JPH1156378A - 変異型ヒト成長ホルモンとその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 成長ホルモン受容体に高い親和性を示しかつ
低いホルモン活性を示す蛋白質、それをコードする塩基
配列、およびそれらの製造法、ならびにその蛋白質の用
途を提供する。 【構成】ヒト成長ホルモン蛋白質のアミノ酸配列中７７
位のアルギニンがシスティンに、又は５３位もしくは１
６５位のシステインがアルギニンに変換されたヒト変異
型成長ホルモン蛋白質、およびその生物学的性質を失わ
ない範囲において配列を部分的に修飾した蛋白質、およ
びそれらをコードする塩基配列。 【効果】本発明の蛋白質は成長ホルモン受容体に高い親
和性を示すので成長ホルモンが受容体に結合するのを妨
げ、かつ本発明の蛋白質は成長ホルモン活性が低いの
で、末端肥大症や巨人症の治療に用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、成長遅延の小児から分
離された生物学的不活性の成長ホルモン（変異型成長ホ
ルモン）遺伝子、該変異遺伝子を遺伝子工学的に発現さ
せた蛋白質に関し、それらは巨人症や末端肥大症の治療
に利用される。

【０００２】本発明の生物学的不活性型成長ホルモン
は、その受容体に正常型成長ホルモンのアンタゴニスト
として作用して過剰分泌に伴う種々の障害や過剰成長を
阻害し、且つ安全性に優れた巨人症や末端肥大症の治療
薬に利用される。成長ホルモンの遺伝子疾患としては、
その欠損による成長遅延とそれの過剰発現による巨人症
及び末端肥大症が知られている。欠損症に対しては成長
ホルモンの補充療法が広く行われているが、巨人症や末
端肥大症に対して今日まで有効な薬剤は開発されていな
い。

【０００３】

【従来の技術】コワルスキー等は、1978年に最初に生物
学的不活性型の成長ホルモン（変異型成長ホルモン）の
存在を報告している(Kowarski AA., et al, J Clin End
ocrinol Metab, 47: 461, 1978 )。しかしながら、小人
症の子供の血液中に異常な成長ホルモンの多量体が認め
られたとの報告はあるが(Valena LJ et al, N Engl J M
ed., 312: 214, 1985)、変異型成長ホルモンに関する分
子レベルでの理解は今日まで明らかにされていない。

【０００４】循環血液中に生物学的不活性型の成長ホル
モンを認める小児は、血液中に高濃度の変異型成長ホル
モンが認められるものの、インスリン様成長因子１(IGF
-1)濃度は低く、それ故、成長の遅延を導く。しかし、
投与した正常型成長ホルモンによく応答することを特徴
としている(Hayek A., et al, Pediatr Res., 12: 413,
1978、Rudman D., et al, N Engl J Med., 305: 123,
1981、Plotnick LP., et al, Pediatrics 71: 324, 198
3、 Bright GM., et al, 71: 576, 1983)。

【０００５】近年、蛋白質工学及び遺伝子工学の進歩に
伴い、ホルモンとその受容体の結合及び活性発現に関与
する構造研究が可能となり、その結果として多数の遺伝
子疾患の原因が明らかにされて来ている。

【０００６】カニングハム等は蛋白質工学的手法を用い
て多数のヒト成長ホルモン変換体を作製して、成長ホル
モンレセプターへの結合部位を検討し、成長ホルモンの
レセプター結合に関与する領域が、アミノ- 末端側の 2
-19 番目のアミノ酸残基からなる領域、54-74 番目のア
ミノ酸残基領域、カルボキシ- 末端側の167-191 番目の
アミノ酸残基からなる領域であることを特定している(C
unningham BC., et al, Science 243 : 1330, 1989)。

【０００７】さらに、内田等はアミノ酸残基を種々交換
した成長ホルモン変換体を作製して、3T3-F 442A細胞に
対する分化活性を測定し、アミノ酸配列62-67の領域が
生物活性発現に重要であることを示唆した(Uchida E et
al., Biochem Biophys ResCommun. 172: 357, 1990)。

【０００８】最近、結晶構造解析によりヒト成長ホルモ
ンとその結合蛋白質(受容体蛋白質の一部)との結合様式
に注目すべき知見が得られた(De Vos AM, et al, Scien
ce255: 306, 1992)。成長ホルモンは逐次的に成長ホル
モン受容体に結合する。初めに、成長ホルモンの部位１
で第一の成長ホルモン受容体に結合し、次に成長ホルモ
ンの部位 2で第二番目の成長ホルモン受容体と結合し、
結果として成長ホルモン受容体の二量体を形成し、成長
ホルモンのシグナルが細胞内に伝達されると推察されて
いる。

【０００９】興味深いことは、ヒト成長ホルモンの部位
１及び部位２のアミノ酸残基は異なるが、受容体蛋白質
の結合部位のアミノ酸残基は共通していることである。
蛋白質工学的に作製した成長ホルモン変換体が、その受
容体に競合的に結合することも認められている(Fuh
G., et al, Science, 256:1677, 1992)。

【００１０】一方、遺伝子解析の進展により、多数の遺
伝病の異常遺伝子が突き止められてきている。小人症の
原因である成長ホルモン遺伝子についても同様である。
成長ホルモンは、生理活性発現に当たって細胞膜の受容
体を介するために、成長ホルモンに関する遺伝子異常
は、受容体遺伝子の異常と成長ホルモン遺伝子自体の異
常に大きく二分される。

【００１１】また、成長ホルモン遺伝子は常染色体上に
あることから、その異常は劣性遺伝の形態をとることが
知られている。それ故、異常の出現には、両親の対立遺
伝子に同時に異常をき たすことが必要である。

