CN113528490A

CN113528490A - 一种几丁质酶、其编码基因及应用

Info

Publication number: CN113528490A
Application number: CN202110631763.6A
Authority: CN
Inventors: 周梅先; 易恩; 邵宗泽; 粱小波
Original assignee: Kunming University of Science and Technology; Third Institute of Oceanography MNR
Current assignee: Kunming University of Science and Technology; Third Institute of Oceanography MNR
Priority date: 2021-06-07
Filing date: 2021-06-07
Publication date: 2021-10-22
Anticipated expiration: 2041-06-07
Also published as: CN113528490B

Abstract

本发明公开了一种几丁质酶、其编码基因及应用。本发明以弧菌Vibrio sp.MCCC1A18305的基因组DNA为模板，设计并合成引物，通过PCR扩增几丁质酶基因，将该基因克隆入pET‑22b表达载体上，在大肠杆菌E.coli BL21中进行诱导表达，采用Ni‑Sepharose亲和层析纯化得到较高纯度的重组几丁质酶蛋白。该酶最适pH为6.5，最适温度为50℃，在40～50℃、pH 5.5～6.5范围内酶活性较好；在40℃和45℃下保温12h后酶活力仍无明显降低；Ca²⁺和K⁺对该酶活性具有明显促进作用；该酶对胶体几丁质具有良好的底物特异性，其水解终产物主要是二糖和单糖，是一种外切型几丁质酶，可用于几丁质资源的开发利用和几丁寡糖的制备。

Description

一种几丁质酶、其编码基因及应用

技术领域

本发明涉及采用基因工程手段获得一种几丁质酶及其制备方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

几丁质是由N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)通过β-1,4糖苷键连接形成的高聚物，在自然界中的含量仅次于纤维素。几丁质广泛存在于多种生物体中，如足纲动物的外骨骼、甲壳类动物外壳、真菌细胞壁等，是一种非常丰富的自然资源。全球生物生命活动每年会产生大约100亿吨的几丁质，其中海洋中每年可生物合成几丁质约10亿吨，虾和蟹作为海洋中最常见的甲壳类生物，它们的外壳中含有丰富的几丁质，是海洋几丁质的主要来源之一。天然几丁质性质稳定、溶解性差，不易被直接利用。尤其近年来，海水养殖和淡水养殖虾蟹快速发展使得几丁质产量剧增，餐桌残留几丁质未被充分利用而造成资源浪费，大量几丁质堆积还造成严重的环境污染问题。几丁寡糖是几丁质降解后形成的低聚合度(DP<10)的寡糖，因其具有良好的抗肿瘤、抗炎症、抗病毒以及抗菌功能而广泛应用于医药行业。此外，几丁寡糖因其能够提升机体免疫力、细胞修复、促进肠道益生菌增殖和抗氧化功能而被应用于食品和保健品行业。在农业中，几丁寡糖也被用作植物生长促进因子，增强植物抵抗力。目前降低几丁质聚合程度的方法主要是化学法和生物酶法，但是化学方法成本高，污染大且产物质量不稳定，最终的产率低而高耗能。而生物酶法降解难溶几丁质是一种较其它化学和物理方法更加安全可靠的一种措施，采用此法得到的低聚糖产物纯度更高，结构稳定，且不会造成环境危害。微生物中含有丰富的几丁质酶资源，微生物几丁质酶分为内切型和外切型两种，可将几丁质降解为不同聚合度的几丁寡糖，利用微生物几丁质酶降解几丁质生产几丁寡糖具有非常重要的实际意义。

发明内容

本发明的主要目的是针对现有技术的不足，提供一种几丁质酶(命名为VBCH01)。

编码该酶的核苷酸序列如下：(SEQ ID NO:1)

其中5’端66bp片段为编码信号肽序列。

该酶的氨基酸序列如下：(SEQ ID NO:2)

其中，N端22个氨基酸为信号肽序列。

本发明的另一目的，在于提供一种几丁质酶的制备方法，它包括如下步骤：

(1)基于弧菌(Vibrio sp.MCCC 1A18305)基因组测序数据分析获得几丁质酶基因VBCH01。

(2)设计并合成扩增去除信号肽编码序列的几丁质酶基因VBCH01的引物，其序列如下：

上游引物VBCH01F:5’-CGCGGATCCGCCTTCAGCTCCGTCAATCGA-3’(SEQ ID NO:3)

