MXPA98009140A

MXPA98009140A - Tratamietno del sindrome de insensibilidad parcial a la hormona del crecimietno

Info

Publication number: MXPA98009140A
Application number: MXPA/A/1998/009140A
Authority: MX
Inventors: M Attie Kenneth; M S Carlsson Lena; Gesundheit Neil; Goddard Audrey
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1996-05-03
Filing date: 1998-11-03
Publication date: 2000-06-05

Abstract

La presente invención se refiere a métodos para incrementar la velocidad de crecimiento de un paciente humano que tiene el síndrome de insensibilidad parcial a la hormona del crecimiento, pero no el síndrome de Laron. Uno de tales métodos comprende administrar una dosis efectiva de la hormona del crecimiento, preferiblemente la hormona del crecimiento con una secuencia humana natural, con o sin la metionina N-terminal, al paciente. El paciente estácaracterizado porque tiene una altura de menos de aproximadamente -2 desviaciones estándares abajo de lo normal para la edad y el sexo, un nivel del suero de la proteína de unión de la hormona del crecimiento de alta afinidad que estáal menos 2 desviaciones estándares abajo de los niveles estándares, un nivel del suero de la IGF-I que estádebajo de los niveles promedio normales, y un nivel del suero de la hormona del crecimiento que es al menos normal. En otro de tales métodos, la misma población de pacientes se trata con una cantidad efectiva de la IGF-I, dada sola o en combinación con una cantidad de la hormona del crecimiento que es efectiva en combinación con la IGF-I.

Description

TRATAMIENTO DEL SÍNDROME DE INSENSIBILIDAD PARCIAL A LA HORMONA DEL CRECIMIENTO Antecedentes de la Invención Campo de la Invención Esta invención se refiere a un método para incrementar las velocidades de crecimiento de los pacientes humanos que tienen el síndrome de insensibilidad parcial a la hormona del crecimiento.

Descripción de los Antecedentes y la Técnica Relacionada La mayoría de los niños con una estatura corta significativa no tienen una deficiencia de la hormona del crecimiento (GH) definida de manera clásica por la respuesta de la GH a estímulos provocativos. Una vez que las causas conocidas de la' estatura corta han sido excluidas, estos pacientes son clasificados con varios términos, incluyendo la estatura corta familiar, el retardo constitucional del crecimiento, o estatura corta ?,idiopática" (ISS) . Algunos de estos niños no pueden alcanzar su potencial genético de altura, aunque no se Rßf.028711 han reportado resultados de estudios longitudinales a gran escala. Puestos que existen así muchos factores que contribuyen al crecimiento normal y al desarrollo, es probable que los pacientes con ISS sean heterogéneos con respecto a su etiología de la estatura corta. A pesar de no ser clásicamente deficientes de la GH, la mayoría de los niños con ISS responden a un tratamiento con GH, aunque no tan bien. Muchos investigadores han buscado alteraciones en la generación de GH espontánea en este grupo de pacientes. Una hipótesis sugiere que algunos de estos pacientes tienen una secreción inadecuada de GH endógena bajo las condiciones fisiológicas, pero son capaces de demostrar una elevación en la GH en respuesta a estímulos farmacológicos, como en las pruebas de estimulación de la GH tradicionales. Este desorden ha sido llamado "disfunción neurosecretoria del GH", y el diagnóstico descansa o se apoya en la demostración de una configuración de GH anormal durante el muestreo del suero prolongado. Numerosos investigadores han reportado los resultados de tales estudios, y han encontrado que esta anormalidad va a estar presente solo ocasionalmente. Otros investigadores han postulado que estos pacientes tienen una "GH bioinactiva"; sin embargo, esto todavía no ha sido demostrado de manera concluyente.

Cuando el receptor de la GH (GHR) se clonó, se demostró que la actividad de unión de GH principal en la sangre se debió a una proteína la cual se deriva del mismo gen que la GHR y corresponde al dominio extracelular de la GHR de longitud total. La mayoría de los pacientes con el síndrome de insensibilidad (o Laron) de la hormona del crecimiento (GHIS) carecen de la actividad de unión del receptor de la hormona del crecimiento y tienen ya sea una ausencia de actividad o una actividad muy baja de la proteína de unión de GH (GHBP) en la sangre. Tales pacientes tienen una evaluación de la desviación estándar de la altura promedio (SDS) de aproximadamente -5 a -6, son resistentes a un tratamiento con GH, y tienen concentraciones de suero incrementadas de la GH y concentraciones de suero bajas del factor de crecimiento semejante a la insulina (IGF-I) . Ellos responden al tratamiento con IGF-I. En pacientes con defectos en el dominio extracelular de GHR, la falta de GHBP funcional en la circulación puede servir como un marcador para la insensibilidad de GH. Existe una subclase de pacientes con ISS que tienen niveles bajos de GHBP en su sangre, quienes tienen una SDS elevada promedio intermedia entre los pacientes con GHIS completa (síndrome de Laron) y los niños normales, y quienes responden algo, pero no completamente, al tratamiento con GH. Esta clase de pacientes pueden estar caracterizados como los que tienen GHIS parcial. Es un objeto de la presente invención identificar un subconjunto de pacientes quienes exhiban GHIS parcial y no tengan una GHIS completa o síndrome de Laron. Es otro objeto tratar este subconjunto identificado de pacientes de modo que los mismos logren una altura o estatura final consistente con su potencial genético como se determinó por la altura de blanco u objetivo paternal promedio. Estos y otros objetos serán evidentes para aquellas personas con experiencia ordinaria en la técnica.

Breve Descripción de la Invención En consecuencia, en un aspecto, la presente invención proporciona un método para incrementar la velocidad de crecimiento de un paciente humano que tenga GHIS parcial, que comprende administrar una cantidad efectiva de GH al paciente, dicho paciente tiene una altura menor que aproximadamente -2 desviaciones estándares abajo de la normal para la edad y el sexo, tiene un nivel de suero de GHBP de afinidad elevada que es al menos de 2 desviaciones estándares abajo de los niveles normales, tiene un nivel del suero de IGF-I que está abajo de los niveles promedio normales, y tiene un promedio del nivel del suero estimulado máximo de GH que es al menos normal, en donde el paciente no tiene el síndrome de Laron. Preferentemente, la GH es una GH recombinante humana. En otro aspecto, la invención proporciona un método para incrementar la velocidad de crecimiento de un paciente humano que tenga un GHIS parcial, que comprende administrar una cantidad efectiva de la IGF-I (preferentemente una IGF-I recombinante humana) al paciente, siempre que el paciente tenga una estatura menor que aproximadamente -2 desviaciones estándares abajo para su edad y sexo, tenga un nivel del suero de GHBP de alta afinidad que es de al menos 2 desviaciones estándares abajo de los niveles normales, tenga un nivel del suero de IGF-I que está abajo de los niveles promedio normales, y tenga un nivel del suelo estimulado promedio o máximo de GH que sea al menos normal, en donde el paciente no tenga el síndrome de Laron. En un aspecto adicional, la invención suministra un método para incrementar la velocidad de crecimiento de un paciente humano que tenga una GHIS parcial, que comprende administrar cantidades de IGF-I y GH al paciente, tales cantidades son efectivas en combinación, siempre que el paciente tenga una estatura menor que aproximadamente -2 desviaciones estándares abajo de lo normal para su edad y sexo, tenga un nivel del suero de GHBP de alta afinidad que es de al menos 2 desviaciones estándares abajo de los niveles normales, tenga un nivel del suero de IGF-I que está abajo de los niveles promedio normales, y tenga un nivel del suelo estimulado promedio o máximo de GH que sea al menos normal, en donde el paciente no tenga el síndrome de Laron. En un aspecto todavía adicional, la presente invención proporciona un método para incrementar la velocidad de crecimiento de un paciente humano que tenga una GHIS parcial, siempre que el paciente tenga un defecto del gen de GHR (intracelular o extracelular) heterogéneo, que comprende administrar una cantidad efectiva de GH y/o IGF/I al paciente. Preferentemente, la GH es la GH recombinante humana y la IGF-I es la IGF-I recombinante humana. En un aspecto todavía adicional, la invención proporciona un método para incrementar la velocidad de crecimiento de un paciente humano que tenga una GHIS parcial, que comprende detectar si el paciente tiene un defecto del gen de GHR heterogéneo (intracelular y/o extracelular), y si es así, administrar una cantidad efectiva de GH y/o de IGF-I al paciente.

Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 muestra las concentraciones de GHBP del suero en los niños en el Genentech National Cooperative Growth Study (NCGS) con deficiencia de la hormona del crecimiento (GHD), ISS, y síndrome de Turner (TS) estandarizado para la edad y el sexo y expresado como SD, por la edad en el tiempo de enrolamiento en el estudio. Esta área sombreada representa el intervalo normal (-2 SD a +2 SD) para cada sexo. La línea continua indica el promedio normal para la edad y el sexo. Ocasionalmente, los puntos para dos o más pacientes se superponen y aparecen como un solo punto. La Figura 2 muestra la velocidad de crecimiento en cm/año de los pacientes enrolados en el NCGS con ISS, tratados con varias dosis de GH administradas por inyección diariamente. La Figura 3A muestra las concentraciones, estandarizadas para la edad y el sexo y expresadas como SDS, por GHBP SDS (promedio + SD) . La Figura 3B muestra las concentraciones de GH de 12 h promedio del muestreo toda la noche cada 20 minutos durante 12 horas, por GHBP SDS (promedio + SD) para los pacientes enrolados en el estudio utilizados para generar la Figura 2. La Figura 4 muestra la velocidad de crecimiento anualizada del primer año (cm/año) por GHBS SDS para los pacientes tratados con GH humana (hGH) quienes permanecieron en la prepubertad durante el primer año de la terapia con GH (n=166) . El área sombreada representa el intervalo normal para la GHBP (-2 SDS hasta +2 SDS) . La Figura 5 es una gráfica de las velocidades de crecimiento para el pretratamiento, el tratamiento del primer año, y el tratamiento del segundo año para los pacientes cuyos datos se describen en la Tabla VII del Ejemplo III posterior que tienen GHBP SDS -2 (n=14) (cuadrados) o una GHBP SDS >-2 (n=29) (círculos) . Las Figuras 6A y 6B muestran, en una forma de gráfica de barras, las velocidades de crecimiento del pretratamiento (Figura 6A) y del tratamiento del primer año (Figura 6B) por GHBP SDS para los pacientes utilizados para generar la Figura 5. La Figura 7 muestra el estado de crecimiento como se predijo por una medición de la secreción de GH (por ejemplo, la concentración de GH estimulada o endógena) contra una medición de su capacidad de respuesta de la GH (por ejemplo, la concentración de GHBP) . La Figura 8 muestra las secuencias de ADN (SEQ ID NOS: 1 y 2, respectivamente) y las secuencias de aminoácidos predichas (SEQ ID NOS: 3 y 4, respectivamente) de dos alelos GHR en el Paciente 4 con ISS (exones 4-6) . Las mutaciones en los alelos 1 y 2 están encajonados. Las barras verticales indican los límites o fronteras de los exones en la secuencia de ADNc . La Figura 9 muestra las secuencias de ADN (SEQ ID NOS: 5 y 6, respectivamente) y las secuencias de aminoácidos predichas (SEQ ID NOS: 7 y 8, respectivamente) de dos alelos de GHR en el paciente 2 con ISS (exon 5) . La mutación en el alelo 2 está encajonada. La Figura 10 muestra las secuencias de ADN (SEQ ID NOS: 9 y 10, respectivamente) y las secuencias de aminoácidos predichas (SEQ ID NOS: 11 y 12, respectivamente) de dos alelos GHR en el Paciente 1 con ISS (exon 7). La mutación en el alelo 2 está encajonada. La secuencia del intrón está dada con letras minúsculas y la secuencia del exon con letras mayúsculas. Las barras verticales indican los límites o fronteras del exon en la secuencia de ADNc.

La Figura 11 muestra las secuencias de ADN (SEQ ID NOS: 13 y 14, respectivamente) y las secuencias de aminoácidos predichas (SEQ ID NOS: 15 y 16, respectivamente) de dos alelos GHR en el Paciente 7 con ISS (exon 7) . La mutación en el alelo 2 está encajonada. La secuencia del intrón está dada con letras minúsculas y la secuencia del exon con letras mayúsculas. Las barras verticales indican los límites o fronteras de los exones en la secuencia de ADNc. Las Figuras 12 a 21 muestran el análisis del gen de GHR para los pacientes aquí, y demuestra la herencia consecuencial de los padres, así como los datos de respuesta del crecimiento para varios de los pacientes de aquí. Véase infra para un texto explicativo adicional. La Figura 22 es una autorradiografía del secuenciamiento de la unión del exon/intrón del exon 8 de la GHR que muestra la secuencia de tipo silvestre y la secuencia de mutantes del paciente 1. El paciente 1 es homozigótico para una transversión de G a C dentro del codón 274 generativo y el codón de ACG (Thr) en lugar de un codón de AGG (Arg) . La Figura 23 es una enzima de restricción con asignación de coordenadas del ADN amplificado por PCR de los elementos de la familia. (a) Un fragmento de 199 pb que contiene el exon 8 se amplificó a partir del ADN genómico de los pacientes 1 y 2 afectados, la madre (M) y el padre (F) del paciente 1, y un sujeto de control (WT) utilizando los cebadores 8a y 8b del oligonucleótido. La mutación genera un sitio Maell que produce 2 fragmentos de 154 y 45 pb respectivamente. Después de 1 h de digestión con Maell los fragmentos de ADN fueron sometidos a electrofóresis de gel de poliacrilamida. Los padres del paciente 1 dieron una configuración de digestión mezclada consistente con la presencia de los alelos tanto mutantes como del tipo silvestre, mientras que ambos pacientes llevan solamente el alelo mutante y el ADN de control solamente el alelo del tipo silvestre. ND = fragmento no digerido. Mk = marcador del TAMAÑO. (b) El linaje parcial de las familias de los pacientes 1 y 2 que demuestra la herencia del alelo mutante como se determinó por el secuenciamiento y la digestión de la restricción del fragmento del exon 8 generado por PCR. El alelo mutante es denotado 154 y el alelo 199 normal (como en la configuración de digestión de la enzima de restricción) . Los datos sobre los individuos integrantes de la prole, recien nacidos, del paciente 1, no han sido mostrados pero la digestión de la restricción del ADN de la placenta reveló una configuración consistente con un estado heterozigótico . La Figura 24 demuestra el efecto de la mutación sobre el empalme de la GHR. (a) La RT-PCR se efectuó sobre el ARN aislado de los linfocitos transformados de EBV del paciente 1 utilizando la técnica de PCR agrupada mostrada (las Secuencias de los cebadores P1-P5 son listadas en la tabla 2) . La última ronda de la PCR que utiliza los cebadores P5 y P6, amplificaron como se esperaba un fragmento de 267 pb en la GHR empalmada normalmente (carriles o pasillos 1 y 2: linfocitos de control normal e hígado respectivamente mientras que en el paciente 1 (carril o pasillo 3) solamente un producto de 176 pb es obtenido el cual es consistente con el salto del exon 8 de 91 pb. M = marcador del tamaño, C = control del agua) (b) El secuenciamiento directo de estos productos de RT- PCR confirmó el salto del exon 8 en el paciente 1 con el exon 7 que se empalma directamente en el exon 9 mientras que ocurre el empalme normal de control del exon 7 en el exon 8.

TABLA A Descripción de las Modalidades Preferidas Definiciones : La población de pacientes tratados por el método de esta invención excluye los pacientes con "síndrome de Laron", conocidos y definidos de otra manera aquí como la gente con una falta completa de función de GHR o de GHIS completa. Estos pacientes logran una estatura adulta de solamente 110-130 cm. Los síntomas comunes adicionales incluyen cara y mandíbula pequeñas, puente nasal deprimido, protuberancias frontales, obesidad, voz de tono alto, e hipoglicemia en la niñez temprana. Bioquímicamente, los mismos están caracterizados porque tienen concentraciones de GH incrementadas en el suero pero concentraciones bajas en el suero de IGF-I. El "incremento de la velocidad de crecimiento de un paciente humano" incluye no solamente la situación en donde el paciente logra al menos la misma estatura final que los pacientes deficientes de GH tratados con GH (es decir, los pacientes diagnosticados con GHD), sino que también se refiere a una situación en donde los pacientes alcanzan su estatura a la misma velocidad de crecimiento que los pacientes deficientes de GH tratados con GH, o logran una estatura de adulto que está dentro del intervalo de estatura de blanco u objetivo, es decir, una estatura final consistente con su potencial genético como se determinó por la estatura de blanco u objetivo de los padres promedio. El "síndrome de insensibilidad parcial a la hormona del crecimiento" o "GHIS parcial" se refiere a un síndrome en donde el paciente responde a la misma dosis de GH que aquella proporcionada a los pacientes deficientes de GH, pero no responden tan bien. Este síndrome está caracterizado además porque el paciente tiene una estatura de menos de aproximadamente -2 desviaciones estándares abajo de lo normal para la edad y el sexo, preferentemente en el intervalo de menos de aproximadamente -2 hasta aproximadamente -4 desviaciones estándares abajo de lo normal para la edad y el sexo, tienen un nivel del suero de GHBP de afinidad elevada que está al menos 2 desviaciones estándares (típicamente 2-4 desviaciones estándares) abajo del nivel normal para los seres humanos, tienen un nivel en el suero de IGF-I que está abajo del nivel promedio normal para los seres humanos, y tiene un nivel en el suero estimulado máximo o promedio de GH que es al menos normal para los seres humanos. Los niveles de suero promedio son el promedio de las mediciones en los pacientes. Cuando se utilice aquí, "estatura corta no deficiente de GH" se refiere a un paciente que tiene una SDS elevada de aproximadamente < 2 SD abajo de lo normal para la edad y el sexo y no tienen una GHD (como está definido de manera clásica con base en los niveles de secreción de GH abajo de un nivel de umbral mínimo) . Cuando se utilice aquí, la "hormona del crecimiento" o "GH" se refiere a la hormona del crecimiento en la secuencia natural o en una forma variable, y desde cualquier fuente, ya sea natural, sintética, o recombinante. Los ejemplos incluyen la hormona del crecimiento humano (hGH) , la cual es una GH natural o recombinante con la secuencia natural humana (somatotropina o somatropina) , y la hormona del crecimiento recombinante (rGH) , la cual se refiere a cualquier GH o variante de GH producida por medio de la tecnología de ADN recombinante, incluyendo somatrem, somatotropina, y somatropina. Se prefiere aquí para uso humano la secuencia natural humana recombinante, la GH madura con o sin una metionina en su terminal N. Es más preferida la hormona del crecimiento humana de metionilo (met-hGH) producida en el E. Coli, por ejemplo, por el proceso descrito en la patente U.S. No. 4,755,465 expedida el 5 de julio de 1988 y Goeddel et al., Nature, 282: 544 (1979) . La Met-hGH, la cual es vendida bajo la marca registrada Protropin® por Genent.ech, Inc., es idéntica al polipéptido natural, con la excepción de la presencia de un residuo de metionina N-terminal. Este aminoácido agregado es un resultado del proceso de síntesis de proteína bacteriana. También se prefiere la hGH recombinante disponible de Genentech, Inc., bajo la marca registrada Nutropin®. Esta última hGH carece de este residuo de metionina y tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a aquella de la hormona natural. Véase Gray et al., Biotechnology, 2: 161 (1984). Tanto la hGh de metionilo como la hGH tienen potencias y valores farmacocinéticos equivalentes. Moore et al., Endocrinology, 122: 2920-2026 (1988). Otro candidato apropiado es una variante de hGH que es una forma placentaria de la GH con actividad somatogénica pura y sin actividad lactogénica como se describe en la patente U.S. No. 4,670,393 expedida el 2 de junio de 1987. También están incluidas las variantes de GH que se describen en WO 90/04788 publicada el 3 de mayo de 1990 y WO 92/09690 publicada el 11 de junio de 1992. Cuando se utilice aquí, "IGF-I" se refiere al factor de crecimiento I semejante a la insulina de cualesquiera especies, incluyendo bovina, ovina, porcina, equina, de aves, y preferiblemente humana, en la secuencia natural o en una forma variable, y a partir de cualquier fuente, ya sea natural, sintética, o recombinante. La IGF-I ha sido aislada del suero humano y producida recombinantemente. Véase, por ejemplo, EP 123,228 y 128,733. Preferida aquí para uso humano es la secuencia natural humana, la IGF-I madura, más preferiblemente sin una metionina N-terminal, preparada, por ejemplo, por el proceso descrito en EP 230,869 publicada el 5 de agosto de 1987; EP 128,733 publicada el 19 de diciembre de 1984; o EP 288,451 publicada el 26 de octubre de 1988. Más preferentemente, esta IGF-I de secuencia natural es producida recombinantemente y está disponible de Genentech, Inc., South San Francisco, CA para investigaciones clínicas. Las variantes de IGF-I preferidas son aquellas descritas en la patente U.S. No. 5,077,276 expedida el 31 de diciembre de 1991, en PCT WO 89/05822 publicada el 29 de junio de 1989, es decir, aquellas en donde al menos el residuo de ácido glutámico está ausente en la posición 3 de la terminal N de la molécula madura o aquellas que tienen una deleción de hasta cinco aminoácidos en la terminal N. La variante más preferida tiene los primeros tres aminoácidos de la terminal N delecionados (designados variablemente como la IGF del cerebro, tIGF-I, des(l-3)-IGF-I, o des-IGF-I). La "proteína de unión de la hormona del crecimiento de alta afinidad" o "GHBP de alta afinidad" se refiere al dominio extracelular de la GHR que circula en la sangre y funciona como una GHBP en varias especies (Ymer y Herington, Mol. Cell. Endocrino., 41: 153 [1985]; Smith y Talamantes, Endocrinology, 123: 1489-1494 [1988]; Emtner y Roos, Acta Endocrinologica (Copenh.), 122: 296-302 [1990]), incluyendo el hombre. Baumann et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. (J.C.E.M.), 62: 134-141 (1986); EP 366,710 publicada el 9 de mayo de 1990; Herington et al., J. Clin. Invest., 77: 1817-1823 (1986); Leung et al., Nature, 330: 537-543 (1987). Una segunda BP con afinidad inferior hacia la GH también ha sido descrita, la cual parece que no va a estar relacionada estructuralmente con la GHR. Baumann y Shaw, J.C.E.M. , 70: 680-686 (1990) . Existen varios métodos para medir la GHBP funcional en el suero, con el método preferido que es un ensayo inmunofuncional mediado por ligando (LIFA) descrito por Carlsson et al., J.C.E.M. , 73: 1216 (1991) y la patente U.S. No. 5,210,017.