【００１２】これまで、両親の成長ホルモン遺伝子の全
欠失、部分的欠損や塩基の置換等の変異が重複して、成
長遅延を起こした例が多数報告されている。 また、片
親が正常な場合に、変異型成長ホルモンが細胞内分泌顆
粒内に留まることも認められている。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、生体内
での遺伝子ミスセンス変異により生じた変異型成長ホル
モンの、分子レベルでの分析やそれの生体内での役割に
かんする詳細な研究は行われていない。また成長ホルモ
ンの過度の作用を抑制する有効な方法も知られていな
い。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明は、小人症で遅延
した骨年齢を持つ５才の少年で、成長ホルモンの高いレ
ベルの血清濃度を示し、且つ惹起試験に顕著な成長ホル
モンの上昇を示しながら、低いIGF-1 レベルが発見され
たことが発端になって、その後の研究により完成された
ものである。

【００１５】これらの内分泌学的発見は成長ホルモン非
感受性症候群にみられる現象と矛盾しないと思われた(R
osenbloom AL., Acta Pediatr Scand(Suppl), 383:117,
1992)。

【００１６】しかし、成長ホルモンを連続投与すること
で、有意な成長の改善が認められ、ラロン型症候群の可
能性も除外された。ラロン型小人症は成長ホルモン受容
体の疾患に由来する。

【００１７】本発明者は、この種の疾患を持つ子供の血
清の成長ホルモンが、正常な子供に比較して不活性型の
成長ホルモンであることをNb2 バイオアッセイで発見
し、等電点電気泳動法を用いて変異型成長ホルモンであ
ることを明らかにした。

【００１８】この変異型成長ホルモンでは、成長ホルモ
ンの77番目のコドンでアルギニン残基がシステイン残基
(R→C)に置換を起こしていた（配列番号１）。この置換
部位は成長ホルモンの二番目のα- ヘリックスに位置
し、受容体への結合部位１の背後に当たる(Cunningham
BC., et al, Science, 254:821, 1991)。置換したシス
テインが新しいジスルフィド結合を形成し、分子の荷電
を変え、そしてこれらのことでコンフォメーショナルな
変化を起こし、ホルモン活性の減じた変異型成長ホルモ
ンを生成したと推察される。

【００１９】成長ホルモンの細胞内へのシグナル伝達に
おいて、リガンド結合による受容体の二量体化とその蛋
白質のチロシン残基の燐酸化が極めて重要とされている
(Argetsinger LS., et al, Cell, 74: 237, 1993、Sil
va CM., et al, J Biol Chem., 269: 27532, 1994)。

【００２０】成長ホルモン結合蛋白質は、受容体の細胞
外ドメインに位置し、また in vivoで血清中で成長ホル
モン貯蔵体として働いている(Herington AC, et al, Ac
ta endocrinol (Copenh), 124: 14, 1991)。

【００２１】成長ホルモン受容体への変異型成長ホルモ
ンの親和性は、野性型に比較して約６倍強くなっている
（図４、５）。変異型成長ホルモンの部位１と部位２は
受容体にたいして野性型と異なる親和性を示すことが示
唆された。変異型成長ホルモンの生物学的な特徴は、受
容体蛋白質に強い親和性を示すにもかかわらず、受容体
燐酸化による細胞へのシグナルトランスダクションの活
性は顕著に低いことである。

【００２２】この様な患者に対する３日間の野性型成長
ホルモンの連続投与で、IGF-1 の顕著な応答は認められ
なかったが、長期投与では、内在的な変異型成長ホルモ
ンの分泌や受容体への結合をアンタゴニスト的に抑制す
ることで、血漿でのIGF-1 の増加と成長の改善に効果的
であった。それで、成長ホルモンが過剰分泌される巨人
症や末端肥大症の患者に変異型成長ホルモンを投与すれ
ば、アンタゴニスト的に働き、過剰成長を抑制すると考
えられる。

【００２３】本発明は上記の新しい知見に基づくもの
で、配列番号１のアミノ酸配列を有する変異型ヒト成長
ホルモン蛋白質、該アミノ酸配列をコードする塩基配列
を有するデオキシリボヌクレオチド、該 アミノ酸配列
に成長ホルモン受容体への高い親和性を示し且つ低いホ
ルモン活性を保持する特徴を失わない範囲においてアミ
ノ酸残基の部分に部分的な置換、挿入または欠失を施し
たアミノ酸配列を有する蛋白質、およびその用途に関す
る。

【００２４】本発明の変異型成長ホルモンはその内在性
の故に生体に副作用を示さず、単に成長遅延を導くこと
から、まだ治療薬の開発されていない巨人症及び末端肥
大症に効果的な治療剤としても用いることができる。そ
れは野性型に比較して約６倍強い受容体親和性を持つた
めに、現在、小人症治療に用いられている投与量の同等
及びそれ以下で、巨人症の治療薬として有用である。

【００２５】本発明の新規な変異型成長ホルモンのDNA
に、部分的なヌクレオチドの欠失、挿入、置換を行って
受容体親和性の強く且つ実質的にホルモン活性を示さな
い変換体を作製することは公知技術によって容易に行う
ことができる。その例としては配列番号２又は３に示す
配列が挙げられる。さらに、蛋白工学的手法を用いて、
変異型成長ホルモンの受容体への結合部位を同定し、結
合部位ペプチドを遺伝子工学的に作製し、巨人症治薬剤
及び末端肥大症の治療薬剤として利用することもでき
る。

【００２６】本発明の新規な変異型成長ホルモンをコー
ドしているDNAを複製可能なプラスミドに結合し、この
プラスミドを用いて細胞を形質転換して、これらの宿主
細胞を培養して物質を生産することができる。宿主細胞
は、細菌、酵母及び動物細胞を含む。

【００２７】細菌などの原核生物がデオキシリボヌクレ
オチドのクローニングに適している。例えば、E.coliに
由来するpBR322のプラスミドはアンピシリンやテトラサ
イクリン抵抗性の遺伝子を含有し、変換細胞を同定する
容易な手段を与える。さらに、細菌のプラスミドは、そ
れ自体の蛋白質の発現に用いられるプロモーターを含有
する。