下游引物VBCH01R:5’-CCGCTCGAGAGGCGTCTGGCACTCGGCC-3’(SEQ ID NO:4)。

(3)PCR扩增及重组质粒的构建：

用VBCH01F和VBCH01R引物，以弧菌(Vibrio sp.MCCC 1A18305)的基因组DNA为模板进行扩增。PCR扩增条件如下：95℃预变性4min；95℃解链30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环。PCR产物经限制性内切酶BamHI和XhoI酶切后被连接到经同样限制性内切酶酶切的表达载体pET-22b上，将连接产物转化大肠杆菌Escherichia coli TOP10受体菌株，筛选含有几丁质酶基因的重组质粒，并进行双酶切和测序验证。

(4)几丁质酶的表达与纯化：

将含有几丁质酶基因的重组质粒转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)受体菌株，用IPTG诱导几丁质酶蛋白表达，利用Ni Sepharose^TM6Fast Flow试剂盒纯化蛋白。纯化后的几丁质酶的SDS-PAGE电泳检测结果如图1所示。

本发明提供了一种几丁质酶，该酶最适pH为6.5左右，最适温度为50℃左右，在50℃下保温10min能保持90％左右的酶活力，在40℃和45℃下保温12h后酶活力仍无明显降低；Ca²⁺和K⁺对该酶活性具有明显促进作用；该酶对胶体几丁质具有良好的底物特异性，其水解终产物主要是二糖和单糖，是一种外切型几丁质酶。

附图说明

图1为纯化后的酶蛋白的SDS-PAGE电泳；

图2为不同pH对酶活力的影响；

图3为不同温度对酶活力的影响；

图4为酶在不同温度条件下的稳定性检测；

图5为不同金属离子和有机溶剂对酶活力的影响；

图6为酶对不同底物水解作用的效果；

图7为酶的水解产物分析

具体实施方式

实施例1几丁质酶的制备

步骤如下：

实验材料

弧菌Vibrio sp.MCCC 1A18305(来源于中国海洋微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为1A18305，可通过购买方式得到)，大肠杆菌E.coli TOP10、大肠杆菌E.coil BL21(DE3)和表达载体pET-22b(购自Novagen公司)；细菌基因组DNA提取试剂盒(购自厦门精聚公司)；DNA聚合酶(购自全式金公司)；限制性内切酶BamHI、XhoI和T4连接酶(购自Takara公司)；LB培养基(每升含蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl 10g)；结合缓冲液(500mM NaCl,20mM磷酸氢二钠，20mM咪唑，pH 7.4)；漂洗缓冲液(500mM NaCl,20mM磷酸氢二钠，50mM咪唑，pH 7.4)；洗脱缓冲液(500mM NaCl,20mM磷酸氢二钠，500mM咪唑，pH 7.4)；1×PBS缓冲液(10mM磷酸盐，pH 7.2～7.4)；3，5－二硝基水杨酸(DNS)、氨苄青霉素和溶菌酶(购自上海生工)；Ni Sepharose^TM6Fast Flow试剂盒(购自美国GE公司)；透析袋MD25(购自北京索莱宝公司)；几丁质和羧甲基纤维素(购自Sigma公司)，壳聚糖(购自上海国药)。本发明中使用的含氨苄青霉素的LB培养基，其氨苄青霉素浓度均为100μg/mL。

实验步骤

(1)基于VBCH01全长序列，设计并合成扩增去除信号肽编码序列的几丁质酶基因VBCH01的引物，其序列如下：

上游引物VBCH01F:5’-CGCGGATCCGCCTTCAGCTCCGTCAATCGA-3’

下游引物VBCH01R:5’-CCGCTCGAGAGGCGTCTGGCACTCGGCC-3’