Modos para Llevar a Cabo la Invención: La subpoblación de los pacientes ubicados como blanco para el tratamiento de la presente invención consiste de aquellos pacientes con GHIS parcial como se definió anteriormente. El paciente debe exhibir cada una de las señales clínicas descritas que van a ser tratables por el método reivindicado aquí. La GH y/o la IGF-I es administrada directamente al paciente por cualquier técnica adecuada, incluyendo parental, intranasal, intrapulmonar, y oralmente, o por absorción a través de la piel. Si las mismas son administradas conjuntamente, las mismas no necesitan ser administradas por la misma ruta. Las mismas pueden ser administradas local o sistémicamente. Los ejemplos de la administración parenteral incluyen la administración subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraarterial, e intraperitoneal. Preferentemente, las mismas son administradas por inyección subcutánea diaria. La GH y/o la IGF-I que van a ser utilizadas en la terapia serán formuladas y dosificadas de una manera consistente con una buena práctica médica, tomando en cuenta la condición clínica del paciente individual (especialmente los efectos laterales del tratamiento con la GH o IGF-I sola), el sitio de suministro de la(s) composición (es) de IGF-I y GH, el método de administración, la programación de la administración, y otros factores conocidos por los practicantes de la técnica. Las "cantidades efectivas" de cada componente para los propósitos de aquí son determinados así por tales consideraciones y son cantidades que incrementan las velocidades de crecimiento de los pacientes. Si la GH es administrada sola, se emplea preferentemente una dosis mayor que aproximadamente 0.2 mg/kg/semana, más preferentemente mayor que aproximadamente 0.25 mg/kg/semana, y aún más preferentemente mayor que o igual a aproximadamente 0.3 mg/kg/semana. En una modalidad, la dosis de la GH varía desde aproximadamente 0.3 hasta 1.0 mg/kg/semana, y en otra modalidad, 0.35 a 1.0 mg/kg/semana. Preferentemente, la GH es administrada una vez al día subcutáneamente.

La GH es administrada adecuadamente de manera continua o no continua, tal como en períodos de tiempo particulares (por ejemplo, una vez al día) en la forma de una inyección de una dosis particular, en donde existirá una elevación en el plasma de la concentración de GH hasta el instante de la siguiente inyección. Otro método de administración no continuo resulta del uso de las microesferas de PLGA y muchos dispositivos de implante disponibles que proporcionan una liberación no continua del ingrediente activo, tales como una dosificación potente inicial, y luego un retardo antes de la liberación del ingrediente activo. Véase, por ejemplo, la patente U.S. No. 4,767,628, col. 2, líneas 19-37. La GH también puede ser administrada para que tenga una presencia continua en la sangre que es mantenida para la duración de la administración de la GH. Esto es efectuado de manera más preferente por medio de la infusión continua por medio, por ejemplo, de una minibomba tal como una minibomba osmótica. Alternativamente, la misma es efectuada apropiadamente por el uso de inyecciones frecuentes de GH (es decir, más de una vez diariamente, por ejemplo, dos o tres veces diariamente) . En todavía otra modalidad, la GH puede ser administrada utilizando formulaciones de GH de actuación a largo plazo que ya sea retardan la desaparición de la GH de la sangre o provocan una liberación lenta de la GH, por ejemplo, desde un sitio de inyección. La formulación para actuación a largo plazo que prolonga la depuración o desaparición en el plasma de la GH puede estar en la forma de GH en la forma de un complejo, o conjugada covalentamente (por unión reversible o irreversible) a una acromolécula tal como una o más de sus proteínas de unión (WO 92/08985 publicada el 29 de mayo de 1992) o un polímero soluble en agua seleccionado de PEG y los homopolímeros de polipropilenglicol y polioxietilen polioles, es decir, aquellos que son solubles en agua a temperatura ambiente. Alternativamente, la GH puede ser convertida en un complejo o unida a un polímero para incrementar su vida media circulatoria. Los ejemplos de polietilenglicoles y polioxietilen polioles útiles para este propósito incluyen el polioxietilen glicerol, polietilenglicol, polioxietilen sorbitol, polioxietilen glucosa, o semejantes. El esqueleto de glicerol del polioxietilen glicerol es el mismo esqueleto que está presente, por ejemplo, en animales y seres humanos en los mono-, di-, y triglicéridos. El polímero no necesita tener ningún peso molecular particular, pero se prefiere que el peso molecular esté entre aproximadamente 3500 y 100,000, más preferentemente entre 5000 y 40,000. Preferentemente, el homopolímero de PEG está sin substituir, pero el mismo puede estar substituido en un extremo con un grupo alquilo. Preferentemente, el grupo alquilo es un grupo alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, y más preferentemente un grupo metilo. Más preferentemente, el polímero es un homopolímero no substituido de PEG, un homopolímero substituido con un monometilo de PEG (mPEG) , o un polioxietilen glicerol (POG) y tiene un peso molecular de aproximadamente 5000 a 40,000. La GH está unida covalentemente por medio de uno o más de los residuos de aminoácidos de la GH a un grupo' reactivo terminal sobre el polímero, dependiendo principalmente de las condiciones de la reacción, el peso molecular del polímero, etc. El polímero con el (los) grupo (s) reactivo (s) está designado aquí como un polímero activado. El grupo reactivo reacciona selectivamente con el amino libre u otros grupos reactivos sobre la GH. Se sobreentenderá, sin embargo, que el tipo y la cantidad del grupo reactivo elegido, así como el tipo del polímero empleado, para obtener resultados óptimos, dependerá de la GH particular empleada para evitar tener que el grupo reactivo reaccione con demasiados grupos activos particularmente sobre la GH. Como esto no puede ser posible que se evite por completo, es recomendable que en general desde aproximadamente 0.1 hasta 1000 moles, preferentemente de 2 a 200 moles, del polímero activado por mol de la proteína, dependiendo de la concentración de la proteína, sean empleados. La cantidad final del polímero activado por mol de la proteína es una cantidad balanceada para mantener la actividad óptima, mientras que al mismo tiempo se optimiza, si el posible, la vida media circulatoria de la proteína. Aunque los residuos pueden ser cualesquiera aminoácidos reactivos sobre la proteína, tales como una o dos cisteínas o el grupo aminoácido N-terminal, preferentemente el aminoácido reactivo es la lisina, la cual está unida o enlazada al grupo reactivo del polímero activado a través de su grupo amino-epsilon libre, o el ácido glutámico o aspártico, el cual está unido o enlazado al polímero a través de una unión de amida. La reacción de modificación covalente se puede llevar a cabo por cualquier método apropiado utilizado generalmente para hacer reaccionar biológicamente los materiales activos con polímeros inertes, preferentemente a aproximadamente pH 5-9, más preferentemente 7-9 si los grupos reactivos sobre la GH son los grupos de la lisina. En general, el proceso involucra la preparación de un polímero activado (con al menos un grupo hidróxilo terminal), preparar un substrato activo a partir de este polímero, y después de esto hacer reaccionar la GH con el substrato activo para producir la GH adecuada para la formulación. La reacción de modificación anterior puede ser efectuada por varios métodos, los cuales pueden involucrar uno o más pasos. Los ejemplos de los agentes modificadores que pueden ser utilizados para producir el polímero activado en una reacción de un paso incluyen el cloruro de ácido cianúrico (2, 4, 6-tricloro-S-triazina) y el fluoruro de ácido cianúrico. En una modalidad la reacción de modificación se lleva a cabo en dos pasos en dos pasos en donde el polímero se hace reaccionar primero con un anhídrido ácido tal como el anhídrido succínico o glutárico para formar un ácido carboxílico, y el ácido carboxílico se hace reaccionar entonces con un compuesto capaz de reaccionar con el ácido carboxílico para formar un polímero activado con un grupo de éster reactivo que es capaz de reaccionar con la GH. Los ejemplos de tales compuestos incluyen la N-hidroxisuccinimida, el ácido 4-hidroxi-3-nitrobencensulfónico, y semejantes, y preferentemente se utiliza la N-hidroxisuccinimida o el ácido 4-hidroxi-3-nitrobencensulfónico. Por ejemplo, el PEG substituido con monometilo se puede hacer reaccionar a temperaturas elevadas, preferentemente de aproximadamente 100-110 °C durante cuatro horas, con anhídrido glutárico. El ácido monometil PEG-glutárico así producido se hace reaccionar entonces con N-hidroxisuccinimida en la presencia de un reactivo de carbodiimida tal como la diciclohexil o isopropil carbodiimida para producir el polímero activado, el glutarato de metoxipolietílen glicolil-N-succinimidilo, el cual se puede hacer reaccionar entonces con la GH. Este método se describe en detalle en Abucho ski et al., Cáncer Biochem. Biophys., 1_: 175-186 (1984). En otro ejemplo, el PEG substituido con monometilo se puede hacer reaccionar con anhídrido glutárico seguido por la reacción con ácido 4-hidroxi-3-nitrobencensulfónico (HNSA) en la presencia de diciclohexil carbodiimida para producir el polímero activado. El HNSA es descrito por Bhatnagar et al., Peptides : Synthesis-Structure-Function, Proceedings of the Seventh American Peptide Symposium, Rich et al. (eds.) (Pierce Chemical Co., Rockford IL, 1981), p. 97-100, y en Nitecki et al., High-Tec nology Route to Virus Vaccines (American Society for Microbiology: 1986) titulada "Novel Agent for Coupling Synthetic Peptides to Carriers and Its Applications". Los métodos específicos de producción de la GH conjugada con la PEG incluyen los métodos descritos en la patente U.S. No. 4,179,337 sobre la PEG-GH y la patente U.S. No. 4,935,465, la cual describe la PEG unida reversible pero covalentamente a la GH. Otros métodos específicos para producir la PEG-GH incluyen los siguientes : La PEGilación (tratamiento con PEG) con el aldehido de metoxipolietilenglicol (aldehido de Me-PEG) por alquilación reductiva y la purificación es efectuada agregando a 2 mg/ml de GH en una solución salada amortiguada con fosfato (PBS) pH 7.0, 5 mM de Me-PEG aldehido-5000 (peso molecular de 5000 daltons) y 20 mM de NaCNBH3 y se mezcla suavemente a temperatura ambiente durante 3 horas. La etanolamina es agrega entonces a 50 mM para a idar reductivamente el Me-PEG que permaneció sin reaccionar. La mezcla es separada sobre una columna de intercambio aniónico, FPLC Mono Q. El Me-PEG que no reaccionó sobrante no se une a la columna y pueden ser separado entonces de la mezcla. Dos fracciones de GH tratadas con PEG principales son obtenidas con pesos moleculares aparentes de 30K y 40K durante la SDS-PAGE reducida, contra 20K de la GH que no reaccionó. El complejo de GH-GHBP es tratado con PEG de la misma manera para dar un derivado de 150K por filtración con gel. El tratamiento con un PEG por ejemplo el N-hidroxisuccinimidil PEG (NHS-PEG) y la purificación son efectuados agregando NHS-PEG a un exceso molar de 5 veces de la concentración de lisina total de GH a una solución que contiene 2 mg/ml de GH en 50 mM de solucipón amortiguadora de borato de sodio a un pH de 8.5 o PBS a pH 7, y mezclando a temperatura ambiente durante una hora. Los productos son separados sobre una columna de dimensionamiento Superóse 12 y/o Mono Q de FPLC. La GH tratada con PEG varía en su tamaño dependiendo del pH de la reacción desde aproximadamente 300 K para la corrida de la reacción a un pH de 8.5 a 40 K para el pH de 7.0 como se midió por filtración de gel. El complejo de GH-GHBP también es tratado con PEG de la misma manera con el peso molecular resultante de 400 a 600 Kd a partir de la filtración de gel. El tratamiento con PEG de los mutantes de cisteína de la GH con PEG-maleimida es efectuada preparando un mutante de cisteína único de GH por la mutagénesis dirigida al sitio, secretándola desde una cepa 16C9 de E. Coli (W3110 ?tonA phoA ?E15 ?(argF-lac)169 deoC2 que no produce la proteína deoC) , y purificándola sobre una columna de intercambio deaniones. La cepa 16C9 se construyó genéticamente transfiriendo el alelo deoC2 de la cepa CGSC#6092 (No. 6092, disponible del E. Coli Genetic Stock Center, New Haven, Conn. Y descrito en Mark et al., Molec. Gen. Genet. , 155: 145-152 (1977), con el genotipo trxAl recAl ilvE720::tn5 metE70 deoC2 lacZ53 rha5 malB45 rspL151) en una cepa designada 7C1. La cepa 7C1 [con el genotipo W3110 ?tonA phoA ?E15 ?(argF-lac) 169] se construyó en varios pasos utilizando técnicas que involucran las transducciones con el fago PlKc, derivado de Pl (J. Miller, Experiments in Molecular Genetics [Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory, 1972]), y las características genéticas del transposon (Kleckner et al., J. Mol. Biol., 116: 125-159 {1977]). El E. Coli ?+) (Bachmann, Bact. Rev. , 36: 525-557 [1972]), se utilizó como el huésped de partida. En primer lugar, el gen tonA (fhuA) (Kadner et al., J. Bact., 143: 256-264 [1980]; Bachmann, Microbiol. Rev., 47: 180-230 [1983]) fue delecionado por la inserción y excisión imprecisa subsiguiente de un transposon TnlO en el gen tonA. En el primer paso de este procedimiento, el E. Coli W3110 se transdujo con ?: :TnlO para generar un conjunto de salto o etapa de TnlO del E. Coli W3110 (Kleckner et al., J. Mol. Biol., supra) . El conjunto de salto de W3110::TnlO de E. Coli se hizo crecer en el caldo L a 37 °C hasta una densidad celular de aproximadamente 1 x 109/ml. Un total de 0.5 ml del cultivo se centrifugaron y las microesferas se volvieron a suspender en 0.2 ml de un lisado de ?phi80 que contiene 7.9 x 109 pfu. Al fago se le permite adsorberse durante 30 minutos a 37 °C. La suspensión se rocía entonces sobre placas de EMB suplementadas con tetraciclina (15 µm/ml). Después de la incubación toda la noche a 37 °C, las colonias fueron agrupadas en 3 ml de caldo L, se hicieron crecer toda la noche a 37 °C, se lava dos veces, y se vuelven a suspender en un caldo L. Un lisado de Plkc del bacteriófago se hizo en este cultivo (Miller, J.H., Experiments en Molecular Biology, supra, página 304). El E. Coli AT982 (No. 4546, E. Coli Genetic Stock Center, New Haven, Conn.) se transdujo a resistente a la tetraciclina por este lisado de Plkc. Los agentes de transducción fueron seleccionados sobre placas con caldo L suplementadas con tetraciclina (15 µg/ml) y 40 µg/ml de ácido diaminopimélico (dap) . Los agentes de transducción resultantes fueron seleccionados para verificar la resistencia a la tetraciclina y la regeneración del gen dap (dap+, tetR) . Los agentes transductores de dap+, tetR se probaron entonces para verificar la resistencia del ?phi80. Los usados de Plkc se hicieron entonces sobre varias cepas resistentes a dap+, tetR, ?phi80. Los usados fueron utilizados para transducir la E. Coli W3110 a resistente a la tetraciclina. Los agentes transductores fueron tamizados y seleccionados para verificar la resistencia a ?phi80. Las substancias aisladas sensibles a la tetraciclina se seleccionaron de los agentes transductores de W3110 tonA: :Tnl0-?phi80R. Maloy y Nunn, J. Bacteriol., 145: 1110 (1981) . Estas substancias aisladas fueron verificadas para la resistencia al ?phidO y la sensibilidad a la tetraciclina después de la purificación de la colonia única. El ADN se aisló de varios mutantes resistentes a ?phi80 sensibles a la tetraciclina y se digerieron con Sstll. El ADN digerido con Sstll esta caracterizado por el procedimiento de manchado de Southern utilizado el ADN ?::TnlO digerido con Sstll como una sonda para determinar si el TnlO ha sido escindido. Davis et al., Advanced Bacterial Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980) . Una de las substancias sensibles a la tetraciclina se muestra que tiene perdidas dos de las bandas de hibridación de TnlO cuando se compara con la hibridación entre el ADN apartir del ?::TnlO y el W3110 tonA: :Tnl0?phi80R. Una tercera banda de hibridación tiene una movilidad alterada, indicando que una deleción provocada por la excisión imprecisa de la TnlO ha ocurrido.

La electrofóresis de gel de SDS de las preparaciones de la membrana externa de la cepa con una excisión de TnlO imprecisa revelaron que la banda que se supuso va a ser la proteína TonA tuvo una movilidad electroforética alterada cuando se compara con la proteína de TonA del tipo silvestre. La proteína resultante fue no funcional como una proteína del receptor del fago ?phidO. Una segunda cepa independiente que también ha padecido una excisión imprecisa del TnlO no mostró ninguna proteína de TonA sobre el gel de SDS. Ninguna de estas cepas demostró la inversión a la resistencia a la tetraciclina o a la susceptibilidad al ?phi?O, indicando que existió una excisión imprecisa de la totalidad o de parte del transposón de TnlO junto con una deleción ya sea parcial o completa del gen de TonA. Por consiguiente, la proteína de TonA (PM 78,000) se eliminó de la membrana externa, haciendo a la cepa W3110 tonA resistente a varios bacteriófagos. Luego, dos mutaciones de deleción adicionales phoA ? E15 (Sarthy et al., J. Bact., 145: 288-292 [1981]) y ? (argF-lac) -169 (Schweizer et al., Mol. Gen. Genet., 192: 293-294 [1983] ) , fueron transferidos simultáneamente en W3110 tonA por la unión o enlace genético a un transposon resistente a la kanamicina insertado en el gen biosintético de prolina (proC::Tn5).

El transposon se eliminó seleccionando un agente de reversión prototrófico espontáneo (pro+) sobre placas de agar mínimo glucosa. La introducción de la mutación phoA se reconoció como agentes de transducción que forman colonias blancas sobre las placas de agar mínimo-glucosa con 0.2 mM fosfato y 20 mg/1 de fosfato de 5-bromo-4-cloro~3-indolilo. De manera semejante, la mutación de ?(argF-lac) 169 provoca la pérdida de la beta-galactosidasa de la enzima y conduce a células que forman colonias blancas sobre las placas de agar lactosa al 1% de MacConkey. Lo que resulta es la cepa 7C1. Finalmente, la mutación de deoC (Bachmann, supra) , removiendo la aldolasa, se introdujo en 71C por un proceso de pasos múltiples de transducciones utilizando el fago Plkc. Se utilizaron métodos estándares para la transducción. En primer lugar, la auxotrofía de treonina se introdujo en 7C1 para proporcionar un medio para la selección positiva de ios segmentos cromosómicos transducidos en la región del gen de deoC como sigue. La Plkc se hizo crecer sobre un auxótrofo de treonina, tales auxótrofos se describen en Clare N. Berg y Douglas E. Berg, Microbiology-1981, "Bacterial Transposons", pp. 107-116 (A er. Soc. for Microbiology, Washington, DC, 1981) .

