JP2002508922A

JP2002508922A - 新規サイトカインレセプター

Info

Publication number: JP2002508922A
Application number: JP2000517076A
Authority: JP
Inventors: エルソン、グレグ; − フランソワゴーシャット、ジャン; −ビルボワ、マリーコスコ
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Current assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 1997-10-16
Filing date: 1998-10-14
Publication date: 2002-03-26
Also published as: GB9721961D0; WO1999020755A3; AU1334799A; EP1027438A2; WO1999020755A2

Abstract

(57)【要約】新規１型サイトカインレセプターであると考えられる新規ポリペプチドが、マウスおよびヒトの両方において同定され、且つその相当するｃDNA配列が得られた。ヒトとネズミのポリペプチドの間でのアミノ酸の保存程度は高く、これはこのレセプターが機能的に重要であることを示す。本発明の範囲におけるポリペプチドは、癌、肥満および免疫または発生障害の治療において有用である。また、それらは、スクリーニングにおいても有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、特に、サイトカインレセプターと考えられる新規分子とその使用に
関する。

【０００２】

【従来の技術】

サイトカインおよび成長因子は、増殖、分化および生存、並びに組織発生等の
重要な細胞機能を制御するために分泌される分子である。これらのシグナリング
分子は、標的細胞表面に位置する特異的なレセプターを介してそれらの効果を発
揮する。これらのレセプターは、構造およびアミノ酸配列の類似性に従ってファ
ミリーに分類される。サイトカインレセプターのスーパーファミリーは、インタ
ーフェロン、ＴＮＦおよび造血性成長因子(haematopoietic growth factors)を含む多くの成長因子ファミリーのためのレセプターを含む。このファミリーにお
ける最も大きなサブクラスは、Ｉ型サイトカインレセプターのサブクラスであり
、２つのフィブロネクチンIII型折り畳み(folds)を含む、約２００アミノ酸の保
存された細胞外領域の存在により特徴づけられるグループである。この領域は、
ヘマトポイエチンレセプター分子として知られ、レセプター／リガンド結合およ
びレセプター／レセプター二量化における極めて重要な役割を担っていることが
示されている。第一のドメインにおける４つの保存されたシステイン残基と第二
ドメインにおけるW-S-x-W-sモチーフにより特徴づけられる。

【０００３】このサブクラスにおけるレセプター鎖は、典型的に、リガンド結合とシグナリ
ングサブユニット（後者は典型的に幾つかのレセプター複合体の一員である）の
両方を含むマルチコンポーネント複合体の部分を形成する。これらの特徴は、多
くは、サイトカインの中の多面発現(pleitropy)と重複性が占める。そのような例の１つは、サイトカイン(IL-6、毛様体神経栄養性因子(ciliary neutrotrophi
c factor ;CNTF)、白血病阻害因子(leukemia inhibitory factor;LIF)、オンコスタチンM(OSM)、およびカルジオトロフィン-1(cardiotrophin-1;CT-1))に関連したインターロイキン−６(IL-6)のあるメンバーの中にあり、これらのサイトカ
インの間で重なる機能は、ｇｐ１３０（夫々のレセプター複合体に存在するシグ
ナル変換分子）の存在により説明できる。加えて、該レセプター複合体(例えば、IL-6Rα、CNTF-RおよびIL-11Rα等)におけるリガンド結合鎖が、一般的に、短
いか、または細胞質内領域にさえ存在しない程であるのに対して、ｇｐ１３０は
より長い細胞質内のテールを有しており、これはJAK-STAT経路の活性化に関与す
る。実際、これらのレセプターのサブユニットの可溶性形態は必要なシグナル変
換鎖が細胞表面に発現されたときに、細胞に適切なサイトカインに対する感受性
を与える。従って、これらのサイトカインレセプターの特異的なサイトカイン結
合鎖は、膜固定性または可溶性タンパクの何れかとして機能し得る。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】

本発明は、どちらも新規１型サイトカインレセプターであると考えられる従来
知られていなかったマウスの分子および従来知られていなかったヒトの分子の同
定および特徴付けに基づく。

【０００５】

【課題を解決するための手段】

本発明に従うと、以下のようなポリペプチドが提供される：ａ）ｈＧＢＲＩ−ＩＬＲのための図１に示されるアミノ酸３８から４２２まで
のアミノ酸配列を有する、またはｍＧＢＲＩ−ＩＬＲのための図１に示されるア
ミノ酸配列を有するポリペプチド；ｂ）上記ａ）で限定されるポリペプチドに関して１以上のアミノ酸の欠失、挿
入または置換を有し、しかしながら少なくともその４０％のアミノ酸配列の同一
性を有するポリペプチド；ｃ）少なくとも１０アミノ酸長である上記ａ）またはｂ）に限定されるポリペ
プチドの断片であるポリペプチド。

【０００６】

【発明の実施の形態】

ここで使用される「ポリペプチド」の語は、広義で、ある分子がペプチド結合
により互いに結合した複数のアミノ酸を含有することを示す。従って、その範囲
には、文献において、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパクと称されることも
ある物質を含む。

【０００７】本発明のポリペプチドは、リガンド／レセプターおよびレセプター／レセプタ
ー複合体形成において重要であると考えられているため、好ましくはヘマトポエ
チンドメインを組み込む。

【０００８】本発明の種々の側面が、その十分な範囲を評価され得るために検討されるだろ
う。

【０００９】本発明のポリペプチドは、当業者に公知の技術により製造される。例えば、そ
のようなポリペプチドをコードする核酸配列を提供するために、遺伝子クローニ
ング技術が使用される。（遺伝子クローニング技術は、本発明の核酸分子に関す
る後述する詳細で更に考察される。）或いは、本発明のポリペプチドを製造する
ために、化学合成技術が使用される。そのような技術は、一般的に、固体相合成
が利用可能である。製造されるべき特定の配列を有したポリペプチドを可能にす
る化学合成技術は、現在自動化されている。ポリペプチドを化学的に合成するこ
とが可能な装置は、例えば、アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystem
s)から入手することが可能である。所望により、短いポリペプチドを最初に合成
し、次に、それらを結合してより長いポリペプチドを製造することが可能である
。

【００１０】本発明のポリペプチドは、実質的に純粋な形態で提供され得る。従って、主な
ポリペプチド成分が存在する組成物中に提供されてもよい。（例えば、５０％以
上、７５％以上、９０％以上のレベル、または９５％以上のレベルでさえ、存在
してもよく；前記レベルは、該組成物の総ポリペプチド含量に対する重量／重量
で測定される）。

【００１１】先に説明した通り、本発明のポリペプチドは、以下の何れかである：ａ）ｈＧＢＲＩ−ＩＬＲのための図１に示されるアミノ酸３８から４２２まで
のアミノ酸配列を有する、またはｍＧＢＲＩ−ＩＬＲのための図１に示されるア
ミノ酸配列を有するポリペプチド；ｂ）上記ａ）で限定されるポリペプチドに関して１以上のアミノ酸の欠失、挿
入または置換を有し、しかしながら少なくともその４０％のアミノ酸配列の同一
性を有するポリペプチド；または、ｃ）少なくとも１０アミノ酸長である上記ａ）またはｂ）に限定されるポリペ
プチドの断片であるポリペプチド。

【００１２】以下に、より十分に本発明を評価するために、それぞれ上記のａ）、ｂ）およ
びｃ）の範囲のポリペプチドを更により詳細に説明する。

【００１３】ａ）の範囲のポリペプチドａ）の範囲にあるポリペプチドは、ｈＧＢＲＩ−ＩＬＲのために図１に示した
アミノ酸３８から４２２のアミノ酸配列、またはｍＧＢＲＩ−ＩＬＲのための図
１に示したアミノ酸配列を含む。或は、更なるＮ−末端および／または更なるＣ
−末端アミノ酸配列を有していてもよい。

【００１４】更なるＮ−末端またはＣ−末端配列は、種々の理由のために提供される。その
ような更なる配列を提供する技術は当該分野で公知である。これらは、ポリペプ
チドまたはその一部分をコードする核酸分子を互いに結合し、次に、結合により
製造された核酸分子によりコードされるポリペプチドを発現することによる、遺
伝子クローニング技術の使用を含む。

