ES2205211T3 - Tratamiento de la insensibilidad parcial a la hormona de crecimiento. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBEN PROCEDIMIENTOS PARA AUMENTAR LA TASA DE CRECIMIENTO DE UN PACIENTE HUMANO QUE TIENE EL SINDROME DE INSENSIBILIDAD PARCIAL A LA HORMONA DEL CRECIMIENTO, PERO NO EL SINDROME DE LARON. UNO DE ESTOS PROCEDIMIENTOS COMPRENDE LA ADMINISTRACION AL PACIENTE DE UNA DOSIS EFECTIVA DE HORMONA DEL CRECIMIENTO, PREFERENTEMENTE HORMONA DEL CRECIMIENTO CON UNA SECUENCIA HUMANA NATIVA, CON O SIN UNA METIONINA N TERMINAL. EL PACIENTE SE CARACTERIZA POR TENER UNA ALTURA INFERIOR A APROXIMADAMENTE -2 DESVIACIONES TIPICAS POR DEBAJO DE LA NORMAL PARA SU EDAD Y SEXO, UN NIVEL SERICO DE PROTEINA DE FIJACION DE LA HORMONA DEL CRECIMIENTO CON ELEVADA AFINIDAD AL MENOS 2 DESVIACIONES TIPICAS POR DEBAJO DE LOS NIVELES NORMALES, UN NIVEL SERICO DE IGF - I INFERIOR A LOS NIVELES MEDIOS NORMALES, Y UN NIVEL SERICO DE HORMONA DEL CRECIMIENTO QUE ES AL MENOS NORMAL. EN OTRO DE ESTOS PROCEDIMIENTOS, LA MISMA POBLACION DE PACIENTES SE TRATA CON UNA CANTIDAD EFECTIVA DE IGF - I, ADMINISTRADA SOLA O EN COMBINACION CON UNA CANTIDAD DE HORMONA DEL CRECIMIENTO QUE ES EFECTIVA EN COMBINACION CON EL IGF - I.

Description

Tratamiento de la insensibilidad parcial a la hormona de crecimiento.

Esta solicitud hace referencia y reivindica los derechos disponibles en el código normativo de los Estados Unidos 35 USC \NAK 120 de la solicitud pendiente de patente americana con Número de Serie 08/224,982 registrada el 7 de abril de 1994, y con Número de Serie 08/410,452, registrada el 24 de marzo de 1995, cuyas descripciones completas se incluyen en la presente por referencia.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

Esta invención hace referencia a un procedimiento para incrementar las tasas de crecimiento de pacientes humanos con el síndrome de insensibilidad parcial a la hormona de crecimiento.

Descripción de los antecedentes y aspectos relacionados

La mayoría de los niños con estatura significativamente corta no tienen una deficiencia de la hormona de crecimiento (GH), tal como se ha definido clásicamente mediante la respuesta de la GH a estímulos provocadores. Una vez excluidas las causas conocidas de la estatura corta, estos pacientes se clasifican de distinta manera, incluyendo la estatura corta familiar, el retraso constitucional del crecimiento, o la estatura corta "idiopática" (ISS). Algunos de estos niños podrían no alcanzar su potencial genético de altura, aunque no se han publicado resultados de estudios longitudinales a gran escala. Debido a la gran cantidad de factores que contribuyen al crecimiento y desarrollo normales, es probable que los pacientes con ISS sean heterogéneos con respecto a la etiología de su estatura corta. Aunque no sean clásicamente deficientes en GH, la mayoría de niños con ISS responden al tratamiento con GH, aunque no todos con igual grado.

Muchos investigadores han buscado alteraciones en la secreción espontánea de GH en este grupo de pacientes. Una hipótesis sugiere que algunos de estos pacientes presentan una secreción inadecuada de GH endógena en condiciones fisiológicas, pero son capaces de presentar un incremento en la GH en respuesta a estímulos farmacológicos, como en los tests de estimulación de GH tradicionales. Este trastorno se ha denominado "disfunción neurosecretora de GH" y el diagnóstico se basa en la demostración de un patrón anormal de GH en un muestreo prolongado de suero. Numerosos investigadores han publicado resultados de este tipo de estudios, descubriendo que esta anomalía sólo se presentaba ocasionalmente. Otros investigadores han postulado que estos pacientes poseen una "GH bio-inactiva"; sin embargo todavía no se ha demostrado de forma concluyente.

Cuando se clonó el receptor de la GH (GHR), se demostró que la mayor actividad de unión a GH en sangre se debía a una proteína derivada del mismo gen que el GHR y que corresponde con el dominio extracelular del GHR de tamaño completo. La mayoría de pacientes con síndrome de insensibilidad a la hormona de crecimiento (o síndrome de Laron, GHIS) carecen de la actividad de unión del receptor de la hormona de crecimiento, o presentan una actividad de proteína de unión a GH (GHBP) en sangre muy baja o nula. Estos pacientes poseen un valor de desviación estándar (SD) respecto a la estatura media de aproximadamente -5 a -6, son resistentes al tratamiento con GH y poseen concentraciones elevadas de GH en suero y concentraciones bajas en suero del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-I), respondiendo al tratamiento con IGF-I. En pacientes con defectos en el dominio extracelular de GHR, la falta de GHBP funcional en la circulación puede servir como marcador de la insensibilidad a GH.

Existe una subclase de pacientes con ISS que poseen niveles bajos de GHBP en sangre, que presentan un valor de SD respecto a la estatura media intermedio entre el valor de los pacientes con GHIS completo (Síndrome de Laron) y el valor de los niños normales, respondiendo en cierta medida, pero no completamente, al tratamiento con GH. Este tipo de pacientes se puede caracterizar como pertenecientes a un GHIS parcial.

Es un objetivo de la presente invención la identificación de un subgrupo de pacientes con ISS que presenten GHIS parcial, pero no presenten el síndrome de Laron o GHIS completo.

Otro objetivo de la presente invención es el tratamiento de este subgrupo de pacientes identificados, de manera que alcancen una estatura adulta que corresponda con su potencial genético, determinada por la altura esperada según la media familiar.

Estos y otros objetivos resultarán evidentes para los expertos en la materia.

La patente internacional WO 95/27495 describe los procedimientos para el tratamiento de pacientes humanos con el síndrome de insensibilidad parcial a la hormona de crecimiento (GH), pero no con el síndrome de Laron, con IGF-1 y/o GH. También se describen ciertas mutaciones en el dominio extracelular del receptor de la hormona de crecimiento, ligadas al síndrome de insensibilidad parcial a la GH.

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La patente internacional WO 91/18621 describe la utilización de la hormona de crecimiento y del IGF-1 para aumentar el crecimiento de un mamífero, demostrándose que dicho crecimiento es superior al obtenido con la utilización de la GH o el IGF-1 por separado.

Resumen de la invención

En concordancia, la presente invención proporciona en un aspecto un procedimiento para incrementar la tasa de crecimiento de un paciente humano con GHIS parcial que consiste en la administración de una cantidad efectiva de GH al mencionado paciente. Éste posee una estatura inferior a aproximadamente -2 desviaciones estándar por debajo de la normal para su edad y sexo, presenta un nivel sérico de GHBP de alta afinidad de por lo menos 2 desviaciones estándar por debajo de los niveles normales, tiene un nivel sérico de IGF-I por debajo de los niveles medios normales y tiene un nivel medio o de estimulación máxima de GH en suero que es como mínimo normal, no presentando este paciente el síndrome de Laron. Preferentemente, la GH es la GH humana recombinante.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para incrementar la tasa de crecimiento de un paciente humano con GHIS parcial y que comprende la administración de una cantidad efectiva de IGF-I (preferentemente IGF-I recombinante humano) al mencionado paciente, el cual posee una estatura inferior a aproximadamente -2 desviaciones estándares por debajo de la normal para su edad y sexo, tiene un nivel sérico de GHBP de alta afinidad que está por lo menos 2 desviaciones estándares por debajo de los niveles normales, tiene un nivel en suero de IGF-I por debajo de los niveles medios normales y posee un nivel medio o de máxima estimulación de GH en suero que por lo menos es normal, no presentando este paciente síndrome de Laron.

En otro aspecto más, la presente invención proporciona un procedimiento para incrementar la tasa de crecimiento de un paciente humano con GHIS parcial, que comprende la administración de cantidades de IGF-I y GH al mencionado paciente en cantidades efectivas en combinación. El mencionado paciente presenta una estatura inferior a aproximadamente -2 desviaciones estándar por debajo de lo normal para su edad y sexo, tiene un nivel en suero de GHBP de alta afinidad que está por lo menos 2 desviaciones estándares por debajo de los niveles normales, tiene un nivel en suero de IGF-I por debajo de los valores medios normales y presenta un nivel medio o de estimulación máxima de GH en suero que por lo menos es normal, no presentando este paciente el síndrome de Laron.

En otro aspecto más, la presente invención proporciona un procedimiento para incrementar la tasa de crecimiento de un paciente humano con GHIS parcial, en donde el mencionado paciente posee un defecto heterogéneo (intracelular y/o extracelular) en el gen del GHR, y que comprende la administración de una cantidad efectiva de GH y/o de IGF-I al mencionado paciente. Preferentemente, la GH es la GH recombinante humana y el IGF-I es el IGF-I recombinante humana.

En otro aspecto más, la invención proporciona un procedimiento para incrementar la tasa de crecimiento en un paciente humano que presenta GHIS parcial y que comprende detectar si el paciente presenta un defecto heterogéneo (intracelular y/o extracelular) en el gen del GHR, y, en cuyo caso, la administración de una cantidad efectiva de GH y/o IGF-I al mencionado paciente.

Descripción resumida de las figuras

La Figura 1 muestra las concentraciones en suero de GHBP del Estudio Nacional y Cooperativo sobre el Crecimiento de Genentech (Genentech National Cooperative Growth Study, NCGS) en niños con deficiencias en la GH (GHD), ISS, y síndrome de Turner (TS) estandarizados por edad y sexo y expresados como valores de SD, según la edad en el momento de participar en el estudio. El área sombreada representa el intervalo normal (-2 SD a +2 SD) para cada sexo. La línea continua representa la media normal por edad y sexo. Ocasionalmente, algunos puntos correspondientes a dos o más pacientes se solapan y aparecen como un punto único.

La Figura 2 muestra la tasa de crecimiento en cm/año de pacientes con ISS participantes en el NCGS, tratados con diferentes dosis de GH administradas mediante inyección diaria.

La Figura 3A representa las concentraciones de IGF-I, estandarizadas por edad y sexo y expresadas como valores de SD, mediante la SD de GHBP (media \pm SD). La figura 3B representa las concentraciones medias de GH de 12 horas, obtenidas mediante muestreo durante toda la noche y cada 20 min. durante 12 horas, mediante la SD de GHBP (media \pm SD) para los pacientes que participaron en el estudio y se utilizaron para generar la Fig. 2.

La Figura 4 muestra la tasa de crecimiento anual durante el primer año (cm/año) mediante el valor de la SD de GHBP para pacientes tratados con la GH humana (hGH) que continuaron prepúberes durante el primer año de terapia con GH (n = 166). El área sombreada representa el intervalo normal para GHBP (-2 SD a +2 SD).

La Figura 5 es un gráfico de las tasas de crecimiento correspondientes al pre-tratamiento, tratamiento durante el primer año y tratamiento durante el segundo año para pacientes cuyos datos se exponen en la tabla VII del ejemplo III de más adelante, teniendo un valor de SD de GHBP de -2 (n = 14)(rectángulos)o un valor de SD de GHBP >-2 (n = 29)(círculos).

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Las Figuras 6A y 6B muestran, en forma de histogramas de barras, las tasas de crecimiento en el pre-tratamiento (Fig. 6A) y durante el tratamiento del primer año (Fig. 6B), mediante el valor de la SD de GHBP de los pacientes utilizados para generar la Fig. 5.

La Figura 7 muestra el estado de crecimiento pronosticado mediante la cuantificación de la secreción de GH (p.ej., concentración de GH endógena o estimulada) respecto a una medida de la capacidad de respuesta de GH (p.ej., concentración de GHBP).

La Figura 8 muestra las secuencias de DNA (SEC ID Nº: 1 y 2, respectivamente) y las secuencias aminoacídicas predichas (SEC ID Nº: 3 y 4, respectivamente) de dos alelos GHR en el paciente 4 con ISS (exones 4-6). Las mutaciones en los alelos 1 y 2 se representan en un recuadro. Las barras verticales indican los límites del exón en la secuencia del cDNA.

La Figura 9 muestra las secuencias de DNA (SEC ID Nº: 5 y 6, respectivamente) y las secuencias aminoacídicas predichas (SEC ID Nº: 7 y 8, respectivamente) de dos alelos GHR en el paciente 2 con ISS (exón 5). La mutación en el alelo 2 se representa en un recuadro.

La Figura 10 muestra las secuencias de DNA (SEC ID Nº: 9 y 10, respectivamente) y las secuencias aminoacídicas predichas (SEC ID Nº: 11 y 12, respectivamente) de dos alelos GHR en el paciente 1 con ISS (exón 7). La mutación en el alelo 2 se representa en un recuadro. La secuencia intrónica está indicada en letras minúsculas y la secuencia exónica en letras mayúsculas. Las barras verticales indican los límites del exón en la secuencia del DNA.

La Figura 11 muestra las secuencias de DNA (SEC ID Nº: 13 y 14, respectivamente) y las secuencias aminoacídicas predichas (SEC ID Nº: 15 y 16, respectivamente) de dos alelos GHR en el paciente 7 con ISS (exón 7). La mutación en el alelo 2 se representa en un recuadro. La secuencia intrónica está indicada en letras minúsculas y la secuencia exónica en letras mayúsculas. Las barras verticales indican los límites del exón en la secuencia del DNA.

Las Figuras 12 a 21 muestran el análisis del gen GHR de los correspondientes pacientes, y demuestran la herencia consiguiente de los padres, así como los resultados de la respuesta de crecimiento para varios de estos pacientes.

Ver más adelante para más texto explicativo.

La Figura 22 es una autorradiografía de secuenciación de la unión exón/intrón del exón 8 del GHR, mostrando la secuencia de tipo salvaje y la secuencia mutante del paciente 1. El paciente 1 es homocigoto para la transversión de G a C en el codón 274, generando un codón ACG (Thr) en lugar de un codón AGG (Arg).

La Figura 23 representa un mapa de restricción de un DNA amplificado por PCR de los miembros de la familia.

a) Se amplificó un fragmento de 199 pb, que contiene el exón 8, del DNA del genoma de los pacientes afectados 1 y 2, la madre (M) y el padre (F) del paciente 1 y un sujeto control (WT), utilizando los cebadores oligonucleotídicos 8a y 8b. La mutación genera una diana de restricción Maell, produciendo 2 fragmentos de 154 y 45 bp, respectivamente. Tras 1 hora de digestión con Maell, los fragmentos de DNA se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida. Los padres del paciente 1 mostraron un patrón de digestión mixta consistente con la presencia tanto de alelos de tipo salvaje como de alelos mutantes, mientras los dos pacientes sólo llevan el alelo mutante y el DNA control únicamente el alelo de tipo salvaje. ND - fragmento no digerido. Mk = marcador de tamaño.

b) Árbol genealógico parcial de las familias de los pacientes 1 y 2 que demuestra la herencia del alelo mutante, tal como se ha determinado mediante secuenciación y digestión por enzimas de restricción del fragmento del exón 8 generado por PCR. El alelo mutante está marcado como 154 y el alelo normal como 199 (como en el patrón de digestión por enzima de restricción). No se han mostrado los datos correspondientes al hermano recién nacido del paciente 1, pero la digestión por enzimas de restricción del DNA placentario reveló un patrón consecuente con un estado heterocigoto.

La figura 24 muestra el efecto de la mutación sobre el ayuste del RNA de GHR.

(a) Se realizó una RT-PCR con el RNA aislado de linfocitos transformados por EBV del paciente 1, utilizando la técnica representada de PCR "anidada" (Las secuencias de los cebadores P1-P5 se detallan en la Tabla 2). En el último ciclo de la PCR utilizando los cebadores P5 y P6, se amplificó como se esperaba un fragmento de 267 pb en el GHR ayustado normalmente (carriles 1 y 2: linfocitos normales control y de hígado, respectivamente), mientras que en el paciente 1 (carril 3) sólo se obtiene un producto de 176 bp que concuerda con el salto del exón 8 de 91 bp. Mk = marcador de tamaño, C = control agua).

La secuenciación directa de estos productos de RT-PCR confirmó el salto del exón 8 en el paciente 1 con el exón 7 ayustado directamente con el exón 9, mientras que en el control se produce el ayuste normal del exón 7 al exón 8.

TABLA A

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Descripción de las realizaciones preferidas Definiciones

La población de pacientes tratados con el procedimiento de esta invención excluye los pacientes con el "síndrome de Laron", también conocidos y definidos en el presente trabajo como personas con ausencia total de función del GHR o con GHIS completo. Estos pacientes alcanzan una estatura adulta de solo 110-130 cm. Otros síntomas comunes adicionales incluyen cara y mandíbula pequeñas, puente nasal deprimido, hueso frontal prominente, obesidad, voz aguda e hipoglucemia en la primera infancia. Bioquímicamente, se caracterizan por tener concentraciones de GH en suero aumentadas pero concentraciones de IGF-1 en suero bajas.

"Aumentar la tasa de crecimiento de un paciente humano" incluye no sólo la situación en que el paciente alcance por lo menos la misma estatura máxima que los pacientes deficientes en GH tratados con GH (p.ej., pacientes diagnosticados de GHD), sino que también se refiere a la situación en que el paciente va creciendo con la misma tasa de crecimiento que los pacientes deficientes en GH tratados con GH, o alcanza una estatura adulta que se encuentra dentro del intervalo de estatura prevista, p.ej., una estatura final en concordancia con su potencial genético determinado por la estatura prevista según el promedio de los padres.

El "síndrome de insensibilidad parcial a la hormona del crecimiento" o "GHIS parcial" se refiere a un síndrome en el cual el paciente responde a las mismas dosis de GH que las que se suministran a pacientes con deficiencia de GH, pero no responde tan bien. Este síndrome además se caracteriza porque el paciente tiene una estatura inferior a aproximadamente -2 desviaciones estándar por debajo de lo normal para su edad y sexo, predominantemente está por debajo de -2 a aproximadamente -4 desviaciones estándar por debajo de lo normal para su edad y sexo, presenta un nivel sérico de GHBP de alta afinidad que está por lo menos 2 desviaciones estándar (típicamente 2-4 desviaciones estándar) por debajo del nivel normal para el hombre, tiene un nivel sérico de IGF-1 que está por debajo del nivel medio para el hombre, y tiene un nivel sérico de GH medio o de estimulación máxima que por lo menos es normal en el hombre.

Los niveles medios en suero son la media de las cuantificaciones en el paciente.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "baja estatura sin deficiencia de GH" hace referencia a un paciente que tiene un valor de SD de estatura de aproximadamente \leq 2 SD por debajo de lo normal para su edad y sexo y no presenta GHD (tal como se ha definido clásicamente en base a los niveles de secreción de GH por debajo de un umbral mínimo).

