DE69723982T2

DE69723982T2 - Behandlung des partiellen wachstumshormon-unempfindlichkeitssyndroms

Info

Publication number: DE69723982T2
Application number: DE69723982T
Authority: DE
Inventors: M. Kenneth ATTIE; M. Lena CARLSSON; Neil Gesundheit; Audrey Goddard
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1996-05-03
Filing date: 1997-04-18
Publication date: 2004-07-22
Anticipated expiration: 2017-04-19
Also published as: JP2001510444A; CA2252560C; EP0914148A1; ES2205211T3; US6207640B1; WO1997041887A1; EP1369125A1; PT914148E; EP0914148B1; DE69723982D1; CA2252560A1; ATE246511T1; DK0914148T3

Description

Die vorliegende Anmeldung bezieht sich auf die laufende Anmeldung mit der US-Seriennummer 08/224.982, eingereicht am 7. April 1994, und mit der Seriennummer 08/410.452, eingereicht am 24. März 1995, deren gesamten Offenbarungen hierin durch Verweis aufgenommen sind, und beansprucht die daraus gemäß 35 USC § 120 erwachsenden Vorteile.
Hintergrund der Erfindung Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung der Wachstumsraten von Humanpatienten, die am partiellen Wachstumshormon-Unempfindlichkeitssyndrom leiden.
Beschreibung des Hintergrunds und des verwandten Standes der Technik
Die meisten Kinder mit auffallend kleinem Körperwuchs besitzen keine klassische Wachstumshormon- (GH-) Defizienz, wie sie durch die GH-Reaktion auf provokative Stimuli definiert ist. Sobald die Ursachen der Kleinwüchsigkeit ausgeschlossen sind, wird der Krankheitszustand dieser Patienten mit verschiedenen Termini bezeichnet, z. B. mit familienbedingter Kleinwüchsigkeit, konstitutioneller Wachstumsverzögerung oder „idiopatischer" Kleinwüchsigkeit (ISS). Einige dieser Kinder können möglicherweise ihr volles genetisches Potenzial in Bezug auf die Körpergröße nicht erreichen, doch es wurde bislang nicht über Ergebnisse von umfangreichen Langzeitstudien berichtet. Da es zahlreiche Faktoren gibt, die zum normalen Wachstum und zu normaler Entwicklung beitragen, ist es wahrscheinlich, dass Patienten mit ISS in Hinblick auf ihre Ätiologie der Kleinwüchsigkeit heterogen sind. Obwohl sie nicht als klassisch GH-defizient eingestuft werden, sprechen die meisten Kinder mit ISS auf die Behandlung mit GH an, wenn auch nicht sehr gut.
Viele Forscher untersuchten die Störungen der spontanen GH-Sekretion in dieser Patientenpopulation. Eine Hypothese besagt, dass einige dieser Patienten eine inadäquate Sekretion von endogenem GH unter physiologischen Bedingungen aufweisen, aber einen Anstieg des GH-Spiegels als Reaktion auf pharmakologische Reize verzeichnen (wie in traditionellen GH-Stimulationstests). Diese Störung wurde als „neurosekretorische GH-Dysfunktion" bezeichnet, und die Diagnose beruht auf dem Vorliegen eines abnormalen GH-Musters, das sich nach dem Ziehen zahlreicher Serumproben über längere Zeit ergibt. Zahlreiche Forscher berichteten über Ergebnisse solcher Studien und stellten fest, dass diese Anomalie nur gelegentlich vorliegt. Andere Forscher postulierten, dass diese Patienten „bioinaktives GH" besitzen, wobei dies jedoch noch nicht schlüssig bewiesen werden konnte.
Beim Klonieren des GH-Rezeptors (GHR) wurde aufgezeigt, dass die wesentliche GH-Bindungsaktivität im Blut auf ein Protein zurückzuführen ist, das aus dem gleichen Gen stammt wie GHR und der extrazellulären Domäne des GHR voller Länge entspricht. Den meisten Patienten mit GH-Unempfindlichkeits- oder Laron-Syndrom (GHIS) mangelt es an GHR-Bindungsaktivität, und sie weisen keine oder eine nur sehr geringe GH-Bindungsprotein- (GHBP-) Aktivität im Blut auf. Solche Patienten weisen einen Durchschnittsgrößen-Standardabweichungs-Score (SDS) von etwa –5 bis –6, sie sind gegenüber GH-Behandlung resistent, und sie besitzen erhöhte Serumkonzentrationen von GH und niedrige Serumkonzentrationen von Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor (IGF-I). Sie sprechen auf Behandlung mit IGF-I an. Bei Patienten mit Defekten in der extrazellulären Domäne des GHR kann der Mangel an funktionellem GHBP im Blutstrom als Marker für die GH-Unempfindlichkeit dienen.