(2)PCR扩增及重组质粒的构建

利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取弧菌Vibrio sp.MCCC 1A18305的基因组DNA。以弧菌Vibrio sp.MCCC 1A18305基因组DNA为模板，使用VBCH01F和VBCH01R引物进行扩增。扩增体系(50μL)如下：VBCH01F(10μM)1μL，VBCH01R(10μM)1μL，10×Pfu PCR Buffer 5μL，dNTPMix(2.5mM)4μL，基因组DNA 2μL，Pfu DNA Polymerase 0.25μL，ddH₂O 36.75μL。扩增条件如下：95℃预变性4min；95℃30s，58℃30s，72℃2min，30个循环。将PCR产物进行胶回收，对pET-22b载体及相应的目的片段用限制性内切酶BamHI和XhoI进行酶切后，用T4连接酶进行连接；将连接产物与受体菌E.coli Top10感受态混合，冰上放置30min，42℃热激90s后，加入950μL LB液体培养基，37℃、100rpm复苏45min，离心后涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养，筛选重组质粒，并对重组质粒进行双酶切和测序验证，获得去掉N-端信号肽的几丁质酶的相关核苷酸序列。

(3)基因的诱导表达及粗酶液的制备

将重组质粒转化入E.coli BL21(DE3)中，获得含有几丁质酶基因的重组菌株。将重组菌株接种于含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中过夜培养，按1:100接种于500mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、250rpm培养至OD₆₀₀为0.6～0.8左右，加入IPTG使其终浓度为1mmol/L进行诱导，20℃、200rpm条件下诱导表达12～16h，5000rpm离心10min收集菌体。将菌体重悬于30ml结合缓冲液中，加入适量溶菌酶于4℃静置裂解细胞壁后进行超声破碎细胞，超声破碎工作/间隙时间为3s/5s，待细胞破碎完成后于4℃、10000rpm离心20min分离上清液和沉淀，收集上清即得到粗酶液。

(4)酶的纯化

将制备的粗酶液加入至预先平衡好的Ni Sepharose^TM6Fast Flow柱料，4℃混匀2h，然后将柱料和上清液混合物转移至纯化柱中，利用重力沉降分离柱料和上清液。之后用4ml漂洗缓冲液漂洗柱料3～4次，漂洗结束后用4mL的洗脱缓冲液洗脱4～5次，分管收集洗脱液，对洗脱液进行SDS-PAGE电泳检测其纯度。利用MD25透析袋，用1×PBS缓冲液对洗脱液进行过夜透析以去除咪唑和高浓度的NaCl，获得纯化好的酶液。

实施例2几丁质酶的酶学性质

(1)几丁质酶活性测定方法

胶体几丁质制备：称取30.0g几丁质粉加入300mL浓盐酸中，搅拌均匀，然后加入500mL去离子水，搅拌均匀后于4℃静置24h，待几丁质自然沉淀之后，取出上清收集沉淀。用去离子水反复重悬沉淀、离心收集，去除胶体几丁质上多余的盐酸，直至pH值约为7.0左右，4℃保藏备用。

采用DNS法测定还原糖含量。将20μL稀释的酶液和200μL 1％胶体几丁质底物混合，在50℃条件下反应2h。反应完成后加入500μL DNS试剂，煮沸5min，立即置于冰水中冷却，短暂离心后取上清，测定OD₅₄₀值(以灭活酶液作为对照)，根据标准曲线计算还原糖量和酶活力。酶活力单位定义：在上述测定条件下，每分钟生成1μmol还原糖所需酶量定义为一个酶活力单位(U)。

(2)酶的作用pH

将稀释的酶液在50℃下，以不同缓冲液(100mM Na-acetate缓冲液，pH 3.5～6.0；100mM Na-phosphate缓冲液，pH 6.0～8.0；100mM Tris-HCl缓冲液，pH 7.0～9.0；100mMGlycine-NaOH，pH 9.0～10.0)配制的1％的胶体几丁质作为底物进行酶活测定，以最大酶活力为100％，计算不同pH下该酶的相对活力。结果表明，该酶的最适pH为6.5，在pH 5.5～6.5范围内酶活性较高，酶活力能够达到80％以上，当pH值大于6.5时酶活力明显下降，结果见图2。

(3)酶的作用温度

将稀释的酶液在20～60℃范围内，以100mM Na-phosphate(pH 6.5)缓冲液配制的1％的胶体几丁质作为底物进行酶活测定，以最大酶活力为100％，计算不同温度下的相对酶活力。结果表明，在pH为6.5时，该几丁质酶的最适反应温度为50℃，在40～50℃范围内酶活力较高，结果见图3。

