CN110495549B - 一种β-葡聚糖酶及其在抑制赭曲霉中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种β‑葡聚糖酶及其在抑制赭曲霉中的应用。本发明通过筛选枯草芽孢杆菌CW14的代谢产物中发挥赭曲霉拮抗作用的组分，发现β‑葡聚糖酶具有较高的拮抗赭曲霉的活性。通过在待处理样品中添加β‑葡聚糖酶能够显著抑制赭曲霉的产生和生长，极大地降低霉变和毒素污染风险。本发明还通过优化表达系统实现了重组β‑葡聚糖酶的高效异源表达，为获得大量的重组β‑葡聚糖酶提供了有效方法。β‑葡聚糖酶可以在实践中用于农产品的赭曲霉及其毒素的污染防控。

Description

一种β-葡聚糖酶及其在抑制赭曲霉中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种β-葡聚糖酶及其在抑制赭曲霉中的应用。
背景技术
赭曲霉(Aspergillus ochraceus)作为引起农产品霉变的重要真菌之一，可在粮油作物的生长、收获、运输、贮藏以及加工等各个环节引起霉变，并造成不可避免的经济损失；其产生的次级代谢产物赭曲霉毒素(Ochratoxin A，OTA)的毒性强、污染广泛，对人类和动物健康危害严重。而微生物法因其具有高效、低毒、特异性强、环境友好的特点成为极具应用前景的减少霉菌污染的策略，因此，开发利用拮抗菌或其代谢物抑制产毒真菌的生长来防控霉变及毒素污染的方法具有重要意义。
曲霉属的细胞壁的纤维核心由β-1,3-葡聚糖和几丁质等组成，其中，β-1,3-/β-1,4-葡聚糖和β-1,5-半乳糖-α-1,2-/α-1,6-甘露聚糖(GM)是共价结合的。β-葡聚糖酶在植物中含量丰富，在细胞分裂、通过胞间连丝运输物质和抵抗非生物胁迫中发挥关键作用。目前已经研究了β-1,3-葡聚糖酶对小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)和烟草赤星病菌(Ahernaria longipes)的生长均具有抑制作用；对黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporumf.sp.cucumerinum)病原菌的孢子萌发和芽管伸长都有一定程度的抑制作用；对大豆疫霉菌菌丝生长和孢子萌发均有一定的抑制作用。然而，目前尚没有关于β-葡聚糖酶在抑制赭曲霉生长方面的研究报道。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种具有抑制赭曲霉功能的β-葡聚糖酶以及该酶在拮抗赭曲霉中的应用。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明通过研究枯草芽孢杆菌CW14(Bacillus subtilis CW14)与OTA产生菌A.ochraceus AS 3.4412的相互作用，发现枯草芽孢杆菌CW14能够抑制A.ochraceus AS3.4412的生长；通过对枯草芽孢杆菌CW14的多种代谢产物的抗真菌活性进行研究，筛选赭曲霉的拮抗组分，最终发现β-葡聚糖酶具有较高的拮抗赭曲霉的活性。
第一方面，本发明提供β-葡聚糖酶在抑制赭曲霉生长中的应用。
第二方面，本发明提供β-葡聚糖酶在拮抗赭曲霉毒素产生中的应用。
第三方面，本发明提供β-葡聚糖酶在防止农产品霉变或赭曲霉毒素污染中的应用。
作为优选，所述β-葡聚糖酶的氨基酸序列为如下任一种：
(1)如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；
(2)与如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的序列具有至少90％同源性的序列；
(3)如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列。
本发明发现来源于枯草芽孢杆菌CW14的β-葡聚糖酶(全长氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，成熟肽序列如SEQ ID NO.2所示)具有十分优异的赭曲霉抑制活性。
第四方面，本发明提供一种赭曲霉生长抑制剂，其包含所述β-葡聚糖酶。
作为优选，所述赭曲霉生长抑制剂还可包含β-葡聚糖酶的稳定剂、保护剂等辅料。
第五方面，本发明提供一种抑制赭曲霉生长的方法，其为在待处理样品中添加β-葡聚糖酶。
上述抑制赭曲霉生长的方法中，所述β-葡聚糖酶的氨基酸序列为如下任一种：
(1)如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；
(2)与如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的序列具有至少90％同源性的序列；
(3)如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列。
上述抑制赭曲霉生长的方法中，所述β-葡聚糖酶优选为序列如SEQ ID NO.1所示的β-葡聚糖酶。
作为优选，所述抑制赭曲霉生长的方法包括：在待测样品中添加β-葡聚糖酶，所述β-葡聚糖酶的添加量为5～10μg/g待处理样品。
第六方面，本发明提供一种重组β-葡聚糖酶的制备方法，其为利用毕赤酵母表达重组β-葡聚糖酶，所述重组β-葡聚糖酶的编码基因序列如SEQ ID NO.4所示。
