CN109929861B - 一种葡甘聚糖酶编码基因及酶和制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种来源于产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)的葡甘聚糖酶基因及其酶的制备方法与应用，即利用基因工程的技术方法，将该葡甘聚糖酶的基因克隆到大肠杆菌表达载体上，获得可异源表达该酶的大肠杆菌重组菌株，该菌株异源表达制备的葡甘聚糖酶，能高效降解魔芋多糖(又称魔芋葡甘聚糖)。本发明提供的葡甘聚糖酶可广泛应用于农业、食品、饲料添加剂、医药及葡甘露低聚糖制备等领域。

Description

一种葡甘聚糖酶编码基因及酶和制备与应用

技术领域

本发明涉及一种葡甘聚糖酶的基因序列及其制备方法和应用。本发明提供了 该葡甘聚糖酶的重组质粒和重组基因工程菌株及其在多糖降解方面的应用。本发 明提供的葡甘聚糖酶可广泛应用于农业、食品、饲料添加、医药及寡糖制备等领 域。

背景技术

蒟蒻(Amorphophallus konjac)，俗称魔芋，天南星科魔芋属多年生草本植 物。魔芋中主要成分为魔芋多糖(又称魔芋葡甘露聚糖)，由葡萄糖与甘露糖组 成。魔芋葡甘露聚糖通过β-1,4吡喃糖苷键将β-D-葡萄糖和β-D-甘露糖按1∶1.6 或1∶1.69的摩尔比连接而成，每19个糖残基上有一个乙酰基团存在，其特殊 的结构使其虽具有多种生物学功能。但是其在水中为胶体，粘度大、溶解度小， 在后续加工利用上带来不便；其在各种食品中添加量小，影响了其生物活性。目 前我国魔芋产业多停留在魔芋初级食品开发层面，亟需高值化加工技术，对魔芋 主要成分魔芋葡甘露聚糖的深加工是魔芋下游产业的主要方向。

将魔芋多糖降解成魔芋寡糖，即魔芋葡甘露寡糖(Konjac oligo-glucomannan，KOGM)，其分子量小，在水中可溶，易于吸收，将会克服魔芋多糖在加工利用 中问题。与魔芋多糖相比，魔芋寡糖具有优良的性能，具有改善食品品质，保鲜 食品，改善人体肠道菌群，增强免疫力，调节血糖、血脂以及肠道解毒等生物活 性。生理功能试验表明，葡甘露低聚糖除了具有低热量、稳定、安全无毒等良好 的理化特性外，还具有促进以双歧杆菌为代表的有益菌群的增殖,改善肠道内菌 群结构；减慢肠道粘膜分泌的β-糖苷酶的扩散速度，不升高血糖，提高机体抗氧 化能力等功能。

目前尚无大量工业生产魔芋葡甘低聚糖的报道，其生产尚停留在实验室研究 期间，获得葡甘低聚糖的方法主要有以下几种：(1)从天然原料(魔芋)中提 取，但提取工艺复杂，且产率极低；(2)通过人工化学合成的方法获得，但此 法步骤繁琐，成本太高；(3)利用酸水解魔芋葡甘露聚糖的方法获得，但这样 生产的低聚糖性质不稳定，副产品多，不易得到特定的低聚糖；(4)利用物理 方法降解得到，但此方法要利用现代化的生产设备，实验设备要求太高，不利于 大量生产；(5)利用酶解葡甘露聚糖的方法获得，酶的反应效率高，方法简单、 易控制，后期分离也容易，且酶作为一种生物制剂，不会带来化学试剂产生的不利因素。所以利用酶解葡甘露聚糖的方法生产葡甘露低聚糖是一条相对简单，容 易研究的生产方法。