【００２８】原核生物に加えて、酵母などの真核生物も
役立つ、特に、酵母菌のサッカロミセス（saccharomyce
s)での発現にはプラスミド YRp7 が共通に用いられる(S
tinchcomb et al., Nature, 282:39,1979)。動物細胞も
宿主として利用される。細胞系として AtT-20、ヒーラ
細胞（HelaCells）、ＣＨＯ細胞（ Chinese Hamster Ov
ary）(CHO) 、COSM6 、COS-7 などが挙げられる。ま
た、細胞系の発現プラスミドの制御機能として用いられ
るのが、ポリオーマ（Polyoma）ウイルス、アデノウイ
ルス（Adenovirus 2）、シトメガロウイルス（Cytomega
lo-virus、シミアンウイルス（ Simian virus） 40の
プロモーターである。動物細胞の発現系で利用性の高い
プラスミドはpCMVである(Thomsen et al., PNAS, 81:65
9, 1984)。

【００２９】変異型成長ホルモンやその変換型成長ホル
モンを動物に免疫して抗体を得ることができる。また、
周知技術を用いて、動物を免疫することで、特異的な抗
体を分泌する細胞からモノクローナル抗体を調製でき
る。

【００３０】変異型成長ホルモン及びその変換体を大量
に調製することが容易になり、それの分子的レベルのよ
りよい理解で、成長ホルモン蛋白質の関連する疾患の治
療薬や診断薬を開発できる。また、本質的な治療法であ
る遺伝子治療薬の作製も含まれる。

【００３１】変異型ホルモンのヌクレオチドやその結合
部位のペプチドのヌクレオチドを、レトロウイルスやア
デノウイルス等のウイルスベクターを含む適当なベクタ
ーに組み込むことで、巨人症及び末端肥大症の遺伝子治
療剤として使用する可能性がある。

【００３２】

【実施例】

実施例１ 前記の小人症で遅延した骨年齢を持つ５才の小年の血液
について以下の検討を行った。ホルモンの分析方法 血清中の成長ホルモンの濃度を、ファルマシヤ製の免疫
放射性分析キットで分析した。成長ホルモンの生物活性
は、Nb2 ヌードラットのリンパ腫細胞を用い、以前に述
べられ ている田中等(Tanaka T., et al., J.Clin.End
ocrinol.Metab., 51: 1058, 1980)の方法 を若干修正
して測定した。 Nb2バイオアッセイ法で、ヒトプロラク
チン(hPRL)に対する兎坑血清(NIDDK-anti-hPRL-IC5;NI
H)がヒトプロラクチンの成長促進作用を中和阻害するた
めに10万倍希釈で加えられた。成長遅延患者の血清成長
ホルモンが測定され、また対照として正常人の血清成長
ホルモンを分析した。

【００３３】等電点電気泳動 等電点電気泳動にTsvetnitsky等(Tsvetnitsky V., et a
l., Biochem J, 307:239, 1995) の方法を用いた。pH勾
配が pH 3.5-8.0 で、1%HPMC（ヒドロキシプロピルメチ
ルセルロース）−４％アンフォライン緩衝液で 血清を
泳動分離し、各フラクションが集められ、免疫的に活性
な成長ホルモンを分析した。 10人の正常人のプール血
清を対照として用いた。

【００３４】変異型成長ホルモン遺伝子の単離と遺伝子
分析 ゲノムDNAを末梢血の白血球から分離した(Gross-Bellar
d M., et al, Eur.J.Biochem., 36: 32, 1973)。さら
に、PCR法によりDNAを増幅した（図１）。オリゴヌクレ
オチド プライマーとして(F3 ; 5'TATGAATTCCTCTGCCTGC
CCTGCCTCAAGAG3' 、GAD ; 5'CTAACACAGTCTCTCAAAGT3'、
GSD ; 5'ACTTTGAGAGACTGTGTTAG3'、GAE ; 5'TGGAGTGGCA
ACTTCCAGGG3'、GHS1 ; 5'CTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACCTA
GCTGCA3'をゲノムDNAの増幅に用いた。

【００３５】PCR法による増幅を以下の様に行った。 F3
-GADとGHS1-GADに対して、92℃で3 分の最初の変性を行
い、92℃で1 分、60℃で2 分、72℃で2 分のサイクルを
35回繰り返し、最後の72℃での処理を7 分間とした。 G
SD-GAEに対して、92℃で 1分、68℃で 1分、72℃で 1分
のサイクルを35回繰り返し、最後の72℃処理を 7分間と
した。

【００３６】これらの増幅生成物を抽出し、pBS SK(+)
(STRATAGENE、USA)またはpT7blue(Novagen 、USA)でサ
ブクーロンして、そして373A DNAシークエンサー(Perki
n Elmer 、USA)を用いて配列を決定した。さらに、患者
のDNA変異部位(Arg→Cys)を同定した後に、PCR 反応で
のミス反応の可能性を排除するために、二重鎖DNA サイ
クルシークエンシング キット(GIBCOBRL、USA)を用い
て、直接的に PCR産物のDNA配列を決定した。

【００３７】その結果、患者のDNA は、77位のアルギニ
ン残基がシステイン残基に置換していることを発見した
（配列番号：１）。

【００３８】RNA 分析 リンパ球を MPRM Ficoll-Hypaque(Flow Lab 、USA)を用
いて分離して、そして全RNA 含量を常法的手段で単離し
た(Maniates T., et al, Cold Spring HarborLaborator
y Press, 1982) 。得られたRNA 1ug から cDNA を合成
した(MartynoffG.,et al, Biochem Biophys Res Commn,
93:645,1980)。合成したcDNAをPCR 反応に用いて、成
長ホルモンcDNAを増幅する。 PCR反応に用いるオリゴヌ
クレオチド プライマーは GHS2; 5'TGGACAGCTCACCTAGCT
GCA3'、GHAS1; 5'GGATTTCTGTTGTGTTTCCT3' 、GHS3; 5'T
TGACACCTACCAGGAGTTT3'、GHAS3; 5'CTAGAAGCCACAGCTGCC
CT3'とし、PCR による増幅を次の条件で行った。