Es existiert eine Untergruppe von Patienten mit ISS mit wenig GHBP im Blut, die einen Durchschnittsgrößen SDS aufweisen, der zwischen jenem von Patienten mit komplettem GHIS (Laron-Syndrom) und normalen Kindern liegt, und die etwas – aber nicht stark – auf GH-Behandlung ansprechen. Diese Patientengruppe kann als eine bezeichnet werden, die an partiellem GHIS leidet.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Untergruppe von Patienten mit ISS zu identifizieren, die partielles GHIS aufweisen und kein komplettes GHIS oder Laron-Syndrom aufweisen.
Ein weiteres Ziel ist die Behandlung dieser identifizierten Untergruppe von Patienten, so dass sie schließlich eine Körpergröße erreichen, die ihrem genetischen Potenzial entspricht (bestimmt durch die „midparental" Zielgröße, d. h. die Größe des Vaters und der Mutter).
Diese und andere Ziele sind für Fachleute auf dem Gebiet offenkundig.
WO 95/27495 beschreibt Verfahren zur Behandlung von Humanpatienten mit partiellem GH-Unempfindlichkeitssyndrom, aber nicht mit Laron-Syndrom, mit IGF-1 und/ oder GH. Bestimmte Mutationen innerhalb der extrazellulären Domäne des GHR, die mit partiellem GH-Unempfindlichkeitssyndrom verbunden sind, sind ebenfalls beschrieben.
WO 91/18621 beschreibt die Verwendung von GH und IGF-1 zur Steigerung des Wachstums eines Säugetiers, welche Verwendung laut dieser Publikation der Verwendung von GH oder IGF-1 alleine überlegen ist.
Zusammenfassung der Erfindung
Demzufolge bietet in einem ersten Aspekt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung der Wachstumsrate eines Humanpatienten mit partiellem GHIS, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge an GH an den Patienten, wobei dieser eine Körpergröße aufweist, die weniger als etwa –2 Standardabweichungen unter dem normalen Wert für sein Alter und Geschlecht liegt, einen Serumspiegel an hochaffinem GHBP besitzt, der zumindest 2 Standardabweichungen unter dem normalen Wert liegt, einen Serumspiegel von IGF-I aufweist, der unter dem normalen mittleren Wert liegt, und einen mittleren oder maximalen stimulierten Serumspiegel von GH aufweist, der zumindest normal ist, wobei der Patient nicht an Laron-Syndrom leidet. Vorzugsweise ist das GH rekombinantes Human-GH.
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung der Wachstumsrate eines Humanpatienten mit partiellem GHIS, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge an IGF-I (vorzugsweise rekombinantes Human-IGF-I) an den Patienten, wobei dieser eine Körpergröße aufweist, die weniger als etwa –2 Standardabweichungen unter dem normalen Wert für sein Alter und Geschlecht liegt, einen Serumspiegel an hochaffinem GHBP besitzt, der zumindest 2 Standardabweichungen unter dem normalen Wert liegt, einen Serumspiegel von IGF-I aufweist, der unter dem normalen mittleren Wert liegt, und einen mittleren oder maximalen stimulierten Serumspiegel von GH aufweist, der zumindest normal ist, wobei der Patient nicht an Laron-Syndrom leidet.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung der Wachstumsrate eines Humanpatienten mit partiellem GHIS, umfassend die Verabreichung von Mengen an IGF-I und GH an den Patienten, welche Mengen in Kombination wirkungsvoll sind, wobei der Patient eine Körpergröße aufweist, die weniger als etwa –2 Standardabweichungen unter dem normalen Wert für sein Alter und Geschlecht liegt, einen Serumspiegel an hochaffinem GHBP besitzt, der zumindest 2 Standardabweichungen unter dem normalen Wert liegt, einen Serumspiegel von IGF-I aufweist, der unter dem normalen mittleren Wert liegt, und einen mittleren oder maximalen stimulierten Serumspiegel von GH aufweist, der zumindest normal ist, wobei der Patient nicht an Laron-Syndrom leidet.
In einem weiteren Aspekt bietet die Erfindung en Verfahren zur Erhöhung der Wachstumsrate eines Humanpatienten mit partiellem GHIS; wobei der Patient einen heterogenen (intrazellulären und/oder extrazellulären) GHR-Gendefekt aufweist, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge an GH und/oder IGF-I an den Patienten. Vorzugsweise ist das GH rekombinantes Human-GH und der IGF-I rekombinanter Human-IGF-I.
In einem weiteren Aspekt bietet die Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung der Wachstumsrate eines Humanpatienten mit partiellem GHIS, umfassend das Detektieren, ob der Patient einen heterogenen (intrazellulären und/oder extrazellulären) GHR-Gendefekt besitzt, und – falls dies zutrifft – die Verabreichung einer wirksamen Menge an GH und/oder IGF-I an den Patienten.