Tal como se utiliza en el presente texto, el término "hormona de crecimiento" o "GH" hace referencia a la hormona de crecimiento en la secuencia nativa o en forma variante y de cualquier origen, sea natural, sintética o recombinante. Los ejemplos incluyen la hormona de crecimiento humana (hGH), que es la GH natural o recombinante con la secuencia humana original (somatotropina o somatropina), y la hormona de crecimiento recombinante (rGH), que hace referencia a cualquier GH o variante de GH obtenida mediante la tecnología del DNA recombinante, incluyendo el somatrem, la somatotropina y la somatropina. La preferida para uso humano en este estudio es la GH madura con o sin metionina en su extremo N-terminal, recombinante humana de secuencia nativa.

La de mayor preferencia es la metionil-hormona de crecimiento humano (met-hGH) producida en E.coli, p.ej., mediante el proceso descrito en la patente americana U.S. 4.755.465 emitida el 5 de julio de 1988 y Goeddel et al., Nature, 282:544(1979). Met-hGH, que está a la venta con la marca registrada de Protropin® de Genentech, Inc., es idéntica al polipéptido natural, con la excepción de la presencia de un residuo N-terminal de metionina. Este aminoácido añadido es el resultado del proceso de síntesis proteica bacteriana. También se prefiere la hGH recombinante suministrada por Genentech, Inc. con la marca de Nutropin®. Esta última hGH no posee el residuo de metionina y posee una secuencia de aminoácidos idéntica a la de la hormona natural. Véase Grey et al., Biotechnology,2: 161(1984). Tanto la metionil-hGH como la hGH tienen una eficacia y valores farmacocinéticas equivalentes. Moore et al., Endocrinology, 122:2920-2926 (1988). Otro candidato apropiado de hGH es una variante de hGH, que es una forma placentaria de GH con actividad somatogénica pura y ninguna actividad lactogénica, tal como se describe en la patente americana U.S. 4.670.393 emitida el 2 de junio de 1987. También se incluyen variantes de GH como se describe en la patente internacional WO 90/04788 publicada el 3 de mayo de 1990 y la patente internacional WO 92/09690 publicada el 11 de junio de 1992.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "IGF-I" hace referencia al factor de crecimiento-I similar a la insulina, de cualquier especie, incluyendo la bovina, ovina, porcina, equina, aviar y preferentemente la humana, en secuencia su nativa o en su forma variante, y de cualquier origen, sea natural, sintético o recombinante. El IGF-I se ha aislado de suero humano y se ha producido mediante recombinación. Véase, p.ej., las patentes europeas EP 123.228 y EP 128.733.

En la presente invención se prefiere para uso humano el IGF-I maduro de secuencia nativa humana, preferentemente sin metionina N-terminal, preparado, p.ej. mediante el proceso descrito en la patente europea EP 230.869 publicado el 5 de agosto de 1987; la patente europea EP 128.733 publicado el 19 de diciembre de 1984; o la patente europea EP 288.451 publicada el 26 de octubre de 1988. Más preferentemente, este IGF-I de secuencia nativa se produce de forma recombinante, estando disponible para investigaciones por Genentech, Inc., South San Francisco, CA.

Las variantes de IGF-I son las descritas en la patente americana U.S. 5.077.276 emitida el 31 de diciembre de 1991, en las patentes internacionales PCTWO 87/01038 publicada el 26 de febrero de 1987 y PCTWO 89/05822 publicada el 29 de junio de 1989, y son aquellas en las que al menos el residuo de ácido glutámico falta en la posición 3 del extremo N-terminal de la molécula madura, o aquellas con una deleción de hasta 5 aminoácidos en el extremo N-terminal. En la variante más preferida faltan los 3 primeros aminoácidos del extremo N-terminal (según los casos, denominado como IGF de cerebro, tIGF-I, des(1-3)-IGF-I, o des-IGF-I).

El término "proteína de unión a la hormona de crecimiento de alta afinidad" o "GHBP de alta afinidad" hace referencia al dominio extracelular del receptor de la GH que circula en la sangre y que actúa como una GHBP en varias especies (Ymer and Herington, Mol.Cell.Endocrino., 41: 153[1985]; Smith and Talamantes, Endocrinology, 123: 1489-1494[1988]; Emtner and Roos, Acta Endocrinologica (Copen.), 122: 296-302[1990]), incluyendo el hombre. Baumann et al., J. Clin. Endocrinol, Metab, (J.C.E.M.), 62:134-141(1986); EP 366,710 publicado el 9 de mayo de 1990; Herington et al., J. Clin. Invest, 77: 1817-1823 (1986); Leung et al., Nature, 330: 537-543 (1987). También se ha descrito una segunda BP con menor afinidad por la GH que parece no estar estructuralmente relacionada con el GHR. Baumann and Shaw, J.C.E.M., 70: 680-686 (1990). Existen varios procedimientos para cuantificar la GHBP funcional en suero, siendo el procedimiento preferido un ensayo inmunofuncional mediado por un ligando (LIFA) descrito por Carlsson et al., J.C.E.M., 73: 1216 (1991) y la patente americana U.S. 5.210.017.

Modos de realizar la invención

La subpoblación de pacientes destinados al tratamiento mediante la presente invención consiste de aquellos pacientes con GHIS parcial, tal como se han definido anteriormente. El paciente debe presentar cada uno de los síntomas clínicos que se han expuesto como tratables mediante el procedimiento reivindicado aquí.

Se administra directamente la GH y/o el IGF-I al paciente, mediante cualquier técnica adecuada, incluyendo la vía parenteral, intranasal, intrapulmonar u oral, o mediante absorción a través de la piel. Si se administran conjuntamente, no necesariamente se han de administrar por la misma vía. Se pueden administrar localmente o por vía sistémica. Ejemplos de administración parenteral incluyen la administración subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraarterial e intraperitoneal. Preferentemente se administran mediante inyección subcutánea diaria.

La GH y/o el IGF-I que se utilizarán en la terapia serán formulados y dosificados de manera consecuente con la buena práctica médica, teniendo en cuenta la condición clínica de cada paciente (especialmente los efectos secundarios del tratamiento con GH o IGF-I solos), el lugar de liberación de la(s) composición(s) de IGF-I y la GH, el procedimiento de administración, el programa de administración y otros factores conocidos por los médicos. Las "cantidades efectivas" de cada componente para los presentes objetivos se determinan mediante estas consideraciones y son cantidades que incrementan las tasas de crecimiento de los pacientes.

Si la GH se administra sola, se emplea preferentemente una dosis superior a aproximadamente 0,2 mg/kg/semana, más preferentemente superior a aproximadamente 0,25 mg/Kg/semana e incluso más preferentemente mayor o igual a aproximadamente 0,3 mg/kg/semana. En una realización, la dosis de GH oscila entre aproximadamente 0.3 y 1.0 mg/kg/semana, y en otra realización, entre 0,35 y 1.0 mg/kg/semana. Preferentemente, la GH se administra una vez al día de forma subcutánea.

La correcta administración de GH puede ser de forma continua o discontinua. Así, en un momento determinado (p.ej. una vez al día) se administra en forma de inyección de una dosis determinada, con la que se alcanzará un incremento en la concentración plasmática de GH en el momento de la inyección y una disminución en la concentración plasmática de GH hasta el momento de la siguiente inyección. Otro procedimiento de administración no continua se obtiene con la utilización de microsferas de PLGA y muchos dispositivos implantados que proporcionan una liberación discontinua del ingrediente activo, tal como una ráfaga inicial, seguida de un retardo antes de la liberación del ingrediente activo.

Véase, p.ej., la patente americana U.S. 4.767.628, col.2, líneas 19-37.

La GH también puede ser administrada de manera que esté presente en la sangre de forma continua durante el período de administración de la GH. Esto se consigue preferentemente mediante una vía de inyección continua, p.ej., mini-bomba tal como una mini-bomba osmótica.

Alternativamente, se consigue de forma apropiada utilizando inyecciones frecuentes de GH (más de una vez al día, por ejemplo, dos o tres veces al día).

En otra realización, la GH puede ser administrada utilizando formulaciones de GH de larga duración, que o bien retrasan el aclaramiento de GH en sangre o bien provocan una lenta liberación de GH, p.ej. desde el punto de inyección. La formulación de larga duración que retrasa el aclaramiento de GH en plasma puede estar en la forma de un complejo de GH, o de una GH conjugada de forma covalente (mediante un enlace reversible o irreversible) a una macromolécula, tal como una o más de sus proteínas de unión (patente internacional WO 92/08985 publicada el 29 de mayo de 1992) o un polímero hidrosoluble seleccionado a partir del PEG y de los homopolímeros de polipropilén glicol y polioxietilén-polioles, es decir, aquellos que son solubles en agua a temperatura ambiente. Alternativamente, la GH puede estar formando un complejo o estar unida a un polímero para incrementar su vida media circulante. Ejemplos de polietilén polioles y polioxietilén polioles útiles para este propósito incluyen el polietilén glicerol, el polietilén glicol, el polioxietilén sorbitol, el polioxietilén glucosa, o similares. El armazón de glicerol del polioxietilén glicerol es el mismo presente en los mono-, di- y triglicéridos, de por ejemplo, animales y humanos.

Los polímeros no necesitan tener ningún peso molecular en particular, pero se prefiere que el peso molecular esté entre aproximadamente 3500 y 100.000, más preferentemente entre 5000 y 40.000. Preferentemente el homopolímero PEG no está substituido, pero podría estar substituido en un extremo por un grupo alquilo. Preferentemente el grupo alquilo es un grupo alquilo C1-C4 y más preferentemente un grupo metilo. Más preferentemente el polímero es un homopolímero de PEG no substituido, un homopolímero de PEG substituido por monometil (mPEG) o polioxietilén glicerol (POG) y tiene un peso molecular de aproximadamente 5000 a 40.000.

La GH está unida covalentemente a través de uno o más residuos de aminoácidos de GH a un grupo terminal reactivo del polímero, dependiendo básicamente de las condiciones de la reacción, el peso molecular del polímero, etc. El polímero con el(los) grupo(s) reactivo(s) se designa en la presente invención como un polímero activado. El grupo reactivo reacciona selectivamente con aminoácidos libres u otros grupos reactivos de GH.

Se entiende, no obstante, que el tipo y la cantidad del grupo reactivo escogido, al igual que el tipo de polímero utilizado para obtener resultados óptimos, dependerá de la GH utilizada en particular para evitar que el grupo reactivo reaccione con demasiados grupos especialmente activos de la GH. Como esto posiblemente no se pueda evitar por completo, se recomienda la utilización en general de aproximadamente 0.1 a 1000 moles, preferentemente de 2 a 200 moles de polímero activado por mol de proteína, dependiendo de la concentración de proteína. La cantidad final de polímero activado por mol de proteína es un equilibrio entre mantener la actividad óptima y al mismo tiempo optimizar, si ello es posible, la vida media de la proteína circulante.

Mientras que los residuos pueden ser cualquier aminoácido reactivo de la proteína, tal como una o dos cisteínas, o el grupo de aminoácidos del extremo N-terminal, preferentemente el aminoácido reactivo será la lisina, que está ligada al grupo reactivo del polímero activado a través de su grupo épsilon-amino libre, o del ácido glutámico o aspártico, que está ligado al polímero mediante un enlace amida.

La reacción de modificación covalente puede llevarse a cabo mediante cualquiera de los procedimientos apropiados que generalmente se utilizan para las reacciones entre materiales biológicamente activos y polímeros inertes, preferentemente a un pH de 5-9, más aún entre 7-9 si los grupos reactivos de la GH son grupos lisina. En general, el proceso consiste en preparar un polímero activado (con al menos un grupo hidroxilo terminal), preparar un substrato activo de este polímero y a continuación permitir que la GH reaccione con el substrato activo para producir la GH adecuada para la formulación. La reacción de modificación descrita anteriormente se puede realizar mediante varios procedimientos, que pueden constar de uno o más pasos. Ejemplos de agentes modificadores que se pueden utilizar para producir el polímero activado en una reacción de un paso incluyen el cloruro de ácido cianúrico (2,4,6-tricloro-S-triazina) y el fluoruro de ácido cianúrico.

En una presentación, la reacción de modificación tiene lugar en dos pasos, en el primero el polímero reacciona con un anhídrido de ácido como el anhídrido succínico o el glutárico para formar un ácido carboxílico y en el segundo el ácido carboxílico reacciona con un compuesto capaz de reaccionar con el ácido carboxílico, para formar un polímero activado con un grupo éster reactivo capaz de reaccionar con la GH. Ejemplos de estos compuestos incluyen la N-hidroxisuccinimida, el ácido sulfónico 4-hidroxi-3-nitrobenzeno, y similares, preferentemente se utiliza la N-hidroxisuccinamida o el ácido sulfónico 4-hidroxi-3-nitrobenzeno. Por ejemplo, el PEG substituido con monometilo puede reaccionar a temperaturas elevadas, preferentemente alrededor de 100-110ºC durante 4 horas, con anhídrido glutárico. El PEG monometilo-ácido glutámico, así producido, se hace reaccionar posteriormente con N-hidroxisuccinimida en presencia de un reactivo carbodiimida, tal como el diciclohexil o el isopropil carbodiimida, para producir un polímero activado, el metoxipolietilén glicol-N-succinimidil glutarato, el cual a continuación podrá reaccionar con la GH. Este procedimiento se describe en detalle en Abuchowski et al., Cancer Biochem. Biophys., 7: 175-186 (1984). En otro ejemplo, el PEG substituido con monometilo se puede hacer reaccionar con anhídrido glutárico seguido de una reacción con ácido sulfónico 4-hidroxi-3-nitrobenzeno (HNSA) en presencia de diciclohexil carbodiimida para producir el polímero activado. HNSA está descrito por Bhatnagar et al., Peptides: Síntesis-Structure-Function, Proceedings of the Seventh American Peptide Symposium, Rich et al. (eds.) (Pierce Chemical Co., Rockford IL, 1981), p.97-100, y en Nitecki et al., High Technology Route to Virus Vaccines (American Society for Microbiology: 1986) titulado "Novel Agent for Coupling Synthetic Peptides to Carriers and Its Applications".

Los procedimientos específicos de producción de GH conjugada con PEG incluyen los procedimientos descritos en la patente americana U.S. 4.179.337 sobre la PEG-GH y la patente americana U.S. 4.935.465, que describen el PEG ligado de forma covalente pero reversible a la GH. Otros procedimientos específicos para producir PEG-GH incluyen los siguientes:

La PEGlicolación se consigue con metoxipolietilén glicol aldehido (Me-PEG aldehido) mediante alquilación reductora y purificación, añadiendo a una solución salina tamponada con fosfato (PBS), a pH 7, de 2 mg/ml de GH, Me-PEG aldehido-5000 0,5 mM (peso molecular 5000 daltons) y 20 nM de NaCNBH3, mezclando suavemente a temperatura ambiente durante 3 horas. A continuación se añade etanolamina a 50 mM para amidar de forma reductora el Me-PEG restante que no ha reaccionado. Se separa la mezcla en una columna de intercambio aniónico, FPLC Mono Q. El Me-PEG sobrante que no ha reaccionado no se adhiere a la columna y así se podrá separar de la mezcla. Se obtienen dos fracciones mayores de GH PEGlicoladas con pesos moleculares aparentes de 30 Kd y 40 Kd en SDS-PAGE reductor, respecto a 20 Kd de la GH que no ha reaccionado. El complejo GH-GHBP se PEGlicola de la misma forma para dar lugar a un derivado de 150 Kd mediante filtración por gel.

La PEGlicación con N-hidroxisuccinimidil PEG (NHS-PEG) y la purificación se consiguen, añadiendo NHS-PEG con un exceso molar de 5 veces la concentración total de lisina de la GH, a una solución que contiene 2 mg/ml de GH en tampón de borato sódico 50 mM a pH 8,5 o PBS a pH 7 y mezclando a temperatura ambiente durante una hora. Los productos se separan en una columna Superose 12 de separación por tamaño y/o Mono Q de FPLC. La GH PEGlicolada varía en tamaño dependiendo del pH de la reacción desde aproximadamente 300 Kd para la reacción que tiene lugar a pH 8,5, a 40 Kd a pH 7,0, tal como se ha cuantificado mediante filtración en gel. El complejo GH-GHBP también está PEGlicolada de la misma forma con un peso molecular resultante de 400 a 600 Kd mediante filtración en gel.

La PEGlicación de los mutantes de cisteína de GH con PEG-maleimida se obtiene preparando un único mutante de cisteína de GH mediante mutagénesis dirigida, expresándolo y secretándolo en la cepa 16C9 de E.coli (W3110 \DeltatonA phoA \DeltaE15 \Delta(argF-lac)169 deoC2 que no produce la proteína deoC) y purificándolo en una columna de intercambio aniónico.

La cepa 16C9 se construyó genéticamente transfiriendo el alelo deoC2 de la cepa CGGSC#6092 (Nº 6092, disponible del E.coli Genetic Stock Center, New Haven, Conn. y descrito en Mark et al., Molec. Gen. Genet., 155: 145-152 (1977), con genotipo trxA1 recA1 ilvE720::tn5 metE70 deoC2 lacZ53 rha5 malB45 rpsL151) en la cepa designada 7C1.

La cepa 7C1 [con genotipo W3110 \DeltatonA phoA \DeltaE15 \Delta(argF-lac)169] se construyó en varios pasos utilizando técnicas que incluyen transducciones con el fago P1Kc, derivado de P1 (J.Miller, Experiments in Molecular Genetics [Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory, 1972]) y transposones genéticos (Kleckner et al., J. Mol. Biol., 116: 125-159 [1977]. E.coli K12 W3110, cepa K12 que es F-, \lambda- (el tipo salvaje es F+, \lambda+) (Bachmann, Bact.Rev., 36: 525-557 [1972]), se utilizó como huésped inicial.

En primer lugar, el gen ton A (fhuA) (Kadkner et al., J.Bact., 143: 256-264 [1980]; Bachmann, Microbiol. Rev., 47: 180-230 [1983] se delecionó mediante la inserción y posterior escisión imprecisa de un transposón Tn10 en un gen tonA. En el primer paso de este procedimiento, E.coli W3110 fue transducida con \lambda::Tn10 para generar un "grupo de salto" de E.coli W3110 (Kleckner et al., J.Mol.Biol., supra).

El grupo de salto de E.coli W3110::Tn10 creció en un caldo de cultivo L a 37º hasta una densidad celular de aproximadamente 1 x 10^{9}/ml. Se centrifugó un total de 0,5 ml del cultivo y se resuspendió el sedimento en 0,2 ml de un lisado de \lambdaphi80 que contenía 7,0 x 10^{9} ufc. Se permitió la adsorción del fago durante 30 minutos a 37ºC. A continuación la suspensión se extendió en placas EMB suplementadas con tetraciclina (15 \mug/ml). Tras incubarlas a 37ºC durante toda la noche, las colonias se agruparon en 3 ml de caldo de cultivo L, se dejaron crecer durante toda la noche a 37ºC, se lavaron 2 veces y se resuspendieron en caldo de cultivo L. Se realizó un lisado del bacteriófago P1kc sobre este cultivo (Miller, J.H., Experiments in Molecular Biology, supra, page 304).