【００３９】GHS2-GHAS1に対しては、最初の92℃で 3分
の変性を行い、92℃で 1分、68℃で1.5 分、72℃で 1.5
分のサイクルを40回繰り返し、最後に72℃で 7分間の伸
長を行った。

【００４０】GHS3-GHAS3に対しては、変性の後に、92℃
で1分、60℃で1分、72℃で1.5分の 40回のサイクルが行
われた。増幅した生成物の塩基配列を決定した。

【００４１】野性型（正常）ヒト成長ホルモンと変異型
ヒト成長ホルモンの cDNA の構築 ヒト成長ホルモン（野性型及び変異型）のcDNAをPCR に
より増幅した。成長ホルモンを分泌する下垂体腺腫細胞
(Clontech)から得られた cDNA ライブラリーを用い、そ
れの正確性はDNA配列のシークエンシングで確認した。

【００４２】PCR に用いたオリゴヌクレオチド プライ
マーは、センスプライマーとしてGHS1、アンチセンスプ
ライマーとして 5'TAAGAATTCGAGGGGTCACAGGGATGCCACCCC
3'を用いた。

【００４３】PCRの反応条件は、92℃で 3分の最初の変
性を行い、92℃で 1分、48℃で1.5分、72℃で1.5 分の
サイクルを35回繰り返し、最終の伸長に72℃で7分間処
理を行う。

【００４４】変異型成長ホルモンのcDNAをTransformerM
T(Clontech)を用いて構築した。成長ホルモンのcDNAの
シグナル配列を除くために、人工的に加えたBamH1 部位
を含むセンスプライマー(5'GCGGATCCTTCCCAACCATTCCCTT
ATC3')とアンチセンスプライマーとして GHAS1を用いて
PCRによる増幅を行った。得られたcDNAについて、直接
塩基配列決定法により、塩基配列を決定し、変異を確認
した（配列番号：１）。

【００４５】野性型（正常）ヒト成長ホルモンと変異型
ヒト成長ホルモンの発現と機能分析 野性型成長ホルモンと変異型成長ホルモンの製造用の発
現ベクターは、λバクテリオファージ由来のプロモータ
ーオペレーターPLOLを含むDNA配列と、宿主細胞により
産生される抗転写終結因子N-蛋白質を結合するN-利用部
位と野性型成長ホルモン遺伝子及び変異型成長ホルモン
遺伝子のmRNAを 宿主細胞内のリボソームに結合せしめ
得るリボゾーム結合部位を含むDNA 配列と、ATG 開始コ
ドンと、ATG 開始コドンと位相を合わせて所望の遺伝子
をベクター内に挿入するための制限酵素部位を含んでい
る（特公平6-87780 ）。

【００４６】発現ベクターは非耐熱性リプレッサーC1を
含む適当な宿主細胞、例えば E.coliに導入され、宿主
細胞がリプレッサー破壊温度までに加熱されたときに野
性型成長ホルモン及び変異型成長ホルモンを発現させ
た。この様な発現生成物は開始コドンに由来するメチオ
ニン残基をアミノ末端に保持するために、特異的アミノ
ペプチダーゼで除去して、成熟した野性型ヒト成長ホル
モン及びヒト変異型成長ホルモンを得ることができる
（特公開昭62-500003 ）。

【００４７】形質転換細胞を発酵させ、細胞懸濁液を遠
心分離や濾過処理して細胞を集め、物理的、化学的手法
で細胞を溶解して変異型成長ホルモンを単離する。

【００４８】精製方法としては、硫酸アンモニウムなど
の分別法、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィー、抗体をもちいたアフィニティークロ
マトグラフィー、順相または逆相高速クロマトグラフィ
ーなどの既知の方法の組み合わせで行われる。

【００４９】また、試験用に用いる少量の試料調製に、
野性型成長ホルモンcDNAと変異型成長ホルモンcDNAをプ
ラスミド(pGEXKG)のBamHI-EcoRI部位にクローン化し、D
H5α細胞に組み込んだ。発現生成物はファルマシヤ製の
グルタチオン-S- トランスフェラーゼ遺伝子融合系でも
調製した。

【００５０】この様にして得られた組換え体変異型成長
ホルモンの分子内でのシステイン間の架橋に、正常型(5
3-165)及び変異型（ 53-77）と変異型（77-165）のジス
ルフィド結合の3通りの存在が示唆された。そこで、患
者リンパ球より調製したcDNAを（図２）に示した手法で
置換改変し、53位または 165位のシステインをアラニン
残基に改変したcDNAを作製した。また、53位または165
位のシスティンをセリン残基に改変したcDNAを作製して
もよい。

【００５１】これらを大腸菌内で発現させて、77位と16
5 位（配列番号２）、53位と77位（配列番号３）のシス
テインが架橋した二種の変異型成長ホルモン蛋白質が得
られた。

【００５２】野性型成長ホルモンと変異型成長ホルモン
の生物学的活性は、IRMAとNb2 のバイオアッセイ系で測
定した。 Nb2バイオアッセイを、成長ホルモン及びプロ
ラクチンの検出されない患者の血清の有無の条件で行っ
た。組換え体ヒト成長ホルモン結合蛋白質（rhGHBP）
を、最終濃度 0.1、0.5 、または 1 nM になるように加
えられた。

【００５３】一段階レセプター分析法で、成長ホルモン
受容体を発現するヒトリンパ芽球 IM-9細胞で競争的結
合を調べた(Lesniak MA., et al, J Biol Chem., 249:1
661,1974)。

【００５４】野性型成長ホルモンと変異型成長ホルモン
へのrhGHBPの直接的な結合を免疫沈澱法を用いて検討し
た。

【００５５】IM-9細胞での成長ホルモン依存性のチロシ
ン燐酸化は、シルバ等(Silva CM.,et al, Endocrinolog
y, 132:101, 1993)の方法で検出した。抗燐酸チロシン
モノクローナル抗体 (RC20:Transduction Laboratorie
s, USA)を、免疫沈澱及びウエスタンブロッティングに
用いた。抗体の結合をAmersham社のECLキットを用いて
視覚化した。