葡甘聚糖酶(glucomannanase)是一种能够将葡甘聚糖降解为葡甘低聚糖的 酶，根据葡甘聚糖的结构，一般分为两类：葡聚糖酶和甘露聚糖酶，大部分研究 报道的是葡甘聚糖酶的类似酶——甘露聚糖酶。β-1,4-D-甘露聚糖水解酶 (β-1,4-D-mannanmannohydrolase，EC 3.2.1.78)是一类从甘露聚糖、葡甘露聚糖、 半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖的主链内部随机切割β-1,4-D-甘露聚糖糖苷键的 水解酶，简称β-甘露聚糖酶(β-mannanase)，是降解葡甘露聚糖制备葡甘露寡糖的 有效工具。国内外对甘露聚糖酶的研究多集中于微生物，其中细菌特别是革兰氏 阳性菌包括芽孢杆菌(Bacillus)和梭菌(Clostridium)，真菌中曲霉(Aspergillus) 和里氏木霉(Trichoderma reesei)，放线菌中链霉菌(Streptomyces)研究较多， 但是来源于产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)中的葡甘聚糖酶鲜有报道(仅有四 篇被报道)。目前已报道的葡甘聚糖酶对魔芋多糖的降解活性均较弱，不适于大 规模应用。因此，寻找一种能够高效、稳定降解魔芋多糖的甘露聚糖酶是降低葡 甘露寡糖生产成本的有利途径。而由于葡甘露聚糖酶在生物体内的含量非常少，借助基因水平进行高量表达和表征是提高葡甘露聚糖酶产量的一种有效措施。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种新型的来源于产酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca)的葡甘聚糖酶KmanA及其编码基因。

本发明的第二个目的是提供一种制备新型葡甘聚糖酶KmanA的方法。

本发明的第三个目的是提供含有所述的葡甘聚糖酶KmanA基因重组表达 质粒和重组基因工程菌株。

本发明的第四个目的是提供一种新型葡甘聚糖酶KmanA在魔芋多糖降解 中的应用。

本发明所提供的葡甘聚糖酶KmanA，来源于土壤中分离纯化的产酸克雷伯 菌Klebsiella oxytoca，从中扩增出的葡甘聚糖酶KmanA编码基因(命名为KmanA)， 具有下述核苷酸序列特征中的一种或二种以上：

1)序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

3)与SEQ ID NO.1限定的脱氧核糖核酸(DNA)序列的同源性达到80％及以 上，且能编码降解葡聚糖的蛋白质的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

4)对序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或几个核 苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有葡甘聚糖酶活性的核苷酸序列。

本发明还提供了葡甘聚糖酶KmanA的氨基酸序列，具有如下特征中的一种 或二种以上：

1)序列表中的SEQ ID NO.2从氨基端开始的第1-716位氨基酸残基序列， 其中1-708位为具有葡甘聚糖酶KmanA活性的氨基酸序列，709-716位为酶切位 点及His-Tag的氨基酸序列；

2)将序列表中的SEQ ID NO.2从氨基端开始的第1-716或1-708位氨基酸 残基进行一个或两个以上氨基酸取代、缺失或添加而形成具有葡甘聚糖酶活性不 变的氨基酸序列。

本发明的葡甘聚糖酶KmanA的氨基酸序列及其核苷酸编码序列也可以根据 预测的葡甘露聚糖酶KmanA的氨基酸序列及其核苷酸编码序列人工合成获得。

制备重组酶KmanA的方法，是将葡甘聚糖酶基因克隆入重组表达载体，导 入宿主细胞，获得重组表达的葡甘聚糖酶。

上述葡甘聚糖酶基因，其核苷酸序列具有如下特征中的一种或二种以上：

1)具有序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

2)编码SEQ ID NO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

3)对序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或两个以 上核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有葡甘聚糖酶活性的核苷酸序列；

所述的重组表达葡甘聚糖酶KmanA的表达载体可以是大肠杆菌表达载体、 酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体 载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达 载体等。

用于重组表达葡甘聚糖酶KmanA的重组菌或转基因细胞系，可以是大肠杆 菌宿主细胞(如Escherichia coli BL21、Escherichia coli JM109、Escherichia coli DH5α等)、酵母菌宿主细胞(如Saccharomyces cerevisiae、Pichiapastoris、 Kluyveromyceslactis等)、枯草杆菌宿主细胞(如Bacillus subtilis R25、Bacillus subtilis9920等)、乳酸菌宿主细胞(如Lactic acid bacteria COCC101等)、放线 菌宿主细胞(如Streptomycesspp.等)、丝状真菌宿主细胞(如Trichodermaviride、 Trichodermareesei、Aspergillusniger、Aspergillusnidulans等)、昆虫细胞(如 Bombyxmori、Antharaeaeucalypti等)或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞CHO、 幼小仓鼠肾脏细胞BHK、中国仓鼠肺细胞CHL等)。