E.coli AT 982 (Nº 4546, E.coli Genetic Stock Center, New Haven, Conn.) fue transducida para obtener la resistencia a tetraciclina por medio de este lisado P1kc. Se seleccionaron los transductantes en placas con caldo de cultivo L suplementadas con tetraciclina (15 \mug/ml) y 40 \mug/ml de ácido diaminopimélico (dap). Los transductantes resultantes se cribaron por su resistencia a la tetraciclina y la regeneración del gen dap (dap^{+}, tet^{R}). A continuación, se analizaron los transductantes dap^{+}, tet^{R} respecto a su resistencia a \lambdaphi80.

Se obtuvieron los lisados de P1kc de varias cepas dap^{+}, tet^{R} resistentes a \lambdaphi80. Los lisados se emplearon para transducir E.coli W3110 y generar su resistencia a tetraciclina. Se rastrearon los transductantes y se seleccionaron respecto a su resistencia a \lambdaphi80.

Se seleccionaron clones aislados sensibles a la tetraciclina de los transductantes W3110tonA::Tn10-\lambdaphi80R. Maloy and Jun, J. Bacteriol., 145: 1110 (1981). Estos clones aislados se analizaron respecto a su resistencia a \lambdaphi80 y su sensibilidad a la tetraciclina tras una única purificación de la colonia.

Se aisló el DNA de varios mutantes sensibles a la tetraciclina y resistentes a \lambdaphi80 y se digirió con Sstll. El DNA digerido con Sstll se caracterizó mediante el procedimiento de transferencia de Southern, utilizando el DNA del \lambda::Tn10 marcado radiactivamente y digerido con Sstll como sonda para determinar si el Tn10 había sido retirado. Davis et al., Advanced Bacterial Genetics (Cold Spring Harbor Laboratoy, New York, 1980). Se demostró que uno de los clones aislados sensible a la tetraciclina había perdido dos de las bandas de hibridación de Tn10 en comparación con la hibridación del \lambda::Tn10 y el W3110tonA::Tn10\lambdaphi80R parentales. Una tercera banda de hibridación presentaba una movilidad alterada, indicando que se había producido una pérdida causada por la eliminación imprecisa de Tn10.

La electroforesis en gel SDS de preparaciones de membrana externa de la cepa con una eliminación imprecisa de Tn10 revelaron que la banda que presumiblemente era una proteína TonA presentaba una movilidad electroforética alterada en comparación con la proteína TonA de tipo salvaje. La proteína resultante no era funcional como proteína receptora del fago \lambdaphi80. Una segunda cepa independiente que también sufrió una eliminación imprecisa de Tn10 no mostró ninguna proteína TonA en el gel SDS.

Ninguna de estas cepas mostró la inversión de la resistencia a la tetraciclina o susceptibilidad al \lambdaphi80, indicando que existía una eliminación imprecisa de una parte o todo el transposón Tn10 conjuntamente con una deleción parcial o completa del gen tonA. De este modo se eliminó la proteína TonA (PM 78,000) de la membrana externa, convirtiendo la cepa W3110 tonA en resistente a varios bacteriófagos.

A continuación, dos mutaciones más de deleción, phoA \Delta E15 (Sarthy et al., J. Bact., 145: 288-292[1981]) y \Delta (argF-lac)-169 (Schweizer et al., Mol. Gen. Genet., 192: 293-294 [1983], se transfirieron simultáneamente a W3110 tonA mediante enlace genético al transposón de resistencia a la canamicina, insertado en un gen biosintético de prolina (proC::Tn5).

Se eliminó el transposón mediante la selección de un revertido espontáneo prototrófico (pro+) en placas de agar con un mínimo de glucosa. Se comprobó la introducción de la mutación phoA porque los transductantes formaban colonias blancas en placas de agar con un mínimo de glucosa y con fosfato 0,2 mM y 20 mg/ml de 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato. Asimismo, la mutación \Delta(argF-lac) 169 causa la pérdida de la enzima beta-galactosidasa y da lugar a células que forman colonias blancas en placas de agar MacConkey-1% lactosa. El resultado fue la cepa 7C1.

Por último, se introdujo la mutación deoC (Bachmann, supra), eliminando la aldolasa, en 7C1 mediante un proceso con varios pasos de transducciones utilizando el fago Plkc. Se utilizaron procedimientos estándares para la transducción. Primero se introdujo la auxotrofía para treonina en 7C1 con el fin de proporcionar un medio de selección positiva de los segmentos cromosómicos transducidos en la región del gen deoC, tal como sigue.

Se dejó crecer P1kc sobre un auxótrofo de treonina, los mencionados auxótrofos están descritos en Clare N. Berg and Douglas E. Berg, Microbiology-1981, "Bacterial Transposons", pp. 107-116 (Amer. Soc. for Microbiology, Washington, DC, 1981).

Se utilizó el lisado resultante para transducir la cepa 7C1 y convertirla en resistente a tetraciclina, seleccionando los transductantes en placas LB conteniendo 25 \mug/ml de tetraciclina. La cepa resultante, designada 14A9 (tonA\Delta, phoA\DeltaE15, \Delta(argF-lac)169thr::tn10), revertió espontáneamente a prototrofía con una elevada frecuencia, de manera que se usaron placas con ácido fusárico (J. Bact., 145: 1110 [1981]) para seleccionar un auxótrofo de treonina estable y sensible a la tetraciclina, designada cepa 16C4.

Se dejó crecer P1kc sobre la Cepa CGSC#6092, tal como se ha descrito supra.

Se utilizó el lisado resultante para transducir la cepa 16C4 a prototrofía, seleccionando para el crecimiento placas con agar y mínimo de glucosa. Para obtener un lisado transductor de elevada frecuencia de la cepa 2D4, el fago P1kc ha tenido que realizar su ciclo vital 2 veces en este huésped. Se aislaron cinco transductantes prototróficos de la cepa 16C4, se purificaron y se comprobó su crecimiento en placas de agar con un mínimo de timidina. Cuatro de estos cinco lisados no pudieron crecer en dicho medio de timidina y por tanto habían recibido la mutación deoC2 que elimina la síntesis de la proteína deoC. Se conservó una de estos cuatro aislados y se designó como cepa 16C9 (\DeltatonA, phoA, \DeltaE15, \Delta(argF-lac)169,deoC2).

Se produce PEG-maleimida mediante la reacción de monometoxiPEG amina con sulfo-MBs en 0.1 M fosfato sódico a pH 7.5 durante una hora a temperatura ambiente y cambiando el tampón por tampón fosfato a pH 6.2. A continuación se añade GH con una cisteína extra libre y se mezcla durante una hora y la mezcla final se separa en una columna MonoQ, como la GH PEGlicolada en Me-PEG aldehido.

Como las uniones éster son química- y fisiológicamente lábiles, puede ser preferible utilizar un reactivo PEG en la reacción de conjugación que no tenga funcionalidad éster. Por ejemplo, se puede realizar un enlace carbamato provocando la reacción entre PEG-monometil éter con fosgeno para dar lugar a PEG-cloroformato. A continuación este reactivo puede ser usado de la misma forma que el éster NHS para hacer funcionales las aminas de las cadenas laterales de lisina. En otro ejemplo se realiza un enlace con urea mediante la reacción entre un amino-PEG-monometil éter con fosgeno. Esto produciría un PEG-isocianato que reaccionará con las aminas de la lisina.

Una forma preferida de producir la PEG-GH, que no contenga un éster que se pueda separar en el reactivo PEG, se describe a continuación: Se convierte metoxipoli(etilén glicol) en un ácido carboxílico, mediante titulación con naftaleno sódico para generar el alcóxido, seguido de un tratamiento con bromoetil acetato para formar el etil éster, seguido por la hidrólisis hasta el correspondiente ácido carboxílico mediante tratamiento con hidróxido sódico y agua, tal como se ha publicado por Bückmann et al., Macromol. Chem., 182: 1379-1384 (1981). A continuación el ácido carboxílico resultante se convierte en un PEG-N-hidroxisuccinimidil éster apropiado para la acilación de la GH mediante la reacción del ácido carboxílico resultante con la diciclohexil-carbodiimida y NHS en etil acetato.

El reactivo resultante de NHS-PEG a continuación se hace reaccionar con 12 mg/ml de GH utilizando un exceso molar de 30 veces de GH en un tampón de borato sódico, pH 8.5, a temperatura ambiente durante una hora y posteriormente se aplica a una columna de Q Sepharose en tampón TRIS y se eluye con un gradiente salino. A continuación se aplica a una segunda columna (fenil Toyopearl) equilibrada con tampón de citrato sódico de 0,3 M, pH 7.8. La GH PEGlicolada se eluye a continuación con un gradiente salino inverso, se agrupan y se intercambia el tampón utilizando una columna de desalado G25 con un tampón con manitol, glicina y fosfato sódico a pH 7.4 para obtener una PEG7-GH de formulación apropiada.

Las moléculas de GH PEGlicoladas y el complejo GH-GHBP se pueden caracterizar mediante SDS-PAGE, filtración en gel, RMN, mapeo con tripsina, cromatografía líquida- espectrometría de masas y ensayos biológicos in vitro. Es más apropiado mostrar la extensión de la PEGlicación primero por SDS-PAGE y filtración en gel y analizarla posteriormente por RMN, en donde se presenta un pico de resonancia específico para los hidrógenos del metileno del PEG. Se puede calcular el número de grupos PEG de cada molécula a partir del espectro RMN o por espectrometría de masas. La electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS al 10% se realiza de forma apropiada en tampón de lavado Tris-HCl 10 mM a pH 8.0 y NaCl 100 mM. Para demostrar qué residuo está PEGlicolado, se puede realizar un mapeo con tripsina. Así la GH PEGlicolada es digerida con tripsina a una relación proteína/enzima de 100 a 1, en base a mg, a 37ºC durante 4 horas en acetato sódico 100 mM, Tris-HCl 10 mM, cloruro cálcico1 mM, pH 8,3 y acidificado a pH < 4 para la digestión antes de la separación en HPLC Nucleosil C-18 (4.6 mm x 150 mm, 5\mu, 100\ring{A}). Se compara el cromatograma con el del material de partida no PEGlicolado. Entonces se puede analizar cada pico mediante espectrometría de masas para verificar el tamaño del fragmento en el pico. El(los) fragmento(s) que llevan grupos PEG no son retenidos habitualmente en la columna de HPLC tras su inyección y desaparecen del cromatógrafo. Esta desaparición del cromatógrafo es una indicación de PEGlicación en aquél fragmento en particular que debería contener al menos un residuo de lisina. A continuación se podrá realizar un ensayo de la GH PEGlicolada respecto a su capacidad de unión a GHBP mediante procedimientos convencionales.

Los diferentes tipos de PEGlicación utilizados produjeron varios tipos de GH PEGlicolada de tipo salvaje, con pesos moleculares aparentes de 35K, 51K, 250K y 300K mediante cromatografía de exclusión por tamaño, que deberían estar próximos a su volumen hidrodinámico original. Éstas se denominaron PEG1-GH, PEG2-GH, PEG3-GH y PEG7-GH, respectivamente. Como resultado del mapeo con tripsina, tanto la PEG1-GH como la PEG2-GH carecían en el cromatograma del fragmento N-terminal de 9 aminoácidos que posiblemente estaba PEGlicolado, lo cual se pudo confirmar mediante la espectrometría de masas de las especies de elevado peso molecular halladas en el eluido de la cromatografía líquida. Partiendo del peso molecular en SDS-PAGE, la PEG1-GH puede tener un PEG en el extremo amino N-terminal y la PEG2-GH puede tener dos moléculas PEG en el extremo amino N-terminal, formando una amida terciaria. La PEG3-GH tiene aproximadamente 5 grupos PEG por molécula, según el resultado de RMN, y en el mapeo por tripsina, al menos faltan cinco fragmentos peptídicos, lo que sugiere que están PEGlicolados. Se cree que la molécula PEG7-GH posee de 6-7 grupos PEG por molécula según la espectrometría de masas.

Los lugares de adición de grupos PEG a la GH y los residuos preferidos para este tipo de conjugación son la metionina o la fenilalanina N-terminales, la lisina 38, lisina 41, lisina 70, lisina 140, lisina 145, lisina 158 y lisina 168. Las dos lisinas que parecen no estar PEGlicoladas son la lisina 115 y la lisina 172.

La GH también se administra apropiadamente mediante sistemas de liberación sostenida. Ejemplos de compuestos de liberación sostenida útiles para ello incluyen las matrices de polímeros semi-permeables del tipo de artículos moldeados, p.ej., películas o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida incluyen poliláctidos (patente americana U.S. 3.773.919, la patente europea EP 58.481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers, 22, 547-556 [1983]), poli(2-hidroxietil metacrilato) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277[1981]; Langer, Chem. Tech., 12: 98-105[1982], etilén vinil acetato (Langer et al., supra) o poli-D-(-)-3-ácido hidroxibutírico (EP 133,988), o microsferas de PLGA.

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Las composiciones de GH de liberación sostenida también incluyen la GH atrapada en liposomas. Los liposomas que contienen GH se preparan mediante procedimientos conocidos per se: la patente DE 3.218.121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688- 3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030-4034 (1980); las patentes europeas EP 52.322; EP 36.676; EP 88.046; EP 143.949; EP142.641; la solicitud de patente japonesa 83-118008; las patentes americanas U.S. 4.485.045 y 4.544.545; y la patente europea EP 102.324. Habitualmente, los liposomas son del tipo pequeño (alrededor de 200-800 Angstroms) y unilamelar, en el cual el contenido lipídico es superior a aproximadamente 30 por ciento de moléculas de colesterol, ajustándose la proporción seleccionada a la terapia óptima. Adicionalmente, se puede hacer una formulación de liberación sostenida biológicamente activa a partir de un producto de adición de la GH unida covalentemente a un polisacárido activado, tal como se describe en la patente americana U.S. 4.857.505 publicada el 15 de agosto de 1989. Adicionalmente, la patente americana U.S. 4.837.381 describe una composición de microsferas de grasa, cera o una mezcla de ambas con la GH para una lenta liberación.

En otra realización, los pacientes identificados anteriormente son tratados con una cantidad efectiva de IGF-I. Como propuesta general, la cantidad total farmacéuticamente efectiva de IGF-I administrada parenteralmente por dosis será del orden de aproximadamente 50 a 240 \mug/kg/día, preferentemente de 100 a 200 \mug/kg/día, del peso corporal del paciente, aunque, tal como se ha mencionado anteriormente, esto estará sujeto en gran medida al criterio terapéutico. Asimismo es preferible administrar el IGF-I por inyección subcutánea una o dos veces al día.

Se puede administrar el IGF-I con diferentes medios, incluyendo inyecciones (sencillas o múltiples, p.ej., 1-4 por día) o infusiones. Al igual que la GH, el IGF-I puede ser formulado de manera que su presencia en sangre sea continua durante todo el tratamiento, tal como se ha descrito anteriormente para la GH. Así, puede estar unido covalentemente a un polímero o incluido en una formulación de liberación sostenida, tal como se ha descrito anteriormente.

Además, el IGF-I se administra de forma apropiada conjuntamente con cualquiera o con varias de sus proteínas de unión, por ejemplo, las actualmente conocidas: IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-5, IGFBP-6. El IGF-I también puede estar acoplado a un receptor, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo para su administración. La proteína de unión preferida para el IGF-I en la presente invención es la IGFBP-3, que está descrita en la patente americana U.S. 5.258.287 y por Martín and Baxter, J. Biol. Chem., 261: 8754-8760 (1986). Esta proteína IGFBP-3 glicosilada es un componente, estable frente a ácidos y de aproximadamente 53 Kd en un gel SDS-PAGE no reductor, de un complejo de glicoproteínas de 125-150 Kd que se encuentra en el plasma humano y que transporta la mayor parte de los IGFs endógenos; y también está regulada por la GH.

La administración de la proteína ligando de IGF con IGF-I puede conseguirse mediante el procedimiento descrito en la patente americana U.S. 5.187.151. Brevemente, IGF-I e IGFBP se administran en cantidades efectivas mediante inyección subcutánea de bolo en proporción molar de aproximadamente 0,5:1 hasta aproximadamente 3:1 y preferentemente alrededor de 1:1.

En otra realización, se pueden administrar IGF-I y GH al paciente, cada uno en cantidades efectivas, o cada uno en una cantidad sub-óptima, pero efectiva cuando se combinan. Preferentemente estas cantidades oscilan alrededor de 50 a 100 \mug/kg/día para IGF-I y aproximadamente 0,3 mg/kg/semana para GH. Preferentemente la administración tanto de IGF-I como de GH es por inyección utilizando, p.ej., sistemas intravenosos o subcutáneos. Más preferentemente, la administración es por inyección subcutánea tanto para IGF-I como para GH, más preferentemente inyecciones diarias.

Se hace notar que los médicos que apliquen dosis tanto de IGF-I como de GH deberían tener en cuenta los efectos secundarios conocidos del tratamiento con estas hormonas. Para GH, los efectos secundarios incluyen la retención de sodio y la expansión del volumen extracelular (Ikkos et al., Acta Endocrinol. (Copenhagen), 32: 341-361 [1959]; Biglieri et al., J.C.E.M., 21: 361-370 [1961]), al igual que la hiperinsulinemia y la hiperglucemia. El mayor efecto secundario aparente de IGF-I es la hipoglucemia. Guler et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 86: 2868-2872 (1989). De hecho, la combinación de IGF-I y GH pueden conducir a una reducción de los efectos secundarios indeseados de los dos agentes (p.ej., hipoglucemia para IGF-I e hiperinsulinemia para GH) y a la restauración de los niveles sanguíneos de GH, cuya secreción es reprimida por el IGF-I.

Para la administración parenteral, en una realización, el IGF-I y la GH se formulan generalmente mezclando cada uno al grado de pureza deseado, en una unidad de dosificación unitaria inyectable (solución, suspensión, o emulsión), con un vehículo aceptable farmacéuticamente, es decir, uno que no sea tóxico para los receptores en las dosificaciones y concentraciones utilizadas y sea compatible con otros ingredientes de la formulación. Por ejemplo, la formulación no incluye, preferentemente, agentes oxidantes y otros compuestos conocidos por ser nocivos para los polipéptidos.

Generalmente, las formulaciones se preparan contactando el IGF-I y la GH uniforme e íntimimamente con los vehículos líquidos, o con los vehículos sólidos bien desmenuzados. A continuación, si es necesario, se da forma al producto en la formulación deseada. Preferentemente, el vehículo es un vehículo parenteral, más preferentemente es una solución isotónica con la sangre del receptor. Ejemplos de dichos vehículos incluyen el agua, la solución salina, la solución de Ringer y la solución de dextrosa. Vehículos no acuosos como los aceites fijos y el oleato etílico también son útiles aquí, así como los liposomas.