【００５６】等電点電気泳動で発端者（患者）の血清中
で既知の野性型（正常）成長ホルモンに加えて、変異型
成長ホルモンの存在が確認された（図３）。

【００５７】変異型成長ホルモン遺伝子が、生物学的不
活性であるかどうかを見積もるために、λファージ由来
のプロモーターオペレーターを持つ発現ベクターでの形
質変換細胞で変異型成長ホルモンと野性型成長ホルモン
を発現し、生成物を得た。同じく、GST 融合蛋白質系で
も発現させて生成物が得られた。

【００５８】変異型成長ホルモンも野性型成長ホルモン
もIRMA細胞による検定で同等な免疫活性であった。プロ
ラクチン受容体を介する生物活性も Nb2バイオアッセイ
により測定した。

【００５９】血清が除去された培地での Nb2バイオアッ
セイで両物質は類似した生物活性を示すにもかかわら
ず、患者の血清培地で、野性型成長ホルモンに比較して
変異型成長ホルモンの活性が半分以下に減少した。 Nb2
バイオアッセイ系への成長ホルモン結合蛋白質による阻
害の可能性を予想して、組換え体の成長ホルモン結合蛋
白質を分析培地に加えた。

【００６０】変異型成長ホルモンの生物学的活性の免疫
学的活性に対する比は、組換え体成長ホルモン結合蛋白
質の 0.5 nM と1 nMの存在下で 0.45 ±0.05(p＜0.05)
と0.22±0.08(p＜0.05) まで著しく減少した。これらの
濃度は末梢血の実際の生理的な結合蛋白質の濃度に相当
する。

【００６１】IM-9細胞でのヒト成長ホルモン受容体への
［¹²⁵I］ヒト成長ホルモンの結合は、濃度に依存して野
性型と変異型成長ホルモンに置き変わる。 変異型成長
ホルモンによる置換は蛋白質濃度の10-¹¹ から10-⁹ Mの
範囲でショルダーを示した。これらのIC₅₀値はほとんど
同じ値で、それぞれ 0.84 ±0.30nMと 0.86 ±0.41nMを
示した。

【００６２】しかしながら変異体による置換は10-¹¹-10
-⁹M でなめらかでない（図４）。また、ヒト組換え体成
長ホルモン結合蛋白質への［¹²⁵I］ヒト成長ホルモンの
結合もまた濃度依存性に従い変異型成長ホルモンや野性
型成長ホルモンに置換する。

【００６３】変異型成長ホルモンのIC₅₀は 0.12 ±0.02
nM（平均値±SEM 、3 回）であり、野性型成長ホルモン
の値 0.68 ±0.08nMより著しく低い値をしめし、変異型
成長ホルモンの親和性が野性型より約 6倍高い値を示し
た（図４）。

【００６４】IM-9細胞を用いた成長ホルモン受容体での
成長ホルモン依存性のチロシン燐酸化を、ウエスタンブ
ロッティングを利用して野性型と変異型で比較した。

【００６５】ヒト組換え体成長ホルモンと野性型成長ホ
ルモン、つまり正常型の成長ホルモンのチロシン燐酸化
の促進に比較して、対照的に、変異型成長ホルモンはそ
れ自体でチロシン燐酸化に作用しないのみならず、野性
型成長ホルモンで誘導される燐酸化を著しく阻害した。
チロシン燐酸化の阻害が、変異体が野性型成長ホルモン
の 1/10量を同時に加えたときでさえ認められた（図
５）。

【００６６】

【発明の効果】本発明の変異型ヒト成長ホルモンの生物
学的性質は、その受容体蛋白質に高い親和性を示し、且
つ本来のホルモン活性を実質的に喪失していることを特
徴し、この変異蛋白質のデオキシリボヌクレオチドを用
いて公知の遺伝子工学技術により変異型成長ホルモンを
量産することができる。この様な変異型ヒト成長ホルモ
ン蛋白質は、それの特徴的な性質から、これまで治療薬
の開発されていない巨人症の治療に役立ち、また本来生
体内でのミスセンス変異により生成した内在性の変異型
成長ホルモンで、人為的な操作による蛋白質工学で得ら
れた種々の成長ホルモン変換体と異なり、抗原性などの
副作用の少ない安全な物質である。