El lisado resultante se utiliza para transducir la cepa 7C1 a resistente a la tetraciclina, seleccionando los agentes transductores sobre las placas de LB que contienen 25 µg/ml de tetraciclina. La cepa resultante, designada 14A9 (tonA?, phoA?E15, ?(argF-lac) 169 thr::tnlO), se revertió espontáneamente por fototrofía a una frecuencia elevada, de modo que las placas de ácido fusárico (J. Bact., 145: 1110 [1981] ) se utilizaron para seleccionar un auxótrofo de treonina sensible a la tetraciclina, designada la cepa 16C4. La Plkc se hizo crecer sobre la Cepa CGSC#6092, descrita supra. El lisado resultante se utilizó para transducir la cepa 16C4 por fototrofía, seleccionado para el crecimiento sobre placas de agar mínimo-glucosa. Para obtener un lisado de transducción de alta frecuencia a partir de la cepa 2D4, el fago Plkc tuvo que ser sometido a un ciclo para el crecimiento dos veces sobre este huésped. Cinco agentes transductores fototróficos de la cepa 16C4 se aislaron, purificaron, y probaron para el crecimiento sobre las placas de agar mímino-timidina. Cuatro de cinco de estas substancias aisladas podrían no crecer sobre la timidina y por lo tanto han recibido la mutación de deoC2 que elimina la síntesis de la proteína de deoC. Una de estas cuatro substancias aisladas se salvó y fue designada la cepa 16C9 (?tonA phoA ?E15 ?(argF-lac) 169 deoC2). La PEG-maleimida se hizo haciendo reaccionar la monometoxiPEG amina con sulfo-MBs en fosfato de sodio 0.01M de p 7.5 durante una hora a .temperatura ambiente y la solución amortiguadora se intercambió a una solución amortiguadora de fosfato de pH 6.2. A continuación la GH con una cisteína adicional libre se mezcló durante una hora y la mezcla final se separa sobre una columna Mono Q como en la GH tratada con un PEG de Me-PEG aldehido. Cuando los enlaces de éster son química y físicamente lábiles, puede ser preferible utilizar un reactivo de PEG en la reacción de conjugación que no contienen una funcionalidad de éster. Por ejemplo, un enlace de carbamato se puede hacer haciendo reaccionar el éster monometílico-PEG con fosgeno para dar el PEG-cloroformiato. Este reactivo podría ser utilizado entonces de la misma manera que el éster de NHS para funcionalizar las amidas con cadenas laterales de lisina. En otro ejemplo, un enlace de urea se fabrica haciendo reaccionar un éster de amino-PEG- onometilo con fosgeno. Esto podría producir un PEG-isocianato que reaccionará con las lisina aminas. Una manera preferida de fabricar la PEG-GH, la cual no contiene un éster desdoblable en el reactivo de PEG, se describe como sigue: el Metoxipoli (etilenglicoi) es convertido a un ácido carboxílico por titulación con sodio naftaleno para generar el alcóxido, seguido por el tratamiento con acetato de bromoetilo para formar el éter etílico, seguido por hidrólisis hasta el ácido carboxílico correspondiente por el tratamiento con hidróxido de sodio y agua, como se reportó por Bückmann et al., Macromol. Chem., 182: 1379-1384 (1981). El ácido carboxílico resultante es convertido entonces a un éster PEG-N-hidroxisuccinimidílico adecuado para la acilación del GH por la reacción del ácido carboxílico resultante con la diciclohexil-carbodiimida y el NHS en acetato de etilo. El reactivo de NHS-PEG resultante se hace reaccionar entonces con 12 mg/ml de GH utilizando un exceso molar de 30 veces sobre la GH en una solución amortiguadora de borato de sodio, pH 8.5, a temperatura ambiente durante una hora y se aplica a una columna de Q Sepharose en una solución amortiguadora de TRIS y eluida con un gradiente de sal. Luego el mismo se aplica a una segunda columna (fenil Toyopearl) equilibrada en una solución amortiguadora de citrato de sodio 0.3 M, pH 7.8. La GH tratada con PEG es eluida entonces con un gradiente de sal inversa, agrupada, e intercambiada con la solución amortiguadora utilizando una columna de desalación de G25 en una solución amortiguadora de manitol, glicina, y fosfato de sodio a un pH de 7.4 para obtener una PEG7-GH formulada adecuadamente. Las moléculas de GH tratadas con PEG y el complejo de GH-GHBP, pueden estar caracterizados por SDS-PAGE, filtración de gel, NMR, asignación de coordenadas trípticas, espectrofotometría de masa-cromatografía líquida, y el ensayo biológico in vitro. El grado del tratamiento con PEG es mostrado primero adecuadamente por SDS-PAGE y la filtración del gel y luego se analizaron por RMN, la cual tiene un pico de resonancia específica para los hidrógenos del metileno de PEG. El número de grupos de PEG sobre cada molécula puede ser calculado del espectro de NMR o por espectrometría de masa. La electrofóresis de gel de poliacrilamida en SDS al 10% es corrida apropiadamente en Tris-HCl 10 mM de pH 8.0, 100 mM NaCl como una solución amortiguadora de elución. Para demostrar cual residuo está tratado con PEG, la asignación de coordenadas trípticas puede ser efectuada. Por consiguiente, la GH tratada con PEG es digerida con tripsina a la relación de proteína/enzima de 100 a 1 en base de mg a 37 °C durante 4 horas en acetato de sodio 100 mM, Tris-HCl 10 mM, cloruro de calcio 1 mM, pH 8.3, y acidificada a pH < 4 para detener la digestión antes de la separación sobre la HPLC (CLAR) Nucleosil C-18 (4.6 mm x 150 mm, 5µ, 100A) . El cromatograma es comparado con aquel del material de partida no tratado con PEG. Cada pico puede ser analizado entonces por espectroscopia de masa para verificar el tamaño del fragmento en el pico. El (los) fragmento (s) que llevan grupos de PEG usualmente no son retenidos sobre la columna de CLAR después de la inyección y desaparece del cromatógrafo. Tal desaparición del cromatógrafo es una indicación del tratamiento con PEG sobre este fragmento particular que debe contener al menos un residuo de lisina. La GH tratada con PEG puede ser evaluada entonces para verificar su capacidad para unirse a la GHBP por métodos convencionales. Los diversos métodos de tratamiento con PEG utilizados produjeron varias clases de GH del tipo silvestre tratada con PEG, con pesos moleculares aparentes de 35K, 51K, 250K, y 300K por cromatografía de exclusión de tamaño, las cuales deben estar cercanas a su volumen hidrodinámico natural. Estas fueron designadas como PEG1-GH, PEG2-GH, PEG3-GH, y PEG7-GH, respectivamente. De los resultados de la asignación de coordenadas trípticas, la PEG1-GH y PGE2-GH ambas tuvieron el fragmento de aminoácido 9 N-terminal omitido del cromatograma y posiblemente tratado con PEG, lo cual podría ser confirmado por la espectrometría de masa de las especies moleculares grandes encontradas en el flujo pasante del cromatógrafo del líquido. A partir del peso molecular sobre SDS-PAGE, la PEGl-GH puede tener un PEG sobre la amina N-terminal, y la PEG2-GH puede tener dos moléculas de PEG sobre la amina N-terminal, formando una amida terciaria. La PEG3-GH tiene aproximadamente 5 grupos de PEG por molécula con base en el RMN resultante, y sobre el mapa tríptico, al menos cinco fragmentos de péptido fueron omitidos, sugiriendo que los mismos fueron tratados con PEG. La molécula de PEG7-GH se cree que tiene 6-7 grupos PEG por molécula con base en la espectrometría de masa. Los sitios para agregar los grupos PEG a la GH, y aquellos que son los residuos preferidos para tal conjugación, son la metionina o fenilalanina N-terminal, lisina 38, lisina 41, lisina 70, lisina 140, lisina 145, lisina 158, y lisina 168. Dos usinas que parece que no fueron tratadas con PEG fueron la lisina 115 y la lisina 172. La GH también es administrada adecuadamente por sistemas de liberación sostenida. Los ejemplos de las composiciones de liberación sostenida útiles aquí incluyen matrices poliméricas semipermeables en la forma de artículos conformados, por ejemplo, películas, o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida incluyen polilactidas (patente U.S. No. 3,773,919, EP 58,481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers, 22, 547-556 [1983]), poli (metacrilato de 2-hidroxietilo) (Langer, Chem. J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 [1981]; Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 [1982]), acetato de vinilo etileno (Langer et al, supra) o ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico (EP 133,988), y microesferas de PLGA. Las composiciones de GH de liberación sostenida también incluyen GH atrapadada liposómicamente. Los liposomas que contienen GH son preparados por métodos conocidos per se: DE 3,218,121; Epstein et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77: 4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; Solicitud de Pat. Japonesa 83-118008; Patentes U.S. Nos. 4,485,045 y 4,544,545; y EP 102,324. Ordinariamente, los liposomas son del tipo unilaminar pequeño (de aproximadamente 200-800 Angstroms) en los cuales el contenido de lípidos es mayor que aproximadamente 30 por ciento en mol de colesterol, la proporción seleccionado es ajustada para la terapia óptima. Además, una formulación de liberación sostenida activa biológicamente se puede hacer a partir de un aducto de la GH unida covalentemente a un polisacárido activado como se describió en la Patente U.S. No. 4,857,505 expedida el 15 de agosto de 1989. Además, la Patente U.S. No. 4,837,381 describe una composición de microesferas de grasa o de cera o de una mezcla de las mismas y la GH para liberación lenta. En otra modalidad, los pacientes identificados anteriormente son tratados con una cantidad efectiva de IGF-I. Como una proposición general, la cantidad efectiva farmacéuticamente total de la IGF-I administrada parenteralmente por dosis estará en el intervalo de aproximadamente 50 a 240 µg/kg/día, preferentemente 100 a 200 µg/kg/día, del peso corporal del paciente, aunque, como se señaló anteriormente, esta estará sometida en gran parte a la discreción terapéutica. También, preferentemente la IGF-I es administrada una o dos veces por día por inyección subcutánea. La IGF-I puede ser administrada por cualquier medio, incluyendo inyecciones (varias o una sola, por ejemplo 1-4 por día) o infusiones. Como con la GH, la IGF-I puede ser formulada para que tenga una presencia continua en la sangre durante el curso del tratamiento, como se describió anteriormente para la GH. Por consiguiente, la misma puede estar fijada covalentemente a un polímero o hecha en una formulación de liberación sostenida como se describió anteriormente.

Además, la IGF-I es administrada apropiadamente junto con una cualquiera o más de sus proteínas de unión, por ejemplo, aquellas conocidas comúnmente, es decir, IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-5, o IGFBP-6. La IGFBP-1 también puede ser unida a un receptor o anticuerpo o fragmento de anticuerpos para la administración. La proteína de unión preferida para la IGF-I aquí es la IGFBP-3, la cual es descrita en la Patente U.S. No. 5,258,287 y por Martin y Baxter, d\_ Biol. Chem., 261: 8754-8760 (1896). Esta proteína de IGFBP-3 glicosilada es un componente estable ácido de aproximadamente 53 Kd sobre un gel de SDS-PAGE no reductor de un complejo de glicoproteína de 125-150 Kd encontrado en el plasma humano que lleva la myoría de los IGFs endógenas y también son reguladas por GH. La administración de la proteína de unión de IGF con la IGF-I puede ser efectuada por el método descrito en la patente U.S. No. 5,187,151. De manera breve, la IGF-I y la IGFBP son administradas en cantidades efectivas por inyección del bolo subcutánea en una proporción molar desde aproximadamente 0.5:1 hasta aproximadamente 3:1, preferentemente de manera aproximada 1:1. En una modalidad adicional, tanto la IGF-I como la GH pueden ser administradas al paciente, cada una en cantidades efectivas, o cada una en cantidades que son subóptimas pero cuando se combinan son efectivas. Preferentemente tales cantidades son de aproximadamente 50 hasta 100 µg/kg/día de IGF-I y de aproximadamente 0.3 mg/kg/semana de GH. Preferentemente, la administración de tanto la IGF-I como de GH es por inyección utilizando, por ejemplo, medios intravenosos o subcutáneos. Más preferentemente, la administración es por inyección subcutánea tanto para la IGF-I como GH, más preferiblemente inyecciones diariamente. Se debe señalar que los médico que contemplan dosis tanto de IGF-I como de GH deben tomar en cuenta los efectos laterales conocidos del tratamiento con estas hormonas. Para la GH, los efectos laterales incluyen la retención y la expansión del volumen extracelular (Ikkos et al., Acta Endocrinol. (Copenhagen), 32: 341-361 [1959]; Biglieri et al., J.C.E.M, 21: 361-370 [1961]), así como hiperinsulinemia e hiperglicemia. El efecto lateral aparente principal de la IGF-I es la hipoglicemia. Guler et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 86: 2868-2872 (1989) . Realmente, la combinación de IGF-I y GH puede conducir a una reducción en los efectos laterales indeseables de ambos agentes (por ejemplo, la hipoglicemia para la IGF-I y el hiperinsulinismo para la GH) y a un restablecimiento de los niveles en la sangre de la GH, la secreción de la cual es suprimida por la IGF-I. Para la administración parenteral, en una modalidad, la IGF-I y la GH son formuladas generalmente mezclando cada una al grado deseado de pureza, en una forma inyectable de dosificación unitaria (solución, suspensión, o emulsión), con un portador aceptable farmacéuticamente, es decir, una que sea no tóxica para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas y sea compatible con otros ingredientes de la formulación. Por ejemplo, la formulación preferentemente no incluye agentes oxidantes y otros compuestos que se sabe que van a ser perjudiciales para los polipéptidos. En general, las formulaciones son preparadas poniendo en contacto la IGF-I y la GH cada una uniforme e íntimamente con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos. Luego, si es necesario, el producto es conformado en la formulación deseada. Preferentemente el portador es un portador parenteral, más preferentemente una solución que sea isotónica con la sangre del receptor. Los ejemplos de tales vehículos portadores incluyen el agua, una solución salada, una solución de Ringer, y la solución de dextrosa. Los vehículos no acuosos tales como los aceites fijos y el oleato de etilo también son útiles aquí, así como los liposomas . El portador contiene adecuamente cantidades menores de aditivos tales como las substancias que mejoran la isotonicidad y la estabilidad química. Tales materiales no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen soluciones amortiguadoras tales como fosfato, citrato, succinato, ácido acético, y otros ácidos orgánicos o sus sales; los antioxidantes tales como el ácido ascórbico; los polipéptidos de peso molecular bajo (menor que aproximadamente diez residuos), por ejemplo, poliaginina o tripéptidos; proteínas, tales como la albúmina del suero, la gelatina, o las inmunoglobulinas; los polímeros hidrofílicos tales como la polivinilpirrolidona; los aminoácidos; los monosacáridos, los disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen la celulosa o sus derivados, la glucosa, la mañosa, o las dextrinas; los agentes quelantes tales como el EDTA; los alcoholes de azúcar tales como el manitol o el sorbitol; los contraiones tales como el sodio; y/o los agentes tensioactivos no iónicos tales como los polisorbatos, los poloxámeros, o el PEG. La IGF-I y la GH son cada una formuladas típicamente de manera individual en tales vehículos a una concentración de aproximadamente 0.1 mg/ml hasta 100 mg/ml, preferentemente 1-10 mgml, a un pH de aproximadamente 4.5 a 8. La IGF-I de longitud total está formulada preferentemente a un pH de aproximadamente 5-6, y una des (1-3) -IGF-I es formulada preferentemente a un ph de aproximadamente 3.2 a 5. La GH está preferentemente a un pH de 7.4-7.8. Se sobreentenderá que el uso de ciertos de los excipientes, portadores, o estabilizadores precedentes conducirá a la formación de las sales de IGF-1 o de GH. Aunque la GH puede ser formulada por cualquier método adecuado, las formulaciones preferidas para la Gh son como sigue: Para la met-GH (marca Protropin®) , la solución volumétrica preliofilizada contiene 2.0 mg/ml de met-GH, 16.0 mg/ml de manitol, 0.14 mg/ml de fosfato de sodio, y 1.6 mg/ml de fosfato de sodio (monohidrato monobásico), pH 7.8. La ampolleta de 5 mg de met-GH contiene 5 mg de met-GH, 40 mg de mannitol, y 1.7 mg de fosfato de sodio total (peso seco) (anhidro dibásica) , pH 7.8. La ampolleta de 10 mg contiene 10 mg de met-GH, 80 mg de manitol, y 3.4 mg totales de fosfato de sodio (peso seco) (anhidro dibásico), pH 7.8. Para GH sin met (marca Nutropin®) , la solución volumétrica preliofilizada contiene 2.0 mg/ml de GH, 18.0 mg/ml de manitol, 0.68 mg/ml de glicina, 0.45 mg/ml de fosfato de sodio, y 1.3 mg/ml de fosfato de sodio (monohidrato básico), pH 7.4. La ampolleta de 5 mg GH, 45 mg de manitol, 1.7 mg de glicina, y 1.7 mg totales de fosfatos de sodio (peso seco) (anhidros dibásicos), pH 7.4. La ampolleta de 10 mg 5 contiene 10 mg de GH, 90 mg de manitol, 3.4 mg de glicina, y 3.4 mg de fosfatos de sodio totales (peso seco) (anhidros dibásicos) . Alternativamente, una formulación líquida para ^^ la marca Nutropin® se puede utilizar la hGH, por ejemplo: 10 5.0 + 0.5 mg/ml de rhGH; 8.8 + 0.9 mg/ml de cloruro de sodio; 2.0 + 0.2 mg/ml de Polysorbate 20; 2.5 + 0.3 mg/ml de fenol; 2.68 + 0.3 mg/ml del dihidrato del citrato de sodio; y 0.17 + 0.02 mg/ml de ácido cítrico anhidro (el ácido cítrico/citrato de sodio anhidro total es de 2.5 mg/ml, o de 10 mM) ; pH 6.0 + 0.3. Esta formulación es colocada adecuadamente en una ampolleta de 10 mg, la cual ^r es de 2.0 ml de llenado de la formulación anterior en una ampolleta de vidrio de 3 ce. Alternativamente, un cartucho de 10 mg (2.0 ml) que contiene la formulación anterior puede ser colocada en una pluma de inyección para la inyección de la GH líquida al paciente. Aunque la IGF-I puede ser formulada de cualquier manera para la administración, la formulación preferida contiene aproximadamente 2-20 mg/ml de IGF-I, aproximadamente 2-50 mg/ml de un osmolito, aproximadamente 1-15 mg/ml de un estabilizador, y una solución amortiguada de aproximadamente pH 5-5.5. Preferentemente, el osmolito es una sal inorgánica a una concentración de aproximadamente 2-10 mg/ml o un alcohol de azúcar a una concentración de aproximadamente 40-50 mg/ml, el estabilizador es alcohol bencílico o fenol, o ambos, y la solución amortiguada es una solución amortiguada de sal de ácido acético. Más preferentemente, el osmolito es el cloruro de sodio y la sal del ácido acético es el acetato de sodio. Aún más preferentemente, la cantidad de IGF-I es de aproximadamente 8-12 mg/ml, la cantidad de cloruro de sodio es de aproximadamente 5-6 mg/ml, la cantidad de alcohol bencílico es de aproximadamente 8-10 mg/ml, la cantidad de fenol es de aproximadamente 2-3 mg/ml, y la cantidad de acetato de sodio es de aproximadamente 50 mM de modo que el pH sea de aproximadamente 5.4. Adicionalmente, la formulación puede contener aproximadamente 1-5 mg/ml de un agente tensioactivo, preferentemente un polisorbato o poloxámero, en una cantidad de aproximadamente 1-3 mg/ml. Además, la IGF-I y la GH, preferentemente la IGF-I de longitud total, pueden ser formuladas conjuntamente en un vehículo portador apropiado para formar una composición farmacéutica que preferentemente no contiene células. En una modalidad, la solución amortiguadora utilizada para la formulación dependerá de si la composición será empleada inmediatamente durante el mezclado o almacenada para un uso posterior. Si se emplea inmediatamente después del mezclado, una mezcla de IGF-I y GH de longitud total puede ser formulada en manitol, glicina, y fosfato, de pH 7.4. Si esta mezcla va a ser almacenada, la misma es formulada en una solución amortiguadora a un pH de aproximadamente 6, tal como el citrato, con un agente tensioactivo que incrementa la solubilidad de la GH a este pH, tal como polisorbato 20 al 0.1% o poloxámero 188. La preparación final puede ser un líquido estable o un sólido liofilizado. La composición combinada preferida comprende la IGF-I y la GH en una relación en peso de IGF-I:GH de entre aproximadamente 1:1 y 100:1 (p/p), aproximadamente 0.05-0.3 mM de un osmolito, aproximadamente 0.1-10 mg/ml de un estabilizador, aproximadamente 1-5 mg/ml de un agente tensioactivo, y aproximadamente 5-100 mM de una solución amortiguadora a aproximadamente pH 5-6. Preferentemente, el osmolito es una sal inorgánica y el agente tensioactivo es no iónico. Más preferentemente, la sal inorgánico es cloruro de sodio o cloruro de potasio, el estabilizador es el fenol o el alcohol bencílico, el agente tensioactivo es polisorbato o poloxámero, la solución amortiguadora es el acetato de sodio o el citrato de sodio o ambos, y las cantidades de IGF-I y GH son de aproximadamente 2-20 mg/ml y de aproximadamente 0.2-10 mg/ml, respectivamente, con la proporción en peso de IGF-I:GH que es de entre aproximadamente 1:1 y 50:1. Aún más preferentemente, la cantidad de IGF-I es de aproximadamente 5-10 mg/ml, la cantidad de GH es de aproximadamente 1-5 mg/ml, la proporción en peso de IGF-I:GI es de aproximadamente 1:1 hasta 4:1, la cantidad de cloruro de sodio es de aproximadamente 5-7 mg/ml, la cantidad de fenol es de aproximadamente 0.1-3 mg/ml, la cantidad de alcohol bencílico es de aproximadamente 6-10 mg/ml, el agente tensioactivo es polisorbato en una cantidad de aproximadamente 1-3 mg/ml, la cantidad de acetato de sodio es de aproximadamente 2.5-4 mg/ml, y la cantidad de citrato de sodio es de aproximadamente 0.1-1 mg/ml. La IGF-I y la GH que van a ser utilizadas para la administración terapéutica son preferentemente estériles. La esterilidad es efectuada fácilmente por filtración a través de las membranas de filtración estéril (por ejemplo, membranas de 0.2 mieras). Las composiciones de IGF-I y de GH terapéuticas generalmente son colocadas en un recipiente que tiene una abertura de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o ampolleta de solución intravenosa que tiene un dispositivo de detención perforable por una aguja de inyección hipodérmica. La IGF-I y la GH ordinariamente serán almacenadas en recipientes de dosis unitarias o de dosis múltiples, por ejemplo, ampollas o ampolletas selladas, tales como una solución acuosa, o como una formulación liofilizada para reconstitución. Como un ejemplo de una formulación liofilizada, se llenan ampolletas de 10 ml con 5 ml de soluciones de IGF-I y de GH acuosas al 1% (p/v) , filtradas-estériles, y la mezcla resultante es liofilizada. La solución de infusión es preparada reconstituyendo la IGF-I y la GH liofilizadas utilizando Agua para Inyección bacteriostática. La invención será entendida de manera más completa con referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, los mismos no deben ser interpretados como limitativos del alcance de la invención. Toda la literatura y las citas de las patentes son incorporadas expresamente para referencia.

EJEMPLO 1 En este ejemplo, las concentraciones del suero de GHBP fueron medidas en un gran número de muestras a partir de niños de estatura corta ya sea con etiologías definidas de falla del crecimiento (GHD o TS) o ISS, y fueron comparadas con los niveles de GHBP en los controles normales.

Sujetos de Control Para establecer el intervalo normal para la GHBP en el suero, se analizaron las muestras de 773 niños, 366 del sexo femenino y 407 del sexo masculino. Las edades variaron desde 3 hasta 16 años; en algunos casos, la edad para un sujeto dado se reportó en cuanto al año más cercano. La mayoría de las muestras fueron obtenidas de una población de edad escolar, normal, por medio de un programa de selección para la detección de anticuerpos para las células ß pancreáticas (Pasco Co. School System, Florida) , y las muestras adicionales fueron provistas generosamente por el Dr. Juan Sotos del Children' s Hospital de Columbus, Ohio y la Dra. Rebecca kirkland del Baylor Colege of Medicine, Houston, Texas. Los niños estaban sanos y se cree que representan una sección transversal de la población americana con respecto a la estatura.

Sujetos con retardo del crecimiento Las muestras del suero de los niños con crecimiento retardado (edad de 1 a 17 años) fueron colectadas en una evaluación de la línea base de 776 sujetos enrolados en un proyecto de observación poscomercialización, el NCGS. Las muestras fueron provistas por 106 de los centros que participan en este estudio. Todos los niños con GHD e ISS incluidos para el análisis tuvieron estaturas que fueron de 2 o más SDS abajo del promedio para la edad y el sexo. Los sujetos fueron clasificados en calidad de que tienen GHD por los médicos seleccionadores . Ninguno de los niños con GHD tuvo niveles de GH endógenos o estimulados, máximos arriba de 10 µg/ml reportados por el médico que proporciona la atención (utilizando un ensayo no especificado) o medido en el Genentech Inc., utilizando un ensayo inmunoradiométrico monoclonal doble (Tandem-R HGH, Hybritech, San Diego, CA) . Están excluidos los sujetos con causas orgánicas de GHD, tales como tumores del sistema nervioso central (CNS) . Los pacientes clasificados como ISS en la base de datos de NCGS fueron designados como tales ya sea por el doctor seleccionador (utilizando varios términos) o tuvieron un nivel de GH estimulado o endógeno > 10 µg/1 sin etiología orgánica de estatura corta indicado. Los pacientes con TS fueron identificados así por sus doctores seleccionadores e incluyen aquellos con varias formas de mosaicismo. Ninguno de los sujetos incluidos ha recibido previamente alguna forma de terapia de GH.