El vehículo adecuado contiene cantidades menores de aditivos tal como sustancias que aumentan la isotonicidad y la estabilidad química. Dichos materiales no son tóxicos para los receptores en las dosificaciones y concentraciones utilizadas, e incluyen tampones como el fosfato, citrato, succinato, ácido acético y otros ácidos orgánicos o sus sales; antioxidantes como el ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de diez residuos), p.ej., poliarginina o tripéptidos; proteínas como la albúmina sérica, la gelatina, o las inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como la polivinilpirrolidona; aminoácidos como la glicina, el ácido glutámico, el ácido aspártico o la arginina; monosacáridos como los disacáridos y otros carbohidratos incluyendo la celulosa o sus derivados, la glucosa, la manosa, o las dextrinas; agentes quelantes como el EDTA; alcoholes de azúcar como el manitol o el sorbitol; parejas de iones salinos como el sodio; y/o tensoactivos no iónicos como los polisorbatos, los poloxámeros o el PEG.

El IGF-I y la GH se formulan de forma típica individualmente en dichos vehículos a una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml a 100 mg/ml, preferentemente de 1-10 mg/ml, a un pH de aproximadamente 4,5 a 8. El

\hbox{IGF-I}

de tamaño completo se formula preferentemente a un pH de aproximadamente 5-6 y el des(1-3)-IGF-I se formula preferentemente a un pH de aproximadamente 3,2 a 5. La GH está preferentemente a un pH de 7,4-7,8. Se entenderá que la utilización de algunos de estos excipientes, vehículos, o estabilizantes dará lugar a la formación de sales de IGF-I o de GH.

Mientras que la GH puede formularse mediante cualquier procedimiento adecuado, las formulaciones preferidas para GH son las siguientes: para la met-GH (marca Protropin®); la solución pre-liofilizada que contiene 2,0 mg/ml de met-GH, 16,0 mg/ml de manitol, 0,14 mg/ml de solución fosfato y 1,6 mg/ml de fosfato sódico (monobásico y monohidrato), pH 7,8. El vial de met-GH de 5 mg contiene 5 mg de met-GH, 40 mg de manitol y 1,7 mg de fosfato sódico (peso seco) (dibásico anhidro), pH 7,8. El vial de 10 mg contiene 10 mg de met-GH, 80 mg de manitol y 3,4 mg de fosfato sódico (peso seco) (dibásico anhidro), pH 7,8. Para la GH sin met (marca Nutropin®), la solución preliofilizada contiene 2,0 mg/ml de GH, 18,0 mg/ml de manitol, 0,68 mg/ml de glicina, 0,45 mg/ml de fosfato sódico y 1,3 mg/ml de fosfato sódico (monobásico monohidrato), pH 7,4. El vial de 5 mg contiene 5 mg de GH, 45 mg de manitol, 1,7 mg de glicina y 1,7 mg totales de fosfato sódico (peso seco) (dibásico anhidro), pH 7,4. El vial de 10 mg contiene 10 mg de GH, 90 mg de manitol, 3,4 mg de glicina y 3,4 mg de fosfatos sódicos (peso seco) (dibásico anhidro).

Alternativamente, puede utilizarse una formulación líquida para hGH de marca Nutropin®, por ejemplo: 5,0 \pm 0,5 mg/ml de rhGH; 8,8 \pm 0,9 mg/ml de cloruro sódico; 2,0 \pm 0,2 mg/ml de Polisorbato 20; 2,5 \pm 0,3 mg/ml de fenol; 2,68 \pm 0,3 mg/ml de citrato sódico dihidrato; y 0,17 \pm 0,02 mg/ml de ácido cítrico anhidro (la proporción total de citrato sódico anhidro/ácido cítrico es de 2,5 mg/ml o de 10 mM); pH 6,0 \pm 0,3. Esta formulación se coloca de forma adecuada en un vial de 10 mg, que se rellena con 2,0 ml de la formulación anterior en un vial de vidrio de 3 cc. Alternativamente, se puede colocar un cartucho que contenga la formulación anterior en un inyectable, para inyectar la GH líquida al paciente.

Mientras que el IGF-I se puede formular de cualquier manera adecuada para la administración, la formulación preferida contiene aproximadamente 2-20 mg/ml de IGF-I, aproximadamente de 2-50 mg/ml de un osmolito, aproximadamente de 1-15 mg/ml de un estabilizante y una solución tamponada a aproximadamente un pH de 5-5,5. Preferentemente, el osmolito es una sal inorgánica a una concentración de aproximadamente 2-10 mg/ml, o un alcohol de azúcar a una concentración de aproximadamente 40-50 mg/ml, el estabilizante es el bencil alcohol o el fenol, o ambos, y la solución tamponada es una solución tamponada de sal de ácido acético. Más preferentemente, el osmolito es el cloruro sódico y la sal de ácido acético es el acetato sódico. Aún más preferentemente, la cantidad de IGF-I es de aproximadamente 8-12 mg/ml, la cantidad de cloruro sódico de aproximadamente 5-6 mg/ml, la cantidad de alcohol bencílico es de aproximadamente 8-10 mg/ml, la cantidad de fenol es de aproximadamente 2-3 mg/ml y la cantidad de acetato sódico de aproximadamente 50 mM, de modo que el pH es de aproximadamente 5,4. Adicionalmente, la formulación puede contener aproximadamente 1-5 mg/ml de un tensoactivo, preferentemente el polisorbato o el poloxámero, en una cantidad de aproximadamente 1-3 mg/ml.

Además, el IGF-I y la GH, preferentemente el IGF-I de tamaño completo, pueden formularse juntos en un vehículo adecuado para formar una composición farmacéutica que preferentemente no contenga células. En una realización, el tampón utilizado para la formulación dependerá de que la composición se emplee directamente después del mezclado o se guarde para una utilización posterior. Si se utiliza inmediatamente después del mezclado, se puede formular una mezcla de IGF-I de tamaño completo y GH en manitol, glicina y fosfato a pH 7,4. Si la mezcla se guarda, ésta se formula en un tampón a un pH de aproximadamente 6, como el citrato, con un tensoactivo que aumente la solubilidad de la GH a este pH, como el polisorbato 20 al 0,1% o el poloxámero 188. La preparación final puede ser un líquido estable o un sólido liofilizado.

La composición combinada preferida comprende el IGF-I y la GH en una proporción aproximada de IGF-I:GH de entre 1:1 y 100:1 (p/p), de aproximadamente 0,05-0,3 mM de un osmolito, de aproximadamente 0,1-10 mg de un estabilizante, de aproximadamente 1-5 mg/ml de un tensoactivo y aproximadamente 5-100 mM de un tampón a aproximadamente pH 5-6. Preferentemente, el osmolito es una sal inorgánica y el tensoactivo es no-iónico. Más preferentemente, la sal inorgánica es el cloruro sódico o el cloruro potásico, el estabilizante es el fenol o el bencil alcohol, el tensoactivo es el polisorbato o el poloxámero, el tampón es el acetato sódico, o el citrato sódico, o ambos. Y las cantidades de IGF-I y GH son de aproximadamente 2-20 mg/ml y 0,2-10 mg/ml, respectivamente, con una proporción en peso de IGF-I:GH de aproximadamente 1:1 y de 50:1. Aún más preferentemente, la cantidad de IGF-I es de aproximadamente 5-10 mg/ml, la cantidad de GH de aproximadamente 1-5 mg/ml, la proporción en peso de IGF-I:GH de aproximadamente 1:1 a 4:1, la cantidad de cloruro sódico es de aproximadamente 5-7 mg/ml, la cantidad de fenol es de aproximadamente 0,13 mg/ml, la cantidad de bencil alcohol es de aproximadamente 6-10 mg/ml, el tensoactivo es polisorbato en una cantidad de aproximadamente 1-3 mg/ml, la cantidad de acetato sódico es de aproximadamente 2,5-4 mg/ml y la cantidad de citrato sódico es de aproximadamente 0,1-1 mg/ml.

El IGF-I y la GH a utilizar para la administración terapéutica son preferentemente estériles. La esterilidad se logra mediante filtración a través de una membrana (p.ej., membranas de 0,2 micrones). Las composiciones de IGF-I y GH se colocan generalmente en un recipiente con una vía de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o un vial de solución intravenosa con un tapón agujereable por una aguja de inyección hipodérmica.

El IGF-I y la GH se guardarán generalmente en recipientes de una sola dosis o de dosis múltiples, por ejemplo, ampolladas o viales sellados, como una solución acuosa, o una formulación liofilizada para su reconstitución. Por ejemplo, para una formulación liofilizada, se rellenan viales de 10 ml con 5 ml de soluciones acuosas de IGF-I y GH al 1% (p/v) filtradas estérilmente, y la mezcla resultante se liofiliza. La solución de infusión se prepara reconstituyendo la solución liofilizada de IGF-I y GH utilizando agua estéril para inyección.

La invención se comprenderá mejor gracias a los siguientes ejemplos. Sin embargo, no deben considerarse limitantes del ámbito de la invención. Toda la literatura y las referencias de patentes se han incorporado aquí expresamente mediante referencias bibliográficas.

Ejemplo I

En este ejemplo, las concentraciones de GHBP se cuantificaron en un gran número de muestras de niños con talla baja con etiologías definidas de deficiencia en GH (GHD o TS) o con ISS, y se compararon con los niveles de GHBP en los controles normales.

Individuos controles

Para establecer el intervalo normal para la GHBP en suero, se analizaron muestras de 773 niños, 366 hembras y 407 varones. Las edades se hallaron en el intervalo de 3 a 16 años; en algunos casos, la edad para un individuo determinado se aproximó al año exacto. La mayoría de las muestras se obtuvieron de una población escolar normal a través de un programa de rastreo de detección de anticuerpos contra células pancreáticas-\beta (Pasco Co. School System, Florida) y muestras adicionales fueron proporcionadas por el Dr. J. Sotos de Children's Hospital of Columbus, Ohio y el Dr. Rebecca Kirkland del Baylor College of Medicine, Houston, Texas. Los niños estaban sanos, con lo que se cree representan una sección transversal de la población americana en relación a la estatura.

Individuos con retraso del crecimiento

Se recogieron muestras de suero de niños con retraso del crecimiento (edades de 1 a 7 años) en la evaluación niveles basales de 776 individuos inscritos en un proyecto de vigilancia de poscomercialización, el NCGS. Las muestras fueron proporcionadas por 106 de los centros participantes en este estudio.

Todos los niños con GHD e ISS incluidos en el análisis tenían alturas que eran 2 o más SD por debajo de la media para la edad y sexo. Los individuos fueron clasificados como GHD por el médico participante en el estudio. Ninguno de los niños con GHD tuvo niveles de GH endógena o de estimulación máxima por encima de 10 \mug/l, según los médicos (utilizando un ensayo no especificado) o cuantificado por Genentech Inc., utilizando un ensayo inmunoradiomimético monoclonal doble (Tandem-R HGH, Hybritech, San Diego, CA). Se excluyen los individuos con causas orgánicas de GHD, como tumores del sistema nervioso central (CNS).

Los pacientes clasificados como ISS en la base de datos NCGS fueron designados como tales por el médico participante en el estudio (utilizando diversos términos), o presentaron un nivel de GH estimulada o endógena

\hbox{> 10  \mu g/ml}

sin etiología orgánica indicativa de talla baja. Los pacientes con TS fueron identificados por los médicos participantes e incluyen aquellos individuos con formas diversas de mosaicismo. Ninguno de los individuos incluidos había recibido con anterioridad ninguna forma de terapia con GH. Cuantificaciones de GHBP

La GHBP se cuantificó por LIFA, tal como se describió anteriormente. En resumen, se recubrieron placas de microtitulación de 96 pocillos (Corning Glass Works, New York) con un anticuerpo monoclonal dirigido contra la GHBP (MAb 263, Agen, Australia), mediante incubación durante toda la noche a 4ºC con 100 \mul/pocillo del anticuerpo a 10 \mug/ml en tampón fosfato 50 mmol/l, pH 9,6. Los pocillos recubiertos se bloquearon con 150 \mul de PBS, pH 7,2, que contenía albúmina sérica bovina (BSA) (5 g/l) y luego se lavaron. Los estándares (hGHBP recombinante) o las muestras (50 \mul/pocillo) se repartieron en los pocillos recubiertos junto con 50 \mul/pocillo de la hGH recombinante (200 \mug/l, Genentech, Inc.) y de la inmunoglobulina G de ratón (10 g/l; Fitzgerald Industries, Chelmsford, MA).

Las placas se sellaron, se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas con agitación ligera y se lavaron antes de añadir un anticuerpo anti-GH monoclonal (MAb MCB, Genentech, Inc.) conjugado con la peroxidasa de rábano (100 \mul/pocillo). Después de una incubación de 2 horas a temperatura ambiente, las placas se lavaron seis veces con un tampón de lavado. Se añadió una solución de sustrato recién preparada (0,4 g de o-fenilendiamina dihidrocloruro en un litro de PBS más 0,4 ml de peróxido de hidrógeno al 30%) a las placas (100 \mul/pocillo) y la incubación se llevó a cabo en la oscuridad durante 15 minutos y a temperatura ambiente. La reacción se paró mediante adición de 100 \mul de 2,25 mol/l de ácido sulfúrico y se determinó la absorbancia a 490 nm. El intervalo de detección en el LIFA fue de 15,6 a 1000 pmol/l. Los coeficientes intra- e inter-ensayo fueron aproximadamente del 7% y 11%, respectivamente. Todas las muestras se cuantificaron por duplicado.

Cuantificaciones de GH

Para valorar la secreción de GH espontánea en los distintos grupos, se cuantificaron las concentraciones de GH en muestras de suero tomadas a intervalos de 20 minutos durante 12 horas (8 de la tarde a 8 de la mañana) en 851 de los niños. Los valores medios se calcularon para cada individuo. Las concentraciones de GH se cuantificaron utilizando un ensayo inmunorradiométrico basado en anticuerpos (IRMA), con un límite de detección de 0,5 \mug/l (Tandem-R HGH, Hybritech).

Cuantificaciones de IGH-I

Las concentraciones de IGF-I se cuantificaron en las muestras de suero obtenidas de 858 niños, en la toma de muestras de GH durante toda la noche para conocer los niveles basales, utilizando RIA después de la extracción con etanol ácido (equipo de RIA de IGF-I, Nicholas Institute, San Juan Capistrano, CA).

Análisis estadísticos

La altura estandarizada (SD) se calculó a partir de la media específica para la edad y sexo y las desviaciones estándares se derivaron de los datos normativos del National Center for Health Statistics (NCHS) para los niños de América. Hamill y col., Am. J. Clin. Nutrition, 32:607-629 (1979). El índice de masa corporal (IMC) se calculó utilizando la fórmula: peso (Kg)/[altura (m^{2})]. Se calcularon los valores para la media y la SD de la edad, la SD de la altura y el IMC para niños con retraso del crecimiento a partir de los resultados publicados en los formularios de inscripción NCGS.

Las medias y las desviaciones estándares para las concentraciones de GHBP (Tablas I y III) y para la media de concentraciones de GH de 12 h (Tabla IV) se calcularon después de una transformación logarítmica debida a la naturaleza sesgada de los resultados. Los antilogaritmos de la media, media \pm 2 SD (GHBP, Tabla I) y la media \pm 1 SD (GHBP, Tabla III y la media 12-h GH, Tabla IV) se calcularon entonces para proporcionar los valores listados. Los efectos de la edad y sexo en las concentraciones logarítmicas de GHBP en el grupo control se valoraron mediante el análisis de la varianza (ANOVA).

El cálculo de los valores de GHBP estandarizados (valor de SD) se basó en las medias y en las SD asociadas de los resultados de individuos controles agrupados por sexo y edad, utilizando la ecuación siguiente. Para una concentración de GHBP en un individuo de 3-15 años de edad (intervalo de edad para el que se evaluaron las muestras control):

valor \ de \ SD \ = \ \frac{Log \ (GHBP) \ - \ media \ (log \ (GHBP) \ | \ edad, \ sexo)}{SD \ (log \ (GHBP) \ | \ edad, \ sexo)}

en donde, (log (GHBP) | edad, sexo) es el valor logarítmico de la media de GHBP para los individuos controles de la misma edad y sexo y la SD (log (GHBP) | edad, sexo) es la SD asociada. Después de la conversión en valores de SD, las concentraciones séricas de GHBP en los niños diagnosticados con GHD, ISS y TS se compararon unos con otros y con los controles del mismo sexo mediante ANOVA. El valor de SD de la GHBP también se calculó basándose en la edad ósea, en lugar de la edad cronológica.

Cuando se realizaron comparaciones múltiples de cualquier variable entre los grupos, se aplicaron los ajustes de Bonferroni a los valores p para una significación estadística con el fin de mantener un nivel global de 0,05 de significación del test. Los valores p nominales para las comparaciones estadísticas significativas se incluyen en el texto.

Resultados

El intervalo normal (media + 2 SD) para las concentraciones de GHBP de suero en los niños entre 3 y 15 años de edad se muestran en la Tabla I. Debido a un problema técnico, los resultados no están disponibles para los niños de 5 años de edad. Tanto la edad como el sexo tuvieron un efecto significativo en las concentraciones de GHBP. Las hembras presentaron concentraciones de GHBP mayores que los varones (p < 0,0001). En ambos sexos, las concentraciones de GHBP incrementaron con la edad (p < 0,0001).

TABLA I

2

La Tabla II muestra la media (\pmSD) de la edad, la SD de la altura y el IMC para cada grupo de individuos (no se dispuso de resultados de la altura y el IMC de todos los individuos control). La edad media fue similar en todos los grupos (aproximadamente 11 años). Los valores de la altura media no fueron diferentes estadísticamente entre las mujeres GHD, ISS y TS o entre los hombres GHD e ISS. Los valores medios de IMC fueron significativamente inferiores en los grupos ISS comparados con los otros grupos con retraso del crecimiento tanto en hembras

\hbox{(p < 0,0137)}

como en varones (p < 0,0001). TABLA II

4

Las Figuras 1A-1E muestran las concentraciones de GHBP séricas en niños con GHD, ISS y TS comparadas con el intervalo normal para el mismo sexo (-2 SD a + 2SD). Las concentraciones medias de GHBP correspondientes y los valores de SD de la media en todos los grupos se enumeran en la Tabla III.

Para los varones con GHD o ISS, el valor de SD de GHBP media fue inferior al del grupo de hombres control (ambos con una p < 0,0001) y la SD media en varones con ISS fue inferior a la de varones con GHD (p < 0,0001). La SD media para las hembras con ISS o GHD fue inferior a la del grupo de hembras control (p < 0,0001 y p = 0,0046, respectivamente). Además, la SD media en hembras ISS fue inferior al de hembras GHD (p = 0,0039). Cuando los grupos GHD se limitaron a individuos con niveles de estimulación máxima de GH \leq 5 \mug/l (n = 23), el valor de SD de GHBP no fue significativamente distinto al del promedio control.

Debido a diferencias en el IMC entre los grupos GHD e ISS y a la relación reconocida entre niveles de IMC y de GHBP, se realizó un análisis de covarianza (ANCOVA) utilizando IMC como una covariante para determinar si la diferencia entre los grupos de GHBP era independiente de las diferencias en IMC. En ambos, individuos hembras y varones, las diferencias de GHBP entre los grupos GHD e ISS continuaron siendo significativas (p < 0,02).

