酶NFAg31A在相同条件下反应的酶活定义为相对酶活100％。结果如图5所示，α-葡萄糖苷酶NFAg31A的热稳定性不佳，酶活随温度升高而降低。

α-葡萄糖苷酶NFAg31A的热失活时间曲线分别在39℃、45℃和50℃进行测试。将7.5μMα-葡萄糖苷酶NFAg31A在上述温度和pH 7.0条件下，分别热处理0、5、10、20、30、40、60、90、120、180min后，测定残余酶活。测定残余酶活的反应条件为，将0.25μM浓度的α-葡萄糖苷酶NFAg31A和2mM对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖，在pH 7.0和45℃条件下，反应30min，结束后通过检测410nm的吸光值，计算对硝基苯酚的浓度。将未进行热处理的α-葡萄糖苷酶NFAg31A在相同条件下反应的酶活定义为相对酶活100％。结果如图6所示，在50℃热处理条件下，α-葡萄糖苷酶NFAg31A迅速失去活性，热处理10min后，只有20％残余活性；在45℃热处理时，处理60min后，还有约50％残余活性；在39℃热处理时，α-葡萄糖苷酶NFAg31A相对比较稳定，处理180min后，残余活性还大于60％。

实施例8：不同单糖对α-葡萄糖苷酶NFAg31A酶活的抑制作用

测定不同单糖浓度对α-葡萄糖苷酶NFAg31A酶活的抑制作用。将1μMα-葡萄糖苷酶NFAg31A和2mM对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖，在不同浓度(0.5～50mM)单糖存在的条件下，具体包括葡萄糖(Glucose)、甘露糖(Mannose)、木糖(Xylose)、果糖(Fructose)、半乳糖(Galactose)或阿拉伯糖(Arabinose)，在pH 7.0和45℃反应30min，结束后通过检测410nm的吸光值，计算对硝基苯酚的浓度。将不含单糖的α-葡萄糖苷酶NFAg31A溶液在相同条件下反应的酶活定义为相对酶活100％。结果如图7所示，随着单糖浓度的增加，α-葡萄糖苷酶NFAg31A的相对酶活是显著降低的；其中葡萄糖对α-葡萄糖苷酶NFAg31A酶活的抑制作用最强，在50mM葡萄糖条件下，α-葡萄糖苷酶NFAg31A的相对酶活小于50％；而阿拉伯糖对α-葡萄糖苷酶NFAg31A酶活的抑制作用最弱，在50mM阿拉伯糖条件下，α-葡萄糖苷酶NFAg31A的相对酶活大于90％。

Claims

1.一种α-葡萄糖苷酶编码基因，其特征在于，该编码基因编码编码氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的蛋白质，或者编码与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列具有90％以上同源性且具有α-葡萄糖苷酶淀粉活性的蛋白质。

2.根据权利要求1所述α-淀粉酶编码基因，其特征在于，该编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或者该编码基因与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性的核苷酸序列。

3.一种α-葡萄糖苷酶，其特征在于，该α-葡萄糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或者该α-葡萄糖苷酶是氨基酸序列与SEQ ID NO.2具有90％以上同源性且具有α-淀粉酶活性的蛋白质。

4.包含权利要求1或2所述α葡萄糖苷酶编码基因的重组载体。

5.包含权利要求1或2所述α-葡萄糖苷酶编码基因的宿主。

6.一种制备权利要求3所述α-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于，该方法包括：在适合权利要求5所述宿主产生α-葡萄糖苷酶的条件下培养该宿主；以及分离纯化所述宿主产生的α-葡萄糖苷酶。

7.权利要求3所述α-葡萄糖苷酶或权利要求5所述宿主在水解含α-葡萄糖苷键的寡聚糖和淀粉中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，应用权利要求3所述α-葡萄糖苷酶或权利要求5所述宿主水解含α-葡萄糖苷键的寡聚糖或淀粉时，使权利要求3所述α-葡萄糖苷酶或权利要求5所述宿主与含有待水解的含α-葡萄糖苷键的寡聚糖或淀粉的反应体系接触，并在适宜α-葡萄糖苷酶进行水解反应的条件下进行水解反应。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，控制所述反应体系的pH值为6.0～8.5、控制进行水解反应的温度为30～75℃。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述含α-葡萄糖苷键的寡聚糖包括黑曲霉二糖、曲二糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖以及麦芽五糖中的至少一种。