本发明的葡甘聚糖酶KmanA的基因序列是通过PCR技术从产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)中克隆得到。该基因编码区长2151bp，包含多个结构域。

本发明提供的葡甘聚糖酶在降解魔芋多糖中可以应用，包括以下应用中的一 种或二种：

1)在断裂魔芋多糖的糖苷键，获得单糖或葡甘露寡糖中的应用；

2)在断裂甘露聚糖的糖苷键，获得单糖或甘露寡糖中的应用；

3)与其他葡甘露聚糖酶混合后，在协同断裂葡甘露聚糖糖苷键方面应用。

本发明从大肠杆菌重组表达获得的葡甘聚糖酶KmanA，可以高效降解魔芋 多糖，以魔芋多糖为底物时，在37℃、pH7.4的条件下具有较好活性，比活为 60U/mg。

本发明的葡甘聚糖酶KmanA可广泛应用于农业、食品、饲料添加、医药及 葡甘露寡糖的制备等领域。

附图说明

图1：葡甘聚糖酶基因KmanA琼脂糖凝胶电泳检测。泳道1：核酸标准； 泳道2-KmanAA扩增产物。

图2：葡甘聚糖酶KmanA表达及纯化的SDS-PAGE图。各泳道加入的样品 分别是：泳道1-KmanA菌体总沉淀，泳道2-KmanA破菌上清，泳道3-KmanA 上柱三次流穿液，泳道4-40mM咪唑洗脱流穿液，泳道5-80mM咪唑洗脱流穿液， 泳道6-250mM咪唑洗脱流穿液，泳道7-蛋白分子量标准。