Kurzbeschreibung der Abbildungen
1 zeigt die Serum-GHBP-Konzentrationen in Kindern in der Genentech National Cooperative Growth Study (NCGS), die GH-Defizienz (GHD), ISS und Turner-Syndrom (TS) aufweisen, standardisiert nach Alter und Geschlecht und als SDS ausgedrückt, nach dem Alter zum Zeitpunkt der Aufnahme in die Studie. Die schraffierte Fläche stellt den normalen Bereich (–2 SD bis +2 SD) für jedes Geschlecht dar. Die durchgehende Linie zeigt das normale Mittel für das betreffende Alter und Geschlecht an. Gelegentlich überschneiden einander Punkte für zwei oder mehr Patienten und scheinen ein einziger Punkt zu sein.
2 zeigt die Wachstumsrate in cm/Jahr von an der NCGS teilnehmenden Patienten mit ISS, die mit verschiedenen Dosen an durch tägliche Injektion verabreichtem GH behandelt werden.
3A veranschaulicht die IGF-I-Konzentrationen, standardisiert nach Alter und Geschlecht und ausgedrückt als SDS, nach GHBP SDS (Mittelwert ± SD). 3B zeigt die mittleren 12-Stunden-GH-Konzentrationen aus Proben, die über Nacht alle 20 min 12 h lang gezogen wurden, je nach GHBP SDS (Mittelwert ± SD) für Patienten, die an der in 2 dargestellten Studie teilnahmen.
4 zeigt die Wachstumsrate (cm/Jahr) des ersten Jahrs nach GHBP SDS für Patienten, die mit Human-GH (hGH) behandelt wurden und während des ersten Jahrs der GH-Therapie präpubertär blieben (n = 166). Die schraffierte Fläche stellt den normalen Bereich für GHBP dar (–2 SD bis +2 SD).
5 ist ein Graph der Wachstumsraten vor der Behandlung, während des ersten Jahrs und während des zweiten Jahrs für Patienten, deren Daten in Tabelle VII und Beispiel III (siehe weiter unten) veranschaulicht sind und die einen GHBP SDS von –2 (n = 14) (Quadrate) oder einen GHBP SDS > –2 (n = 29) (Kreise) besitzen.
6A und 6B zeigen in Form von Balken die Wachstumsraten vor der Behandlung (6A) und während des ersten Jahrs (6B) nach GHBP SDS für die in 5 gezeigten Patienten.
7 stellt den Wachstumsstatus dar, wie er anhand der Messung der GH-Sekretion (z. B. stimulierte oder endogene GH-Konzentration) im Vergleich zur Messung der GH-Empfänglichkeit (z. B. GHBP-Konzentration) vorhergesagt wird.
8 zeigt die DNA-Sequenzen (SEQ ID Nr. 1 und 2) und die vorhergesagten Aminosäuresequenzen (SEQ ID Nr. 3 und 4) zweier GHR-Allele in ISS-Patient 4 (Exons 4–6). Die Mutationen in Allelen 1 und 2 sind eingerahmt. Die vertikalen Balken zeigt Exongrenzen in der cDNA-Sequenz an.
9 veranschaulicht de DNA-Sequenzen (SEQ ID Nr. 5 und 6) und die vorhergesagten Aminosäuresequenzen (SEQ ID Nr. 7 und 8) von zwei GHR-Allelen in ISS-Patient 2 (Exon 5). Die Mutation in Allel 2 ist eingerahmt.
10 zeigt die DNA-Sequenzen (SEQ ID Nr. 9 und 10) und die vorhergesagten Aminosäuresequenzen (SE ID Nr. 11 und 12) zweier Allele in ISS-Patient 1 (Exon 7). Die Mutation in Allel 2 ist eingerahmt. Die Intronsequenz ist in Kleinbuchstaben und die Exonsequenz in Großbuchstaben dargestellt. Die vertikalen Balken geben Exongrenzen in der DNA-Sequenz an.
11 zeigt die DNA-Sequenzen (SEQ ID NR. 13 und 14) und die vorhergesagten Aminosäuresequenzen (SEQ ID Nr. 15 und 16) zweier GHR-Allele in ISS-Patient 7 (Exon 7). Die Mutation in Allel 2 ist eingerahmt. Die Intronsequenz ist in Kleinbuchstaben und die Exonsequenz in Großbuchstaben dargestellt. Die vertikalen Balken geben Exongrenzen in der DNA-Sequenz an.
12 bis 21 zeigen die Analyse des GHF-Gens für die hierin vorgestellten Patienten und die resultierende Vererbung von den Eltern auf deren Nachkommen sowie die Wachstumsreaktionsdaten für verschiedene Patienten. Siehe nähere Erläuterungen weiter unten.
22 ist ein Sequenzier-Autoradiogramm der Exon/Intron-Verbindungsstelle von Exon 8 des GHR, aus der die Sequenz de rWildform und die Mutantensequenz von Patient 1 ersichtlich ist. Patient 1 ist homozygot für eine G-nach-C-Transversion innerhalb von Codon 274, wodurch ein AGG (Thr) Codon anstelle eines AGG (Arg) Codon entsteht.