【００１５】更なる配列は、特定のポリペプチドの特徴を変えるために提供されてもよい。
これは、発現の改善または特定の発現系における発現の調節に利用できる。例え
ば、更なる配列をタンパク分解性断片に対するある保護を提供してもよい。これ
は、ホルモンソマトスタチンのためには、β-ガラクトシダーゼ酵素の部分に対するそのＮ−末端での融解によりなされている(Itakwa ら、Science 198:105-63
(1977))。

【００１６】更なる配列は、また、ポリペプチドの性質の変更し、特定の位置に対する該ポ
リペプチドの方向付けを補助することにも利用される。例えば、シグナル配列は
、細胞における特定の位置に対して該ポリペプチドの輸送を方向づけるために、
または該細胞から該ポリペプチドを移出するために存在してもよい(例えば、ｈG
BRI-ILRのための図１に示したアミノ酸１から３７を使用し、シグナル配列を提供してもよく、または他のシグナル配列を存在させてもよい)。異なるシグナル配列は、異なる発現系のために使用されてもよい。

【００１７】疎水性配列が提供され、膜にポリペプチドを固定してもよい。従って本発明は
、その範囲中に、可溶性および膜結合性ポリペプチドの両方を含む。(後に考察する通り、そのような形態をコードするのに適当な大きなmRNA転写物が本発明に
より同定されているので、図１で同定されるポリペプチドの天然に存在する膜結
合型が存在すると考えられる)。膜結合型ポリペプチドは、所望に応じてハイブリッド型であってもよい。従って、それらは、異種膜貫通および／または細胞質
ドメインを有してもよい。例えば、そのようなドメインは、ヒトIL-13レセプターα鎖に由来してもよい。膜結合ポリペプチドを発現するトランスフェクション
した哺乳類細胞を、(例えば、抗体または該レセプターに結合する他の分子等のためも)リガンドスクリーニングおよび結合実験に使用することが可能である。

【００１８】更なる配列の手段のもう１つの例は、ポリペプチドが、精製／同定を補助する
成分、例えば、アフィニティクロマトグラフィにより単離されることが可能な成
分等に結合するポリペプチドである。その成分はエピトープであってよく、且つ
アフィニティカラムは、前記エピトープ(好ましくは高い程度の特異性を有する)
に結合する固定化された抗体、または固定化された抗体断片を含んでよい。次に
、該ポリペプチドは適切な緩衝液の添加により該カラムより溶離され、該エピト
ープから切断される。His₆、Glu₂、１７９タグが精製／同定における使用に好ま
しい。従って、１以上のそのようなタグを有するポリペプチドは、本発明の範囲
内にある。

【００１９】ポリペプチドは、抗体またはその一部分に結合してもよい。例えば、F_c部分に
結合してよい。これは、インビトロおよびインビボの両方で使用され得る良好な
安定性を分子に生じる。それは、その特定のエピトープに結合する抗体の一部分
に結合してもよく、そのエピトープを標的とすることは望ましい。

【００２０】ｍGBRI-ILRのための図１に示すアミノ酸配列の場合、更なるアミノ酸は、ｈGB
RI-ILRのために図１に示される４２２長のアミノ酸ポリペプチドの長さにより近
いアミノ酸配列を生じるように提供されてもよい。例えば、ｍGBRI-ILRポリペプ
チドのために図１に示されるアミノ酸配列に対してN-末端に隣接して更なる２つ
のアミン酸が提供されてもよい。(ｈGBRI-ILRの場合と同様、これらはAおよびH である)。シグナル配列も、また／或は提供されてもよい。

【００２１】追加のN-末端またはC-末端は、使用された特定の技術の結果の通りに本発明の
ポリペプチドを得るために単に存在するだけで、何れの特定の有利な特徴を提供
する必要がなくてもよいことに留意されたい。

【００２２】ｂ）の範囲のポリペプチド次に、上記のｂ）において限定したポリペプチドに従うと、上記のａ）に挙げ
られるポリペプチドの変異体が存在することを当業者は認めるであろう。

【００２３】当業者は、種々の変化が、前記性質を依然として有する変異体（しばしば「改
変タンパク(muteins)」として知られる）を製造する所望の性質を有するポリペプチドのアミノ酸配列を作り得ることも高く評価するであろう。前記ａ）に記載
の該ポリペプチドのそのような変異体は本発明の範囲に含まれ、以下のセクショ
ン(ｉ)から(iii)でより詳細に考察する。それらは対立および非対立変異体を含む。

【００２４】（ｉ）置換本発明の変異体の例は、１以上の他のアミノ酸により１以上のアミノ酸を置換
したことを除いては、上記ａ）に記載される通りのポリペプチドである。

【００２５】当業者は、変異体アミノ酸が同じ特徴を有することに気付くであろう。ポリペ
プチドの1以上のそのようなアミノ酸は、そのポリペプチドの所望する性質を消去することなしに、1以上の他のアミノ酸によって、しばしば置換され得る。

【００２６】例えば、該アミノ酸グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシ
ンは、しばしば、もう1つのアミノ酸（脂肪酸側鎖を有するアミノ酸）で置換され得る。このような可能な置換は、グリシンおよびアラニンを使用して、もう1 つのアミノ酸と置換されること（それらは比較的短い側鎖を有しているため）、
およびバリン、ロイシンおよびイソロイシンを使用してもう1つのアミノ酸と置換すること（それらは疎水性のより長い脂肪族の側鎖を有しているため）が好ま
しい。

【００２７】しばしば、もう１つアミノ酸を置換できる他のアミノ酸は、以下を含む：フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン（芳香族の側鎖を有するアミ
ノ酸）；リジン、アルギニンおよびヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）
；アスパルテートおよびグルタメート（酸性側鎖を有するアミノ酸）；アスパラ
ギンおよびグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；およびシステインおよ
びメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）。

【００２８】この性質の置換は、しばしは「保守的な」または「半保守的な」アミノ酸置換
と称される。

【００２９】（ii)欠失アミノ酸欠失は、所望する性質を依然として維持したままで、ポリペプチドの
全体の長さおよび分子量を減少できるので都合がよい。これは、特定の目的のた
めに、所望されるポリペプチド量を減少することを可能にする。例えば、仮に、
該ポリペプチドが薬剤中で使用される場合、投与量レベルを減少することが可能
である。

【００３０】 (iii)挿入上記ａ）で限定されたポリペプチドに関してアミノ酸を挿入することも可能で
ある。これは、該ポリペプチドの性質を変更するため、例えば、融合タンパクに
関して上記で説明した通り、同定、精製または発現を補助するために）になされ
る。

【００３１】上記のａ）に限定されるポリペプチドの配列に関してアミノ酸鎖を組み込まれ
るポリペプチド（置換、欠失または挿入の何れかによる）は、何れの適切な技術
を使用して提供される。例えば所望する配列鎖を組み込む核酸配列が、部位方向
性の突然変異生成により提供されてもよい。次に、これは、そのアミノ酸配列に
おける対応する鎖を有するポリペプチドの発現を可能にするために使用される。

【００３２】アミノ酸鎖がどのように作られたとしても、本発明の好ましいポリペプチドは
、ｈＧＢＲＩ−ＩＬＲのために図１に示されるアミノ酸３８から４２２までのア
ミノ酸配列と、またはｍＧＢＲＩ−ＩＬＲのための図１に示されるアミノ酸配列
と、少なくとも４０％のアミノ酸配列の同一性を有する。更に好ましくは、該配
列の同一性の程度は、少なくとも５０％または少なくとも７５％である。少なく
とも９０％、または少なくとも９５％の同一性がもっとも好ましい。

【００３３】本発明の目的のために、(アミノ酸または核酸)配列同一性は「ベストフィット
(BESTFIT）」プログラム(Wisconsin Sequence Analysis Package Genetics Comp
uter Group version 8.0)を使用することにより決定することが可能である。

【００３４】配列同一性の程度が高い場合、それらは、アミノ酸配列における相違は比較的
に少ない。従って、例えば、２０未満、10未満、または少なく５未満の相違であ
ってもよい。

