KR20040039187A - 암컷 동물에 핵산 서열의 투여 - Google Patents

암컷 동물에 핵산 서열의 투여 Download PDF

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Abstract

성장 증진 잠재 방법을 이용하여 GHRH 또는 이의 유사체의 핵산 서열을 암컷 동물에, 바람직하게는 비경구 투여 경로를 통해 투여함으로써 성장이 개선된다. GHRH 암호화 DNA로 주사된 암퇘지에서 출생한 새끼는 이후의 임신에서 증명되는 바와 같이 추가의 벡터 투여없이 더 큰 효과를 나타낸다.

Description

암컷 동물에 핵산 서열의 투여{Administration of nucleic acid sequence to female animal}
본 출원은 2000년 12월 12일자로 출원된 미국 특허 가출원 번호 제60/255,021호에 대한 우선권을 주장한다.
성장 호르몬(GH) 생성 경로는 정상적인 성장을 위해 필요한 산물의 일련의 상호의존적 유전자로 구성되어 있다. GH 경로 유전자는 (1) GH 및 인슐린-유사 성장 인자-I(IGF-I)과 같은 리간드, (2) pit 1의 전구체 또는 prop 1 및 pit 1과 같은 전사 인자, (3) 각각 성장 호르몬 분비 호르몬(GHRH) 및 소마토스타틴과 같은 효능제 및 길항제 및 (4) GHRH 수용체(GHRH-R) 및 GH 수용체(GH-R)와 같은 수용체를 포함한다. 이들 유전자는 시상하부, 뇌하수체, 간 및 골을 포함한 상이한 기관 및 조직에서 발현된다. GH 경로의 효과적이고 조절된 발현은 최적의 1차 성장에 필수적일뿐만 아니라 뇌하수체 전엽으로부터의 탄수화물, 단백질 및 지방 대사 GH 합성 및 분비의 항상성은 GHRH에 의해 자극을 받고 소마토스타틴에 의해 억제되고 GHRH와 소마토스타틴 모두는 시상하부 호르몬이다. 사람 및 기타 척추동물에서 체세포 성장을 조절하는데 있어서 GH의 중추적인 역할 및 뇌하수체로부터의 GH 분비를 조절하는 생리적 연관된 경로들은 잘 알려져 있다. GH는 주로 간 및 기타 표적 기관에서 IGF-I의 생성을 증가시킨다. IGF-I 및 GH는 차례로 시상하부 및 뇌하수체에서 피드백하여 GHRH 및 GH 분비를 억제한다. GH는 말초조직에 직접 및 간접적으로 작용하며, 간접적인 효과는 IGF-I에 의해 주로 매개된다.
아동 및 성인에 있어서 1차 성장(아동 환자(prepubertal patients)) 또는 신체 조성의 균형이 잡힌 상태에서 GH 또는 GHRH 요법에 반응하는 임상 상태는 많이 있다. 모든 경우에 있어서 GHRH-GH-IGF-I 축이 기능하지만 여러 가능한 이유로 인해서 최적의 민감성 또는 반응성으로 반드시 작용하는 것은 아니다.
아동에 있어서 GH 결손의 주된 특징은 난쟁이로 나타난다. 유사한 표현형이 GH 축의 다른 포인트에서의 유전적 결함(Parks et al., 1995) 뿐만 아니라 비-GH-결손 난쟁이에서 나타난다. 비-GH-결손은 다른 병리를 나타내는데, 예를 들면 (1)유전병으로 터너 증후군(Jacobs et al., 1990; Skuse et al., 1999), 연골발육부전(Tanaka et al., 1998; Key and Gross, 1996) 및 크론병(Savage et al., 1999); (2) 자궁내 성장장애(Albanese and Stanhope, 1997; Azcona et al., 1998); 및 (3) 만성 신장 결핍증(Sohmiya et al., 1998; Benfield and Kohaut, 1997). GH 축이 영향을 받지 않은 경우(즉, 환자는 정상적인 호르몬, 유전자 및 수용체를 갖는다)는 성장 장애의 전체 환자중 50% 이상을 차지한다. 이들 경우에 있어서, GHRH 또는 GH 요법은 효과적인 것으로 제시되어 왔다(Gesundheit and Alexander, 1995).
뇌하수체 전엽으로부터 감소된 GH 분비는 25세 내지 노인의 연령층에서 골근질량의 손실을 일으킨다. GHRH-GH-IGF-I 축은 감소된 GH 생성율 및 GH 반감기와 더불어 노화 및 성인(D'Costa et al., 1993)에서 급격한 변화를 겪으며, GH 및 GHRH 자극에 대한 감소된 IGF-I 반응은 골근 질량의 손실(sarcopenia: 근육량감소증), 골다공증 및 지방증가와 체중감소를 유도한다(Bartke, 1998). 이전의 연구는 상당히 많은 정상 성인에서 혈청의 GH 및 IGF 수준이 13 내지 19세 수준의 70-80%까지 현저히 감소한다(Corpas et al., 1993; Iranmanesh et al., 1991). 근육량감소증의 발달은 GH 치료법으로 회복될 수 있음이 증명되어 왔다. 그러나, 이 요법은 비용과 성인에서의 빈번한 부작용으로 인해 반대에 부딪혀 있다.
재조합 단백질의 제조는 이들 상태의 치료에 유용한 도구로 작용한다. 비록 GH 대체 요법이 성장 결핍증 환자에게서 널리 사용되어 만족할만한 성장을 제공하고 치료받고 있는 아동에게 긍정적인 정신적 효과를 나타내지만(Rosenbaum andSaigal, 1996; Erling, 1999), 이 요법은 몇가지 단점을 안고 있는데, 예를 들면 GH를 빈번하게 투여하여야 한다는 비실용성(Monti et al., 1997; Heptulla et al., 1997) 및 바람직하지 못한 이차 효과(Blethen et al., 1996; Watkins, 1996; Shalet et al., 1997; Allen et al., 1997)를 들 수 있다.
두개강외 분비된 GHRH는 성숙 펩타이드 또는 절단된 분자(췌장섬 세포 종양 및 다양하게 위치한 카시노이드와 더불어 관찰됨)로서 흔히 생물학적으로 활성적이고 심지어 말단비대증을 유발할 수 있는 것으로 잘 알려져 있다(Esch et al., 1982; Thorner et al., 1984). GH-결손 아동 또는 성인에 재조합 GHRH의 투여는 IGF-I 수준을 높이고, GH 분비를 GHRH 용량에 비례해서 증가시키며, GHRH의 환괴 용량에 대한 반응을 유발한다(Bercu and Walker, 1997). 따라서, GHRH 투여는 정상이하의 GH 및 IGF-I 수준을 증가시키는 보다 생리학적 대안이 된다(Corpas et al., 1993).
비록 GHRH 단백질 요법이 실질적으로 부작용을 유발하지 않고서 정상적인 GH 분비 주기를 유도 및 자극할 지라도 GHRH의 짧은 생체내 반감기는 빈번한(일일 1 내지 3회) 정맥내, 피하 또는 비내(300배 많은 용량) 투여를 필요로 한다. 따라서, GHRH 투여는 장기적인 치료법으로 실용적이지 못하다. 그러나, 두개강외 분비된 GHRH는 프로세싱된 단백질 종(Tyr1-40 또는 Tyr1-Leu44)으로서 또는 심지어는 보다 짧은 절단된 분자로서 생물학적으로 활성을 나타낸다(Thorner et al., 1984). 중요한 것은 혈액 공급에서 GHRH의 낮은 수준(100 pg/ml)은 GH 분비를 자극하며(Corpas et al., 1993) 그로인해 GHRH가 유전자 치료 발현을 위한 우수한후보자인 것이다. 직접적인 플라스미드 DNA 유전자 전달은 현재 거론되고 있는 많은 유전자 요법 전략의 근간이 되고, 이에 따라 바이러스 유전자 또는 지질 입자를 필요로 하지 않는다(Muramatsu et al., 1998; Aihara and Miyazaki, 1998). 골근은 근섬유의 수명이 길고 면역적격 숙주에서 수개월 또는 수년에 걸쳐 발현하는 환형 DNA 플라스미드에 의해 형질도입될 수 있기때문에 바람직한 표적 조직이다(Davis et al., 1993; Tripathy et al., 1996). 이전의 보고서는 사람의 GHRH cDNA가 마우스의 근육으로 주사가능한 근성 발현 벡터에 의해 전달될 수 있고 이 경우에 GHRH가 GH 분비를 2주간에 걸쳐 중간 정도로 일시 자극하였음을 증명하였다(Draghia-Akli et al., 1997).
야생형 GHRH는 사람(Frohman et al., 1984) 및 가축의 순환계에서 비교적 짧은 반감기를 갖는다. 혈장중 60분 배양 후 GHRH(1-44)NH2의 95%가 분해되는 한편, 유사한 조건하에서 그 호르몬의 보다 짧은 (1-40)OH 형태의 배양은 배양 60분 후 77%의 분해만을 보인다(Frohman et al., 1989). 유전자 요법 벡터에 특정 프로테아제-내성 GHRH 유사체의 암호화 cDNA의 삽입은 혈청중의 보다 긴 반감기, 증가된 효능을 갖는 분자를 유도하며 플라스미드 주입된 동물에서 보다 많은 GH 분비를 제공한다(Draghia-Akli et al., 1999, 본원에 참고로 원용된다). 프로테아제 민감성 아미노산의 아미노산 치환을 통한 돌연변이유발은 hGHRH 분자의 혈청 반감기를 연장한다. 또한, GHRH의 생물학적 활성 증대는 특이적 수용체에 대한 결합 친화성을 증가시킬 수 있는 초-활성 유사체를 사용하여 달성한다(Draghia-Akli et al., 1999).
성장 호르몬의 분비를 증가시킬 목적의 신규한 GHRH 유사체 단백질(미국특허 제5,847,066호; 제5,846,936호; 제5,792,747호; 제5,776,901호; 제5,696,089호; 제5,486,505호; 제5,137,872호; 제5,084,442호; 제5,036,045호; 제5,023,322호; 제4,839,344호; 제4,410,512호; RE33,699) 또는 GHRH의 합성 또는 천연 펩타이드 단편(미국특허 제4,833,166호; 제4,228,158호; 제4,228,156호; 제4,226,857호; 제4,224,316호; 제4,223,021호; 제4,223,020호; 제4,223,019호)에 관한 허여된 특허가 있다. 다음의 돌연변이를 함유한 GHRH 유사체가 보고된 바 있다(미국특허 제5,846,936호): 1번 위치의 Tyr이 His로; 2번 위치의 Ala가 Val, Leu 또는 다른 것으로; 8번 위치의 Asn이 Gln, Ser 또는 Thr로; 15번 위치의 Gly가 Ala 또는 Leu로; 27번 위치의 Met가 Nle 또는 Leu로; 및 28번 위치의 Ser이 Asn으로. 미국특허원 제60/145,624호(본원에 참고로 원용됨)의 대상인 GHRH 유사체는 활성을 위해 필요한 것으로 미국특허원 제5,846,936호에 보고된 모든 아미노산 치환을 함유하지 않는다. 미국특허원 제60/145,624호의 발명은 미국특허 제5,756,264호와 두 가지 관점에서 다르다. 첫째, 미국특허원 제60/145,624호의 발명은 GH 분비촉진제로서의 작용을 향상시키는(즉, 치료 효과 능력을 연장시켜 주는 것으로 프로테아제에 대한 민감성의 감소 및 안정성의 증가; 및 치료 효과 능력을 증대시켜 주는 것으로 생물학적 활성의 증가) 유의적인 변형을 갖고 야생형과 다른 성장 호르몬 분비 호르몬의 유사체에 관한 것이다. 미국특허원 제60/145,624호의 유사체는 미국특허 제5,756,264호의 GHRG 유사체에 존재하는 8번 위치에서의 Gln, Ser 또는 Thr로의 치환이 없다. 또한, 미국특허원 제60/145,624호의 발명은 한 관점에서 골격 α-액틴, 다중 MEF-2 부위, MEF-1 부위 및 TEF-1 결합 부위로부터의 근위 혈청 반응 요소(SRE)를 함유하고 천연 근성 프로모터의 전사 효능을 상당히 능가하는 SPc5-12(Li et al., 1999)라고 하는 특정 합성 프로모터에 연결된 GHRH 유사체를 암호화하는 DNA를 이용한다. 이러한 합성 프로모터의 특이성은 예를 들면 근성 프로모터 및 이의 용도에 관한 특허(예, 미국특허 제5,374,544호) 또는 핵산 서열의 근성 발현을 위한 시스템(예, 미국특허 제5,298,422호)에 비해 유의적인 개선이다.
미국특허 제5,061,690호는 임신중의 암컷 포유동물에 유효량의 hGRF 또는 이의 유사체중 하나를 10 내지 20일간 공급함으로써 출산 체중과 젖 생산을 증가시키는 것에 관한 것이다. 유사체의 적용은 수유기간 내내 계속된다. 그러나, 수회 투여가 제시되며, 유전자 요법 기술에서와 같이 DNA 분자로서 성장 호르몬 분비 호르몬(또는 인자)의 투여에 관한 기술 내용이 없다.
미국특허 제5,134,120호 및 제5,292,721호는 유사하게 DNA 형태로서 성장 호르몬 분비 호르몬의 투여에 관한 기술을 제공하지 않는다. 또한, 이들 특허는 잉태의 마지막 2주 기간내 및 출생 후 3주내에 재조합 단백질 GH의 수회 투여에 관한 것이다. 또한 본 발명에서 제공되는 것과 같이 어떠한 비-야생형 형태에 관하여도 전혀 논의된 바 없다.
가축에 성장 호르몬(GH)의 투여는 제지방 조직 침식 및/또는 젖 생성을 증진시키는 한편 급식 효율을 증대시킨다(Etherton et al., 1986; Klindt et al., 1998). 많은 연구들은 GH가 지육 지방의 양을 현저히 감소시키고, 결과적으로 육질은 증가한다. 그러나, 장기간 GH 투여는 실용적으로 및 생리학적으로 한계가 있으며 잠재적으로 그의 유용성 및 효용성을 약화시킨다(Chung et al., 1985; Gopinath and Etherton, 1989). 실험상 GH-분비 호르몬(GHRH)은 보다 생리학적 대안으로서 사용되었다. 돼지 또는 소와 같은 큰 종의 경우, GH의 상류 자극제인 GHRH의 사용은 성장 및 젖 생산뿐만 아니라 더욱 중요한 것으로 실질적이고 대사적인 측면으로부터 생산 효율을 증가시킬 수 있는 대안이다(Dubreuil et al., 1990; Farmer et al., 1992). 그러나, 재조합 펩타이드의 고비용 및 필요한 투여횟수가 현재 이 치료의 이용에 한계를 주고있다. 이들의 주된 단점은 GHRH의 전위 생성을 유도하는 유전자 요법을 사용함으로써, 그의 생성이 장기적으로 지속될 수 있다는 전제하에, 피할 수 있다. GHRH 유전자의 뇌하수체 조직-특이적 발현은 두개강외 분비된 GHRH가 생물학적으로 활성을 나타낼 수 있음에 따라 활성을 위해 필요하지 않다(Faglia et al., 1992; Melmed, 1991). GHRH를 전달하는 유전자 요법은 유전자, cDNA 및 천연 및 몇가지 돌연변이된 분자가 돼지, 소 및 많은 기타 종에서 그 특징이 잘 나타나 있으며 치료 요법의 결정이 수월하고 정확하기 때문에 유리하다. 골근조직이 근육내 주사를 산업적 세팅에서 쉽게 수행할 수 있고 근섬유의 수명이 길며 환형 DNA 플라스미드에 의해 형질도입될 수 있기때문에 표적 조직에 완벽한 후보자이다(Bettan et al., 2000; Everett et al., 2000). 따라서, 재투여할 필요가 없으며 트랜스유전자는 면역적격 숙주에서 수개월 또는 수년에 걸쳐 효율적으로 발현될 수 있다(Wolff et al., 1992).
발명의 요약
본 발명의 한 양태로서, 프로모터, 뉴클레오타이드 서열 및 3' 비해독 영역을, 뉴클레오타이드 서열이 발현되고 벡터의 도입 및 발현이 후손의 향상 또는 증진된 성장 결과를 제공하는 조건하에, 포함하는 벡터의 유효량을 암컷 동물의 세포내로 암컷 후손의 잉태이전 또는 동안에 도입하는 단계를 포함하여, 암컷 동물로부터 후손의 성장을 개선 또는 증진하는 방법이 제공된다. 특정 양태로서, 상기 암컷 동물의 세포는 이배체 세포를 포함한다. 다른 특정 양태로서, 상기 암컷 동물의 세포는 근육 세포를 포함한다. 추가의 특정 양태로서, 핵산 서열은 성장 호르몬 분비 호르몬 또는 이의 유사체를 암호화한다. 또 다른 추가의 특정 양태로서, 성장 호르몬 분비 호르몬은 서열 1, 서열 8 또는 이의 개개 유사체이다. 또 다른 추가의 특정 양태로서, 프로모터는 합성된 근성 프로모터를 포함한다. 또 다른 추가의 특정 양태로서, 3' 비해독 영역은 hGH 3' 비해독 영역을 포함한다. 또 다른 추가의 특정 양태로서, 벡터는 전기천공, 바이러스 벡터, 담체와의 결합 또는 비경구 경로를 통해 암컷 동물의 세포내로 도입된다. 또 다른 추가의 특정 양태로서, 암컷 동물은 사람, 애완 동물, 농장 동물, 식용 동물 또는 작업 동물이다. 추가의 특정 양태로서, 암컷 동물은 사람, 돼지, 소, 양, 염소 또는 닭이다. 추가의 다른 특정 양태로서, 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 리포좀 및 양이온성 지질로 이루어진 그룹중에서 선택된다. 또 다른 특정 양태로서, 벡터는 단일 투여로 암컷내로 도입된다. 다른 추가의 양태로서, 도입은 후손 잉태의 6-9개월 기간에 일어난다. 다른 추가의 특정 양태로서, 본 방법은 성장 호르몬 분비촉진제 수용체에 대한 리간드를 암컷에 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 특정 양태로서, 리간드의투여는 경구 투여이다.
본 발명의 추가의 양태로서, 프로모터, 뉴클레오타이드 서열 및 3' 비해독 영역을, 뉴클레오타이드 서열이 발현되고 벡터의 도입 및 발현이 후손의 성장 호르몬 수준의 증가 결과를 제공하는 조건하에, 포함하는 벡터의 유효량을 암컷 동물의 세포내로 암컷 후손의 잉태이전 또는 동안에 도입하는 단계를 포함하여, 암컷 동물로부터 후손의 성장 호르몬 수준을 증가시키는 방법이 제공된다. 특정 양태로서, 상기 암컷 동물의 세포는 이배체 세포를 포함한다. 다른 특정 양태로서, 상기 암컷 동물의 세포는 근육 세포를 포함한다. 추가의 특정 양태로서, 핵산 서열은 성장 호르몬 분비 호르몬 또는 이의 유사체를 암호화한다. 또 다른 추가의 특정 양태로서, 성장 호르몬 분비 호르몬은 서열 1, 서열 8 또는 이의 개개 유사체이다. 또 다른 추가의 특정 양태로서, 프로모터는 합성된 근성 프로모터를 포함한다. 또 다른 추가의 특정 양태로서, 3' 비해독 영역은 hGH 3' 비해독 영역을 포함한다. 또 다른 추가의 특정 양태로서, 벡터는 전기천공, 바이러스 벡터, 담체와의 결합 또는 비경구 경로를 통해 암컷 동물의 세포내로 도입된다. 또 다른 추가의 특정 양태로서, 암컷 동물은 사람, 애완 동물, 농장 동물, 식용 동물 또는 작업 동물이다. 추가의 특정 양태로서, 암컷 동물은 사람, 돼지, 소, 양, 염소 또는 닭이다. 추가의 다른 특정 양태로서, 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 리포좀 및 양이온성 지질로 이루어진 그룹중에서 선택된다. 또 다른 특정 양태로서, 벡터는 단일 투여로 암컷내로 도입된다. 다른 추가의 양태로서, 도입은 후손 잉태의 6-9개월 기간에 일어난다. 다른 추가의 특정 양태로서, 본 방법은 성장 호르몬 분비촉진제수용체에 대한 리간드를 암컷에 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 특정 양태로서, 리간드의 투여는 경구 투여이다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 프로모터, 뉴클레오타이드 서열 및 3' 비해독 영역을, 뉴클레오타이드 서열이 발현되고 벡터의 도입 및 발현이 후손의 제지방량 증가 결과를 제공하는 조건하에, 포함하는 벡터의 유효량을 암컷 동물의 세포내로 암컷 후손의 잉태이전 또는 동안에 도입하는 단계를 포함하여, 암컷 동물로부터 후손의 제지방량을 증가시키는 방법이 제공된다. 특정 양태로서, 상기 암컷 동물의 세포는 이배체 세포를 포함한다. 다른 특정 양태로서, 상기 암컷 동물의 세포는 근육 세포를 포함한다. 추가의 특정 양태로서, 핵산 서열은 성장 호르몬 분비 호르몬 또는 이의 유사체를 암호화한다. 또 다른 추가의 특정 양태로서, 성장 호르몬 분비 호르몬은 서열 1, 서열 8 또는 이의 개개 유사체이다. 또 다른 추가의 특정 양태로서, 프로모터는 합성된 근성 프로모터를 포함한다. 또 다른 추가의 특정 양태로서, 3' 비해독 영역은 hGH 3' 비해독 영역을 포함한다. 또 다른 추가의 특정 양태로서, 벡터는 전기천공, 바이러스 벡터, 담체와의 결합 또는 비경구 경로를 통해 암컷 동물의 세포내로 도입된다. 또 다른 추가의 특정 양태로서, 암컷 동물은 사람, 애완 동물, 농장 동물, 식용 동물 또는 작업 동물이다. 추가의 특정 양태로서, 암컷 동물은 사람, 돼지, 소, 양, 염소 또는 닭이다. 추가의 다른 특정 양태로서, 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 리포좀 및 양이온성 지질로 이루어진 그룹중에서 선택된다. 또 다른 특정 양태로서, 벡터는 단일 투여로 암컷내로 도입된다. 다른 추가의 양태로서, 도입은 후손 잉태의 6-9개월 기간에 일어난다.다른 추가의 특정 양태로서, 본 방법은 성장 호르몬 분비촉진제 수용체에 대한 리간드를 암컷에 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 특정 양태로서, 리간드의 투여는 경구 투여이다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 프로모터, 뉴클레오타이드 서열 및 3' 비해독 영역을, 뉴클레오타이드 서열이 발현되고 벡터의 도입 및 발현이 후손의 증가된 IGF-I 수준 결과를 제공하는 조건하에, 포함하는 벡터의 유효량을 암컷 동물의 세포내로 암컷 후손의 잉태이전 또는 동안에 도입하는 단계를 포함하여, 암컷 동물로부터 후손의 IGF-I의 수준을 증가시키는 방법이 제공된다. 특정 양태로서, 상기 암컷 동물의 세포는 이배체 세포를 포함한다. 다른 특정 양태로서, 상기 암컷 동물의 세포는 근육 세포를 포함한다. 추가의 특정 양태로서, 핵산 서열은 성장 호르몬 분비 호르몬 또는 이의 유사체를 암호화한다. 또 다른 추가의 특정 양태로서, 성장 호르몬 분비 호르몬은 서열 1, 서열 8 또는 이의 개개 유사체이다. 또 다른 추가의 특정 양태로서, 프로모터는 합성된 근성 프로모터를 포함한다. 또 다른 추가의 특정 양태로서, 3' 비해독 영역은 hGH 3' 비해독 영역을 포함한다. 또 다른 추가의 특정 양태로서, 벡터는 전기천공, 바이러스 벡터, 담체와의 결합 또는 비경구 경로를 통해 암컷 동물의 세포내로 도입된다. 또 다른 추가의 특정 양태로서, 암컷 동물은 사람, 애완 동물, 농장 동물, 식용 동물 또는 작업 동물이다. 추가의 특정 양태로서, 암컷 동물은 사람, 돼지, 소, 양, 염소 또는 닭이다. 추가의 다른 특정 양태로서, 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 리포좀 및 양이온성 지질로 이루어진 그룹중에서 선택된다. 또 다른 특정 양태로서, 벡터는 단일 투여로암컷내로 도입된다. 다른 추가의 양태로서, 도입은 후손 잉태의 6-9개월 기간에 일어난다. 다른 추가의 특정 양태로서, 본 방법은 성장 호르몬 분비촉진제 수용체에 대한 리간드를 암컷에 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 특정 양태로서, 리간드의 투여는 경구 투여이다.