如SEQ ID NO.4所示的序列为将β-葡聚糖酶的原始编码基因(如SEQ ID NO.3所示)进行人工密码子优化、添加His标签肽序列和酶切位点序列后得到的序列。
本发明发现采用毕赤酵母表达β-葡聚糖酶能够更好地促进β-葡聚糖酶的正确高效折叠，而在毕赤酵母中，采用如SEQ ID NO.4所示的序列能够在保证酶的结构和功能正确的同时，实现β-葡聚糖酶的高水平、稳定表达。
具体地，所述重组β-葡聚糖酶的制备方法包括如下步骤：
(1)将如SEQ ID NO.4所示的序列与载体pPIC9K连接构建重组β-葡聚糖酶的表达载体；
(2)将所述重组β-葡聚糖酶的表达载体导入毕赤酵母；
(3)培养携带所述重组β-葡聚糖酶的表达载体的毕赤酵母，表达所述重组β-葡聚糖酶。
本发明的有益效果在于：
本发明以枯草芽孢杆菌CW14对A.ochraceus的抑菌活性出发，研究其拮抗组分及其对赭曲霉的抑菌机制，通过实验筛选枯草芽孢杆菌CW14(Bacillus subtilis CW14)的代谢产物中发挥赭曲霉拮抗作用的组分并结合生物信息学分析以及质谱检测，发现β-葡聚糖酶具有较高的拮抗产毒赭曲霉的活性。通过在待处理样品中添加β-葡聚糖酶能够显著抑制赭曲霉的产生和生长(抑菌率达到96.6％)，极大地降低霉变和毒素污染风险，同时不破坏待处理样品的正常品质。
本发明还通过优化表达系统(宿主、表达基因序列等)实现了重组β-葡聚糖酶的高效异源表达，为获得大量的重组β-葡聚糖酶提供了有效方法。本发明对重组β-葡聚糖酶的最适温度、pH、热稳定性等酶学性质进行了分析，发现重组β-葡聚糖酶具有很好的环境适应(温度、pH等)能力，为β-葡聚糖酶的广泛应用提供可能。
利用β-葡聚糖酶可解决单独使用微生物拮抗作用的不稳定情况，同时避免了繁琐的分离纯化步骤；且β-葡聚糖酶的制备方法具有简单易行，成本低廉的优势，因此，β-葡聚糖酶可以在实践中用于农产品的赭曲霉及其毒素污染防控。本发明为开发高效的赭曲霉拮抗制剂提供了技术基础，对于综合预防粮食和饲料的曲霉及毒素污染具有重要意义。
附图说明
图1为本发明实施例1中B.subtilis CW14菌株对赭曲霉生长的抑制作用检测，其中，1为A.ochraceus 3.4412，2为B.subtilis CW14。
图2为本发明实施例1中B.subtilis CW14的发酵无细胞上清中分子量<3kDa、3-10kDa和>10kDa的三种组分对赭曲霉生长的抑制；其中，CK为添加LB培养基的对照组；1,2,3分别为B.subtilis CW14的无细胞上清液中分子量<3kDa、3-10kDa和>10kDa的组分；4为添加等体积的1mg/mL卡泊芬净的阳性对照组。
图3为本发明实施例3中重组质粒pPI9K-β-glu的构建示意图。
图4为本发明实施例3中重组质粒pPI9K-β-glu的双酶切电泳图，其中，M1，M2分别为15000bp marker，2000bp marker；泳道1和2分别为重组质粒pPIC9K/glu双酶切和重组质粒pPIC9K/glu电泳结果；泳道3和4分别为空质粒pPIC9K双酶切和空质粒pPIC9K电泳结果。
图5为本发明实施例3中重组质粒的酶切电泳图；其中，M为15000bp marker；泳道1为空质粒pPIC9K，泳道2为空质粒pPIC9K线性化，泳道3为重组质粒pPIC9K/glu，泳道4为重组质粒pPIC9K/glu线性化
图6为本发明实施例3中高拷贝菌株的筛选；其中，A为重组空质粒高拷贝菌株筛选；B为重组目的质粒的高拷贝菌株筛选。
图7为本发明实施例3中重组菌株诱导表达上清的SDS-PAGE；其中，泳道1-8分别是重组菌株GS115/pPIC9K/glu诱导0、1、2、3、4、5、6、7d的SDS-PAGE结果；泳道9和10分别为GS115/pPIC9K诱导6、7d的结果。
图8为本发明实施例3中重组菌株诱导表达上清的western blot验证；其中，泳道1和1’为重组菌株GS115/pPIC9K/glu的诱导5d、6d表达上清；泳道2和2’为空质粒GS115/pPIC9K诱导表达上清。
图9为本发明实施例3中重组表达产物的抗真菌活性验证；其中，1为对照组；2为重组菌株GS115/pPIC9K/glu的诱导表达上清的抑菌活性；3为空质粒GS115/pPIC9K诱导表达上清的抑菌活性。
图10为本发明实施例3中重组蛋白的分离纯化的SDS-PAGE；其中泳道1为重组菌株上清；泳道2为纯化蛋白；泳道3为抽滤液。
图11为本发明实施例4中重组β-葡聚糖酶的最适温度。
图12为本发明实施例4中重组β-葡聚糖酶的最适pH。
图13为本发明实施例4中重组β-GLU的温度稳定性。
图14为本发明实施例4中重组β-葡聚糖酶的pH稳定性。
图15为本发明实施例4中金属离子对重组β-葡聚糖酶活性的影响。
图16为本发明实施例4中重组β-葡聚糖酶的酶促动力学曲线。
图17为本发明实施例5中利用B.subtilis CW14的发酵液、无细胞上清液和重组β-葡聚糖酶处理大豆的赭曲霉抑制实验；其中，A为对照组；B为利用B.subtilis CW14的发酵液处理；C为利用B.subtilis CW14的无细胞上清液处理；D为利用纯化的重组β-葡聚糖酶处理。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 B.subtilis CW14菌体及其代谢产物对赭曲霉生长的抑制