图3：葡甘聚糖酶KmanA对魔芋多糖降解产物的MALDI-TOF-MS图谱。

具体实施方式

序列表

SEQ ID No.1的信息

(a)序列特征

长度：2151bp核苷酸

类型：核苷酸

链型：单链

(b)分子类型：DNA

序列描述：SEQ ID NO.1

ATGGCGGAGCAGTCGCACTTTGAACACTTTATTACCCGCGACGGCGCGACGCTAAAAG ACGGCGACAAGGTTTTCCGCTTTGCGGGCATCCACGCGCCGGAGCTGCACCGTATCGA GGACGATGCGCGCGGTACCTGTAAGGCCGACACACGCGGCTGGGGGCAATACTTCCGC TGGCCGACGGCGGAAGAGCAGGAAAACTGGATTAAGGCGATGGTGCAAACCGGCGCC AGGGCGCAGCGGGTATACGTGCTCTCGGTGCAGCAGACGTTTGACGAGGCCTGCGGT CGCGAAACCCATATTCTGGCCCCGGAAACCACCGACGGCATGCCGCGCCTGAACGAA AAGGCGATGCGGGTATACGACAACATGATCGCCGAGGCGGACAAACAGGGGCTGCGC CTGATCCTGCCGTTTATCGATCACTGGTGGTGGTGGGGCGGTCGCGAGCAGCTGGCGG CGTTCTACCACGAAAAGCCGGAGGATTTTTACCGTACCGACAGTAAAACCTTCAAGGT CTATCTTGACGTGATTCGCCAGGTTATCACCCGTACCAACAGCGTGACCGGTCGTCCTT ATTTCGACGAAAAAGCGATTATGGCCTGGGAGACCGGCAACGAACTGGAAGACACCA ACGCGGCGTTCCTTCAGCAGACCGCCGCGTGGATCAAAAAGTGGGCGCCGCATCAGC TGGTGGTCGATGGCACCTACAAGAAAATTAACGGGTTTGCGCTCAACGATCCTAATGTC GATATCGTCAGCAACCACTACTACACCAATGCCGATAACAACCATCCCGATCAGGTGAA AAAAGACCTGACGGCGGCAGCGGGTAAAAAAGTCTATATGGTGGGCGAATTCGGCCT GCTGGACGCGCAGCAGCTTAACGCCATTATGCAGTCGATCGTGCATAGCGAAGTCAAC GGCGCGCAGGCGGCGGGCGGCTTGATTTGGGGCTTCCGCGGTCATCGTCACGATGGCG GTTTCTACTGGCATAAAGAGTCCACCGGCCACTACAGCTACCATCTGCCGGGCTTCCCG ATGGAAGGTAAGGCCAATCAGGAAATGGAAGTGGTCGACCTGGTGCGGACCGCCGCG GCGCAGATGAACGGGCAGGAGAACGCGCCGCCGCTGCCGAAACCGGATGCGCCGAC GCTGCGGGCGACGGATTCACCGTTTGCTATCAACTGGCTGGGGGCGGCGGTAGGGCGC GCTTATGATGTCGAGCGCGCTGATTCGGCATCCGGGCCGTGGAAAGTGGTGGGGCGCG ATATTTCCGATGGCGTTAACGAGTGGAACCCGCAGACGATGGATCTGTTCCGCGATGAC TATCGCAGTCTGCAACTGGGGAATACGTACTATTACCGCGTCATCGCTAAAAACGAGAG CGGGAGCTCAGCGCCTTCGAACGTGATTAGCGTGAAGCACACCCAGGCGAATCAGGC GCCGGTAGTCGCGCTGGCGGAGACGCTCACCACCAGCCAGGATCAGGGCGTGCAGCT GAGCGCGAGCTGGCGCGATGACGGACTCCCGGACCGCGACGTAAAGGTGAACTGGAG CAACGGCGGCAGCGCGCAGGCTCATTTCTGCGCGACGGATAAAGCCGAAACCCGCGC CTGGTTCAGCGCCCCCGGTGAATATGCGCTGACCTTTAGCGCCGATGACGGCCTGCTC AAAAGCAGCAAAACCGTAAAGGTCACGGTGACGGAAGCCGTCGGTAAAGTCCCCGCC GACTACTGCCGTTTTGGCGGTGGGGTATTGCACGTGACCGAGGGCAAGATTGAGGCGG CGAAAAGCGAGAAAGACGCGCTGACGATTGACGAAGACGGCTTCCTCGGGCCGTTCG CCAACGACGGCGATAAGGTGAGCTGGCAGGTTTCCGCGCCGTGGGCCGGCAAGTATCT GCTGCGGGTGACGTTCAGCGGCAAATGGGGCGGCAAGAAAAACTCGTTTATTGTCAA CGGCGGCGCGCCAATCGCGGTTGAGTTCCCGCAGACCGATGAACAGGGCCAGCAGCA ACTGGTGCCGGTCGAGCTGAAGGCCGGCGATAACCGCATCGACTTCGGTAAATTCGCC GGCGACTGGGGCTATATGTTTATCAAATCGATTGAAGAGGGTGCAGAGCTCGAGCACC ACCACCACCACCACTGA

SEQ ID No.2的信息

(a)序列特征

长度：716氨基酸

类型：氨基酸

链型：单链

(b)分子类型：蛋白

序列描述：SEQ ID NO.2

MAEQSHFEHFITRDGATLKDGDKVFRFAGIHAPELHRIEDDARGTCKADTRGWGQYFRW PTAEEQENWIKAMVQTGARAQRVYVLSVQQTFDEACGRETHILAPETTDGMPRLNEKAM RVYDNMIAEADKQGLRLILPFIDHWWWWGGREQLAAFYHEKPEDFYRTDSKTFKVYLD VIRQVITRTNSVTGRPYFDEKAIMAWETGNELEDTNAAFLQQTAAWIKKWAPHQLVVDGT YKKINGFALNDPNVDIVSNHYYTNADNNHPDQVKKDLTAAAGKKVYMVGEFGLLDAQQ LNAIMQSIVHSEVNGAQAAGGLIWGFRGHRHDGGFYWHKESTGHYSYHLPGFPMEGKA NQEMEVVDLVRTAAAQMNGQENAPPLPKPDAPTLRATDSPFAINWLGAAVGRAYDVERA DSASGPWKVVGRDISDGVNEWNPQTMDLFRDDYRSLQLGNTYYYRVIAKNESGSSAPSN VISVKHTQANQAPVVALAETLTTSQDQGVQLSASWRDDGLPDRDVKVNWSNGGSAQAH FCATDKAETRAWFSAPGEYALTFSADDGLLKSSKTVKVTVTEAVGKVPADYCRFGGGVL HVTEGKIEAAKSEKDALTIDEDGFLGPFANDGDKVSWQVSAPWAGKYLLRVTFSGKWGG KKNSFIVNGGAPIAVEFPQTDEQGQQQLVPVELKAGDNRIDFGKFAGDWGYMFIKSIEEG AELEHHHHHH