본 발명의 또 다른 추가의 양태로서, 프로모터, 뉴클레오타이드 서열 및 3' 비해독 영역을, 뉴클레오타이드 서열이 발현되고 벡터의 도입 및 발현이 후손의 증가된 사료효율 결과를 제공하는 조건하에, 포함하는 벡터의 유효량을 암컷 동물의 세포내로 암컷 후손의 잉태이전 또는 동안에 도입하는 단계를 포함하여, 암컷 동물로부터 후손의 사료효율을 증가시키는 방법이 제공된다. 특정 양태로서, 상기 암컷 동물의 세포는 이배체 세포를 포함한다. 다른 특정 양태로서, 상기 암컷 동물의 세포는 근육 세포를 포함한다. 추가의 특정 양태로서, 핵산 서열은 성장 호르몬 분비 호르몬 또는 이의 유사체를 암호화한다. 또 다른 추가의 특정 양태로서, 성장 호르몬 분비 호르몬은 서열 1, 서열 8 또는 이의 개개 유사체이다. 또 다른 추가의 특정 양태로서, 프로모터는 합성된 근성 프로모터를 포함한다. 또 다른 추가의 특정 양태로서, 3' 비해독 영역은 hGH 3' 비해독 영역을 포함한다. 또 다른 추가의 특정 양태로서, 벡터는 전기천공, 바이러스 벡터, 담체와의 결합 또는 비경구 경로를 통해 암컷 동물의 세포내로 도입된다. 또 다른 추가의 특정 양태로서, 암컷 동물은 사람, 애완 동물, 농장 동물, 식용 동물 또는 작업 동물이다. 추가의 특정 양태로서, 암컷 동물은 사람, 돼지, 소, 양, 염소 또는 닭이다. 추가의 다른 특정 양태로서, 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 리포좀 및 양이온성 지질로 이루어진 그룹중에서 선택된다. 또 다른 특정 양태로서, 벡터는 단일 투여로 암컷내로 도입된다. 다른 추가의 양태로서, 도입은 후손 잉태의 6-9개월 기간에 일어난다. 다른 추가의 특정 양태로서, 본 방법은 성장 호르몬 분비촉진제 수용체에 대한 리간드를 암컷에 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 특정 양태로서, 리간드의 투여는 경구 투여이다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 프로모터, 뉴클레오타이드 서열 및 3' 비해독 영역을, 뉴클레오타이드 서열이 발현되고 벡터의 도입 및 발현이 후손의 증가된 성장속도 결과를 제공하는 조건하에, 포함하는 벡터의 유효량을 암컷 동물의 세포내로 암컷 후손의 잉태이전 또는 동안에 도입하는 단계를 포함하여, 암컷 동물로부터 후손의 성장속도를 증가시키는 방법이 제공된다. 특정 양태로서, 상기 암컷 동물의 세포는 이배체 세포를 포함한다. 다른 특정 양태로서, 상기 암컷 동물의 세포는 근육 세포를 포함한다. 추가의 특정 양태로서, 핵산 서열은 성장 호르몬 분비 호르몬 또는 이의 유사체를 암호화한다. 또 다른 추가의 특정 양태로서, 성장 호르몬 분비 호르몬은 서열 1, 서열 8 또는 이의 개개 유사체이다. 또 다른 추가의 특정 양태로서, 프로모터는 합성된 근성 프로모터를 포함한다. 또 다른 추가의 특정 양태로서, 3' 비해독 영역은 hGH 3' 비해독 영역을 포함한다. 또 다른 추가의 특정 양태로서, 벡터는 전기천공, 바이러스 벡터, 담체와의 결합 또는 비경구 경로를 통해 암컷 동물의 세포내로 도입된다. 또 다른 추가의 특정 양태로서, 암컷 동물은 사람, 애완 동물, 농장 동물, 식용 동물 또는 작업 동물이다. 추가의 특정 양태로서, 암컷 동물은 사람, 돼지, 소, 양, 염소 또는 닭이다. 추가의 다른 특정양태로서, 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 리포좀 및 양이온성 지질로 이루어진 그룹중에서 선택된다. 또 다른 특정 양태로서, 벡터는 단일 투여로 암컷내로 도입된다. 다른 추가의 양태로서, 도입은 후손 잉태의 6-9개월 기간에 일어난다. 다른 추가의 특정 양태로서, 본 방법은 성장 호르몬 분비촉진제 수용체에 대한 리간드를 암컷에 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 특정 양태로서, 리간드의 투여는 경구 투여이다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 프로모터, 뉴클레오타이드 서열 및 3' 비해독 영역을, 뉴클레오타이드 서열이 발현되고 벡터의 도입 및 발현이 후손의 증가된 성장호르몬분비세포 대 다른 호르몬-생성 세포 비율 결과를 제공하는 조건하에, 포함하는 벡터의 유효량을 암컷 동물의 세포내로 암컷 후손의 잉태이전 또는 동안에 도입하는 단계를 포함하여, 암컷 동물로부터 후손의 뇌하수체에서의 성장호르몬분비세포 대 다른 호르몬-생성 세포 비율을 증가시키는 방법이 제공된다. 특정 양태로서, 상기 암컷 동물의 세포는 이배체 세포를 포함한다. 다른 특정 양태로서, 상기 암컷 동물의 세포는 근육 세포를 포함한다. 추가의 특정 양태로서, 핵산 서열은 성장 호르몬 분비 호르몬 또는 이의 유사체를 암호화한다. 또 다른 추가의 특정 양태로서, 성장 호르몬 분비 호르몬은 서열 1, 서열 8 또는 이의 개개 유사체이다. 또 다른 추가의 특정 양태로서, 프로모터는 합성된 근성 프로모터를 포함한다. 또 다른 추가의 특정 양태로서, 3' 비해독 영역은 hGH 3' 비해독 영역을 포함한다. 또 다른 추가의 특정 양태로서, 벡터는 전기천공, 바이러스 벡터, 담체와의 결합 또는 비경구 경로를 통해 암컷 동물의 세포내로 도입된다. 또 다른 추가의 특정양태로서, 암컷 동물은 사람, 애완 동물, 농장 동물, 식용 동물 또는 작업 동물이다. 추가의 특정 양태로서, 암컷 동물은 사람, 돼지, 소, 양, 염소 또는 닭이다. 추가의 다른 특정 양태로서, 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 리포좀 및 양이온성 지질로 이루어진 그룹중에서 선택된다. 또 다른 특정 양태로서, 벡터는 단일 투여로 암컷내로 도입된다. 다른 추가의 양태로서, 도입은 후손 잉태의 6-9개월 기간에 일어난다. 다른 추가의 특정 양태로서, 본 방법은 성장 호르몬 분비촉진제 수용체에 대한 리간드를 암컷에 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 특정 양태로서, 리간드의 투여는 경구 투여이다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 프로모터, 뉴클레오타이드 서열 및 3' 비해독 영역을, 뉴클레오타이드 서열이 발현되고 벡터의 도입 및 발현이 후손의 지연된 출생 결과를 제공하는 조건하에, 포함하는 벡터의 유효량을 암컷 동물의 세포내로 암컷 후손의 잉태이전 또는 동안에 도입하는 단계를 포함하여, 암컷 동물로부터 후손의 출생을 지연시키는 방법이 제공된다. 특정 양태로서, 상기 암컷 동물의 세포는 이배체 세포를 포함한다. 다른 특정 양태로서, 상기 암컷 동물의 세포는 근육 세포를 포함한다. 추가의 특정 양태로서, 핵산 서열은 성장 호르몬 분비 호르몬 또는 이의 유사체를 암호화한다. 또 다른 추가의 특정 양태로서, 성장 호르몬 분비 호르몬은 서열 1, 서열 8 또는 이의 개개 유사체이다. 또 다른 추가의 특정 양태로서, 프로모터는 합성된 근성 프로모터를 포함한다. 또 다른 추가의 특정 양태로서, 3' 비해독 영역은 hGH 3' 비해독 영역을 포함한다. 또 다른 추가의 특정 양태로서, 벡터는 전기천공, 바이러스 벡터, 담체와의 결합 또는 비경구 경로를 통해암컷 동물의 세포내로 도입된다. 또 다른 추가의 특정 양태로서, 암컷 동물은 사람, 애완 동물, 농장 동물, 식용 동물 또는 작업 동물이다. 추가의 특정 양태로서, 암컷 동물은 사람, 돼지, 소, 양, 염소 또는 닭이다. 추가의 다른 특정 양태로서, 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 리포좀 및 양이온성 지질로 이루어진 그룹중에서 선택된다. 또 다른 특정 양태로서, 벡터는 단일 투여로 암컷내로 도입된다. 다른 추가의 양태로서, 도입은 후손 잉태의 6-9개월 기간에 일어난다. 다른 추가의 특정 양태로서, 본 방법은 성장 호르몬 분비촉진제 수용체에 대한 리간드를 암컷에 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 특정 양태로서, 리간드의 투여는 경구 투여이다. 특정 양태에서, 호르몬 생성 세포는 부신피질자극 호르몬 분비세포, 프로락틴 분비세포 및 성선 자극 호르몬 분비세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 프로모터, 뉴클레오타이드 서열 및 3' 비해독 영역을, 뉴클레오타이드 서열이 발현되고 벡터의 도입 및 발현이 동물의 증가된 젖 생성 결과를 제공하는 조건하에, 포함하는 벡터의 유효량을 동물의 세포내로 도입하는 단계를 포함하여, 동물의 젖 생성을 증가시키는 방법이 제공된다. 특정 양태로서, 상기 암컷 동물의 세포는 이배체 세포를 포함한다. 다른 특정 양태로서, 상기 암컷 동물의 세포는 근육 세포를 포함한다. 추가의 특정 양태로서, 핵산 서열은 성장 호르몬 분비 호르몬 또는 이의 유사체를 암호화한다. 또 다른 추가의 특정 양태로서, 성장 호르몬 분비 호르몬은 서열 1, 서열 8 또는 이의 개개 유사체이다. 또 다른 추가의 특정 양태로서, 프로모터는 합성된 근성 프로모터를 포함한다. 또 다른 추가의 특정 양태로서, 3' 비해독 영역은 hGH 3' 비해독 영역을 포함한다. 또 다른 추가의 특정 양태로서, 벡터는 전기천공, 바이러스 벡터, 담체와의 결합 또는 비경구 경로를 통해 암컷 동물의 세포내로 도입된다. 또 다른 추가의 특정 양태로서, 암컷 동물은 사람, 애완 동물, 농장 동물, 식용 동물 또는 작업 동물이다. 추가의 특정 양태로서, 암컷 동물은 사람, 돼지, 소, 양, 염소 또는 닭이다. 추가의 다른 특정 양태로서, 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 리포좀 및 양이온성 지질로 이루어진 그룹중에서 선택된다. 또 다른 특정 양태로서, 벡터는 단일 투여로 암컷내로 도입된다. 다른 추가의 양태로서, 도입은 후손 잉태의 6-9개월 기간에 일어난다. 다른 추가의 특정 양태로서, 본 방법은 성장 호르몬 분비촉진제 수용체에 대한 리간드를 암컷에 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 특정 양태로서, 리간드의 투여는 경구 투여이다.
기타 및 추가의 목적, 특징 및 이점은 하기 명세서를 읽고 이의 일부를 구성하는 첨부된 도면 또는 설명의 목적상 제공한 본 발명의 바람직한 양태의 예시를 참고로 하여 명백하고 보다 용이하게 이해될 것이다.
본 발명은 일반적으로 내분비학, 의학 및 세포 생물학에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 본 발명은 성장 및 기능의 증진, 즉 동물에서의 성장 호르몬 생성을 정상적인 성장과 연관된 수준보다 큰 수준으로 자극 및 성장 호르몬 분비 호르몬을 암호화한 DNA를 암컷 동물에 투여하는 것을 이용한 성장의 증진에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 특히 전기천공(electroporation) 기술을 이용하여 근육 조직내로 근육-특이적인 프로모터에 의해 조절되는 성장 호르몬 분비 호르몬 또는 이의 유사체와 같이 성장을 증진하는 뉴클레오타이드 서열을 적용하는 것에 관한 것이다.
도 1A 내지 1C는 GHRH 초-활성 유사체가 GH 분비촉진제 활성 및 안정성을 증가시킴을 증명한다. 도 1A는 돼지 야생형(1-40)OH 아미노산 서열을 유사체 HV-GHRH와 비교한 것이다. 도 1B는 돼지 원발성 뇌하수체 배양물에서의 돼지 GH 분비에 상이한 GHRH 종이 미치는 영향을 보여준다. 도 1C는 6시간의 배양 동안에 HV-GHRH 및 야생형 돼지 GHRH에서 발생한 안정성의 변화를 증명한다.
도 2A 내지 2E는 초-활성 유사체 GHRH 근성 발현 벡터의 일회 주사 후 2개월에 걸쳐서 GHRH, GH 및 IGF-I 혈청 수준의 증가를 증명한다. 도 2A는 SPc5-12 합성 프로모터와 GH의 3' UTR을 함유한 작제물을 도시한 것이다. 돌연변이된 단백질의 모델로서, HV-GHRH 작제물이 사용되었고 양성 대조군로서 돼지 야생형과 및 음성 대조군로서 β-갈락토시다제 작제물과 비교되었다. 도 2B는 pSP-GHRH 주사된 돼지 대 위약 주사된 대조군 돼지에서의 상대적인 혈청 GHRH 수준을 도해한 것이다. 도 2C는 pSP-GHRH 주사된 돼지 대 체중/혈액 용량 증가를 위해 교정된 대조군 돼지에서의 혈청 GHRH 절대 수준을 증명한다. 도 2D는 pSP-HV-GHRH 주사된 돼지에서의 GH 수준의 변화를 보여준다. 도 2E는 pSP-GHRH 작제물의 직접적인 근육내 주사 후의 혈장 IGF-I 수준을 보여준다.
도 3A 내지 3C는 돼지 성장에 미치는 근성 GHRH 발현 벡터의 영향을 증명한다. 도 3A는 돼지에 pSP-GHRH 또는 pSP-HV-GHRH를 주사한 후 2개월 동안의 돼지의 평균 체중 변화를 보여준다. 도 3C는 pSP-HV-GHRH 주사된 돼지와 위약 주사된 대조군 돼지를 주사 후의 45일 경과 동안 비교한 것이다.
도 4는 10일된 어린 돼지에 주사된 다른 양의 pSP-HV-GHRH가 IGF-I 수준에 미치는 영향을 보여준다.
도 5는 10일된 어린 돼지에 주사된 다른 양의 pSP-HV-GHRH가 IGF-I 수준에 미치는 영향을 보여준다.
도 6은 어린 돼지에 pSP-HV-GHRH 플라스미드의 주사에 대한 시간 경과를 도해한 것이다.
도 7은 주사가능한 전극을 위한 본 발명의 바람직한 양태 대 외부 캘리퍼 전극의 다른 양태를 도해한 것이다. 위쪽에는 2 평방 평판/1.5 cm 측면을 갖는 외부 캘리퍼 전극을 도해한 것이다. 아래쪽에는 1 cm 직경 배열에 존재하는 길이 2 cm, 18-26 g의 침을 갖는 6-침 배열 장치를 도해한 것이다. 좌측은 측면에서 본 것이고 우측은 저면에서 본 것이다.
도 8은 대조군 및 실험 어린 돼지의 신생 체중을 증명한다.
도 9는 실험 및 대조군 어린 돼지의 이유시점에서의 체중을 도해한 것이다.
도 10은 주사된 동물에 잡교 양육된 대조군의 체중과 그들의 한배 새끼의 체중을 비교한 것이다.
도 11은 대조군 암퇘지에 잡교 양육된 GHRH-처리된 암퇘지로부터의 어린 돼지의 체중을 그들의 한배 새끼의 체중을 비교한 것이다.
도 12는 대조군 암퇘지에 비육된 대조군에 대한 체중의 전체 증가를 도해한 것이다.
도 13은 실험 및 대조군 정육 체중을 비교한 것이다.
도 14는 3주, 10주 및 24주째에서 후손의 체중을 도해한 것이다.
도 15는 생후 3주째의 체중당 근육 체중을 보여준 것이다.
도 16은 후손의 전체 체중당 뇌하수체 체중을 증명한 것이다.
도 17은 후손의 GH, GHRH 및 PRL의 RNA 분석을 보여주며 GHRH가 뇌하수체에 성장 인자로서 작용함을 증명한다.
도 18은 GH-분비 세포의 DAB 염색을 도해한 것이다.
도 19는 3주, 12주 및 6개월째에서 후손의 IGF-I 농도를 증명한다.
본원에 기술된 본 발명은 본 발명의 범위 및 취지에서 벗어나지 않고서 여러가지로 치환 및 변형될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다.
본원에 사용된 용어 부정관사(a 또는 an)은 하나 이상을 의미할 수 있다. 청구항에 사용된 바와 같이 "포함하는" 단어와 병용하여 사용되는 경우 부정관사(a 또는 an)는 2개 이상을 의미할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "동물"은 동물의 모든 종을 포함한다. 바람직한 양태로서, 동물은 보다 특정적으로 사람, 야생 상태의 동물, 애완 동물(새, 개, 고양이, 말), 작업에 사용되는 동물(말, 소, 개) 및 음식을 공급하는 동물(닭, 소, 물고기), 가축(돼지, 말, 소, 양, 닭) 또는 자신이 음식인 동물(개구리, 닭, 물고기, 게, 가재), 새우, 조개, 가리비, 염소, 수퇘지, 소, 양, 암퇘지, 타조, 에뮤, 뱀장어) 및 기타 본 분야에 잘 알려진 동물을 가리킨다.
본원에 사용된 용어 "유효량"은 본 분야의 숙련가에게 알려진 수개의 종점을 사용하여 모니터링할 수 있는 숙주에게 효과를 얻는데 필요한 조성물의 양으로 정의된다. 특정한 양태로서, 이들 종점은 대체 표지이다.
본원에 사용된 용어 "사료 전환 효율"은 매일 동물이 섭취하는 음식의 양에 대하여 그 동물이 획득하는 체중의 양으로서 정의된다. 본원에 사용된 용어 "효율" 또는 "사료 효율"은 "사료 전환 효율"과 상호 바꾸어 쓸 수 있다.
본원에 사용된 용어 "성장 결핍증"은 성장이 정상에 미치지 못하는 건강 상태, 의학 상태 또는 질환으로 정의된다. 결핍증은 성장 호르몬 경로(예, GHRH-GH-IGF-I 축)에 직접적으로 영향을 미치거나, 성장 호르몬 경로에 간접적으로 영향을 미치거나, 성장 호르몬 경로에 전혀 영향을 미치지 않는 이탈 결과일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "성장 호르몬"은 성장에 관한 것으로 화학전달물질로 작용하여 표적 세포에 작용하는 호르몬으로서 정의된다.
본원에 사용된 용어 "성장 호르몬 분비 호르몬"은 성장 호르몬의 분비를 촉진 또는 자극하는 호르몬으로서 정의된다.
본원에 사용된 용어 "성장 호르몬 분비 호르몬 유사체"는 아미노산 서열의 천연 형태(합성된 덱스트로 또는 사이클릭 아미노산이 없음)에서 GHRH 분자에 천연적으로 존재하는 않는 아미노산 변이 및/또는 결실을 함유하면서도 기능을 유지하여 성장 호르몬의 합성 및 분비를 증대시키는 단백질로서 정의된다.
본원에 사용된 용어 "성장 호르몬 분비촉진제 수용체"(GHS-R)은 뇌하수체로부터의 성장 호르몬의 분비와 직간접으로 연관된 작은 합성 화합물의 수용체로서 정의된다.
본원에 사용된 용어 "제지방량"은 근육과 같이 무지방 조직에 속하는 동물의 신체 질량으로서 정의된다.
본원에 사용된 용어 "성장 호르몬 분비촉진제 수용체에 대한 리간드"는 성장 호르몬 분지촉지제 수용체에 대하여 효능제로서 작용하는 화합물로서 정의된다.리간드는 합성되거나 천연적인 것일 수 있다. 리간드는 펩타이드, 단백질, 당, 탄수화물, 지질, 핵산 또는 이의 조합일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "근성"은 특정적으로 근육 조직을 가리킨다.
본원에 사용된 용어 "신생"은 출생 직후 및 이후의 모든 성숙 또는 성장 단계의 동물을 가리킨다.
본원에 사용된 용어 "후손"은 태아 또는 신생아를 포함한 자손을 가리킨다.
본원에 사용된 용어 "비경구"는 동물내로 물질을 도입하기 위한 장관이외에 기작을 가리킨다. 특정 양태로서, 비경구로는 피하, 근육내, 정맥내, 경막내, 복강내 및 기타 방법이 있다.
본원에 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는"은 투여했을 때 수혜 동물이 허용할 수 있는 화합물을 가리킨다.
본원에 사용된 용어 "분비촉진제"는 감소-조절된 분자의 합성 및 분비를 증가시키는 천연 또는 합성 분자를 가리킨다(예, GHRH는 GH의 분비촉진제이다).
본원에 사용된 용어 "성장호르몬분비세포"는 성장 호르몬을 생성하는 세포를 가리킨다.
본원에 사용된 용어 "치료학적 유효량"은 생리학적으로 유의적인 화합물의 투여량을 가리킨다. 한 물질의 존재가 수혜 동물의 생리에 기술적 변화를 초래하는 경우 그 물질은 생리학적으로 유의적인 것이다. 예를 들면, 성장 결핍증의 치료에 있어서, 성장을 증대시키는 조성물은 치료학적으로 유효한 것일 수 있으며; 소모성 질환에 있어서는 손실율을 감소시키거나 성장을 증대시킬 수 있는 조성물이치료학적으로 유효한 것이다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 세포 또는 유기체내로 핵산을 전달하는 비히클을 가리킨다. 이의 예로는 플라스미드, 바이러스 벡터, 리포좀 또는 양이온성 지질이 포함된다. 특정 양태로서, 리포좀 및 양이온성 지질은 다른 벡터와 복합체를 형성하여 표적 세포에 의한 플라스미드 또는 바이러스 벡터의 흡수를 증가시킬 수 있는 보조제(담체)이다. 바람직한 양태로서, 벡터는 프로모터, 바람직하게는 성장 호르몬 분비 호르몬 또는 이의 유사체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 3' 비해독 영역을 포함한다. 다른 바람직한 양태로서, 프로모터, 뉴클레오타이드 서열 및 3' 비해독 영역은 진핵 세포에서의 발현을 위해 작동적으로 연결된다.
본원에 사용된 용어 "소모성 증세"는 소모병 또는 만성 소모병과 연관된 증세 및 상태로서 정의된다.
본원은 1999년 7월 26일에 출원된 미국가특허원 제60/145,624호 및 2000년 7월 24일에 출원된 미국특허원 제09/624,268호의 주요 요지와 관련되어 있다. 이들 특허원은 본원에 참고로 원용된다.
성장 호르몬 분비 호르몬(GHRH) 유전자 용법의 성장 효과를 평가하기 위해서, 임신 6-9개월째의 암퇘지에 야생형 (pSP-wt-GHRH) 또는 돌연변이된 (pSP-HV-GHRH) GHRH cDNA를 함유한 근성 벡터 10 mg을 주사하였다. 주사에 이어 전기천공을 주었다. 비-주사된/전기천공된 암퇘지는 대조군로서 사용하였다. GHRH 주사된 암퇘지로부터의 어린 돼지는 출생시 더욱 컸다(평균 1.65 ± 0.06 kg HV-GHRH, p<0.00002 및 1.46 ± 0.05 kg wt-GHRH, p<0.0014, 대조군 1.27 ± 0.02 kg). 교차양육 연구를 실시하였다. 이유시에 주사된 암퇘지의 새끼는 대조군보다 컸다. 주사된 암퇘지에서 젖을 빨린 교차양육 대조군은 한배 새끼보다 상당히 더 컸다. 이점은 계속되었고 주사된 암퇘지의 새끼는 출생 후 170일 경과시에 HV-GHRH의 경우 135.7 kg이었고 wt-GHRH의 경우 129.3 kg이었다. 수회의 생화학적 조치를 어린 돼지에 실시하였다. 주사된 암퇘지의 새끼에서 전체 단백질은 증가하였고 시험기간 내내 모든 시점에서 혈중 요소 수준은 감소하였으며, 양 상수는 향상된 단백질 대사를 증명한다. 크레아티닌 농도는 정상적이었으며 이는 정상적인 신장 기능을 가리킨다. 글루코스 및 인슐린 수준은 정상적이었다. 따라서, GHRH를 암호화하는 플라스미드 DNA 작제물을 사용하여 유전자 요법으로 처치된 암퇘지의 새끼는 출생 후 적어도 170일까지 정상 수준이상의 성장 패턴 증가를 보이며, 정상적인 항상성을 유지하면서 제지방체이다. 이러한 증가는 마찬가지로 주사된 암퇘지에서 젖 생산 및 후소의 시상하부 뇌하수체 축의 변형의 증가에 기여한다. 주요 실험의 이러한 증거는 플라스미드 매개된 전달이 고전적인 단백질 처치와 연관된 부작용을 피하면서 세대내내 특정한 동물의 특징을 증진시키는데 사용할 수 있음을 증명한다.