【００３５】ｃ）の範囲のポリペプチド上述した通り、ポリペプチドの長さの減少は多くの場合都合がいい。従って、
本発明の特徴ｃ）は少なくとも１０アミノ酸長である上記のａ）またはｂ）のポ
リペプチドの断片を含んでよい。所望に応じて、これらの断片は、少なくとも２
０、少なくとも５０、または少なくとも１００アミノ酸長である。断片は、例え
ば、特定の抗原に対する抗体の産生において有用である。また、それらは、完全
長ポリペプチドの機能的に重要なドメインを研究することにおいても有用である
。従って、例えば、ヘマトポイエチンレセプターモジュールの全部または一部分
を含む断片が提供されてもよい。

【００３６】［ポリペプチドの使用］Ａ）医学的な使用本発明のポリペプチドは、医薬品において使用することも可能である。好まし
い治療は、ヒトの治療であるが、家畜の治療も除外されるわけではない。その治
療は、予防的にも可能であり、また、存在する病状に対して使用することも可能
である。

【００３７】本発明の種々のポリペプチドは、アゴニストまたはアンタゴニストとして使用
されてよい。アゴニストは、天然に存在するレセプターの生物学的機能をアップ
レギュレートするものであり、一方アンタゴニストは、その様な機能をダウンレ
ギュレートするものである。問題のポリペプチドが、特定の生物学的機能のアゴ
ニストまたはアンタゴニストとして作用しているかどうかは、適切なアッセイ方
法を使用して当業者が決定することが可能である。

【００３８】アンタゴニストは、サイトカインの過剰発現、また、通常よりも高いサイトカ
イン活性のレベルを有する成分の発現に関する疾患の治療において使用される。
ＩＬ６−Ｒとの相同性の点において、本発明のレセプターの機能の１以上のアン
タゴニストが、高レベルの細胞増殖に関する疾患の治療（例えば癌の治療）に有
用である。また、アンタゴニストは、免疫疾患、体重疾患および／または発達上
の疾患の治療において有用である。特に、それらは、肥満（図１に示されるポリ
ペプチドとレプチンレセプターとの相同性の点で）、炎症、敗血症ショック、Ａ
ＩＤＳおよび胎児発生障害の治療において有用である。

【００３９】アゴニストは、サイトカインの過少発現、また、通常よりも低いサイトカイン
活性のレベルを有する成分の発現に関する疾患の治療において使用される。それ
らは、低レベルの細胞増殖に関する疾患治療の有用である。また、アゴニストは
、また、免疫疾患、体重疾患および／または発達上の疾患の治療において有用で
ある。特にそれらは、肥満（図１に示されるポリペプチドとレプチンレセプター
との相同性の点で）、炎症、敗血症ショック、ＡＩＤＳおよび胎児発生障害の治
療において有用である。

【００４０】従って、アンタゴニストまたはアゴニストは、上述した治療のための医薬品の
製造においても有用である。

【００４１】該医薬品は、通常、薬学的に許容される担体を含み得る薬学的組成物の一部分
として供給される。この薬学的組成物は、一般的に密閉された容器内に滅菌され
た形態で提供される。一般的に密閉された容器内で、投与単位形態で提供されて
もよく、また、キットの一部として提供されてもよい。そのようなキットも本発
明の範囲内である。通常（しかしながら必須ではないが）は、使用のための説明
書を含む。多くの投与単位形態が提供される。

【００４２】本発明の範囲内の薬学的組成物は、以下の１以上を含むことが可能である：保
存剤、可溶化剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、甘味剤、着色剤、臭気剤、塩、緩
衝剤、被覆剤および抗酸化剤。また、それらは、本発明のポリペプチドに加えて
治療学的活性剤を含有してもよい。それらは、制御された放出形態、例えば、少
なくとも１週間、好ましくは少なくとも１ヶ月間に亘り、効果的であるように提
供されてもよい。

【００４３】本発明の範囲の薬学的組成物は、例えば、経口（口内若しくは舌下を含む）、
直腸、鼻用、局所（口内、舌下または経皮）、膣内、または非経口（皮下、筋肉
内、静脈内または皮内を含む）経路等、何れの適切な経路による投与にも適する
。そのような組成物は、薬学の分野で公知の何れの方法、例えば、１以上の活性
成分を適切な担体と無菌的条件下で混合すること等の方法により製造することも
可能である。

【００４４】投与用量活性剤の投与用量は、治療の性質、治療されるべき個体の年齢および病状等に
依存して、広い範囲で変更することが可能であり、最終的に、医師が使用される
べき適切な投与量を決定するであろう。投与は、適切な回数で反復されてもよい
。仮に副作用が生じた場合、臨床実施基準(GCP)に従って、投与量および／または投与回数を減らすことが可能である。

【００４５】Ｂ）診断的使用上述した医学的使用に加えて、本発明のポリペプチドは診断に使用することが
可能である。例えば、それらを１型サイトカインの存在または不在を診断するた
めの、またはそのようなサイトカインのレベルにおける異常を診断するための結
合実験に使用することが可能である。

【００４６】Ｃ）スクリーニングでの使用本発明のポリペプチドは、また、スクリーニングに使用することも可能である
。例えば、可溶性または膜結合性レセプター／その変異体を使用し、それに対す
る結合能力を有する薬剤をスクリーニングしてもよい。そのような薬剤は通常、
インビボで該レセプターに結合するサイトカインであってもよい。或は、それら
は、そのようなサイトカインのアゴニストまたはアンタゴニストであってもよく
、上述のＡ）の１以上の疾患の治療において利用してもよい。

【００４７】Ｄ）抗体の産生および選択における使用本発明の更なるもう１つの使用は抗体の産生および選択における使用である。
そのため、本発明は、本発明のポリペプチドに対して結合する抗体を含む。好ま
しい抗体は、本発明のポリペプチドに特異的に結合し、それによって、そのよう
なポリペプチドを精製するために使用することも可能である（例えば、それらは
、固相化され、本発明のポリペプチドに結合するために使用されてもよい。次に
、該ポリペプチドは適切な溶離液により適切な条件下で洗浄されることによって
溶離される。）。

【００４８】本発明の範囲にある抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗
体であってもよい。

【００４９】ポリクローナル抗体は、適切な動物ホスト（例えば、マウス、ラット、モルモ
ット、ウサギ、ヒツジ、ヤギまたはサル等）においてそれらの産生を刺激するこ
とにより、即ち、本発明のポリペプチドまたはそのようなポリペプチドを提供す
るのに使用できる核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ等）が該動物に対して注射された
場合に生じる。必要であれば、アジュバントを本発明の該ポリペプチドと共に投
与することも可能である。次に、該抗体を該ポリペプチドに結合する手段により
精製する。

【００５０】モノクローナル抗体は、ハイブリドーマから産生することが可能である。これ
らは、不死の細胞株を形成するために、骨髄腫細胞と、所望する抗体を産生する
脾臓細胞とを融合することにより形成することが可能である。従って、周知のコ
ーラーとミルステインの技術（Kohler & Milstein technique, Nature 256 52-5
5(1975)）またはこの技術の改変方法を使用することが可能である。

【００５１】特定のポリペプチドに結合するモノクローナルおよびポリクローナル抗体を製
造するための技術は、現在、当該分野において首尾よく開発されている。それら
は、標準的な免疫学の教本、例えば、ロイトらの「免疫学」(Roitt et al, Immu
nology 第２版(1989), Churchill Livingstone, London)において記述さている。

【００５２】全抗体に加えて、本発明は、本発明のポリペプチドに結合することが可能なそ
の誘導体を含む。従って、本発明は、抗体断片および合成構築物を含む。抗体断
片および合成構築物の例は、ドウガルら(Dougall et al, Tibtech 12 371-379,
9月, 1994)により提供されている。

【００５３】抗体断片は、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ‘）_２およびＦｖ断片を含む(これらは、例えば、前述したロイトの文献に記述される)。Ｆｖ断片は修飾され、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ)分子として公知の合成構築物を産生する。これは、該分子の安定性に寄与するＶ_ｈおよびＶ_ｌ領域に共有結合するペプチドリンカーを含む。使
用することが可能な他の合成構築物は、ＣＤＲペプチドを含む。これらは抗原結
合決定基を具備する合成ペプチドである。ペプチドミメティックも使用すること
が可能である。これらの分子は、通常、ＣＤＲループの構造を擬態し、且つ抗原
相互作用部位鎖を含む、構造上で制限された有機環である。