实施例1葡甘聚糖酶全长基因克隆

参照基因组DNA纯化试剂盒(Thermo，LOT 00105781)操作步骤提取产酸 克雷伯菌的基因组DNA。对The National Center for Biotechnology Information (NCBI)数据库中葡甘聚糖酶基因序列进行多序列比对分析后，设计简并引物 KmanA-F:5’-GATATACATATGGCGGAGCAGTCGCACTTTGAAC-3’；KmanA-R: 5’-GTATAACTCGAGCTCTGCAACCACTTCAATCG-3’，以提取的产酸克雷伯菌的基因 组DNA为模板，扩增编码葡甘聚糖酶成熟蛋白的基因序列(不包括信号肽基因)。 PCR反应条件为：94℃2min，1个循环；94℃30s，68℃30s(每个循环降0.5℃)， 72℃2min 30s，30个循环；72℃5min，1个循环。PCR产物进行琼脂糖凝胶 电泳分析后(见图1)，对目的基因进行切胶回收，经双酶切的方法连接到原核 表达载体pET21a上后测序。

实施例2葡甘聚糖酶基因序列分析

测序结果采用GenBank数据库中的Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)分析，DNAMAN软件进行多序列比对，Vector NTI分析序列信息。

获得的葡甘聚糖酶基因(命名为KmanA)编码区长2151bp，其核苷酸序列 如SEQ IDNO 1所示。KmanA编码716个氨基酸和一个终止密码子，其氨基酸 序列如SEQ ID NO 2所示，蛋白质理论分子量为79.79kDa，预测等电点为5.60。 KmanA编码的氨基酸包含多个结构域:一个COG3934超家族结构域，一个FN3 (Fibronectin type 3)超家族结构域和一个CBM(Carbohydrate Binding Module) 6-CBM35-CBM36_Like超家族结构域。其中COG3934超家族结构域编码内切 β-1,4-甘露糖苷酶结构域；FN3结构域在细菌糖苷水解酶中也有报道；CBM6-CBM35-CBM36_Like结构域包含有CBM6、CBM35及CBM36中的部分 活性，这些结构域往往与Glycoside hydrolase(GH)催化模块有关，共同作用， 完成对葡甘聚糖的降解。

实施例3KmanA基因在大肠杆菌中的重组表达及纯化

为了便于基因的重组表达，在设计的上下游引物中分别引入NdeI和XhoI酶 切位点。将PCR清洁产物KmanA和表达载体pET21a分别用NdeI和XhoI进行 双酶切，酶切产物经清洁回收后，用T₄DNA连接酶连接(连接体系：(5μLT₄DNA Ligase 0.5μL，10×T₄DNA LigaseBuffer 0.5μL，pET21a 2μL，PCR产物2μL)， 连接条件：室温过夜连接。)。取5μL连接产物转化E.coli TOP10感受态细胞， 涂布在含100μg/mL氨苄青霉素的固体Luria-Bertani培养基上，37℃培养12-16 h。挑取单克隆，使用简并引物进行菌落PCR验证，将扩增正确的单克隆接入含 有100μg/mL氨苄青霉素的液体Luria-Bertani培养基中培养，提取质粒；使用内 切酶NdeI和XhoI对提取的质粒进行双酶切，结果正确的重组质粒送华大基因测 序。测序结果表明，在pET21a的NdeI和XhoI酶切位点之间插入了SEQ ID NO 1所示的KmanA基因，且插入方向正确，证明重组质粒构建成功，将该重组质 粒命名为pET21a-KmanA。

将pET21a-KmanA转化E.coli BL21(DE3)，对其进行诱导表达及纯化。用聚 丙烯酰胺凝胶电泳检测葡甘聚糖酶KmanA的表达及纯化情况，结果如图2所示， 纯化后的葡甘聚糖酶KmanA在电泳胶上呈单一条带，且位置与预测的分子量相 吻合。

实施例4葡甘聚糖酶KmanA的活性测定

以450μL 0.5％(w/v)的魔芋多糖为底物，加入50μL重组酶KmanA，反应 10min，采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定其活性。酶活力单位定义为:每分 钟释放1μmol还原糖(以甘露糖计)所需的酶量为一个酶活力单位(U)。蛋白浓 度使用碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒进行测定。