23 ist eine Restriktionsenzym-Kartierung von PCR-amplifizierter DNA aus den Familienmitgliedern.

(a) Ein 199 bp-Fragment mit Exon 8 wurde aus der genomischen DNA der betroffenen Patienten 1 und 2, der Mutter (M) und des Vaters (F) von Patient 1 sowie eines Vergleichsprobanden (WT) unter Einsatz der Oligonucleotidprimer 8a und 8b amplifiziert. Die Mutation erzeugt eine Maell-Stelle, die zwei Fragmente mit einer Größe von 154 bzw. 54 produziert. Nach einstündigem Verdau mit Maell wurden die DNA-Fragmente Polyacylamidgel-Elektrophorese unterzogen. Die Eltern von Patient 1 lieferten ein gemischtes Verdauu muster, das mit der Gegenwart von Allelen der Wildform und Allelmutanten übereinstimmte, während beide Patienten nur die Allelmutante aufwiesen und die Vergleichs-DNA nur das Allel der Wildform aufwies. ND – nichtverdautes Fragment. Mk = Größenmarker
(b) Teil des Stammbaums der Familien von Patienten 1 und 2; man erkennt die Vererbung der Allelmutante (bestimmt durch Sequenzieren und Restriktionsverdau des durch PCR erzeugten Exon 8-Fragments). Die Allelmutante wird als 154 und das normale Allel als 199 bezeichnet (wie im Restriktionsenzym-Verdaumuster). Die Daten über den neugeborenen Bruder bzw. die neugeborene Schwester von Parient 1 sind nicht dargestellt, doch der Restriktionsverdau von Plazenta-DNA zeigte ein mit einem heterozygoten Zustand übereinstimmendes Muster.

24 veranschaulicht de Wirkung der Mutation auf das Spleißen mit dem GHR.

(a) Es erfolgte RT-PCR auf RNA, die aus EBV-transformierten Lymphozyten von Patient 1 isoliert wurde, unter Einsatz des ineinandergeschachtelten PCR-Technik (Sequenzen der Primer P1–P5 sind aus Tabelle 2 ersichtlich). Die letzte Runde von PCR unter Verwendung der Primer P5 und P6 amplifizierte wie erwartet ein 267 bp-Fragment im normal gespleißten GHR (Spalten 1 und 2: normale Vergleichs-Lymphozyten bzw. Leber), während in Patient 1 (Spalte 3) nur ein 176 bp-Produkt erhalten wird (dies stimmt mit dem Überspringen des 91 bp-Exons 8 überein). Mk = Größenmarker, C = Wasservergleich).
(b) Das direkte Sequenzieren dieser RT-PCR-Produkte bestätigte das Überspringen von Exon 8 in Patient 1 – Exon 7 spleißt direkt in Exon 9, während im Vergleich normales Spleißen von Exon 7 in Exon 8 stattfindet.

Tabelle A
Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen
Definitionen
Die anhand des Verfahrens der Erfindung behandelte Patientenpopulation schließt Patienten mit „Laron-Syndrom" aus, die in der Literatur und hierin als Patienten mit einem vollständigen Mangel an GHR-Funktion oder komplettem GHIS bezeichnet werden. Diese Patienten erreichen im Erwachsenenalter eine Körpergröße von 110– 130 cm. Weitere häufig anzutreffende Symptome sind ihr kleines Gesicht und Kiefer, ihre eingedrückte Nasenbrücke, ihre vorstehende Stirn, ihre Fettleibigkeit, ihre hohe Stimme und Hypoglykämie in früher Kindheit. Biochemisch sind diese Patienten dadurch gekennzeichnt, dass sie erhöhte GH-Serumkonzentrationen, aber niedrige IGF-I-Serumkonzentrationen besitzen.
„Erhöhung der Wachstumsrate eines Humanpatienten" bezieht sich hierin nicht nur auf eine Situation, in der der Patient zumindest die gleiche Endgröße erreicht wie mit GH behandelte GH-defiziente Patienten (d. h. Patienten mit diagnostiziertem GHD), sondern auch auf eine Situation, in der der Patient mit gleicher Wachstumsrate wie mit GH behandelte Patienten mit GH-Defizienz in Bezug auf seine Körpergröße aufholt oder im Erwachsenenalter eine Größe erreicht, die innerhalb des Zielgrößenbereichs liegt, d. h. eine Endgröße erreicht, die seinem genetischen Potenzial (bestimmt durch die „midparental" Zielgröße, d. h. den Durchschnitt der Körpergröße der Mutter und des Vaters) entspricht.