(4)酶在不同温度条件下的稳定性

将酶液在不同温度(40℃、45℃、50℃)下保温，40℃和45℃下每隔2h取一次样，50℃下每10min取一次样，取样后与Na-phosphate(pH 6.5)缓冲液配制的1％的胶体几丁质反应进行酶活测定，以未经处理的酶的活力为100％，计算不同处理的酶的相对活力。结果表明，该酶在40℃和45℃条件下保温12h后，酶活力无明显降低；在50℃下保温10min后，酶活力保持90％左右，在50℃下保温20min分钟后，酶活力仍保留60％左右，结果见图4。

(5)金属离子及有机溶剂对酶活力的影响

在50℃、pH 6.5条件下，在反应体系中分别加入终浓度为1mM/1％(V/V)或5mM/5％(V/V)的不同金属离子和有机溶剂，然后测定酶活，以未添加任何金属离子或有机溶剂条件下的相对酶活力为100％，计算不同金属离子和有机溶剂影响下的酶的相对活力。结果表明，Ca²⁺对该酶活性具有明显促进作用，k⁺对酶活力也具有促进作用；较低浓度的Mg²⁺能够提升该酶活力，较高浓度的Mg²⁺则呈现出抑制作用；Fe²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺和EDTA能够显著减低VBCH01的酶活力，较高浓度的离子比低浓度离子的抑制效果更加明显；尿素对该酶活性影响不大；SDS几乎完全抑制该酶活性；其它有机溶剂对该酶活力均呈现出抑制作用，且浓度越高抑制效果越明显，结果见图5。

(6)酶的底物特异性

在50℃、pH 6.5条件下，分别以1％的胶体几丁质、粉末几丁质、壳聚糖和羧甲基纤维素为底物进行酶活测定，以最大酶活力为100％，计算几丁质酶水解不同底物的相对活力。结果表明该酶对胶体几丁质具有明显的水解活性，对其它三种底物水解活性极低或几乎没有活性，结果见图6。

(7)水解产物分析

采用薄层层析(TLC)法分析几丁质酶产物。将纯酶加入用不同pH缓冲液(Na-acetate缓冲液，pH 5.5和pH 6；Na-phosphate缓冲液，pH 6、pH 6.5、pH 7和pH 7.5；Tris-HCl缓冲液，pH 7)分别配制的1％胶体几丁质中，在50℃下完全反应72h，取反应上清进行薄层层析分析。展层剂为正丁醇：甲醇：25％氨水：水＝5:4:2:1(V:V:V:V)，显色剂为苯胺：二苯胺：丙酮：85％磷酸＝1:1:50:7.5(W:V:V:V)。结果显示，在Na-acetate和Tris-HCl缓冲液中，该酶水解胶体几丁质的最终产物主要是几丁二糖，该酶仅在pH 6的Na-phosphate缓冲液中水解终产物为几丁单糖，而在pH 6.5、pH 7和pH 7.5的Na-phosphate缓冲液中水解终产物为几丁二糖，结果见图7。上述结果显示该酶属于一种外切型几丁质酶。

序列表

<110> 昆明理工大学

自然资源部第三海洋研究所

<120> 一种几丁质酶、其编码基因及应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2538

<212> DNA

<213> 弧菌(Vibrio sp. MCCC 1A18305)