在最适温度和最适pH条件下，按标准方法测得KmanA的比活为60U/mg。

实施例5重组酶KmanA降解魔芋葡甘露聚糖产物分析

将0.5％(w/v)魔芋多糖与重组酶KmanA按9:1(体积比)的比例混合后， 在37℃条件下反应24h，通过Sevage法除蛋白后，对其产物进行基质辅助 激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析。如图3所示，KmanA对 魔芋多糖的降解可以生成多种聚合度的低聚糖，DP＝2-9。因此，KmanA可用于 葡甘露低聚糖的制备以及与魔芋多糖降解相关方面的研究，包括农业、食品、 饲料添加、医药及葡甘露低聚糖制备等领域。

序列表

<110> 中国科学院大连化学物理研究所

<120> 一种葡甘聚糖酶编码基因及酶和制备与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2151

<212> DNA

<213> 产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)

<400> 1

atggcggagc agtcgcactt tgaacacttt attacccgcg acggcgcgac gctaaaagac 60

ggcgacaagg ttttccgctt tgcgggcatc cacgcgccgg agctgcaccg tatcgaggac 120

gatgcgcgcg gtacctgtaa ggccgacaca cgcggctggg ggcaatactt ccgctggccg 180

acggcggaag agcaggaaaa ctggattaag gcgatggtgc aaaccggcgc cagggcgcag 240

cgggtatacg tgctctcggt gcagcagacg tttgacgagg cctgcggtcg cgaaacccat 300

attctggccc cggaaaccac cgacggcatg ccgcgcctga acgaaaaggc gatgcgggta 360

tacgacaaca tgatcgccga ggcggacaaa caggggctgc gcctgatcct gccgtttatc 420

gatcactggt ggtggtgggg cggtcgcgag cagctggcgg cgttctacca cgaaaagccg 480

gaggattttt accgtaccga cagtaaaacc ttcaaggtct atcttgacgt gattcgccag 540

gttatcaccc gtaccaacag cgtgaccggt cgtccttatt tcgacgaaaa agcgattatg 600

gcctgggaga ccggcaacga actggaagac accaacgcgg cgttccttca gcagaccgcc 660

gcgtggatca aaaagtgggc gccgcatcag ctggtggtcg atggcaccta caagaaaatt 720

aacgggtttg cgctcaacga tcctaatgtc gatatcgtca gcaaccacta ctacaccaat 780

gccgataaca accatcccga tcaggtgaaa aaagacctga cggcggcagc gggtaaaaaa 840

gtctatatgg tgggcgaatt cggcctgctg gacgcgcagc agcttaacgc cattatgcag 900

tcgatcgtgc atagcgaagt caacggcgcg caggcggcgg gcggcttgat ttggggcttc 960

cgcggtcatc gtcacgatgg cggtttctac tggcataaag agtccaccgg ccactacagc 1020

taccatctgc cgggcttccc gatggaaggt aaggccaatc aggaaatgga agtggtcgac 1080

ctggtgcgga ccgccgcggc gcagatgaac gggcaggaga acgcgccgcc gctgccgaaa 1140

ccggatgcgc cgacgctgcg ggcgacggat tcaccgtttg ctatcaactg gctgggggcg 1200

gcggtagggc gcgcttatga tgtcgagcgc gctgattcgg catccgggcc gtggaaagtg 1260

gtggggcgcg atatttccga tggcgttaac gagtggaacc cgcagacgat ggatctgttc 1320

cgcgatgact atcgcagtct gcaactgggg aatacgtact attaccgcgt catcgctaaa 1380

aacgagagcg ggagctcagc gccttcgaac gtgattagcg tgaagcacac ccaggcgaat 1440

caggcgccgg tagtcgcgct ggcggagacg ctcaccacca gccaggatca gggcgtgcag 1500

ctgagcgcga gctggcgcga tgacggactc ccggaccgcg acgtaaaggt gaactggagc 1560

aacggcggca gcgcgcaggc tcatttctgc gcgacggata aagccgaaac ccgcgcctgg 1620

ttcagcgccc ccggtgaata tgcgctgacc tttagcgccg atgacggcct gctcaaaagc 1680

agcaaaaccg taaaggtcac ggtgacggaa gccgtcggta aagtccccgc cgactactgc 1740

cgttttggcg gtggggtatt gcacgtgacc gagggcaaga ttgaggcggc gaaaagcgag 1800

aaagacgcgc tgacgattga cgaagacggc ttcctcgggc cgttcgccaa cgacggcgat 1860

aaggtgagct ggcaggtttc cgcgccgtgg gccggcaagt atctgctgcg ggtgacgttc 1920

agcggcaaat ggggcggcaa gaaaaactcg tttattgtca acggcggcgc gccaatcgcg 1980

gttgagttcc cgcagaccga tgaacagggc cagcagcaac tggtgccggt cgagctgaag 2040

gccggcgata accgcatcga cttcggtaaa ttcgccggcg actggggcta tatgtttatc 2100

aaatcgattg aagagggtgc agagctcgag caccaccacc accaccactg a 2151

<210> 2

<211> 716

<212> PRT

<213> 产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)