利用对峙培养研究菌体对赭曲霉的抑制，向PDA平板中央接种上直径为5mm的赭曲霉A.ochraceus AS 3.4412菌块，向距离其3cm处接种B.subtilis CW14细菌，培养5d后，测量赭曲霉菌块中央到霉菌菌落边缘的最远距离(r)和霉菌中央到面对细菌的那一端边缘的距离(r’)，按照如下公式计算抑菌率(％)：抑菌率(％)＝[(r-r’)/r]×100。
结果如图1所示，通过测量计算，B.subtilis CW14菌体对赭曲霉生长的抑菌率达到85.7％。
将冻存的B.subtilis CW14菌株，划线于LB平板，于细菌培养箱中37℃，200r/min培养完成活化，培养24h后，用接种环挑取CW14单菌落，接种于200mL LB液体培养基中，37℃，200r/min振荡培养48h(OD600检测为1左右)，取发酵液4℃，6000g离心10min，获得上清液，将样品通过0.22μm过滤器除菌获得无菌上清液。
分别准备10kDa、3kDa截留大小的超滤管。将CW14的无菌上清液先用10kDa超滤管离心超滤(4500g，离心40min)，分别获得分子量>10kDa、<10kDa范围的截流液；然后再将分子量<10kDa范围的截留液通过3kDa的超滤管离心超滤获得分子量3-10kDa和<3kDa范围的截留液，最后将样品通过0.22μm无菌过滤膜除菌获得无菌截留液。
利用牛津杯法检测菌体代谢物对赭曲霉的抑制：取100μL赭曲霉菌A.ochraceusAS 3.4412孢子悬液(106Conidia/mL)均匀涂布于PDA平板，将灭菌后的牛津杯在酒精灯火焰上烧至一段时间，放在平板的既定位置，确保牛津杯刚好粘在培养基表面，而不滑动。静置5min后，用移液枪吸取100μL的抑菌物质(B.subtilis CW14的发酵液通过超滤管将上清液分成的分子量<3kDa，3-10kDa和>10kDa的无菌截留液)加入到牛津杯中，以加入等量的无菌LB培养基作为对照，以等体积的1mg/mL的卡泊芬净作为阳性对照。每组3个平行，于30℃恒温培养箱中培养2d，观察牛津杯周围是否有抑菌圈，并用十字测量法测定抑菌圈直径(mm)。
结果如图2所示，与阳性对照类似，B.subtilis CW14的发酵液中分子量<3kDa、3-10kDa和>10kDa这三种组分均有一定的抑菌圈，抑菌圈直径分别为15.3±0.70mm、13.1±0.28mm和21.2±0.14mm。
实施例2 B.subtilis CW14中的抗真菌蛋白的筛选
根据实施例1得到的检测结果，将分子量<3kDa、3-10kDa和>10kDa这三种组分的抑菌效果进行比较，结果显示，>10kDa的组分的抑菌效果最好，并且含有大分子的抗真菌蛋白，因此将>10kDa组分进行质谱检测。根据B.subtilis CW14的全基因组数据，通过生物信息学分析结合质谱检测结果，最终确定B.subtilis CW14的β-葡聚糖酶(β-GLU)可能具有较高的抑制赭曲霉生长的活性。
根据信号肽软件(signal P-4.1Server)分析该蛋白的信号肽和成熟氨基酸的序列，β-葡聚糖酶的全长氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，成熟肽序列如SEQ ID NO.2所示，编码基因序列如SEQ ID NO.3所示。
实施例3 B.subtilis CW14的β-葡聚糖酶的异源表达
将B.subtilis CW14的β-葡聚糖酶在毕赤酵母中进行异源表达，具体方法如下：
(一)β-葡聚糖酶的重组表达质粒的构建
根据毕赤酵母(P.pastoris)的密码子偏爱性、结合人工密码子优化对B.subtilisCW14的β-葡聚糖酶编码基因进行密码子优化，同时在优化得到的序列上添加HIS标签以及双酶切位点EcoR I和Not I，得到如SEQ ID NO.4所示的序列。以pPIC9K质粒作为载体，将如SEQ ID NO.4所示的序列插入至pPIC9K质粒中，构建β-葡聚糖酶重组表达质粒pPI9K-β-glu，重组表达质粒图谱如图3所示。重组质粒的构建由北京奥科鼎盛有限公司完成。
(二)β-葡聚糖酶重组表达质粒的提取和验证
将保存有重组质粒的大肠杆菌接种到5mL LB/kan液体培养基，37℃、200r/min、摇床过夜后，取出1mL活化的菌液接种到50mL LB/kan液体培养基中，相同条件下进行扩大培养，将培养好的菌液转移至50mL离心管中，6000g离心10min收集菌体。按照全式金质粒大量提取试剂盒说明书提取质粒。
用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切，酶切反应采用20μL体系。全部操作在冰上进行，即在0.5mL Eppendorf管中依次加入：2μL10×酶切缓冲液、2μL的BSA溶液、限制性内切酶EcoRⅠ(10U/μL)和NotⅠ(10U/μL)各1μL、10μL重组质粒，最后加入4μL无菌水、以上各溶液经瞬时离心后，于37℃酶切反应4-6h，取10μL产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切条带。
结果如图4所示，分别得到约9kbp和约600bp的两个片段(泳道1)，证明目的基因已经成功连接到pPIC9k载体中，而对照的空质粒没有额外的片段跑出(泳道3)。
(三)重组质粒的线性化