본 발명의 양태로서, 성장을 증가시키고, 성장을 증진시키며, 사료전환율을 증대시키고, 제지방량을 증가시키고, IGF-I 수준을 증가시키며, 성장속도를 증가시키고, 성장호르몬분비세포 대 기타 호르몬-생성 세포의 비율을 증대시키며, 출산을 지연시키고 또는 암컷의 후손에서 젖 생성을 증대시키는 핵산 서열이 본 발명의 방법에 사용된다. 특정 양태로서, 핵산 서열은 성장 호르몬 분비 호르몬, IGF-I, 프로락틴 또는 이의 유사체이다. 암컷은 모친, 임신 또는 출산 경험이 없는 암컷 또는 태반 이식에 의한 임신과 같은 대리모일 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태는 서얼번호: 1 또는 서열 8(wt GHRH)의 아미노산 서열을 갖는 성장 호르몬-분비 호르몬 유사체를 이용한다. 본원에 사용된 용어 "야생형"은 모든 동물의 GHRH의 내인성 형태일 수 있거나 돼지 GHRH와 같은 호르몬의 약간 변형된 형태일 수 있다. 당업자는 내인성 GHRH가 44개의 아미노산과 말단에 아미드 그룹을 가지고 있음을 알고 있으며, 이 형태의 정확한 표기는 (1-44)NH2-GHRH이다. 특정 양태로서, 단지 40개의 아미노산을 갖고(마지막 4개 아미노산이 결여) 아미드 그룹을 또한 함유하지 않는 형태가 사용되며, (1-40)OH-GHRH로 표기될 수 있다. 본원에 사용된 이 형태는, 부위 지시된 돌연변이유발에 의해 도입된 내부 돌연변이를 갖는 본원에 논의된 다른 형태(예, HV)와 반대로, 야생형 서열과 비교하여 내부 돌연변이를 함유를 함유하지 않기때문에 야생형으로 또한 언급될 수 있다. 당업자는 1-40 형태 및 보다 짧은 형태(예, 1-32 또는 1-29)가 사람 및 기타 포유동물(심지어 다른 유형의 GHRH 분비 종양)에 천연적으로 존재하며 천연 (1-44)NH2와 비슷한 활성을 갖는 다는 것을 알고 있다. 본 발명의 바람직한 양태로서, 야생형 GHRH에 비해 안정성이 증가된 GHRH가 사용된다.
다른 양태로서, GHRH의 다른 종 또는 GHRH의 유사체가 본 발명의 범위에 속한다. 본 발명의 목적에서 DNA에 의해 암호화된 잔기들은 핵산 투여의 특성하에 해독 후 변형되지 않는다.
다음의 종들은 본 발명의 범위에 속한다. 미국특허 제4,223,019호에는 아미노산 서열 NH2--Y--Z--E--G--J-COOH (여기서, Y는 D-라이신 및 D-아르기닌으로 이루어진 그룹중에서 선택되고; Z와 J는, 독립적으로, 티로신, 트립토판 및 페닐알라닌으로 이루어진 그룹중에서 선택되며; E와 G는, 독립적으로, D-티로신, D-트립토판 및 D-페닐알라닌으로 이루어진 그룹중에서 선택된다)를 갖는 펩타펩타이드가 기술되어 있다. 미국특허 제4,223,020호에는 아미노산 서열 NH2--Y--Z--E--G-COOH (여기서, Y와 G는, 독립적으로, 티로신, 트립토판 및 페닐알라닌으로 이루어진 그룹중에서 선택되며; Z와 E는, 독립적으로, D-티로신, D-트립토판 및 D-페닐알라닌으로 이루어진 그룹중에서 선택된다)를 갖는 테트라펩타이드가 기술되어 있다. 미국특허 제4,223,021호에는 아미노산 서열 NH2--Y--Z--E--G--J-COOH (여기서, Y와 G는, 독립적으로, 티로신, 트립토판 및 페닐알라닌으로 이루어진 그룹중에서 선택되며; Z는 글리신, 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 하이드록시프롤린, 세린, 트레오닌, 시스테인 및 메티오닌으로 이루어진 그룹중에서 선택되고; E와 Z는 독립적으로 D-티로신, D-트립토판 및 D-페닐알라닌으로 이루어진 그룹중에서 선택된다)를 갖는 펩타펩타이드가 기술되어 있다. 미국특허 제4,224,316호에는 아미노산 서열 NH2-Y-Z-E-G-J-COOH (여기서, Y와 E는, 독립적으로, D-티로신, D-트립토판 및 D-페닐알라닌으로 이루어진 그룹중에서 선택되고; Z와 G는 티로신, 트립토판 및 페닐알라닌으로 이루어진 그룹중에서 선택되며; J는 글리신, 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 하이드록시프롤린, 세린, 트레오닌, 시스테인, 메티오닌, 아스파트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민, 아르기닌 및 라이신으로 이루어진 그룹중에서 선택된다)를 갖는 펜타펩타이드가 기술되어 있다. 미국특허 제4,226,857호에는 아미노산 서열 NH2-Y-Z-E-G-J-COOH (여기서, Y와 G는, 독립적으로, 티로신, 트립토판 및 페닐알라닌으로 이루어진 그룹중에서 선택되고; Z와 J는, 독립적으로, D-티로신, D-트립토판 및 D-페닐알라닌으로 이루어진 그룹중에서 선택되며; E는 글리신, 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 하이드록시프롤린, 세린, 트레오닌, 시스테인, 메티오닌, 아스파트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민 및 히스티딘으로 이루어진 그룹중에서 선택된다)를 갖는 펜타펩타이드가 기술되어 있다. 미국특허 제4,228,155호에는 아미노산 서열 NH2-Y-Z-E-G-J-COOH (여기서, Y는 티로신, D-티로신, 트립토판, D-트립토판, 페닐아라닌 및 D-페닐알라닌으로 이루어진 그룹중에서 선택되고; Z와 E는, 독립적으로, D-티로신, D-트립토판 및 D-페닐알라닌으로 이루어진 그룹중에서 선택되며; G는 라이신 및 아르기닌으로 이루어진 그룹중에서 선택되고; J는 글리신, 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 하이드록시프롤린, 세린, 트레오닌, 시스테인 및 히스티딘으로 이루어진 그룹중에서 선택된다)를 갖는 펜타펩타이드가 기술되어 있다. 미국특허 제4,228,156호에는 아미노산 서열 NH2-Y-Z-E-COOH (여기서, Y 및 Z는, 독립적으로, D-티로신, D-트립토판 및 D-페닐알라닌으로 이루어진 그룹중에서 선택되고; E는 티로신, 트립토판 및 페닐알라닌으로 이루어진 그룹중에서 선택된다)를 갖는 펩타펩타이드가 기술되어 있다. 미국특허 제4,833,166호에는 식 H-Asp-Pro-Val-Asn-Ile-Arg-Ala-Phe-Asp-Asp-Val-Leu-Y (여기서, Y는 OH 또는 NH2이다)을 갖는 합성 펩타이드 또는 이의 무독성 염및 식 H-Val-Glu-Pro-Gly-Ser-Leu-Phe-Leu-Val-Pro-Leu-Leu-Pro-Val-His-Asp-Phe-Val-Gln-Gln-Phe-Ala-Gly-Ile-Y (여기서, Y는 OH 또는 NH2이다)을 갖는 합성 펩타이드 또는 이의 무독성 염이 기술되어 있다. Draghia-Akli 등 (1997)은 처음에 Mayo 등 (1995)에 의해 기술된 31-아미노산 시그날 펩타이드와 완전한 성숙 펩타이드 사람 GHRH(1-44)OH(Tyr1-Leu44)를 암호화하는 hGHRH의 228-bp 단편을 이용한다. Guillemin 등 (1992)은 또한 사람 췌장 성장 호르몬 분비 인자 (hpGRE)의 서열을 결정한다.
본 발명의 추가의 양태는 (1) 후손의 성장능을 향상시키는 방법; (2) 후손의 성장 호르몬 생성을 정상적인 성장과 연관된 것보다 많은 수준으로 자극하는 방법; 및 (3) 후손의 성장을 증대시키는 방법을 포함한다. 이들 모든 방법은 플라스미드 벡터를 후손의 임신 동안 또는 이전 임신동안에 후손의 모친내로 도입하는 단계를 포함하며, 상기 벡터는 기능적인 발현을 위해 적절한 거리를 두고 순차적으로 작동적으로 연결된 프로모터, 뉴클레오타이드 서열 (예, 서열 1 또는 서열 8을 암호화하는 서열) 및 3' 비해독 영역을 포함한다.
추가의 특정 양태로서, 기능적인 발현을 위해 적절한 거리를 두고 순차적으로 작동적으로 연결된 프로모터, 서열 1 또는 서열 8을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 3' 비해독 영역을 포함하는 벡터를 후손의 임신 동안에 후손의 모친내로 도입하는 단계를 포함하여, 정상적인 성장과 연관된 것보다 많은 수준으로 후손의 성장 호르몬 생성을 자극하는 방법이 제공된다. 정상적인 성장과 연관된 것보다많은 수준은 성장-연관된 결핍증 동물 또는 성장-연관된 결핍증이 없는 동물을 포함하여 군락에서 기타 유사한 동물과 비슷한 성장 수준의 동물의 기초, 고유 성장을 포함한다.
바람직한 양태로서, 기능적인 발현을 위해 적절한 거리를 두고 순차적으로 작동적으로 연결된 프로모터, 서열 1 또는 서열 8을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 3' 비해독 영역을 포함하는 벡터의 유효량을 동물에 도입하여 동물의 성장을 증진시키는 방법이 제공된다. 성장이 증진되는 동물은 성장 결핍증을 앓고 있거나 앓고 있지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 동물, 바람직하게는 모친으로부터의 후손의 성장 및/또는 성장 속도를 증가시키는데 있다. 바람직한 양태로서, 동물의 성장 및/또는 성장 속도는 수주 이상 또는 수개월 이상과 같은 장기간 동안 진행된다. 특정 양태로서, 이는 성장 호르몬 분비 호르몬을 후손의 모친에, 바람직하게는 핵산 형태로서, 투여함으로써 달성한다. 바람직한 양태로서, GHRH 핵산은 근육 세포에서 에피좀으로서 유지된다. 특정 양태로서, GHRH의 증가는 성장 호르몬 생성 세포의 수를 증가시킴으로써 뇌하수체에 영향을 미치며, 이에 따라 그들의 세포 계통에 변화를 일으킨다. 특정 양태로서, 성장호르몬분비세포 (성장 호르몬 생성 세포)의 비율은 뇌하수체에서의 다른 호르몬 생성 세포, 예를 들면 부신피질자극호르몬분비세포, 프로락틴분비세포, 성선자극호르몬분비세포 등에 비하여 증가한다. 특정 양태로서, 성장 호르몬-생성 세포의 숫적 증가와 연관된 성장 호르몬의 증가는 IGF-I 수준의 증가에서 반영된다. 다른 특정 양태로서, 성장 호르몬 수준의 증가는 제지방량의 증가 및 후손의 성장 속도의 증가와 연관이 있다. 다른 특정 양태로서, 제지방량의 증가는 골 계통 성장의 증가와 연관이 있다. 추가의 특정 양태로서, 후손의 사료전환율이 증가한다. 다른 특정 양태로서 후손의 출생이 지연되고, 바람직한 양태로서 이것은 태아의 향상된 또는 증가된 성장 속도와 연관이 있다.
바람직한 양태로서, 프로모터는 합성 근성 프로모터이며 hGH 3' 비해독 영역은 3' 비해독 영역안에 있다. 그러나, 3' 비해독 영역은 어떠한 천연 또는 합성 영역으로부터 유래된 것일 수 있다. 본 발명의 특정 양태로서, 골 α-액틴, 다중 MEF-2 부위, MEF-1 부위 및 TEF-1 결합 부위로부터의 근접 혈청 반응 요소(SRE)를 함유하고 천연 근성 프로모터의 전사 효능을 상당히 초과하는 SPc5-12(Li et al., 1999)(서열 6)라고 하는 합성 프로모터가 사용된다. 바람직한 양태로서, 본 발명에서 사용된 프로모터는 내인성 세포 기작 또는 인자에 의해 활성이 정지하거나 유의적으로 감소하지 않는다. 트랜스-작용 인자 결합 부위 및 인핸서를 포함한 다른 요소가 본 발명의 이러한 양태에 따라 사용할 수 있다. 다른 양태로서, 천연 근성 프로모터가 사용되며 당업자는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank 데이터베이스 또는 NCBI PubMed 사이트를 포함한 데이터베이스로부터 그러한 프로모터 서열을 획득하는 방법을 잘 알고 있다. 당업자는 이들 월드 와이드 웹 사이트를 사용하여 본 발명과 관련된 서열 또는 문헌을 얻을 수 있다.
특정 양태로서, hGH 3' 비해독 영역(서열 7)은 플라스미드와 같은 핵산 벡터에서 이용된다.
특정 양태로서, 상기 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 리포좀 및 양이온성 지질로 이루어진 그룹중에서 선택된다. 보다 특정한 양태로서, 상기 벡터는 근성 세포 또는 근육 조직내로 도입된다. 추가의 특정 양태로서, 상기 동물은 사람, 애완 동물, 작업 동물 또는 식용 동물이다.
그러한 작제물을 동물내로 플라스미드 벡터를 통해 도입하는 특정 양태이외에, 본 분야에 알려진 동물 또는 이의 세포내로 핵산을 형질감염시키기 위한 전달 시스템을 사용할 수 있다. 예를 들면, 다른 비바이러스 또는 바이러스 방법을 사용할 수 있다. 당업자는 DNA 또는 RNA의 비바이러스 형태의 표적 시스템이 4가지의 구성요소를 필요로 한다는 것을 인식한다: 1) 해당 DNA 또는 RNA; 2) 세포 표면 수용체 또는 항원을 인식하고 그에 결합하는 잔기; 3) DNA 결합 잔기; 및 4) 세포 표면으로부터 세포질로 복합체의 수송을 가능하게 하는 용해성 잔기. 또한, 리포좀 및 양이온성 지질을 사용하여 치료 유전자 조합체를 전달하여 동일한 효과를 달성할 수 있다. 가능성이 있는 바이러스 벡터로는 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 소 유두종 바이러스와 같이 바이러스로부터 유래된 발현 벡터가 포함된다. 또한, 에피좀 벡터가 사용될 수 있다. 다른 DNA 벡터 및 이송 시스템이 본 분야에 알려져 있다.
당업자는 여러 세균 플라스미드, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스 또는 백시니아 바이러스로부터 유도된 발현 벡터가 표적 기관, 조직 또는 세포 군에 뉴클레오타이드 서열을 전달하는데 사용할 수 있음을 알고 있다. 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 성장 호르몬 분비 호르몬 유사체를 암호화하는 유전자를 발현하는 재조합 벡터를 작제할 수 있다. 일시적인 발현이 비-복제 벡터로 한달 이상 동안 지속될 수 있으며 적절한 복제 요소가 벡터 시스템의 일부인 경우 더욱 장기간 지속될 수 있다.
본 발명의 목적은 성장 호르몬 분비 호르몬의 1회 투여가 수회의 임신 기간동안에 충분하며 또한 증가된 성장 및 변화된 신체 조성으로서 정육 체중에 어린 돼지 성능을 강화하는 요법을 제공하는데 있다.
핵산
1. 벡터
본원에 사용된 용어 "벡터"는 벡터가 복제하고 핵산 서열이 발현할 수 있는 세포내로 핵산 서열을 도입하기 위해 삽입할 수 있는 캐리어 핵산 분자를 가리킨다. 핵산 서열은 외인성일 수 있으며, 이는 벡터가 도입되는 세포에 외래성이거나 세포에 있지만 서열이 보통 발견되지 않는 숙주 세포의 핵산내에 위치한 서열에 상동성임을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스(벡테리오파아지, 동물 바이러스 및 식물 바이러스) 및 인공 염색체(예, YAC)를 포함한다. 당업자는 표준 재조합 기술을 통해 벡터를 작제할 수 있으며 이들 기술은 Maniatis et al., 1988 및 Ausubel et al., 1994에 기술되어 있다. 이들 모두는 본원에 참고로 원용된다.
용어 "발현 벡터"는 전사될 수 있는 유전자 산물의 적어도 일부를 암호화하는 핵산 서열을 함유한 벡터를 가리킨다. 특정 양태로서, 핵산 서열은 GHRH의 일부 또는 전부를 암호화한다. 일부 경우에서, RNA 분자가 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드로 해독된다. 다른 경우에서는 그들 서열은 예를 들면 안티센스 분자 또는 리보자임의 생성시 해독되지 않는다. 발현 벡터는 다양한 "조절 서열"을 함유할 수 있으며, 이는 특정 숙주 유기체에서 작동적으로 연결된 암호 서열의 전사 및 가능한 해독을 위해 필요한 핵산 서열을 가리킨다. 전사 및 해독을 통제하는 조절 서열이외에, 벡터 및 발현 벡터는 다른 기능을 제공하고 여기에 기술되어 있는 핵산 서열을 함유할 수 있다.
바람직한 양태로서, 본 발명의 벡터는 합성된 근성 (근육-특이적) 프로모터, 성장 호르몬 분비 호르몬 또는 이의 유사체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 3' 비해독 영역을 포함한 플라스미드이다. 다른 양태로서, 벡터는 아데노-연관된 바이러스, 아데노바이러스 또는 레트로바이러스와 같은 바이러스 벡터이다. 또 다른 양태로서, 골격 알파-액틴 프로모터, 마이오신 경쇄 프로모터, 사이토메갈로바아러스 프로모터 또는 SV40 프로모터를 사용할 수 있다. 또 다른 양태로서, 사람 성장 호르몬, 소 성장 호르몬, SV40 또는 골격 알파 액틴 3' 비해독 영역이 벡터에 사용된다.
a. 프로모터 및 인핸서
"프로모터"는 전사 개시 및 속도가 조절되는 핵산 서열의 영역인 조절 서열이다. 이는 RNA 폴리머라제 및 다른 전사 인자와 같은 조절 단백질 및 분자가 결합할 수 있는 유전 요소를 함유할 수 있다. 용어 "작동적으로 위치한", "작동적으로 연결된", "조절하에" 및 "전사 조절하에"는 프로모터가 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 조절하는 핵산 서열과 관련하여 정확한 작동 위치 및/또는 방향에 있음을 의미한다. 프로모터는 인핸서와 결합하여 사용되거나 사용되지 않을 수 있으며, 인핸서는 핵산 서열의 전사 활성화에 연루된 cis-작용성 조절 서열을 가리킨다.
프로모터는 암호 단편 및/또는 엑손의 상류에 위치한 천연 암호 서열중 하나일 수 있다. 이러한 프로모터는 내인성이라고 할 수 있다. 유사하게, 인핸서는 그 서열의 상류 또는 하류에 위치한 핵산 서열과 천연적으로 연관된 것일 수 있다. 다른 방도로서, 암호 핵산 단편을 재조합 또는 이질성 프로모터의 조절하에 위치해 둠으로써 특정 이점을 얻을 수 있다. 이러한 프로모터는 천연 환경에서 핵산 서열과 정상적으로 연관되지 않은 프로모터를 가리킨다. 이러한 프로모터 또는 인핸서는 다른 유전자의 프로모터 또는 인핸서, 다른 원핵, 바이러스 또는 원핵 세포로부터 분리된 프로모터 또는 인핸서 및 천연적으로 존재하지 않는, 즉 상이한 전사 조절 영역의 다른 요소 및/또는 발현을 변화시키는 돌연변이를 함유한 프로모터 또는 인핸서를 포함할 수 있다. 프로모터 및 인핸서의 핵산 서열을 합성적으로 생산하는 것이외에, 본원에 기술된 조성물과 관련하여 PCRTM을 포함한 핵산 증폭 기술 및/또는 재조합 클로닝을 사용하여 서열을 제조할 수 있다(참조: 미국특허 제4,683,202 및 제5,928,906호, 이들 특허의 내용은 본원에 참고로 원용된다). 또한, 서열의 전사 및/또는 발현을 미토콘드리아, 엽록체 등과 같은 비핵 소기관내에서 지시하는 조절 서열이 또한 사용될 수 있다.
당연히, 발현을 위해 선택된 세포 종류, 소기관 및 유기체에서 DNA 절편의 발현을 효과적으로 지시하는 프로모터 및/또는 인핸서를 사용하는 것은 중요하다. 분자 생물학의 숙련가는 단백질 발현을 위해 프로모터, 인핸서 및 세포 종류를 조합하여 사용하는 것에 대해 일반적으로 알고 있다(참조: Sambrook et al. (1989)-이의 내용은 본원에 참고로 원용된다). 사용된 프로모터는 재조합 단백질 및/또는 펩타이드의 대량 생산에서 유리한 것처럼 도입된 DNA 절편의 고 수준 발현을 유도하는 적절한 조건하에서 구성적, 조직-특이적, 유도성 및/또는 유용할 수 있다. 프로모터는 이질성 또는 내인성일 수 있다. 특정 양태로서, 프로모터는 문헌[참조: Li et al (1999)]에 기술된 것과 같이 합성된 근성 프로모터이다.
조직-특이적 프로모터 또는 요소의 실체뿐만 아니라 그들의 활성을 특성화하는 검정은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 영역의 예로는 사람 LIMK2 유전자(Nomoto et al. 1999), 소마토스타틴 수용체 2 유전자(Kraus et al. 1998), 쥐 부고환 레틴산-결합 유전자(Lareyre et al., 1999), 사람 CD4(Zhao-Emonet et al. 1998), 마우스 알파2(XI) 콜라겐(Tsumaki, et al., 1998), D1A 도파민 수용체 유전자(Lee, et al., 1997), 인슐린-유사 성장 인자 II(Wu et al., 1997), 사람 혈소판 내피 세포 흡착 분자-1(Almendro et al., 1996)이 포함된다.
b. 개시 시그날 및 내부 리포좀 결합 부위
특정 개시 시그날은 또한 암호 서열의 효율적인 해독을 위해 필요할 수 있다. 이들 시그날은 ATG 개시 코돈 또는 인접한 서열을 포함한다. ATG 개시 코돈을 포함한 외인성 해독 조절 시그날은 제공될 필요가 있을 수 있다. 당업자는 이것을 용이하게 결정하고 필요한 시그날을 제공할 수 있다. 개시 코돈은 완전한 삽입체의 해독을 보장하기 위해 목적하는 암호 서열의 판독 프레임과 프레임내에 있어야한다는 것은 잘 알려져 있다. 외인성 해독 조절 시그날 및 개시 코돈은 천연 또는 합성적인 것일 수 있다. 발현 효율은 적절한 전사 인핸서 요소를 포함시킴으로써 증강시킬 수 있다.