En el 91% de los individuos varones ISS y en el 92% de los individuos hembras ISS, las concentraciones de GHBP estuvieron por debajo de los controles emparejados por edad y sexo. La diferencia entre los individuos ISS y GHD fue especialmente impactante en los varones, donde 79 de 394 (20,1%) con ISS presentaron valores > 2 SD por debajo de la media, comparado con sólo 6 de 69 (87%) varones con GHD.

Al contrario que los individuos hembras con GHD o ISS, la SD de GHBP media en niñas con TS no se diferenció significativamente del de las hembras control. El valor de SD de GHBP calculado para todos los grupos con retraso del crecimiento utilizando la edad ósea en lugar de la edad cronológica mostró poca diferencia (Tabla III).

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA III

5

Para el promedio de las concentraciones de GH de 12 h obtenidas por muestreo durante toda la noche (Tabla IV), el análisis ANCOVA con etiología, sexo y edad demostró que únicamente la etiología tenía un impacto significativo sobre el nivel promedio de GH de 12 horas. Tal como se esperaba, el valor promedio en los niños con GHD fue significativamente inferior al de controles (p < 0,0001). El valor en los individuos hembras con TS fue superior que el de hembras GHD (p < 0,0001), e inferior al de hembras ISS o controles (ambos p < 0,002). La concentración media de GH de 12 h en individuos con ISS no fue significativamente distinta a la de controles. Sin embargo, los individuos ISS con niveles de GHBP > 2 SD por debajo de la media tenían valores promedios de GH de 12 h superiores a los de individuos con niveles de GHBP normales (2,8 versus 2,3 \mug/l, p < 0,005). El promedio de los niveles de IGF-I en pacientes GHD fue inferior al de los controles para los pacientes ISS y TS.

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA IV

6

Las concentraciones de GHBP séricas en algunos niños con ISS son inferiores a las de niños control emparejados por edad. En comparación con los controles, los niños con GHD también presentaron concentraciones de GHBP inferiores, pero la reducción fue menos pronunciada que en los controles con ISS. En chicas con TS, afección en la que el diagnóstico se basa en la presencia de una anomalía cromosómica y en consecuencia el diagnóstico es absoluto, los niveles de GHBP no fueron distintos de los hallados en el grupo control, lo que indica que los niveles de GHBP no se correlacionan simplemente con la estatura baja.

Además de las poblaciones bien definidas geográfica y genéticamente con una acción de GH periférica deficiente, como los pacientes con el síndrome de Laron y los pigmeos Africanos, pueden haber individuos con formas más sutiles de insensibilidad a la GH, representando seguramente una variedad de defectos moleculares. A pesar de la heterogeneidad probable en las causas del retraso de crecimiento en niños con ISS, los resultados anteriores muestran que como grupo tienen concentraciones de GHBP séricas reducidas, y un subgrupo significativo (20%) tiene niveles de GHBP 2 o más SD por debajo de la media normal para la edad y sexo.

Los niños con ISS que se estudiaron no se diferenciaron del grupo control en términos de secreción de GH y presentaron concentraciones de GHBP significativamente inferiores a los grupos con GHD. Los pacientes definidos como GHD, según el nivel de corte arbitrario de GH máxima < 10 \mug/l, presentaron niveles de GHBP inferiores a los controles. Sin embargo, en pacientes con GH máxima \leq5 \mug/l, la SD de GHBP media fue superior a la del grupo GHD con GH > 5 \mug/l y no fue distinta a la de controles.

Ejemplo II

Pacientes seguidos en un estudio de vigilancia poscomercialización, el National Cooperative Growth Study
(NCGS), se estudiaron para comparar las tasas de crecimiento en pacientes GHD con las de pacientes ISS tratados con varias dosis de GH. Los pacientes ISS incluyen los de niveles normales de GHBP y los de niveles bajos de GHBP. Los resultados para los pacientes ISS, que se muestran en la Figura 2, demuestran que para los niños tratados con 0,25 + 0,025 mg/Kg/semana de GH, comparado con 0,20 mg/Kg/semana o menos, se obtuvo una tasa de crecimiento esencialmente superior. La comparación con los pacientes GHD pone de manifiesto que las dosis normales de GH de hasta 0,20 mg/Kg/semana no fueron suficientes para permitir que los pacientes presentaran un intervalo de la tasa de crecimiento media cercano al observado en los pacientes GHD; sin embargo, las dosis de 0,25 + 0,025 mg/Kg/semana dieron como resultado una tasa de crecimiento medio más cercana al intervalo observado en los pacientes GHD (aproximadamente 10 cm/año). Por lo tanto, una dosis de GH superior a aproximadamente 0,20 mg/Kg/semana es adecuada por lo menos para algunos pacientes identificados por la presente invención.

\newpage

Ejemplo III

Los pacientes ISS (definidos por un nivel máximo de GH > 10 \mug/l y SD de la altura <-2) tienen niveles de GHBP bajos, comparados con los controles normales determinados por LIFA. No fue así en el caso de niños de talla baja con GHD o TS.

Para valorar la utilidad del ensayo GHBP en la evaluación de niños con talla baja, los pacientes ISS se agruparon de acuerdo con sus valores de SD de GHBP. Los pacientes con SD GHBP baja, definida como <-2, se compararon con pacientes con niveles de GHBP normales (SD de GHBP >-2) para determinar si existían evidencias de una sensibilidad deficiente al tratamiento con GH en el primer grupo.

Población de pacientes

Se recogieron muestras de suero en 96 sitios de 511 niños con ISS, que a continuación se trataron con hGH, marca Protropin® (con una dosis media \pm SD de GH de 0,26 + 0,07 mg/Kg/semana, mediante inyección parenteral para los pacientes con resultados de crecimiento de un año, con dosis y programa de GH determinados a discreción de cada médico investigador), inscribiéndose los pacientes en el NCGS. Para ser incluidos en este estudio, los pacientes debían tener una GH de estimulación máxima de > 10 \mug/l, SD de altura \leq-2 y ninguna otra etiología descrita de talla baja. Los resultados de las cuantificaciones de GHBP no se conocieron antes de la iniciación de la terapia con GH. Para los análisis implicando una respuesta de crecimiento al tratamiento con GH, sólo se incluyeron pacientes prepúberes.

Procedimientos de ensayo

La GHBP se analizó utilizando el LIFA, tal como se describe en Carlsson y col., supra. Se utilizaron los anticuerpos monoclonales contra la GHBP (MAb 263) y GH (MAb MCB). Los valores de GHBP se estandarizaron para la edad y sexo utilizando los resultados normativos para el LIFA basados en la muestras proporcionadas por el Dr. Thomas Merimee en la Universidad de Florida, División de Endocrinología y Metabolismo, Health Science Center, código postal 100226, Gainesville, Floria 32610-0226 y por los Drs. Sotos y Kirkland anteriormente mencionados. Estos valores se han publicado anteriormente. Carlsson y col., J.C.E.M., 78:1325-1330 (1994). Las muestras de toda la noche para GH se analizaron utilizando un ensayo inmunorradiométrico (Tandem-R HGH, Hybritech, San Diego, CA). Los valores publicados para los tests de la estimulación de GH se cuantificaron utilizando diversos ensayos de GH.

El IGF-I se cuantificó mediante radioinmunoensayo después de la extracción con ácido-etanol (IGF-I mediante extracción, Nichols Institute, San Juan Capistrano, CA) y se estandarizaron para la edad y sexo utilizando los resultados normativos proporcionados.

Procedimientos estadísticos

Las alturas se estandarizaron para la edad y sexo y los pesos se estandarizaron para la altura y sexo utilizando las normas derivadas de los resultados publicados para los niños de Norte América. Hamill y col., Am. J. Clin. Nutrition, 32:607-629 (1979). La SD de las alturas de los progenitores para ambos sexos se calculó según los percentiles de altura para adultos normales. Hamill y col., supra.

La regresión lineal múltiple se utilizó para determinar qué variables causales estaban relacionadas linealmente con la SD de GHBP, si las hubiera. Además, los individuos se dividieron en dos grupos según su SD de GHBP

\hbox{( \leq 2 SD
y >-2 SD),}

para determinar el grado de significación, si lo hubiera, de los valores de GHBP que se hallan por debajo del intervalo normal. Los dos grupos se compararon uno con otro con respecto a las medias o medianas de algunos covariantes (ver la Tabla VI). Entre los grupos, se realizaron tests univariantes de significación utilizando uno de los tres tests: el test t (para las variables de distribución Gaussiana), el test de la suma de rangos de Wilcoxon (para variables de distribución no-Gaussiana), o el test de la Chi-cuadrado (para variables categóricas). Para el ajuste de múltiples comparaciones, los valores de p < 0,005 se consideraron estadísticamente significativos. El test de ANCOVA se utilizó para examinar las diferencias entre los dos grupos de GHBP después de controlar para otras variables significativas. Resultados

Los pacientes en el grupo de GHBP baja fueron más jóvenes y presentaron una SD para el peso e IMC inferior a la del grupo de GHBP normal (Tabla V). La SD de la altura media fue de -2,9 en ambos grupos, con valores en el intervalo de -5,8 a -2,0. Aproximadamente tres cuartas partes de los pacientes fueron varones; una distribución de sexos similar se observó en la base de datos del NCGS total. August y col., J. Pediatr., 116:899-903 (1990). El 72% de los pacientes fueron prepúberes en el nivel basal.

TABLA V

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Hubo 101 pacientes con un valor de SD de GHBP \leq-2 (media -2,5) y 410 pacientes con un valor de SD de GHBP >-2 (media -0,9) (Tabla VI). Los dos grupos presentaron niveles de GH media y máxima comparables; sin embargo, estos valores son difíciles de evaluar debido a la utilización de diversos ensayos de GH. El promedio para la media de las concentraciones de GH de 12 horas (utilizando el ensayo de Hybritech) fue significativamente superior en el grupo de GHBP bajo, mientras que la SD de IGF-I fue significativamente inferior en dicho grupo (ambos con una

\hbox{p = 0,0001,}

Tabla VI).

La Figura 3 muestra que los que tienen una SD de GHBP menor también tienen una SD de IGF-I menor (Fig. 3A) y niveles de GH de 12h superiores. Entre todos los pacientes ISS, la SD de GHBP se correlacionó positivamente con la SD de IGF-I (r = 0,285, p = 0,0001) y negativamente con la GH de 12 h media (r = -0,17, p = 0,0001).

El análisis de ANCOVA, que controla las diferencias según la edad, SD del peso en relación a la altura y media de GH de 12-h, mostró que los pacientes con GHBP <- 2 todavía tenían valores de SD de IGF-I significativamente inferiores que los que tienen una SD de GHBP >-2 (p = 0,0001). De forma similar, el grupo de GHBP baja presentaban una media de GH de 12 horas superior significativamente a la del grupo de GHBP normal (p = 0,0001) después de controlar la edad, el SD del peso según la altura y la SD de IGF-I.

TABLA VI

8

Los análisis de la tasa de crecimiento se limitaron a los pacientes que permanecieron prepúberes durante los períodos de tratamiento considerados. No hubo correlaciones lineales significativas de la SD de GHBP ni tampoco de la tasa de crecimiento ni un cambio en la SD de la talla durante cada uno de los tres primeros años de tratamiento. La tasa de crecimiento media pre-tratamiento fue aproximadamente de 4 cm/año a pesar de la SD de GHBP. La tasa media de crecimiento durante el primer año de terapia con GH fue aproximadamente de 8 cm/año. La Figura 4 muestra las tasas de crecimiento para los pacientes pre-púberes tratados con GH con respecto a la SD de GHBP. No hubo correlación estadísticamente significativa entre los dos (r = 0,047, p = 0,55, n = 166). La figura muestra que los pacientes que pueden ser tratados por la presente invención son los que se hallan por debajo del área sombreada, siempre que tengan también la GH, IGF-I y los requerimientos de talla indicados para esta subpoblación. Los resultados indican que los pacientes con niveles bajos de SD de GHBP y que cumplen con el criterio de la presente invención responden a la administración farmacológica de GH.

Las Figuras 5 y 6 comparan las tasas de crecimiento durante el pre-tratamiento y el primer año de tratamiento de los pacientes (y en la Fig. 5, también se comparan las tasas de crecimiento del segundo año). Estas figuras muestran que existe un incremento claro en el crecimiento de los pacientes tratados con GH, independientemente de que la SD de GHBP de un paciente determinado sea -2 o >-2.

La Tabla VII muestra los resultados de la respuesta del crecimiento para el grupo con una SD de GHBP baja comparado con el grupo que presenta una SD de GHBP normal. En los dos grupos y durante el primer año de terapia, la dosis media de GH y los programas de inyección fueron similares. No hubo diferencias significativas entre los grupos para la tasa de crecimiento del pre-tratamiento, o para las tasas de crecimiento durante los primeros años de terapia con GH. El cambio medio en la SD de la altura tampoco fue estadísticamente distinto entre los dos grupos; el incremento medio en los que se realizó un seguimiento durante 4 años fue de 1,5 \pm 0,6 (n = 13) en el grupo de GHBP baja y de 1,7 \pm 0,6 (n = 21) en el grupo de GHBP normal.

TABLA VII

9

Aunque la estatura corta puede definirse de diversas maneras, como por ejemplo estar por debajo de un percentil determinado según las normas de estatura estándar, los pacientes en este estudio representan un grupo más selecto. A todos estos pacientes se les prescribió la terapia con GH y en consecuencia pasaron por un proceso de cribare y selección por los médicos participantes. Además, los pacientes con una SD de altura de aproximadamente -2 no se incluyeron en este estudio. El grupo resultante presentó una SD de altura media de -2,9, un retraso de edad ósea de 2,4 años y una tasa de crecimiento media de 4,2 cm/año, similar a la de los pacientes publicados con ISS y tratados con GH. Hopwood y col., J. Pediatr., 123:215-222 (1993); Albertsson-Wikland, Acta Paediatr. Scand. Supl.,

\hbox{343:77-84 81988).}

En este grupo seleccionado, se hallo que algunos pacientes presentaban niveles bajos de GHBP en suero, después de la estandarización por edad y sexo y después del ajuste por la edad ósea. Carlsson y col., J.C.E.M., 78, supra.

Se demostró que la GHBP se derivaba del mismo gen que el GHR y compartía identidad de secuencia con el dominio extracelular. Leung y col., Nature, 330:537-543 (1987). Los niveles de GHBP en suero cuantificados utilizando el ensayo funcional fueron bajos o indetectables en los pacientes con GHIS completo. Fielder y col., J.C.E.M., 74:743-750 (1992). En este ejemplo, el intervalo normal de los niveles de GHBP en niños se determinó para la edad y sexo y se demostró que los niveles de GHBP bajos observados en pacientes con ISS fueron significativamente inferiores a los observados en individuos normales o deficientes en GH, o con el síndrome de Turner. Carlsson y col., J.C.E.M, 78, supra.

Se obtuvieron perfiles de muestreo seriado de 12 horas durante la noche para GH en todos los niños de este estudio y los niveles medios fueron normales, lo que sugiere, sin limitarse a ninguna teoría, que la disfunción neurosecretora no estaba presente en la mayoría de los pacientes. Los niveles medios de GH de 12 horas mostraron una correlación negativa con la SD de GHBP media, tal como se ha descrito en los individuos normales. Martha y col., J.C.E.M., 73:175-181 (1991). Sin embargo, la SD de IGF-I se correlacionó positivamente con la SD de GHBP. En consecuencia, los pacientes con niveles de GHBP inferiores presentaron niveles de GH superiores y todavía niveles de IGF-I inferiores, consistente con la insensibilidad a la GH.

Un indicador significativo de la concentración de GHBP es la composición corporal, que se valoró utilizando tanto el IMC como los estándares de peso para la altura y edad. En un análisis de ANCOVA, se halló que la GHBP seguía siendo un indicador significativo para pronosticar la SD del promedio de GH de 12 horas y de IGF-1 después de ajustar según la edad y para la SD del peso según la altura.

Los resultados de crecimiento disponibles para pacientes prepúberes incluidos en las bases de datos del NCGS no pusieron de manifiesto ninguna correlación lineal significativa entre la SD de GHBP de nivel basal y la tasa de crecimiento del pre-tratamiento o la SD de la altura a nivel basal. Sin limitarse a ninguna teoría, una explicación posible es que la tasa de crecimiento y la altura se utilizan comúnmente para seleccionar los pacientes a tratar con GH, y en consecuencia son uniformemente bajas en esta población de pacientes.

Una observación interesante fue la falta de correlación de la SD de GHBP y la respuesta de crecimiento a la terapia con GH. Debido a que los niveles de secreción de GH y GHBP parecen estar correlacionados negativamente en niños con crecimiento normal (Martha y col., supra), puede proponerse un intervalo normal tal como se muestra en la Figura 7. Los que presentan niveles de GH excesivos en relación con sus niveles de GHBP se esperaría que tuvieran un crecimiento excesivo, y los que presentan niveles de GH demasiado bajos para sus niveles de GHBP tendrían un peor crecimiento. Actualmente, la GHD está definida arbitrariamente y se basa únicamente en las cuantificaciones de la secreción de GH; es posible que algunos pacientes con niveles de GH por encima de este umbral arbitrario (y dentro del ámbito de la presente invención) tengan cantidades inadecuadas de GH en relación con sus niveles de GHBP bajos, dando como resultado un crecimiento pobre. La administración exógena de GH a este subgrupo de pacientes (con niveles de GHBP e IGF-I inferiores y niveles medios de GH de 12-horas superiores comparados con el normal, que sugieren una insensibilidad parcial a GH) se esperaría que sus niveles de GH circulantes alcanzaran niveles más adecuados para sus niveles GHBP bajos, con lo que se solventaría parcialmente su estado de resistencia.

Ejemplo IV Introducción

La etiología de un fallo en el crecimiento en la mayoría de los niños bajos sin GHD (niños con estatura baja no deficientes en GH) está poco definida. Estos niños, por lo demás normales, con ISS producen cantidades normales de GH en respuesta a la estimulación farmacológica, pero son incapaces de presentar un patrón de crecimiento normal. Lippe y Nakamoto, Rec. Prog. Horm. Res., 48:179-235 (1993). Se han propuesto diversos defectos relacionados con la GH para justificar su fallo del crecimiento, incluyendo la disfunción neurosecretora (Spiliotis y col., J. Am. Med. Assoc., 251:2223-2230 [1984]; Zadik y col., Pediatrics, 76:355-360 [1985]) y la GH reactiva inmunológicamente pero inactiva biológicamente. Kowarski y col., J.C.E.M., 47:461-464 (19789; Valenta y col., N. Engl. J. Med., 31:214-217 (1985). Mientras que estos mecanismos pueden justificar el fallo de un crecimiento normal en algunos pacientes ISS, la mayoría no parece tener defectos demostrables en la secreción o función de la GH. Lanes, Am. J. Dis. Child., 143:1284-1286 (1989); Llondo y col., J.C.E.M., 70:1445-1451 (1990).