【００６７】 配列 TTC CCA ACC ATT CCC TTA TCC AGG CTT TTT GAC AAC GCT ATG CTC CGC GCC CAT Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His 5 10 15 CGT CTG CAC CAG CTG GCC TTT GAC ACC TAC CAG GAG TTT GAA GAA GCC TAT ATC Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile 20 25 30 35 CCA AAG GAA CAG AAG TAT TCA TTC CTG CAG AAC CCC CAG ACC TCC CTC TGT TTC Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe 40 45 50 TCA GAG TCT ATT CCG ACA CCC TCC AAC AGG GAG GAA ACA CAA CAG AAA TCC AAC Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn 55 60 65 70 CTA GAG CTG CTC TGC ATC TCC CTG CTG CTC ATC CAG TCG TGG CTG GAG CCC GTG Leu Glu Leu Leu Cys Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val 75 80 85 90 CAG TTC CTC AGG AGT GTC TTC GCC AAC AGC CTG GTG TAC GGC GCC TCT GAC AGC Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser 95 100 105 AAC GTC TAT GAC CTC CTA AAG GAC CTA GAG GAA GGC ATC CAA ACG CTG ATG GGG Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly 110 115 120 125 AGG CTG GAA GAT GGC AGC CCC CGG ACT GGG CAG ATC TTC AAG CAG ACC TAC AGC Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser 130 135 140 AAG TTC GAC ACA AAC TCA CAC AAC GAT GAC GCA CTA CTC AAG AAC TAC GGG CTG Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu 145 150 155 160 CTC TAC TGC TTC AGG AAG GAC ATG GAC AAG GTC GAG ACA TTC CTG CGC ATC GTG Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val 165 170 175 180 CAG TGC CGC TCT GTG GAG GGC AGC TGT GGC TTC Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 185 190 配列 TTC CCA ACC ATT CCC TTA TCC AGG CTT TTT GAC AAC GCT ATG CTC CGC GCC CAT Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His 5 10 15 CGT CTG CAC CAG CTG GCC TTT GAC ACC TAC CAG GAG TTT GAA GAA GCC TAT ATC Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile 20 25 30 35 CCA AAG GAA CAG AAG TAT TCA TTC CTG CAG AAC CCC CAG ACC TCC CTC GTC TTC Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Ala Phe 40 45 50 TCA GAG TCT ATT CCG ACA CCC TCC AAC AGG GAG GAA ACA CAA CAG AAA TCC AAC Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn 55 60 65 70 CTA GAG CTG CTC TGC ATC TCC CTG CTG CTC ATC CAG TCG TGG CTG GAG CCC GTG Leu Glu Leu Leu Cys Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val 75 80 85 90 CAG TTC CTC AGG AGT GTC TTC GCC AAC AGC CTG GTG TAC GGC GCC TCT GAC AGC Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser 95 100 105 AAC GTC TAT GAC CTC CTA AAG GAC CTA GAG GAA GGC ATC CAA ACG CTG ATG GGG Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly 110 115 120 125 AGG CTG GAA GAT GGC AGC CCC CGG ACT GGG CAG ATC TTC AAG CAG ACC TAC AGC Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser 130 135 140 AAG TTC GAC ACA AAC TCA CAC AAC GAT GAC GCA CTA CTC AAG AAC TAC GGG CTG Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu 145 150 155 160 CTC TAC TGC TTC AGG AAG GAC ATG GAC AAG GTC GAG ACA TTC CTG CGC ATC GTG Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val 165 170 175 180 CAG TGC CGC TCT GTG GAG GGC AGC TGT GGC TTC Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 185 190 配列 TTC CCA ACC ATT CCC TTA TCC AGG CTT TTT GAC AAC GCT ATG CTC CGC GCC CAT Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His 5 10 15 CGT CTG CAC CAG CTG GCC TTT GAC ACC TAC CAG GAG TTT GAA GAA GCC TAT ATC Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile 20 25 30 35 CCA AAG GAA CAG AAG TAT TCA TTC CTG CAG AAC CCC CAG ACC TCC CTC TGT TTC Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe 40 45 50 TCA GAG TCT ATT CCG ACA CCC TCC AAC AGG GAG GAA ACA CAA CAG AAA TCC AAC Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn 55 60 65 70 CTA GAG CTG CTC TGC ATC TCC CTG CTG CTC ATC CAG TCG TGG CTG GAG CCC GTG Leu Glu Leu Leu Cys Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val 75 80 85 90 CAG TTC CTC AGG AGT GTC TTC GCC AAC AGC CTG GTG TAC GGC GCC TCT GAC AGC Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser 95 100 105 AAC GTC TAT GAC CTC CTA AAG GAC CTA GAG GAA GGC ATC CAA ACG CTG ATG GGG Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly 110 115 120 125 AGG CTG GAA GAT GGC AGC CCC CGG ACT GGG CAG ATC TTC AAG CAG ACC TAC AGC Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser 130 135 140 AAG TTC GAC ACA AAC TCA CAC AAC GAT GAC GCA CTA CTC AAG AAC TAC GGG CTG Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu 145 150 155 160 CTC TAC GCC TTC AGG AAG GAC ATG GAC AAG GTC GAG ACA TTC CTG CGC ATC GTG Leu Tyr Ala Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val 165 170 175 180 CAG TGC CGC TCT GTG GAG GGC AGC TGT GGC TTC Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 185 190

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例で得られた変異型成長ホルモン(77 位、
R →C)のアミノ酸配列とその蛋白質をコードする塩基配
列を示す。

【図２】実施例で得られた組換え変換(53 位、C →A)に
よる変異型成長ホルモンのアミノ酸配列とその蛋白質を
コードする塩基配列を示す。

【図３】実施例で得られた組換え変換（165 位、C →A
）による変異型成長ホルモンのアミノ酸配列とその蛋
白質をコードする塩基配列を示す。

【図４】a: 変異型成長ホルモンの遺伝子構造とPCR 増
幅用のプライマーのデザイン；5箇所のエクソン部位を
ボックスで示し、そしてPCR プライマーを矢印で示し
た。77番目の変異アミノ酸（アルギニン→システイン置
換）を示している。 b: 変異型成長ホルモン遺伝子のDNA配列を示す電気泳動
のパターン；77番目のコドンでアルギニンのシステイン
への変異を示した。この変異はPCR を用いてゲノムDNA
とRNA の配列を直接分析して決定した。

【図２】53位または 165位のシステインをアラニンに改
変するためのcDNA作成フローシート。プライマーとして
は以下の配列のオリゴヌクレオチドを用いた。 f1; 5'ACAGAAACAGGTGGGGGCAA3' R2; 5'AATAGACTCTGAGAAAGCGGG3' R3; 5'GTCCATGTCCTTCCTGAAGGCGTAGAG3' 53 位（C →A ）の置換については、f1とR2、165 位（C
→A ）の置換については、f1とR3のプライマーを用い
てPCR 増幅を行った。別に、正常型成長ホルモンのcDNA
をそれぞれ、制限酵素 HinfI及びNlaIIIで消化した断片
の下流側を調製し、PCR 産物とリガーゼを用いて結合さ
せた。

【図３】血清の中での変異型成長ホルモンと野性型成長
ホルモンの等電点電気泳動(IEF) の結果をしめすグラ
フ。血清(150-300 ul)を、1% HPMC- 4% Ampholine (pH
3.5-8.0)で、等電点電気泳動処理した。試料フラクショ
ンが分離、プールされ、そして成長ホルモンに対する免
疫活性を測定した（□）。 IEFで形成されたpH勾配は
（◆）でしめした。成長ホルモン蛋白質でのアルギニン
からシステインの変異は、等電的にpH 0.16 の低下を起
こすと見込まれる。野性型成長ホルモンと変異型成長ホ
ルモンのピークは白矢印と黒矢印でそれぞれ示した。 a: 発端者（患者：小児） b: 父親