<400> 1

atgaatcgca tcactctgtg cgcggcaggt attgcactgg caatgtccgg agcggtaatt 60

gctgcacctt cagctccgtc aatcgatctt tatggctcaa acaatcttca gttttccaag 120

attgaactgg cgatggaaac aacagcgggc tatgacagta tggttcagta ccatgatcag 180

gcccctgttt cgatagtgtt taatcagtgg agcggggaaa ccggcgacac ctacaaaatc 240

tattttgacg gagaggaagt ggcctccggc cccatttccg gcagtcagac gacagccagc 300

tttacctatg gcaaaggcgg acgttatcaa ctggaagtgg aagcctgcga cgccggcgga 360

tgcagcagaa gtgcgccggc tgagctggtt attgctgata cagacggctc ctacctgcca 420

cccctgccga tgaatgtcga tcccaataac aagacttata ccacaccaga agggacagtg 480

gtgggggctt attttgtgga gtggggcatt tacggacgtg attttacggt tgataaaatt 540

ccggctcaga acctgaccca tatactgtat ggatttatcc ctatctgtgg cccgaatgaa 600

tccctgaaat cggtaggcgg taacagttac aatgcgctga tgacggcatg ccagggtatg 660

aaagattatc aggtcgttat tcatgatccc tgggcggcct atcagaaaag ttttcctcag 720

gccgggcatg aatacggttc accaatcaag gggaactacg ccatgctgat ggcactgaag 780

cagcgttatc ccgatttgaa aattatcccg tcagtcggtg gctggaccct ttctgatcct 840

ttctttgatt tcaccaccaa agccaaccgg gataccttcg ttgcttcagt gaaaaaattc 900

ctgcagacct ggaagttttt cgatggtgtg gatattgact gggagttccc gggtgggggt 960

ggtgccgccc cgggtctggg tgatccggtt aaggacggcc cggcctatgt ggtccttatg 1020

caggaactgc ggacaatgct ggacgaactg ggagccgata ccggccgccg gtacgagctg 1080

acatccgcca tcggcgttgg ctatgacaag attgaagatg tgaattatgc cgatgcggtg 1140

cagtacatgg attacatctt cgccatgacc tacgactttt atggcggctg gaataacgtc 1200

cccggccatc agacggcgct gtattgcggc tcttttatgc gccccgggca gtgtgacgga 1260

accggcaccg atgagaatgg tgaagcgtac aaaggcccgg cttatacgac ggataacggc 1320

attcggcttc tgcttgcaca aggggtgccg ccaagtaagc tggtggtcgg tacggctatg 1380

tatggccgtg gctggacggg agtgaaacct gactctttgt ctgatcccgg cgatccgatg 1440

accggtgtgg gtaatggtaa actgaccggc accacagctc agggagtctg ggaagacggc 1500

gtcatcgact acaaagggat taaaacctac atgctgggtg ccgacaaatc cggggtcaac 1560

gggtttgagt atggttacga tgaacaggca caggcgccat gggtctggaa tcgtaccacc 1620

ggggatctgg ttacctttga cgatgaccgt tctgctatag cgaaaggcgc ctatgttcgt 1680

agtctgggtc tggccggtct gtttgcctgg gaaatcgatg ccgacaacgg tgatatcctc 1740

aatgctatgc atgacggcct tgccggtggt gcagcagaga accaggcacc ggttgccaat 1800

gctggtctgg ctcagaccgt tgaagggcct gcaacagtga cgctggatgg cagcctttcg 1860

aaggacagtg atggttccat tgccgcatac tcctgggtac agacctccgg aatggcggtg 1920

atcctgacgg gagccgatca ggctcacgcg aatttctcag ttgccgaagt cagccagaaa 1980

gagacgctgg tatttactct gacagtgacg gataacaaag gcgccacggc cagtgactca 2040

gtcaccatta tcgttaatcc gaaaggaacc ggccccgtca atacaccacc ggtggcagca 2100

gtatctgctc cggcagaagt tacggcgggt cagactgtca cagtggacgc ttcaggatcg 2160

tctgacgctg ataatgatcc cctgactttc agctggaacc tgccagaggc tctgcacgca 2220

acggtaaatg gtgctgtggt cagctttacg gcaccggaat acagcgccga tacgactctg 2280

acatttaccg taacagtcag cgatggctcg gcatcgggca gtgcgtctgc ctctgtcgtg 2340

gtgctgaaag cctcggggaa tggcgaaacc tgtaccaatc tgtgggattc atccgcagtc 2400

tataacggtg gggatcaggt aagctgggcc ggtaaagtat gggaagccaa gtggtggact 2460

cagggggatg atccgagtca gtccggcgac tggggtgtct ggaaagaggt tggtccggcc 2520

gagtgccaga cgccttaa 2538

<210> 2

<211> 845

<212> PRT

<213> 弧菌(Vibrio sp. MCCC 1A18305)