【００５４】合成構築物は、キメラ分子を含む。従って、例えば、ヒト化（霊長目化）抗体
またはその誘導体も本発明の範囲内にある。ヒト化した抗体の例は、ヒトフレー
ムワーク領域を有し、しかし、げっ歯類の高可変領域である抗体である。また、
合成構築物は、抗原結合に加えて、幾つかの所望する特性を有する分子を提供す
る更なる成分を具備する分子を含んでもよい。例えば、その成分は、標識（例え
ば、蛍光または放射活性標識）であってもよい。或は、それは薬学的に活性な作
用物質であってもよい。

【００５５】本発明の抗体またはその誘導体は、上述のポリペプチドの精製におけるそれら
の使用に加えて、広範に多様な使用を有する。

【００５６】それらを治療に使用することが可能である。例えば、それらは、好ましくない
リガンド／レセプターまたはレセプター／レセプター相互作用を阻害するために
使用してもよい。

【００５７】それらを診察において使用することが可能である。例えば、それらをＲＩＡま
たはＥＬＩＳＡに使用し、本発明の範囲にある１型ケモカインレセプターの存在
または不在を同定することも可能である。

【００５８】核酸分子およびその使用また、本発明は、その範囲に核酸分子も含む。

【００５９】そのような核酸分子は：ａ）本発明に従うポリペプチドをコードする；若しくはｂ）ａ）に限定された分子に相補的である；またはｃ）上記のａ）若しくはｂ）において限定された分子にハイブリダイズする核酸
分子である。

【００６０】これらの核酸分子およびそれらの使用を、更に以下で詳しく考察する：本発明のポリペプチドは、周知の遺伝的コードの変質(degeneracy)を考慮して
、広く多様な核酸分子によりコードされてよい。これらのコード核酸分子は、全
て、本発明の範囲である。それらは個体に対して投与されてもよく、本発明のポ
リペプチドを発現するために使用されてもよい。従って、それらは本発明のポリ
ペプチドと同様の治療に使用されてよい。該核酸分子は、直接に、例えば、それ
らを筋肉内に注射することによって（任意に、例えば、リポソーム等の脂質ベー
スの担体等に、先ず、組み込んだ後で）使用することも可能である。或は、それ
らをベクターに挿入して使用してもよい。治療において使用するためのベクター
は、複製欠損性アデノウイルス、レトロウイルスまたはアデノ随伴ウイルスを含
む。

【００６１】ベクターはクローニングに使用することも可能である。それらは、当業者に公
知の技術を使用して、ホスト細胞に導入されて本発明のポリペプチドの発現を可
能にしてもよい。或は、細胞を含まない発現系を使用することも可能である。適
切な発現系を使用することにより、該ポリペプチドを所望する形態で産生するこ
とが可能である。例えば、該ポリペプチドは、細菌または酵母等の微生物系によ
り、培養昆虫細胞（バキュロウイルスをインフェクションする）により、哺乳類
細胞（CHO細胞等）により、または、例えば、ミルク中にタンパクを分泌する等のトランスジェニック動物により産生することが可能である。グリコシレーショ
ンが所望される場合、真核細胞（所望する哺乳類）の発現系が好ましい。

【００６２】 N−末端のメチオニンを含むポリペプチドは、ある発現系を使用して産生することが可能であり、それに対して、その他、成熟したポリペプチドはこの残基を
欠くであろう。ポリペプチドは、最初は、シグナル配列を含んで発現される。異
なるシグナル配列は、異なる発現系で提供されるであろう。あるいは、シグナル
配列は不在であってもよい。

【００６３】ポリペプチドのクローニング、発現および精製の技術は当業者に周知である。
種々のそのような技術が標準的な教本に、例えば、サンブロックら（Sambrook e
t al, Molecular Cloning 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press
, 1989）；オールド＆プライムローズ(Old & Primrose, Principles of Gene Ma
nipulation 5th Edition, Blackwell Scientific Publications (1994)); ストリアー(Stryer, Biochemistry 4th Edition, W H Freeman and Company (1995))
により開示される。

【００６４】本発明のポリペプチドをコードする核酸分子に加えて（ここでは「コード」核
酸分子と称する）、また、本発明は、それに対して相補的な核酸分子鎖を含む。
従って、例えば、二重鎖核酸分子の両方の鎖が本発明の範囲である（それらはも
う一方と結合していても、または結合していなくてもよい）。また、ｍＲＮＡ分
子および相補的ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ分子）も含む。

【００６５】また、上述した該核酸分子の１以上に対してハイブリダイズできる核酸分子も
、本発明の範囲である。そのような核酸分子は、ここでは「ハイブリダズ」核酸
分子と称する。

【００６６】本発明のハイブリダイズ核酸分子は、その長さに沿って上記のａ）またはｂ）
の範囲の核酸分子との高い程度の配列同一性を有する（例えば、少なくとも５０
％、少なくとも７５％、または少なくとも９０％の配列同一性）。

【００６７】当業者により評価されるであろう通り、問題のシングル鎖核酸分子ともう1つの核酸分子との配列同一性の程度が高ければ高いほど、適切な条件下での他の核
酸分子の配列に対して相補的な核酸分子に対してハイブリダイズするであろう可
能性が高くなる。

【００６８】本発明の所望するハイブリダイズ分子は、長さが少なくとも１０ヌクレオチド
であり、好ましくは少なくとも２５または少なくとも５０ヌクレオチドの長さで
ある。

【００６９】好ましいハイブリダイズ分子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション
の条件でハイブリダイズする。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件の
１例は、試みるハイブリダイゼーションが、温度約３５℃から約６５℃で、約０
．９モーラーの塩溶液を使用して実施される条件である。しかしながら、当業者
は、プローブの長さ、塩基組成物、存在するイオンの種類等の変量を考慮するた
めに適切にそのようなパラメーターを変更することが出来るであろう。

【００７０】最も好ましくは、本発明のハイブリダイズ核酸分子は、図３または図５に示さ
れる配列を有するｃＤＮＡ分子に対して；その等価のＲＮＡに対して；または前
述の分子の何れかに対する相補配列に対してハイブリダイズする。

【００７１】ハイブリダイズ核酸分子は、例えば、プローブまたはプライマーとして使用す
ることが可能である。プローブは、核酸を精製および／または同定するために使
用することが可能である。それらは、診断において使用することが可能である。
例えば、プローブは、個体が、本発明のレセプターを有するか否かを決定するた
めに使用することが可能であり、それは、機能的レセプターをコードする完全な
遺伝子が存在するか否かを決定することによりなされる。プライマーは、例えば
、ＰＣＲ技術による核酸またはその一部分の増幅において有用である。

【００７２】プローブまたはプライマーとしての使用に加えて、本発明のハイブリダイズ核
酸分子は、アンチセンス分子として使用し、相補的核酸分子に結合することによ
り本発明のポリペプチドの発現を変更することが可能である（一般的に、これは
一般的に翻訳されるＲＮＡ分子に対して結合する核酸分子を提供し、それにより
、二重鎖が形成されるために翻訳が阻害されることにより達成される）。この技
術は、アンチセンス治療において使用される。アンチセンス分子は、ＤＮＡまた
はＲＮＡ分子の形成において可能である。

【００７３】しかしながら、本発明に使用するための核酸分子が古典的なＤＮＡまたはＲＮ
Ａ構造を有する分子のみではなく、修飾された（非ホスホジエステル）主鎖を有
する変異体も含むことに留意することも重要である。完全な主鎖を置換するため
の２つの成功した試み、即ち、モルホリノ誘導体およびペプチド核酸(ＰＮＡｓ)
[N-(2-アミノメチル)グリシン-ベースの擬ペプチド主鎖を含む]が報告されている(Nielsen, P. E., Annual Review of Biophysics & Biomolecular Structure,
24 167-83(1995)を参照されたい)。修飾した主鎖を有する核酸変異体は、非修飾核酸と比較して安定性を増加でき、特に長時間のハイブリダイゼーションが所
望される場合に（例えば、アンチセンス治療において）有用である。