将上述大量提取的质粒，采用限制性内切酶SacI进行线性化酶切，酶切体系是20μL。即在0.5mL Eppendorf管中依次加入如表1所示的反应体系：
表1 SacI线性化反应体系组成
Figure BDA0002120111470000091
可一次性做10-20管，以上各溶液经瞬时离心后，于37℃酶切反应4-6h，取5μL产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切条带。若酶切完全，则将各管合并，加入2-2.5倍体积的无水乙醇，于-80℃醇沉30min，12000g离心5min，弃上清液晾干后加入20μL无菌水溶解，-20℃冻存备用。
提取的质粒DNA进行电泳时，可能会出现3条电泳条带：一条是超螺旋结构的质粒，因其结构紧密，在凝胶中速度最快；一条是较为松散的螺旋状质粒，所以速度最小，最后一条是在提取过程中受到机械损伤而呈现线性化的质粒，泳动速度介于两者之间。外源基因整合到酵母细胞基因组中主要通过同源重组进行，而线状分子引发同源重组的几率比环状分子要大。采用Sac1对重组质粒进行线性化酶切的结果如图5所示，从图中可以看出，重组质粒pPIC9K/glu经SacⅠ酶切后完全呈现出线性化(泳道4)，酶切效果佳。
(四)感受态细胞的制备
活化P.pastoris GS115：接种100μL保存在-80℃冰箱中的毕赤酵母GS115甘油菌于2mL新鲜的YPD液体培养基中，28℃、200r/min摇床培养过夜后，在新鲜的YPD平板上进行划线，于28℃霉菌培养箱中静置培养，直至出现单菌落。
(1)挑取GS115单菌落接种于5mL YPD液体培养基中，28℃、200r/min摇床培养过夜，取出1mL菌液接种于100mL新鲜的YPD液体培养基中扩大培养至OD600＝1.3～1.5，剩余菌液可用20％的甘油进行菌种保藏。
(2)扩大培养后的菌液于4℃、1500g离心5min，倒掉上清液，加入100mL预冷的无菌水，用移液器小心地吸打液体，重悬菌体细胞。
(3)菌体细胞重悬浮均匀后于4℃、1500g离心5min，倒掉上清液，再次加入50mL冰预冷的无菌水重悬菌体细胞。
(4)菌体细胞重悬浮后于4℃、1500g离心5min，倒掉上清液，再用4mL冰预冷的无菌的1mol/L山梨醇重悬菌体细胞。(5)菌体细胞重悬浮后于4℃、1500g离心5min，倒掉上清液，再用0.2mL冰预冷的无菌的1mol/L山梨醇重悬菌体细胞，即获得感受态细胞。感受态细胞宜现制现用。若分装于离心管中冻存备用，其转化效率会明显下降。
(五)感受态细胞的电转化
(1)将感受态细胞、线性化的重组表达质粒DNA样品及0.2cm干净的电转化杯置于冰上预冷10min。
(2)将80μL感受态细胞和10μL线性化的重组质粒DNA于离心管中混合均匀，随后转入电转杯中，冰浴5min后，擦干电转化杯，并迅速盖上杯盖，置于电转仪上，1500V电击1次，然后立即向电转杯中加入1mL冰预冷的1mol/L的无菌山梨醇溶液，混和均匀后转入1.5mL离心管中，置于冰上备用。
(3)取200μL电转化物均匀涂布于MD平板上，于30℃进行培养直至转化子出现。将转化子置于4℃备用。同法以空质粒pPIC9K转化菌株GS115，作为表达的阴性对照。
(六)高拷贝菌株筛选
1、转化子的遗传稳定性鉴定
(1)在超净工作台中，将200μL新鲜的YPD液体培养基中加入无菌的细胞培养96孔板的各孔中。
(2)用10μL无菌枪头将MD平板上的His+转化子分别接入各孔中，并搅拌均匀。注意不要弄混转化子，造成污染。
(3)盖上96孔板的上盖，置于30℃酵母培养箱中静置培养2d，此时为第一批His+转化子。
(4)取另一块新的细胞培养96孔板，将190μL新鲜的YPD培养基加入各孔中。
(5)按照对应的顺序向各孔中加入1μL第一批His+转化子，并用枪头搅拌搅拌均匀。盖好96孔板的上盖，置于30℃酵母培养箱中静置培养1d，此时为第二批His+转化子。
(6)重复操作4)和5)，盖好96孔板的上盖，置于30℃酵母培养箱中静置培养1d，此时为第三批His+转化子。用移液器吸打搅拌各孔中的培养物，使第三批His+转化子混合均匀，获得充分的悬浮。
2、高拷贝菌株筛选：在分别含有0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL G418的YPD平板上，分别点接2μL相同的转化子培养物。先在30℃酵母培养箱中静置一段时间，待菌悬液被培养基吸干后，再将YPD/G418平板进行倒置培养，并分别在第2、3、4或5d观察平板中转化子的生长状况。
利用遗传毒素G418来筛选高拷贝子，细胞对氨基糖苷类抗生素G418敏感，在其作用下细胞的功能受到影响从而无法生长。电导法将目的基因导入酵母细胞后，只有少数的细胞能将外源基因整合到自己的基因组中，使细胞对G418产生抗性。因此，筛选出对G418抗性高的细胞，就能得到稳定表达目的基因的高拷贝菌株。将重组菌株接种于G418浓度分别为0.5、1、2、4、6mg/mL的YPD平板上，结果如图6所示，存活的转化子数目随着G418浓度的增加而减少，最终得到高拷贝菌株。通过高拷贝筛选出了3株重组菌，分别命名为G-1，G-2，G-3。
(七)重组β-葡聚糖酶的诱导表达
1、重组毕赤酵母的诱导表达
(1)将重组酵母接种于新鲜的YPD平板，30℃培养箱2d。