„Partielles GH-Unempfindlichkeitssyndrom" oder „partielles GHIS" bezieht sich auf ein Syndrom, bei dem der Patient auf die gleiche GH-Dosis anspricht wie sie an GH-defiziente Patienten verabreicht wird, aber nicht gut darauf anspricht. Dieses Syndrom ist ferner dadurch gekennzeichnet, dass der Patient eine Körpergröße aufweist, die weniger als etwa –2 Standardabweichungen unter dem Normalwert für sein Alter und Geschlecht, vorzugsweise im Bereich von weniger als etwa –2 bis etwa –4 Standardabweichungen unter dem Normalwert für sein Alter und Geschlecht, liegt, einen Serumspiegel von hochaffinem GHBP aufweist, der zumindest 2 Standardabweichungen, typischerweise 2–4 Standardabweichungen, unter dem Normalwert für Menschen liegt, einen Serumspiegel von IGF-I aufweist, der unter dem normalen Mittelwert für Menschen liegt, und einen mittleren oder maximalen stimulierten Serumspiegel von GH aufweist, der zumindest normal für Menschen ist. Mittlere Serumspiegel beziehen sich auf den Durchschnitt der im Patienten gemessenen Werte.
„Nicht-GH-defiziente Kleinwüchsigkeit" bezieht sich hierin auf einen Patienten, der einen Körpergrößen-SDS von etwa = 2 SD unter dem Normalwert für sein Alter und Geschlecht und keine klassische GHD aufweist (definiert auf der Basis der sekretierten Mengen an GH unter einem minimalen Schwellenwert).
„Wachstumshormon" oder „GH" bezieht sich hierin auf Wachstumshormon in Form nativer Sequenz oder in Variantenform, das aus jeder beliebigen Quelle (natürlich, synthetisch oder rekombinant) stammt. Beispiele sind hGH, das natürliches oder rekombinantes GH mit der nativen Humansequenz ist (Somatotropin oder Somatro pin), und rekombinantes GH (rGH), das sich auf jedes GH oder jede GH-Variante bezieht, das/die mittels DNA-Rekombinationstechnologie produziert wird, z. B. Somatrem, Somatotropin und Somatropin. Für die Verwendung mit dem Menschen ist hierin rekombinante native Humansequenz, reifes GH mit oder ohne ein Methionin an seinem N-Terminus, vorzuziehen. Noch bevorzugter ist Methionyl-hGH (met-hGH), das in E. coli produziert wird, z. B. durch das in US-Patent 4.755.465, veröffentlicht am 5. Juli 1988, und von Goeddel et al., Nature 282, 544 (1979) geoffenbarte Verfahren. Met-hGH, das unter dem Markennamen Protropin^® von Genentech, Inc. vertrieben wird, ist mit dem natürlichen Polypeptid identisch – mit Ausnahme der Gegenwart eines N-terminalen Methioninrests. Diese zusätzliche Aminosäure ist das Ergebnis des bakteriellen Proteinsynthese-Prozesses. Ferner vorzuziehen ist rekombinantes hGH, das von Genentech, Inc. unter dem Markennamen Nutropin^® vertrieben wird. Dieses hGH besitzt diesen Methioninrest nicht, weist aber eine Aminosäuresequenz auf, die mit jener des natürlichen Hormons identisch ist. Siehe Gray et al., Biochemistry 2, 161 (1984). Sowohl met-hGH als auch hGH besitzen gleiche Wirksamkeit und pharmakokinetische Werte. Moore et al., Endocrinology 122, 2920– 2926 (1988). Ein weiterer geeigneter hGH-Kandidat ist eine hGH-Variante, die eine Plazentaform von GH mit reiner somatogener, aber ohne laktogene Aktivität ist (siehe US-Patent 4.670.393 vom 2. Juni 1987). Hierin enthalten sind auch GH-Varianten, die in WO 90/04788 vom 3. Mai 1990 und in WO 92/09690 vom 11. Juni 1992 beschrieben sind.
„IGF-I" beschreibt hierin Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor 1 aus jeder beliebigen Spezies, z. B. aus Rindern, Schafen, Schweinen, Pferden, Vögeln und vorzugsweise aus Menschen, in Form nativer Sequenz oder in Variantenform, aus jeder beliebigen Quelle (natürlich, synthetisch oder rekombinant). IGF-I wurde aus Humanserum isoliert und rekombinant produziert. Siehe z. B. EP 123.228 und 128.733.
Bevorzugt hierin für die Verwendung mit dem Menschen ist native Humansequenz, reifes IGF-1, noch bevorzugter ohne N-terminales Methionin, hergestellt z. B. durch das Verfahren aus EP 230.869 , veröffentlicht am 5. August 1987; EP 128.733 , veröffentlicht am 19. Dezember 1984; oder EP 288.451 , veröffentlicht am 26. Oktober 1988. Noch bevorzugter wird dieser Nativsequenz-IGF-I rekombinant produziert, stammt von Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA und eignet sich für klinische Untersuchungen.