【００７４】また、ハイブリダイズ分子は、リボザイムとして提供されることも可能である
。リボザイムは、使用されて、特定の標的配列を含むＲＮＡ分子に対して結合す
ること、および切断することにより発現を調節する。

【００７５】前述の考察から、多くの核酸が本発明の範囲であることが認められるであろう
。従って、本文脈が別な状態を示すのでなければ、本発明の核酸分子は以下の特
徴の１以上を有する：１）それらはＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい（天然に存在しない塩基およ
び／または天然に存在しない主鎖、例えばＰＮＡｓ等を含む）；２）それらは、一本鎖または二本鎖であってもよい；３）それらは、組み替え形態で提供されてもよく、即ち、異種の５’および／
または３’フランク配列を共有結合して天然には存在しないキメラ分子（例えば
、ベクター等）を提供してよい；４）それらは、通常天然に存在する５’および／または３’フランク配列を伴
わずに提供されてもよい；５）それらは、例えば、クローニングされた所望する標的配列を有する分子を
単離するためのプローブを使用して、または、キメラ合成技術を使用することに
より、実質的に純粋な形態で提供されてよい（従って、それらは、汚染タンパク
および／または他の核酸を実質的に含んでない形態で提供されてもよい）；６）それらは、イントロンと共に（例えば、完全長遺伝子として）またはイン
トロンを含まずに（例えば、ｃＤＮＡとして）提供されてもよい。

【００７６】以下に、添付図面を参照しながら例示することにより、本発明をさらに説明す
る。

【００７７】材料および方法ＧＢＲＩ−ＩＬＲのためのヒトおよびマウスｃＤＮＡのクローニングネズミＩＬ−１３Ｒからのアミノ酸配列ＮＫＬＣＦＤＤＮＫＬＷＳＤＷＳＥＡ
ＱＳＩＧＫＥＱＮを、ＴＢＬＡＳＴＩＮを使用した発現配列標識（expressed se
quence tags; ＥＳＴｓ）によるゲンバンク(Genbank)のデータベースの検索のた
めに使用し、関係するESTを同定した。このＥＳＴ配列でのゲンバンクデータベースのＢＬＡＳＴＮ検索は、オーバーラップするＥＳＴｓの同定を可能にする。
マウスｃＤＮＡクローン４７９０４３は、リサーチ・ジーンテック・Ｉｎｃ．(R
esearch Genetics Inc. ,Birmingham, AL)から入手した。５’−ＲＡＣＥを使用
して、製造業者のガイドラインに従ってマウス肺から抽出したポリＡ＋ＲＮＡ上
でのクロンテックからのマラソンｃＤＮＡ増幅キット(Palo Alto, CA)を使用して、該ｃＤＡＮクローンの５’末の上流のネズミのｃＤＮＡの更なる３１０ｂｐ
をクローニングした。（提供されたＡＰ−１プライマーと一緒に）ＰＣＲ増幅で
使用したプライマーは、5’-CGTACCACCTCAGCTTGTACTTG-3’であった。ＰＣＲ産物は、ベクターｐＣＲＩＩ（Invitrogen, Leek, The Netherlands）にクローニングし、コロニーは、オリゴヌクレオチドプローブ5’-AAGGATCTCACGTGCCGCTGGA
CACCGGGT-3’を使用したコロニーハイブリダイゼーションによりスクリーニング
した。

【００７８】ヒトＧＢＲＩ−ＩＬＲｃＤＮＡの部分は、プライマー5’-ACCGCCGAGGGCCTCTAC
TG-3’および5’-TTGAGGGAGTAGTTGGTGTGGAGG-3’を用いて、ヒト肺からのポリＡ
＋ＲＮＡに由来するｃＤＮＡを使用したＰＣＲにより増幅した。増幅産物をベク
ターｐＣＲＩＩにクローニングし、コロニーをオリゴヌクレオチドプローブ5’-
TGAGCTCTCCCGTGTACTCAACGCCTCCAC-3’を使用したコロニーハイブリダイゼーショ
ンにより関係するインサートをスクリーニングした。この増幅ＤＮＡ産物をプロ
ーブとして使用し、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーをλｇｔ１０でスクリーニン
グした。最も大きなｃＤＮＡ(1740bp)をpBluescriptII SK-で再クローニングした。

【００７９】ＤＮＡおよびタンパク配列解析配列は、両鎖自動シークエンシングによりｃＤＮＡクローンから得て、配列解
析ソフトウェアシーケンサー(Genecodes Corporation, Ann Arbor, MI)により全
ての関係するＥＳＴｓを用いて解析した。シグナルＰサーバー(htpp://www.cbs.
dtu.dk/signalp/cbssignalp.html)を使用し、ＧＢＲＩ−ＩＬＲのシグナルペプチドの予測された切断部位を同定した。ＤＮＡおよびアミノ酸配列アラインメン
ト、並びに疎水性領域の予測は、ウィスコンシンパッケージバージョン８．１(W
isconsin package version 8.1, Genetics Computer Group Inc., Madison, WI)
を用いて解析した。

【００８０】ＧＢＲＩ−ＩＬＲのためのヒトおよびマウスｍＲＮＡ転写物の検出ノーザンブロット分析により、ヒトＧＢＲＩ−ＩＬＲｍＲＮＡ転写物を検出す
るために、ヒト胎盤ライブラリー(上述を参照されたい)をスクリーニングするた
めに使用した３１０ｂｐｃＤＮＡと同じ物をプローブとして使用した。ヒトｇｐ
１３０ｍＲＮＡの検出には、部分的なｃＤＮＡをプライマー5’-CCGCGCAAGATGTT
GACGTT-3’および5’-CATTCGGACAGCTTGAACAG-3’と増幅し、プローブとして使用
した。ヒトＩＬ−６Ｒαを検出するために、部分的なｃＤＮＡをプライマー5’-
CTGACCAGTCTGCCAGGAGACA-3’および5’-GAGGACCCCACTCACAAACAAC-3’と増幅し、
プライマーとして使用した。ヒト、ヒトＩＩ、ヒト免疫システム、ヒト内分泌お
よびヒト胎児マルチプル組織ノーザンブロット(Clonetech)を使用し、ヒト組織における発現を検した。ヒト細胞および細胞系のために、即ち、ポリＡ＋ＲＮＡ
は、オリゴテックス・ダイレクト・ｍＲＮＡ・ミニ・キット(Qiagen, Basel, Sw
itzerland)を使用し、製作者ガイドラインに従って単離した。０．５μｇＲＮＡ
を、ホルムアルデヒドゲルに溶解し、ジーンスクリーン・メンブラン(Genescree
n membrane, NEN Research Prroducts, Boston, MA)に移行した。全ノーザンブロットを適切なプローブを用いてエクスプレスHyb溶液(Expressahyb solution,
Clonetech)においてハイブリダイゼーションした。