【図４】a: 野性型成長ホルモンと変異型成長ホルモン
による、IM-9細胞への［¹²⁵I］ラベルヒト成長ホルモン
の結合阻害を示すグラフ。細胞(IM-9)を1-3x10⁷/mlの最
終濃度で、野性型成長ホルモンと変異型成長ホルモンの
添加濃度依存性に増加させて培養した。 0.8 ng/mlの［
¹²⁵I］ヒト成長ホルモン(DU POINT 、USA)(0.33 uCi/m
l) 、全溶液 250 ul 、30℃。 4時間培養の後に、細胞
を集めて洗い、細胞に結合している放射性活性を測定し
た。 b: 成長ホルモン結合蛋白質への［¹²⁵I］ヒト成長ホル
モンの結合阻害を示すグラフ。［¹²⁵I］ヒト成長ホルモ
ン(0.6uCi/ml)、組換え体ヒト成長ホルモン結合蛋白質
（0.6nM ）、抗成長ホルモン受容体マウスモノクローナ
ル抗体(Mab 263; AGEN、Australia)(1:100000)を、野性
型成長ホルモンと変異型成長ホルモンのそれぞれの濃度
を増加させて４℃，16時間培養した。それから、10% 抗
マウス IgG (goat) 抗体(50ul)、1%正常マウス血清(50u
l)、そして5%PEG(300ul)を加えた。反応液をさらに 4
℃、 4時間培養し、遠心分離して、そして沈澱物（pell
ets ）の放射活性をγ- カウンターで測定した。値は、
3回実験の平均値である。

【図５】a: IM-9細胞での野性型成長ホルモンと変異型
成長ホルモン依存性のチロシンの燐酸化を示す電気泳動
の写真。IM-9細胞を 100ng/ml のヒト成長ホルモンの有
無で処理した（レーン1 、2)。野性型成長ホルモン( レ
ーン 3; 10ng/ml 、レーン 4; 100ng/ml) 、変異型成長
ホルモン( レーン 5; 10ng/ml 、レーン 6; 100ng/ml)
、変異型成長ホルモン 10ng/mlを一定にして野性型成
長ホルモン濃度を増加する( レーン 7;10ng/ml、レーン
8; 25ng/ml 、レーン 9; 50ng/ml 、レーン 10; 100ng
/ml)、37℃で15分間処理した。これらの細胞の介面活性
剤による溶解物を燐酸化チロシン特異的抗体で免疫沈澱
して、パーオキシダーゼ結合した同じ抗体でウエスタン
ブロッティングして分析した。分子量はキロダルトンの
単位で左側に示した。矢印は成長ホルモンにより生じた
チロシンの燐酸化蛋白質バンドを示している。 b: p120の抗燐酸チロシン免疫ブロットのデンシトメト
リー分析を示す棒グラフである。p120のチロシン燐酸化
（IM-9細胞でJAK2と報告されている）の量をデンシトメ
トリーで定量した。デンシトメトリーの強度は対照とし
ての成長ホルモンの無い時に相対的に表現されている。
3回の独立した実験での平均値（±SEM ）を示し、統計
分析を Student's-t test で行った。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１０年４月２４日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図面の簡単な説明

【補正方法】変更

【補正内容】

【図面の簡単な説明】

【図１】ａ：変異型成長ホルモンの遺伝子構造とＰＣＲ
増幅用のプライマーのデザイン；５箇所のエクソン部位
をボックスで示し、そしてＰＣＲプライマーを矢印で示
した。７７番目の変異アミノ酸（アルギニン→システイ
ン置換）を示している。 ｂ：変異型成長ホルモン遺伝子のＤＮＡ配列を示す電気
泳動のパターン；７７番目のコドンでアルギニンのシス
テインへの変異を示した。この変異はＰＣＲを用いてゲ
ノムＤＮＡとＲＮＡの配列を直接分析して決定した。

【図２】５３位または１６５位のシステインをアラニン
に改変するためのｃＤＮＡ作成フローシート。プライマ
ーとしては以下の配列のオリゴヌクレオチドを用いた。 ｆ１；５’ＡＣＡＧＡＡＡＣＡＧＧＴＧＧＧＧＧＣＡＡ
３’ Ｒ２；５’ＡＡＴＡＧＡＣＴＣＴＧＡＧＡＡＡＧＣＧＧ
Ｇ３’ Ｒ３；５’ＧＴＣＣＡＴＧＴＣＣＴＴＣＣＴＧＡＡＧＧ
ＣＧＴＡＧＡＧ３’ ５３位（Ｃ→Ａ）の置換については、ｆ１とＲ２、１６
５位（Ｃ→Ａ）の置換については、ｆ１とＲ３のプライ
マーを用いてＰＣＲ増幅を行った。別に、正常型成長ホ
ルモンのｃＤＮＡをそれぞれ、制限酵素ＨｉｎｆＩ及び
ＮｌａＩＩＩで消化した断片の下流側を調製し、ＰＣＲ
産物とリガーゼを用いて結合させた。

【図３】血清の中での変異型成長ホルモンと野性型成長
ホルモンの等電点電気泳動（ＩＥＦ）の結果をしめすグ
ラフ。血清（１５０−３００ｕｌ）を、１％ＨＰＭＣ−
４％Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ（ｐＨ ３．５−８．０）で、
等電点電気泳動処理した。試料フラクションが分離、プ
ールされ、そして成長ホルモンに対する免疫活性を測定
した（□）。ＩＥＦで形成されたｐＨ勾配は（◆）でし
めした。成長ホルモン蛋白質でのアルギニンからシステ
インの変異は、等電的にｐＨ ０．１６の低下を起こす
と見込まれる。野性型成長ホルモンと変異型成長ホルモ
ンのピークは白矢印と黒矢印でそれぞれ示した。 ａ：発端者（患者：小児） ｂ：父親