(2)挑取单菌落，接种于25mLBMGY培养基中，28℃、175r/min直至OD600＝2-6。
(3)4000r离心5min，弃上清，获得的菌体用20mLBMMY培养基进行重悬，30℃、1755r/min诱导表达6d。
(4)每天取样500μL，并补加100％甲醇至1％，按表2进行，取得的样品于4℃、10000r/min离心5min，获得上清液，-20℃保存。
表2重组毕赤酵母的诱导表达
取样时间(d) 0 1 2 3 4 5 6 7
总体积(mL) 20 19.5 19 18.5 18 17.5 17 16.5
补加甲醇(μL) 200 195 190 185 180 175 170 165
2、重组β-葡聚糖酶表达量的测定
利用bradford测定蛋白，根据试剂盒进行。
筛选得到的G-1菌株经甲醇诱导1-6d后的培养物上清液进行SDS-PAGE分析，以转化空质粒的酵母菌表达上清为对照。结果如图7所示，从诱导表达第4d开始，与对照相比，重组转化子的表达上清中含有一条约35kDa的蛋白条带，说明目的蛋白已在毕赤酵母中成功表达。分子量比理论值大，可能是因为蛋白发生糖基化。取诱导5d、6d的上清进行Western-Blot验证发现(图8)，重组菌株在35kDa附近有明显特异性条带，而空质粒表达无条带出现，重组菌株在35kDa附近有明显特异性条带。表明重组菌株的目的蛋白已成功表达。
对重组毕赤酵母菌株的表达上清进行赭曲霉抑制活性分析，重组表达产物的赭曲霉抑制活性验证结果如图9所示，重组菌株的表达上清液与对照相比，具有明显的抑菌圈，直径为12.8±0.42mm，而空质粒的表达上清与对照相比，几乎没有抑菌圈，说明表达产物具有抑菌活性，所需目的蛋白已经表达。
(八)重组β-葡聚糖酶的分离纯化及活性分析
1、表达上清液的超滤浓缩
(1)使用超滤管(膜孔径10kDa，50mL，Millipore)浓缩纯化
1)在超滤管中加入7mL的超纯水至完全过膜，冰浴20分钟，随后于4℃、4500g，离心20min，去掉管中的超纯水。
2)在超纯水过膜后的超滤管中加入7mL培养基上清，4℃、4500g、离心40min。
3)离心后用200μL枪头轻轻沿着滤膜的边缘插入枪头，小心不要碰到膜壁，小心吹打截留在滤膜上的蛋白液，将其与底部的沉淀混匀，随后吸出蛋白液置于2mL新离心管中，-20℃保存备用。
2、表达上清液的纯化
(1)加入10mL Ni Sepharose 6Fast Flow凝胶于砂芯漏斗中抽滤，以除去凝胶中的乙醇；
(2)向砂芯漏斗中加入50mL的结合液，用药勺搅拌一下，用于平衡凝胶，抽滤；
(3)将凝胶刮至容器中，加入10mL表达上清液，4℃、175rpm振荡15min，抽滤；
(4)将凝胶再次刮至容器中，加入20mL结合液，4℃、175rpm振荡10min，抽滤，去掉杂质；
(5)在刮下的凝胶中加入50mL的洗脱液，4℃、175rpm振荡10min，抽滤，重复两次。合并两次滤液，4℃过夜透析去盐，使用截留分子量为10KDa的超滤离心管超滤浓缩，溶解于0.02mol/L Tris-HCl(pH7.0)，-80℃贮存。重组β-GLU的抗真菌活性
3、纯化后的重组β-GLU根据微孔法测定活性
对于微孔法对抑菌率的测定方法如下：取100μL重组β-GLU，加入20μL的赭曲霉孢子悬浮液(106Conidia/mL)，再加入100μL的PDB培养基于96孔板中，以添加100μL的LB作为对照，混匀后，在30℃摇床培养箱培养3d后，测定OD630，按照以下公式计算抑菌率(％)。
抑菌率(％)＝(对照OD-处理OD)/对照OD×100
重组酵母的表达上清通过超滤管(膜孔径10kDa，50mL，Millipore)浓缩纯化，再通过Ni-NTA琼脂糖凝胶进一步纯化。利用Ni-NTA琼脂糖凝胶对重组β-GLU进行纯化浓缩后，得到纯化的重组蛋白的酶活等参数见表3，回收率为36.55％，纯化的倍数为16.63。回收率一般，但是纯化倍数较好(10倍以上)，因此可以用于后续的表征研究。
表3 Ni-NTA琼脂糖凝胶对重组β-葡聚糖酶的纯化
Figure BDA0002120111470000141
注：比活力(U/mg)即1mg蛋白所含酶活；回收率(％)＝纯化后酶活/纯化前酶活；纯化倍数＝纯化后比活力/纯化前比活力
重组β-葡聚糖酶的分离纯化的SDS-PAGE检测结果如图10所示，表达上清液中杂蛋白较多，但是目的蛋白占绝大多数；纯化并浓缩后，目的蛋白条带颜色变深，浓度变大，且条带单一，说明纯化有效。纯化后的β-GLU通过微孔法测定其对赭曲霉的抗真菌活性，3d后测得的对赭曲霉的抑制率为93.1％。
实施例4重组β-葡聚糖酶的酶学性质分析
1、重组β-GLU反应的最适温度
将100μL纯化后的重组β-GLU酶液与100μL的β-葡聚糖混合后，分别以20、30、40、50、60、70、80、90、100℃为反应温度作用20min，测定酶活。以酶活最大值作为100％相对酶活，其它温度下的酶活值除以最大值所得百分数即为该温度下的相对酶活。
结果如图11所示，重组β-GLU的最适温度为50℃，在低于50℃时，酶活变化不大，在20℃时，酶活为最高酶活的87.3％；高于50℃时，随着温度的升高，酶活逐渐降低，在100℃时，仅为最高酶活的47.6％。
2、重组β-GLU反应的最适pH
先用pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的缓冲液溶解β-葡聚糖作为底物，然后将100μL纯化后的重组β-GLU分别与100μL的底物混合，50℃恒温条件下水浴20min，测定酶活。相对酶活计算方式同1。