<400> 2

Met Asn Arg Ile Thr Leu Cys Ala Ala Gly Ile Ala Leu Ala Met Ser

1 5 10 15

Gly Ala Val Ile Ala Ala Pro Ser Ala Pro Ser Ile Asp Leu Tyr Gly

20 25 30

Ser Asn Asn Leu Gln Phe Ser Lys Ile Glu Leu Ala Met Glu Thr Thr

35 40 45

Ala Gly Tyr Asp Ser Met Val Gln Tyr His Asp Gln Ala Pro Val Ser

50 55 60

Ile Val Phe Asn Gln Trp Ser Gly Glu Thr Gly Asp Thr Tyr Lys Ile

65 70 75 80

Tyr Phe Asp Gly Glu Glu Val Ala Ser Gly Pro Ile Ser Gly Ser Gln

85 90 95

Thr Thr Ala Ser Phe Thr Tyr Gly Lys Gly Gly Arg Tyr Gln Leu Glu

100 105 110

Val Glu Ala Cys Asp Ala Gly Gly Cys Ser Arg Ser Ala Pro Ala Glu

115 120 125

Leu Val Ile Ala Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Leu Pro Pro Leu Pro Met

130 135 140

Asn Val Asp Pro Asn Asn Lys Thr Tyr Thr Thr Pro Glu Gly Thr Val

145 150 155 160

Val Gly Ala Tyr Phe Val Glu Trp Gly Ile Tyr Gly Arg Asp Phe Thr

165 170 175

Val Asp Lys Ile Pro Ala Gln Asn Leu Thr His Ile Leu Tyr Gly Phe

180 185 190

Ile Pro Ile Cys Gly Pro Asn Glu Ser Leu Lys Ser Val Gly Gly Asn

195 200 205

Ser Tyr Asn Ala Leu Met Thr Ala Cys Gln Gly Met Lys Asp Tyr Gln

210 215 220

Val Val Ile His Asp Pro Trp Ala Ala Tyr Gln Lys Ser Phe Pro Gln

225 230 235 240

Ala Gly His Glu Tyr Gly Ser Pro Ile Lys Gly Asn Tyr Ala Met Leu

245 250 255

Met Ala Leu Lys Gln Arg Tyr Pro Asp Leu Lys Ile Ile Pro Ser Val

260 265 270

Gly Gly Trp Thr Leu Ser Asp Pro Phe Phe Asp Phe Thr Thr Lys Ala

275 280 285

Asn Arg Asp Thr Phe Val Ala Ser Val Lys Lys Phe Leu Gln Thr Trp

290 295 300

Lys Phe Phe Asp Gly Val Asp Ile Asp Trp Glu Phe Pro Gly Gly Gly

305 310 315 320

Gly Ala Ala Pro Gly Leu Gly Asp Pro Val Lys Asp Gly Pro Ala Tyr

325 330 335

Val Val Leu Met Gln Glu Leu Arg Thr Met Leu Asp Glu Leu Gly Ala

340 345 350

Asp Thr Gly Arg Arg Tyr Glu Leu Thr Ser Ala Ile Gly Val Gly Tyr

355 360 365

Asp Lys Ile Glu Asp Val Asn Tyr Ala Asp Ala Val Gln Tyr Met Asp

370 375 380

Tyr Ile Phe Ala Met Thr Tyr Asp Phe Tyr Gly Gly Trp Asn Asn Val

385 390 395 400

Pro Gly His Gln Thr Ala Leu Tyr Cys Gly Ser Phe Met Arg Pro Gly

405 410 415

Gln Cys Asp Gly Thr Gly Thr Asp Glu Asn Gly Glu Ala Tyr Lys Gly

420 425 430

Pro Ala Tyr Thr Thr Asp Asn Gly Ile Arg Leu Leu Leu Ala Gln Gly

435 440 445

Val Pro Pro Ser Lys Leu Val Val Gly Thr Ala Met Tyr Gly Arg Gly

450 455 460

Trp Thr Gly Val Lys Pro Asp Ser Leu Ser Asp Pro Gly Asp Pro Met

465 470 475 480

Thr Gly Val Gly Asn Gly Lys Leu Thr Gly Thr Thr Ala Gln Gly Val