Die bevorzugten IGF-I-Varianten sind in US-Patent 5.077.276 vom 31. Dezember 1991, in WO 87/01038 vom 26. Februar 1987 und in WO 89/05822 vom 29. Juni 1989 beschrieben, d. h. jene, worin zumindest der Glutaminsäurerest an Position 3 im N-Terminus des reifen Moleküls fehlt, oder jene mit einer Deletion von bis zu fünf Aminosäuren am N-Terminus. In der bevorzugtesten Variante sind die ersten drei Aminosäuren aus dem N-Terminus deletiert (als Hirn-IGF, tIGF-I, des(1-3)-IGF-I oder des-IGF-I bezeichnet).
„Hochaffines" Wachstumshormon-Bindungsprotein oder „hochaffines GHBP" bezieht sich hierin auf die extrazelluläre Domäne des GHR, die im Blut zirkuliert und in mehreren Spezies als GHBP dient (Ymer und Herington, Mol. Cell. Encodrino. 41, 153 (1985); Smith und Talamantes, Endocrinology 123, 1489–1494 (1988); Emtner und Roos, Acta Endocrinologica (Copenh.) 122, 296–302 (1990)), z. B. beim Menschen. Baumann et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. (J. C. E. M.) 62, 134–141 (1986); EP 366.710 , veröffentlicht am 9. Mai 1990; Herington et al., J. Clin. Invest. 77, 1817– 1823 (1986); Leung et al., Nature 330, 537–543 (1987). Ein zweites BP mit geringerer Affinität für GH wurde ebenfalls beschrieben, wobei es mit dem GHR strukturell nicht verwandt zu sein scheint. Baumann und Shaw, J. C. E. M. 70, 680–686 (1990). Es gibt verschiedene Verfahren zur Messung von funktionellem GHBP in Serum, wobei das bevorzugteste der Liganden-mediierte immunfunktionelle Assay (LIFA) ist, der von Carlsson et al., J. C. E. M. 73, 1216 (1991) und in US-Patent 5.210.017 erläutert ist.
Durchführungsarten der Erfindung
Die Subpopulation von Patienten, die für die Behandlung gemäß der vorliegenden Erfindung ausgewählt wurde, besteht aus den oben definierten Patienten mit partiellem GHIS. Der Patient muss jedes der klinischen Symptome aufweisen, die durch das hierin beanspruchte Verfahren behandelt werden können.
GH und/oder IGF-I wird mittels eines geeigneten Verfahrens direkt an den Patienten verabreicht, z. B. parenteral, intranasal, intrapulmonal, oral oder durch Absorption durch die Haut. Wenn sie gemeinsam verabreicht werden, müssen sie nicht auf gleichem Wege verabreicht werden. Sie können auch lokal oder systemisch zugeführt werden. Beispiele für die parenterale Verabreichung sind subkutane, intramuskuläre, intravenöse, intraarterielle und intraperitoneale Verabreichung. Vorzugsweise werden sie durch tägliche subkutane Injektion verabreicht.
Das in der Therapie zu verwendende GH und/oder IGF-I wird gemäß der bewährten medizinischer Praxis formuliert und dosiert, wobei insbesondere der klinische Zustand des Patienten (vor allem die Nebenwirkungen der Behandlung mit GH oder IGF-1 alleine), die Verabreichungsstelle der IGF-I- und GH-Zusammensetzung(en), das Verabreichungsverfahren, der Verabreichungszeitplan und andere Fachleuten bekannte Faktoren zu berücksichtigen sind. Die „wirksamen Mengen" jeder Komponente werden hierin durch dieser Überlegungen bestimmt; es sind Mengen, die die Wachstumsraten der Patienten steigern.
Wenn GH alleine verabreicht wird, verwendet man vorzugsweise eine Dosis von mehr als etwa 0,2 mg/kg/Woche, noch bevorzugter von mehr als etwa 0,25 mg/kg/ Woche, am bevorzugtesten von etwa 0,3 mg/kg/Woche oder mehr. In einer Ausführungsform reicht die GH-Dosis von etwa 0,3 bis 1,0 mg/kg/Woche, in einer anderen von 0,35 bis 1,0 mg/kg/Woche. Vorzugsweise wird GH einmal täglich subkutan verabreicht.
Das GH wird günstigerweise kontinuierlich oder nicht-kontinuierlich verabreicht, z. B. zu bestimmten Zeitpunkten (z. B. einmal täglich), in Form einer Injektion einer bestimmten Dosis, wobei ein Anstieg der Plasma-GH-Konzentration zum Zeitpunkt der Injektion und dann ein Abfall der Plasma-GH-Konzentration bis zur nächsten Injektion zu beobachten ist. Ein weiteres nicht-kontinuierliches Verabreichungsverfahren ergibt sich aus der Verwendung von PLGA-Mikrokügelchen und vieler Implantationsvorrichtungen, die für diskontinuierliche Freisetzung von Wirkstoff sorgen, z. B. für ein anfängliches Aufplatzen und eine anschließende zeitliche Verzögerung bis zur Freisetzung des Wirkstoffs; siehe z. B. US-Patent 4.767.628, Spalte 2, Zeilen 19–37.