본 발명의 특정 양태로서, 내부 리보좀 진입 부위(IRES) 요소를 사용하여 다중유전자 또는 폴리시스트론 메시지를 창출한다. IRES 요소는 5' 메틸화된 Cap 의존 해독의 리보좀 스캐닝 모델을 우회하고 내부 부위에서 해독을 개시할 수 있다(Pelletier and Sonenberg, 1988). 피코나바이러스 계열의 두 구성 요소(폴리오 및 뇌심근염)로부터의 IRES 요소(Macejak and Sarnow, 1991)뿐만 아니라 포유동물 메시지로부터의 IRES(Macejak and Sarnow, 1991)가 공지되어 있다. IRES 요소는 이종 개방판독 프레임에 연결될 수 있다. 다중 개방판독 프레임이 함께 전사될 수 있으며, 각각은 IRES에 의해 분리되어 폴리시스트론 메시지를 창출한다. IRES 요소로 인해, 각 개방판독 프레임은 효율적인 해독을 위한 리보좀에 근접한다. 다중 유전자는 단일 프로모터/인핸서를 사용하여 효율적으로 발현시켜 단일 메시지를 전사시킬 수 있다(참조: 미국특허 제5,925,565호 및 제5,935,819호, 이들 내용은 본원에 참고로 원용된다).
c. 다중 클로닝 부위
벡터는 다중 제한 효소 부위를 함유한 핵산 영역인 다중 클로닝 부위(MCS)를 포함할 수 있다. 제한 효소 부위는 어떠한 것도 표준 재조합 기술과 병용하여 벡터를 분해시킬 수 있다. (참조: Carbonelli et al., 1999, Levenson et al., 1998 및 Cocea, 1997, 이들 내용은 본원에 참고로 원용된다). "제한 효소 분해"는 핵산 분자의 특정 위치에서만 작용하는 효소에 의한 핵산 분자의 촉매적 절단을 가리킨다. 많은 제한 효소들이 시판되고 있다. 이러한 효소의 사용은 당업자에의해 널리 이해되고 있다. 흔히, 벡터는 외래 서열을 벡터에 연결하기 위해 MCS내를 절단하는 제한 효소를 사용하여 선형으로 만들거나 절편으로 만든다. "연결"은 서로 인접하거나 인접하지 않을 수 있는 두 핵산 단편사이의 포스포디에스테르 결합을 형성하는 과정을 가리킨다. 제한 효소 및 연결 반응이 연루된 기술은 재조합 기술의 숙련가에게 잘 알려져 있다.
d. 스플라이싱 부위
대부분의 전사된 진핵 RNA 분자는 원발 전사체로부터 인트론을 제거하는 RNA 스플라이싱을 겪을 것이다. 게놈 진핵 서열을 함유한 벡터는 단백질 발현을 위한 전사물의 적절한 프로세싱을 보장하기 위해 공여자 및/또는 수용자 스플라이싱 부위를 필요로할 수 있다. (참조: Chandler et al., 1997, 이의 내용은 본원에 참고로 원용된다).
e. 폴리아데닐화 시그날
발현에서, 전사물의 적절한 폴리아데닐화를 위해 폴리아데닐화 시그날을 포함시키는 것이 전형적이다. 폴리아데닐화 시그날의 특성은 본 발명의 성공적인 실시에 중요한 것은 아니며/아니거나 그러한 서열은 어떠한 것도 사용할 수 있다. 바람직한 양태는 SV40 폴리아데닐화 시그날 및/또는 소 또는 사람 성장 호르몬 폴리아데닐화 시그날을 포함하며, 이들은 편리하고/하거나 여러 표적 세포에서 잘 기능하는 것으로 알려져 있다. 또한, 발현 카세트의 요소로서 전사 종결 부위가 고려된다. 이들 요소는 메시지 수준을 증가시키고/시키거나 카세트로부터 다른 서열로의 판독을 최소화하는 역할을 할 수 있다.
f. 복제 오리진
숙주 세포에서 벡터를 증식하기 위해, 하나 이상의 복제 오리진 부위(흔히 "ori"로 표시된다)를 함유할 수 있으며, 이는 복제가 개시되는 특정 핵산 서열이다. 다른 방도로서, 자가 복제 서열(ARS)은 숙주 세포가 효모인 경우 사용할 수 있다.
g. 선택 및 선별 마커
본 발명의 특정 양태로서, 세포는 본 발명의 핵산 작제물을 함유하며, 세포는 발현 벡터에 마커를 포함시킴으로써 시험관내 또는 생체내에서 동정할 수 있다. 이러한 마커는 동정가능한 변화를 세포에 제공하여 발현 벡터를 함유한 세포의 간편한 동정을 가능케한다. 일반적으로, 선별 마커는 선별을 허용하는 특성을 제공하는 것이다. 양성 선별 마커는 마커의 존재가 선별을 허용하는 것인 한편 음성 선별 마커는 이의 존재가 선별을 저지하는 것이다. 양성 선별 마커의 예는 약물 내성 마커이다.
보통, 약물 내성 마커의 삽입은 형질전환체의 클로닝 및 동정에 보조적인 역할을 한다. 예를 들면 네오마이신, 퓨로마이신, 하이그로마이신, DHFR, GPT, 제오신 및 히스티디놀에 대한 내성을 제공하는 유전자는 유용한 선별 마커이다. 조건의 이행을 기초로 하여 형질전환체의 식별을 허용하는 표현형을 제공하는 마커이외에, 색도계 분석을 기초로 한 GFP와 같은 선별 마커를 포함한 다른 유형의 마커가 또한 고려된다. 다른 방도로서, 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제(tk) 또는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT)와 같은 선별 효소를 사용할 수 있다. 당업자는 또한 가능한 FACS 분석과 병용하여 면역학적 마커를 사용하는 방법을 알고있다. 사용된 마커는 유전자 산물을 암호화하는 핵산과 동시에 발현될 수 있는 한 중요한 것으로 믿어지지 않는다. 선택 및 선별 마커의 예는 당업자에게 잘 알려져 있다.
2. 숙주 세포
본원에 사용된 용어 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 상호교환하여 사용할 수 있다. 이들 모든 용어는 또한 이의 후손 및 이후의 연속된 모든 세대를 포함한다. 모든 후손은 의도적이거나 우연한 돌연변이로 인해 동일하지 않을 수있음을 이해할 것이다. 이종 핵산 서열을 발현하는 측면에서, "숙주 세포"는 원핵 또는 진핵 세포를 가리키며 벡터를 복제할 수 있고/있거나 벡터에 의해 암호화된 이종 유전자를 발현할 수 있는 모든 형질전환가능한 유기체를 포함한다. 숙주 세포는 벡터의 수용체로서 사용될 수 있고 사용되어 왔다. 숙주 세포는 형질전환되거나 형질감염될 수 있으며, 이들 용어는 외래 핵산이 숙주 세포내로 전달되거나 도입되는 과정을 가리킨다. 형질전환된 세포는 원발 대상 세포 및 이의 후손을 포함한다.
숙주 세포는 목적하는 결과가 벡터의 복제 또는 벡터-암호화된 핵산 서열의 일부 또는 전부의 발현인지에 따라 원핵 또는 진핵 세포로부터 유도될 수 있다. 많은 세포주 및 배양물이 숙주 세포로 이용되고 있으며 이들은 ATCC (American Type Culture Collection)을 통해 입수할 수 있다. 이 기관은 생존 배양물 및 유전 물질의 보관소로 작용하는 기관이다(www.atcc.org). 적당한 숙주는 벡터 골격 및 목적하는 결과를 기준으로 당업자에 의해 결정될 수 있다. 플라스미드 또는 코스미드는 예를 들면 많은 벡터의 복제를 위해 원핵 숙주 세포내로 도입할 수 있다. 벡터 복제 및/또는 발현을 위해 숙주 세포로 사용된 세균 세포는 DH5a, JM109 및 KC8뿐만 아니라 SURE® 컴피턴트 세포 및 SOLOPACKa Gold 세포(STRATAGENE®, La Jolla)와 같은 많은 시판 세균 숙주를 포함한다. 다른 방도로서, 이. 콜라이 LE392와 같은 세균 세포가 파아지 바이러스를 위한 숙주 세포로서 사용할 수 있다.
벡터의 복제 및/또는 발현을 위한 진핵 숙주 세포의 예로는 HeLa, NIH3T3, Jurkat, 293, Cos, CHO, Saos 및 PC12이 포함된다. 여러 세포 유형 및 유기체로부터의 많은 숙주 세포가 이용되고 있고 당업자에게 알려져 있다. 유사하게, 바이러스 벡터는 진핵 또는 원핵 숙주 세포, 특히 벡터의 복제 또는 발현을 허용하는 세포와 병용할 수 있다.
일부 벡터는 원핵 및 진핵 세포 모두에서 복제되고/되거나 발현될 수 있도록 하는 조절 서열을 사용할 수 있다. 당업자는 상기된 숙주 세포 모두에 대해 이들을 유지하고 벡터의 복제를 가능케 하기 위해 배양하는 조건을 이해한다. 또한 벡터의 대량 생산뿐만 아니라 벡터에 의해 암호화된 핵산 및 이들의 동계 폴리펩타이드, 단백질 또는 펩타이드의 생성을 허용하는 기술 및 조건이 이해되고 알려져 있다.
3. 발현 시스템
상기된 조성물의 적어도 일부 또는 전부를 포함하는 많은 발현 시스템이 존재한다. 원핵- 및/또는 진핵-계 시스템을 본 발명에서 사용하여 핵산 서열 또는 이들의 동계 폴리펩타이드, 단백질 및 펩타이드를 생성할 수 있다. 이러한 많은 시스템은 시판되고 있고 널리 이용되고 있다.
곤충 세포/백큘로바이러스 시스템은 미국특허 제5,871,986호 및 제4,879,236호(이들의 내용은 본원에 참고로 원용된다)에 기술된 것과 같은 이종 핵산 절편의 고 수준의 단백질 발현을 생성할 수 있다. 이들은 예를 들면 INVITROGEN®으로부터 상품명 MAXBAC® 2.0 및 CLONTECH®으로부터 상품명 BACPACKTMBACULOVIRUSEXPRESSION SYSTEM®으로 구입할 수 있다.
발현 시스템의 다른 예로는 합성 엑디손-유도성 수용체를 포함한 STRATAGENE®의 COMPLETE CONTROLa 유도성 포유동물 발현 시스템 또는 이. 콜라이 발현 시스템인 pET 발현 시스템이 포함된다. 유도성 발현 시스템의 다른 예가 INVITROGEN®으로부터 입수할 수 있으며, 이는 전체 길이 CMV 프로모터를 이용하는 유도성 포유동물 발현 시스템인 T-REX™(테트라사이클린-조절된 발현) 시스템을 갖는다. INVITROGEN은 Pichia 메타놀리카 발현 시스템이라고 하는 효모 발현 시스템을 제공한다. 이 시스템은 메틸이용성 효모 피키아 메타놀리카(Pichia methanolica)에서 재조합 단백질의 고-수준 생성을 위해 고안된 것이다. 당업자는 발현 작제물과 같은 벡터를 발현하여 핵산 서열 또는 이의 동계 폴리펩타이드, 단백질 또는 펩타이드를 생성하는 방법을 알고 있다.
돌연변이유발
돌연변이유발은 사용하는 경우 여러 표준 돌연변이 절차에 의해 달성한다. 돌연변이는 유기체의 양 또는 구조에서 변화가 발생하는 과정이다. 돌연변이는 단일 유전자, 유전자들의 블록 또는 전체 염색체의 뉴클레오타이드 서열의 변화를 포함할 수 있다. 단일 유전자의 변화는 DNA 서열내에 단일 뉴클레오타이드 염기의 제거, 부가 또는 치환을 포함하는 점 돌연변이의 결과일 수 있거나 많은 뉴클레오타이드의 삽입 또는 결실을 포함한 변화의 결과일 수 있다.
돌연변이는 DNA 복제의 정확도 또는 게놈내 전위 유전 요소(트랜스포존)의이동에서의 실수와 같은 진행의 결과로서 동시에 일어날 수 있다. 이들은 또한 화학물질 또는 물리적 돌연변이원에 대해 노출된 후 유도된다. 이러한 돌연변이-유도제로는 이온화 방사선, 자외선 및 다양한 화학 물질, 예를 들면 핵산과 직간접적으로(일반적으로 일부 대사성 생물형질전환 후) 상호작용할 수 있는 알킬화제 및 폴리사이클릭 방향족 탄화수소가 포함된다. 이러한 환경 제제에 의해 유도된 DNA 병소는 영향을 받은 DNA가 복제되거나 복원될 때 염기 서열의 변형을 유도하고 그 결과로 돌연변이를 유도할 수 있다. 돌연변이는 또는 특정 표적 방법의 이용을 통해 부위 지시될 수 있다.
부위 지시된 돌연변이
구조-안내된 부위 특이적 돌연변이는 단백질-리간드 상호작용의 절단 및 공학을 위한 강력한 도구를 대표한다 (Wells, 1996, Braisted et al., 1996). 이 기술은 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열 변화를 선택된 DNA내로 도입함으로써 서열 변이체의 제조 및 시험을 제공한다.
부위 특이적 돌연변이유발은 목적하는 돌연변이의 DNA 서열을 암호화하는 특정 올리고뉴클레오타이드 서열뿐만 아니라 충분한 수의 인접한 변형된 뉴클레오타이드를 사용한다. 이 경우에서, 프라이머 서열에 횡단하는 결실 접점의 양쪽에 안정한 이본쇄를 형성하기에 충분한 크기 및 복합성이 제공된다. 약 17 내지 25개 뉴클레오타이드의 프라이머가 바람직하며, 서열 접점의 양쪽에 약 5 내지 10개 잔기가 변이된다.
이 기술은 전형적으로 일본쇄 및 이본쇄 형태 모두에서 존재하는 박테리오파아지 벡터를 사용한다. 부위 지시된 돌연변이유발에 유용한 벡터는 M13 파아지와 같은 벡터를 포함한다. 이들 파아지 벡터는 시판되고 있으며, 이들의 용도는 일반적으로 당업자에게 잘 알려져 있다. 이본쇄 플라스미드가 또한 부위 지시된 돌연변이유발에서 통상 사용되며, 이는 해당 유전자를 파아지로부터 플라스미드로 이전하는 단계를 제거한다.
일반적으로, 처음에 서열내에 목적하는 단백질 또는 유전 요소를 암호화하는 일본쇄 벡터를 수득하거나 이본쇄 벡터의 두 가닥을 용융시킨다. 그런다음, 합성적으로 제조된 목적하는 돌연변이 서열을 함유한 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 일본쇄 DNA 제제로 어닐링하고, 하이브리드화 조건을 선택할 때 부정합의 정도를 고려한다. 하이브리드화된 산물을 돌연변이-함유 가닥의 합성을 완성하기 위해 이. 콜라이 폴리머라제 I(클레노우 단편)과 같은 DNA 중합 효소에 적용시킨다. 그에 따라 이종 이본쇄가 형성되고 여기서 한 가닥은 본래의 비-돌연변이된 서열을 암호화하고 다른 한 가닥은 목적하는 돌연변이를 함유한다. 그런다음 이 이종 이본쇄 벡터를 사용하여 이. 콜라이 세포와 같은 적절한 숙주 세포를 형질전환시키고 돌연변이된 서열 배열을 갖는 재조합 벡터를 포함하는 클론을 선택한다.
단백질의 주어진 잔사에 대한 기능적 중요성의 포괄적인 정보 및 정보량은 19개 모든 아미노산 치환을 검사하는 포화 돌연변이유발에 의해 수득할 수 있다. 이 방법의 결점은 다중-잔사 포화 돌연변이유발의 논리가 빈약하다는 점이다(warren et al., 1996, Brown et al., 1996; Zeng et al., 1996; Burton andBarbas, 1994; Yelton et al., 1995; Jackson et al., 1995; Short et al., 1995; Wong et al., 1996; Hilton et al., 1996). 수백, 나아가 수천의 부위 특이적 돌연변이가 연구되어야 한다. 그러나, 향상된 기술은 돌연변이의 생성 및 신속한 선별을 훨씬 더 수월하게 한다 ("워크-쓰루" 돌연변이유발의 설명에 관한 참조: 미국특허 제5,798,208 및 제5,830,650호).
부위 지시된 돌연변이유발의 다른 방법이 미국특허 제5,220,007, 5,284,760, 5,354,670, 5,366,878, 5,389,514, 5,635,377 및 5,789,166호에 기술되어 있다.
용량 및 제형
본 발명의 조성물 (활성 성분: 기능적 발현을 위해 적절한 거리를 두고 순차적으로 작동적으로 연결된 프로모터, 서열 1 또는 서열 8을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 3' 비해독 영역을 포함한 벡터)은 동물의 체내에서 활성 성분과 제제의 활성 작용 부위의 접촉을 생성하는 수단에 의해 여러 성장 결핍 상태에 영향을 줄 수있도록 제형 및 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 본원에 기술된 아미노산 서열 유사체인 본 발명의 화합물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 함유한 벡터로서 정의된다. 상기 조성물은 치료 유효량의 화합물을 발생하기에 충분한 양으로 투여된다. 당업자는 용어 "투여된"과 "도입된"이 상호교환하여 사용할 수 있음을 인식한다. 이들은 개개의 치료 활성 성분으로서 또는 치료 활성 성분의 배합물로서 제약과 병용하도록 이용되고 있는 통상적인 수단에 의해 투여할 수 있다. 바람직한 양태로서, 활성 성분은 단독으로 또는 PBS와 같은 완충액으로 투여할 수있으나, 선택된 투여 경로 및 표준 제약 실례를 바탕으로 선택된 약학적 담체과 함께 투여할 수 있다. 이러한 약학 조성물은 사람 및 수의 모두의 임상 의학에서 치료 또는 진단 목적으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 이들은 성장 호르몬 생성에서의 비정상에 의해 일어나는 저뇌하수체 소인증과 같은 성장-연관된 질환의 치료에 유용하다. 또한, 이들은 고기 생산을 위해 사육된 동물의 성장을 자극하거나 사료전환 효율을 증진시키고, 우유 생산을 증강하며, 난 생산을 자극하는데 사용할 수 있다.
투여 용량은 활성 성분의 치료 유효량이며, 물론 특정 활성 성분의 약동학적 특징 및 이의 투여 방식 및 경로, 동물 종류, 수혜자의 연령, 수혜자의 성별, 수혜자의 생식 상태, 수혜자의 건강, 수혜자의 체중, 증세의 성질 및 정도, 동시 치료의 유형, 치료 빈도 및 원하는 효과와 같은 알려진 인자에 따라 변할 것이다. 본 발명에 따른 벡터의 적절한 투여 용량은 개개 대상 및 다른 변수에 따라 약간은 변할 것이다. 당업자는 정상적인 성장과 연관된 성장 호르몬의 알려진 순환 수준 및 벡터의 성장 호르몬 분비 활성을 기초로 하여 적절한 용량을 결정할 수 있을 것이다. 본 분야에 잘 알려진 바와 같이, 보다 큰 동물을 생산하기 위해 암컷 또는 모친을 처리하는 것은 필요한 성장 호르몬 생성의 증가 수준 정도에 따라 개별적으로 용량을 변화시키는 것이 필수적이다.
따라서, 본 발명은 후손의 암컷 또는 모친에 정상적인 성장과 연관된 것보다 높은 수준으로 성장 호르몬의 생성을 증가시키기에 충분한 양의 본 발명의 유사체를 투여함을 포함하여, 후손의 성장을 증가시키는 방법을 제공한다. 성장 호르몬의 정상적인 수준은 개별적으로 상당히 다양하며, 주어진 개개 대상의 경우 순환하는 성장 호르몬의 수준은 하루 동안에 상당히 다양하다.
또한, 본 발명은 정상 성장과 연관된 것보다 높은 수준으로 성장 호르몬의 성장을 자극하기에 충분한 양의 GHRH 유사체를 투여하여 동물의 성장 속도를 증가시키는 방법을 제공한다.
유전자 요법 투여
필요한 경우, 유전자 요법 벡터는 개개 투여 경로에 대해 본 분야에 알려진 방법으로 고체, 반고체, 액체 또는 기체 형태의 제제로 제형할 수 있다. 본 분야에 알려진 수단을 사용하여 조성물이 표적 기관에 도달할 때까지 조성물의 방출 및 흡수를 방지하거나 조성물의 시간별 방출을 보장할 수 있다. 본 발명의 조성물이 효력을 발휘하도록 하는 약제학적으로 허용되는 형태가 사용되어야 한다. 약제학적 용량형에서 조성물은 단독으로 또는 적절한 배합뿐만 아니라 다른 약제학적 활성 화합물과 조합하여 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 약제학적 조성물은 여러 경로를 통해 동물 체내의 여러 부위에 전달되어 특정 효과를 얻을 수 있다(참조: Rosenfeld et al. (1991); Rosenfeld et al., (1991a); Jaffe et al., 1992). 당업자는 비록 한개 경로 이상이 투여에 사용될 수 있으나, 특정 경로가 다른 경로보다 보다 즉각적이고 보다 효과적인 반응을 제공할 수 있음을 알고있다. 국소 또는 전시 전달은 체강내로 제제의 적용 또는 점적, 에어로졸의 흡입 또는 흡인 또는 비경구 도입을 포함한 투여또는 근육내, 정맥내, 복강내, 피하, 피내 및 국소 투여에 의해 달성할 수 있다.
당업자는 다른 전달 방법을 사용하여 벡터를 세포로 투여할 수 있음을 알고 있다. 예로는 (1) 전기천공(전기), 유전자 총(물리력) 또는 많은 양의 액체(압력)을 적용하는 것과 같은 물리적 수단을 이용하는 방법; 및 (2) 상기 벡터를 리포좀 또는 트랜스포터 분자와 같은 다른 실체와 복합체를 형성하는 방법이 포함된다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 벡터를 바람직하게는 조성물의 일부로서 상기 투여 경로 또는 당업자에게 알려져 있고 특정한 적용에 적절한 대체 경로를 사용하여 투여함을 포함하여 숙주에게 치료 유전자를 전달하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 숙주 세포로의 벡터의 효과적인 유전자 전달은 치료 효과의 관점(치료하고자 하는 특정 질환과 연관된 일부 증세의 완화)에서 모니터링하거나 또한 숙주내 전달된 유전자 또는 그 유전자의 발현의 증거(예, 서열분석과 함께 중합효소 연쇄 반응, 노썬 또는 써던 하이브리드화 또는 숙주 세포에서 핵산을 검출하는 전사 검정을 사용하거나, 면역블롯 분석, 항체-매개된 검출, mRNA 또는 단백질 반감기 연구 또는 전달된 핵산에 의해 암호화되거나 그러한 전달로 인해 수준 또는 기능에서 영향을 받는 단백질 또는 폴리펩타이드를 검출하기 위한 특정화된 검정을 이용)에 의해 모니터링할 수 있다.
본원에 기술된 이들 방법은 유일한 것이 아니며 특정 용도에 맞는 다른 방법들이 있으며 이들은 당업자에게 명백할 것들이다. 게다가, 유효량의 조성물은 원하는 효과를 발휘하도록 알려진 화합물과의 유사성을 통해 조정될 수 있다.
또한, 실질적인 용량 및 일정은 조성물이 다른 약학적 조성물과 배합하여 투여되는 지의 여부 또는 약동학, 약물 성질 및 대사의 개별적 차이에 따라 변할 수 있다. 마찬가지로, 양도 사용된 특정 세포주에 따라 시험관내 적용에서 변할 수 있다(예, 세포 표면에 존재하는 벡터 수용체의 수 또는 유전자 전달에 사용된 특정 벡터가 그 세포주에서 복제하는 능력). 또한, 세포당 첨가되는 벡터의 양은 벡터에 삽입된 치료 유전자의 길이 및 안정성뿐만 아니라 서열의 성질에 따라 변할 것이며 특히 경험적으로 결정될 필요가 있고 본 발명의 방법에 귀속하지 않는 인자로 인해 변할 수 있는 변수이다. 당업자는 특정 상황의 요건에 따라 적절히 간단히 조절할 수 있다.
하기 실시예로 본 발명을 좀더 구체적으로 예시하나 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
실시예 1
GH 분비촉진제 활성과 안정성을 증가시키는 GHRH 과도활성 유사체
GHRH는 사람(Frohman et al., 1984)과 돼지의 순환계에서 약 12분의 비교적 짧은 반감기를 갖고 있다. GHRH의 생물학적 반감기를 연장시키고(또는) GHRH의 GH 분비촉진제 활성을 증가시키는 GHRH 유사체를 이용하여 GH 분비 향상을 달성한다. GHRH 돌연변이체는 부위 지시된 돌연변이유발법으로 제조하였다. Ala15 대신에 Gly15를 사용하여 트립신 유사 효소에 의한 감소된 절단성을 가진 α-나선 형태와 양성친화성 구조를 증가시켰다(Su et al., 1991). Ala15 치환체를 가진 GHRH 유사체의 GHRH 수용체에 대한 친화성은 4 내지 5배 증가되었다(Campbell et al., 1991). 유리 COOH 말단을 가진 분자를 사용하여 약간 더 안정된 형태로서 Met 산화로 인한 생물학적 활성의 손실을 감소시키기 위하여 Leu27과 Asn28 대신에 Met27과 Ser28을 치환시켰다. 이에 따라 GHRH-15/27/28로 표시되는 3중 아미노산 치환 돌연변이체가 형성되었다. 디펩티딜 펩티다제 IV는 주요 혈청 GHRH 분해 효소이다(Walter et al., 1980; Martin et al., 1993). 이에 대한 보다 불량한 디펩티다제 기질을 만들기 위해 GHRH15/27/28을 사용하여 Ile2를 Ala2(GHRH-TI)로 대체하거나 Val2(GHRH-TV)로 대체하였고, 또는 Tyr1과 Ala2를 His1과 Val2(GHRH-HV(도 1a); H1V2A15L27N28)로 전환시켰다.
실시예 2
DNA 작제물
특정 구체예로서, 서열 9의 플라스미드(pSPc5-12-HV-GHRH)를 본 발명에 이용하였다. 또 다른 구체예에서는 pVC0289 골격(서열 10); 서열 6과 같은 프로모터; 돼지 HV-GHRH와 같은 GHRH cDNA(변이된 HV-GHRH cDNA)(서열 11); 및 3' UTR, 예컨대 사람 GH 유래의 3' UTR(서열 7)을 포함하는 플라스미드 벡터를 사용하였다.