【００８１】ネズミのＧＢＲＩ−ＩＬＲ転写物を検出するために、ｃＤＮＡまたはｃＲＮＡ
プローブの何れかを使用した。ｃＤＮＡプローブは、プライマー5’-CTAGGCTCAG
CAAGATCTAGTGTCC-3’および5’-GCTCCAGATTCCCGCCTTTTTCGACC-3’を使用したＰＣＲ増幅産物である。ｃＲＮＡプローブを生じるために、生じたＰＣＲ産物とプ
ライマー5’-CTGGCCCTGGCTAACCTTAATGG-3’および5’-GCTCCAGATTCCCGCCTTTTTCG
ACC-3’をpBluescript II KS-(Stratagene)に、ＥｃｏＲＶ制限部位でクローニングした。該プラスミドは、制限酵素ＢｌｎＩで直線化し、ｃＲＮＡをＴ３プロ
モーターからのＴ３ＲＮＡポリメラーゼによる転写により^３２Ｐで標識した。該
マウスとマウス胎児マルチプル組織ノーザンブロット(Clonetech)を、エクスプレスHyb溶液(ExpressHyb solution)中でｃＤＮＡプローブとハイブリダイゼーシ
ョンした。他のノーザンブロット分析には、マウスをミョウバン沈殿物ＫＬＨ皮
下注射で免疫化し、組織を第０日または第１４日の何れかで移動した（骨髄は、
例外で、両方を合わせた）。総ＲＮＡはＴＲＩｚｏｌ領域(Life Technologies A
G, Basel, Switerland)を用いて単離し、ポリＡ＋ＲＮＡはオリゴテックスビーズ(Oligotex beads, Qiagen)を使用して単離した。ノーザンブロット分析は、ｃ
ＲＮＡプローブを使用して、１．５μｇポリＡ＋ＲＮＡにおいてガウチャットら
(Gauchat, J-F.et al, European Journal of Immunology, 1989, 19:1079)によって以前記載された通りに行った。ＲＴ−ＰＣＥによるネズミの転写物を検出す
るために、適切な起源からの総ＲＮＡの５μｇを、第１鎖ｃＤＮＡ合成キット(P
harmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden)を使用して、製造者のガイドラ
インに沿って逆転写した。ＰＣＲは、ネズミのＤＮＡプローブ（上述を参照）を
増幅するのに使用したのと同一のプライマーを使用して行った。ＰＣＲ産物はジ
ーンスクリーニングハイブリダイゼーションメンブラン(Genescreen hybridizat
ion membrane, NEN research products)に移動し、３２Ｐ標識化オリゴヌクレオ
チドプローブ5'-GCGGATCTGGTACTTGGTTTGAAAGAGGAA-3'とハイブリダイズした。

【００８２】レセプターのクローニングおよび分布ヒトＧＢＲＩ−ＩＬＲのクローニング発現配列タグ(ESTs)を伴うゲンバンクデータベースを、クエリーとしてマウス
ＩＬ−１３受容体α１のＷ−Ｓ−ｘ−Ｗ−Ｓモチーフを取り囲む２０アミノ酸配
列を有するTBLASTNを使用して探索した。次に、顕著な相同性を示すESTsを翻訳し、オープンリーディングフレーム使用し、相同したタンパクについてBLASRPを
使用しスイスプロットデータベース(Swissprot database)を探索した。ネズミか
らのEST W66776からの該アミノ酸配列は、ＩＬ−６型サイトカインレセプターフ
ァミリーの構成要素、およびプロラクチンレセプターに対して高い相同レベルを
示した。Ｗ６６７７６の配列を使用してのゲンバンクデータベースを探索するこ
とにより、(ネズミおよびヒトを起源とする)オーバーラップする相同配列を同定
することを可能にし、次に、ゲンバンクデータベースに対してより重なりのある
ESTsを同定した(表１)。これは、ヒトおよびマウスの予測される受容体配列をコ
ードする重なりのある核酸配列のアッセンブリを可能にする。

【００８３】ＧＢＲＩ−ＩＬＲをコードするヒトｃＤＮＡをクローニングするために、３１
０ｂｐＰＣＲ産物をヒトＥＳＴｓから設計されたプライマーを使用してヒト肺ｃ
ＤＮＡから増幅した。該ＰＣＲ産物は、次に、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーを
スクリーニングするためのプローブとして使用し、３’ポリＡテールを含む１７
４０ｂｐの完全長クーロンの単離を可能にした。該ヒトｃＤＮＡは、推定される
３７アミノ酸のシグナルペプチドを有する４２２アミノ酸の前駆体タンパクをコ
ードする。インビトロにおける翻訳により、推定シグナルペプチドの開始部位で
メチオニンをコードするＡＵＧコドンを実際に使用して翻訳が開始されることが
明らかになった(データには示さず)。

【００８４】マウスＧＢＲＩ−ＩＬＲのクローニング発現配列標識(expressed sequence tags; ESTs)を有するゲンバンクデータベースは、クエリーとしてマウスＩＬ−１３受容体α１のＷ−Ｓ−ｘ−Ｗ−Ｓモチ
ーフを取り囲む２０アミノ酸配列を有するＴＢＬＡＳＴＮを使用して探索された
。顕著な相同性を示すＥＳＴｓを、次に、翻訳し、そのオープンリーディングフ
レームを相同性タンパクのＢＬＡＳＴＰを使用するスイスプロットデータベース
を探索するために使用した。ネズミＥＳＴＷ６６７７６からのアミノ酸配列は、
ＩＬ−６型サイトカインレセプターファミリーの構成要素とプロラクチンレセプ
ターとに対して高い相同性を示した。ゲンバンクデータベースを探索するために
Ｗ６６７７６の配列を使用することは、(ネズミおよびヒトを起源とする)オーバ
ーラップする相同性配列（これは、次に、更によりオーバーラップするＥＳＴｓ
を同定するためのゲンバンクデータベースに対する）の同定を可能にした(表１)
。これは、ヒトおよびマウス推定レセプター配列をコードするオーバーラッピン
グ核酸配列のアッセンブリを可能にした。

【００８５】該配列アッセンブリにおいて５’まで明らかになったマウスＥＳＴに対して生
じたｃＤＮＡクローン４７９０４３は、ＩＭＡＧＥ協会から得られ、且つシーケ
ンシングされ、３’ポリＡテールを含む１Ｋｂのインサートが含まれることが明
らかになった。ネズミ肺のｃＤＮＡにおける５’ｃＤＮＡ末高速増幅(The rapid
amplification of 5' cDNA ends; 5'-RACE)が、更なる３０８ｂｐ上流のクロー
ニングを可能にした。該ネズミｃＤＮＡは、３８３アミノ酸のタンパクをコード
した。該マウスｃＤＮＡ配列は、５’末が、予測されるヒトレセプター配列の３
９アミノ酸に整列された翻訳された配列の最初のアミノ酸として不完全であり、
また開始メチオニンまたは予測されるシグナルペプチドは同定されなかった。

【００８６】配列解析ヒトおよびネズミｃＤＮＡの配列解析は、核酸レベルで８５％の配列同一性、
およびアミノ酸レベルで９６％の同一性を示した(図１)。ヒトとマウスのｇｐ１
３０の間のアミノ酸の同一性は７７％であり、また、ヒトとマウスプロラクチン
レセプターの同一性は６９％であった。ヒトとネズミの推定レセプターの間の同
一性のレベルが顕著により高いことから、これは、ＧＢＲＩ−ＩＬＲの機能的に
重要な役割を示唆している。推定膜貫通ドメインは、ヒトまたはマウスの何れに
おいてもアミノ酸配列が同定されることはなく、このことは、クローニングされ
たｃＤＮＡｓによりコードされるタンパクが、分泌されるのか、または固定され
たＧＰＩであるのか何れかであることを示唆する。ＣＮＴＦレセプター等のＧＰ
Ｉ固定タンパクの特長である該配列のＣ末端における疎水性領域が同定されてい
ないことから、クローニングされたヒトおよびマウスｃＤＮＡｓは可溶性レセプ
ターをコードする可能性が高い。Ｉ型サイトカインレセプターファミリーでは、
可溶性形態のレセプターの多くの例が存在し、これは膜分離または代替スプライ
シングの何れかによるものである。これらの可溶性形態は、可溶性ｇｐ１３０お
よび可溶性ＩＬ−５レセプターα鎖により示されるようなリガンドシグナリング
の点でのアンタゴニスト作用、またはＩＬ−６レセプターα鎖、ＣＮＴＦレセプ
ターおよびＩＬ−１１レセプターα鎖により示されるアゴニスト作用の何れかを
示すことが可能である。

【００８７】ヒトおよびネズミＧＢＲＩ−ＩＬＲは、ＩＬ−６型サイトカインレセプターフ
ァミリー(表II)の構成要素に対して、同様に、スイスプロットデータベースを探
索するためのクエリーとして使用する場合のプロラクチンレセプターに対して近
似する相同性を示す。ＩＬ−６型サイトカインレセプターファミリーの構成要素
に対するヒトおよびマウスアミノ酸配列のアラインメントは、２つの機能的に重
要なサイトカインレセプター様ドメインに保存された相同性の領域、最も顕著に
高く保存されている４つのシステイン残基とＷ−Ｓ−ｘ−Ｗ−Ｓモチーフ(図２)
を示した。また、両方の配列のＮ末端は、Ｃ２-セット配列に最も近似するＩｇ様ドメインを示すようでもある。