Das GH kann auch solcherart verabreicht werden, dass es kontinuierlich im Blut vorhanden ist und dass diese Gegenwart während der Dauer der GH-Verabreichung aufrechterhalten wird. Dies erfolgt am bevorzugtesten mittels Dauerinfusion, z. B. mittels Minipumpen wie etwa osmotische Minipumpen. Alternativ dazu erfolgt dies durch häufige GH-Injektionen (d. h. mehr als einmal täglich, z. B. zwei- oder dreimal täglich).
In einer weiteren Ausführungsform kann GH unter Verwendung von GH-Formulierungen mit Langzeitwirkung verabreicht werden, die entweder die Clearance von GH aus dem Blut verzögern oder eine langsame Freisetzung von GH aus z. B. einer Injektionsstelle bewirken. Die Formulierung mit Langzeitwirkung, die die GH-Plasma-Clearance verzögert, kann in Form von GH vorliegen, das mit einem Makromolekül komplexiert oder kovalent konjugiert ist (durch reversible oder irreversible Bindung); Beispiele dafür sind eines oder mehrere seiner Bindungsproteine (WO 92/08985, veröffentlicht am 29. Mai 1992) oder ein wasserlösliches Polymer, ausgewählt aus PEG und Polypropylenglykol-Homopolymeren und Polyoxyethylenpolyolen, d. h. aus jenen, die in Wasser bei Raumtemperatur löslich sind. Alternativ dazu kann das GH mit einem Polymer komplexiert oder daran gebunden sein, um seine Halbwertszeit im Blutstrom zu verlängern. Beispiele für Polyethylenpolyole und Polyoxyethylenpolyole, die sich zu diesem Zweck eignen, sind Polyoxyethylenglycerin, Polyethylenglykol, Polyoxyethylensorbit, Polyoxyethylenglucose o.dgl. Das Glycerin-Rückgrat von Polyoxyethylenglycerin ist das gleiche Rückgrat, das z. B. in Tieren und Menschen in Mono-, Di- und Triglyceriden vorkommt.
Das Polymer muss kein bestimmtes Molekulargewicht aufweisen, aber es ist vorzuziehen, dass das Molekulargewicht zwischen etwa 3.500 und 100.000, noch bevorzugter zwischen 5.000 und 40.000, reicht. Vorzugsweise ist das PEG-Homopolymer unsubstituiert, doch es kann auch an einem Ende mit einer Alkylgruppe substituiert sein. Vorzugsweise ist die Alkylgruppe eine C1-C4-Alkylgruppe, am bevorzugtesten eine Methylgruppe. Am bevorzugtesten ist das Polymer ein unsubstituiertes Homopolymer von PEG, ein Monomethyl-substituiertes Homopolymer von PEG (mPEG) oder Polyoxyethylenglycerin (POG) und besitzt ein Molekulargewicht von etwa 5.000 bis 40.000.
Das GH ist über einen oder mehrere der Aminosäurereste des GH kovalent an eine endständige reaktive Gruppe auf dem Polymer gebunden; dies hängt hauptsächlich von den Reaktionsbedingungen, dem Molekulargewicht des Polymers usw. ab. Das Polymer mit der bzw. den reaktiven Gruppe(n) wird hierin als aktives Polymer bezeichnet. Die reaktive Gruppe reagiert selektiv mit freien Amino- oder anderen reaktiven Gruppen auf dem GH. Es ist jedoch zu beachten, dass die Art und Menge der ausgewählten reaktiven Gruppe sowie die Art des verwendeten Polymers zwecks Erreichung optimaler Ergebnisse vom jeweils verwendeten GH abhängt, um zu vermeiden, dass die reaktive Gruppe mit zu vielen besonders aktiven Gruppen auf dem GH reagiert. Da man dies möglicherweise nicht vollständig vermeiden kann, ist es zu empfehlen, dass im Allgemeinen je nach Proteinkonzentration von etwa 0,1 bis 1.000 Mol, vorzugsweise von 2 bis 200 Mol, aktiviertes Polymer pro Mol Protein verwendet wird. Die endgültige Menge an aktiviertem Polymer pro Mol Protein ist ein Kompromiss – einerseits optimale Aktivität, andererseits die Optimierung der Halbwertszeit des Proteins im Blutstrom.
Während die Reste jede reaktive Aminosäure auf dem Protein sein können, z. B. ein oder zwei Cysteine auf der N-terminalen Aminosäuregruppe, ist die reaktive Aminosäure vorzugsweise Lysin, das mit der reaktiven Gruppe des aktivierten Polymers über seine freie ε-Aminogruppe verbunden ist, oder Glutamin- oder Asparaginsäure, die mit dem Polymer über eine Amidbindung verbunden ist.