<400> 2

Met Ala Glu Gln Ser His Phe Glu His Phe Ile Thr Arg Asp Gly Ala

1 5 10 15

Thr Leu Lys Asp Gly Asp Lys Val Phe Arg Phe Ala Gly Ile His Ala

20 25 30

Pro Glu Leu His Arg Ile Glu Asp Asp Ala Arg Gly Thr Cys Lys Ala

35 40 45

Asp Thr Arg Gly Trp Gly Gln Tyr Phe Arg Trp Pro Thr Ala Glu Glu

50 55 60

Gln Glu Asn Trp Ile Lys Ala Met Val Gln Thr Gly Ala Arg Ala Gln

65 70 75 80

Arg Val Tyr Val Leu Ser Val Gln Gln Thr Phe Asp Glu Ala Cys Gly

85 90 95

Arg Glu Thr His Ile Leu Ala Pro Glu Thr Thr Asp Gly Met Pro Arg

100 105 110

Leu Asn Glu Lys Ala Met Arg Val Tyr Asp Asn Met Ile Ala Glu Ala

115 120 125

Asp Lys Gln Gly Leu Arg Leu Ile Leu Pro Phe Ile Asp His Trp Trp

130 135 140

Trp Trp Gly Gly Arg Glu Gln Leu Ala Ala Phe Tyr His Glu Lys Pro

145 150 155 160

Glu Asp Phe Tyr Arg Thr Asp Ser Lys Thr Phe Lys Val Tyr Leu Asp

165 170 175

Val Ile Arg Gln Val Ile Thr Arg Thr Asn Ser Val Thr Gly Arg Pro

180 185 190

Tyr Phe Asp Glu Lys Ala Ile Met Ala Trp Glu Thr Gly Asn Glu Leu

195 200 205

Glu Asp Thr Asn Ala Ala Phe Leu Gln Gln Thr Ala Ala Trp Ile Lys

210 215 220

Lys Trp Ala Pro His Gln Leu Val Val Asp Gly Thr Tyr Lys Lys Ile

225 230 235 240

Asn Gly Phe Ala Leu Asn Asp Pro Asn Val Asp Ile Val Ser Asn His

245 250 255

Tyr Tyr Thr Asn Ala Asp Asn Asn His Pro Asp Gln Val Lys Lys Asp

260 265 270

Leu Thr Ala Ala Ala Gly Lys Lys Val Tyr Met Val Gly Glu Phe Gly

275 280 285

Leu Leu Asp Ala Gln Gln Leu Asn Ala Ile Met Gln Ser Ile Val His

290 295 300

Ser Glu Val Asn Gly Ala Gln Ala Ala Gly Gly Leu Ile Trp Gly Phe

305 310 315 320

Arg Gly His Arg His Asp Gly Gly Phe Tyr Trp His Lys Glu Ser Thr

325 330 335

Gly His Tyr Ser Tyr His Leu Pro Gly Phe Pro Met Glu Gly Lys Ala

340 345 350

Asn Gln Glu Met Glu Val Val Asp Leu Val Arg Thr Ala Ala Ala Gln

355 360 365

Met Asn Gly Gln Glu Asn Ala Pro Pro Leu Pro Lys Pro Asp Ala Pro

370 375 380

Thr Leu Arg Ala Thr Asp Ser Pro Phe Ala Ile Asn Trp Leu Gly Ala

385 390 395 400

Ala Val Gly Arg Ala Tyr Asp Val Glu Arg Ala Asp Ser Ala Ser Gly

405 410 415

Pro Trp Lys Val Val Gly Arg Asp Ile Ser Asp Gly Val Asn Glu Trp

420 425 430

Asn Pro Gln Thr Met Asp Leu Phe Arg Asp Asp Tyr Arg Ser Leu Gln

435 440 445

Leu Gly Asn Thr Tyr Tyr Tyr Arg Val Ile Ala Lys Asn Glu Ser Gly

450 455 460

Ser Ser Ala Pro Ser Asn Val Ile Ser Val Lys His Thr Gln Ala Asn