结果如图12所示，重组β-GLU的最适反应pH为5，在pH为4时，酶活为最高酶活的82.2％。在pH为6-8之间，酶活保持相对稳定，最低达到92.5％。随着pH继续降低，酶活逐渐降低，在pH为10时，酶活仅为最高酶活的35.6％。
3、重组β-GLU的温度稳定性
在pH为5的条件下，将100μL纯化后的重组β-GLU分别于20、30、40、50、60、70、80、90、100℃条件下保持20min，待酶液温度恢复至室温，再与100μL的β-葡聚糖溶液混合，测定残余酶活，同时以(未处理组)标准条件下(50℃，pH＝5)纯化酶的酶活为100％，其它温度下的酶活值除以最大值所得百分数即为该温度下的相对酶活。以此确定重组酶的热稳定性。
结果如图13所示，重组β-GLU酶活在20℃-70℃之间保持相对稳定，最低酶活为55.7％。当温度高于70时，酶活逐渐降低，当温度为100℃时，酶活仅为28.3％。
4、重组β-GLU的pH稳定性
将100μL纯化后的重组β-GLU分别于pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的缓冲剂中50℃保持20min，再与100μL的β-葡聚糖溶液混合，以标准条件下测定残余酶活，相对酶活计算方式同3。
结果如图14所示，重组β-GLU在pH 4-9保持相对稳定，最低酶活为72.9％。pH继续升高，酶活逐渐减低，最低酶活保持率为47.5％。
5、金属离子对重组β-GLU酶活的影响
用0.05mol/L，pH 5.0的柠檬酸缓冲液分别配制含有金属离子(CaCl2、FeCl2、MgCl2、ZnCl2、CuCl2)的溶液，将纯化的β-GLU分别与上述溶液(金属离子终浓度为10mmol/L)混合保持20min，然后取出100μL纯化后的重组β-GLU与100μL的β-葡聚糖溶液混合，以标准条件下测定残余酶活，相对酶活计算方式同3。
结果如图15所示，与对照相比，Fe2+和Ca2+会增强重组β-GLU的活性，酶活为标准酶活的109.1％和107.5％，增强率分别为9.1％和7.5％，而Mg2+、Zn2+、Cu2+会抑制重组β-GLU的活性，抑制率分别为6.3％、3.3％、3.8％。
6、动力学参数的确定
将100μL纯化后的重组β-GLU分别与浓度为0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM、1.2mM的重组β-葡聚糖溶液混合保持20min，测定酶活，根据米氏方程，采用双倒数法作图，获得重组酶水解底物的动力学参数。
米氏常数Km值是指酶促反应速度为最大值一半时底物的浓度，代表了酶对底物的亲和力大小，Km值越小表示酶对底物的亲和力越大。米氏常数一般可根据双倒数作图法获得，其公式如下所示：
Figure BDA0002120111470000171
运用双倒数法作图，获得重组β-GLU的动力学参数，其结果如图16所示。以1/V对1/[S]作图，可获得一条直线，重组β-葡聚糖酶的酶促动力学标准方程式为y＝1.7323x+0.0476，该直线在Y轴上的截距为1/Vmax，在X轴上的截距即为1/Km的绝对值，通过计算：重组β-GLU的Vmax＝21U/min，Km＝0.0275mg/mL。
7、底物专一性的测定
分别用0.05M，pH 5.0的柠檬酸缓冲剂配制大麦β-葡聚糖(β-1,3-1,4-(glucose))、纤维二糖(β-1,4-(glucose))、昆布多糖(β-1,3-(glucose))和可溶性淀粉(α-1,4-1,6-(glucose))作为底物，测定重组β-GLU对不同底物保持20min的酶活，确定该重组β-葡聚糖酶的底物专一性，以等量的柠檬酸缓冲剂作为对照(Control)。
表4重组β-葡聚糖酶对不同底物的酶活测定
Figure BDA0002120111470000172
表4中a代表p<0.05
通过测定重组酶对不同底物的酶活确定底物专一性，结果见表4，结果表明，重组β-GLU能够显著水解β-1,3和β-1,4糖苷键，而对α-1,4和α-1,6糖苷键几乎没有水解作用。
实施例5 B.subtilis CW14的发酵液、无细胞上清液和重组β-葡聚糖酶的赭曲霉抑制作用
本实施例将B.subtilis CW14的发酵液、发酵液的无细胞上清液以及异源表达的重组β-GLU应用于大豆，分析其抑菌活性，具体方法如下：
将实验大豆进行121℃，20min高温杀菌。向一次性平板分别加入5mL的B.subtilisCW14液体发酵液(含菌体，OD＝1)、发酵液的无细胞上清液上清以及纯化的重组β-GLU(15μg/mL)，以加入5mL的无菌LB培养基为对照组，在上述一次性平板中分别接种100μL的106Conidia/mL的赭曲霉孢子悬浮液。最后向平板中各加入30粒灭菌后的大豆(10g)，培养3d后，观察大豆表面菌体生长情况，并用等量的吐温80溶液进行洗脱，测定孢子浓度，按照如下公式计算抑菌率(％)：抑菌率(％)＝(对照组孢子数-实验组孢子数)/对照组孢子浓度×100％。