【００８８】ＧＢＲＩ−ＩＬＲに対する相同性を示すヒトＥＳＴ’ｓ(H14009)の１つは、ゲ
ノムクローン(D2-17)に由来する配列である。このクローンは、ヒト染色体１９ｐ１２−１３からの染色体ＤＮＡのエキソン増幅により生じ、これによりこの領
域に対してヒトＧＢＲＩ−ＩＬＲ遺伝子を局所に留めることを可能にする。ＧＢ
ＲＩ−ＩＬＲと顕著な相同性を共有するエリスロポエチンレセプターの遺伝子は
、染色体１９のこのアームに集中されるべきであると示される該レセプターファ
ミリーの他の構成要素である。

【００８９】ヒトＧおよびマウスのＢＲＩ−ＩＬＲの分布ｍＲＮＡ発現は、ノーザンブロット解析によりヒトおよびマウス組織において
研究されている。主に発現されたヒトｍＲＮＡの形態は、１．７Ｋｂ転写物とし
て移動し、該クローンから予測された１つに近いサイズが該ライブラリーのスク
リーニングから得られた。約４．５Ｋｂのもう１つの転写物が幾つかの組織にお
いてみられた。この形態は、該レセプターの膜固定形態をコードし、２つの転写
物に対する類似体はＩＬ−５レセプターα鎖を検出した。１．７Ｋｂ転写物の発
現が幾つかの組織で検出されたが、ｇｐ１３０とＩＬ−６Ｒαの発現に比べて低
い遍在性であった。ヒトＧｂＲＩ−ＩＬＲｍＲＮＡの最も強い発現は、脾臓、胸
線、リンパ節、虫垂、骨髄、甲状腺、副腎皮質、胃、心臓、胎盤および骨格筋で
検出された。この分布は、免疫系におけるヒトＧＢＲＩ−ＩＬＲの予想される役
割に適合する。また、発現は、繊維芽細胞株ＨＥＫ２９３、単球細胞株ＴＨＰ−
１(PMA刺激の後)、ＪＹリンパ芽球細胞、ＲＰＭＩ８２２６骨髄腫細胞、マスト細胞株ＨＭＣ−１、気管支上皮細胞ＨＢＥ−１４０等の幾つかの細胞株でも検出
されており、およびＨＵＶＥＣでも低レベルの発現が検出された。ヒト胎児組織
においては、強い発現が肺で見られたが、脳、腎臓または肝臓では見られなかっ
た。

【００９０】成熟マウスにおいては、１．７Ｋｂ転写物の発現が肺において最も強く見られ
たが、また、該転写物は、骨格筋並びに心臓および脳でも低いレベルで検出され
た。また、１．７Ｋｂ転写物の発現は、免疫化マウスおよび非免疫化マウスのリ
ンパ節および胸腺、並びにマウスにおける骨髄でも検出された。胚においては、
１．７Ｋｂ転写物は、受胎後第１１日で最初に検出され、且つ、受胎後第１５お
よび１７日後を通して発現が進行する。発現のこの様式は、受胎後第１０．５日
での、免疫系の先駆の最初の覚醒と同時に起こるようである。総合すれば、これ
らのデータは、免疫系および胚の発生におけるＧＢＲＩ−ＩＬＲの可能な役割を
示す。

【００９１】クローニング／発現の困難性の克服５’ｃＤＮＡ末高速増幅(The rapid amplification of 5' cDNA ends; 5'-RAC
E)で試みられた場合、ＰＣＲによるヒトおよびマウスのＧＢＲＩ−ＩＬＲの両方
に関する完全長ｃＤＮＡをクローニングする幾つかの試みは、顕著に長い産物の
増幅の不足のために失敗した。これは、後に、該ｃＤＮＡの５’末では該ＤＮＡ
に、ＰＣＲ反応を阻害する非常にＧＣの豊富な領域が存在するためであることが
明らかにされた。この問題は、ヒトＥＳＴｓから設計されたプライマーを使用し
たＰＣＲ増幅により得られたクローニングｃＤＮＡ断片を用いた胎盤ｃＤＮＡラ
イブラリーのスクリーニングによるｈＧＢＲＩ−ＩＬＲによって克服された。

【００９２】また、バキュロウイルス発現系を使用した組み替えタンパクの発現は、これは
イムノグロブリンドメインを欠いたｈＧＢＲＩ−ＩＬＲの部分的なｃＤＮＡを使
用した場合に比較して、その効果が低いことが明らかになった。該タンパクの完
全なＮ−末端領域をコードするｃＤＮＡを使用した場合に、高いレベルのタンパ
ク産生が得られた。

【００９３】

【表１】

【００９４】

【表２】

【００９５】

【表３】

【００９６】組み替え可溶性ＧＢＲＩ−ＩＬＲの製造例アミノ酸３７８で平頭し、第６ヒスチジンおよび３’末での１７９認識標識を
コードする可溶性ヒトＧＢＲＩ−ＩＬＲのｃＤＮＡをｐＦＡＳＴＢＡＣ１にクロ
ーニングした。組み替えウイルスは、ライフ・テクノロジー BAC-TO-BACキット(
Life Technologies BAC-TO-BAC kit)を使用して製造し、且つSF900II培地中に展
開したＳＦ９細胞を感染するために使用した。該培地中に分泌したタンパクを、
ＮＩ−ＮＴＡ樹脂カラム(第６ヒスチジンが結合する)を使用して精製した。精製
したタンパクを、１７９標識(CLEPYTACD)を認識するモノクローナル抗体を使用するウェスタンブロット分析により検出した。

【００９７】抗GBRI-ILRモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの生成例 Balb/cマウスを、四肢および頚部の後側の皮下に対して、注射当り１００μｇ
のタンパクで第０、７および２８日に免疫化した。最終回の注射の後３日、ドレ
ーニングリンパ節を得て、その組織を他の文献に報告された方法に従ってコラゲ
ナーゼとＤＮＡｓｅカクテルを使用して消化した(Kosco-Vilbois M.H., Isolati
on and Enrichment of Follicular Dendritic Cells from Murine Lymphoid Tis
sue, Immunology Methods Manual, Vol 3, 1997)。得られた細胞懸濁液を１ｍＬ
当り１０^６細胞で再懸濁し、Ｓｐ２骨髄腫細胞とコーラーとミルステインの方法
(Kohler and Milstein protocols)に従って融合した。そのハイブリドーマをスクリーニングのために採取した。

【００９８】該ハイブリドーマ上澄のスクリーニングのために、９６ウェルプレート(Falco
n 3912;Becton Dickinson Labware Europe, Meylan, France)を、４℃で、炭酸緩衝液中で１μｇ／ｍＬの感染Ｓｆ９細胞から精製した可溶性ＧＢＲＩ−ＩＬＲ
で一晩コーティングした。次に、プレートを洗浄し、１％のＢＳＡを含有するＰ
ＢＳでブロックし、２００μＬのハイブリドーマ上澄で２時間インキュベーショ
ンし、先勝した。ｍＡｂｓに特異的なＧＢＲＩ−ＩＬＲを、西洋ワサビペルオキ
シダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ(Southern Biotechnology Associates, Inc.) を使用して明らかにした。陽性の上澄をプラスチック免疫化ＧＢＲＩ−ＩＬＲで
再試験した。特異性をＩＬ−１３Ｒα１を１μｇ／ｍＬを添加したＥＬＩＳＡを
使用して検査した。特異的に陽性な上澄を、更に、アミノ酸３５４までＧＢＲＩ
−ＩＬＲとＩＬ−１３Ｒα１膜貫通および細胞質領域との間での融合タンパクを
コードするｃＤＮＡ、ＩＬ−１３Ｒα１ｃＤＮＡ、または空のプラスミド(発現のために使用されたプラスミドはｐＥＢＳ)でトランスフェクションしたＨＥＫ −２９３細胞を使用したＦＡＣＳによりスクリーニングした。ＧＢＲＩ−ＩＬＲ
トランスフェクタントで最も強い蛍光シグナルを示し、且つまた、コントロール
タンパクまたはトランスフェクタントと結合しなかったハイブリドーマを、更な
る使用のために保存した。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ｃＤＮＡ配列情報から予測されるヒトおよびネズミのレ
セプターアミノ酸配列のアラインメントを示す。同一のアミノ酸残基を黒く囲む
。それらがインターロイキンレセプター（または、少なくとも実質的にそのよう
なレセプターの一部分）であると考えられているので、ヒトおよびネズミのポリ
ペプチドは、夫々、ｈＧＢＲＩ−ＩＬＲおよびｍＧＢＲＩ−ＩＬＲと称される。