485 490 495

Trp Glu Asp Gly Val Ile Asp Tyr Lys Gly Ile Lys Thr Tyr Met Leu

500 505 510

Gly Ala Asp Lys Ser Gly Val Asn Gly Phe Glu Tyr Gly Tyr Asp Glu

515 520 525

Gln Ala Gln Ala Pro Trp Val Trp Asn Arg Thr Thr Gly Asp Leu Val

530 535 540

Thr Phe Asp Asp Asp Arg Ser Ala Ile Ala Lys Gly Ala Tyr Val Arg

545 550 555 560

Ser Leu Gly Leu Ala Gly Leu Phe Ala Trp Glu Ile Asp Ala Asp Asn

565 570 575

Gly Asp Ile Leu Asn Ala Met His Asp Gly Leu Ala Gly Gly Ala Ala

580 585 590

Glu Asn Gln Ala Pro Val Ala Asn Ala Gly Leu Ala Gln Thr Val Glu

595 600 605

Gly Pro Ala Thr Val Thr Leu Asp Gly Ser Leu Ser Lys Asp Ser Asp

610 615 620

Gly Ser Ile Ala Ala Tyr Ser Trp Val Gln Thr Ser Gly Met Ala Val

625 630 635 640

Ile Leu Thr Gly Ala Asp Gln Ala His Ala Asn Phe Ser Val Ala Glu

645 650 655

Val Ser Gln Lys Glu Thr Leu Val Phe Thr Leu Thr Val Thr Asp Asn

660 665 670

Lys Gly Ala Thr Ala Ser Asp Ser Val Thr Ile Ile Val Asn Pro Lys

675 680 685

Gly Thr Gly Pro Val Asn Thr Pro Pro Val Ala Ala Val Ser Ala Pro

690 695 700

Ala Glu Val Thr Ala Gly Gln Thr Val Thr Val Asp Ala Ser Gly Ser

705 710 715 720

Ser Asp Ala Asp Asn Asp Pro Leu Thr Phe Ser Trp Asn Leu Pro Glu

725 730 735

Ala Leu His Ala Thr Val Asn Gly Ala Val Val Ser Phe Thr Ala Pro

740 745 750

Glu Tyr Ser Ala Asp Thr Thr Leu Thr Phe Thr Val Thr Val Ser Asp

755 760 765

Gly Ser Ala Ser Gly Ser Ala Ser Ala Ser Val Val Val Leu Lys Ala

770 775 780

Ser Gly Asn Gly Glu Thr Cys Thr Asn Leu Trp Asp Ser Ser Ala Val

785 790 795 800

Tyr Asn Gly Gly Asp Gln Val Ser Trp Ala Gly Lys Val Trp Glu Ala

805 810 815

Lys Trp Trp Thr Gln Gly Asp Asp Pro Ser Gln Ser Gly Asp Trp Gly

820 825 830

Val Trp Lys Glu Val Gly Pro Ala Glu Cys Gln Thr Pro

835 840 845

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

CGCGGATCCG CCTTCAGCTC CGTCAATCGA 30

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

CCGCTCGAGA GGCGTCTGGC ACTCGGCC 28

Claims

1.一种表达几丁质酶的基因序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种表达几丁质酶的基因序列，其特征在于，其由权利要求1所述的几丁质酶的基因序列去除其5’端66bp片段得到。

3.一种重组载体，其含有权利要求1或2所述的一种表达几丁质酶的基因序列。

4.一种重组菌，其含有权利要求3所述的重组载体。

5.一种几丁质酶，其特征在于：其蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。

6.一种几丁质酶，其特征在于：其由权利要求5所述的几丁质酶的蛋白序列去除其N端22个氨基酸得到。

7.如权利要求5或6所述的几丁质酶的用途，其用于自然界几丁质资源利用和几丁寡糖制备。

8.如权利要求5或6所述的几丁质酶的使用方法，使用时的pH为5.5～6.5，温度为40～50℃。

9.如权利要求5或6所述的几丁质酶的使用方法，使用时添加Ca²⁺和K⁺，促进酶活性。

10.如权利要求5或6所述的几丁质酶的使用方法，以胶体几丁质作为底物。