结果如图17所示，对照组的大豆表面出现大量的赭曲霉菌丝和孢子；CW14的发酵液处理大豆，表面没有明显的赭曲霉产生，抑菌率最高达到97.1％；无细胞上清液处理大豆，表明出现少量的菌丝，抑菌率仅为50.8％；重组β-GLU处理大豆，表面没有赭曲霉的产生，且豆子状态良好，抑菌率达到96.6％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种β-葡聚糖酶及其在抑制赭曲霉中的应用
<130> KHP191113417.8
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Pro Tyr Arg Met Lys Arg Val Leu Leu Leu Leu Val Thr Gly Leu
1 5 10 15
Phe Met Ser Leu Ser Ala Ile Thr Ser Thr Ala Ser Ala Gln Thr Gly
20 25 30
Gly Ser Phe Phe Asp Pro Phe Asn Ser Tyr Asn Ser Gly Leu Trp Gln
35 40 45
Lys Ala Asn Gly Tyr Ser Asn Gly Asn Met Phe Asn Cys Thr Trp Arg
50 55 60
Ala Asn Asn Val Ser Met Thr Ser Leu Gly Glu Met Arg Leu Ala Leu
65 70 75 80
Thr Ser Pro Ser Tyr Asn Lys Phe Asp Cys Gly Glu Asn Arg Ser Val
85 90 95
Gln Thr Tyr Gly Tyr Gly Leu Tyr Glu Val Arg Met Lys Pro Ala Lys
100 105 110
Asn Thr Gly Ile Val Ser Ser Phe Phe Thr Tyr Thr Gly Pro Thr Asp
115 120 125
Gly Thr Pro Trp Asp Glu Ile Asp Ile Glu Phe Leu Gly Lys Asp Thr
130 135 140
Thr Lys Val Gln Phe Asn Tyr Tyr Thr Asn Gly Val Gly Asn His Glu
145 150 155 160
Lys Val Val Asp Leu Gly Phe Asp Ala Ala Asn Ala Tyr His Thr Tyr
165 170 175
Ala Phe Asp Trp Gln Pro Asn Ser Ile Lys Trp Tyr Val Asp Gly Gln
180 185 190
Leu Lys His Thr Ala Thr Ser Gln Ile Pro Thr Thr Pro Gly Lys Ile
195 200 205
Met Met Asn Leu Trp Asn Gly Thr Gly Val Asp Glu Trp Leu Gly Ser
210 215 220
Tyr Asn Gly Val Thr Pro Leu Tyr Ala His Tyr Asp Trp Val Arg Tyr
225 230 235 240
Thr Lys Lys
<210> 2
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gln Thr Gly Gly Ser Phe Phe Asp Pro Phe Asn Ser Tyr Asn Ser Gly
1 5 10 15
Leu Trp Gln Lys Ala Asn Gly Tyr Ser Asn Gly Asn Met Phe Asn Cys
20 25 30
Thr Trp Arg Ala Asn Asn Val Ser Met Thr Ser Leu Gly Glu Met Arg
35 40 45
Leu Ala Leu Thr Ser Pro Ser Tyr Asn Lys Phe Asp Cys Gly Glu Asn
50 55 60
Arg Ser Val Gln Thr Tyr Gly Tyr Gly Leu Tyr Glu Val Arg Met Lys
65 70 75 80
Pro Ala Lys Asn Thr Gly Ile Val Ser Ser Phe Phe Thr Tyr Thr Gly
85 90 95
Pro Thr Asp Gly Thr Pro Trp Asp Glu Ile Asp Ile Glu Phe Leu Gly
100 105 110
Lys Asp Thr Thr Lys Val Gln Phe Asn Tyr Tyr Thr Asn Gly Val Gly
115 120 125
Asn His Glu Lys Val Val Asp Leu Gly Phe Asp Ala Ala Asn Ala Tyr
130 135 140
His Thr Tyr Ala Phe Asp Trp Gln Pro Asn Ser Ile Lys Trp Tyr Val
145 150 155 160
Asp Gly Gln Leu Lys His Thr Ala Thr Ser Gln Ile Pro Thr Thr Pro
165 170 175
Gly Lys Ile Met Met Asn Leu Trp Asn Gly Thr Gly Val Asp Glu Trp
180 185 190