Mediciones de GHBP La GHBP se midió por LIFA como se describió anteriormente. Brevemente, las placas de microtitulación de noventa y seis cavidades (Corning Glass Works, Corning, New York) fueron recubiertas con un anticuerpo monoclonal dirigido contra la GHBP (Mab 263, Agen, Australia) por incubación toda la noche a 4 °C con 100 µl/cavidad del anticuerpo a 10 µg/ml en 50 mmoles/1 de solución amortiguadora de carbonato, pH 9.6. Las cavidades recubiertas fueron bloqueadas con 150 µl de PBS, pH 7.2, que contiene albúmina de suero de bovino (BSA) (5 g/1) y se lavan. Los estándares (hGHBP recombinante) o las muestras (50 µl/cavidad) fueron distribuidas en las cavidades recubiertas junto con 50 µl/cavidad de la hGH recombinante (200 µg/1; Genentech, Inc.) y la inmunoglobulina g del ratón (10 g/1; Fitzgerald Industries, Chelmsford, MA) .

Las placas fueron selladas, incubadas a temperatura ambiente durante 2 horas con agitación suave, y se lavan antes de la adición de un anticuerpo anti-GH monoclonal (Mab MCB, Genentech, Inc.) conjugado con la peroxidasa de rábano picante (100 µl/cavidad) . Después de la incubación adicional durante 2 horas a temperatura ambiente, las placas fueron lavadas seis veces con una solución amortiguadora de lavado. La solución del substrato preparada recientemente (0.4 g del diclorhidrato de la o-fenilendiamina en un litro de PBS más 0.4 ml de peróxido de hidrógeno al 30%) se agrega a las placas (100 µl por cavidad) y la incubación se llevó a cabo en la oscuridad durante 15 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo por la adición de 100 µl de 2.25 moles/1 de ácido sulfúrico y la absorbencia a 490 nm determinada. El intervalo de detección en la LIFA fue de 15.6 a 1000 pmoles/1. Los coeficientes de intra- e interensayo de la variación fueron de aproximadamente 7% y 11%, respectivamente. Todas las muestras fueron _medidas por duplicado.

Mediciones de GH Para evaluar la secreción de GH espontánea en los diferentes grupos, se midieron las concentraciones de GH en las muestras del suero tomadas a intervalos de 20 minutos durante 12 horas (8 pm a 8 am) de 851 de los niños. Los valores promedio fueron calculados para cada sujeto. Las concentraciones de GH fueron medidas utilizando un ensayo inmunoradiométrico a base de anticuerpos monoclonales (IRMA), con un límite de detección de 0.5 µg/1 (Tandem-R HGH, Hybritech) .

Mediciones de IGF-I • 10 Las concentraciones de IGF-I fueron medidas en muestras del suero tomadas de 858 de los niños en la línea base en el instante del muestreo de GH en la noche, utilizando RÍA a continuación de la extracción con etanol 15 ácido (IGF-I Ria Kit, Nichols Institute, San Juan Capistrano, CA) . • Análisis estadístico El peso estandarizado (SDS) se calculó a partir de las desviaciones promedio y estándar específicas para el sexo y la edad, derivadas de los datos normativos del National Center for health Statistics (NCHS) para los niños americanos. Hamill et al., Am. J. Clin. Nutrition, 32: 607-629 (1979). El índice de masa corporal (BMI) se calculó utilizando 1 fórmula: peso (kg) / [peso (m)]2. Los valores promedio y de SD para la edad, el peso SDS, y la BMI para los niños con crecimiento retardado se calcularon de los datos reportados sobre las formas de enrolamiento de NCGS. Las desviaciones estándares y promedio para las concentraciones de GHBP (Tablas I y III) y para las concentraciones de GH de 12 horas promedio (Tabla IV) se calcularon después de la transformación logarítmica debido a la naturaleza deslizante de los datos. Los antilogaritmos del promedio, promedio + 2 SD (GHBP, Tabla I) y el promedio + 1 SD (GHBP, Tabla III, y el promedio de 12 h GH, Tabla IV) fueron calculados entonces para proporcionar los valores listados. Los efectos de la edad y el sexo sobre las concentraciones de GHBP log en el grupo de control fueron evaluadas por análisis de las varianzas (ANOVA) . El cálculo de los niveles de GHBP estandarizados (SDS) estuvieron basados en el promedio y las SD' s asociadas de los datos del sujeto de control agrupadas por sexo y edad utilizando la ecuación de abajo. Para una concentración de GHBP en un individuo de 3-15 años de edad (el intervalo de edad para el cual las muestras de control estuvieron disponibles), log (GHBP) - promedio (log (GHBP) i edad, sexo) SDS = SD (log GHBP) | edad, sexo) en donde promedio (log (GHBP) | edad, sexo) es el valor log promedio del GHBP para los sujetos de control de la misma edad y sexo que aquel del individuo, y la SD (log (GHBP) | edad, sexo) es la SD asociada. Después de la conversión al SDS, las concentraciones de GHBP del suero en los niños diagnosticados con GHD, ISS, y TS fueron comparadas entre sí y con los controles del mismo sexo po ANOVA. La GHBP SDS también fue calculada con base en la edad ósea, en lugar de la edad cronológica. Cuando se efectuaron comparaciones entre grupo múltiples sobre cualquier variable, se aplicaron ajustes de Bonferroni a los valores de p para el signicado estadístico, para mantener un nivel de 0.05 total de significancia para la prueba. Los valores de p nominales para las comparaciones estadísticas significativas están incluidas en el texto.

Resultados El intervalo normal (promedio + 2 SD) para las concentraciones de GHBP del suero en niños de entre 3 y 15 años de edad es mostrado en la Tabla I. Debido a problemas técnicos, los resultados no están disponibles para los niños de 5 años de edad. Tanto la edad como el sexo tuvieron un efecto significativo sobre las concentraciones de GHBP. Las niñas tuvieron concentraciones de GHBP más elevadas que los niños (p < 0.0001). En ambos sexos, las concentraciones de GHBP se incrementaron con la edad (p < 0.0001).

TABLA I Intervalo Normal para la Concentración de GHBP del Suero (?mol/1) La Tabla II muestra la edad promedio (+ SD) , la altura SDS, y BMI para cada grupo de sujetos (los datos de estatura y BMI no estuvieron disponibles para todos los sujetos de control) . La edad promedio fue similar en todos los grupos (aproximadamente 11 años). Los valores de SDS de la estatura promedio no fueron estadísticamente diferentes entre las mujeres con GHD, ISS, y TS o entre las mujeres con GHD e ISS. Los valores de BMI promedios fueron significativamente inferiores en los grupos de ISS comparado con los otros grupos con un crecimiento retardado tanto en las mujeres (p < 0.0137) como en los hombres (p < 0.0001) .

TABLA II Edad, Peso SDS, y BMI (promedio + SD) Etiología Sexo n Edad (años) Estatura (SDS) BMI Control M 47 11.7 + 2.8 0.3 + 0.8 8.4 + 2.9 w F 35 11.6 + 2.4 0.3 + 0.8 19.0 + 3.0 GHD M 80 11.8 + 3.6 -2.9 + 0.8 18.3 + 4.5 F 27 10.8 + 2.9 -3.2 ± 0.9 17.8 + 4.0 TTSS FF 9966 11.5 + 3.3 -3.3 + 0.9 19.1 + 4.0 ISS M 449 11.4 + 3.4 -2.9 + 0.7 16.6 + 2.3 F 124 10.8 + 3.0 -3.1 + 0.7 16.4 + 2.4 Las Figuras 1A-1E muestran las concentraciones de GHBP del suero en los niños individuales con GHD, ISS, y TS, comparado con el intervalo normal para el mismo seco (-2 SD a + 2 SD) . Las concentraciones de GHBP promedio correspondientes y los valores de SDS promedio en todos los grupos son listadas en la Tabla III. Para los hombres ya sea con GHD o ISS, el GHBP SDS promedio fue inferior que aquel de los hombres de control (ambas p < 0.0001), y la SDS promedio en los hombres con la ISS fue inferior que aquella de las mujeres con GHP (p < 0.0001). La SDS promedio para las mujeres con ISS y GHD fue inferior que aquella de las mujeres de control (p < 0.0001 y p 0.0046, respectivamente) . Además, la SDS promedio en las mujeres con ISS fue inferior que aquel en las mujeres con GHD (p = 0.0039). Cuando los grupos de GHD estuvieron limitados a los sujetos con niveles de GH máximos-estimulados < 5 µg/1 (n = 23) , el GHBP SDS no fue significativamente diferente del promedio de control. A causa de las diferencias de la BMI entre los grupos de GHD e ISS y la relación reconocida entre los niveles de BMI y GHBP, se efectuó un análisis de covarianza (ANCOVA) utilizando la BMI como una covariación para determinar si la diferente entre grupos en la GHBP fue independiente de las diferencias en BMI . Tanto en los hombres como en las mujeres, las diferencias en la GHBP entre los grupos de GHD e ISS permanecieron significativos (p < 0.02). En el 91% de los sujetos con ISS hombres y 92% de los sujetos con ISS mujeres, las concentraciones de GHBP estuvieron abajo del promedio para los controles correspondientes para la edad y el sexo. Las diferencias entre los sujetos con ISS y GHD fueron particularmente contrarios en los hombres, en donde 79 de 394 (20.1%) de los hombres con ISS tuvieron valores > 2 SDS abajo del promedio, comparado con solamente 6 de 69 (8.7 %) de hombres con GHD.

En contraste con las mujeres con GHD o ISS, el GHBP SDS promedio en los niños con TS no fue significativamente diferente de aquel de las mujeres de control. La GHBP SDS calculada para todos los grupos con crecimiento retardado que utilizan la edad ósea en lugar de la edad cronológica, mostraron diferencias pequeñas (Tabla III) .

TABLA III Concentraciones de GHBP del Suero (pmol/1) N/a - disponible CA - edad cronológica BA - edad ósea Para las concentraciones de GH promedio obtenidas durante el muestreo de GH de 12 horas toda la noche (Tabla IV) , ANCOVA con etiología, sexo, y edad revelaron que solamente la etiología tuvo un impacto significativo sobre el nivel de GH de 12 horas promedio. Como se esperaba, el valor promedio en los niños con GHD fue significativamente menor que en los controles (p<0.0001). El valor en las mujeres con TS fue mayor que aquel en las mujeres con GHD (p < 0.0001) y menor que aquella en las mujeres ya sea de control o con ISS (ambas p < 0.002). La concentración de GH de 12 horas promedio en los sujetos con ISS no fue diferente estadísticamente de aquella en los controles. Sin embargo, los sujetos con ISS con niveles de GHBP > 2 SD abajo del promedio tuvieron valores de GH de 12 horas promedio más elevadas que aquellas con los niveles de GHBP normales (2.8 contra 2.3 µg/1, p < 0.005). Los niveles de IGF-I fueron más bajos en los pacientes con GHD, y fueron inferiores que los controles para los pacientes con ISS y con TS.

TABLA IV Concentraciones de IGF-I y GH de 12 horas promedio (µg/1) GH 12-h Promedio (µg/1 ) IGF-I Extraidos (µg/1) Las concentraciones de GHBP del suero en algunos niños con ISS son inferiores que aquellas en los niños de control de edad correspondiente. Comparado con los sujetos de control, los niños con GHD también tuvieron concentraciones de GHBP inferiores, pero la reducción fue menos pronunciada que en los niños con ISS. En mujeres con TS, una condición en donde el diagnóstico está basado en la presencia de una anormalidad cromosómica y por lo tanto es absoluta, los niveles de GHBP no fueron diferentes de aquellos del grupo de control, indicando que los niveles de GHBP no se correlacionan simplemente con la estatura corta. Además de las poblaciones bien definidas geográfica y genéticamente con una acción de GH periférica dañada, tales como pacientes con el síndrome de Laron y pigmeos africanos, pueden existir sujetos con formas más sutiles de insensibilidad de GH, que representan más probablemente una variedad de defectos moleculares. A pesar de la probable heterogeneidad de las causas del retardo del crecimiento en niños con ISS, los resultados anteriores muestran que como un grupo los mismos tienen concentraciones de GHBP del suero reducidas, y un subconjunto significativo (20%) tiene niveles de GHBP de 2 SD o más abajo del promedio normal para la edad y el sexo.

Los niños con ISS que fueron estudiados no > k diferieron del grupo de control en términos de la secreción de GH y tuvieron concentraciones de GHBP significativamente inferiores que aquellas del grupo con 5 GHD. Los pacientes definidos como GHD, basados en el corte arbitrario de la GH máxima < 10 µg/1, tuvieron niveles de GHBP inferiores que los controles. Sin embargo, en pacientes con GHD con una GH máxima < 5 µg/1, el GHBP SDS promedio fue mayor que aquel del grupo de GHD 10 con GH > 5 µg/1 y no fue diferente de aquel de los controles.

EJEMPLO II Los pacientes seguidos en un estudio de observación poscomercialización, el National Cooperative Growth Study (NCGS), fueron estudiados para comparar las velocidades de crecimiento para los pacientes con GHD con aquellas para los pacientes con ISS tratados con varias dosis de GH. Los pacientes con ISS incluyen ambos de aquellos con niveles de GHBP normales como aquellos con niveles de GHBP bajos. Los resultatos para los pacientes con ISS, mostrados en la Figura 2, demostraron que una velocidad de crecimiento substancialmente más elevada fue obtenida para niños tratados con 0.25 + mg/kg/semana de GH cuando se compara con 0.20 mg/kg/semana o menor. La comparación con los pacientes con GHD reveló que la dosis normal de GH de hasta 0.20 mg/kg/semana no fueron suficientes para permitir a los pacientes tener un intervalo de velocidad de crecimiento promedio cercano a aquel observado en los pacientes con GHD; sin embargo, las dosis de 0.25 + 0.025 mg/kg/semana condujeron a una velocidad de crecimiento más cercana al intervalo observado en los pacientes con GHD (aproximadamente 10 cm/año) . Por consiguiente, una dosis de GH mayor que aproximadamente 0.20 mg/kg/semana es adecuada para al menos algunos pacientes identificados por esta invención.

EJEMPLO III Los pacientes con ISS (como se definieron por un nivel de GH máximo > 10 µg/1 y una estatura SDS < -2) tienen niveles de GHBP bajos comparado con los controles normales como se determinó por LIFA. Este no es el caso de niños de estatura corta con GHD o TS. Para evaluar la utilidad del ensayo de GHBP en la evaluación de niños de estatura corta, los pacientes con ISS fueron agrupados de acuerdo con su GHBP SDS. Los pacientes con GHBP SDS bajos, definidos como < -2, fueron comparados con pacientes con niveles de GHBP normales (GHBP SDS > -2) para determinar si existió evidencia de sensibilidad dañada con respecto al tratamiento de GH en el grupo precedente.

Población de Pacientes Las muestras de suero fueron colectadas en 96 sitios de 511 niños con ISS quienes fueron tratados subsiguientemente con hGH marca Protropin® (con el promedio + SD de la dosis de GH que es de 0.26 + 0.07 mg/kg/semana por inyección parenteralmente para pacientes con datos de crecimiento de un año, con la dosis particular y el programa de GH que es a discreción del investigador clínico individual), y enrolado en NCGS. Para que sean incluidos en este estudio, los pacientes tienen que tener una GH estimulada máxima > 10 µg/1, estatura SDS < -2, y ninguna otra etiología reportada de estatura corta. Los resultados de las mediciones de GHBP no fueron conocidos antes del inicio de la terapia de GH. Para el análisis que involucra la respuesta del crecimiento mientras que está en el tratamiento de GH, solamente fueron incluidos los pacientes en la pubertad.

Métodos de Ensaye La GHBP fue evaluada utilizando la LIFA, como se describió en Carlsson et al., supra. Los anticuerpos monoclonales para el GHBP (Mab 263) y GH (Mab MCB) fueron utilizados. Los valores de GHBP fueron estandarizados para la edad y el sexo utilizando datos normativos para la LIFA con base en los ejemplos provistos por el Dr. Thomas Merimee en la Universidad de Florida, División de Endocrinología y Metabolismo, Health Science Center, P.O. Box 100226, Gainesville, Florida 32610-0226, y por los Drs. Sotos y Kilkland mencionados anteriormente. Estos valores ya han sido reportados previamente. Carlsson et al., J.C.E.M., 78: 1325-1330 (1994). Las muestras de toda la noche para la GH fueron evaluadas utilizando un ensayo inmunorradiométrico monoclonal doble (Tandem-R HGH, Hybritech, San Diego, Ca) . Los valores reportados para las pruebas de estimulación de GH se midieron utilizando varios ensayos de GH. La IGF-I se midió por radioinmunoensayo a continuación de la extracción de etanol-ácido (IGF-I by Extraction, Nichols Institute, San Juan Capistrano, CA) y se estandarizó para la edad y el sexo utilizando los datos normativos provistos.

Métodos Estadísticos Las alturas fueron estandarizadas para la edad y el sexo, y los pesos fueron estandarizados para la altura y el sexo utilizando las normas derivadas de los datos publicados por la North American childer. Hamill et al., Am. J. Clin. Nutrition, 32: 607-629 (1979). Las SDS de la altura de las madres y los padres fueron calculadas con base en los percentiles de altura para adultos normales. Hamill et al., supra. Se utilizó la regresión lineal múltiple para determinar cuales variables explicatorias estuvieron relacionadas linealmente con la GHBP SDS, si existe alguna. Además, los sujetos fueron divididos en dos grupos basados en su GHBP SDS (< -2 SD y > -2 SD) , para determinar la significancia, si existe alguna, de los valores de GHBP que están abajo del intervalo normal. Los dos grupos fueron comparados entre sí con respecto a los promedios o medianas de varias ccovarianzas (véase la Tabla VI) . Las pruebas univariables de significancia entre grupos fueron efectuadas utilizando una de tres pruebas: la prueba t (para variables distribuidas Gaussianas), la prueba t (para las variables de distribución Gaussiana) , la prueba de la suma de rangos de Wilcoxon (para as variables de distribución no Gaussiana), o la prueba de Chi-cuadrada (para variables categóricas) . Para ajustar comparaciones múltiples, los valores de p <0.005 fueron considerados estadísticamente significativos. La ANCOVA fue utilizada para probar las diferencias entre los dos grupos GHBP después de controlar las otras variables significativas.

Resultados Los pacientes en el grupo de GHBP bajo fueron más jóvenes y tuvieron un SDS y un BMI de peso para la altura inferior que el grupo de GHBP normal (Tabla V) . La SDS para la altura promedio fue de -2.9 en ambos grupos, con valores que varían desde -5.8 hasta -2.0. Aproximadamente tres cuartas partes de los pacientes fueron hombres; una distribución de sexo similar es observada en la base de datos de NCGS total. August et al., J. Pediatr., 116: 899-903 (1990). Setenta y dos por ciento de los pacientes están en la pubertad en la línea base.

TABLA V Características de los Pacientes de la Línea Base GHBP SDS < -2 GHBP SDS > -2 n prom. SD n prom. SD VALOR Existen 101 pacientes con GHBP SDS < -2 (promedio -2.5) y 410 pacientes con GHBP SDS > -2 (promedio -0.9) (Tabla VI). Los dos grupos tuvieron niveles de GH máximos promedios comparables; sin embargo, estos valores son difíciles de evaluar a causa del uso de varios ensayos de GH. El promedio para las concentraciones de GH de 12 horas promedio (utilizando el ensayo de Hybritech) fue significativamente más elevado en el grupo de GHBP bajo, mientras que el IGF-I SDS fue significativamente inferior en este grupo (ambos p = 0.0001, Tabla VI) . La Figura 3 muestra que aquellos con GHBP SDS bajo tuvieron una IGF-I SDS inferior (Figura 3A) y los niveles de GH de 12 horas promedio más elevados (figura 3B) . Entre todos los pacientes con ISS, la GHBP SDS fue correlacionada positivamente con IGF-I SDS (r = 0.285, p = 0.001) y se correlacionó negativamente con la GH de 12 horas promedio (r = -0.17, p = 0.0001). La ANCOVA, que controla las diferencias en la edad, la SDS de la altura para el peso, y la GH de 12 horas promedio, mostró que los pacientes con GHBP SDS < - 2 todavía tuvieron una IGF-I SDS significativamente inferior que aquellos con GHBP SDS > -2 (p = 0.0001). De manera similar, el grupo de GHBP bajo tuvo una GH de 12 horas promedio significativamente más elevada que el grupo de GHBP normal (p = 0.0001) después del control para edad, la SDS del peso para la altura, y la SDS de IGF-I.

TABLA VI Concentraciones de GHBP, IGF-I y GH de la Línea Base (promedio + SD) GHBP SDS < -2 GHBP SDS < -2 (n = 101) (n = 410) valor p Los análisis de la velocidad de crecimiento estuvieron restringidos a los pacientes quienes permanecieron en la prepubertad durante los períodos de tratamiento considerados. No existieron correlaciones lineas significativas de GHBP SDS ni ya sea de la velocidad de crecimiento o cambio en la SDS de altura durante cada uno de los primeros tres años de tratamiento. La velocidad de crecimiento del pretratamiento promedio fue de aproximadamente 4 cm/año sin importar la GHBP SDS. La velocidad de crecimiento promedio durante el primer año de la terapia de GH fue de aproximadamente 8 cm/año. La Figura 4 muestra las velocidades de crecimiento del primer año para los pacientes prepubertales tratados con la GH graficada contra su GHBP SDS. No existió correlación significativa estadísticamente entre los dos (r=0.047, p=0.55, n=166) . La figura muestra que los pacientes que pueden ser tratados por la invención de aquí son aquellos bajo el área sombreada, siempre que los mismos tengan los requerimientos de GH, IGF-I, y altura descritos como los requeridos en esta subpoblación. Los resultados indican que los pacientes con niveles de GHBP bajos y que tienen los criterios de esta invención respondieron a la administración farmacológica de la GH. Las Figuras 5 y 6 comparan las velocidades de pretratamiento y del primer año de los pacientes (y en la Figura 5 también las velocidades de crecimiento del segundo año) . Estas figuras muestran que existe un claro incremento en el crecimiento en los pacientes tratados con GH, sin importar si la GHBP SDS del paciente particular es de -2 o > -2. La Tabla VIII muestra los datos de respuesta de crecimiento para el grupo que tiene la GHBP SDS baja comparado con el grupo que tiene la GHBP SDS normal. Los dos grupos tuvieron una dosis de GH promedio y programas de inyecciones similares durante el primer año de la terapia. No existieron diferencias significativas entre los grupos para la velocidad de crecimiento en el pretratamiento o las velocidades de crecimiento durante los primeros cuatro años de la terapia de GH. El cambio promedio en la SDS de la altura tampoco fue estadísticamente diferente entre los dos grupos; el incremento promedio en estos seguido por 4 años, fue de 1.5 + 0.6 (n=13) en el grupo de GHBP bajo y de 1.7 + 0.6 (n=21) en el grupo de GHBP normal.