변이된 돼지 GHRH cDNA 서열의 생물학적 잠재능을 시험하기 위하여, 골격 α-액틴 유래의 근접 혈청 반응 인자, 다중 MEF-2 부위, 다중 MEF-1 부위 및 TEF-1 결합 부위(Li et al., 1999)를 포함하는 신규의 합성 근육 프로모터 SPc5-12에 의해 다량의 골격근 특이적 유전자 발현을 유도할 수 있는 플라스미드 벡터를 제작하였다. 31개 아미노산 시그널 펩타이드와 성숙한 펩타이드 돼지 GHRH(Tyr1-Gly40) 전체 및/또는 GHRH 돌연변이체를 암호화하는 돼지 GHRH 228bp 단편과 그 다음 사람 GH cDNA의 3' 비해독 영역을 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 근육의 GHRH 발현 벡터에 통합시켰다. 이 플라스미드 pSPc5-12는 pSK-GHRH 골격(Draghia-Akli et al., 1997)의 SacI/BamHI 부위 내에 SPc5-12 합성 프로모터(Li et al., 1999)의 360bp SacI/BamHI 단편을 포함한다.
키트[Altered Sites II in vitro Mutagenesis System, Promega(위스콘신 매디슨 소재)]를 사용한 사람 GHRH cDNA의 부위 지정 돌연변이유발법으로 야생형 및 돌연변이된 돼지 GHRH cDNA를 수득하였다. 사람 GHRH cDNA는 BamHI-Hind III 단편으로서 pALTER Promega 벡터의 상응하는 부위에 서브클로닝하였고, 제조자의 지시에 따라 돌연변이유발법을 실시하였다. 돼지의 야생형 cDNA는 하기 서열 2의 프라이머를 사용하여 사람의 아미노산 34와 38을 변화시켜 사람 cDNA로부터 수득하였다: 5'-AGGCAGCAGGGAGAGAGGAACCAAGAGCAAGGAGCATAATGACTGC-AG-3'. 돼지의 HV 돌연변이는 다음 서열 3의 프라이머를 사용하여 제조하였다: 5'-ACCCTCAGGATGCGGCGGCACGTAGATGCCATCTTCACCAAC-3'. 돼지 15Ala 돌연변이는 다음 서열 4의 프라이머를 사용하여 제조하였다: 5'-CGGAAGGTGCTGGCCCAGCTGTCCGCC-3'. 돼지 27Leu28Asn 돌연변이는 다음 서열 5의 프라이머를 사용하여 제조하였다: 5'-CTGCTCCAGGACATCCTGAACAGGCAGCAGGGAGAG-3'. 돌연변이유발 후 수득되는 클론의 정확성을 확인하기 위하여 서열분석하고 그 다음 당업자에게 공지된 방법으로 본 실시예에 기술된 pSK-GHRH의 BamHI/HindIII 부위로 서브클로닝하였다.
실시예 3
세포 배양 및 형질감염
돼지의 뇌하수체전엽 배양물과 원시 병아리 근원세포 배양물을 사용하여 동일한 성공률로 실험을 실시하였다. 하지만, 도면에는 돼지의 뇌하수체 전엽 배양물에 의해 나타나는 데이터만을 예시하였다. 원시 병아리 근원세포 배양물은 다음과 같이 수득하였다. 병아리 배형성 조직을 수거하고, 피부와 연골조직을 절개 제거한 후 기계로 분리시켰다. 세포 현탁액을 무명망과 렌즈 페이퍼를 통해 통과시킨 후 100mm 플라스틱 배양접시에 1x108내지 2x108의 밀도로 평판배양하였다. 현탁액 상태의 세포 집단을 콜라겐이 도포된 100mm 플라스틱 접시에 2x106내지 3x106세포의 밀도로 평판배양하고 5% CO2환경에서 37℃ 하에 항온배양하였다. 그 다음, 세포를 형질감염시키기 24시간 전에 10% 열불활성화된 말 혈청(HIHS), 5% 병아리 배 추출물(CEE)(Gibco BRL; Grand Island, NY) 및 젠타마이신이 보충된 최소 필수 배지(MEM)에서 1.5x106/100mm 평판의 밀도로 항온배양하였다. 보다 상세한 설명은 문헌[Draghia-Akli et al., 1997 and Bergsma et al., 1986]을 참조. 돼지의 뇌하수체 전엽 배양물은 문헌(Tanner et al., 1990)에 거의 기술된 대로 수득하였다. 간략히 설명하면, 뇌하수체 조직을 효소 조건하에 해리시키고 플라스틱 접시 상에 부착하기에 충분한 시간 동안 평판배양하였다. 그 다음, 세포를 세정하고 실험에 앞서 항온배양 배지에 노출시켰다. 문헌[Tanner et al(1990)]을 참조.
세포를 리포펙타민을 사용하여 제조자의 지시에 따라 100mm 평판 당 플라스미드 4㎍으로 형질감염시켰다. 형질감염 후, 배지를 2% HIHS와 2% CEE를 함유하는 MEM으로 교체시켜 세포를 분화시켰다. 분화 72시간 후 배지와 세포를 수거하였다.형질감염율은 대조군 평판의 β-갈락토시다제 조직화학으로 평가한 결과 10%인 것으로 추정되었다. 수거하기 1일 전에 세포를 항크스 평형 염 용액(HBSS)으로 2회 세척하고 배지를 0.1% 소혈청알부민이 보충된 MEM으로 교환시켰다. 조정배지는 1% 트리플루오로아세트산과 1mM 페닐메틸설포닐플루오라이드 0.25 부피를 첨가하여 처리하고 -80℃에서 냉동시켜 동결건조시키고, C-18 Sep-컬럼(캘리포니아주 벨몬트 소재, 페닌술라 레보레이토리즈) 상에서 정제한 다음, 재동결건조시키고 방사능면역분석하거나 또는 원시 돼지 뇌하수체 전엽 세포 배양물을 위해 조정된 배지에 재현탁시켰다.
실시예 4
GH 분비촉진제 활성과 안정성을 증가시키는 GHRH 과도활성 유사체
골격의 근원세포를 실시예 3에서와 같이 각각의 작제물로 형질감염시키고 조정 배양 배지 세포에서 정제한 GHRH부를 돼지 뇌하수체 전엽 세포 배양물에 분비된 성장 호르몬에 대하여 분석하였다. 도 1b에 도시된 바와 같이, 24시간 후 수거하여 돼지 특이적 GH-방사능면역분석법으로 정량한 배지에서는 변형된 GHRH 종(GH15/27/28; GHRH-TI; GHRH-TV)이 야생형 돼지 GHRH 보다 약 20 내지 50%에 달하는 약간의 GH 분비량의 증가를 보였다. 4가지 돌연변이체 중 하나인 GHRH-HV 만은 돼지 GH 수준이 200ng/ml의 기준값에서 1600 ng/ml까지 상승하는 유의적인 GH 분비촉진제 활성 증가를 보였다(도 1b).
실시예 5
HV-GHRH 분자의 혈장 배양
대조군 돼지로부터 돼지 혈장 푸울을 수집하여 -80℃에 보관하였다. 화학적으로 합성된 HV-GHRH는 펩타이드 합성법으로 제조하였다. 돼지 혈장을 해동시키고 원심분리한 후 37℃에 방치하여 평형화시켰다. GHRH 돌연변이체는 혈장 샘플에 100㎍/ml의 최종 농도로 용해시켰다. GHRH 돌연변이체를 첨가한 즉시와, 15분 후, 30분 후, 60분 후, 120분 후 및 240분 후에 혈장 1ml을 회수하여 1M TFA 1ml로 산성화하였다. 산성화된 혈장은 C18 친화성 SEP-Pak 컬럼 상에서 정제하고 동결건조시킨 뒤, 월터스(Walters) 600 다중시스템 전달 시스템, 월터스 지능 샘플 프로세서 타입 717 및 월터스 분광모니터 490(Walters Associates, Milipore Corp., Milford MA)를 사용하여 HPLC로 분석하였다. 검출은 214nm에서 실시하였다. 이 시점에서 분해된 펩타이드의 비율은 피크 적분값으로 측정하였다.
그 다음 야생형 GHRH와 유사체 GHRH-HV의 안정성은 GHRH 펩타이드의 항온배양과 후속 고상 추출 및 HPLC 분석을 통해 돼지 혈장에서 시험하였다. 도 1c에 도시된 바와 같이, 야생형 GHRH (1-44)NH2 95%는 혈장에서 항온배양한 지 60분 이내에 분해되었다. 이에 반해, 돼지 혈장에 존재하는 GHRH-HV의 항온배양은 항온배양 4 내지 6시간 동안 폴리펩타이드의 75% 이상이 효소 분해에 대하여 보호되었음을 보였다. 따라서, 동일한 조건하에 야생형 GHRH는 완전히 분해되는 반면 GHRH-HV의 상당부분은 그대로 유지되어 혈청 프로테아제에 대한 GHRH-HV의 안정성이 상당히 증가되었음을 나타내었다.
실시예 6
동물 연구
3 내지 4주령의 하이브리드 잡종 거세 수퇘지(요크셔, 랜드레이스, 햄프셔 및 두록) 5마리로 이루어진 3그룹을 GHRH 연구에 사용하였다. 물과 체중 식사량의 6%(24% 단백질 돼지 식이, Producers Cooperative Association, Bryan, TX)는 자유롭게 공급하면서 동물을 각각 수용하였다. 동물의 체중을 2일에 한번씩 오전 8시 30분에 측정하고 사료를 계속 공급하였다. 동물은 NIH 가이드, USDA 및 동물 복지 강령 지침서에 따라 유지하였다.
실시예 7
돼지로의 플라스미드 DNA의 근육내 주사
pSPc5-12-HV-GHRH, pSPc5-12-wt-GHRH 및 pSPc5-12bgal 내독소 제거된 플라스미드(퀴아겐 인코포레이티드 제품, 캘리포니아주 채스워스 소재)를 PBS(pH 7.4)에 1mg/ml로 희석하였다. 처리군 하나에 동물을 동등하게 할당하였다. 돼지를 이소플루란(마취 유도를 위해 2 내지 6% 농도와 마취 유지를 위해 1 내지 3%)으로 마취하였다. 플라스미드 주사 후 3일, 7일, 14일, 21일, 28일, 45일 및 65일째 동물로부터 혈액을 채혈하기 위하여 수술하여 경부로 카테터를 주입시켰다. 마취하는 동안플라스미드 10mg을 돼지의 반힘줄모양근으로 직접 주사하였다. 주사 후 2분이 지나서 캘리퍼스 세트 사이에 그 주사부위 근육을 놓고 200V/cm의 최적 조건하에 60밀리초 펄스를 4회 실시하여 전기천공시켰다(Aihara et al., 1998). 주사후 65일이 지나서 동물을 죽이고 내부 기관과 주사 부위 근육을 모아, 칭량하고 액체 질소하에 동결시킨 뒤 -80℃에 보관하였다. 도체를 칭량하고 중성자 활성을 분석하였다. 등지방을 측정하였다.
실시예 8
돼지의 GHRH를 증가시키는 pSP-HV-GHRH 근육 주사; 2개월 동안의
GH 및 IGF-I 혈청 수준
GHRH의 장기간 발현을 용이하게 하고 GH 및 IGF-I 분비 수준을 자극하는 최적화된 프로테아제 내성 pSP-HV-GHRH 벡터의 활성을 측정하였다. pSP-HV-GHRH와 야생형 작제물인 pSP-wt-GHRH(야생형 대조군) 및 합성 근성 프로모터 이. 콜리 β-갈락토시다제 발현 벡터 pSP-β-gal(위약 대조군)의 개략적 지도는 도 2a에 도시하였다. 3주령의 거세한 수퇘지를 마취시키고 경정맥 카테터를 삽입하여 동물에게 부자유스럽지 않게 혈액 샘플을 수거하였다. 플라스미드 발현 벡터 DNA(pSP-HV-GHRH; pSP-wt-GHRH; 또는 pSP-β gal의 DNA 10mg)를 반힘줄모양근에 직접 주사한 다음 전기천공시켰다(실시예 7 참조).
실시예 9
돼지 GHRH, GH 및 IGF-I 측정
돼지 GHRH는 이종의 사람 분석 시스템(캘리포니아주 벨몬트 소재의 페니술라 레보레이토리즈)으로 측정하였다. 이 분석 시스템의 감도는 1 pg/튜브 이다. 혈장 중의 돼지 GH는 특이적인 이중 항체 절차 RIA(더 펜실베니아 스테이트 유니버시티)로 측정하였다. 이 분석법의 감도는 4ng/튜브 이다. 돼지 IGF-I는 이종 사람 분석법(Diagnostic System Lab., Webster, TX)으로 측정하였다. 데이터는 마이크로소프트 엑셀 통계 분석 패키지로 분석하였다. 도면에 제시된 값은 평균값±s.e.m. 이다. 특이적 p값은 스투던츠 t 검정을 사용하여 비교 수득하였다. p<0.05 값이 통계 유효 수준이다. pSP-HV-GHRH를 반힘줄모양근에 주사한 돼지에서 주사후 7일째 GHRH 수준이 증가하였고(도 2b) 14일째에는 대조군의 수준 보다 150% 이상이었다(652/4±77 pg/ml 대 419.6±13 pg/ml). pSV-HV-GHRH 발현 활성은 60일까지 위약을 주사한 대조군의 값 보다 약 2 내지 3배 높은 최고값에 도달하였다. pSP-HV-GHRH를 주사한 돼지에서 분비되고 0일에서 60일 사이의 체중 증가에 대해 보정한(혈액 부피는 총 체중의 8%에 해당함) 혈청 GHRH의 절대량은 위약을 주사한 대조군의 양보다 3배 이상 높았다(1426.49±10.47ng 대 266.84±25.45ng)(도 2c). 반힘줄모양근에 야생형 pSP-GHRH를 주사한 동물은 주사 후 45일부터 GHRH 수준의 약간의 증가만을 보였으나 주사후 60일까지는 2배 증가하였고(779.36ng), 이것은 생물학적 효과를 유도하기에 충분한 수준이었다.
어린 동물은 매우 높은 함량의 GH를 갖고 있으며, 이는 나이가 들수록 점차 감소한다. 1차 주사한 다음 7일과 14일후에 24시간 동안 15분마다 채혈한 혈액 샘플을 pGH 농도에 대해 분석하고, 이 분석값으로 pGH 함량의 총 변화율을 추정하였다. pSP-HV-GHRH를 주사한 돼지(도 2d)에서는 주사 7일 후(HV Δ변화율=+1.52, wt = -0.73 대 대조군 = -3.2ng/ml) 및 주사 14일 후 (HV Δ변화율=+1.09, wt = -4.42 대 대조군 = -6.88ng/ml)에 분명한 GH 함량의 증가를 보였다.
GH 전신 농도의 증가는 또한 IGF-I 수준의 증가로 확인할 수 있다. 혈청 돼지 IGF-I 수준은 주사 후 약 3일째 pSP-HV-GHRH 주사한 돼지에서 상승하기 시작했다(도 2e). 21일째에는 이들 동물의 평균 혈청 IGF-I 수준의 증가가 약 3배였고, 이것은 60일 이상 동안 유지되었다(p<0.03). 비교용으로, 야생형 pSP-GHRH 발현벡터를 주사한 돼지에서는 혈행 IGF-I 수준(p=0.39)이 40% 증가에만 그쳤다(도 2e).
실시예 10
돼지 성장을 증가시키는 근성 GHRH 발현 벡터
근성 pSP-GHRH 발현 벡터를 근육내 주사한 후 전신 순환계로 분비된 돼지 GH는 거세한 어린 수퇘지에서 65일 이상 성장을 증진시킨다. 체 조성 측정은 주사 후 30일과 65일째 생체내에서(농도계, K40) 또는 사후에(직접 분리 후 중성자 활성화실에서 처리된 기관, 도체, 체 지방) 실시하였다. 야생형 pSP-GHRH를 주사한 동물은 위약 대조군 보다 평균 21.5% 더 무거운 반면(37.125kg 대 29.375kg), pSP-HV-GHRH를 주사한 돼지는 37.8% 더 무거웠다(41.775kg; p=0.014)(도 3a 참조). 사료 전환 효율은 또한 대조군과 비교했을 때 GHRH 작제물을 주사한 돼지에서 20%까지 증가되었다(pSP-HV-GHRH의 경우 체중 증가 kg 당 사료 0.267kg/일, pSP-wt-GHRH의 경우 0.274kg, pSP-β-gal을 주사한 돼지의 경우 0.334kg, 도 3b 참조). 농도계, K40 칼륨 챔버 및 중성자 활성화 챔버에 의한 체 조성 연구에서 GHRH를 주사한 동물은 기관비대증, 체지방의 상대적 비율 및 관련 병리상태의 어떤 징후 없이 모든 체 성분의 비례적 증가를 보여주었다. 45일 후 위약을 주사한 대조군 돼지와 pSP-HV-GHRH를 주사한 돼지의 사진을 도 3c에 제시하였다.
표 1에 제시된 pSP-HV-GHRH를 주사한 돼지의 대사 프로필은 pSP-GHRH 및 pSP-HV-GHRH 각각에 비해 혈청 우레아 수준의 유의적인 감소를 암시하며[대조군 9±0.9mg/dl, 주사맞은 돼지에서 8.3±1mg/dl 및 6.875±0.5mg/dl(p=0.006)], 이것은 아미노산 대사의 감소를 시사한다. 혈청 글루코스 수준은 대조군과 플라스미드 GHRH를 주사한 돼지 사이에서 유사하였다[대조군 돼지에서 99.2±4.8mg/dl, pSP-HV-GHRH 주사한 돼지에서 104.8±6.9mg/dl, 야생형 pSP-GHRH 주사한 돼지에서 97.5±8mg/dl(p<0.27)]. 기타 다른 대사적 변화는 발견되지 않았다.
GHRH를 주사한 돼지와 대조군의 대사 프로필(mg/ml)
글루코스 우레아 크레아티닌 총 단백질
대조군 99.2 ±4.8 9 ±0.9 0.82 ±0.06 4.6 ±0.22
pSP-wt-GHRH 97.5 ±8 8.3 ±1 0.83 ±0.056 4.76 ±0.35
pSP-HV-GHRH 104.8 ±6.9 6.875 ±0.5 0.78 ±0.04 4.88 ±0.23
실시예 11
상이한 수준의 pSP-HV-GHRH를 이용한 실험
새끼돼지의 성장에 pSP-HV-GHRH가 미치는 효과를 추가로 연구하기 위하여 출생 후 10일째인 2마리의 새끼 돼지 그룹에 새로운 주사용 6 니들-어레이 전극을 사용하여 pSP-HV-GHRH(3mg, 1mg, 100㎍)를 주사하였다. 이 전극은 사전 테스트한 결과 당해 기술분야에 공지된 캘리퍼스 전극 보다 10배 이상 효과적이었다. 따라서, 니들 전극은 본 발명의 방법에 사용하기에 바람직하다. 도 4에 도시한 바와 같이 플라스미드 100㎍을 주사한 그룹이 최대 성장 곡선을 나타내었으며, 50일 후 대조군과 통계상 유의적인 차이를 보였다. 3mg을 주사한 그룹의 한 동물은 항체를 형성시켜, 성장 패턴의 유의적인 감소를 보였다.
또한, 2마리의 새끼 돼지 그룹에게 출생 후 10일째 표시된 용량의 pSP-HV-GHRH를 주사하였다. IGF-I 값은 주사후 10일째 상승하기 시작했고, 주사후 35일째 플라스미드 100㎍을 주사한 돼지는 대조군에 비해 IGF-I 값이 평균 10.62배 더 높았다. 1mg을 주사한 돼지는 대조군에 비해 평균 7.94배 더 높았고, 3mg을 주사한 돼지는 대조군에 비해 평균 1.16배 더 높았다.
따라서, 특정 구체예에서는 저용량의 pSP-HV-GHRH를 주사한다. 특정 일 구체예에서 플라스미드 약 100㎍(1mg)을 이용한다. 또 다른 구체예에서는 약 200 내지 300㎍을 주사한다. 또 다른 추가 구체예에서는 50 내지 100㎍을 투여한다.
실시예 12
pSP-HV-GHRH를 이용한 연령 비교
pSP-HV-GHRH 주사에 최대로 적합한 연령을 조사하기 위하여 2마리의 새끼 돼지 그룹에게 출생시부터 pSP-HV-GHRH 2mg을 주사하였다. 도 6에 도시된 바와 같이, 출생후 14일째 주사를 맞은 그룹이 최대의 성장 곡선을 나타내었으며, 매시점마다 대조군에 비해 유의적인 통계적 차이가 나타났다. 21일째 주사한 그룹중 한 마리는 항체를 형성시켰고 유의적인 성장 패턴의 감소를 나타냈다. 지나치게 조기에 처리되면(즉, 약 10 내지 14일령 미만) 인슐린 내성이 있을 수 있다. 특정 구체예에서치료법은 자연 GH와 IGF-I 수준이 가장 낮을 때(약 10 내지 14일령) 가장 효과적이고 GHRH 수준이 보통 높을 때에는 반대효과를 나타낼 수 있다. 특정 구체예에서 면역 감시 시스템이 임신동안 감소된다면 임신한 동물은 임신하지 않은 동물에 비해 변형된 GHRH에 대해 생성되는 항체의 수가 적다.
실시예 13
특정 구체예
요약해보면 최적의 주사 시점은 출생 후 14일이다[주사 후 40일째 대조군에 비해 평균 8 파운드 더 무겁다(p<0.04)]. 바람직한 주사 용량은 2 내지 5ml 용량 중에 100㎍이다[주사 후 40일째 대조군에 비해 평균 6 파운드 더 무겁다(p<0.02)]. 호르몬 및 생화학적 상수는 체중 증가와 상호관련하여 암퇘지 1의 후손(시간 경과) 및 암퇘지 3의 후손(용량 곡선)에서 정상(IGF-I, IGF-BP3, 인슐린, 우레아, 글루코스, 총 단백질, 크레아티닌)이다. 이전 실험에서 얻은 체 조성 결과는 HV-GHRH가 모든 체성분의 균일한 증가를 결정하는 반면(대조군과 체 조성은 유사하지만 보다 더 크다), wt-GHRH는 제지방량의 증가와 지방 감소를 결정한다는 것을 보여주었다.
성장 호르몬의 증가가 체온의 증가를 초래할 수 있다면 바람직한 구체예에서 체온이 약 62℉에서 약 80℉가 되는 조건하에 암퇘지에게 주사한다.
실시예 14
첫출산 전 임신한 암퇘지로의 GHRH 근성 벡터의 주사
GHRH 근성 벡터의 성장 효과를 분석하기 위하여 마지막 임신 3개월 중에 GHRH를 함유하는 벡터 10mg을 임신한 암퇘지에게 주사하였다. 이 실시예에서는 첫 임신 기간 중 임신 90일째 pSP-HV-GHRH 벡터 10mg을 암퇘지(약 800 파운드)에게 주사하였다. 투여 방법은 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있다. 이 구체예에서는 전기천공용 캘리퍼스 전극을 이용하는 것을 제외하고는 실시예 7에서와 같이 플라스미드를 투여하였다(도 7). 이 전극은 길이가 2cm이고 직경이1cm인 원형 플라스틱 지지체 상에 있는 6개의 니들(22g)을 갖고 있다.
표 2는 임신 90일째 전기천공으로 pSP-HV-GHRH(p2)를 주사한 암퇘지로부터 태어난 새끼 돼지의 시간 경과에 따른 체중(kg)을 제시한 것이다. 표 3은 표 2와 동일한 데이터로 주사받지 않은 암퇘지(p3)로부터 태어난 대조군 동물의 체중(kg)을 제시한 것이다. 표 4는 pSP-HV-GHRH를 주사한 암퇘지와 미주사한 암퇘지로부터 태어난 새끼 돼지의 체 조성 데이터(지방%/BW/d 평균)를 나타낸 것이다. 이 표는 지방대 체중의 상대적 비율을 나타내고 주사한 암퇘지의 새끼 돼지가 체중 단위 당 지방이 18.5% 적은 것을 보여준다. 돼지 p2/1과 p2/6을 죽여 체 조성 데이터를 수득하였다. 새끼 돼지들의 생화학적 조성은 이 암퇘지의 2차 임신 동안 확인된 것과 유사하였다(실시예 15). p값은 모든 시점마다 매우 유사하였다. 이 표는 임신 동안 pSP-HV-GHRH를 주사받은 암퇘지에서 태어난 새끼 돼지가 대조군 암퇘지에서 태어난 새끼 돼지 보다 체중이 훨씬 더 무겁다는 것을 분명하게 보여준다. 본 발명의 영역을 제한함이 없이 본 발명의 경계와 범위에 제한을 둠이 없이 출원인은 근육 세포로 주사한 GHRH가 분비되어 태반을 통해 통과한다고 추정한다. 뇌하수체에 대한 GHRH의 비대 및 증생 효과의 결과로서 GH를 방출하는 뇌하수체 세포의 수가 증가된다.