Una posibilidad alternativa es que los pacientes ISS tengan patrones secretores normales de GH bioactiva y que el defecto radique en la capacidad de las células diana para responder a la GH. Dichos defectos podrían hallarse al nivel del GHR o de los mediadores de la señalización de GH, como IGF-I o el receptor de IGF-I. Las alteraciones en el gen de IGF-I son poco comunes en los trastornos del crecimiento. Lajara y col., J.C.E.M., 70:687-692 (1990). La resistencia a la GH podría ser debida a la reducción de la afinidad del GHR por la GH, a la capacidad deficiente para propagar una señal en respuesta a la unión a GH, o a los defectos causantes de la reducción del número de receptores de superficie celular. La GHBP de alta afinidad presente en el suero humano es idéntica al dominio extracelular del GHR y se piensa que se produce a partir del receptor mediante corte proteolítico. Sotiropulos y col., Endocrinol., 132:1863-1865 (1993). Los niveles inmunofuncionales de GHBP (Carlsson y col., J.C.E.M., 73, supra) están por debajo de la media en el 90% de los pacientes ISS y están más 2 SD por debajo de la media en el 20% de estos niños (Carlsson y col., J.C.E.M., 78, supra; Mauras y col., Metabolism, 43:357-359 [1994]). Sin limitarse a ninguna teoría, se debe indicar que en pacientes ISS pueden presentarse anomalías en el GHR que reduzcan la cantidad de su GHBP funcional.

Se postula un fenotipo de GHIS parcial a partir de la observación en el Ejemplo III de que los pacientes ISS con niveles bajos de GHBP tienen niveles de IGF-I inferiores y niveles medios de GH de 12-horas superiores cuando se comparan con los niveles de GHBP normales. Sin limitarse a ninguna teoría, ello sugiere una deficiencia en la vía de señalización por el GHR, que conduce a una producción de IGF-I reducida y a una retro-alimentación negativa reducida de IGF-I en la secreción de GH. La mayoría de niños ISS responden al tratamiento con GH recombinante con un incremento en la tasa de crecimiento (Hopwood y col., supra); sin embargo, esta respuesta es inferior a la observada en los pacientes con GHD (pacientes deficientes en GH) tratados con la misma dosis de GH, lo que de nuevo sugiere, como teoría, una insensibilidad parcial a GH en los pacientes ISS.

La elevada frecuencia de mutaciones inactivantes en el gen GHR en la enfermedad de GHIS completa o síndrome de Laron (LS) indica que la mayoría de casos con GHIS completa puede explicarse por la falta de funcionalidad del GHR. La mayor parte de pacientes LS carecen de actividad GHBP detectable en su sangre (Baumann y col., J.C.E.M., 65:814-816 [1987]; Daughaday y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:4636-4640 [1987]), y cuando se la cuantifica, presentan niveles bajos o ausentes de unión específica a GH en los microsomas hepáticos. Eshet y col., Isr. J. Med. Sci., 20:8-11 (1984). Existen 17 mutaciones GHR caracterizadas asociadas con LS y concentradas en el dominio extracelular de la proteína (revisado por Rosenfeld y col., Endocrinol. Rev., 15:369-390 [1994]).

Para determinar si el fenotipo más suave de GHIS parcial podía esta causado por mutaciones menos perjudiciales en el GHR, y si los niveles reducidos de GHBP circulante en la población ISS podían servir como marcadores para GHIS parcial, y por lo tanto podían indicar mutaciones en el GHR, se seleccionó un subgrupo de pacientes ISS con niveles de GHBP superiores a 2SD por debajo de la media y se analizó la región codificante del gen GHR para conocer la presencia de mutaciones. Utilizando el análisis de conformación de cadenas sencillas (SSCA) y la secuenciación de los productos de la reacción de la polimerasa en cadena (PCR) con movilidad alterada, se detectaron mutaciones en el dominio extracelular del receptor en 4 de los 14 pacientes.

Individuos

De los dos subestudios del NCGS, se seleccionaron 14 pacientes ISS que cumplían con todas o algunas de las características siguientes: 1) SD de la altura <-2,5; 2) niveles de IGF-I en suero por debajo de los niveles medios normales (cuantificado por extracción con ácido-etanol, Nichols Institute); 3) GH en suero > 10 \mug/l en uno o más de los tests de estimulación; 4) SD de GHBP en suero máxima \leq-2 (cuantificado por LIFA tal como se describe en Carlsson y col., J.C.E.M., 73, supra, o mediante separación con carbón activo tal como se describe en Amit y col., J. C.E.M., 71:474-479 [1990]) en el caso del Paciente 1); 5) la tasa de crecimiento durante el pre-tratamiento < 4 cm/año; y 6) ausencia de enfermedad sistémica subyacente. Se tuvo en consideración información adicional, cuando ésta estuvo disponible, incluyendo la GH media de 12-horas (ensayo de Hybritech), la tasa de crecimiento durante el primer año con GH y los niveles de IGFBP-3 (Endocrine Sciences). El sistema de evaluación utilizado para seleccionar los pacientes de la base de datos de NCGS se muestra en la Tabla VIII. Aparte de los pacientes con un valor máximo de 12, el resto de pacientes obtuvo una puntuación de 4-10, y una SD de GHBP \leq-2. Se estudiaron los familiares de dos pacientes (#2 y #4) para confirma la herencia de las mutaciones. Veinticuatro voluntarios adultos normales cuyas SD de altura se hallaba dentro de, o aproximadamente en el intervalo normal (-2,0 a +3,5 SD) se utilizaron como controles. La significación estadística de las diferencias poblacionales se calculó con un Test Exacto de Fischer.

TABLA VIII

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Los pacientes tratados con hGH (los indicados en la Tabla IX que no se incluyen bajo la columna "GH sensibles" como "na") fueron inyectados subcutáneamente con la GH de marca Protopin® (todos los pacientes tratados excepto el paciente 2) y la GH de marca Nutropin® (paciente 2), a aproximadamente 0,3 mg/Kg/semana durante por lo menos 6 meses.

Preparación de muestras y amplificación por PCR

Los linfocitos se aislaron a partir de 1,5 a 10 ml de sangre de cada paciente utilizando tubos de separación de células LeucoPREP (Becton Dickinson) o medio de separación de linfocitos LSM (Organon Teknika) y se transformaron con el virus de Epstein Barr (EBV). Katz y col., J. Infect. Dis., 160:589-598 (1989). El DNA se aisló a partir de linfocitos transformados con EBV o directamente de linfocitos frescos utilizando el equipo QIAmp Blood (Quiagen, Inc.). Los fragmentos genómicos del GHR, específicos para los exones 2 a 9 y sus regiones flanqueantes de los sitios de ayuste del RNA, se amplificaron mediante PCR utilizando cebadores intrónicos. La porción codificante del exón 10 se amplificó en tres fragmentos solapantes con el fin de restringir el tamaño de los fragmentos a menos de 400 pb. La localización y la secuencia de los cebadores intrónicos es la siguiente:

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El DNA (100 ng) se amplificó en un volumen final de 50 \mul con dNTPs 2 mM, 2 unidades de Taq Polimerasa (Perkin Elmer Corp.), MgCl_{2} 1,5 mM, 7 \muCi^{33}P-\alpha-dATP (duPont New England Nuclear) y 15 ng de cada uno de los cebadores para 40 ciclos (1 minuto, 94ºC; 1 minuto, 55ºC; 1 minuto, 72ºC con 5 segundos añadidos por ciclo). El ciclo final se prosiguió con 1 minuto a 94ºC y enfriamiento a 22ºC durante unos 30 min. Los productos de PCR se migraron en una electroforesis en gel de agarosa al 2% para verificar que no hubiera contaminación y el tamaño de los fragmentos.

El RNA total (5-10 \mug) se preparó a partir de linfocitos transformados con EBV por el procedimiento del fenol ácido (Choczynski y Sacchi, Anal Biochem., 162:156-159 [1987]) y se transcribió de forma inversa (Perkin Elmer Corp., equipo de RT) utilizando cebadores aleatorios (Promega Corp.). La amplificación por PCR del cDNA de GHR se llevó a cabo mediante una estrategia de PCR anidada. Los exones 3-10 se amplificaron en 3 fragmentos. Los cebadores anidados se utilizaron para generar fragmentos más pequeños (220-415 pb). Las condiciones del ciclo fueron las siguientes:desnaturalización a 95ºC durante 3 minutos seguido por 3 ciclos de 95ºC, 1 minuto; 55ºC, 1 minuto; 72ºC, 1 minuto; y por último 72ºC durante 10 minutos. Las secuencias de los cebadores utilizados en la estrategia de cebador anidado fue la siguiente.

Tres fragmentos de PCR-RT (5'a 3'):

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130

Análisis de conformación de cadena sencilla

El SSCCA se llevó a cabo con los productos de cada reacción de PCR. Se mezclaron 2-4 \mul de la mezcla de reacción con un volumen idéntico de tampón de carga, se desnaturalizaron a 100ºC durante 2 minutos y se colocaron en hielo. Las muestras se migraron en una electroforesis a temperatura ambiente en geles de MDE 0,5X (AT Biochem Inc.) con glicerol al 1% o 10%, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los geles se secaron sobre un papel de filtro y se autorradiografiaron.

Secuenciación de DNA

Las mutaciones detectadas como bandas anómalas por SSCA se confirmaron mediante secuenciación. La secuenciación de ciclo directo de los productos de PCR se llevó a cabo con los cebadores de la amplificación o con cebadores internos (anidados), descritos anteriormente, y con terminadores de color en un secuenciador ABI373 (Applied Biosystems de Perkin Elmer Corp.) siguiendo los protocolos estándares, o utilizando el equipo Ampli-Cycle (Perkin Elmer Corp.) y con P^{33}-\alphadATP (duPont NEw England Nuclear). Además, de cada fragmento sospechosos de contener una mutación se generaron múltiples subclones en M13mp19 o pBluescript KS+, se secuenciaron con el cebador de color de M13-21 y se analizaron con el secuenciador ABI373.

Ensayo de unión de GH

Para examinar la unión de GH con los receptores mutantes, se diseñaron dominios extracelulares de GHR recombinante con las mutaciones. Ello se realizó mediante mutagénesis dirigida mediada por oligonucleótidos, la expresión en E. coli y su purificación. Claxon y Wells, Science, 267:383-386 (1995); Fuh y col., J. Biol. Chem., 265:3111-3115 (1990); Bass y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:4498-4502 (1991). La afinidad por la GH se determinó mediante desplazamiento competitivo de la GH de los receptores mutantes, utilizando GH radio-yodinada como un trazador. Spencer y col., J. Biol. Chem., 263:7862-7867 (1988). Las constantes de disociación (Kds) se calcularon mediante análisis de Scatchard. Para precipitar el complejo GHR:GH se utilizó el anticuerpo monoclonal anti-GHR (MAb) 5 (Barnard y col., Endocrinology, 115:1805 [1984]; Cunningham y col., Science, 254:821 [1991]). El MAb 5 evita la homodimerización del receptor, permitiendo que la Kd para la interacción inicial de 1:1 pueda realizarse sin los efectos de la dimerización. Claxon y Wells, supra, Cunningham y col., supra.

Resultados

Se seleccionaron catorce niños con ISS con un valor de 4, o aproximado, según los criterios de selección (Tabla VIII). Los datos clínicos para estos pacientes se enumeran en la Tabla IX. Una GHBP poco funcional en suero condujo a la búsqueda de mutaciones sutiles en el gen de GHR, utilizando, una combinación de amplificación por PCR y SSCA. Se observaron fragmentos que migraban con una movilidad alterada en cuatro pacientes: 1, 2, 4 y 7, aunque no se detectaron anomalías en el locus GHR en 24 controles adultos normales, con la excepción de polimorfismos conocidos en los exones 6 y 10 (Leung y col., Nature, 330:537-543 [1987]; Godowski y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:8083-8087 [1989]). Así, se observó un incremento significativo en las alteraciones en el gen GHR en pacientes ISS con GHBP reducida en comparación con una población normal (p = 0,014). Cada uno de los fragmentos de PCR genómicos sospechosos de contener una mutación se secuenció para caracterizar la alteración causante de la banda anómala. Ver las Figuras 8-11. Los pacientes 1 a 9 también se analizaron por RT-PCR (exones 3-10) y todos los fragmentos presentaron el tamaño previsto, descartando alteraciones de ayuste del RNA.

El paciente 4 presentó bandas anómalas en los geles de SSCA, al analizarse los exones 4 y 6 o los fragmentos de RT-PCR que abarcaban esta región. El DNA se secuenció y se demostró que el niño era un heterocigoto compuesto para una transición guanosina a adenosina en el exón 4, lo que introducía una lisina en lugar de un ácido glutámico en la posición 44 (E44K) de la proteína madura (Fig. 8, alelo 2 y Tabla X), y una transición de citosina a timidina en el exón 6, que causaba una sustitución de arginina a cisteína en el residuo 161 (R161C) (Fig. 8, alelo 1 y Tabla X). Los productos de RT-PCR que abarcan los exones 4 a 6 se subclonaron y secuenciaron. Las dos mutaciones se hallaron en subclones distintos; así, una mutación se halló en cada uno de los 2 alelos. Adicionalmente, el análisis genético de los miembros de la familia indicó que la alteración del exón 4 se había heredado de la rama paterna de la familia y la mutación del exón 6 del linaje materno. El padre y la abuela materna presentaban el mismo desplazamiento de banda en SSCA para el exón 4 que el probando, confirmándose por secuenciación que ambos portaban idéntica mutación E44K. Asimismo, los SSCA y la secuenciación confirmaron la presencia de la mutación puntual del exón 6 causante del cambio R161C en la madre y un tío materno. El paciente 4 no respondió a GH exógena con un incremento significativo en la tasa de crecimiento; su tasa de crecimiento durante el pre-tratamiento fue de 5,5 cm/año y su tasa de crecimiento durante el tratamiento con GH fue de 5,8 cm/año.

Los efectos de estas sustituciones de aminoácidos sobre la capacidad del receptor para unirse a GH en un complejo 1:1 se investigaron utilizando el dominio extracelular del receptor mutante expresado en E.coli. El residuo E44 está implicado en los contactos directos con GH (de Vos y col., Science, 255:306-312 [1992]) y su mutación a alanina reduce la unión del ligando (Kd_{MUT}/Kd_{WT} = 17,4). Claxon y Well, supra. Se halló que la introducción de una lisina en posición 44 reduce la unión 330 veces con respecto al dominio extracelular del receptor de tipo salvaje (Tabla X). En cambio, el residuo 161 no ofrece ninguna interfaz intermolecular en el complejo GH:GHR humano (DeVos y col., supra) y su mutación a cisteína causa una reducción de la unión de 2,1 veces (Tabla X).

El DNA del paciente 2 presentó un desplazamiento de bandas en SSCA en los fragmentos de la PCR genómica del exón 5. La secuenciación del DNA identificó una transversión de timidina a adenosina en la posición 419 del cDNA que introducía un codón de parada en lugar de la cisteína 122 (C122X). Ver la Figura 9. El subclonaje y la secuenciación de múltiples productos de PCR genómica de todos los exones del paciente 2 produjo únicamente la secuencia de tipo salvaje, al igual que la secuenciación directa de los fragmentos de la PCR genómica. La probabilidad de que estos pacientes porten una segunda mutación que no se detectó es, en consecuencia, baja. El análisis del DNA de la madre y del padre del paciente 2 indicó que dicho paciente heredó la mutación del codón de parada de su madre. Durante el primer año de tratamiento con GH, su tasa de crecimiento incrementó desde 4,1 cm/año a 5,7 cm/año (Tabla IX), indicativo de una respuesta a GH exógena. Un crecimiento asociado a un estirón de crecimiento en la pubertad de 10,3 cm/año tuvo lugar durante su segundo año de tratamiento con GH exógena.

Los pacientes 1 y 7 portaban ambos cambios de una sola base en heterocigosis que causaban alteraciones aminoacídicas en el GHR de un alelo. En el paciente 1, se observó una banda anómala con los fragmentos de PCR genómica del exón 7. Una transición de guanosina a adenosina en el par de bases 686 causó el cambio del residuo arginina por una histidina en el aminoácido 211 (R211H). Ver Figura 10, alelo 2. El paciente 1 respondió al tratamiento con GH; dió positivo en el test de generación de IGF-I (el nivel basal de IGF-I fue de 56 \mug/l y alcanzó un pico de 179 \mug/l al cabo de 4 días de tratamiento con 0,1 unidades de GH/Kg por inyección). Además, su tasa de crecimiento incrementó desde 2,0 cm/año a 3,0 cm/año con 0,03 mg de GH/Kg/día y 6,0 cm/año con 0,05 mg de GH/Kg/día (Tabla IX).

El paciente 7 está igualmente afectado por una alteración en un solo alelo. Una transversión de guanosina a citosina en el par de bases 726 que introduce un ácido aspártico en lugar del ácido glutámico de tipo salvaje en la posición 224 (E224D). Ver la Fig. 11, alelo 2. El paciente 7 nunca había sido tratado con GH. Ni los SSCA ni la secuenciación directa del dominio extracelular del GHR detectaron una segunda alteración en ninguno de estos pacientes.

El residuo R211 está expuesto en la superficie del receptor lejos de cualquier interfaz molecular. DeVos y col., supra. El mutante histidina produjo una proteína con una afinidad comparable al receptor de tipo salvaje, Kd_{MUT}/Kd_{WT} = 1,4. Sin embargo, hubo una reducción drástica en el nivel de expresión de la proteína mutante; se expresó a un nivel de aproximadamente 10^{-4} respecto al salvaje. La mutación del síndrome de Laron arginina 211 a glicina publicada por Amselmen y col., Hum. Mole. Genet., 2:355-359 (1993), da como resultado un nivel de expresión indetectable. Un efecto similar sobre la afinidad del receptor por la GH se observó para la sustitución R224D (Tabla X). La sustitución conservadora E224D, no se espera que perturbe la unión de la GH. También, se observó que dicha sustitución con ácido aspártico (Kd_{MUT}/Kd_{WT} = 1,6) tenía poco efecto sobre la afinidad.

TABLA X

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^{1} La expresión de este dominio extracelular del receptor mutante se redujo aproximadamente 4 órdenes de magnitud comparado con el de tipo salvaje. ^{2} nd = no realizado.

Ejemplo V

La etiología del fallo en el crecimiento es desconocida en muchos niños con una estatura baja marcada. Resultados recientes sugieren que las mutaciones del dominio extracelular heterocigotas del gen de GHR en algunos niños con estatura baja idiopática (ISS) seleccionados por sus bajos niveles de GHBP pueden causar un GHIS parcial. NEJM 333:1093-1098 (1995). Para valorar si el GHIS parcial debido a mutaciones heterocigotos en el gen GHR existe en por lo menos una población selectiva de niños ISS, se analizó el gen GHR en 34 de 121 niños ISS inscritos en un ensayo a largo plazo de terapia con GH. Todos los niños en el estudio presentaron niveles de GH estimulada > 10 \mug/l; la altura media del nivel basal fue -2,8 SD y el IGF-I de -0,9. Estos pacientes se trataron con GH (0,3 mg/Kg/semana) durante un período máximo de 9 años. Se analizaron 11 pacientes adicionales con ISS que no eran parte del ensayo clínico y para los cuales se dispuso de menos datos sobre su crecimiento. Ninguno de estos niños presentó características fenotípicas del síndrome de Laron.