【図２】図２は、イムノグロブリンドメインおよびヘマトポイエチンレセ
プターモジュールにおけるＩＬ−６型サイトカインレセプターファミリーの一員
と共に、図１に示したｈＧＢＴＩ−ＩＬＲとｍＧＢＲＩ−ＩＬＲアミノ酸配列の
アラインメントを示す。ＧＣＳＦ−Ｒは、顆粒球コロニー刺激因子レセプターで
あり、且つＣＮＴＦ−Ｒは毛様体神経栄養性因子である。

【図３】図３は、ｈＧＢＲＩ−ＩＬＲに対して得られたｃＤＮＡ配列を示
す。

【図４】図４は、図３に提供されたｃＤＮＡ配列から得られる予測アミノ
酸配列を示す。

【図５】図５は、ｍＧＢＲＩ−ＩＬＲに対して得られたｃＤＮＡ配列を示
す。

【図６】図６は、図５に提供されるｃＤＮＡ配列から得られる予測アミノ
酸配列を示す。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１１年１２月２１日（１９９９．１２．２１）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｐ 3/04 ４Ｈ０４５ 48/00 35/00 Ａ６１Ｐ 3/04 37/02 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/715 37/02 16/28 Ｃ０７Ｋ 14/715 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 16/28 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人ＧｌａｘｏＷｅｌｌｃｏｍｅＨｏｕｓｅ，ＢｅｒｋｅｌｅｙＡｖｅｎｕｅＧｒｅｅｎｆｏｒｄ，ＭｉｄｄｌｅｓｅｘＵＢ６０ＮＮ，ＧｒｅａｔＢｒｉｔａｉｎ (72)発明者ゴーシャット、ジャン − フランソワフランス国、エフ − 74164 サン・ジュリアン・アン・ジュヌボア、アブニュ・ナポレオン・トロワズィエーム、サントル・ダムノロジー・ピエール・ファブル５ (72)発明者コスコ −ビルボワ、マリースイス国、シーエイチ − 1228 プラン −レ −ウワット、シュマン・デ・オー、スロノ・ファーマスーティカル・リサーチ・インスティチュート・エス・エー 14 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA43 BA63 CA04 DA02 GA03 GA11 HA01 HA15 4B064 AG20 AG27 CA10 CA19 CA20 CC24 DA01 4C084 AA02 AA13 AA17 CA53 DA45 NA14 ZA592 ZA702 ZA812 ZB262 ZB352 4C085 AA13 AA14 AA16 CC04 CC05 DD86 4C086 AA01 EA16 MA01 NA14 ZA59 ZA70 ZA81 ZB26 ZB35 4H045 AA10 AA11 BA10 CA40 DA50 DA76 EA20 EA50 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ポリペプチドであって、ａ）図１に示すアミノ酸３８から４２２のアミノ酸配列を有するｈＧＢＲＩ−
ＩＬＲのための、または図１に示すアミノ酸配列を有するｍＧＢＲＩ−ＩＬＲの
ための；ｂ）上記のａ）に限定される通りのポリペプチドに関して、１以上のアミノ酸
の欠失、挿入または置換を有し、しかしながら、それとともに少なくとも４０％
のアミノ酸配列の一致を有し；またはｃ）少なくとも１０アミノ酸長である、上記のａ）またはｂ）に限定されるポリ
ペプチドの断片であるポリペプチド。
【請求項２】請求項１に記載のポリペプチドであって、ヘマトポイエチン
レセプターモジュールを有するポリペプチド。
【請求項３】請求項１または請求項２の何れか１項に記載のポリペプチド
であって、ｈＧＢＲＩ−ＩＬＲのための図１に示すアミノ酸３８から４２２のア
ミノ酸配列、またはｍＧＢＲＩ−ＩＬＲのための図１に示すアミノ酸配列を含む
ポリペプチド。
【請求項４】グリコシル化形態にある請求項１から３の何れか１項に記載
のポリペプチド。
【請求項５】可溶性形態にある請求項１から４の何れか１項に記載のポリ
ペプチド。
【請求項６】請求項１から５の何れか１項に記載のポリペプチドを含有す
る薬学的に許容される組成物。
【請求項７】薬剤において使用するための請求項１から５の何れか１項に
記載のポリペプチドまたは請求項６に記載の薬学的に許容される組成物。
【請求項８】癌、免疫疾患、肥満または発生障害の治療のための薬剤の製
造における、請求項１から５の何れか１項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項９】ＡＩＤＳ、敗血症ショック、胎児発生障害または肺の炎症の
治療のための薬剤の製造における請求項１から５の何れか１項に記載のポリペプ
チドの使用。
【請求項１０】スクリーニングにおける請求項１から５の何れか１項に記
載のポリペプチドの使用。
【請求項１１】１型サイトカインレセプターに対して結合するサイトカイ
ンのスクリーニングにおける請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】１型サイトカインレセプターに対して結合するサイトカイ
ンのアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニングにおける請求項１０に記
載の使用。
【請求項１３】請求項１０から１２の何れか１項に記載のスクリーニング
により確認され得る、または確認される１型サイトカインレセプターに対して結
合するサイトカイン、またはそのアゴニスト若しくはアンタゴニスト。
【請求項１４】薬剤において使用するための、請求項１３に記載のサイト
カイン、アゴニストまたはアンタゴニスト。
【請求項１５】癌、免疫疾患、肥満または発生障害の治療のための薬剤の
製造における請求項１２に記載のサイトカイン、アゴニストまたはアンタゴニス
トの使用。
【請求項１６】ＡＩＤＳ、敗血症ショック、胎児発生障害または肺の炎症
の治療のための薬剤の製造における１型サイトカインレセプターに結合するサイ
トカインのアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングするための請求項
１０に記載の使用。
【請求項１７】抗体を産生するまたは選択することにおける請求項１から
５の何れか１項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項１８】請求項１か５の何れか１項に記載のポリペプチドに対して
結合する抗体またはその誘導体。
【請求項１９】請求項１８に記載の抗体またはその誘導体を含む薬学的に
許容される組成物。
【請求項２０】薬剤において使用するための請求項１８に記載の抗体若し
くはその誘導体、または請求項１９に記載の薬学的に許容される組成物。
【請求項２１】癌、免疫疾患、肥満または発生障害を治療するための薬剤
の製造における請求項２０に記載の抗体またはその誘導体の使用。
【請求項２２】 AIDS、敗血症ショック、胎児発生障害または肺の炎症を治
療する薬剤の製造における請求項２０に記載の抗体またはその誘導体の使用。
【請求項２３】核酸分子であって：ａ）請求項１から５の何れか１項に記載のポリペプチドをコードする、ｂ）上記ａ）において限定される通りの分子に相補的な、またはｃ）上記ａ）またはｂ）に限定される通りの分子に対してハイブリダイズする分子。
【請求項２４】請求項２３に記載の核酸分子を具備するベクター。
【請求項２５】請求項２３に記載の核酸分子または請求項２４に記載のベ
クターを具備するホスト。
【請求項２６】請求項１から５の何れか１項に記載のポリペプチドを得る
ための方法であって、前記ポリペプチドの発現を誘導する条件下で請求項２５に
記載のホストをインキュベーションすることと、および次に前記ポリペプチドを
精製することとを具備する方法。
【請求項２７】薬剤において使用するための、請求項２３、２４または２
５の何れか１項に記載の夫々の核酸分子、ベクターまたはホスト。
【請求項２８】アンチセンス療法のための薬剤の製造における、請求項２
３、２４または２５の何れか１項に記載の核酸分子、ベクターまたはホストの夫
々の使用。
【請求項２９】請求項２３に記載の核酸分子のプローブまたはプライマー
としての使用。
【請求項３０】実質的に記載された本発明。