실시예 15
주사받은 암퇘지의 둘째 새끼
표 5는 1차 임신 기간 동안 pSP-HV-GHRH를 주사받은 암퇘지의 둘째 새끼의 체중 데이터를 제시한 것이다.
시간 경과에 따른 새끼 돼지의 체 조성
4월27일 5월1일 5/4/2000 5/8/2000 5/11/2000 5/16/2000 5/18/2000 5/23/2000 7/13/2000
암퇘지 1일 5일 7일 11일 14일 19일 21일 26일 77일
돼지 1 2.097 3.26 4.22 5.627 6.505 8.4 9.1 10.75 36.32
돼지 2 2.264 3.512 4.46 5.882 6.799 8.7 9.4 11.25 37.228
돼지 3 1.758 2.78 3.68 4.817 5.7 7.5 8.25 10.25 35.866
돼지 4 1.895 2.843 3.62 4.733 5.714 7.1 7.6 8.9 32.234
돼지 5 2.397 3.458 4.24 5.704 6.692 8.85 9.6 11.35 39.498
돼지 7 2.457 3.599 4.68 6.132 7.05 8.9 9.65 11.55 37.682
돼지 8 1.907 2.882 3.58 4.767 5.593 6.95 7.55 9.65 36.32
돼지 9 2.381 3.52 4.23 5.635 6.45 8.25 8.9 10.65 34.504
돼지 10 2.473 3.655 4.57 5.935 6.87 8.6 9.25 10.7 39.952
평균 2.181 3.2787 4.14222 5.47022 6.37478 8.13889 8.81111 10.56111 36.62267
STDEV 0.2733 0.3509 0.41817 0.54711 0.55986 0.75778 0.81616 0.85322 2.3808
SE 0.1933 0.2481 0.29569 0.38686 0.39588 0.53583 0.57711 0.60332 1.68348
증가 0 1.0977 1.96122 3.28922 4.19378 5.95789 6.63011 8.38011 34.44167
합(㎏) 19.629 29.509 37.28 49.232 57.373 73.25 79.3 95.05 329.604
파운드 43.183 64.919 82.016 108.3104 126.2206 161.15 174.46 209.11 725.1288
평균 하루 증가 0.32231 0.44729
둘째 새끼를 임신한 이래로 또는 임신 기간 중의 암퇘지에게는 GHRH를 투여하지 않았다. 둘째 새끼는 출산 후부터 더 컸다(유사한 환경에서 사육한 다른 암퇘지의 출산 시의 새끼 돼지의 평균 체중은 1.71kg이고, 이 새끼 돼지는 출산시 평균2.181kg 이었다.). 21일째 품종별로 특징적인 한배의 모든 새끼 돼지들의 체중의 총합은 평균 약 130 파운드(약 59kg)이고 이전에 pSP-HV-GHRH를 주사한 암퇘지의 새끼 돼지들은 총합이 174 파운드(약 79kg)이다. 이러한 장점은 유지되었는데, 출생 후 77일째에도 당업계에 잘 알려진 수량인 최고의 품종과 비교했을 때 체중이 돼지 1마리당 평균 11 내지 15 파운드(5.5 내지 6kg) 더 무거웠다. 출생 후 168일째에도 주사받은 동물은 대조군에 비해 평균 22 파운드(10kg) 더무거웠다(p<0.0007).
암퇘지는 주사/전기천공 절차시에만 마취를 시켰는데, 이를 위해 2.2mg/kg 용량의 TELAZOLR(틸레타민 염산염과 졸라제팜 염산염의 혼합물)을 사용하였다. 새끼 돼지의 경우에는 체 조성을 평가하는 동안 약 15분 동안 등을 이중 X레이 밀도계(DEXA)에 대고 누워있어야만 할 때 케타민/크실라진 HCl의 조합물을 사용하여 마취시켰다. 구체적으로, 케타민 20mg/kg + 크실라진 1mg/kg(보통 크실라진 용량은 2mg/kg 임)을 사용한다. 다른 구체예에서는 당해 기술분야에 공지된 다른 마취제, 예를 들어 케타민 15mg/kg + 아세프로마진 0.4mg/kg을 투여한다. 또 다른 구체예에서는 채혈이나 주사 등을 위해 새끼 돼지의 마취를 필요로 하지 않을 수도 있다.
돼지와 몇몇 다른 동물은 일반적으로 여러 종류의 마취제에 민감하여 마취후 온도 조절 과정(저체온 또는 고체온, 후자가 훨씬 자주 일어남)의 큰 변화로 죽을 수 있다면 때로 아트로핀을 투여한다. 아트로핀은 마취전에 종종 사용되는 항콜린작동성 약물로서 분비물의 건조를 용이하게 하고 마취 필요량을 감소시키며 마취 동안 심부정맥증을 방지하고 바람직하지 않은 이상 고열 발생의 횟수를 줄여 마취의 회복 동안 동물의 편안함을 증가시키는 것으로 생각되고 있다. 특정 구체예에서는 아트로핀 0.05mg/kg subq(피하) 예비처리를 포함한다. 아트로핀의 대체제로서 당해 기술분야에 공지된 다른 유사 약물을 사용할 수도 있다.
새끼 돼지로부터 다중 생화학적 측정 결과를 얻었다. 표 6 내지 12는 이 측정에 관한 데이터를 제공한 것이다. 인슐린 실험(표 6)은 2000년 5월 25일에 측정하였다. 시험된 모든 이전 대조군의 평균값은 6.8μU/ml이고, 실험 새끼 돼지의 평균값은 4.785μU/ml로서 통계적 유의성(p=0.07)은 없었다.
새끼 돼지의 인슐린 농도
25일
돼지 1 4.3827
돼지 2 4.131
돼지 3 4.8176
돼지 4 5.7899
돼지 5 4.4267
돼지 7 4.3076
돼지 8 4.1648
돼지 9 6.0912
돼지 10 4.9527
평균 4.78501
STDEV 0.71397
SE 0.23799
IGF-I 분석은 2000년 5월 25일에 실시하였다(표 7). 실험 그룹의 평균값은 145.509 ng/ml이고 시험된 모든 종래 대조 그룹의 평균값은 53.08 ng/ml이었다. 따라서, p값은 유의성이 매우 크다(p<0.0001). GH가 IGF-I의 생산과 방출을 자극한다면, IGF-I 분석은 GHRH 수준 증가의 지표이며 그대로 당업계에 널리 사용된다.
새끼 돼지의 IGF-I 농도
1일 10일 18일 25일
돼지 1 290.46 118.63 185.01 356.02
돼지 2 265.7 115.62 117.99 172.28
돼지 3 109.27 77.389 200.75 109.99
돼지 4 94.689 36.746 93.795 65.113
돼지 5 155.98 95.946 138.24 179.3
돼지 7 171.41 19.463 213.29 226.43
돼지 8 178.3 101.55 98.478 165.88
돼지 9 104.86 78.872 84.7 77.214
돼지 10 262.4 131.36 206.23 138.99
평균 181.4521 86.17511 148.7203 165.6908
STDEV 74.91415 37.61337 52.67175 57.96496
SE 24.97138 12.53779 17.55725 29.32165
표 8에서 IGF-BP3(IGF 결합 단백질 3) 면역방사능측정 분석(IRMA)은 2000년 5월 25일에 시험하였다. IRMA는 2부위 면역방사능측정 분석을 이용한다[참조: Miles LEM, Lipschitz DA, Bieber CP and Cook JD: Measurements of serum ferritin by a 2-site immunoradiometric assay. Analyt Biochem 61:209-224, 1974]. IRMA는 측정될 피분석물이 두 항체 사이에 "샌드위치"되는 비경쟁적 분석법이다. 제1 항체는 튜브의 내벽에 고정된다. 다른 항체는 검출을 위해 방사능표지된다. 미지 시료, 표준물 및 대조군에 존재하는 피분석물은 항체 둘 모두에 결합되어 "샌드위치" 복합체를 형성한다. 미결합 물질은 튜브를 기울여 버리거나 세척하여 제거한다. 표 8의 측정값은 보정 인자 x 50을 포함한다. 표 8은 실험군의 평균값이 238.88ng/ml인 반면, 시험된 종래 대조군 모두의 평균값이 205.44ng/ml 임을 제시하고 있다. p<0.048로, 통계학적 유의성이 있다.
새끼 돼지의 IGF-BP3 농도
1일 10일 18일 25일 1일 10일 18일 25일
돼지 1 7.9841 3.917 7.1657 3.5957 399.205 195.85 358.285 179.785
돼지 2 7.5463 3.4327 3.3382 4.4706 377.315 171.635 166.91 223.53
돼지 3 3.4187 4.9039 6.7961 6.3021 170.935 245.195 339.805 315.105
돼지 4 5.6354 4.2184 3.8551 1.9101 281.77 210.92 192.755 95.505
돼지 5 4.282 4.5592 5.2783 3.8224 214.1 227.96 263.915 191.12
돼지 7 3.7328 4.4454 2.9426 4.8232 186.64 222.27 147.13 241.16
돼지 8 5.4265 3.3285 4.1714 7.1258 271.325 166.425 208.57 356.29
돼지 9 3.7912 5.6354 3.9117 6.7643 189.56 281.77 195.585 338.215
돼지 10 4.7668 5.6099 5.24 3.8474 238.34 280.495 262 192.37
평균 5.17598 4.45004 4.74434 4.74018 258.7989 222.5022 237.2172 237.0089
STDEV 1.652 0.83658 1.48489 1.70536 82.6 41.8289 74.24472 85.2679
SE 0.55067 0.27886 0.49496 0.56845 27.53333 13.94297 24.74824 28.42263
표 9는 총 단백질 농도(g/dl)를 제시한 것이다. 실험군의 평균값은 5.3g/dl인 반면, 시험된 종래 대조군 모두의 평균값은 4.02g/dl이다. p<0.0001로 통계학적 유의성이 매우 높다.
새끼 돼지 중의 총 단백질 농도
1일 10일 18일 25일
돼지 1 5.7 5.9 G.H. 5.5
돼지 2 5.3 5.6 5.5 5
돼지 3 5.2 5.3 5.3 5.4
돼지 4 5.3 5.5 4.9 5.4
돼지 5 5.8 5.3 5. 5.4
돼지 7 5.6 5.4 5.3 5.2
돼지 8 4.5 5 G.H. 4
돼지 9 5.3 5.1 5.3 5.2
돼지 10 6.3 5 5.2 5.5
평균 5.44444 5.34444 5.21429 5.17778
STDEV 0.49526 0.29627 0.20354 0.47111
SE 0.16509 0.09876 0.06795 0.15704
표 10은 크레아틴 농도(mg/dl)를 나타낸 것이다. 실험군의 평균값은0.936mg/dl인 반면, 시험된 종래 대조군 모두의 평균값은 0.982mg/dl이다. 통계적 유의성은 없었고(p<0.34), 이는 정상 신장 기능을 나타낸다.
새끼 돼지의 크레아틴 농도
1일 10일 18일 25일
돼지 1 0.75 0.96 G.H. 1.14
돼지 2 0.73 1.03 0.98 1.46
돼지 3 0.69 0.92 0.95 1.1
돼지 4 0.65 0.94 1.18 1.18
돼지 5 0.64 0.8 0.91 0.92
돼지 7 0.72 0.93 1.02 1.12
돼지 8 0.68 0.9 0.83 1.2
돼지 9 0.68 0.87 1 1.07
돼지 10 0.74 1.02 1.02 1.03
평균 0.69778 0.93 0.98625 1.13556
STDEV 0.0393 0.07124 0.10113 0.14783
SE 0.0131 0.02375 0.03371 0.04928
표 11은 BUM(혈액내 우레아 수준)(mg/dl)을 나타낸다. 실험군의 평균값은 3.88mg/dl인 반면, 시험된 종래 대조군 모두의 평균값은 8.119 mg/dl이다. p<0.0012로 통계학적 유의성이 현저하다.
새끼 돼지의 BUN 농도
1일 10일 18일 25일
돼지 1 4 3 5 4
돼지 2 4 3 3 6
돼지 3 6 6 5 7
돼지 4 5 3 4 5
돼지 5 3 2 3 3
돼지 7 3 3 3 3
돼지 8 2 3 5 7
돼지 9 3 3 4 4
돼지 10 3 3 3 4
평균 3.66667 3.22222 3.88889 4.77778
STDEV 1.22474 1.09291 0.92796 1.56347
SE 0.40825 0.3643 0.30932 0.52116
표 12는 글루코스 농도(mg/d)를 나타낸 것이다. 실험군의 평균값은 123.23mg/dl인 반면, 시험된 종래 대조군 모두의 평균값은 122.8mg/dl이다. 통계학적 유의성이 없다(p<0.67). 용어 G.H.는 총 용혈작용을 나타낸다. 이 샘플에서 생화학적 상수는 측정할 수 없었다.
새끼 돼지의 글루코스 농도
1일 10일 18일 25일
돼지 1 117 115 G.H. 115
돼지 2 112 137 130 119
돼지 3 133 138 143 115
돼지 4 125 127 132 90
돼지 5 115 123 133 120
돼지 7 114 120 123 115
돼지 8 126 123 G.H. 116
돼지 9 118 129 124 119
돼지 10 142 134 136 112
평균 122.4444 127.3333 131.5714 113.4444
STDEV 9.98888 7.88987 6.90066 9.15302
SE 3.32963 2.62996 2.30022 3.05101
상기 표들에 나타나듯이 IGH, IGH-BP3은 증가하고(GH 축의 자극의 결과로서), 우레아는 감소하고 총 단백질은 증가하는 한편(개선된 단백질 대사작용의 표시), 인슐린과 글루코스는 정상을 유지하였다. 인슐린과 글루코스의 정상 수준은 고전적인 GH 치료법이 과혈당증을 가진 "당뇨병"과 같은 상태를 산출하기 때문에 본 발명의 장점이다. 이 실험에서 정상인 크레아티닌은 부적절한 대사 조건하에 동물에서 때로 손상될 수도 있는 신장 기능을 측정하는데 사용되는 변수이다.
따라서, 특정 구체예에서 첫 임신때 pSP-HV-GHRH를 주사받은 암퇘지의 후속되는 다수의 임신으로부터 태어난 새끼 돼지는 정상 수준이나 임의 형태의 GHRH를 암호화하는 DNA를 주사받지 않은 암퇘지로부터 태어난 동물보다 우수한 성장 증가를 보였다.
특정 구체예에서, 암컷이나 어미에게 GHRH를 암호하는 핵산의 투여는 GH 생성 세포의 약 25 내지 50%의 증가에 관여한다.
또 다른 구체예에서 임신하지 않은 암퇘지에게는 임신 전에 주사한다.
또 다른 구체예에서는, 본 발명의 pSP-HV-GHRH 벡터를 투여하는 대신에 당해 기술분야에 공지된 다른 성장 호르몬 방출 호르몬 유사체를 이용할 수 있다. 예를 들어 야생형 GHRH를 이용하기도 한다. 실험은 본 명세서에 제시된 교시와 유사하게 실시한다.
또 다른 구체예에서, 새끼 돼지를 죽인 즉시 뇌하수체를 수거하여 뇌하수체 함량의 변화를 분석한다. 즉 새끼 돼지는 시판 중량(약 100 kg)에 이르렀을 때 죽여서 뇌하수체를 수거한다. 분석에는 여러 종류의 호르몬 분비 세포의 상대적 뇌하수체 함량을 포함한다(성장 호르몬, 프로락틴, 황체 자극 호르몬(FSH) 등을 분비하는 세포의 상대적 비율).
실시예 16
추가 실험
특정 구체예에서, 보다 많은 암퇘지, 예컨대 약 20마리에게 실시예 14와 15에 제시된 것과 동일하거나 유사한 처리로 주사하였다. 100㎍에서 10mg에 이르기까지 다양한 플라스미드 함량을 처리군 당 5마리의 암퇘지를 사용하는 그룹에 대하여 처리하였다. 그 후손을 미주사된 암퇘지의 후손과 비교하였다. 특정 구체예에서 이 실험은 그 데이터를 문헌의 데이터로 표준화할 수 있도록 하기 위해 한 농장에서 실시한다.
실시예 17
최적화 실험
첫 임신 동안의 최적의 주사 시간을 결정하기 위하여 임신한 래트를 사용하였다. 래트의 임신 기간은 약 21일이다. 임신한 암컷에게 임신 5일부터 18일까지 주사하고, 그 후손은 출생 후 여러 시점에서 시험하였다. 구체적 실험으로는 체중, 체 조성 및 여러 종류의 호르몬 분비 세포의 뇌하수체 상대적 함량(성장 호르몬, 프로락틴, FSH 등을 분비하는 세포의 상대적 비율)을 포함한다.
실시예 18
젖 생산을 증가시키는 방법
본 발명의 일 구체예에서는 성장 호르몬 방출 호르몬을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 발현되는 조건하에서 동물의 세포내로 벡터의 유효량을 도입시키는 단계를 포함하여 젖 생산(젖분비라고도 함)을 증가시키는 방법을 제공하며, 여기에서 벡터는 프로모터; 상기 성장 호르몬 방출 호르몬을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열; 이 뉴클레오타이드 서열을 기능적으로 발현시키기 위해 작동적으로 결합된 3' 비해독 영역을 포함하고; 이 벡터의 도입 및 발현 결과 동물의 젖생산이 증가된다. 이 구체예에서 동물은 사람, 소, 돼지, 염소 또는 양이다.
본 명세서에 기술된 방법에 의해 동물로의 GHRH를 포함하는 벡터의 도입은동물에서의 젖 생산을 증가시킨다. 특정 구체예에서 동물은 암컷이거나 어미이거나 임신한 암컷이다. 또 다른 특정 구체예에서 암컷 또는 어미의 후손은 대략 처음 2주 내에 암컷이나 어미의 젖 생산 증가로 인해 더 빠르게 성장한다. 본 명세서에 기술된 바와 같이 젖 생산의 증가는 동물에게 GHRH를 암호화하는 핵산을 1회 주사했을 때 나타난다.
당업자라면 젖 생산의 증가를 측정하는 방법을 잘 알고 있을 것이다[예컨대, 미국 특허 제5,061,690호; 제5,134,120호; 및 제5,292,721호 또는 Peel et al., J.Nutr.,1981, 111:1662].
젖 샘플은 출산시(초유)와 젖생산 13일과 20일째 손으로 짠다. 40IU의 옥시토신을 근육내 주사로 투여하고(초유 수집시는 제외) 암퇘지 당 두 유선에서 더 이상 젖이 나오지 않을 때까지 가능한한 신속하게 젖을 짜낸다. 두 유선의 샘플을 충분히 혼합하고, 일정량을 보존제, 예컨대 이크롬화 칼륨을 첨가한 2개의 바이엘에 넣었다. 바이엘은 분석할 때까지 동결시켜 두었다. 유지방, 무수물 및 단백질은 A.O.A.C.(1980) 절차와 같은 당업계에 공지된 표준 절차에 따라 측정한다. 특정 구체예에서 젖의 락토스는 반자동(모델 27 산업용 분석기, Yellow Springs Instrument Co., Inc., Yellow Springs, Ohio) 효소 절차(조작 절차 번호 OP-025, Monsanto Co., St.Louis, Mo.)로 분석하였다. 각 암퇘지의 젖 수율은 특정 구체예에서는 돼지를 루이스 등(1978) 및 마한 등(1971)에 의해 기술된 바와 같이 포유하기 전과 후에 시간마다 돼지의 체중을 달아 13일과 20일째 측정한다. 이 시기 동안 요와 배변의 손실을 예방하거나 고려하는 주의가 필요하다. 특정 구체예에서는, 처음 2회의 포유 기간을 통해 암퇘지와 새끼를 적응시키고 1일 젖 수율을 계산하는데에는 포함시키지 않는다. 젖 수율은 연속 6시간 동안 수득한 수율을 4로 곱하여 계산한다.
실시예 19
다른 구체예
본 발명의 다른 구체예에, 성장 호르몬 분비촉진제 수용체(GHS-R)의 리간드는 GHRH 핵산 전달과 유사한 결과를 제공한다. 당업자라면 당해 기술분야에 공지된 많은 다양한 GHS-R 리간드 구조 형태를 잘 알고 있을 것이며 이 모든 형태는 GHS-R을 통해 작동한다. 그 예로는 MK-0677(Merck, Whitehouse Station, NJ), GHRP-6(Bowers, 1998 참조) 및 내인성 리간드인 귀렐린(ghrelin)(Kojima et al., 1999; Dieguez and Casanueva, 2000)이 있다. 다른 예로는 헥사렐린(hexarelin)(유로펩타이드), L-692,943(Merck & Co.; Whitehouse Station, NJ), NN703(Novo Nordisk; Bagsvaerd, Denmark) 또는 GHS-R 수용체 상에서 작동물질로서 작용하는 모든 화합물이 있으며, 이들 모두는 당업자에게 공지된 것이다(예컨대, Pong et al.(1996); Howard et al.(1996); 또는 Smith et al.(1997)).
GHS-R이 GHRH의 상류에 있고 뇌하수체로부터 GHRH 방출을 증가시킨다는 것은 당업자라면 잘 알고 있는 것이다. 특정 구체예에서, GHS-R 리간드는 경구(예컨대 사료나 음용수에 첨가하여) 투여하는데, 이것은 뇌하수체로부터 GH 방출을 일으킬 때 GHRH의 효과를 증폭시킨다. 이 구체예에서 본 발명의 GHRH 핵산 전달은 부가 향상 효과를 제공한다. 본 발명의 영역을 제한함이 없이 본 발명자들은 유사한 작용 기작이 부가 GHRH가 pit-1(배발생 동안 뇌하수체 전엽에서 성장자극세포인 GH 생성 세포의 발생에 관여하는 전사 인자)의 발현을 증가시키는 것으로 추정한다. GHS-R의 활성화 역시 pit-1 발현을 증가시킨다. pit-1 발현 역시 cAMP에 의해 증가되고 GHS-R 리간드는 GHRH에 대한 반응으로 만들어진 cAMP의 양을 증가시킨다. 따라서, 태어났을 때 돼지는 증가된 성장자극세포의 농도를 갖고 있을 가능성이 있다. 그러므로, 돼지는 더 많은 GH를 생산한다. 따라서 특정 구체예에서 본 발명의 GHRH 핵산 전달은 1종 이상의 GHS-R 리간드와 함께 투여한다. GHS-R 리간드는 약학적 허용성 조성물로 투여된다.
본 명세서에 기술된 모든 특허 및 공개문헌은 본 발명이 속하는 당해 기술분야의 숙련된 자의 수준을 나타낸다. 모든 특허와 공개문헌은 각 문헌이 참고인용되는 것으로 각각 구체적으로 표시될지라도 동일한 정도로 참고인용되는 것이다.
실시예 20
GHRH 투여가 암퇘지 및 후손에게 미치는 다중 효과
본 발명의 목적에서 임신한 동물 중의 이상 생성되는 GHRH는 예컨대 태반을 통해 후손으로 전달되어 후손의 장기간 GH 생산을 향상시키고, 그 이후 성장 증가와 체 조성 변화를 나타낸다. 이와 동시에 주사를 맞은 암퇘지는 유의적으로 더 많은 젖을 생산한다.
큰 포유동물에게 GHRH 근성 벡터를 주사한 후 후손에 미치는 성장 효과 및 암퇘지의 젖 생산에 미치는 GHRH 전달의 효과를 측정하기 위하여 임신한 암퇘지 6마리에게 임신 95일째 플라스미드 DNA pSP-HV-GHRH(n=4) 또는 pSP-wt-GHRH(n=2)10mg을 주사하였다. 최근에 설치류 및 큰 포유동물의 생체내 플라스미드 흡수율을 증가시키기 위한 전기천공 기법을 사용함으로써 이상 유전자 발현을 위해 근육을 사용하는 기술에 대한 유의적 진보가 이루어졌다(Bettan et al., 2000; Draghia-Akli et al., 1999; Mir et al., 1999). 이 경우에 플라스미드 주사를 먼저 실시하고 그 다음 본 명세서에 기술되고 문헌(Draghia-Akli et al., 1999)에 기술된 바와 같은 조건과 6 니들 어레이 전극을 사용하여 전기천공하였다. 6마리의 동등한 암퇘지를 대조군으로 사용하였다. 동물들은 서로 24시간 이내에 출산하였다. 후속 연구에서는 총 132마리의 새끼 돼지가 분석되었다.
출산하기 2주 전에 주사액으로 재조합 GHRH를 투여하면 13일째와 이유시 돼지의 체중을 증가시키고 돼지 생존율을 증가시키는 것으로 알려져 있다(Etienne et al., 1992). 이 경우에 GHRH를 주사한 암퇘지의 새끼 돼지는 출생시에도 훨씬 컸다(평균 HV-GHRH 1.65±0.06kg, p<0.00002 및 wt-GHRH 1.46±0.05kg, p<0.0014 대 대조군 1.27±0.02kg)(도 8).