Leu Gly Ser Tyr Asn Gly Val Thr Pro Leu Tyr Ala His Tyr Asp Trp
195 200 205
Val Arg Tyr Thr Lys Lys
210
<210> 3
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caaacaggtg gatcgttttt tgaccctttt aacagctata actccggttt atggcaaaaa 60
gcaaatggtt attcgaatgg aaatatgttc aactgcactt ggcgtgcaaa taacgtatcc 120
atgacgtcat taggtgaaat gcgtttggcg ctaacaagtc catcttataa caagtttgac 180
tgcggggaaa accgctctgt tcaaacatat ggctatggac tttatgaagt cagaatgaaa 240
ccagctaaaa acacagggat cgtttcatcg ttcttcacat acacaggccc aacggatgga 300
acgccttggg atgagattga tatcgaattt ttaggaaaag acacaacaaa ggttcaattt 360
aactattata caaatggtgt aggaaaccat gagaaggttg tggatctcgg ctttgatgca 420
gccaatgcct atcacacgta cgcgttcgat tggcagccaa actctattaa atggtatgtc 480
gatgggcaat taaaacatac tgcgacaagc caaattccga caacacctgg aaagatcatg 540
atgaacttgt ggaatggtac gggtgtcgat gaatggctcg gttcctacaa tggtgtaaca 600
ccgctatacg ctcattacga ctgggtgcgt tatacaaaaa aa 642
<210> 4
<211> 677
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaattccacc accaccacca ccaccagacc ggtggttctt tcttcgaccc attcaactcg 60
tacaactctg gcttgtggca gaaggccaac ggttactcta acggcaacat gttcaactgc 120
acttggagag ccaacaacgt gtcgatgact tctctgggtg agatgagact ggctctgacc 180
tctccatcgt acaacaagtt tgactgcggc gagaacagat cggttcagac ttatggttac 240
ggcctgtacg aggtgagaat gaagccagct aagaacaccg gtatcgtgtc gtcgttcttt 300
acctacactg gtccaactga cggtactcca tgggacgaga tcgacattga gttccttggt 360
aaggacacca ccaaggtgca gttcaactac tacaccaacg gtgtgggtaa ccacgagaag 420
gttgttgact tgggtttcga cgctgctaac gcttaccaca cctacgcttt tgattggcag 480
ccaaactcga tcaagtggta cgttgacggt cagttgaagc acaccgctac ctctcagatt 540
ccaaccactc caggcaagat catgatgaac ctgtggaacg gtactggtgt tgacgagtgg 600
cttggatctt acaacggtgt tactccactg tacgctcact acgactgggt tagatacacc 660
aagaagtaag cggccgc 677

Claims (6)

1.β-葡聚糖酶在抑制赭曲霉生长中的应用，所述β-葡聚糖酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2所示。
2.β-葡聚糖酶在拮抗赭曲霉毒素产生中的应用，所述β-葡聚糖酶的氨基酸序列如SEQID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
3.β-葡聚糖酶在防止由赭曲霉引起的农产品霉变中的应用，所述β-葡聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
4.β-葡聚糖酶在防止农产品被赭曲霉毒素污染中的应用，所述β-葡聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
5.一种抑制赭曲霉生长的方法，其特征在于，在待处理样品中添加β-葡聚糖酶，所述β-葡聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述β-葡聚糖酶的添加量为5~10 μg/g待处理样品。
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