TABLA VII Velocidad de Crecimiento y Cambio en la SDS de la Altura desde la Línea Base durante la Terapia de GH en Pacientes Prepubertales GHBP SDS < -2 GHBP SDS > -2 il Aunque la estatura puede ser definida en una variedad de formas, tales como las que están abajo de un percentil dado para las normas de altura estándares, los pacientes en este estudio representan un grupo más selecto. Estos pacientes fueron todos prescritos con una terapia de GH, y por consiguiente pasaron por un proceso de tamización y selección por los médicos enroladores. Además, los pacientes con SDS de altura arriba de -2 no estuvieron incluidos en este estudio. El grupo resultante tuvo una SDS de altura promedio de -2.9, un retardo de la edad ósea promedio de 2.4 años, y una velocidad de crecimiento promedio de 4.2 cm/año, similar a otros pacientes reportados con ISS tratados con GH. Hopwood et al., J. Pedriatr., 123: 215-222 (1993); Albertsson-Wikland, Acta Paedriatr. Scand. Suppl., 343: 77-84 (1988). En este grupo de selección, se encontró que algunos de los niveles de GHBP del suero bajos, después de la estandarización para la edad y el sexo, y después de hacer ajustes para la edad ósea. Carlsson et al., J.C.E.M., 78, supra. La GHBP se ha mostrado que va a ser derivada del mismo gen que la GHR y comparte la homología de la secuencia con su dominio extracelular. Leung et al., Nature, 330: 537-543 (1987). Los niveles de GHBP del suero medidos utilizando el ensayo funcional fueron bajo o son indetectables en pacientes con GHIS completa. Fielder et al., J.C.E.M., 74: 743-750 (1992). En este ejemplo, el intervalo normal de niveles de GHBP en los niños ha sido determinado por la edad y el seco y se ha mostrado que los niveles de GHBP bajos observados en los pacientes con ISS fueron significativamente menores que aquellos observados en sujetos normales o deficientes de GH o en el síndrome de Turner. Carlsson et al., J.C.E.M. , 78, supra. Los perfiles de muestreo en serie de 12 horas toda la noche para la GH fueron obtenidos sobre todos los niños en este estudio y los niveles promedio fueron normales, sugiriendo, sin estar limitado a ninguna teoría, que la disfunción neurosecretoria no estuvo presente en la mayoría de los pacientes. Los niveles de GH de 12 horas promedio mostraron una correlación negativa con la GHBP SDS promedio, como se ha descrito en individuos normales. Martha et al., J.C.E.M. , 73 : 175-181 (1991) . Sin embargo, 'la IGF-I SDS fue correlacionada positivamente con GHBP SDS. Por consiguiente, los pacientes con los niveles de GHBP inferiores tuvieron niveles de IGF-I inferiores pero todavía más elevados de GH, consistentes con la insensibilidad de GH. Un agente de predicción significativo de la concentración de GHBP es la composición del cuerpo, la cual fue evaluada utilizando los estándares tanto del peso como del BMI para la altura y la edad. En un ANCOVA, se encontró que la GHBP permaneció como un agente de predicción significativo de la GH de 12 horas promedio y la IGF-I SDS después de realizar el control par la edad y el peso para la altura SDS. Los datos de crecimiento disponibles para los pacientes prepubertales enrolados en la base de datos de NCGS no revelaron una correlación lineal significativa entre la GHBP SDS de la línea base y ya sea la velocidad de crecimiento del pretratamiento o la SDS de la altura de la línea base. Sin que esté limitado por ninguna teoría, una posible explicación es que la velocidad de crecimiento y la altura son utilizados comúnmente para seleccionar a los pacientes que van a ser tratados con GH, y por consiguiente son uniformemente bajos en esta población de pacientes. Una observación interesante fue la falta de correlación de GHBP SDS y la respuesta de crecimiento a la terapia de GH. A causa de que los niveles de GHBP y de secreción de la GH parece que van a estar correlacionados negativamente en los niños que crecen normalmente (Martha et al, supra), un intervalo normal puede ser propuesto como se muestra en la Figura 7. Aquellos con una GH excesiva con relación a sus niveles de GHBP se podría esperar que tengan un crecimiento excesivo, y aquellos cuyos niveles de GH son demasiado bajos para sus niveles de GHBP podrían tener un crecimiento pobre. Habitualmente, la GHD está definida arbitrariamente y basada solamente en las mediciones de secreción de GH; es posible que algunos pacientes con niveles de GH arriba de esta umbral arbitrario (y dentro del alcance de esta invención) tengan cantidades inadecuadas de GH con relación a sus niveles de GHBP bajos, conduciendo a un crecimiento pobre. La administración de GH exógena a este subconjunto de pacientes (con niveles de GHBP y de IGF-I inferiores y con niveles de GH de 12 horas promedio más elevados, se compararon con los normales, sugiriendo una insensibilidad a la GH parcial) se podría esperar que eleve su GH circulante a niveles más apropiados para sus niveles de GHBP bajos, superando por consiguiente su estado resistente parcialmente.

EJEMPLO IV Introducción La etiología de la falla de crecimiento en la mayoría de niños de estatura corta sin GHD (niños de estatura corta no deficientes en GH) está definida pobremente. Estos niños con ISS normales de otra manera, producen cantidades normales de GH en respuesta a la estimulación farmacológica, pero fallan en demostrar una configuración de crecimiento normal. Lipple y Nakamoto, Rec. Prog. Horm. Res., 4_8: 179-235 (1993). Se ha propuesto tomar en cuenta varios defectos relacionados con la GH para su falla del crecimiento, incluyendo la disfunción neurosecretoria (Spiliotis et al., J. Am. Med. Assoc, 251: 2223-2230 [1984]; Zadik et al., Pediatrics, 76: 355-360 [1985]), y reactivos inmunológicamente pero inactivos biológicamente a la GH. Kowarski et al., J.C.E.M., 47: 461-464 (1978); Valenta et al., N. Eng. J. Med. , 31 : 214-217 (1985). Aunque estos mecanismos pueden tomar en cuenta la falla de crecimiento normalmente en algunos pacientes con ISS, la mayoría no parece que tengan defectos demostrables en la función o secreción de la GH. Lañes, Am. J. Dis. Child. , 143: 1284-1286 (1989); Hondo et al., J.C.E.M., 10 : 1445-1451 (1990). Una posibilidad alternativa es que los pacientes con ISS tengan configuraciones secretorias normales de GH bioactiva y que el defecto radica en la capacidad de las células de blanco u objetivo para responder a la GH. Tales defectos podrían estar relacionadas con el nivel de GHR o los mediadores de la señalización de GH, tales como la IGF-I o el receptor de IGF-I. Las alteraciones en el gen.de IGF-I no son comunes en los desórdenes del crecimiento. Lajara et al., J.E.C.M., 70: 687-692 (1990). La resistencia a la GH podrían deberse a la reducción en la afinidad de la GHR hacia la GH, la capacidad alterada para propagar una señal en respuesta a la GH de unión, o a los defectos que provocan un número reducido de receptores superficiales de la célula. La GHBP de afinidad elevada presente en el suero humano es idéntica al dominio extracelular de la GHR y se enseña que va a ser producida a partir del receptor por desdoblamiento proteolítico. Sotiropoulos et al., Endocrinol., 132: 1863-1865 (1993). Los niveles de GHBP inmunofuncionales (Carlsson et al., J.C.E.M. , 73, supra) están abajo del promedio en el 90% de los pacientes con ISS, y están más de dos SDs abajo del promedio en el 20% de estos niños (Carlsson et al., J.C.E.M. , 78, supra; Mauras et al., Metabolism, 43: 357-359 [1994] ) . Sin que esté limitado a ninguna teoría, se nota que las anormalidades en la GHR que reducen la cantidad de la GHBP funcional pueden estar presentes en los pacientes con ISS. Un fenotipo de la GHIS parcial en ISS es postulada por la observación en el Ejemplo III de que los pacientes con ISS con niveles de GHBP inferiores tengan niveles de IGF-I inferiores y niveles de GH de 12 horas promedio, más elevados, cuando se compara con aquellos con los niveles de GHBP normales. Sin que este limitado a ninguna teoría, esto sugiere una deficiencia en la señalización por medio de la GHR, conduciendo a la producción de IGF-I reducida y a la retroalimentación negativa reducida de la IGF-I durante la secreción de la GH. La mayoría de los niños con ISS responden a un tratamiento de GH recombinante con un incremento en la velocidad de crecimiento (Hopwood et al., supra), sin embargo, esta respuesta es menor que aquella observada aquí en pacientes con GHD (pacientes deficientes en GH) tratados con la misma dosis de GH, sugiriendo una vez más, como una teoría, una insensibilidad parcial a la Gh en los pacientes con ISS. La frecuencia elevada de las mutaciones de inactivación en el gen de GHR es la GHIS completa o síndrome de Laron (LS) indica que la mayoría de los casos de GHIS completos pueden ser explicados por la falta de GHR funcional. La mayoría de los pacientes con LS carecen de actividad de GHBP detectable en su sangre (Baumann et al., J.C.E.M., 65: 814-816 [1987]; Daughaday et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 84: 4636-4640 [1987]), y cuando se midieron, no tienen o tienen niveles muy bajos de unión de GH específica a los microsomas hepáticos. Eshet et al., Isr. J. Med. Sci., 20: 8-11 (1984). Existen 17 mutaciones de GHR caracterizadas asociadas con el LS concentrado en el dominio extracelular de la proteína (revisado por Rosenfeld et al., Endocrinol . Rev. , 15: 369-390 [1994]). Para determinar si el fenotipo más suave de GHIS parcial podría ser provocado por mutaciones menos alterantes en la GHR, y que los niveles reducidos de GHBP circulante en la población con ISS puede servir como un marcador para la GHIS parcial y pueden indicar las mutaciones en la GHR, un subconjunto de pacientes con ISS con niveles de GHBP mayores que 2 SD abajo del promedio fueron seleccionados, y la región de codificación del gen de GHR fue analizado para verificar las mutaciones. La utilización del análisis de conformación de una sola hebra (SSCA) y el secuenciamiento de los productos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con una movilidad alterada, permite que las mutaciones fueran detectadas en el dominio extracelular del receptor en 4 de 14 pacientes.

Sujetos Catorce pacientes con ISS fueron seleccionados de dos subestudios del NCGS con algunos o la totalidad de los siguientes criterios: 1) SDS de la altura < -2.5; 2) niveles de IGF-I del suero abajo de los niveles promedio normales (medidos por extracción de ácido-etanol, Nichols Institute) ; 3) GH del suero > 10 µg/1 o una o más pruebas provocativas; 4) GHBP SDS del suero máxima < -2 (medido por LIFA como se describió en Carlsson et al., J.C.E.M. , 73, supra, o por separación de carbón vegetal como se describió en Amit et al., J.C.E.M., 71: 474-479 [1990]) en el caso del Paciente 1); 5) velocidad de crecimiento en el pretratamiento < 4 cm/año; y 6) ausencia de enfermedad sistémica subyacente. La información adicional fue considerada si estaba disponible, incluyendo la GH de 12 horas promedio (ensayo Hybritech), velocidad de crecimiento del 1/er. Año sobre los niveles de GH, e IGFBP-3 (Endocrine Sciencies) . El sistema de evaluación utilizado para seleccionar los pacientes de la base de datos de NCGS es mostrado en la Tabla VIII. Fuera de la evaluación máxima de 12, los pacientes evaluados o marcados con 4-10 y todos tuvieron GHBP SDS < -2. Las características relativas de dos pacientes (#2 y #4) fueron estudiados para confirmar la heredabilidad de las mutaciones. Veinticuatro voluntarios adultos normales cuya SDS de la altura cayó dentro o arriba del intervalo normal (-2.0 a +3.5 SDS) sirvió como los controles. La significancia estadística de las diferencias de la población se calcularon con una Prueba Exacta de Fischer.

TABLA VIII Criterios para la Selección de los Pacientes Aquellos pacientes tratados con hGH (aquellos dados en la Tabla IX que no están listados bajo la columna de "respuesta a la GH" como "na") fueron inyectados subcutáneamente con GH marca Protropin® (todos los pacientes tratados excepto el Paciente 2) y con GH marca Netropin® (Paciente 2), a aproximadamente 0.3 mg/kg/semana durante al menos 6 meses.

Preparación de la Muestra y Amplificación por PCR Los linfocitos fueron aislados a partir de 1.5 a 10 ml de sangre de cada paciente utilizando ya sea Tubos de Separación de Células de LeucoPREP (Becton Dickenson) o un Medio de Separación de Linfocitos de LSM (Organon Teknika) y transformados por el Virus de Epstein Barr (EBV) . Katz et al., J. Infect. Dis., 160: 589-598 (1989) . El ADN fue aislado de los linfocitos transformados con EBV o directamente a partir de linfocitos frescos utilizando el QIAamp Blood Kit (Qiagen Inc.). Los fragmentos genómicos de la GHR, específicos para los exones de codificación 2 a 9 y sus sitios de división o separación laterales, fueron amplificados por PCR utilizando los cebadores intrónicos. La porción de codificación del exon 10 se amplificaron en tres fragmentos superpuestos para restringir el tamaño de los fragmentos a menos de 400 pares base (pb) . La localización y la secuencia de los cebadores intrónicos son como sigue: Exon Tamaño del Nombre Secuencia (5' a 3' ) Fragmento (bp) 2 154 101 TCGTGGGCTTTACCTTAC (SEQ ID NO: 17) 102 CAAAACACTGAGGGTGGA (SEQ ID NO: 18) 3 240 154.1 TACACAGGGTCATATCAGATTG (SEQ ID NO: 19) 154.2 CTATTCCAGTTACTACCATCCC (SEQ ID NO: 20) 4 188 105 CTGATTTCATGCCTTGCC (SEQ ID NO: 21) 106 AG AAGGCATGATGGTGG (SEQ ID NO: 22) 286 107B2 ACTTAAGCTACAACATGATT (SEQ ID NO: 23) 108B1 GCTTCCCCATTTATTTAGT (SEQ ID NO: 24) 6 229 109 ATGCTCTGT GAATTGCAC (SEQ ID NO: 25) 110 GTGTAAGGTGTAGCAACAT (SEQ ID NO: 26) 7 249 Illa GACTCTTTGGCCAATATG (SEQ ID NO: 27) 112a AAGCCAGGTTAGCTÁCTA (SEQ ID NO: 28) 8 205 113B1 GAAACTGTGCTTCAACTAGTC (SEQ ID NO: 29) 114B1 GGTCTAACACAACTGGTACA (SEQ ID NO: 30) . 9 179 115 ATGTAGCTTTTAACATCTCAA (SEQ ID NO: 31) 116 ATGACAGGAGTCTTCAGG (SEQ ID NO: 32) 10a 311 117B GAGTTTCTTTTCATAGATCTTC (SEQ ID NO: 33) 8 TTAACCTCTGTGGCTGAG (SEQ ID NO: 34) 10b 396 9 ACATGAGGGTACCTCAGA (SEQ ID NO: 35) 10 CAGAAGTAGGCATTGTCC (SEQ ID NO: 36) 10C 375' 11 GGAAATGGTCTCACTCTG (SEQ ID NO: 37) 12 CCAAAGAAAGGCTAAGGC (SEQ ID NO: 38) El ADN (100 ng) se amplificó en 50 µl que contienen 0.2 mM 40 dNTPs, 2 unidades de Taq Polimerasa (Perkin Elmer Corp.), 1.5 mM MgCl2, 7 µCi 33P-a-dATP (DuPont New England Nuclear) , y 15 ng de cada cebador para 40 ciclos (1 minuto, 94 °C; 1 minuto, 55 °C; 1 minuto, 72 °C con 5 segundos agregados por ciclo) . El ciclo final fue seguido por 1 minuto a 94 °C y enfriamiento a 22 °C durante 30 minutos. Los productos obtenidos por PCR fueron sometidos a electrofóresis en 2% de agarosa para verificar la contaminación y para verificar el tamaño del fragmento. El ARN total (5-10 µg) se preparó a partir de los linfocitos transformados por EBV por el método de fenol ácido (Chomczynski y Sacchi, Anal. Biochem., 162: 156-159 [1987]) y a la inversa, transcrito (Perkin Elmer Corp., conjunto RT) utilizando cebadores al azar (promega Corp.). La amplificación por PCR del ADNc de GHR se llevó a cabo por una estrategia de PCR agrupada. Los exones 3-10 fueron amplificados en 3 fragmentos. Los cebadores agrupados fueron utilizados para generar fragmentos más pequeños (220-415 bp) . Las condiciones del ciclo fueron como sigue: la desnaturalización a 95 °C durante 3 minutos seguido por 30 ciclos de 95 °C, 1 minuto; 55 °C, 1 minuto; 72 °C, 1 minuto; y finalmente 72 °C durante 10 minutos. Las secuencias de los cebadores utilizados en la estrategia de los cebadores agrupados fueron como sigue: Tres fragmentos de RT-PCR (5' a 3'): 1. Cl.l - C2.1r Cl.l: GTCCTACAGGTATGGATCTCT (SEQ ID NO: 39) C3.1r: GAATATCTGCATTGCGTGGTG (SEQ ID NO: 40) Productos de PCR agrupados internos: Cl . l - Cl . lr Cl.l: GTCCTACAGGTATGGATCTCT (SEQ ID NO: 39) Cl.lr: CTGGTATAGAACAGCTGTATG (SEQ ID NO: 41) ex4 - ex4.r ex4: ATTCTTCTAAGGAGCCTAAATTCACCA (SEQ ID NO: 42) ex4.r: CCACCATTGCTAGTTAGCTTG (SEQ ID NO: 43) ex5 - c3. ir e?5: ATGGACTCAAGAATGGAAAGAATG (SEQ ID NO: 44) c3.1r: GAATATCTGCATTGCGTGGTG (SEQ ID NO: 40) C5.1 - C8 C5.1: CACCACGCAATGCAGATATTC (SEQ ID NO: 45) C8 : CTCATGGTCACTGCTTAGAAG (?EQ ID NO : 46 ) Productos de PCR agrupados internos: C5 . 1 - C5 . 1r C5.1: CACCACGCAATGCAGATATTC (SEQ ID NO: 45) C5.1r: GTTACATAGAGCACCTCACTG (SEQ ID NO: 47) n7 - C6.1 n7: ATGGACCCTATATTGACAACATC (SEQ ID NO: 48) C6.1: CCTTTAATCT.TTGGAACTGGAAC (SEQ ID NO: 49) C7 - C7.r C7: GGGCTAACAGTGATGCTATTT (SEQ ID NO: 50) C7.R: GCTTAGAAGTCTGTCTGTGTC (SEQ ID NO: 51) C9- - C14 C9 : GCTAGATATTGATGAGCCAGA (SEQ ID NO : 52 ) C14 : GCTAAGGCATGATTTTGTTCA (SEQ ID NO : 53 ) Productos de PCR agrupados internos: C9 - CIO C9: GCTAGATATTGATGAGCCAGA (SEQ ID NO: 52) CIO: GTCGATGTTTGACAGTGAACT (SEQ ID NO: 54) Cll.l - C12.1 Cll.l: GAAGGAGCTGAGTCAACTCAC (SEQ ID NO: 55*) C12.1: GCTTGGCTGTATGTGTGATTC (SEQ ID NO: 56) C13 - C14 C13: TACTTCTGTGAGGCAGATGCC (SEQ ID NO: 57) C14: GCTAAGGCATGATTTTGTTCA (SEQ ID NO: 53) Análisis de Conformación de una Sola Hebra La SSCA se llevó a cabo sobre los productos de cada reacción de PCR. 2-4 µl de la mezcla de la reacción se mezclan con un volumen igual de la solución amortiguadora de carga, se desnaturalizan a 100 °C durante 2 minutos y se colocan sobre hielo. Las muestras fueron sometidas a electrofóresis a temperatura ambiente en geles de MDE de 0.5 X (AT Biochem Inc.) con ya sea 1% a 10% de glicerol, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los geles fueron secados sobre papel filtro y se autorradiografiaron.

Secuenciamiento de ADN Las mutaciones detectadas como bandas aberrantes por SSCA fueron confirmadas por secuenciamiento. El secuenciamiento del ciclo directo de los productos de PCR se llevó a cabo con los cebadores de amplificación o los cebadores internos (agrupados) descritos anteriormente y la química del terminador del tinte sobre el secuenciador de ABI373 (Applied Biosystems División de Perkin Elmer Corp.) siguiendo los protocolos estándares o utilizando el juego o conjunto Ampli-Cicle (Perkin Elmer Corp.) y 33P-a-dATP (duPont New England Nuclear) . Además, los subclones múltiples de cada fragmento sospechoso de que contenga una mutación fueron generados en M13mpl9 o pBluescript KS+, secuenciados con el tinte-cebador M13-21, y se analizaron sobre el secuenciador de ABI373.

Ensayo de Unión de GH Para examinar la unión de GH a los receptores mutantes, se diseñaron dominios extracelulares de GHR recombinantes que colectan las mutaciones. Esto se hace utilizando la expresión en E. Coli, por mutagénesis dirigida al sitio, mediada por oligonucleótidos, y purificación. Clackson and Wells, Science, 267 : 383-386 (1995); Fuh et al., J. Biol. Chem., 265: 3111-3115 (1990); Bass et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88: 4498-4502 (1991). La afinidad para la GH se determinó por el desplazamiento competitivo de la GH a partir de los receptores mutantes utilizando la GH radio-yodada como un trazador. Spencer et al., J. Biol. Chem., 263: 7862-7867 (1988) . Las constantes de disociación (Kds) fueron calculadas por el análisis de Scatchard. El anticuerpo monoclonal anti-GHR (Mab) 5 (Barnard et al., Endocrinology, 115: 1805 [1984]; Cunningham et al., Science, 254 : 821 [1991] ) se utilizó para precipitar el complejo de GHR:GH. El Mab 5 previene la homodimerización del receptor, permitiendo que la Kd para la interacción 1:1 inicial sea determinada libre de los efectos de la dimerización. Clackson and Wells, supra; Cunningham et al., supra.