새끼 돼지는 21일째 이유시키고 출생후 170일째 도살 중량에 대해 분석하였다. 주사한 암퇘지의 새끼 돼지는 이유시 평균 18% 더 컸다(도 9). 각 한배 새끼 중 절반을 대조군 암퇘지(주사 맞은 암퇘지의 새끼 돼지) 또는 주사 맞은 암퇘지(대조군 암퇘지의 새끼 돼지)에게 교차 양육시켰다. 흥미롭게도, 주사 맞은 동물에게 교차 양육된 대조군은 이들의 한배새끼 보다 유의적으로 더 컸다(12.2% 정도까지)(p<0.02, 도 10). 이와 같은 GHRH 처리된 동물에게 교차 양육된 대조군 동물의 체중 변화는 주사 맞은 암퇘지의 유의적으로 증가된 젖 생산을 나타내는 것이다.그럼에도 불구하고, 대조군 암퇘지에게 교차 양육된 GHRH 처리된 암퇘지의 새끼 돼지는 이들의 한배 새끼 보다 더 작은(5.8% 정도까지) 경향이 있었으나, 그 수치는 통계적으로 유의적인 값은 아니었고, 이것은 GHRH 처리된 동물의 후손이 성장을 증가시키는 시상하부-뇌하수체 축의 내인적 변화가 있음을 나타낸다. 대조군(대조군 암퇘지에게 공급) 이상의 전반적인 증가는 도 12에 도시하였다.
이러한 장점은 시판 중량까지 유지되었는데, 즉 170일째 체중이 HV-GHRH의 경우 평균 135.7±1.89kg이고 wt-GHRH의 경우 129.3±2.17kg인 반면 대조군의 체중은 평균 125.3±1.74kg이었다(도 13). 체중 차는 매시점 마다 통계적 유의적 차이가 났다(p값이 0.05 내지 10-5사이).
다수의 생화학적 측정을 실시하였다(표 13a 및 13b). 동화작용의 증가의 표시로서 실험군에서 총 단백질 및 알부민 농도(g/dl)의 증가가 나타났다. 시험한 시점의 약간의 차이로 인해(출생 후 50일째와 170일째) 총 단백질은 8% 증가한 반면 알부민은 7.5% 증가하였다(표 13a와 13b).
크레아틴 농도는 정상(0.936 mg/dl 대 대조군 0.982mg/dl, p<0.34)으로, 정상적인 신장 기능을 나타낸다.
글루코스 농도는 시험한 모든 시점에서 정상이었다(표 14a 및 14b).
인슐린 수준은 정상이었다. 인슐린과 글루코스의 정상 수준은 고전적인 GH 치료법이 과혈당증을 가진 "당뇨병"과 같은 상태를 산출하기 때문에 본 발명의 장점이다(Pursel et al.,1990).
전 연구 동안의 생존율은 처리된 암퇘지의 후손의 경우 유의적으로 더 높았다(표 15). 발병율도 처리된 그룹에서 훨씬 적었다.
돼지카테고리 총 # 돼지 # 사망한 돼지 사망 % 병리학 임상 기록
대조군 63 7 11.11 돌연사 1
탈장 1
수족 장애 1 뒷다리
장염 1 7/26 탈장- 10/10 장염
부은 관절 2 텐더풋트 헤르미츠(Tenderfooted Hermiths)8/30 종양
출혈 궤양 1 소모성-빈혈
WT-GHRH 18 1 5.56 돌연사 1
HV-GHRH 42 2 4.76 돌연사 1
수족 장애 1 8/21 손상된 다리 분투
용혈작용성 궤양, 간과 신장의 공포형성 또는 심지어 암퇘지의 사망을 일으킬 수 있는 돼지 재조합 성장자극세포(rpST)의 주사와 달리(Smith et al.), GHRH 유전자 치료법은 허용성이 우수하며, 동물에서 관찰된 부작용도 없었다. GHRH 플라스미드가 존재하지 않는 처리된 동물의 후손에서도 성장 증가가 수득되어진다는 점에 주목해야 한다. 돌연변이유발, 근성 전이 또는 리포좀 매개 정맥내 주사법에 의해 GH를 가축 및 GH 결손형 숙주내에 전달하고 안정하게 생성시키기 위하여 조절된 조직/섬유 종류 특이적 hGH 함유 플라스미드가 종래에 사용되었다(Dahler etal., 1994; Pursel et al., 1990; Barr and Leiden, 1991). 그러나, 이 기법들은 대규모 작업 및/또는 사료 동물에 사용될 수 없는 다음과 같은 유의적인 단점이 있다: 1) 리포좀 전달과 관련된 가능한 독성 또는 면역 반응; 2) 형질감염된 근원세포 방법에서의 포괄적인 생체외 조작 기술의 필요성; 및/또는 3) 돌연변이유발시의 중요한 부작용 또는 비효율의 위험성(Mililer et al., 1989; Dhawan et al., 1991). 이 기법들에 비해 플라스미드 DNA 주사법은 간단하고 효과적이며 전달 시스템이나 과도한 발현과 관련된 문제점이 없다.
본 명세서에 제시된 데이터는 GHRH 플라스미드를 주사한 큰 포유동물의 후손에서 향상된 생물학적 잠재능이 나타나고, GH 생산 및 분비의 생리적 수준의 증가 및 치사율과 발병율의 감소도 나타난다. 처리된 암퇘지는 유의적으로 높은 젖 생산량을 나타낸다. 후손의 새끼 돼지는 치료에 의한 어떤 부작용도 경험하지 못했으며 관련 병리상태나 기관비대증 없이 정상적인 생화학적 프로필을 나타냈다. 성장의 현저한 향상은 근성 GHRH 벡터의 이상 발현이 고전적 GH 치료 섭생을 대체할 수 있을 것이며 보다 생리학적으로 적당한 방식으로 GH 축을 자극할 수 있음을 시사한다. 돼지에서 고도의 안정성과 GH 분비 활성을 나타내는 HV-GHRH 분자는 GHRH를 분해하는 혈청 프로테아제가 대부분의 동물에서 유사하기 때문에 다른 포유동물에서도 유용할 수 있다.
이하, 본 실시예에 사용된 재료와 방법을 설명한다.
DNA 작제물
플라스미드 pSPc5-12는 pSK-GHRH 골격의 SacI/BamHI 부위에 SPc5-12 합성 프로모터의 360bp SacI/BamHI 단편을 포함한다(Draghia-Akli et al., 1997). 야생형 돼지 GHRH는 사람 GHRH cDNA (1-40)OH의 부위 지정 돌연변이유발법으로 위치 34의 Ser을 Arg으로, 위치 38의 Arg을 Glu으로 변이시켜 수득하고; 돌연변이 돼지 HV-GHRH DNA는 사람 GHRH cDNA (1-40)OH의 부위 지정 돌연변이유발로 위치 1의 Tyr을 His으로, 위치 2의 Ala을 Val으로, 위치 15의 Gly을 Ala으로, 위치 27의 Met을 Leu로, 위치 28의 Ser을 Asn으로, 위치 34의 Ser을 Arg으로, 위치 38의 Arg을 Glu로 변이시키고(Altered Sites II in vitro Mutagenesis System, Promega, Madison, WI), pSP-GHRH의 BamHI/HinIII 부위에 클로닝하였다. GHRH cDNA 다음에 사람 성장 호르몬의 3' 비해독 영역을 배치하여 pSPc5-12-wt-GHRH 및 pSPc5-12-HV-GHRH를 수득하였다. 대조군의 플라스미드에는 동일한 합성 프로모터의 조절하에 이. 콜리 베타-갈락토시다제 유전자를 함유시켜 pSP-bgal을 수득하였다.
동물 연구
이 GHRH 연구에는 약 365kg인 PIC 라인의 22마리 첫출산 암퇘지를 사용하였다. 이 동물을 임신 87일째 농장 시설로 옮기고 각각 출산 축사에 단독으로 수용하여, 물과 사료는 무한 공급하면서 25일의 젖생산 기간 말까지 지내도록 하였다. 실험은 3월에 시작하여 첫 새끼가 4월에 출생했고 10월 중순까지 분석하였다. 농장 건물에는 고온의 기후에서도 외부 온도 보다 2 내지 5℃ 낮은 최대 온도를 유지할 수 있는 냉각 시스템을 설치하였다. 7월, 8월 및 9월의 평균 최대 온도는 각각 40.6℃, 41.6℃ 및 36.6℃였다. 동물은 NIH 가이드, USDA 및 동물 복지 강령 지침에 따라 보육하였다.
돼지로의 플라스미드 DNA의 근육내 주사
내독소가 제거된 pSPc5-12-HV-GHRH 및 pSPc5-12-wt-GHRH(Qiagen Inc., Chatsworth, CA, USA) 플라스미드 제제를 pH7.4의 PBS로 1mg/ml로 희석하였다. 각 암퇘지에게 1가지씩 처리하였다. 4마리의 암퇘지에게는 pSPc5-12-HV-GHRH를 주사하고 2마리의 암퇘지에게는 pSPc5-12-wt-GHRH를 주사하였으며 6마리의 암퇘지는 대조군으로 사용하였다. 임신 95일째 동물을 테라졸 2.2mg/kg으로 가볍게 마취시켰다. 플라스미드 총 10mg을 돼지의 좌측 반힘줄모양근으로 직접 주사하였다. 2분 후 주사 맞은 근육에 6 니들 어레이 주사용 전극(직경 1cm, 22 게이지, 길이 2cm)을 사용하여 다음과 같은 조건하에 전기천공시켰다: 6 펄스, 니들 사이의 교호장, 200V/cm, 60밀리초/펄스(Draghia-Akli et al., 1999; Aihara and Miyazai, 1998 참조).
교차 양육 연구
출생 후 즉시 각 새끼를 두 그룹으로 나누었다. 새끼 중 절반은 자신의 어미에게 두고 나머지 절반은 다른 그룹에게 교차 양육하게 하였다(예컨대, 대조군의 새끼 돼지는 HV 또는 wt-주사처리된 동물에게 교차 양육하게 하거나 wt 태생의 새끼돼지는 대조군 동물에게 교차 양육하게 하였다). 체중은 매주 기록하였다.
먹이
21일째 이유시킨 후 새끼 돼지에게 1.012% 리신이 함유된 Nutrena 18% Medicated Pig Starter(Cargill, Minneapolis, MN)를 60일 동안 공급하였다. 이어서, 45일 동안 1.4% 리신이 함유된 Custom Mix Pig Starter 단백질을, 그 다음 45일 동안 1.4% 리신이 함유된 Custom Mix 22.7% 단백질을 공급한 후, 나머지 연구 기간 동안 1.2% 리신과 함께 20% 단백질이 함유된 Custom Mix를 가지고 보육하였다.
생화학
출생 후 50일과 170일째 혈청을 수집하여 독립된 실험실(Antech Diagnostics, Irvine, CA)에서 분석하였다.
돼지 IGF-I RIA
돼지 IGF-I는 이종 사람 IGF-I 분석법으로 측정하였다(Diagnostic System Lab., Webster, TX).
돼지 인슐린 RIA
돼지 인슐린은 이종 사람 분석법으로 측정하였다(Linco Research Inc.; St. Charles, Missouri). 이 분석의 감도는 2 μU/ml 이었다.
체 조성 데이터
연구를 통해 동일하게 조정된 저울(±0.2kg의 정확도가 인증된 것, 변동 계수 0.3%)을 사용하여 1주에 2회씩 체중을 측정하였다.
통계학
데이터는 마이크로소프트 엑셀 통계 분석 패키지를 사용하여 분석하였다. 도면에 제시된 값은 평균값±s.e.m. 값이다. 특이적 p값은 스투던츠 검정으로 비교하여 수득할 수 있다. p<0.05는 통계적 유의성이 있는 수준으로 설정하였다.
실시예 21
GHRH를 처리한 래트의 다중 효과
성장 호르몬 분비는 천연 GH 분비촉진제인 성장 호르몬 방출 호르몬(GHRH)으로 자극하고 소마토스타틴(SS)으로 억제시켰으며, 이 두 호르몬 모두 시상하부 호르몬이다(Thorner et al., 1995). GH 펄스는 소마토스타틴 분비의 감소 또는 철회와 관련된 GHRH 분비의 결과이다. 또한, 이 펄스 발생기 기구는 GH 음성 피드백에 의해 조정되는 것으로 보인다. 또한, 래트의 위에서 처음으로 분리된 신규 펩타이드인 귀렐린은 GH 분비 및 에너지 항상성의 중요한 조절인자로 인식되고 있다. 귀렐린은 성장 호르몬 분비촉진제 수용체의 내인성 리간드로서, 이의 생체내 GH 방출 활성은 GHRH에 의존적이다(Hataya et al., 2001). 건강한 성숙 포유동물에서 GH는 24시간 이내에 4 내지 8회 나타나는 고도 조절성이며 독특한 진동 패턴으로 방출되며, 그 생물학적 활성에 심원한 중요성이 있다(Argente et al., 1996). 분비의 이상 패턴은 말초 수준에서 최적 유도되는 생리적 효과와 관련이 있다(Veldurs, 1998). GH 이소폼의 발현, 프로세싱 및/또는 방출과 이들 사이의 상대적 비율은 성장 및 발육 단계 동안 차등 조절된다(Araburo et al., 2000).
성장자극세포의 조절 및 분화는 또한 뇌하수체 자체내에서의 파라크린 프로세스에 따라 달라지고 성장 인자와 여러 신경펩타이드, 예컨대 혈관형성형 장 펩타이드(Rawlings et al., 1995), 안지오텐신 2, 엔도텔린(Tomic et al., 1999) 및 액티빈(Billesbup et al., 1990)을 수반한다. GH와 인슐린 유사 성장 인자 I(IGF-I) 경로의 효과적이며 조절적 발현은 최적의 직선 성장, 탄수화물, 단백질 및 지방 대사의 항상성 및 양성의 질소 평형을 제공하는데 필수적이다(Murray and Shalet,2000). GHRH, GH, 귀렐린, 프로락틴(PRL) 및 IGF-I는 생리적 상태는 물론 병리학적 상태에서의 체액 및 세포 면역반응의 조절에 중요한 역할을 한다(Geffner et al., 1997; Hattori et al., 2001).
GHRH 유전자의 시상하부 조직 특이적 발현은 두개 외로 분비된 GHRH가 생물학적 활성이기 때문에 활성에 필수적인 것은 아니다(Faglia et al., 1992; Melmed, 1991). GH 활성의 병리학적 GHRH 자극(그 급원에 관계없이, 돌연변이 모델에서 췌장 종양에 이르기까지)은 선하수체 세포의 증식, 이상증식 및 선암을 초래할 수 있다(Asa et al., 1992; Sano et al., 1988). 그럼에도 불구하고, 치료를 받은 동물의 후손에서 지속되는 GHRH 치료의 장기간 효과는 아직 밝혀지지 않았다.
합성 근육 특이적 프로모터에 의해 조절되는 발현 플라스미드 유래의 신규 혈청 프로테아제 내성 돼지 GHRH의 이상 발현이 근육내 주사 및 생체내 전기천공에 의한 전달 후 돼지내에서 높은 GH와 IGF-I 수준을 유도한다는 것은 이미 밝혀져 있다(Lopez-Calderon et al., 1999). 본 실시예에서 설명한 실험의 목적은 플라스미드 DNA 유전자 치료법에 의해 전달된 GHRH가, 임신 마지막 3주 동안에 처리된 동물 후손의 성장을 향상시키고 체 조성을 변화시키는지 평가하는 것이다.
특정 구체예에서, 임신한 동물에서 이상 생산된 GHRH는 태반을 통해 후손으로 전달되고, 뇌하수체 이상증식을 좌우하고 장기간 후손의 GH 생산을 향상시켜 성장을 증가시키고 체 조성을 변화시킨다. 포유동물에게 GHRH 근성 벡터를 주사하여 후손에게 미치는 성장 효과를 측정하기 위하여 임신한 래트에게 임신 16일째에 플라스미드 DNA pSP-HV-GHRH 또는 pSP-βgal 30㎍을 주사하였다. 주사 후 전기천공을 실시하여 플라스미드 흡수율을 증가시켰다.
모든 동물은 임신 20 내지 22일째 출산하였다. 한배에서 나온 후손의 평균 수는 그룹 마다 유사하였다(처리군(T), n=10.8 마리/한배; 대조군(C) n=11.75 마리/한배). 새끼 수는 어미들 사이에서 균등하여 10 마리/어미 정도였다. 출산 후 2주째 새끼들의 평균 체중은 처리군의 경우 9% 증가하였다: T=31.47±0.52g 대 C=28.86±0.75g, p<0.014.
이유시 체중은 T의 후손이 유의적으로 증가되었다: T 암컷은 평균 51.97±0.83g이고 대조군 암컷(CF)은 47.07±4.4g(p<0.043)이며, 처리된 수컷은 평균 60.89±1.02g이고 대조군 수컷(CM)은 49.85±4.9g (p<0.001) 이었다(도 14). 이 장점은 10주 동안 유지되었고, 24주까지는 체중 차가 무의미하게 되었다.
암컷 및 수컷 모두 3주령째 체중 당 장딴지근(G)과 앞정강근(TA)의 유의적 차이를 보이며 근육 비대증을 나타냈다(도 15). TF는 연구 동안 근육 비대증을 유지한 반면 수컷은 10주령후 근육 비대증의 징후를 나타내지 않았다. 이러한 변화는 골격근에서 생리학적으로 증가된 GH의 효과를 둔하게 하는 수컷의 성숙시의 성 스테로이드 변화 때문인 것으로 생각된다.
뇌하수체는 사후 1분 이내에 분리해내어 무게를 달았다. 총 체중에 대한 뇌하수체 중량의 비율은 출생 후 12주까지는 주로 IF에서 유의적으로 증가하였다(도 16). 뇌하수체 중량의 증가는 GHRH가 뇌하수체 전엽으로부터 GH 합성과 분비를 자극할 수 있고 성장자극세포에 대하여 특이적인 비대 효과를 갖고 있는 것으로 알려져 있기 때문에(Morel et al., 1999; Murray et al., 2000), 성장자극세포 이상증식이 가장 큰 원인인 것으로 생각된다. 이것은 호르몬(도 17) 및 조직학적(도 18) 증거에 의해 입증되고 있다. 주사처리된 동물의 뇌하수체를 노던 블롯 분석한 결과 GH와 PRL mRNA 수준의 유의적인 증가와 함께 내인성 래트 GHRH mRNA 수준의 감소가 나타났다. 조직학적 기술에 의해 특이적인 항래트 GH 항체는 성장자극세포 수의 증가를 보여준다.
GHRH 및 GH 수준의 전신 증가는 혈청 IGF-I 농도의 증가로 나타나기도 한다. 래트의 혈청 IGH-I는 출산 후 24주까지 pSP-HV-GHRH를 주사한 래트의 후손에서 유의적으로 높았다(시험한 모든 시점에서의 p<0.05, 도 19).
기관(폐, 심장, 간, 신장, 위, 장, 부신, 생식선, 뇌)을 수거하여 무게를 달았다. 동물에서 관찰되는 관련 병리상태는 전혀 없었다. 생체내 유전자 전이의 비바이러스 기법 중에서 근육내로의 플라스미드 DNA의 직접적인 주사가 간편하고 비용도 저렴하고 안전하지만 이 방법의 적용은 전이된 DNA 발현 벡터의 발현율이 비교적 낮다는 단점이 있었다. 특정 구체예에서 유전자 치료법에 의해 성장 및 체 조성을 조절하기 위하여 표적 동물이 직접 처리되지는 않지만 임신한 어미의 치료로 인해 향상된 생물학적 특성을 갖게 되는 혁신적인 시도의 이용이 필요하게 되었다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 플라스미드 벡터의 또 다른 유의적 개선점은 보다 안정된 GHRH 유사체인 HV-GHRH를 암호화하는 유전자를 이용한다는 점이다(Draghia-Akli et al., 1999). 전기유전자 치료 전이법은 목적한 기관 또는 조직내에서 유전자가 효과적으로 전이 및 발현될 수 있도록 하며 1회 투여 후 장기간 발현을 제공할 수 있다. 이 방법은 바이러스 유전자 또는 입자를 필요로 하지않는 매우 효과적인 핵산 전이법의 새로운 방법이라 할 수 있다.
돼지 또는 양과 같은 큰 포유동물의 경우 GH의 상류 자극인자인 GHRH의 이용은 성장능이나 젖 생산은 물론 보다 중요하게는 실질적이며 대사적 측면에서 생산 효율을 증가시킬 수 있는 교호적 전략이다(Dubreuil et al., 1990). 하지만, 현재 이 치료법의 다양한 이용은 재조합 펩타이드의 고비용과 필요한 투여횟수로 인해 제한적이다. 이러한 주된 단점은 GHRH의 이상 생산을 유도하는 핵산 전이 방법을 이용함으로써, 특히 그 생산이 장기간 지속될 때 해소될 수 있다.
따라서, 변이된 성장 호르몬 방출 호르몬(GHRH) cDNA를 발현하는 플라스미드를 성숙한 임신 래트의 앞정강이근에 1회 전기천공 주사한 후, 후손에서 동물의 성장 향상이 나타났다. 신생 래트(F1)는 출생시 유의적으로 더 컸다. 오랜 체중 및 체 조성 연구는 연령과 함께 성별 사이의 차이를 보여주었다. 호르몬 및 생화학적 측정값은 성장 패턴과 일치하였다. F1은 뇌하수체량이 더 많았고, 성장자극세포 이상증식과 GH 함량의 증가를 보였다. F1의 혈장 IGF-I 수준은 유의적으로 상승되었다. 요약해보면, 이 신규 발견이 GHRH가 플라스미드를 기초로한 유전자 치료 후 여러 세대를 거쳐 특정 동물 특성을 향상시키는데 이용될 수 있음을 입증한다.
이하 본 실시예에서 실시된 실험에 대하여 설명한다.
DNA 작제물
플라스미드 pSPc5-12는 pSK-GHRH 골격의 SacI/BamHI 부위에 SPc5-12 합성 프로모터(Li et al., 1999)의 360bp SacI/BamHI 단편을 포함한다(Draghia-Akli et al., 1997). 변이된 돼지 GHRH cDNA는 사람 GHRH cDNA의 부위 지정 돌연변이유발법으로 수득하였다(Altered Sites II in vitro Mutagenesis System, Promega, Madison, WI). 31개 아미노산 시그널 펩타이드와 변이된 돼지 GHRH(1-40)OH를 암호화하는 돼지 GHRH의 변이된 228bp 단편(엑손 2의 일부, 엑손 3 전체 및 엑손 4 일부)은 다음과 같은 아미노산 치환을 특징으로 한다: GLy15 → Ala, Met27 → Leu 및 Ser28 → Asn, Tyr1의 His으로의 전환, Ala2 → Val. 이 단편을 pSP-GHRH의 BamHI/HinIII 부위에 클로닝하였다. hGH pA는 사람 GH 유전자 유래의 3' 비해독 영역 및 폴리(A) 시그널이다. 플라스미드는 이. 콜리 DH5α(Gibco BRL, Carlbad, CA)에서 증식시켰다. 내독소가 제거된 플라스미드(Quiagen Inc., Chatsworth, CA, USA) 준비물을 pH7.4의 PBS로 1mg/ml가 되게 희석하였다.
플라스미드의 근육내 주사 및 전기천공
시간 조절로 임신된 성숙한 비스타 암컷 래트를 수용하여 베일러 의과대학(텍사스주 휴스톤 소재)의 동물 사육시설에서 보육하였다. 동물은 10h 광조건/14시간 암조건의 환경 조건하에 NIH 가이드, USDA 및 동물 복지 강령 지침에 따라 보육하고 프로토콜은 동물 보호 이용 위원회의 승인을 받았다. 실험은 2회 반복하였다. 임신 16일째, 동물(n=20 그룹)을 체중을 달고 케타민 42.8mg/ml, 크실라진 8.2mg/ml 및 아세프로마진 0.7mg/ml의 조합물을 사용하여 0.5 내지 0.7ml/kg의 용량을 근육내 투여하여 마취시켰다. 래트의 좌측 앞정강이근에 0.3cc 인슐린 주사기(Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ)를 사용하여 100ml PBS 중에 용해시킨 pSP-HV-GHRH 30mg을 주사하였다. 대조군 동물에게는 PBS만을 주사하였다. 그 그룹 모두에 대하여 주사 후 캘리퍼스 전기천공을 문헌(Draghia-Akli et al., 1999)에 기술된 바와 같이 실시하였다. 간략히 설명하면, 주사 후 2분이 지나서 래트의 다리를 두 바늘 전극(길이 1cm, 26게이지, 니들 사이 거리 1cm)(Genetronics, San Diego, CA) 사이에 놓고, 그 부위에 전기 펄스를 가하였다. 100V/cm의 전압엥서 60ms 펄스를 한쪽 배향으로 3회 가하고 전기장을 역위시켜 반대방향으로 펄스를 3회 더 가하였다. 펄스는 T-820 Electro Square Porator(Genetronics, San Diego, CA)로 발생시켰다.