El DNA genómico se extrajo de linfocitos transformados por el virus de Epstein-Barr y se amplificaron los exones 2-10 del gen de GHR mediante PCR. Las secuencias amplificadas se examinaron para ver la presencia de mutaciones sutiles mediante la técnica del análisis de polimorfismos conformacionales de cadena sencilla (SSCP) en geles MDE con glicerol al 0% o al 10%. Orita y col., Genomics, 5:874-879 (1989); Soto y Sukumar, PCR Meth. Appl., 2:96-98 (1992) y se reamplificaron las bandas de SSCP anómalas, determinándose su secuencia mediante la química de los terminadores de color y separación en un secuenciador automático ABD373 o ABD377. El análisis de SSCP se basa en las diferencias de estructura secundaria que presentan las moléculas de DNA de cadena sencilla que difieren en tan sólo un cambio de base. Estas diferencias en la estructura secundaria dan como resultado una variación de la movilidad electroforética en geles de acrilamida no desnaturalizantes. La eficiencia en la detección de mutaciones con el análisis de SSCP varía desde aproximadamente el 90% para fragmentos por debajo de 200 pares de bases de tamaño a un 70-80% para tamaños de 200 a 400 pb. Prosse, Tibtech, 11:238-246 (1993). Nueve de los 44 niños ISS en esta población menos seleccionada portaban mutaciones en el gen GHR. No se detectaron anomalías en el locus GHR en siete de los niños controles ni en los 34 adultos controles.

Tres pacientes ISS presentaron mutaciones en el dominio y 6 pacientes mutaciones en el dominio intracelular del receptor de GH (Tabla 1).

El paciente 13 presentó a la edad de 6 años y 10 meses un retraso de crecimiento severo (-4 SD), edad ósea retrasada (4 años y 6 meses) y un crecimiento de 3,8 cm/año. Los niveles de hormona del crecimiento fueron normales, así como los niveles de IGF-BP3 y de GHBP. Sin embargo, sus niveles de IGF-I fueron bajos y no pasaron el test de generación de IGF-I (GH a 0,06 mg/Kg/día durante 5 días) (Tabla 1). Se realizó un ensayo de terapia con GH a una dosis de 0,6 mg/Kg/semana. El paciente respondió con una tasa de crecimiento durante el primer año de 10 cm/año y sus niveles de IGF-I incrementaron de forma significativa (de 57 ng/ml a 339 ng/ml: intervalo normal de 88-474). El análisis del gen GHR demostró la presencia de dos cambios de una base, cada uno en un alelo del gen GHR: un cambio de una bases en el codón 473 (que codifica para un residuo de serina) (Figura 12) y una sustitución de G por A en el codón 478 que introduce una treonina en lugar de la alanina normal (Ala478Thr) (Figura 13). El polimorfismo Ser473 fue heredado de su padre, la Ala478Thr de su madre (Figura 14). El polimorfismo Ser473 se ha observado en otros tres individuos de estatura corta (un paciente IUGR, un paciente ISS y un adulto de estatura corta (la bis-tía materna del probando)) y en ninguno de los controles con estatura normal. Queda todavía por ver si tiene un efecto sobre el procesamiento del mRNA de GHR o sobre su estabilidad.

Los pacientes 27 y 32 portan ambos dos cambios de una sola base en el exón 10. Uno cambia la cisteína 422 a fenilalanina (Cys422Phe) (Figura 15) y el segundo reemplaza la prolina 561 por treonina (Pro561Thr) (Figura 16). El paciente 27 es homocigoto o hemicigoto para estos dos cambios, así ambas mutaciones se hallan en el mismo alelo del gen. El paciente 32 es heterocigoto para las dos alteraciones. No se sabe si estas dos mutaciones se hallan en el mismo alelo o no. No está disponible ningún dato sobre el crecimiento para el paciente 27. El paciente 32 presentó junto con una estatura corta (altura -3,4 SD), niveles de hormona de crecimiento normales y niveles de GHBP, IGF-I e IGF-BP3 cercanos a la media (Tabla 1). El paciente 32 tuvo una buena respuesta a la terapia con GH, su tasa de 4,4 cm/año de crecimiento durante el pre-tratamiento mejoró a 9,1 cm/año durante el primer año de terapia y en su gráfica de crecimiento (Figura 17) se muestra su respuesta a largo término a la terapia con GH. La combinación de estas dos mutaciones se ha publicado con anterioridad en un paciente con fallo de crecimiento y niveles bajos de GHBP en suero y una respuesta inconsistente a GH. JCEM, 76:54-59 (1993).

El paciente 44 porta dos cambios de una base. La treonina 306 se reemplaza por una prolina debido a una mutación de una base (Figura 18). Este paciente también porta el polimorfismo Ser473 observado en el paciente 13 (Figura 1). De este paciente no se dispone de datos clínicos ni de su respuesta al crecimiento. El paciente 48 es heterocigoto para una sustitución aminoacídica; la cisteína 422 se sustituye por fenilalanina (Cys 422Phe) (Figura 15). Esto es debido a la misma sustitución de bases observada en los pacientes 27 y 32. Los datos clínicos (Tabla 1) muestran que esta chica con una estatura corta (-2,8 SD), niveles de GHBP e IGF-I bajos y niveles de IGF-BP3 normales, respondió a la terapia con GH con un incremento en su tasa de crecimiento de 4,1 cm/año durante el pre-tratamiento a 8,2 cm/año durante el primer año de terapia. Su curva de crecimiento (Figura 19) muestra su respuesta continuada a GH, logrando una altura adulta dentro del intervalo previsto por las alturas de sus progenitores.

El gen GHR en el paciente 49 está interrumpido por dos mutaciones de una sola base. Lo que resulta en la sustitución de la treonina 306 por una prolina (Thr306Pro) (Figura 18); esta es la misma mutación que la del paciente 44. La segunda mutación causa una sustitución de la cisteína 518 por un codón de parada (Cys518Stop) (Figura 20), dando como resultado una proteína truncada carente de 107 aminoácidos del extremo carboxilo. Este paciente era -1,9 SD para la altura y presentaba niveles normales de GH y niveles bajos de GHBP, IGF-I e IGF-BP3 (Tabla 1). Su curva de crecimiento (Figura 21) refleja una tasa de crecimiento mejorada después de la terapia con GH (de 4,7 cm/año a 9,0 cm/año durante el primer año de terapia), alcanzando una altura adulta dentro del intervalo previsto por las alturas de sus progenitores.

Estos resultados sugieren que los defectos del dominio intracelular del receptor de GH pueden ser la causa de un crecimiento pobre en un subgrupo de pacientes con estatura corta y no-deficientes en GH. Estos defectos del receptor de GH difieren de las mutaciones extracelulares observadas en el síndrome de la insensibilidad completa a GH (Laron) ya que afectan al dominio intracelular de la proteína.

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

16

El síndrome de Laron (LS) es una enfermedad recesiva autosómica rara caracterizada por una resistencia severa a GH (1). Las características clínicas principales de este síndrome son un fallo del crecimiento postnatal combinado con una apariencia de hipoplasia mediofacial con un puente nasal plano. Los niños pueden sufrir de episodios de hipoglucemia (1,2). La resistencia a GH se manifiesta bioquímicamente por niveles elevados de GH circulante combinado con niveles bajos o indetectables del factor de crecimiento similar a la insulina-I (IGF-I) y de la proteína-3 de unión a IGF (IGF-BP3), que no logran responder a la GH humana exógena (1).

El defecto en LS yace a nivel del receptor de GH (GHR) (3-9). Este receptor pertenece a la superfamilia de citoquina receptores de GH-prolactina y consiste de 3 dominios: un dominio extracelular responsable de la unión a la hormona y de la dimerización del receptor, un dominio transmembrana y un dominio intracelular que inicia la señalización intracelular (10, 11). Aunque el primer defecto en el GHR identificado en LS fue una deleción génica compleja (3), todos los defectos significativos identificados a continuación procedían de mutaciones puntuales confinadas al dominio extracelular del receptor (4,9). Kou y col., describieron un paciente LS con 2 polimorfismos del DNA en heterocigosis dentro del dominio intracelular en un mismo alelo, aunque todavía se desconoce su significación funcional (12).

Una forma soluble del GHR denominada proteína de unión de alta afinidad a GH (GHBP) está presente en la circulación de individuos normales y actúa como una reserva y tampón para la GH circulante (10, 13, 14). Se piensa que se produce como resultado del corte proteolítico del dominio extracelular procedente del resto de la proteína receptora en el hombre, aunque en roedores se ha demostrado que se produce como resultado del ayuste alternativo (15, 16). Cuantificaciones iniciales de GHBP en individuos LS mostraron niveles ausentes o extremadamente bajos, consistente con la hipótesis de que los defectos moleculares detectados en el receptor disminuyen o reducen la unión de GH (17).

Más recientemente se demostró que hasta un 20% de pacientes LS clásicos son GHBP "positivos" con niveles normales o elevados de GHBP (1,18). En este subgrupo, únicamente se ha publicado una mutación de GHR que implique la sustitución en homocigosis de un residuo aspartato, altamente conservado por una histidina en una posición del dominio extracelular del receptor conocida por ser crítica para la homodimerización del receptor (D152H). Duquesnoy y col., demostraron que el fallo de la dimerización del receptor era el mecanismo de acción de esta mutación, sin que la unión a GH se vea afectada, lo que explicaría el nivel normal de GHBP (9).

No se ha descrito ningún individuo LS con un defecto significativo funcionalmente fuera del dominio extracelular del GHR, aunque los experimentos de mutagénesis han demostrado que se necesita la mayor parte del dominio intracelular del GHR para mediar una respuesta celular completa a GH (19-22). Así, se esperaría que las mutaciones de origen natural que resultan en deleciones o interrumpciones graves del dominio intracelular del receptor produjeran una resistencia severa a GH manteniendo una actividad de GHBP.

Se describen dos pacientes LS que tienen una resistencia a GH severa y una actividad GHBP en el intervalo normal. Los análisis del GHR de ambos individuos demostraron que son homocigotos para una sustitución de arginina por treonina en el extremo N-terminal del dominio intracelular del GHR. Como la sustitución del nucleótido se localiza en una posición crítica en el sitio donante de ayuste 5' del exón 8, la mutación da como resultado el salto del exón 8 produciendo un GHR mutante sin dominio transmembrana o intracelular funcional.

Procedimientos

Pacientes. Los pacientes 1 y 2 son primos hermanos nacidos de una familia altamente consanguínea originaria de Kashmir, Pakistán. Los individuos NS presentaron a la edad de 2,5 años una estatura corta severa (SD de altura -5,4) y un fenotipo facial típico. Los niveles de GH fueron muy elevados con niveles basales de 638 mU/l. Los niveles de

\hbox{IGF-I}

fueron indetectables a < 20 ng/ml (NR 40-150 ng/ml) y los niveles de IGF-BP3 fueron inferiores a percentil 5 para la edad, a 180 ng/ml (NR 1410-2970 ng/ml) (23). La administración de hGH exógena (0,1 UI/Kg/día por vía subcutánea durante 4 días) no produjeron una respuesta significativa ni en los niveles de IGF-I ni de IGF-BP3, confirmando la resistencia severa a GH. La GHBP fue > percentil 95 para la edad en un 78,2% (1), con una afinidad de unión a GH normal. Una nueva cuantificación de GHBP al cabo de 6 meses de terapia con IGF-I no demostró ningún cambio (nivel 82,1%), a pesar de la buena respuesta al tratamiento con un incremento rápido de hasta 8,7 cm/año. Sus padres que son primos hermanos tienen una estatura normal. Su madre ha dado a luz recientemente a otra hija que parece normal en este estadio. El paciente 2, un varón primo hermano presentaba un fallo del crecimiento (SD de altura -5,2), la apariencia facial típica de LS y micropene a la edad de 2,2 años. Las investigaciones iniciales demostraron un nivel basal de GH de 810 mU/l y niveles basales de IGF-I de < 20 ng/ml.

Amplificación del DNA genómico mediante la reacción en cadena de la polimerasa y secuenciación del DNA . Se preparó el DNA genómico de leucocitos de los pacientes y miembros familiares mediante procedimientos estándares. En el paciente 1, se amplificaron individualmente los exones 4-10 incluyendo las uniones intrón-exón, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando parejas de cebadores (en donde el cebador antisentido estaba biotinilado) deducidos de la secuencia de DNA publicada (3) (Secuencias disponibles a petición). Los productos de PCR se sometieron a la secuenciación genómica directa en fase sólida utilizando bolas paramagnéticas cubiertas de estreptavidina (Dynal, Oslo, Norway) y la tecnología de la Sequenase de cadena sencilla (U.S. Biochemical Corp., Cleveland, Ohio). Las secuencias de DNA de la autorradiografía-S^{35} se compararon con la secuencia publicada de GHR (3).

Análisis de restricción enzimática. La mutación R247T crea una diana de restricción MaeII. Los cebadores oligonucleotídicos 8a y 8b se utilizaron para amplificar el exón 8 del GHR de los pacientes 1 y 2 y de los padres del paciente 1, a partir de sus DNAs genómicos procedentes de leucocitos mediante PCR (para las secuencias de los cebadores ver la Tabla 1). El DNA de placenta de la primera hermana recién nacida también se amplificó utilizando los mismos cebadores. Se digirieron 10 \mul de producto de PCR con MaeII y se separaron en un gel de poliacrilamida al 6%. El DNA se visualizó mediante tinción con bromuro de etidio.

Análisis del cDNA

Se generaron líneas linfoblásticas a partir de los linfocitos del paciente 1, mediante transformación con el virus de Epstein-Barr (EBV) utilizando procedimientos estándares. Se aisló el RNA celular de los linfocitos transformados con EBV y de linfocitos control obtenidos a partir de sangre periférica de un sujeto normal, utilizando un procedimiento de una sola etapa (Biogénesis, Bournemouth, UK9. A continuación, se convirtieron 15 \mug de esta RNA a cDNA en una reacción de transcripción inversa cebada con hexámeros aleatorios. Los exones 7-10 del cDNA de GHR se amplificaron utilizando una PCR anidada, cuya aproximación se muestra en la Figura 3a. La secuencia de los cebadores de PCR se indica en la Tabla A. En la última ronda de la PCR, el cebador P6 se biotiniló y se obtuvieron cadenas sencillas para la secuenciación directa, secuenciándose a continuación tal como se describió anteriormente.

Análisis de GH, IGF-I, IGF-BP3 y GHBP. La GH se determinó mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima. El IGF-I se cuantificó mediante radioinmunoensayo específico (RIA) después de la extracción con ácido-etanol (24). La IGF-BP3 se cuantificó también utilizando un RIA específico (25). La GHBP se cuantificó mediante filtración en gel por HPLC utilizando el procedimiento descrito por Postel-Vinay y col., (26). No se realizó ninguna corrección para la alta concentración de GH.

Cuantificaciones de la afinidad de unión de GHBP

Se obtuvo un trazado de Scatchard de los experimentos de unión competitiva utilizando 50 \mul de plasma. El análisis se realizó utilizando el programa Ligand (27).

\newpage

Resultados

Identificación de una mutación sin sentido en la posición 1 del sitio donante de ayuste 5' del exón 8 del GHR.

La secuenciación del GHR en los pacientes 1 y 2 demostró que la sustitución homocigota de una G por una C en el nucleótido 91 del exón 8 (Figura 22), localizada en la posición -1 del sitio donante de ayuste 5'. La secuenciación del DNA no demostró ninguna alteración adicional de la secuencia publicada o de la de un individuo control. Los progenitores del paciente 1 eran heterocigotos para esta mutación.

Esta sustitución de nucleótidos da como resultado la sustitución de arginina (AGG) por treonina (ACG) en el aminoácido 274 del GHR maduro (R274T), que se ha predicho como el cuarto aminoácido del dominio intracelular de la proteína receptora (10).

Mapeo por enzimas de restricción

La mutación crea una diana de reconocimiento para la enzima de restricción MaeII. La amplificación de un fragmento de 199 pb del exón 8 de GHR que contiene esta mutación seguido de la digestión con MaeII proporciona fragmentos de 154 y 45 pb, mientras que el fragmento normal permanece sin cortar. Tal como se muestra en la Figura 23, el análisis por enzimas de restricción de los padres del paciente 1 proporcionó un patrón de digestión mixto, lo que confirmó su estado de heterocigosidad, mientras que para los pacientes 1 y 2, únicamente puede verse el fragmento más corto de 154 pb, lo que demuestra su homocigosidad para la mutación. La digestión del exón 8 de GHR del DNA de placenta obtenido de la hermana recién nacida del paciente 1 demostró que es heterocigota para la mutación.

Análisis del cDNA

La amplificación del cDNA de linfocitos controles utilizando los cebadores P4 y P5 produjeron una banda de 267 pb, tal como se esperaba. De los linfocitos transformados con EBV obtenidos del paciente 1, únicamente se obtuvo un producto menor de 176 pb. La secuenciación directa de estos productos de transcripción inversa (RT-PCR) demostró que en el mRNA de GHR obtenido del paciente 1, se saltó el exón 8 dando como resultado el ayuste del exón 7 en el exón 9 (Figura 24), mientras que el mRNA obtenido de linfocitos controles fue ayustado normalmente con el exón 8 a continuación del 7.

Características de la GHBP sérica

La afinidad de unión a GH de la GHBP del paciente 1 estuvo dentro de los límites normales con una constante de asociación (Ka) de 3,09 x 10^{-8} M (intervalo normal para adultos: 3,6 - 7,4 x 10^{-8} M). La capacidad de unión máxima del plasma para GH (B max) aumentó de forma marcada a 317 ng/ml de plasma (intervalo normal del adulto:24-86 ng/ml). Estos resultados sugieren que el incremento en GHBP cuantificable refleja un incremento absoluto en la proteína de unión circulante. El complejo de I^{125}-hGH-GHBP eluido en el tiempo esperado de la columna de HPLC sugiere que el peso molecular de la GHBP en el plasma del paciente 1 es comparable con la de individuos normales.

Discusión

Nuestros resultados documentan por primera vez el síndrome de Laron (LS) asociado con un defecto homocigoto en el dominio intracelular del GHR. Esta mutación en el sitio de ayuste donante 5' del exón 8 induce el salto del exón 8 que codifica para el dominio transmembrana de GHR. Los niños afectos presentan un fenotipo clásico, con excepción de la GHBP en el probando que se halla bastante por encima del nivel normal. Los padres, en los que se ha demostrado una heterocigosidad son de estatura normal.

Nuestro hallazgo de que esta transversión G C en la posición -1 del sitio donante de ayuste 5' dé como resultado el salto de un exón no es inesperado. El nucleótido G en al posición -1 está conservado en el 78% de todos los sitios donantes 5' y se piensa que es crítico para el ayuste normal. Shapiro y Senapaty (28) recogieron los resultados de 62 mutaciones puntuales en sitios de ayuste 5' en otros genes: en la mitad de estos trabajos que incluyen resultados sobre su efecto en el mRNA, el salto de exones fue el único producto de transcripción aberrante (28). La otra consecuencia posible de una tal mutación es la utilización del sitio de ayuste críptico, pero ello no parece ser el caso para esta mutación, ya que no fue posible detectar otros fragmentos de RT-PCR anómalos.