Resultados Catorce niños con ISS fueron seleccionados con una marca del núcleo de 4 o arriba en el criterio de selección (Tabla VIII) . Los datos clínicos para estos pacientes están listados en la Tabla IX. El GHBP del suero funcional bajo en estos pacientes condujo a una búsqueda de mutaciones sutiles en el gen de GHR por una combinación de la amplificación de PCR y SSCA. Los fragmentos que migran con una movilidad alterada fueron observados en cuatro pacientes: 1, 2, 4, y 7, aunque no se detectaron anormalidades en el sitio de GHR en 24 controles adultos normales, con la excepción de los polimorfismos conocidos en los exones 6 a 10 (Leung et al., Nature, 330: 537-543 [1987]; Godowkski et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 86: 8083-8087 [1989]). Por consiguiente, existe un incremento significativo de las alteraciones en el gen de GHR en los pacientes con ISS con GHBP reducida cuando se compara con una población normal (p=0.014). Cada uno de los fragmentos de PCR genómicos sospechosos de llevar a cabo una mutación se sometieron a secuenciamiento para caracterizar la alteración que provoca la banda aberrante. Véanse las Figuras 8-11. Los pacientes 1 a 9 también fueron analizados por RT-PCR (exones 3-10) y todos los fragmentos fueron del tamaño predicho, eliminando la división o separación de las alteraciones. El paciente 4 exhibió bandas anormales sobre los geles de SSCA cuando los exones 4 y 6 o los fragmentos de RT-PCR que cubren esta región fueron analizados. El ADN fue secuenciado y el producto encontrado va a ser un compuesto heterozigótico para una transición de guanosina a adenosina en el exon 4, introduciendo una lisina en lugar del ácido glutámico en la posición 44 (E44K) en la proteína madura (Figura 8, alelo 2 y Tabla X) , y una transición de citosina a timidina en el exon 6, provocando una substitución de arginina a cisteína en el residuo 161 (R161C) (Figura 8, alelo 1 y Tabla X) . Los productos de RT-PCR que se extienden a los exones 4 a 6 fueron subclonados y secuenciados. Las dos mutaciones se encontraron en diferentes subclones; por consiguiente, se encontró una mutación en cada uno de los dos alelos. Adicionalmente, el análisis genético de los elementos familiares indicó que la alteración del exon 4 fue heredada del lado paternal de la familia y la mutación del exon 6 del linaje maternal. El padre y el abuelo paternal ambos exhibieron el mismo desplazamiento de la banda SSCA para el exon 4 como lo hizo la probanda, y el secuenciamiento confirmó que ambos de ellos llevaron una mutación E44K idéntica. De manera semejante, la SSCA y el secuenciamiento afirmaron la presencia de la mutación puntual del exon 6 provocando el cambio de R161C en la madre y un tío maternal. El paciente 4 no respondió a la GH exógena con un incremento significativo en la velocidad de crecimiento; esta velocidad de crecimiento en el pretratamiento fue de 5.5 cm/año y su velocidad de crecimiento durante el tratamiento con GH fue de 5.8 cm/año. Los efectos de estas substituciones de aminoácidos sobre la capacidad del receptor para unirse a la GH en un complejo 1:1 fueron investigados utilizando el dominio extracelular del receptor mutante expresado en E. Coli. El residuo E44 está involucrado en los contactos directos con GH (deVos et al., Science, 225: 306-312 [1992] ) y la mutación a la alanina redujo la unión del ligando (KdM_-/Kdwt=17.4) . Clackson y Wells, supra. Se encontró que la introducción de una lisina en la posición 44 reduce la unión 330 veces con respecto al dominio extracelular del receptor del tipo silvestre (Tabla X) . En contraste, el residuo 161 no está en ninguna interfase intermolecular en el complejo de GH:GHR humano (DeVos et al., supra), y su mutación a cisteína provocó una reducción de 2.1 veces en la unión (Tabla X). El ADN del Paciente 2 exhibió un desplazamiento de banda de SSCA con fragmentos de PCR genómicos del exon. El secuenciamiento de ADN identificó una transversión de timidina a adenosina en la posición 418 en el ADNc la cual introdujo un codón de detención en lugar de la cisteína 122 (C122X) . Véase la Figura 9) . La subclonación y el secuenciamiento de los productos de PCR genómicos múltiples de todos los exones del Paciente 2 dio solamente la secuencia del tipo silvestre, como lo hizo el secuenciamiento directo de los fragmentos de PCR genómicos. La probabilidad que este paciente lleve una segunda mutación que no fue posible que fuera detectada es, por lo tanto, reducida. El análisis del ADN tanto de la madre como del padre del Paciente 2 indicó que él heredó la mutación del codón de detención de su madre. Durante el primer año de tratamiento con GH su velocidad de crecimiento se incrementó desde 4.1 cm/año hasta 5.7 cm/año (Tabla IX) , indicando una respuesta a la GH exógena. Un aumento repentino del crecimiento asociado con la pubertad de 10.3 cm/año ocurrió durante su segundo año de tratamiento con GH exógena. Los pacientes 1 y 7 ambos llevan cambios del par base único heterozigótico lo cual provoca alteraciones los aminoácidos en el GHR desde un alelo. En el Paciente 1. se observó una banda aberrante con fragmentos de PCR genómicos del exon 7. Una transición de guanosina a adenosina en el par base 686 provocó que un residuo de arginina sea reemplazado con una histidina en el aminoácido 211 (R211H) . Véase la Figura 10, alelo 2. El paciente 1 respondió a la GH; él tuvo una prueba de generación de IGF-I positiva (la IGF-I de la línea base fue de 56 µg/1 y se elevó a un pico de 179 µg/1 después de cuatro días de tratamiento con 0.1 unidad de GH/kg por inyección. Además, su velocidad de crecimiento se incrementó desde 2.0 cm/año hasta 3.0 cm/año en 0.03 mg GH/kg/día y 6.0 cm/año en 0.05 g GH/kg/día (Tabla IX). El paciente 7 es afectado de manera semejante por una alteración en un solo alelo. Una transversión de guanosina a citosina en el par base 726 introduce un ácido aspártico en lugar del ácido glutámico del tipo silvestre en la posición 224 (E224D) . Véase la Figura 11, alelo 2. El paciente 7 nunca ha sido tratado con GH. Ni el SSCA ni el secuenciamiento directo del dominio extracelular de la GHR detectaron una segunda alteración en cualquiera de estos pacientes. El residuo R211 está expuesto en la superficie del receptor aparte de cualquier interfase molecular. DeVos et al., supra. El mutante de histidina produjo una proteína con una afinidad comparable con el receptor del tipo silvestre, KdMut/Kdwt=l .4. Sin embargo, existió una reducción contradictoria en el nivel de expresión de la proteína mutante; la misma se expresó a un nivel de aproximadamente 10~4 que la del tipo silvestre. La mutación asociada con LS de la arginina 211 a la glicina reportada por Amselem et al., Hum. Mol. Genet., 2 : 355-359 (1993), conduce a un nivel no detectable de la expresión. Un efecto similar sobre la afinidad del receptor para la GH se observó para la substitución de R224D (Tabla X) . La substitución de E224D conservativa no se esperaba que alterara la unión de GH y, realmente, se ha encontrado que la substitución con ácido aspártico (KdMu_/Kdwt=l .6) tuvo un efecto pequeño sobre la afinidad.

TABLA X Mutaciones en el Gen de GHR 1 La expresión de este dominio extracelular del receptor mutante fue reducida en aproximadamente cuatro órdenes de magnitud comparado con el tipo silvestre. 2 nd = no determinado EJEMPLO V La etiología de la falla del crecimiento es desconocida para muchos niños con estatura corta marcada. Los datos recientes sugieren que las mutaciones del gen de GHR extracelular heterozigótico en algunos niños de Estatura Corta Idiopática (ISS) seleccionados para niveles de GHBP bajos pueden provocar la GHIS parcial. NEJM 333: 1093-1098 (1995). Para evaluar si la GHIS parcial debida a las mutaciones del gen de GHR heterozigótico existen en una población menos selectiva de niños con ISS, hemos analizado el gen de GHR en 34 de 121 niños con ISS enrolados en un ensayo a largo plazo de la terapia de GH. Todos los niños en el estudio tuvieron una GH estimulada > 10 ug/L; la altura promedio de la línea base fue de -2.8 SDS y la IGF-I fue de -0.9. Estos pacientes han sido tratados con GH (0.3 mg/kg/semana) durante hasta nueve años. Se han analizado unos 11 pacientes adicionales con ISS quienes no fueron parte del ensayo clínico y para quienes los datos crecimiento menor estuvieron disponibles. Ninguno de estos niños tuvo las características fenotípicas del síndrome de Laron. La ADN genómica se extrajo de los linfocitos transformados con el Virus de Epstein Barr, y los exones 2-10 del gen de GHR fueron amplificados por PCR. Las secuencias amplificadas fueron examinadas por mutaciones sutiles por la técnica del análisis del polimorfismo conformacional de una sola hebra (SSCP) sobre geles de MDE con 0% a 10% de glicerol. Orita et al., Genomics, 5: 874-879 (1989); Soto y Sukumar, PCR Meth. Appl., 2: 96-98 (1992) y cualesquiera bandas de SSCP aberrantes fueron reamplificadas y la secuencia de ADN determinada por la química del Terminador-Tinte estándar y la separación sobre el secuenciador automático ABD373 o ABD377. El análisis de SSCP se apoya en las diferencias en la estructura secundaria asumida por las moléculas de ADN de una sola hebra las cuales difieren tan poco como un cambio de una sola base. Estas diferencias en la estructura secundaria conducen a una variación en la movilidad electroforética en los geles a base de acrilamida no desnaturalizantes. La eficiencia de la detección de las mutaciones con el análisis de SSCP varía desde aproximadamente 90% para los fragmentos bajo 200 pares base de tamaño hasta 70-80 % para el intervalo de tamaño de 200 a 400 pares base. Prosser, Tibtech, 11: 238-246 (1993). 9 de los 44 niños con ISS en esta población menos seleccionada llevaron mutaciones en el gen de GHR. No se detectó ninguna anormalidad en el sitio de GHR en siete niños de control y 34 adultos de control.

Tres pacientes con ISS tuvieron mutaciones de dominio extracelular y 6 llevaron mutaciones en el dominio intracelular del receptor de GH. (Tabla 1). El paciente 13 presentó a los 6 10/12 años de edad un severo retardo del crecimiento (-4 SDS), una edad ósea retardada (4 6/12 años) y una velocidad de crecimiento de 3.8 cm/año. Los niveles de la hormona del crecimiento fueron normales, como lo fueron los niveles de IGF-BP3 y GHBP. Sin embargo, sus niveles de IGF-I fueron bajos y no se condujeron a una prueba de generación de IGF-I (GH a 0.06 mg/kg/d durante 5 días) (Tabla 1) . Un ensayo de terapia con GH fue dada a una dosis de 0.6 mg/kg/semana. El paciente respondió con una velocidad de crecimiento del primer año de 10 cm/año y sus niveles de IGF-I se incrementaron significativamente (57 ng/ml a 339 ng/ml: intervalo normal 88-474) . El análisis del gen de GHR reveló que en él se han llevado a cabo dos cambios de pares base únicos, uno en cada alelo del gen de GHR: un cambio del par base silencioso en el codón 473 (el cual se codifica para un residuo de resina) (Figura 12) y una substitución de G a A en el codón 478, el cual introduce una treonina en lugar de la alanina normal (Ala478Thr) (Figura 13) . El polimorfismo Ser473 fue heredado de su padre y el Ala478Thr de su madre (Figura 14). El polimorfismo de Ser473 ha sido observado en otros tres individuos de estatura corta (un paciente con IUGR, un paciente con ISS y un adulto de estatura corta (probanda de la tía abuela maternal)) y en ninguno de los controles con una estatura normal. La misma subsiste siendo observada si tiene cualquier efecto sobre el procesamiento o estabilidad de GHR ARNm. Los pacientes 27 y 32 ambos llevaron a cabo dos cambios de un solo par base en el exon 10. Un cambio es de cisteína 422 a fenilalanina (Cys422Phe) (figura 15) y el segundo reemplaza la prolina 561 con treonina (Pro561Thr) (Figura 16) . El paciente 27 es homozigótico o semizigótico para estos dos cambios, así ambas mutaciones son en el mismo alelo del gen. El paciente 32 es heterozigótico para las dos alteraciones. No se sabe si estas dos mutaciones se encuentran en el mismo alelo o no. No están disponibles los datos de crecimiento para el Paciente 27. El paciente 32 presentó una estatura corta severa (altura -3.4 SDS), los niveles de la hormona del crecimiento normales, y los niveles de GHBP, IGF-I e IGF-BP3 cercanos al promedio (Tabla 1) . El paciente 32 tuvo una buena respuesta a la terapia de GH, su velocidad de crecimiento en el pretratamiento de 4.4 cm/año mejoró a 9.1 cm/año durante el primer año de terapia y su diagrama de crecimiento (Figura 17) muestra su respuesta a largo plazo para la terapia de GH. La combinación de estas dos mutaciones ha sido reportada previamente en un paciente con falla del crecimiento y niveles bajos de GHBP en el suero y una respuesta inconsistente a la GH. JCEM, 76:54-59 (1993). El paciente 44 lleva dos cambios de un solo par base. La treonina 306 es reemplazada por una prolina debido a una mutación de un solo par base (Figura 18). Este paciente también lleva el polimorfismo de Ser473 observado en el Paciente 13 (Figura 1) . No se tienen datos de respuesta del crecimiento o clínicos para este paciente. El paciente 48 es heterozigótico para una substitución de aminoácido; la cisteína 422 es reemplazada por la fenilalanina (Cys422Phe) (Figura 15) . Esto se debe a la misma substitución del par base observada en los Pacientes 27 y 32. Los datos clínicos (Tabla 1) muestran que esta niña presentó estatura corta (-2.8 SDS), niveles de GHBP e IGF-I bajos y niveles de IGF-BP3 normales. Ella respondió a la terapia de GH con un incremento en su velocidad de crecimiento desde 4.1 cm/año en el pretratamiento hasta 8.2 cm/año durante su primer año de terapia. Su curva de crecimiento (Figura 19) muestra su respuesta continua al GH y su logro de una altura final dentro del intervalo predicho a partir de las alturas de sus padres.

El gen de GHR en el Paciente 49 está alterado por dos mutaciones de un solo par base. Uno conduce al reemplazo de la treonina 306 con una prolina (Thr306Pro) (Figura 18); esta es la misma mutación que aquella observada en el paciente 44. La segunda mutación provoca que la cisteína 518 sea reemplazada con un codón de detención (Cys518Stop) (Figura 20), conduciendo a una proteína truncada omitida en los 107 aminoácidos carboxi-terminales. Este paciente tuvo una -1.9 SDS en su altura y tuvo niveles de GH normales y niveles bajos de GHBP, IGF-I e IGF-BP3 (Tabla 1) . Su curva de crecimiento (Figura 21) refleja su velocidad de crecimiento mejorada durante la terapia de GH (desde 4.7 cm/año a 9.0 cm/año durante el primer año de terapia) y al logro de una estatura final dentro del intervalo predicho por las alturas de sus padres. Estos datos sugieren que los defectos del receptor de GH intracelular heterogéneo pueden ser la causa de un crecimiento pobre en un subconjunto de pacientes de estatura corta no deficientes de GH. Estos defectos del receptor de GH difieren de las mutaciones extracelulares observadas en el síndrome de insensibilidad a la GH completo, puesto que los mismos afectan el dominio intracelular de la proteína.

Tabla 1 Pacientes con ISS con Mutaciones Intracelulares na = no disponible het = heterozigótico hom = homozigótico hem = semizigótico El síndrome de Laron (LS) es una condición recesiva autosómica rara caracterizada por la resistencia de GH severa (1) . Las características clínicas principales de este síndrome son la falla del crecimiento posnatal extremo combinado con una apariencia facial típica de la hipoplasia semifacial con un puente nasal plano. Los infantes también pueden padecer también episodios de hipoglicemia (1,2). Bioquímicamente la resistencia a la GH es manifestada por niveles de la GH circulantes elevados, combinados con una proteína -3 de unión a IGF (IGFBP-3) baja y el factor I de crecimiento semejante a la insulina (IGF-I) bajo o no detectable, el cual falla en su respuesta a la GH humana exógena (1) . El defecto en el LS radica en el nivel del receptor de GH (GHR) (3-9) . Este receptor pertenece a la superfamilia del receptor de citocina-prolactina-GH y consiste de 3 dominios: un dominio extracelular responsable de la unión de la hormona y la dimerización del receptor, un dominio de la transmembrana, y un dominio intracelular el cual inicia la señalización intracelular (10,11). Aunque el primer defecto en la GHR que va a ser identificada en LS fue una deleción de un gen complejo (3), la totalidad de los defectos significativos subsiguientes que van a ser identificados han resultado de las mutaciones puntuales confinadas al dominio extracelular del receptor (4-9) . Kou et al describieron a un paciente de LS con 2 polimorfismos de ADN heterozigóticos dentro del dominio intracelular sobre el mismo alelo pero el significado funcional de estas variantes todavía va a ser establecido (12) . Una forma soluble de la GHR llamada proteína de unión de GH de afinidad elevada (GHBP) está presente en la circulación de los individuos normales y actúa como un depósito y una solución amortiguadora para la GH en circulación (10,13,14). Se piensa que la misma va a ser producida como un resultado del desdoblamiento proteolítico del dominio extracelular del resto de la proteína receptora en el hombre, aunque en los roedores se ha mostrado que va a ser producida como resultado de la división o separación alternativa (15,16). La medición total de la GHBP en los sujetos de LS reveló niveles ausentes o extremadamente bajos, consistentes con la hipótesis de que los defectos moleculares detectados en el receptor disminuyeron o redujeron la unión de GH (17).

Más recientemente ha salido a la luz de que hasta el 20% de los pacientes con LS de otra manera clásicos son GHBP "positivos" con una GHBP normal o aún elevada (1, 18). En este subgrupo solamente una mutación de GHR ha sido reportada, la cual involucra la substitución homozigótica de un residuo de aspartato altamente conservado por una histidina en una posición en el dominio extracelular del receptor que se sabe que va a ser crítica para la homodimerización del receptor (D152H) . Duquesnoy et al han demostrado que la falla de dimerización del receptor fue realmente el mecanismo de acción de esta mutación, y que la unión de la GH no fue afectada, explicando la GHBP normal (9). Ningún individuo con LS con un -defecto funcionalmente significativo fuera del dominio extracelular de la GHR ha sido descrito, aunque la experimentos de la mutagénesis han demostrado que la mayoría del dominio intracelular de la GHR es requerido para hacer una mediación entre la capacidad de respuesta celular completa con respecto a la GH (19-22) . Se aquí que se podrían esperar que ocurran mutaciones de manera natural, conduciendo a la deleción o alteración severa del dominio intracelular del receptor, originando una resistencia de GH severa con la preservación de la actividad de GHBP.

Se han descrito dos pacientes con LS relacionados quienes tienen una resistencia de Gh severa con la actividad de GHBP arriba del intervalo normal. El análisis de la GHR de ambos individuos reveló que los mismos son homozigóticos para una substitución de arginina a treonina en el extremo N-terminal del dominio intracelular de la GHR. Como la substitución del nucleótido está localizada en una posición crítica en el sitio donador del empalme 5' del exon 8. La mutación conduce al salto del exon 8 conduciendo a un GHR mutante sin el dominio intracelular o de la transmembrana funcional.

Métodos Pacientes. Los pacientes 1 y 2 son primos hermanos nacidos de un linaje altamente consanguíneo que se origina en Kashmir, Pakistán. La NS se presentó a la edad de 2.5 años con estatura corta severa (SDS de la altura -5.4) y un fenotipo facial típico. Ls niveles de GH fueron elevados notablemente con los niveles básales de 638mU/I. Los niveles de IGF-I básales fueron indetectables a <20 ng/ml (NR 40 - 150 ng/ml) y los niveles de IGFBP-3 fueron menores que el 5/o. Centil para la edad a 180 ng/ml (NR 1410 - 2970 ng/ml) (23) . La administración de hGH exógena (0.1 lU/kg/día sc durante 4 días) no produjo respuesta significativa en los niveles ya sea de IGF-I o de IGFBP-3 confirmando una resistencia a GH severa. La GHBP fue > 95/o. centil para la edad a 78.2 % (1) con la afinidad de unión de GH normal. Cuando se volvió a medir el nivel de GHBP después de 6 meses de terapia con IGF-I, no se reveló cambio alguno (nivel 82.1%) a pesar de una buena respuesta al tratamiento con su velocidad de altura que se incrementó a 8.7 cm/año. Sus padres quienes eran primos hermanos son de altura normal. Su madre ha dado a luz a otra hija que parece normal en esta etapa. El paciente 2, un primo hermano hombre ha presentado recientemente una falla de crecimiento (SDS de la altura -5.2), la apariencia facial típica de LS y el micropene a la edad de 2.2 años. Las investigaciones iniciales han revelado una GH basal de 810 mU/I y niveles de IGF-I básales de < 20 ng/ml.

Amplificación del ADN genómico por reacción en cadena de la polimerasa y secuenciamiento de ADN. El ADN genómico del lleucocito se preparó a partir de los pacientes y los miembros de la familia por métodos estándares. En el paciente 1, los exones 4-10 incluyendo los límites del intrón-exón fueron amplificados individualmente por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando pares de cebadores (de los cuales el antisentido fue biotinilado) deducido de la secuencia de ADN publicada (3) (Secuencias disponibles a petición) . Los productos de PCR fueron sometidos a secuenciamiento genómico de fase sólida directa utilizando glóbulos paramagnéticos recubiertos con estreptavidina (Dynal, Oslo, Noruega) y la tecnología de la Sequenase de una sola hebra (U.S. Biochemical Corp., Cleveland, Ohio) . Las secuencias de ADN de la autorradiografía de 35S fueron comparadas con la secuencia de GHR publicada (3) .