후손 연구
주사처리된 모든 래트는 임신 20 내지 22일째 출산하였다. 1차 연구에서 240 마리 후손과 2차 연구에서 60마리 후손을 출생시부터 5개월령(출생시, 출생후 2주령, 3주령, 6주령, 8주령, 12주령, 16주령 및 22주령)까지 분석하였다. 각 시점에서 동일하게 조정된 체중계를 사용하여 체중을 기록하였다. 실험 마지막에는 사후에 체 조성을 분석하였다. 혈액을 수거하여 0℃에서 즉시 원심분리하고 분석전까지 -80℃에 보관해두었다. 주사처리된 동물 및 대조군의 기관(심장, 간, 비장, 신장, 뇌하수체, 뇌, 부신, 골격근-앞정강이근(TA), 장딴지근(G), 비근(S) 및 긴발가락펌근(EDL)), 사체, 지방을 분리하여 분석용 저울에 달고 액체 질소하에서 순간 동결시켰다. 정강이 길이를 측정하여 기록하였다.
뇌하수체의 노던 블롯 분석
뇌하수체는 순간 동결시켜 용액 D에 넣고 균질화하여 추출시켰다. 총 RNA 20mg을 DNaseI 처리하고 1.5% 아가로스-포름알데하이드 겔에서 크기 분리한 뒤 나일론 막으로 전이시켰다. 이 막을 무작위 프라이밍으로 32P로 표지된 특이적 GHRHcDNA 프로브와 하이브리드화시켰다.
래트의 IGF-I 방사능면역분석법
래트의 IGF-I는 특이적 방사능면역분석법으로 측정하였다(Diagnostic System Laboratories, Webster, Texas). 이 분석의 감도는 0.8ng/ml 였고, 분석내 및 분석간 편차는 각각 2.4%와 4.1% 였다.
통계학
도면에 제시된 값은 평균값±s.e.m. 이다. 특이적 p값은 스투던츠 t-검정이나 ANOVA 분석으로 비교하여 수득하였다. p<0.05를 통계적 유의성이 있는 수준으로 설정하였다.
본원에 인용되는 미국 특허 문헌
발명자로서 등록된 코이(Coy)등에게 1998년 12월 8일자로 허여된 미국 특허 제5,847,066호,
발명자로서 등록된 펠릭스(Felix)등에게 1998년 12월 8일자로 허여된 미국 특허 제5,846,936호,
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발명자로서 등록된 바우어스(Bowers)등에게 1998년 7월 7일자로 허여된 미국 특허 제5,776,901호,
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발명자로서 등록된 셀리(Seely)등에게 1992년 8월 11일자로 허여된 미국 특허 제5,137,872호,
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발명자로서 등록된 토르너(Thorner)등에게 1991년 7월 30일자로 허여된 미국 특허 제5,036,045호,
발명자로서 등록된 코박(Kovacs)등에게 1991년 6월 11일자로 허여된 미국 특허 제5,023,322호,
발명자로서 등록된 바우어스등에게 1989년 6월 13일자로 허여된 미국 특허 제4,839,344호,
발명자로서 등록된 바우어스등에게 1983년 10월 18일자로 허여된 미국 특허 제4,410,512호,
발명자로서 등록된 드렌글러(Drengler)등에게 1991년 9월 24일자로 허여된 미국 특허 제RE33,699호,
발명자로서 등록된 그로스베너(Grosvenor)등에게 1989년 5월 23일자로 허여된 미국 특허 제4,833,166호,
발명자로서 등록된 모마니(Momany)등에게 1980년 10월 14일자로 허여된 미국 특허 제4,228,158호,
발명자로서 등록된 모마니등에게 1980년 10월 14일자로 허여된 미국 특허 제4,228,156호,
발명자로서 등록된 모마니등에게 1980년 10월 7일자로 허여된 미국 특허 제4,226,857호,
발명자로서 등록된 모마니등에게 1980년 9월 23일자로 허여된 미국 특허 제4,224,316호,
발명자로서 등록된 모마니등에게 1980년 9월 16일자로 허여된 미국 특허 제4,223,021호,
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발명자로서 등록된 모마니등에게 1980년 9월 16일자로 허여된 미국 특허 제4,223,019호.
참조문헌
당해 기술 분야의 기술자는 본 발명이 고유 잇점 뿐만 아니라 목적을 수행하고 결과 및 잇점을 수득하는데 널리 적용됨을 인지하고 있다. 본원에 기술된 성장 호르몬, 성장 호르몬 분비 호르몬, 유사체, 플라스미드, 벡터, 약제학적 조성물, 치료, 방법, 과정 및 기술은 현재 바람직한 양태를 대표하는 것이고 예시하고자 한 것이지 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 이의 변화 및 기타 용도가 본 발명의 취지내에 포함되거나 첨부된 청구항의 범위에 의해 한정됨을 당해 기술 분야의 기술자는 인지할 것이다.

Claims (136)

  1. 뉴클레오타이드 서열이 발현되고 벡터의 도입 및 발현이 후손의 성장을 개선시키거나 증진시키는 조건하에, 프로모터, 뉴클레오타이드 서열 및 3' 비해독 영역을 포함하는 벡터의 유효량을 암컷 동물의 세포내로 암컷 후손의 잉태이전 또는 동안에 도입하는 단계를 포함하여, 암컷 동물로부터 후손의 성장을 개선시키거나 증진시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 암컷 동물의 세포가 이배체 세포를 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 암컷 동물의 세포가 근육 세포를 포함하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 핵산 서열이 성장 호르몬 분비 호르몬 또는 이의 유사체를 암호화하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 성장 호르몬 분비 호르몬이 서열 1, 서열 8 또는 이의 각각의 유사체인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 프로모터가 합성 근성 프로모터를 포함하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 3' 비해독 영역이 hGH 3' 비해독 영역을 포함하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 벡터가 바이러스 벡터를 통해 담체와 배합되어 전기천공에 의해, 비경구 경로에 의해 또는 이들의 조합에 의해 암컷 동물의 세포로 도입되는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 암컷 동물이 사람, 애완 동물, 농장 동물, 식용 동물 또는 작업 동물인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 암컷 동물이 사람, 돼지, 소, 양, 염소 또는 닭인 방법.
  11. 플라스미드, 바이러스 벡터, 리포좀, 양이온성 지질 또는 이들의 조합인 제1항에 따른 벡터.
  12. 제1항에 있어서, 벡터가 1회 투여로 암컷내로 도입되는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 도입이 후손의 출산전 1/3 기간 동안에 이루어지는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 암컷에 성장 호르몬 분비촉진제 수용체에 대한 리간드를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 리간드 투여가 경구 투여인 방법.
  16. 뉴클레오타이드 서열이 발현되고 벡터의 도입 및 발현이 후손의 성장 호르몬 수준을 증가시키는 조건하에, 프로모터, 뉴클레오타이드 서열 및 3' 비해독 영역을포함하는 벡터의 유효량을 암컷 동물의 세포내로 암컷 후손의 잉태이전 또는 동안에 도입하는 단계를 포함하여, 암컷 동물로부터 후손의 성장 호르몬 수준을 증가시키는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 암컷 동물의 세포가 이배체 세포를 포함하는 방법.
  18. 제16항에 있어서, 암컷 동물의 세포가 근육 세포를 포함하는 방법.
  19. 제16항에 있어서, 핵산 서열이 성장 호르몬 분비 호르몬 또는 이의 유사체를 암호화하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 성장 호르몬 분비 호르몬이 서열 1, 서열 8 또는 이의 각각의 유사체인 방법.
  21. 제16항에 있어서, 프로모터가 합성 근성 프로모터를 포함하는 방법.
  22. 제16항에 있어서, 3' 비해독 영역이 hGH 3' 비해독 영역을 포함하는 방법.
  23. 제16항에 있어서, 벡터가 바이러스 벡터를 통해 담체와 배합되어 전기천공에 의해, 비경구 경로에 의해 또는 이들의 조합에 의해 암컷 동물의 세포로 도입되는 방법.
  24. 제16항에 있어서, 암컷 동물이 사람, 애완 동물, 농장 동물, 식용 동물 또는 작업 동물인 방법.
  25. 제16항에 있어서, 암컷 동물이 사람, 돼지, 소, 양, 염소 또는 닭인 방법.
  26. 플라스미드, 바이러스 벡터, 리포좀, 양이온성 지질 또는 이들의 조합인 제16항에 따른 벡터.
  27. 제16항에 있어서, 벡터가 1회 투여로 암컷내로 도입되는 방법.
  28. 제16항에 있어서, 도입이 후손의 출산전 1/3 기간 동안에 이루어지는 방법.
  29. 제16항에 있어서, 암컷에 성장 호르몬 분비촉진제 수용체에 대한 리간드를투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 리간드 투여가 경구 투여인 방법.
  31. 뉴클레오타이드 서열이 발현되고 벡터의 도입 및 발현이 후손의 제지방량을 증가시키는 조건하에, 프로모터, 뉴클레오타이드 서열 및 3' 비해독 영역을 포함하는 벡터의 유효량을 암컷 동물의 세포내로 암컷 후손의 잉태이전 또는 동안에 도입하는 단계를 포함하여, 암컷 동물로부터 후손의 제지방량을 증가시키는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 암컷 동물의 세포가 이배체 세포를 포함하는 방법.
  33. 제31항에 있어서, 암컷 동물의 세포가 근육 세포를 포함하는 방법.
  34. 제31항에 있어서, 핵산 서열이 성장 호르몬 분비 호르몬 또는 이의 유사체를 암호화하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 성장 호르몬 분비 호르몬이 서열 1, 서열 8 또는 이의 각각의 유사체인 방법.
  36. 제31항에 있어서, 프로모터가 합성 근성 프로모터를 포함하는 방법.
  37. 제31항에 있어서, 3' 비해독 영역이 hGH 3' 비해독 영역을 포함하는 방법.
  38. 제31항에 있어서, 벡터가 바이러스 벡터를 통해 담체와 배합되어 전기천공에 의해, 비경구 경로에 의해 또는 이들의 조합에 의해 암컷 동물의 세포로 도입되는 방법.
  39. 제31항에 있어서, 암컷 동물이 사람, 애완 동물, 농장 동물, 식용 동물 또는 작업 동물인 방법.
  40. 제31항에 있어서, 암컷 동물이 사람, 돼지, 소, 양, 염소 또는 닭인 방법.
  41. 플라스미드, 바이러스 벡터, 리포좀, 양이온성 지질 또는 이들의 조합인 제31항에 따른 벡터.
  42. 제31항에 있어서, 벡터가 1회 투여로 암컷내로 도입되는 방법.
  43. 제31항에 있어서, 도입이 후손의 출산전 1/3 기간 동안에 이루어지는 방법.
  44. 제31항에 있어서, 암컷에 성장 호르몬 분비촉진제 수용체에 대한 리간드를투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 리간드 투여가 경구 투여인 방법.
  46. 뉴클레오타이드 서열이 발현되고 벡터의 도입 및 발현이 후손의 IGF-I 수준을 증가시키는 조건하에, 프로모터, 뉴클레오타이드 서열 및 3' 비해독 영역을 포함하는 벡터의 유효량을 암컷 동물의 세포내로 암컷 후손의 잉태이전 또는 동안에 도입하는 단계를 포함하여, 암컷 동물로부터 후손의 IGF-I 수준을 증가시키는 방법.
  47. 제46항에 있어서, 암컷 동물의 세포가 이배체 세포를 포함하는 방법.
  48. 제46항에 있어서, 암컷 동물의 세포가 근육 세포를 포함하는 방법.
  49. 제46항에 있어서, 핵산 서열이 성장 호르몬 분비 호르몬 또는 이의 유사체를 암호화하는 방법.
  50. 제49항에 있어서, 성장 호르몬 분비 호르몬이 서열 1, 서열 8 또는 이의 각각의 유사체인 방법.
  51. 제46항에 있어서, 프로모터가 합성 근성 프로모터를 포함하는 방법.
  52. 제46항에 있어서, 3' 비해독 영역이 hGH 3' 비해독 영역을 포함하는 방법.
  53. 제46항에 있어서, 벡터가 바이러스 벡터를 통해 담체와 배합되어 전기천공에 의해, 비경구 경로에 의해 또는 이들의 조합에 의해 암컷 동물의 세포로 도입되는 방법.
  54. 제46항에 있어서, 암컷 동물이 사람, 애완 동물, 농장 동물, 식용 동물 또는 작업 동물인 방법.
  55. 제46항에 있어서, 암컷 동물이 사람, 돼지, 소, 양, 염소 또는 닭인 방법.
  56. 플라스미드, 바이러스 벡터, 리포좀, 양이온성 지질 또는 이들의 조합인 제46항에 따른 벡터.
  57. 제46항에 있어서, 벡터가 1회 투여로 암컷내로 도입되는 방법.
  58. 제46항에 있어서, 도입이 후손의 출산전 1/3 기간 동안에 이루어지는 방법.
  59. 제46항에 있어서, 암컷에 성장 호르몬 분비촉진제 수용체에 대한 리간드를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  60. 제59항에 있어서, 리간드 투여가 경구 투여인 방법.
  61. 뉴클레오타이드 서열이 발현되고 벡터의 도입 및 발현이 후손의 사료 효율을 증가시키는 조건하에, 프로모터, 뉴클레오타이드 서열 및 3' 비해독 영역을 포함하는 벡터의 유효량을 암컷 동물의 세포내로 암컷 후손의 잉태이전 또는 동안에 도입하는 단계를 포함하여, 암컷 동물로부터 후손의 사료 효율을 증가시키는 방법.
  62. 제61항에 있어서, 암컷 동물의 세포가 이배체 세포를 포함하는 방법.
  63. 제61항에 있어서, 암컷 동물의 세포가 근육 세포를 포함하는 방법.
  64. 제61항에 있어서, 핵산 서열이 성장 호르몬 분비 호르몬 또는 이의 유사체를 암호화하는 방법.
  65. 제64항에 있어서, 성장 호르몬 분비 호르몬이 서열 1, 서열 8 또는 이의 각각의 유사체인 방법.
  66. 제61항에 있어서, 프로모터가 합성 근성 프로모터를 포함하는 방법.
  67. 제61항에 있어서, 3' 비해독 영역이 hGH 3' 비해독 영역을 포함하는 방법.
  68. 제61항에 있어서, 벡터가 바이러스 벡터를 통해 담체와 배합되어 전기천공에 의해, 비경구 경로에 의해 또는 이들의 조합에 의해 암컷 동물의 세포로 도입되는 방법.
  69. 제61항에 있어서, 암컷 동물이 사람, 애완 동물, 농장 동물, 식용 동물 또는 작업 동물인 방법.
  70. 제61항에 있어서, 암컷 동물이 사람, 돼지, 소, 양, 염소 또는 닭인 방법.
  71. 플라스미드, 바이러스 벡터, 리포좀, 양이온성 지질 또는 이들의 조합인 제61항에 따른 벡터.
  72. 제61항에 있어서, 벡터가 1회 투여로 암컷내로 도입되는 방법.
  73. 제61항에 있어서, 도입이 후손의 출산전 1/3 기간 동안에 이루어지는 방법.
  74. 제61항에 있어서, 암컷에 성장 호르몬 분비촉진제 수용체에 대한 리간드를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  75. 제74항에 있어서, 리간드 투여가 경구 투여인 방법.
  76. 뉴클레오타이드 서열이 발현되고 벡터의 도입 및 발현이 후손의 성장 속도를 증가시키는 조건하에, 프로모터, 뉴클레오타이드 서열 및 3' 비해독 영역을 포함하는 벡터의 유효량을 암컷 동물의 세포내로 암컷 후손의 잉태이전 또는 동안에 도입하는 단계를 포함하여, 암컷 동물로부터 후손의 성장 속도를 증가시키는 방법.
  77. 제76항에 있어서, 암컷 동물의 세포가 이배체 세포를 포함하는 방법.
  78. 제76항에 있어서, 암컷 동물의 세포가 근육 세포를 포함하는 방법.
  79. 제76항에 있어서, 핵산 서열이 성장 호르몬 분비 호르몬 또는 이의 유사체를 암호화하는 방법.
  80. 제79항에 있어서, 성장 호르몬 분비 호르몬이 서열 1, 서열 8 또는 이의 각각의 유사체인 방법.
  81. 제76항에 있어서, 프로모터가 합성 근성 프로모터를 포함하는 방법.
  82. 제76항에 있어서, 3' 비해독 영역이 hGH 3' 비해독 영역을 포함하는 방법.
  83. 제76항에 있어서, 벡터가 바이러스 벡터를 통해 담체와 배합되어 전기천공에 의해, 비경구 경로에 의해 또는 이들의 조합에 의해 암컷 동물의 세포로 도입되는 방법.
  84. 제76항에 있어서, 암컷 동물이 사람, 애완 동물, 농장 동물, 식용 동물 또는 작업 동물인 방법.
  85. 제76항에 있어서, 암컷 동물이 사람, 돼지, 소, 양, 염소 또는 닭인 방법.
  86. 플라스미드, 바이러스 벡터, 리포좀, 양이온성 지질 또는 이들의 조합인 제76항에 따른 벡터.
  87. 제76항에 있어서, 벡터가 1회 투여로 암컷내로 도입되는 방법.
  88. 제76항에 있어서, 도입이 후손의 출산전 1/3 기간 동안에 이루어지는 방법.
  89. 제76항에 있어서, 암컷에 성장 호르몬 분비촉진제 수용체에 대한 리간드를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  90. 제89항에 있어서, 리간드 투여가 경구 투여인 방법.
  91. 뉴클레오타이드 서열이 발현되고 벡터의 도입 및 발현이 후손의 뇌하수체에서의 성장호르몬분비세포 대 다른 호르몬-생성 세포의 비율을 증가시키는 조건하에, 프로모터, 뉴클레오타이드 서열 및 3' 비해독 영역을 포함하는 벡터의 유효량을 암컷 동물의 세포내로 암컷 후손의 잉태이전 또는 동안에 도입하는 단계를 포함하여, 암컷 동물로부터 후손의 뇌하수체에서의 성장호르몬분비세포 대 다른 호르몬-생성 세포의 비율을 증가시키는 방법.
  92. 제91항에 있어서, 암컷 동물의 세포가 이배체 세포를 포함하는 방법.
  93. 제91항에 있어서, 암컷 동물의 세포가 근육 세포를 포함하는 방법.
  94. 제91항에 있어서, 핵산 서열이 성장 호르몬 분비 호르몬 또는 이의 유사체를 암호화하는 방법.
  95. 제94항에 있어서, 성장 호르몬 분비 호르몬이 서열 1, 서열 8 또는 이의 각각의 유사체인 방법.
  96. 제91항에 있어서, 프로모터가 합성 근성 프로모터를 포함하는 방법.
  97. 제91항에 있어서, 3' 비해독 영역이 hGH 3' 비해독 영역을 포함하는 방법.
  98. 제91항에 있어서, 벡터가 바이러스 벡터를 통해 담체와 배합되어 전기천공에 의해, 비경구 경로에 의해 또는 이들의 조합에 의해 암컷 동물의 세포로 도입되는 방법.
  99. 제91항에 있어서, 암컷 동물이 사람, 애완 동물, 농장 동물, 식용 동물 또는 작업 동물인 방법.
  100. 제91항에 있어서, 암컷 동물이 사람, 돼지, 소, 양, 염소 또는 닭인 방법.
  101. 플라스미드, 바이러스 벡터, 리포좀, 양이온성 지질 또는 이들의 조합인 제91항에 따른 벡터.
  102. 제91항에 있어서, 벡터가 1회 투여로 암컷내로 도입되는 방법.
  103. 제91항에 있어서, 도입이 후손의 출산전 1/3 기간 동안에 이루어지는 방법.
  104. 제91항에 있어서, 암컷에 성장 호르몬 분비촉진제 수용체에 대한 리간드를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  105. 제104항에 있어서, 리간드 투여가 경구 투여인 방법.
  106. 제91항에 있어서, 호르몬-생성 세포가 부신피질자극호르몬 분비세포, 프로락틴 분비세포 및 성선 자극 호르몬 분비세포로 이루어진 그룹중에서 선택되는 방법.
  107. 뉴클레오타이드 서열이 발현되고 벡터의 도입 및 발현이 후손의 출생을 지연시키는 조건하에, 프로모터, 뉴클레오타이드 서열 및 3' 비해독 영역을 포함하는 벡터의 유효량을 암컷 동물의 세포내로 암컷 후손의 잉태이전 또는 동안에 도입하는 단계를 포함하여, 암컷 동물로부터 후손의 출산을 지연시키는 방법.
  108. 제107항에 있어서, 암컷 동물의 세포가 이배체 세포를 포함하는 방법.
  109. 제107항에 있어서, 암컷 동물의 세포가 근육 세포를 포함하는 방법.
  110. 제107항에 있어서, 핵산 서열이 성장 호르몬 분비 호르몬 또는 이의 유사체를 암호화하는 방법.
  111. 제110항에 있어서, 성장 호르몬 분비 호르몬이 서열 1, 서열 8 또는 이의 각각의 유사체인 방법.
  112. 제107항에 있어서, 프로모터가 합성 근성 프로모터를 포함하는 방법.
  113. 제107항에 있어서, 3' 비해독 영역이 hGH 3' 비해독 영역을 포함하는 방법.
  114. 제107항에 있어서, 벡터가 바이러스 벡터를 통해 담체와 배합되어 전기천공에 의해, 비경구 경로에 의해 또는 이들의 조합에 의해 암컷 동물의 세포로 도입되는 방법.
  115. 제107항에 있어서, 암컷 동물이 사람, 애완 동물, 농장 동물, 식용 동물 또는 작업 동물인 방법.
  116. 제107항에 있어서, 암컷 동물이 사람, 돼지, 소, 양, 염소 또는 닭인 방법.
  117. 플라스미드, 바이러스 벡터, 리포좀, 양이온성 지질 또는 이들의 조합인 제107항에 따른 벡터.
  118. 제107항에 있어서, 벡터가 1회 투여로 암컷내로 도입되는 방법.
  119. 제107항에 있어서, 도입이 후손의 출산전 1/3 기간 동안에 이루어지는 방법.
  120. 제107항에 있어서, 암컷에 성장 호르몬 분비촉진제 수용체에 대한 리간드를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  121. 제120항에 있어서, 리간드 투여가 경구 투여인 방법.
  122. 뉴클레오타이드 서열이 발현되고 벡터의 도입 및 발현이 동물의 젖 생성을 증가시키는 조건하에, 프로모터, 뉴클레오타이드 서열 및 3' 비해독 영역을 포함하는 벡터의 유효량을 동물의 세포내로 도입하는 단계를 포함하여, 동물로부터 젖 생성을 증가시키는 방법.
  123. 제122항에 있어서, 암컷 동물의 세포가 이배체 세포를 포함하는 방법.
  124. 제122항에 있어서, 암컷 동물의 세포가 근육 세포를 포함하는 방법.
  125. 제122항에 있어서, 핵산 서열이 성장 호르몬 분비 호르몬 또는 이의 유사체를 암호화하는 방법.
  126. 제125항에 있어서, 성장 호르몬 분비 호르몬이 서열 1, 서열 8 또는 이의 각각의 유사체인 방법.
  127. 제122항에 있어서, 프로모터가 합성 근성 프로모터를 포함하는 방법.
  128. 제122항에 있어서, 3' 비해독 영역이 hGH 3' 비해독 영역을 포함하는 방법.
  129. 제122항에 있어서, 벡터가 바이러스 벡터를 통해 담체와 배합되어 전기천공에 의해, 비경구 경로에 의해 또는 이들의 조합에 의해 암컷 동물의 세포로 도입되는 방법.
  130. 제122항에 있어서, 암컷 동물이 사람, 애완 동물, 농장 동물, 식용 동물 또는 작업 동물인 방법.
  131. 제122항에 있어서, 암컷 동물이 사람, 돼지, 소, 양, 염소 또는 닭인 방법.
  132. 플라스미드, 바이러스 벡터, 리포좀, 양이온성 지질 또는 이들의 조합인 제122항에 따른 벡터.
  133. 제122항에 있어서, 벡터가 1회 투여로 암컷내로 도입되는 방법.
  134. 제122항에 있어서, 도입이 후손의 출산전 1/3 기간 동안에 이루어지는 방법.
  135. 제122항에 있어서, 암컷에 성장 호르몬 분비촉진제 수용체에 대한 리간드를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  136. 제135항에 있어서, 리간드 투여가 경구 투여인 방법.
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