El salto del exón 8 en el mRNA de GHR también da como resultado que el exón 9 (que codifica para el inicio del dominio intracelular) se transcriba fuera del marco de lectura con un codón de parada 5 aminoácidos cadena abajo. En consecuencia, se predice que la proteína mutante de GHR producida por estos individuos no tendrá un dominio transmembrana ni tampoco un dominio intracelular funcional. Este hallazgo es consistente con la resistencia severa a GH hallada en los pacientes, debido a que una molécula de este tipo no sería capaz de realizar una transducción de señal.

La falta de un dominio transmembrana daría como resultado un receptor que ya no estaría anclado en la membrana celular, pero con un dominio extracelular normal sí sería capaz de unirse a GH. El aumento de GHBP en el paciente 1 puede, en consecuencia, explicarse sobre la base de que toda la proteína GHR que produce se libera a la circulación y es cuantificable como GHBP. El hallazgo de una afinidad de unión a GH normal en el suero sugiere que este aumento de GHBP no es debido a un incremento de la afinidad del receptor mutante, sino que refleja un incremento absoluto de los receptores circulantes disponibles para unirse a GH.

Esta relación directa entre el número de receptores y la GHBP cuantificada proporciona una oportunidad única para valorar el efecto de IGF-1 en los niveles de expresión del gen GHR. En individuos normales, se ha sugerido que un cambio en la GHBP sérica puede reflejar cambios en los niveles de GHR celulares, la proteolisis del receptor o el aclaramiento de GHBP (29). Recientemente, Silbergeld y colaboradores publicaron una caída en la GHBP sérica después de la terapia con IGF-1 en 3 individuos LS con un posible defecto post-receptor, interpretando este hallazgo como una evidencia de que el IGF-1 puede ser un factor regulador para la GHBP sérica (30). Sin embargo, en nuestros pacientes, a pesar de una buena respuesta a la terapia con IGF-I en términos de velocidad de crecimiento, su GHBP cayó solo ligeramente y todavía está bastante por encima del intervalo normal para su edad.

En resumen, se ha descrito la primera mutación homocigota que afecta el dominio intracelular del receptor en el GHR de 2 pacientes con LS, dichas mutaciones parecen tener su efecto causando el salto del exón 8 y produciendo un GHR que no contiene un dominio transmembrana o intracelular. Se ha demostrado que en la forma homocigota se segrega claramente con el fenotipo de la enfermedad y es probablemente el defecto en el GHR el causante de esta variante de LS con GHBP elevada. La otra mutación a identificar en esta variante con GHBP "positiva" de LS se halló en el dominio extracelular del receptor, lo que demuestra la heterogeneidad molecular de esta forma de LS. Otros estudios de pacientes con este fenotipo proporcionarán probablemente una mayor comprensión a la función del GHR.

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Conclusión

Un subgrupo de niños con ISS presentan fenotipos que implican un GHIS parcial en la etiología de su estatura corta. La hipótesis, propuesta aquí de una señalización de GHR reducida ejemplificada por los niveles menores de IGF-I y las concentraciones superiores de GH junto con niveles menores de GHBP, se ha confirmado tras la identificación de las mutaciones del GHR en pacientes con estatura corta, no deficientes en GH seleccionados por sus niveles de GHBP e IGF-I bajos. Ninguno de los 24 controles presentaron alteraciones de secuencia detectables por SSCA, mientras que 4 de 14 pacientes ISS seleccionados presentaron alteraciones de una sola base (p = 0,014). Ya que los SSCA sólo son capaces de detectar aproximadamente el 80% de las mutaciones conocidas en los sistemas modelo (Vidal-Puig y Moller, Biotechniques, 17:490-496 [1994]; Ravnik-Glavac y col., Hum. Mol. Genet., 3:801-807 [1994]), pueden existir mutaciones adicionales presentes en estos pacientes ISS que han pasado desapercibidas.

Dos de estos cuatro pacientes ISS con mutaciones GHR respondieron a GH exógena (pacientes 1 y 2 de la Tabla IX). La presencia de mutaciones y la respuesta a GH sugieren que estos pacientes pueden ser parcialmente insensibles a GH debido a un GHR disfuncional. Sin limitarse a ninguna teoría, se cree que la incapacidad del paciente 4 para responder a GH refleja probablemente la naturaleza de las dos mutaciones portadas en sus dos alelos GHR. Una de las alteraciones reduce la afinidad del receptor por la GH unas 300 veces, presumiblemente convirtiendo este receptor en insensible a niveles fisiológicos o farmacológicos de GH. El efecto de la segunda alteración, R161C, no es conocido, pero esta mutación es severa; en el estado homocigoto causa GHIS completo. Amselem y col., supra. El cuarto paciente (paciente 7) no había sido todavía tratado con GH. A partir de estos resultados, se hace evidente que una continua sensibilidad a GH abarca desde el GHIS completo observado en pacientes LS, los pacientes ISS insensibles severos carentes de las características fenotípicas del síndrome de Laron, pero que puede que no respondan a dosis estándares de GH, los pacientes ISS con GHIS parcial que son sensibles a una terapia con GH, y por último al fenotipo normal.

El paciente 4 es un heterocigoto compuesto para las sustituciones E44K y R161C, siendo cada progenitor heterocigoto para una de las dos mutaciones. Las estaturas de los padres y de los abuelos se hallan todas dentro del intervalo normal para la población adulta; sin embargo, las estaturas de portadores conocidos de una sola mutación se hallan por debajo de la media. El paciente 2 es heterocigoto para la mutación de cambio de cisteína por codón de parada en la posición 122 y por ello tiene un alelo que produce una proteína truncada, presumiblemente inestable. Su madre porta la misma mutación. El paciente 2, ahora de 19 años de edad, está más severamente afectado por la presencia de esta mutación (SD de altura -3,2) que su madre (SD de altura -1,4). Sin limitarse a ninguna teoría, el probando puede haber heredado una mutación todavía no definida de su padre (SD de altura -1,4) que afecte la expresión del alelo GHR estructuralmente normal o de otra etapa en el eje GH. La familia 2 es similar a un paciente sospechoso de presentar un LS, cuya madre no está afectada, siendo ambos portadores de dos mutaciones en un alelo del locus GHR. Kou y col., J.C.E.M., 76:54-59 (1993). La similitud entre este paciente y el paciente 2 sugiere, según una teoría, que ambos pueden ser portadores de una segunda mutación no identificada, al igual que muchos pacientes con insensibilidad severa a la insulina, en los que se han observado niveles reducidos de mRNA del receptor de insulina a pesar de la falta de mutación en ninguno de los exones (revisado por Taylor y col., Endocrine Rev., 13:566-595 [1992]).

Dos otros pacientes portan mutaciones heterocigotos que conducen a sustituciones aminoacídicas (R211H en el paciente 1 y E224D en el paciente 7). Los padres del paciente 1 tienen ambos estaturas dentro del intervalo normal para la población adulta. Hamill y col., Am. J. Clin. Nutrition, 32:607-629 (1979). De forma similar, el padre del paciente 7 tiene una SD de altura de -0,43 y la SD de altura de la madre de dicho paciente es de +1,4.

El síndrome de Laron o LS es una enfermedad autosómica recesiva. Los individuos afectados heredan generalmente la misma mutación que los progenitores consanguíneos. Las mutaciones heterocigotos para GHR (progenitores y descendencia de pacientes LS) pueden tener anomalías de crecimiento moderadas. Laron, The Endocrinologist, 3:21-28 (1593); Rosenbloom y col., Acta Paediatr., Suppl. 399:125-127 (1994). Aproximadamente la mitad de los portadores heterocigotos tienen niveles de GHBP superiores a 2 SD por debajo de la media para la edad. Aguirre y col., Horm Res., 34:4-8 (1990); Laron y col., Acta Endocrinol., 121:603-608 (1989). Además, Laron, The Endocrinologist, supra, publicó que las alturas de los padres y de la descendencia clínicamente normal de pacientes LS están típicamente por debajo del percentil 50 para su sexo y origen étnico. Sin limitarse a ninguna teoría, el GHIS parcial que produce una SD de altura inferior a -2 puede tener lugar en portadores de mutaciones heterocigotos del GHR bajo la influencia de genotipos particulares en loci modificadores todavía no identificados, o cuando las alteraciones confieren un fenotipo dominante negativo, tal como se propuso para las mutaciones del receptor de la insulina en heterocigosis en diversos pacientes insensibles a la insulina.

Las cinco mutaciones identificadas en los cuatro pacientes (E44K, C122X, R161C, R211H, E224D) están limitadas al dominio extracelular del receptor. La sustitución E44K causa una reducción de 330 veces en la afinidad para GH, mientras que la alteración de los residuos R161, R211, o E224 tiene poco efecto sobre la unión del ligando (Tabla X).

El residuo R211 es distal tanto de la unión del ligando como de los sitios de dimerización del GHR. Y, sin embargo, es adyacente al motivo "similar a WS" conservado en la superfamilia de receptores citoquina. Los residuos del motivo "similar a WS" se agrupan estrechamente con el R211 y otras cadenas laterales de aminoácidos para formar una pila de cadenas laterales alternantes aromáticas y básicas.

El residuo E224 corresponde al residuo variable del motivo "similar a WS". Al igual que R211, se halla fuera de los sititos de unión conocidos en la molécula de GHR y las mutaciones no alteran significativamente la unión a GH (Tabla X). Una sustitución E224A expresada en células de mamífero en cultivo presentó una localización subcelular alterada. Baumgartner y col., J. Biol Chem., 269:2904-29101 (1994). En una localización próxima al núcleo, se observó una fracción aumentada de receptor total. No se sabe si ello refleja la acumulación de receptor sintetizado de nuevo o un aumento de la internalización del receptor. Sin limitarse a ninguna teoría, si la mutación E224D causa un efecto similar, el procesamiento incorrecto podría resultar en un número reducido de receptores en la superficie celular y en una reducción concomitante de los niveles de GHBP séricos.

Con este estudio se muestra que la selección de un subgrupo de niños ISS con parámetros clínicos sugestivos de una insensibilidad parcial a GH identifica pacientes portadores de mutaciones GHR que pueden afectar la función GHR. Ya que los pacientes estudiados se seleccionaron según una GHBP funcional circulante reducida, las mutaciones han de afectar directamente a la unión al ligando (E44K), o causar una reducción en la disponibilidad del receptor de superficie celular (R161C, R211H y E224D), contribuyendo con ello a la aparición de un síndrome GHIS parcial. De hecho, dos de los tres pacientes ISS con mutaciones GHF que se trataron con GH exógena presentaron un GHIS parcial de sensibilidad a GH.

Ejemplo VI

Dieciocho niños prepúberes, de edades comprendidas entre 5 y 12 años, diagnosticados por tener una altura media inferior a -2 desviaciones estándar por debajo de la altura normal, un nivel sérico de GHBP de por lo menos 2 desviaciones estándar por debajo del nivel normal, un nivel sérico de IGF-I por debajo del nivel medio normal y un nivel sérico de GH media o de estimulación máxima por lo menos normal, se trataron de la manera siguiente: 20 con sólo IGF-I, 20 con sólo GH, 20 con GH e IGF-I juntos y 20 con placebo. Cuando se administraron los fármacos solos, el IGF-I se administró una vez al día mediante inyección subcutánea 150 \mug/Kg/día y la GH se administró una vez al día mediante inyección subcutánea a una dosis de a una dosis de 0,70 mg/Kg/semana. Cuando se administraron los fármacos en combinación, el IGF-I se administró una vez al día mediante inyección subcutánea a una dosis de 75 \mug/Kg/día y la GH se administró una vez al día mediante inyección subcutánea a una dosis de 0,35 mg/Kg/semana. La formulación de IGF-I es (a) 10 mg/ml de IGF-I en tampón acetato sódico 20 mM, 2,5 mg/ml de fenol (0,25%), 45 mg/ml de manitol, pH 5,0; o (b) 10 mg/ml de IGF-I en tampón acetato sódico 50 mM, 2,5 mg/ml de fenol, 5,84 mg/ml de NaCl y 9 mg/ml de bencil alcohol, pH 5,4. La formulación de GH es la marca Nutropin® o la Protropin® disponibles por Genentech, Inc. Los pacientes se trataron durante 6 minutos con este protocolo y se cuantificó el aumento en la estatura para cada paciente.

En este estudio se espera que el IGF-I, la GH o su combinación incrementen las tasas de crecimiento de todos los pacientes en comparación con los pacientes tratados con placebo.

Los diseños alternativos para los ensayos clínicos son los siguientes:

Los mismos grupos y subclases de niños se trataron de la misma manera con sólo GH a 0,35 mg/Kg/semana o 0,70 mg/Kg/semana, o con sólo IGF-I a 75, 100, 150, o 200 \mug/Kg/día. Para el tratamiento de combinación, se utilizó la GH a 0,35 mg/Kg/semana y el IGF-I a 75 ó 100 \mug/Kg/día con o sin un placebo para comparar.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: Attie, Kenneth

Carlsson, Lena

Gesundheit, Neil

Goddard, Audray

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Tratamiento del síndrome de insensibilidad a la hormona de crecimiento

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 57

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DIRECCIÓN: Genentech, Inc.

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CALLE: 460 Point San Bruno Blvd.

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CIUDAD: South San Francisco

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

ESTADO: California

\vskip0.333000\baselineskip

(E)

PAÍS: USA

\vskip0.333000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 94080

\vskip0.666000\baselineskip

(v)

FORMATO PARA LECTURA POR ORDENADOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

TIPO DE SOPORTE: 5,25 pulgadas, disco de 360 Kb

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

PROGRAMA: patin (Genentech)

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE LA SOLICITUD:

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 24 de marzo de 1995

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.666000\baselineskip

(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE LA SOLICITUD: 08/224982

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FECHA DE SOLICITUD: 07-abril-1994

\vskip0.666000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN SOBRE EL AGENTE/REPRESENTANTE:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Hasak, Janet E.

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 28.616

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE ACTA/REFERENCIA: 884P1

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 415/225-1896

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 415/952-9881

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TELEX: 910/371-7168

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 445 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:

17

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 445 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

18

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 148 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3

\vskip1.000000\baselineskip

19

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 148 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4

\vskip1.000000\baselineskip

20

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 173 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

21

2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 173 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

22

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 57 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7

\vskip1.000000\baselineskip

23

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 50 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8

\vskip1.000000\baselineskip

24

2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 240 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

25

2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 240 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

26

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 11:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 55 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 11

\vskip1.000000\baselineskip

27

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 12:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 55 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 12

\vskip1.000000\baselineskip

28

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 13:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 240 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

29

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 14:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 240 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

30

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 15:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 55 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 15

\vskip1.000000\baselineskip

31

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 16:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 55 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 16

\vskip1.000000\baselineskip

32

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 17:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 17:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TGCTGGGCT TACCTTAC

\hfill

18

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 18:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 18:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CAAAACACTG AGGGTGGA

\hfill

18

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 19:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 19:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TACACAGGGT CATATCAGAT TG

\hfill

22

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 20:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 20:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CTATTCCAGT TACTACCATC CC

\hfill

22

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 21:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 21:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CTGATTTCAT GCCTTGCC

\hfill

18

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 22:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 22:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

AGAAAGGCAT GATGGTGG

\hfill

18

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 23:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 23:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

ACTTAAGCTA CAACATGATT

\hfill

20

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 24:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 24:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GCTTCCCCAT TTATTTAGT

\hfill

19

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 25:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 25:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

ATGCTCTGTT GAATTGCAC

\hfill

19

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 26:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 26:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GTGTAAGGTG TAGCAACAT

\hfill

19

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 27:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 27:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GACTCTTTGG CCAATATG

\hfill

18

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 28:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 28:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

AAGCCAGGTTAGCTACTA

\hfill

18

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 29:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 29:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GAAACTGTGC TTCAACTAGT C

\hfill

21

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 30:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 30:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GGTCTAACAC AACTGGTACA

\hfill

20

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 31:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 31:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

ATGTAGCTTT TAACATCTCA A

\hfill

21

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 32:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 32:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

ATGACAGGAG TCTTCAGG

\hfill

18

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 33:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 33:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GAGTTTCTTT TCATAGATCT TC

\hfill

22

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 34:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 34:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TTAACCTCTG TGGCTGAG

\hfill

18

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 35:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 35:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

ACATGAGGGT ACCTCAGA

\hfill

18

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 36:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 36:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CAGAAGTAGG CATTGTCC

\hfill

18

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 37:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 37:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GGAAATGGTC TCACTCTG

\hfill

18

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 38:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 38:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CCAAAGAAAG GCTAAGGC

\hfill

18

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 39:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 39:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GTCCTACAGG TATGGATCTC T

\hfill

21

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 40:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 40:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GAATATCTGC ATTGCGTGGT G

\hfill

21

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 41:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 41:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CTGGTATAGA ACAGCTGTAT G

\hfill

21

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 42:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 42:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

ATTCTTCTAA GGAGCCTAAA TTCACCA

\hfill

27

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 43:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 43:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CCACCATTGC TAGTTAGCTT G

\hfill

21

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 44:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 44:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

ATGGACTCAA GAATGGAAAG AATG

\hfill

24

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 45:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 45:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CACCACGCAA TGCAGATATT C

\hfill

21

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 46:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 46:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CTCATGGTCA CTGCTTAGAA G

\hfill

21

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 47:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 47:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GTTACATAGA GCACCTCACT G

\hfill

21

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 48:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 48:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

ATGGACCCTA TATTGACAAC ATC

\hfill

23

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 49:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 49:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CCTTTAATCT TTGGAACTGG AAC

\hfill

23

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 50:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 50:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GGGCTAACAG TGATGCTATT T

\hfill

21

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 51:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 51:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GCTTAGAAGT CTGTCTGTGT C

\hfill

21

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 52:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 52:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GCTAGATATT GATGAGCCAG A

\hfill

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 53:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 53:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GCTAAGGCAT GATTTTGTTC A

\hfill

21

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 54:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 54:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GTCGATGTTT GACAGTGAAC T

\hfill

21

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 55:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 55:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GAAGGAGCTG AGTCAACTCAA C

\hfill

21

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 56:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 56:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GCTTGGCTGT ATGTGTGATT C

\hfill

21

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 57:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 57:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TACTTCTGTG AGGCAGATGC C

\hfill

21

Claims (3)

1. Procedimiento para la identificación de un paciente humano que tiene el síndrome de insensibilidad parcial a la hormona de crecimiento, pero no el síndrome de Laron, que comprende la detección de un defecto génico heterogéneo en el dominio intracelular del gen del receptor de la hormona de crecimiento (GHR) en una muestra biológica obtenida de dicho paciente.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde se detecta por lo menos una de las mutaciones siguientes: polimorfismo 5473, A478T, C422F, P561T, T306P y C518Stop.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el paciente tiene una estatura inferior a -2 desviaciones estándares por debajo de la normal para su sexo y edad, tiene un nivel sérico de IGF-I por debajo de los niveles medios normales y un nivel medio o máximo estimulado de GH en suero que como mínimo es normal.