Análisis de la enzima de restricción. La mutación R274T crea un sitio de restricción para Mae II. Los cebadores 8a y 8b de los oligonucleótidos se utilizaron para amplificar el exon 8 de la GHR de los pacientes y 2 y los padres del paciente 1 del ADN genómico del leucocito por PCR (Para las secuencias cebadoras véase la tabla 1) . El ADN placental de la hermana recién nacida del paciente 1 también fue amplificado utilizando los mismos cebadores. lOµl de este producto de PCR fueron digeridos entonces con Mae II y separados sobre un gel de poliacrilamida al 6%. El ADN fue visualizado por teñido de bromuro de etidio.

Análisis del ADNc Las líneas celulares de linfoblastoide fueron generadas de los linfocitos del paciente 1 por la transformación del virus de Epstein-Barr (EBV) utilizando procedimientos estándares. El ARN celular se aisló de estos linfocitos transformados con EBV y los linfocitos de control se colectaron de la sangre periférica de un sujeto normal utilizando un método de un solo paso (Biogénesis, Bournemouth, UK) . 15 µg de este ARN se convirtieron entonces al ADNc en una reacción de transcripción inversa cebada por hexámeros al azar. El ADNc del GHR que se extiende a los exones 7-10 se amplificó utilizando el enfoque de PCR agrupado mostrado en la Figura 3a. La secuencia de los cebadores de PCR son listados en la Tabla A: En la última ronda de PCR, el cebador P6 fue biotinilado y se obtuvieron las hebras únicas para el secuenciamiento directo y se secuenciaron como se describió anteriormente.

Análisis de GH, IGF-1, IGFBP-3 y GHBP. La GH se determinó por el ensayo inmunoabsorbente relacionada con la enzima. La IGF-I se midió por radioinmunoensayo específico (RÍA) después de la extracción de etanol-ácido (24) . La IGFBP-3 también fue medida utilizando un RÍA específico (25) . La GHBP se midió por la filtración con gel de CLAR utilizando el método descrito por Postel-Vinay et al (26) . No se hizo ninguna corrección para la concentración de GH elevada.

Medición de la afinidad de unión de GHBP Una gráfica de Scatchard fue obtenida de los experimentos de unión de competición utilizando 50 µl de plasma. El análisis fue efectuado utilizando el Ligando (27) del programa.

Resultados Identificación de una mutación de sentido omitido en la posición -1 del sitio de separación o división del donador en 5' del exon 8 de la GHR El secuenciamiento de la GHR en los pacientes 1 y 2 reveló la substitución homozigótica de una G por un C en el nucleótido 91 del exon 8 (Figura 22), el cual está localizado en la posición -1 del sitio del donador del empalme 5' . El secuenciamiento de ADN no reveló alteración adicional de la secuencia publicada o aquella de un sujeto de control. Los padres del paciente 1 fueron heterozigóticos para esta mutación. Esta substitución del nucleótido conduce al reemplazo de la arginina (AGG) por treonina (ACG) en el aminoácido 274 de la GHR madura (R274T) , el cual se predice que va a ser el cuarto aminoácido del dominio intracelular de la proteína receptora (10) .

Asignación de las coordenadas de la enzima de la restricción La mutación crea un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción Mae II. La amplificación de un fragmento de 199 pb del exon 8 GHR que contiene esta mutación seguido por la digestión con Mae II produce los fragmentos de 154 y 45 pb mientras que el fragmento normal permanecerá sin corte. Como se muestra en la Figura 23, el análisis de la enzima de restricción de los padres del paciente 1 dio una configuración de digestión mezclada que confirma su estado heterozigótico, mientras que para los pacientes 1 y 2 solamente el fragmento de 154 pb más cortes pueden ser observados demostrando su homozigosidad para la mutación. La digestión del exon 8 del GHR del ADN placental obtenido del hermano recién nadido del paciente 1 demostró que él es heterozigótico para la mutación.

Análisis del ADNc La amplificación del ADNc de los linfocitos de control utilizando los cebadores P4 y P5 produjo una banda de 267 pb como se esperaba. A partir de los linfocitos transformados con EBV obtenidos del paciente 1, solamente un producto más pequeño de 176 pb fue obtenido. El secuenciamiento directo de estos productos de transcripción inversa-PCR (RT-PCR) demostró que en el ARNm del GHR obtenido del paciente 1, el exon 8 fue saltado conduciendo al exon 8 que se empalma en el exon 9 (Figura 24), mientras que el ARNm de la GHR obtenida de los linfocitos de control fue empalmado normalmente con el exon 8 a continuación del exon 7.

Características del GHBP del suero La afinidad de unión de la GH de la GHBP del paciente 1 estuvo dentro de los límites normales con una constante de asociación (Ka) de 3.09xl0-8 M (intervalo de adultos normales: 3.6 - 7.4 x 810-M) . La capacidad de unión máxima del plasma para la GH (Bmáx) fue marcadamente incrementada a 317 ng/ml del plasma (intervalo de adultos normales: 24-86 ng/ml9. Estos resultados sugieren que el incremento en la GHBP medible refleje un incremento absoluto en la proteína de unión circulante. El complejo de 125I-hGH-GHBP eluido en el tiempo esperado de la columna de CLAR que sugiere que el peso molecular de la GHBP en el plasma del paciente 1 es comparable con aquel de los sujetos normales.

Discusión Nuestros resultados documentan el primer tiempo LS asociado con un defecto homozigótico en el dominio intracelular del GHR. Esta mutación en el sitio de empalme del donador 5' del exon 8 induce el salto del exon 8 el cual codifica el dominio de la transmembrana del GHR. Los niños afectados tienen un fenotipo clásico aparte de la GHBP en la probanda el cual está muy arriba del intervalo normal. Los padres, en quienes se ha demostrado la heterozigosidad, son de estatura normal. Nuestro descubrimiento de que esta transversión G C en la posición -1 del sitio de empalme del donador 5' en el salto del exon no es inesperado. El nucleótido G en la posición 1 es conservado en el 78% de todos los sitios del donador 5' y se enseña que va a ser crítico para el empalme normal. Los datos colacionados de Shapiro y Senapathy (28) sobre otras 62 mutaciones puntuales en los sitios de empalme de 5' en otros genes: en más de la mitad de estos documentos los cuales incluyen datos sobre su efecto en el ARNm, el salto del exon fue el únio producto de transcripción aberrante (28). La otra consecuencia posible de tal mutación es la utilización del sitio del empalme críptico pero esto no parece que haya sido el caso para esta mutación porque se fue posible detectar algunos otros fragmentos de RT-PCR anormales. El salto del exon 8 en el ARNm GHR también conduce al exon 9 (el cual se codifica al inicio del dominio intracelular) que es transcrito fuera del marco con un codón de detención 5 aminoácidos corriente abajo. De aquí que se ha predicho que la proteína de GHR mutante producida por estos individuos podría no tener dominio de transmembrana y ningún dominio intracelular funcional. Este descubrimiento es consistente con la resistencia de GH severa encontrada en los pacientes en que tal molécula podría no ser capaz de la transducción de la señal. La falta de un dominio de la transmembrana podría conducir a que el receptor ya no sea anclado en la membrana celular, pero con un dominio extracelular normal debe ser capaz de unión a la GH. La elevación en la GHBP en el paciente 1 puede ser explicada por lo tanto con base en que la totalidad de la proteína de GHR que ella produce es liberada en la circulación y medible como GHBP. El descubrimiento de la afinidad de unión de GH normal en el suero sugiere que esta elevación en la GHBP no se debe a un incremento en la afinidad del receptor mutante sino que refleja un incremento absoluto en los receptores circulantes disponible para la unión a la GH. Esta relación directa entre el número de receptores y la GHBP medida proporciona una oportunidad única para evaluar el efecto de la IGF-I sobre los niveles de la expresión del gen de GHR. En los sujetos normales, se ha sugerido que un cambio en la GHBP del suero puede reflejar cambios en los niveles de GHR celulares, la proteólisis del receptor o el espaciado de la GHBP (29) . Recientemente, Sildberg y colaboradores reportaron una reducción en la GHBp del suero después de la terapia de IGF-I en 3 sujetos con LS, con un posible defecto del posrreceptor, interpretando este descubrimiento como evidencia de que la IGF-I puede ser un factor regulatorio para la GHBP del suero (30) . Sin embargo en este paciente, a pesar de una buena respuesta a la terapia de IGF-I en términos de la velicidad de crecimiento, su GHBP disminuyó solo de manera ligera y está todavía muy arriba del intervalo normal para su edad. En resumen, se ha descrito la primera mutación homozigótica que afecta al dominio intracelular del receptor en la GHR de 2 pacientes con LS los cuales parece que tienen su efecto provocando el salto del exon 9 y la producción de una GHR que no contiene la transmembrana o el dominio intracelular. Se ha demostrado que en la forma homozigótica la misma se segrega claramente con el fenotipo de la enfermedad y es probable que sea el defecto causal en la GHR de esta variante de LS con GHBP elevada. La otra mutación única que va a ser identificada en esta variante "positiva" de GHBP de la LS se encontró en el dominio extracelular del receptor, demostrando la heterogeneidad molecular de esta forma de LS. Los estudios adicionales de los pacientes con este fenotipo es probable que proporcionen discernimientos en la función de la GHR.

REFERENCIAS 1. Savage, M. O., et al. J Clin Endocrinol Metatab 77:1465-1471. 2. Laron, Z., et al. Isr J Med Sci 2:152-155. 3. Godowski, P. J. Proc Nati Acad Sci, USA 86:8083-8087. 4. Amselem, S., et al. N Engl J Med 321:989-995. 5. Amselem, S., et al. J Clin Invest 87:1098-1102. 6. Berg, M.A. , et al. Hum Mutat 1:24-34. 7. Berg, M.A. , et al. Am J. Hum. Genet. 52:998-1005. 8. Amselem, S. , et al. Hum. Mol. Genet. 2:355-359. 9. Duquesnoy, P. , et al. EMBO Journal 13: 1386-1395. 10. Leung, et al. Nature 330:537-543. 11. Bazin, J.F., et al. Proc Nati Acad Sci, USA 87:6934-6938. 12. Kou, K., et al. J Clin Endocrinol Metab 76:54-59. 13. Veldhuis, et al. J Clin Invest 91:629-641. 14. Baumann, et al. J. Clin Endocrinol Metab 64:657-660.

. Baumbach, et al. Genes & Development 3:1199-1205. 16. Sotiropoulos, et al. Endocrinology 132:1863-1865. 17. Daughaday, et al. Proc Nati Acad Sci, USA 84:4636- 4640. 18. Buchanan, et al. Clin Endocrinol 35:179-185. 19. Goujon, et al. Proc Nati Acad Sci, USA 91:957-961.

. - Billestrup, et al. [Review]. P.S.E.B.M. 206(3):205- 209. 21. Sotiropoulos, et al. Endocrinology 135:1292-1298. 22. Wang, Y-D, et al. Mol Endocrinol 303-307. 23. Bluirt, et al. Insulin-like growth factors and their binding proteins. Functional endocrinologic diagnosis in children and adolescents. M.B. Ranke, editor, J.J. Verlag, Mannheim. 102-117. 24. Bang, P., et al. Acta Endocrinologica 124:620-629.

. Blum, W. , et al. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 70:1292-1298. 26. Tar, A., et al. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 71:1202-1207. 27. Munson, et al. Analytical Biochemistry 107,220-239. 28. Shapiro, et al. Nucí Acids Res 15:7155-7174. 29. Fontoura, et al. Clin Endocrinol 37:249:253. 30. Silbergeld, A., et al. P.S.E.B.M. 206:324-327.

Conclusión Un subgrupo de niños con ISS tienen fenotipos los cuales implican la GHIS parcial en la etiología de su estatura corta. La hipótesis planteada aquí de la señalización de GHR reducida como se ejemplificó por los niveles inferiores de IGF-I y las concentraciones de GH más elevadas con niveles de GHBP inferiores han sido confirmadas por medio de la identificación de las mutaciones de GHR en pacientes no deficientes en GH, de estatura corta, seleccionados para GHBP baja e IGF-I baja. Ninguno de los 24 controles normales exhibieron alteraciones de la secuencia detectables por SSCA, mientras que 4 de los 14 pacientes con ISS seleccionados tuvieron alteraciones del par base único identificable (p=0.014). Puesto que la SSCA es capaz de detectar aproximadamente 80% de mutaciones conocidas en los sistemas modelo (Vidal-Puig y Moller, Biotechniques, 17 : 490-496 [1994]; Ravnik-Glavac et al., Hum. Mol. Genet., 3: 801-807 [1994]), pueden existir mutaciones adicionales presentes en estos pacientes con ISS los cuales sean omitidas . Dos de los cuatro pacientes con ISS con mutaciones de GHR han respondido a la GH exógena (Pacientes 1 y 2 de la Tabla IX) . La presencia de las mutaciones y la respuesta a la GH sugiere que estos pacientes puedan ser parcialmente insensibles a la GH debido a la GHR disfuncional. Sin que esté limitado a alguna teoría, se cree que la incapacidad del Paciente 4 para responder a la GH refleja más probablemente la naturaleza de las dos mutaciones llevadas a cabo en sus alelos de GHR. Una alteración reduce la afinidad del receptor para 330 veces de la GH, haciendo presumiblemente a este receptor insensible a los niveles fisiológicos o farmacológicos de GH. El efecto de la segunda alteración, R161C, no es mostrado, pero esta mutación es severa; en el estado homozigótico el mismo provoca la GHIS completa. Amselem et al., supra. El cuarto paciente (Paciente 7) no ha sido tratado todavía con GH. Es claro de los resultados de aquí que un grado continuo de respuesta a la GH se extiende desde el GHIS completo observado en el LS, a través de pacientes con ISS severamente insensibles que carecen de las características fenotípicas del síndrome de LS pero quienes no pueden responder a las dosis estándares de GH, por medio de los pacientes con ISS con GHIS parcial quienes responden a la terapia de GH estándar, y finalmente al fenotipo normal. El paciente 4 es un heterozigoto compuesto para las substituciones de E44K y R161C, y cada padre es heterozigótico para una de las dos mutaciones. Las alturas de los padres y de los abuelos están todos dentro del intervalo normal para la población adulta; sin embargo, las alturas de los portadores conocidos de una sola mutación están abajo del promedio. El paciente 2 es heterozigótico para la cisteína, para detener la mutación en la posición 122 y por consiguiente tiene un alelo que produce una proteína, presumiblemente inestable, truncada. Su madre lleva la misma mutación. El paciente 2, ahora de 19 años de edad, está afectado más severamente por la presencia de esta mutación (SDS DE altura -3.2) que su madre (SDS de altura -1.4). Sin que esté limitado a alguna teoría, la probanda puede tener heredada una mutación todavía no definida de su padre (SDS de altura -1.4) que afecta la expresión del alelo de GHR estructuralmente normal u otro paso en el eje de GH. La familia 2 es similar a un paciente de LS sospechoso y a su madre no afectada, ambos de los cuales llevaron dos mutaciones sobre un alelo del sitio de GHR. Kou et al., J.C.E.M., 76: 54-59 (1993). La similaridad entre este paciente y el Paciente 2 sugiere, bajo una teoría, que ambos pueden ser portadores de una segunda mutación no identificada, análogo a varios pacientes insensibles a la insulina en quienes han sido observados niveles reducidos del ARNm del receptor de insulina a pesar de la falta de mutación en cualquiera de los exones (revisado por Taylor et al., Endocrine Rev., 13: 566-595 [1992]). Dos de otros pacientes llevan mutaciones heterozigóticas que conducen a las substituciones de aminoácidos (R211H en el Paciente 1 y E224D en el Paciente 7) . Los padres del Paciente 1 ambos tuvieron alturas dentro del intervalo normal para la población adulta. Hamill et al., Am. J. Clin. Nutrition, 32: 607-629 (1979). De manera similar, el padre del Paciente 7 tiene una SDS de la altura de -0.43 y la SD de la altura de la madre es de +1.4. La LS es una condición recesiva autosómica. Los individuos afectados usualmente heredan la misma mutación de los padres consanguíneos. Los heterozigotos para las mutaciones de GHR (padres y hermanos de los pacientes con LS) pueden tener anormalidades leves del crecimiento. Laron, The Endocrinologist, 3: 21-28 (1993); Rosenbloom et al., Acta Paediatr., Suppl. 399: 125-127 (1994). Aproximadamente la mitad de los portadores heterozigóticos tienen niveles de GHBP de más de 2 SDs abajo del promedio para la edad. Aguirre et al., Horm. Res . , 34 : 4-8 (1990); Laron et al., Acta Endocrinol., 121: 603-608 (1989) . Además, Laron, Tehe Endocrinologist, supra, reportó que las alturas de los padres y los hermanos clínicamente normales de los paciente con LS están típicamente abajo del 50/o. Percentil para su sexo y origen étnico. Sin que esté limitado a alguna teoría, la GHIS parcial que conduce a una SDS de la altura menor que -2 puede surgir en los portadores de mutaciones heterozigóticas de la GHR bajo la influencia de los genotipos particulares en un lugar del modificador todavía no identificado, o cuando las alteraciones confieren un fenotipo negativo dominante. Como ha sido propuesto para las mutaciones del receptor de insulina heterozigóticos en varios pacientes insensibles a la insulina. Las cinco mutaciones identificadas en los cuatro pacientes (E44K, C122X, R161C, R211H, E224D) están confinados al dominio extracelular del receptor. La substitución de E44K provoca una reducción de 330 veces en la afinidad hacia la GH, mientras que la alteración de los residuos R161, R211, o E224 tiene efectos sutiles sobre la unión del ligando (Tabla X) . El residuo R211 está alejado de los sitios tanto de unión como de dimerización del ligando de la GHR. El mismo, sin embargo, está adyacente al motivo "semejante a WS" conservado a través de la superfamilia del receptor de citocina. Los residuos del motivo semejante a WS se agrupan o empaquetan estrechamente con el R211 y otras cadenas laterales de aminoácidos para formar una pila de cadenas laterales básicas y aromáticas alternativas. El residuo E224 corresponde al residuo variable del motivo semejante a WS. De igual manera que R211, el mismo radica fuera de los sitios de unión conocidos sobre la molécula de GHR y las mutaciones no alteran la unión de GH significativamente (Tabla X) . Una substitución de E224A expresada en las células del mamífero en cultivo tuvieron una localización subcelular alterada. Baumgartner et al., J. Biol. Chem., 269: 29094-29101 (1994) . Una fracción incrementada del receptor total fue observada en una localización próxima nuclear. No se sabe si esto refleja la acumulación del receptor sintetizado recientemente o la internación del receptor incrementada. Sin que esté limitado por alguna teoría, si la mutación de E224D provoca un efecto similar, el procesamiento incorrecto podría conducir a números del receptor reducidos sobre la superficie de la célula y a una reducción concomitante en los niveles de GHBP del suero. Con este estudio se sabe que la selección de un subconjunto de niños con ISS con los parámetros clínicos sugestivos de una insensibilidad parcial a la GH identifica a los pacientes que llevan las mutaciones de GHR las cuales pueden afectar la función de GHR. Puesto que los pacientes estudiados fueron seleccionados con base en la GHBP funcional circulante reducida, las mutaciones deben efectar a la unión del ligando directamente (E44K) o provocar una reducción en la disponibilidad del receptor de la superficie de la célula (R161C, R211H y E224D) , por lo cual contribuyen a un síndrome de GHIS parcial. Realmente, dos de los tres pacientes con ISS, con mutaciones de GHR, quienes fueron tratados con GH exógena, tuvieron una GHIS parcial de respuesta a la GH.

EJEMPLO VI Ochenta niños en la prepubertad, que se ha diagnosticado que tienen una altura promedio menor que -2 desviaciones estándares abajo de la altura normal, un nivel del suero de GHBP que es de al menos 2 desviaciones estándares abajo del nivel normal, un nivel del suero de IGF-1 que. está abajo del nivel promedio normal, y un nivel de suero estimulado promedio o máximo de GH que es al menos normal, de edad 5-12, son tratados como sigue: 20 con IGF-I sola, 20 con GH sola, 20 con GH y IGF-I conjuntamente, y 20 con placebo. Cuando los fármacos son proporcionados solos, la IGF-I es administrada una vez por día por inyección subcutánea a una dosis de 150 µg/kg/día y la GH es administrada una vez por día por inyección subcutánea a una dosis de 0.70 mg/kg/semana. Cuando los fármacos son combinados, la IGF-1 es administrada una vez por día por la inyección subcutánea a una dosis de 75 µg/kg/día y la GH es administrada una vez por día por inyección subcutánea a una dosis de 0.35 mg/kg/semana. La formulación de IGF-I es ya sea (a) 10 mg/ml de IGF-I en 20 mM de solución amortiguadora de acetato de sodio, 2.5 mg/ml (0.25%) de fenol, 45 mg/ml de manitol, pH 5.0; o (b) 10 mg/ml de IGF-I en 50 mM de solución amortiguadora de acetato de sodio, 2.5 mg/ml de fenol, 5.84 mg/ml de NaCl, y 9 mg/ml de alcohol bencílico, pH 5.4. La formulación de GH es la GH marca ya sea Nutropin® o Protropin® disponible de Genentech, Inc. Los pacientes son tratados durante 6 meses con este protocolo. El incremento en la altura de cada paciente es medida. En este estudio se espera que la IGF-I, GH, o la combinación podría incrementar las velocidades de crecimiento de la totalidad de los pacientes cuando se comparan con aquellos pacientes tratados con el placebo. Los diseños alternativos para los ensayos clínicos son como sigue: Los mismos grupos y subclases de niños son tratados del mismo modo con GH sola a 0.35 mg/kg/semana o 0.70 mg/kg/semana, o la IGF-I sola a 75, 100, o 200 µg/kg/día. Para el tratamiento en combinación, la GH es utilizada a 0.35 mg/kg/semana y la IGF-I a 75 o 100 µg/kg/día con o sin la utilización de un placebo para comparación.