465 470 475 480

Gln Ala Pro Val Val Ala Leu Ala Glu Thr Leu Thr Thr Ser Gln Asp

485 490 495

Gln Gly Val Gln Leu Ser Ala Ser Trp Arg Asp Asp Gly Leu Pro Asp

500 505 510

Arg Asp Val Lys Val Asn Trp Ser Asn Gly Gly Ser Ala Gln Ala His

515 520 525

Phe Cys Ala Thr Asp Lys Ala Glu Thr Arg Ala Trp Phe Ser Ala Pro

530 535 540

Gly Glu Tyr Ala Leu Thr Phe Ser Ala Asp Asp Gly Leu Leu Lys Ser

545 550 555 560

Ser Lys Thr Val Lys Val Thr Val Thr Glu Ala Val Gly Lys Val Pro

565 570 575

Ala Asp Tyr Cys Arg Phe Gly Gly Gly Val Leu His Val Thr Glu Gly

580 585 590

Lys Ile Glu Ala Ala Lys Ser Glu Lys Asp Ala Leu Thr Ile Asp Glu

595 600 605

Asp Gly Phe Leu Gly Pro Phe Ala Asn Asp Gly Asp Lys Val Ser Trp

610 615 620

Gln Val Ser Ala Pro Trp Ala Gly Lys Tyr Leu Leu Arg Val Thr Phe

625 630 635 640

Ser Gly Lys Trp Gly Gly Lys Lys Asn Ser Phe Ile Val Asn Gly Gly

645 650 655

Ala Pro Ile Ala Val Glu Phe Pro Gln Thr Asp Glu Gln Gly Gln Gln

660 665 670

Gln Leu Val Pro Val Glu Leu Lys Ala Gly Asp Asn Arg Ile Asp Phe

675 680 685

Gly Lys Phe Ala Gly Asp Trp Gly Tyr Met Phe Ile Lys Ser Ile Glu

690 695 700

Glu Gly Ala Glu Leu Glu His His His His His His

705 710 715

Claims (8)

1.一种葡甘聚糖酶基因，其核苷酸序列为：

1）序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；或

2）编码SEQ ID NO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列。

2.一种权利要求1所述的葡甘聚糖酶基因编码的葡甘聚糖酶，其特征在于：其氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO.2从氨基端开始的第1-716位氨基酸残基序列。

3.一种权利要求2所述的葡甘聚糖酶的制备方法，其特征在于：将葡甘聚糖酶基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的葡甘聚糖酶；

上述葡甘聚糖酶基因，其核苷酸序列为如下中的一种或二种：

1）序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

2）编码SEQ ID NO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列。

4.按照权利要求3所述的制备方法，其特征在于：

所述的重组表达葡甘聚糖酶的表达载体，是指大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体中的一种或二种以上。

5.按照权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述宿主细胞，即用于重组表达葡甘聚糖酶的重组菌或转基因细胞系，是指大肠杆菌宿主细胞、枯草杆菌宿主细胞、乳酸菌宿主细胞、放线菌宿主细胞、丝状真菌宿主细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞中的一种。

6.一种权利要求2所述的葡甘聚糖酶在降解魔芋多糖中的应用。

7.按照权利要求6所述的应用，其特征在于：包括以下应用中的一种或二种：

1）在断裂魔芋多糖的糖苷键，获得单糖或葡甘露寡糖中的应用；

2）在断裂甘露聚糖的糖苷键，获得单糖或甘露寡糖中的应用；

3）与其他葡甘露聚糖酶混合后，在协同断裂葡甘露聚糖糖苷键方面的应用。

8.一种权利要求2所述的葡甘聚糖酶在降解含有甘露聚糖连接的底物中的应用。

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