【図４】ａ：野性型成長ホルモンと変異型成長ホルモン
による、ＩＭ−９細胞への［^１２５Ｉ］ラベルヒト成長
ホルモンの結合阻害を示すグラフ。細胞（ＩＭ−９）を
１−３ｘ１０^７／ｍｌの最終濃度で、野性型成長ホルモ
ンと変異型成長ホルモンの添加濃度依存性に増加させて
培養した。０．８ｎｇ／ｍｌの［^１２５Ｉ］ヒト成長ホ
ルモン（ＤＵ ＰＯＩＮＴ、ＵＳＡ）（０．３３ｕＣｉ
／ｍｌ）、全溶液２５０ｕｌ、３０℃。４時間培養の後
に、細胞を集めて洗い、細胞に結合している放射性活性
を測定した。 ｂ：成長ホルモン結合蛋白質への［^１２５Ｉ］ヒト成長
ホルモンの結合阻害を示すグラフ。［^１２５Ｉ］ヒト成
長ホルモン（０．６ｕＣｉ／ｍｌ）、組換え体ヒト成長
ホルモン結合蛋白質（０．６ｎＭ）、抗成長ホルモン受
容体マウスモノクローナル抗体（Ｍａｂ ２６３；ＡＧ
ＥＮ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）（１：１０００００）を、
野性型成長ホルモンと変異型成長ホルモンのそれぞれの
濃度を増加させて４℃，１６時間培養した。それから、
１０％抗マウスＩｇＧ（ｇｏａｔ）抗体（５０ｕｌ）、
１％正常マウス血清（５０ｕｌ）、そして５％ＰＥＧ
（３００ｕｌ）を加えた。反応液をさらに４℃、４時間
培養し、遠心分離して、そして沈澱物（ｐｅｌｌｅｔ
ｓ）の放射活性をγ−カウンターで測定した。値は、３
回実験の平均値である。

【図５】ａ：ＩＭ−９細胞での野性型成長ホルモンと変
異型成長ホルモン依存性のチロシンの燐酸化を示す電気
泳動の写真。ＩＭ−９細胞を１００ｎｇ／ｍｌのヒト成
長ホルモンの有無で処理した（レーン１、２）。野性型
成長ホルモン（レーン３；１０ｎｇ／ｍｌ、レーン４；
１００ｎｇ／ｍｌ）、変異型成長ホルモン（レーン５；
１０ｎｇ／ｍｌ、レーン６；１００ｎｇ／ｍｌ）、変異
型成長ホルモン１０ｎｇ／ｍｌを一定にして野性型成長
ホルモン濃度を増加する（レーン７；１０ｎｇ／ｍｌ、
レーン８；２５ｎｇ／ｍｌ、レーン９；５０ｎｇ／ｍ
ｌ、レーン１０；１００ｎｇ／ｍｌ）、３７℃で１５分
間処理した。これらの細胞の介面活性剤による溶解物を
燐酸化チロシン特異的抗体で免疫沈澱して、パーオキシ
ダーゼ結合した同じ抗体でウエスタンブロッティングし
て分析した。分子量はキロダルトンの単位で左側に示し
た。矢印は成長ホルモンにより生じたチロシンの燐酸化
蛋白質バンドを示している。 ｂ：ｐ１２０の抗燐酸チロシン免疫ブロットのデンシト
メトリー分析を示す棒グラフである。ｐ１２０のチロシ
ン燐酸化（ＩＭ−９細胞でＪＡＫ２と報告されている）
の量をデンシトメトリーで定量した。デンシトメトリー
の強度は対照としての成長ホルモンの無い時に相対的に
表現されている。３回の独立した実験での平均値（±Ｓ
ＥＭ）を示し、統計分析をＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ−ｔ ｔ
ｅｓｔで行った。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/61 Ｃ０７Ｋ 16/26 16/26 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ Ｃ１２Ｐ 21/02 21/08 21/08 Ａ６１Ｋ 37/36 ＡＥＥ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１記載のアミノ酸配列を有する
   変異型ヒト成長ホルモン蛋白質。
2. 【請求項２】 配列番号１記載のアミノ酸配列をコード
   する配列番号１記載のデオキシリボヌクレオチド。
3. 【請求項３】 成長ホルモン受容体蛋白質に高い親和性
   を示し且つ低い成長ホルモン活性を保持することを特徴
   とする請求項１記載の変異型ヒト成長ホルモン蛋白質。
4. 【請求項４】 配列番号１記載のアミノ酸配列に成長ホ
   ルモン受容体への高い親和性を示し且つ低いホルモン活
   性を保持する特徴を失わない範囲においてアミノ酸残基
   の部分に部分的な置換、挿入または欠失を施したアミノ
   酸配列を有する蛋白質。
5. 【請求項５】 アミノ酸配列とそれをコードするデオキ
   シリボヌクレオチドが配列番号２で表される蛋白質。
6. 【請求項６】 配列番号３で表されるアミノ酸配列とそ
   れをコードするデオキシリボヌクレオチド。 【図３】
7. 【請求項７】 請求項１に記載の蛋白質において、その
   受容体蛋白質への結合部位であるペプチド及びそのペプ
   チドのアミノ酸配列をコードするデオキシリボヌクレオ
   チド。
8. 【請求項８】 請求項４に記載される蛋白質のアミノ酸
   配列をコードする塩基配列を有するデオキシリボヌクレ
   オチド。
9. 【請求項９】 請求項２、５、６、７又は８に記載のデ
   オキシリボヌクレオチドを、それぞれプロモーターの下
   流に置いた発現プラスミド。
10. 【請求項１０】 請求項９に記載のプラスミドで形質転
    換された生物細胞から発現した生成物。
11. 【請求項１１】 請求項１、４、５又は６に記載の変異
    型ヒト成長ホルモン蛋白質と相互作用する抗体。
12. 【請求項１２】 モノクローナル抗体である請求項１１
    に記載の抗体。
13. 【請求項１３】 請求項１、４、５、６又は７に記載の
    蛋白質及びペプチドを有効成分とする巨人症治療剤又は
    末端肥大症治療剤。
14. 【請求項１４】 請求項２、５、６、７又は８のデオキ
    シリボヌクレオチドを利用した遺伝子治療剤。