LIST7ADO DE LAS SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: Attie, Kenneth Carlsson, Lena Gesundheit, Neil Goddard, Audrey (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: Tratamiento del Síndrome de Insensibilidad Parcial a la Hormona del Crecimiento (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 57 (iv) DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: Genentech, Inc. (B) CALLE: 460 Point San Bruno Blvd (C) CIUDAD: South San Francisco (D) ESTADO: California (E) PAÍS: E.U.A. (F) CÓDIGO POSTAL: 94080 (v) FORMA LEÍBLE PARA LA COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: disco magnético flexible de 360 KB de 13.33 cm (5.25 pulgadas) (B) COMPUTADORA: compatible con IBM PC (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA: patín (Genentech) (vi) DATOS COMUNES DE LA SOLICITUD: (A) NUMERO DE LA SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 24-MAR-1995 (C) CLASIFICACIÓN: (vii) FECHA DE SOLICITUD PREVIA: (A) NUMERO DE SOLICITUD: 08/224982 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 07-ABR-1994 (viii) INFORMACIÓN DEL APODERADO/MANDATARIO: (A) NOMBRE: Hasak, Janet E. (B) NUMERO DE REGISTRO: 28,616 (C) NUMERO DE REGISTRO/REFERENCIA: 884P1 (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES: (A) TELEFONO: 415/225-1896 ( B) TELEFAX : 415/ 952-9881 (C) TELEX: 910/371-7168 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:l: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 445 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:l: ATCCTCTAAG GAGCCTAAAT TCACCAAGTG CCGTTCACCT GAGCGAGAGA 50 CTTTTTCATG CCACTGGACA GATGAGGTTC ATCATGGTAC AAAGAACCTA 100 GGACCCATAC AGCTGTTCTA TACCAGAAGG AACACTCAAG AATGGACTCA 150 AGAATGGAAA GAATGCCCTG ATTATGTTTC TGCTGGGGAA AACAGCTGTT 200 ACTTTAATTC ATCGTTTACC TCCATCTGGA TACCTTATTG TATCAAGCTA 250 ACTAGCAATG GTGGTACAGT GGATGAAAAG TGTTTCTCTG TTGATGAAAT 300 AGTGCAACCA GATCCACCCA TTGCCCTCAA CTGGACTTTA CTGAACGTCA 350 GTTTAACTGG GATTCATGCA GATATCCAAG TGAGATGGGA AGCACCATGC 400 AATGCAGATA TTCAGAAAGG GTGGATGGTT CTGGAGTATG AACTT 445 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 2 : ( i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD : 445 bases ( B ) TIPO : ácido nucleico ( C ) TIPO DE HEBRA: única ( D) TOPOLOGÍA: lineal ( x ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 2 : ATCCTCTAAG GAGCCTAAAT TCACCAAGTG CCGTTCACCT GAGCGAAAGA 50 CTTTTTCATG CCACTGGACA GATGAGGTTC ATCATGGTAC AAAGAACCTA 100 GGACCCATAC AGCTGTTCTA TACCAGAAGG AACACTCAAG AATGGACTCA 150 AGAATGGAAA GAATGCCCTG ATTATGTTTC TGCTGGGGAA AACAGCTGTT 200 ACTTTAATTC ATCGTTTACC TCCATCTGGA TACCTTATTG TATCAAGCTA 250 ACTAGCAATG GTGGTACAGT GGATGAAAAG TGTTTCTCTG TTGATGAAAT 300 AGTGCAACCA GATCCACCCA TTGCCCTCAA CTGGACTTTA CTGAACGTCA 350 GTTTAACTGG GATTCATGCA GATATCCAAG TGAGATGGGA AGCACCACGC 400 AATGCAGATA TTCAGAAAGG GTGGATGGTT CTGGAGTATG AACTT 445 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 148 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3 Ser Ser Lys Glu Pro Lys Phe Thr Lys Cys Arg Ser Pro Glu Arg 1 5 10 15 Glu Thr Phe Ser Cys His Trp Thr Asp Glu Val His His Gly Thr 20 25 30 Lys Asn Leu Gly Pro He Gln Leu Phe Tyr Thr Arg Arg Asn Thr 35 40 45 Gln Glu Trp Thr Gln Glu Trp Lys Glu Cys Pro Asp Tyr Val Ser 50 55 60 Ala Gly Glu Asn Ser Cys Tyr Phe Asn Ser Ser Phe Thr Ser He 65 70 75 Trp He Pro Tyr Cys He Lys Leu Thr Ser Asn Gly Gly Thr Val 80 85 90 Asp Glu Lys Cys Phe Ser Val Asp Glu He Val Gln Pro Asp Pro 95 100 105 Pro He Ala Leu Asn Trp Thr Leu Leu Asn Val Ser Leu Thr Gly 110 115 120 He His Ala Asp He Gln Val Arg Trp Glu Ala Pro Cys Asn Ala 125 130 135 Asp He Gln Lys Gly Trp Met Val Leu Glu Tyr Glu Leu 140 145 148 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 148 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4 Ser Ser Lys Glu Pro Lys Phe Thr Lys Cys Arg Ser Pro Glu Arg 1 5 10 15 Lys Thr Phe Ser Cys His Trp Thr Asp Glu Val His His Gly Thr 20 25 30 Lys Asn Leu Gly Pro He Gln Leu Phe Tyr Thr Arg Arg Asn Thr 35 40 45 Gln Glu Trp Thr Gln Glu Trp Lys Glu Cys Pro Asp Tyr Val Ser 50 55 60 Ala Gly Glu Asn Ser Cys Tyr Phe Asn Ser Ser Phe Thr Ser He 65 70 75 Trp He Pro Tyr Cys He Lys Leu Thr Ser Asn Gly Gly Thr Val 80 85 90 Asp Glu Lys Cys Phe Ser Val Asp Glu He Val Gln Pro Asp Pro 95 100 105 Pro He Ala Leu Asn Trp Thr Leu Leu Asn Val Ser Leu Thr Gly 110 H5 12J He His Ala Asp He Gln Val Arg Trp Glu Ala Pro Arp Asn Ala 125 130 135 Asp He Gln Lys Gly Trp Met Val Leu Glu Tyr Glu Leu 40 145 148 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 173 bases (E) TIPO: ácido nucleico (F) TIPO DE HEBRA: única (G) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5: GAACACTCAA GAATGGACTC AAGAATGGAA AGAATGCCCT GATTATGTTT 50 CTGCTGGGGA AAACAGCTGT TACTTTAATT CATCGTTTAC CTCCATCTGG 100 ATACCTTATT GTATCAAGCT AACTAGCAAT GGTGGTACAG TGGATGAAAA 150 GTGTTTCTCT GTTGATGAAA TAG 173 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 173 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6: GAACACTCAA GAATGGACTC AAGAATGGAA AGAATGCCCT GATTATGTTT 50 CTGCTGGGGA AAACAGCTGT TACTTTAATT CATCGTTTAC CTCCATCTGG 100 ATACCTTATT GTATCAAGCT AACTAGCAAT GGTGGTACAG TGGATGAAAA 150 GTGATTCTCT GTTGATGAAA TAG 173 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 57 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7: Asn Thr Gln Glu Trp Thr Gln Glu Trp Lys Glu Cys Pro Asp Tyr 1 5 10 15 Val Ser Ala Gly Glu Asn Ser Cys Tyr Phe Asn Ser Ser Phe Thr 20 25 30 Ser He Trp He Pro Tyr Cys He Lys Leu Thr Ser Asn Gly Gly 35 40 45 Thr Val Asp Glu Lys Cys Phe Ser Val Asp Glu He 50 55 57 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 50 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (xü) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: Asn Thr Gln Glu Trp Thr Gln Glu Trp Lys Glu Cys Pro Asp Tyr 1 5 10 15 Val Ser Ala Gly Glu Asn Ser Cys Tyr Phe Asn Ser Ser Phe Thr 20 25 0 Ser He Trp He Pro Tyr Cys He Lys Leu Thr Ser Asn Gly Gly 35 40 45 Thr Val Asp Glu Lys 50 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 240 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9: GACTCTTTGG CCAATATGCG TTTATATTTT GTCTTGAAAG ATGGACCCTA 50 TATTGACAAC ATCAGTTCCA GTGTACTCAT TGAAAGTGGA TAAGGAATAT 100 GAAGTGCGTG TGAGATCCAA ACAACGAAAC TCTGGAAATT ATGGCGAGTT 150 CAGTGAGGTG CTCTATGTAA CACTTCCTCA GATGAGCCAA TTTACATGTG 200 AAGAAGGTAA AAGAAATAAA AGATTAAAAT AGTAGCTAAC 240 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 240 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10: GACTCTTTGG CCAATATGCG TTTATATTTT GTCTTGAAAG ATGGACCCTA 50 TATTGACAAC ATCAGTTCCA GTGTACTCAT TGAAAGTGGA TAAGGAATAT 100 GAAGTGCATG TGAGATCCAA ACAACGAAAC TCTGGAAATT ATGGCGAGTT 150 CAGTGAGGTG CTCTATGTAA CACTTCCTCA GATGAGCCAA TTTACATGTG 200 AAGAAGGTAA AAGAAATAAA AGATTAAAAT AGTAGCTAAC 2 0 (3) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 55 aminoácidos (C) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11: Met Asp Pro He Leu Thr Thr Ser Val Pro Val Tyr Ser Leu Lys 1 5 10 15 Val Asp Lys Glu Tyr Glu Val Arg Val Arg Ser Lys Gln Arg Asn 20 25 30 Ser Gly Asn Tyr Gly Glu Phe Ser Glu Val Leu Tyr Val Thr Leu 35 40 45 Pro Gln Met Ser Gln Phe Thr Cys Glu Glu 50 55 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 55 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12: Met Asp Pro He Leu Thr Thr Ser Val Pro Val Tyr Ser Leu Lys 1 5 10 15 Val Asp Lys Glu Tyr Glu Val His Val Arg Ser Lys Gln Arg Asn 20 25 30 Ser Gly Asn Tyr Gly Glu Phe Ser Glu Val Leu Tyr Val Thr Leu 35 40 45 Pro Gln Met Ser Gln Phe Thr Cys Glu Glu 50 55 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 240 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13: GACTCTTTGG CCAATATGCG TTTATATTTT GTCTTGAAAG ATGGACCCTA 50 TATTGACAAC ATCAGTTCCA GTGTACTCAT TGAAAGTGGA TAAGGAATAT 100 GAAGTGCGTG TGAGATCCAA ACAACGAAAC TCTGGAAATT ATGGCGAGTT 150 CAGTGAGGTG CTCTATGTAA CACTTCCTCA GATGAGCCAA TTTACATGTG 200 AAGAAGGTAA AAGAAATAAA AGATTAAAAT AGTAGCTAAC 240 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 240 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14: GACTCTTTGG CCAATATGCG TTTATATTTT GTCTTGAAAG ATGGACCCTA 50 TATTGACAAC ATCAGTTCCA GTGTACTCAT TGAAAGTGGA TAAGGAATAT 100 GAAGTGCGTG TGAGATCCAA ACAACGAAAC TCTGGAAATT ATGGCGACTT 150 CAGTGAGGTG CTCTATGTAA CACTTCCTCA GATGAGCCAA TTTACATGTG 200 AAGAAGGTAA AAGAAATAAA AGATTAAAAT AGTAGCTAAC 240 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 55 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15 Met Asp Pro He Leu Thr Thr Ser Val Pro Val Tyr Ser Leu Lys 1 5 10 15 Val Asp Lys Glu Tyr Glu Val Arg Val Arg Ser Lys Gln Arg Asn 20 25 30 Ser Gly Asn Tyr Gly Glu Phe Ser Glu Val Leu Tyr Val Thr Leu 35 40 45 Pro Gln Met Ser Gln Phe Thr Cys Glu Glu 50 55 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 55 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16: Met Asp Pro He Leu Thr Thr Ser Val Pro Val Tyr Ser Leu Lys 1 5 10 15 Val Asp Lys Glu Tyr Glu Val Arg Val Arg Ser Lys Gln Arg Asn 20 25 30 Ser Gly Asn Tyr Gly Asp Phe Ser Glu Val Leu Tyr Val Thr Leu 35 40 45 Pro Gln Met Ser Gln Phe Thr Cys Glu Glu 50 55 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 18 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17 TGCTGGGCTT TACCTTAC 18 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 18 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18: CAAAACACTG AGGGTGGA 18 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 22 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19: TACACAGGGT CATATCAGAT TG 22 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 20: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 22 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20: CTATTCCAGT TACTACCATC CC 22 2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 21: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 18 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21: CTGATTTCAT GCCTTGCC 18 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 22: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 18 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22: AGAAAGGCAT GATGGTGG 18 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 23: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23: ACTTAAGCTA CAACATGATT 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 24 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24: GCTTCCCCAT TTATTTAGT 19 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 25: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal !xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25: ATGCTCTGTT GAATTGCAC 19 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 26: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26: GTGTAAGGTG TAGCAACAT 19 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 27: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 18 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27 GACTCTTTGG CCAATATG 18 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 28: (í) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 18 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal ( xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 28 AAGCCAGGTT AGCTACTA 18 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 29: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:29: GAAACTGTGC TTCAACTAGT C 21 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 30: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30: GGTCTAACAC AACTGGTACA 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 31: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31: ATGTAGCTTT TAACATCTCA A 21 2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 32: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 18 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32: ATGACAGGAG TCTTCAGG 18 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 33: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 22 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33: GAGTTTCTTT TCATAGATCT TC 22 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 34: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 18 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34: TTAACCTCTG TGGCTGAG 18 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 35: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 18 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 35: ACATGAGGGT ACCTCAGA 18 INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 36: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 18 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:36: CAGAAGTAGG CATTGTCC 18 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 37: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 18 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 37 GGAAATGGTC TCACTCTG 18 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 38: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 18 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 38 CCAAAGAAAG GCTAAGGC 18 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 39: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 39: GTCCTACAGG TATGGATCTC T 21 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 40: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 40: GAATATCTGC ATTGCGTGGT G 21 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 41: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 41: CTGGTATAGA ACAGCTGTAT G 21 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 42: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 27 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 42: ATTCTTCTAA GGAGCCTAAA TTCACCA 27 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 43: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 43: CCACCATTGC TAGTTAGCTT G 21 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 44: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 44: ATGGACTCAA GAATGGAAAG AATG 24 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 45: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 45: CACCACGCAA TGCAGATATT C 21 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 46: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 46: CTCATGGTCA CTGCTTAGAA G 21 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 47: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 47 GTTACATAGA GCACCTCACT G 21 2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 48: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 23 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 48: ATGGACCCTA TATTGACAAC ATC 23 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 49: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 23 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 49: CCTTTAATCT TTGGAACTGG AAC 23 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 50: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 50: GGGCTAACAG TGATGCTATT T 21 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 51: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 51 GCTTAGAAGT CTGTCTGTGT C 21 INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 52: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 52: GCTAGATATT GATGAGCCAG A 21 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 53: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi), DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 53: GCTAAGGCAT GATTTTGTTC A 21 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 54: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 54 GTCGATGTTT GACAGTGAAC T 21 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 55: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 55: GAAGGAGCTG AGTCAACTCA C 21 ,'2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 56: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 56: GCTTGGCTGT ATGTGTGATT C 21 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 57: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 57: TACTTCTGTG AGGCAGATGC C 21 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para incrementar la velocidad de crecimiento de un paciente humano que tiene el síndrome de insensibilidad parcial a la hormona del crecimiento, caracterizado porque comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de una hormona del crecimiento que incrementa la velocidad de crecimiento del paciente, dicho paciente tiene una altura menor que aproximadamente -2 desviaciones estándares abajo de lo normal para su edad y sexo, tiene un nivel en el suero de la proteina de unión de la hormona de crecimiento de alta afinidad que es de al menos 2 desviaciones estándares abajo de los niveles normales, tiene un nivel del suero de la IGF-I que está abajo de los niveles promedio normales, y tiene un nivel en el suero estimulado promedio o máximo de la hormona del crecimiento que es al menos normal, en donde el paciente no tiene el síndrome de Laron.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cantidad efectiva de la hormona del crecimiento es mayor que aproximadamente 0.2 mg/kg/semana.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cantidad efectiva de la hormona del crecimiento es mayor que aproximadamente 0.25 mg/kg/semana.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cantidad efectiva de la hormona del crecimiento es mayor que o igual a aproximadamente 0.3 mg/kg/semana.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la hormona del crecimiento es administrada una vez por dia.

6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la hormona del crecimiento es administrada por inyecciones subcutáneas.

7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la hormona del crecimiento es formulada a un pH de aproximadamente 7.4 a 7.8.

8. Un método para incrementar la velocidad de crecimiento de un paciente humano que tiene el síndrome de insensibilidad parcial a la hormona del crecimiento, caracterizado porque comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de la IGF-I que incrementa la velocidad de crecimiento del paciente, dicho paciente tiene una altura menor que aproximadamente -2 desviaciones estándares abajo de lo normal para su edad y sexo, tiene un nivel en el suero de la proteina de unión de la hormona de crecimiento de alta afinidad que es de al menos 2 desviaciones estándares abajo de los niveles normales, tiene un nivel en el suero de la IGF-I que está abajo de los niveles promedio normales, y tiene un nivel en el suero estimulado promedio o máximo de la hormona del crecimiento que es al menos normal, en donde el paciente no tiene el síndrome de Laron.

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la cantidad de la IGF-I administrada es una dosis de aproximadamente 50 a 240 µg/kg/día.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la IGF-I es administrada una o dos veces diariamente.

11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la IGF-I es administrada por inyección subcutánea.

12. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la IGF-I es formulada a un pH de aproximadamente 5-6.

13. El método de conformidad con las reivindicaciones 1 u 8, caracterizado porque el paciente tiene un defecto del gen de GHR heterogéneo.

14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el paciente tiene un defecto del gen de GHR intracelular.

15. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el paciente tiene un defecto del gen de GHR extracelular.

16. Un método para incrementar la velocidad de crecimiento de un paciente humano que tiene el síndrome de insensibilidad parcial a la hormona del crecimiento, caracterizado porque comprende administrar al paciente cantidades de la IGF-I y de la hormona del crecimiento que incrementan la velocidad de crecimiento del paciente, tales cantidades son efectivas en combinación, dicho paciente tiene una altura menor que aproximadamente -2 desviaciones estándares abajo de lo normal para su edad y sexo, tiene un nivel en el suero de la proteína de unión de la hormona de crecimiento de alta afinidad que es de al menos 2 desviaciones estándares abajo de los niveles normales, tiene un nivel del suero de la IGF-I que está abajo de los niveles promedio normales, y tiene un nivel en el suero estimulado promedio o máximo de la hormona del crecimiento que es al menos normal, en donde el paciente no tiene el síndrome de Laron.

17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la IGF-I y la hormona del crecimiento son administradas conjuntamente por inyecciones subcutáneas.

18. Un método para incrementar la velocidad de crecimiento de un paciente humano con una estatura corta no deficiente de GH pero sin el síndrome de Laron, caracterizado porque comprende detectar si el paciente tiene una altura menor que aproximadamente -2 desviaciones estándares abajo de lo normal para su edad y sexo, tiene un nivel en el suero de la proteína de unión de la hormona de crecimiento de alta afinidad que es de al menos 2 desviaciones estándares abajo de los niveles normales, tiene un nivel del suero de la IGF-I que está abajo de los niveles promedio normales, y tiene un nivel en el suero estimulado promedio o máximo de la hormona del crecimiento que es al menos normal, y si es asi, administrar una cantidad efectiva de la hormona del crecimiento al paciente, que incrementa la velocidad de crecimiento del paciente.

19. Un método para incrementar la velocidad de crecimiento de un paciente humano con una estatura corta no deficiente de GH pero sin el síndrome de Laron, caracterizado porque comprende detectar si el paciente tiene una altura menor que aproximadamente -2 desviaciones estándares abajo de lo normal para su edad y sexo, tiene un nivel en el suero de la proteína de unión de la hormona de crecimiento de alta afinidad que es de al menos 2 desviaciones estándares abajo de los niveles normales, tiene un nivel del suero de la IGF-I que está abajo de los niveles promedio normales, y tiene un nivel en el suero estimulado promedio o máximo de la hormona del crecimiento que es al menos normal, y si es así, administrar una cantidad efectiva de la IGF-I al paciente.

20. El método de conformidad con las reivindicaciones 16, 18 o 19, caracterizado porque el paciente tiene un defecto del gen de GHR heterogéneo.

21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el paciente tiene un defecto del gen de GHR intracelular.

22. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el paciente tiene un defecto del gen de GHR extracelular.

23. Un método para incrementar la velocidad de crecimiento de un paciente humano que tiene el síndrome de insensibilidad parcial a la hormona del crecimiento, por lo cual el paciente tiene un defecto del gen de GHR heterogéneo, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva de la hormona del crecimiento al paciente, lo cual incrementa la velocidad de crecimiento del paciente.

24. Un método para incrementar la velocidad de crecimiento de un paciente humano que tiene el síndrome de insensibilidad parcial a la hormona del crecimiento, por lo cual el paciente tiene un defecto del gen heterogéneo, caracterizado porque comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de la IGF-I. •

25. El método de conformidad con las 5 reivindicaciones 23 o 24, caracterizado porque el paciente tiene un defecto del gen de GHR intracelular.

26. El método de conformidad con las reivindicaciones 23 o 24, caracterizado porque el 10 paciente tiene un defecto del gen de GHR extracelular.

27. Un método para incrementar la velocidad de crecimiento de un paciente humano con una estatura corta no deficiente de GH pero sin el síndrome de Laron, 15 caracterizado porque comprende detectar si el paciente tiene un defecto del gen de GHR heterogéneo, y si es así, administrar una cantidad efectiva de la hormona del crecimiento al paciente, lo cual incrementa la velocidad de crecimiento del paciente. 20

28. Un método para incrementar la velocidad de crecimiento de un paciente humano con una estatura corta no deficiente de GH pero sin el síndrome de Laron, caracterizado porque comprende detectar si el paciente 25 tiene un defecto del gen de GHR heterogéneo, y si es así, administrar una cantidad efectiva de la IGF-I al paciente.

29. El método de conformidad con las reivindicaciones 27 o 28, caracterizado porque el paciente tiene un defecto del gen de GHR intracelular.

30. El método de conformidad con las reivindicaciones 27 o 28, caracterizado porque el paciente tiene un defecto del gen de GHR extracelular.

.31. Un método para incrementar la velocidad de crecimiento de un paciente humano con una estatura corta no deficiente de GH pero sin el síndrome de Laron, caracterizado porque comprende detectar si el paciente tiene un defecto del gen de GHR heterogéneo, v si es así, administrar una cantidad efectiva de la hormona del crecimiento y de la IGF-I al paciente, lo cual incrementa la velocidad de crecimiento del paciente.

32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el paciente tiene un defecto del gen de GHR intracelular.

33. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el paciente tiene un defecto del gen de GHR extracelular.