Die kovalente Modifikationsreaktion kann durch jedes zweckmäßige Verfahren stattfinden, das im Allgemeinen durch Umsetzung biologisch aktiver Materialien mit inerten Polymeren angewendet wird; es erfolgt vorzugsweise bei einem pH-Wert von 5– 9, noch bevorzugter bei einem pH-Wert von 7–9, wenn die reaktiven Gruppen auf dem GH Lysingruppen sind. Im Allgemeinen umfasst das Verfahren die Herstellung eines aktivierten Polymers (mit zumindest einer endständigen Hydroxylgruppe), die Herstellung eines aktiven Substrats aus diesem Polymer und danach das Umsetzen des GH mit dem aktiven Substrat, um das für die Formulierung in Frage kommende GH zu erzeugen. Die obige Modifikationsreaktion kann unter Anwendung mehrerer Verfahren durchgeführt werden, die einen oder mehrere Schritte umfassen können. Beispiele für in Frage kommende Modifikatoren zur Bildung des aktivierten Polymers in einer aus einem Schritt bestehenden Reaktion sind Cyanursäurechlorid (2,4,6-Trichlor-S-triazin) und Cyanursäurefluorid.
In einer Ausführungsform findet die Modifikationsreaktion in zwei Schritten statt, worin das Polymer zunächst mit einem Säureanhydrid wie z. B. Bernsteinsäure- oder Glutarsäureanhydrid umgesetzt wird, um eine Carbonsäure zu bilden, und die Carbonsäure dann mit einer Verbindung umgesetzt wird, die zur Reaktion mit der Carbonsäure fähig ist, um ein aktiviertes Polymer mit einer reaktiven Estergruppe zu bilden, die zur Reaktion mit dem GH fähig ist. Beispiele für solche Verbindungen sind N-Hydroxysuccinimid, 4-Hydroxy-3-nitrobenzolsulfonsäure u. dgl. vorzugsweise wird N-Hydroxysuccinimid oder 4-Hydroxy-3-nitrobenzolsulfonsäure verwendet. Beispielsweise kann Monomethyl-substituiertes PEG bei erhöhten Temperaturen, vorzugsweise bei etwa 100°C–110°C, vier Stunden lang mit Glutarsäureanhydrid umgesetzt werden. Die somit produzierte Monomethyl-PEG-Glutarsäure wird dann mit N-Hydroxysuccinimid in der Gegenwart eines Carbodiimidreagens wie z. B. Dicyclohexyl- oder Isopropylcarbodiimid umgesetzt, um das aktivierte Polymer, Methoxypolyethylenglykolyl-N-succinimidylglutarat, zu bilden, das dann mit dem GH umgesetzt werden kann. Dieses Verfahren ist ausführlich in Abuchowski et al., Cancer Biochem. Biophys. 7, 175–186 (1984) beschrieben. In einem weiteren Beispiel kann das Monomethyl-substituierte PEG mit Glutarsäureanhydrid umgesetzt werden, gefolgt von der Reaktion mit 4-Hydroxy-3-nitrobenzolsulfonsäure (HNSA) in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid, um das aktivierte Polymer zu schaffen. HNSA wird von Bhatnagar et al., Peptides: Synthesis-Structure-Function, Proceedings of the Seventh American Peptide Symposium, Rich et al. (Hrsg.) (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, USA, 1981), S. 97–100, und Nitecki et al., High-Technology Route to Virus Vaccines (American Society for Microbiology, 1986), Novel Agent for Coupling Synthetic Peptides to Carriers and Its Applications.
Spezifische Verfahren zur Erzeugung von an PEG konjugiertem GH sind z. B. die Verfahren von US-Patent 4.179.337 über PEG-GH und von US-Patent 4.935.465, die PEG geoffenbart, das reversibel, aber kovalent mit GH verbunden ist. Andere spezifische Verfahren zur Erzeugung von PEG-GH sind die Folgenden:
PEGylierung mit Methoxypolyethylenglykolaldehyd (Me-PEG-Aldehyd) durch reduktive Alkylierung und Reinigung erfolgt durch Zugabe von GH in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), pH 7,0, 5 mM Me-PEG-Aldehyd-5000 (Molekulargewicht 5.000 Da) und 20 mM NaCNBH3 zu 2 mg/ml und vorsichtiges Vermischen bei Raumtemperatur über den Zeitraum von 3 Stunden. Dann wird Ethanolamin 50 mM zugegeben, um das verbleibende nicht umgesetzte Me-PEG reduktiv zu amidieren. Das Gemisch wird auf einer Anionenaustausch-Säule, FPLC Mono Q, getrennt. Das überschüssige nicht umgesetzte Me-PEG bindet sich nicht an die Säule und kann dann vom Gemisch abgetrennt werden. Zwei wichtige PEGylierte GH-Fraktionen werden mit scheinbaren Molekulargewichten von 30 K und 40 K auf reduzierter SDS-PAGE im Vergleich zu 20 K des nicht umgesetzten GH erhalten. GH-GHBP-Komplex wird in gleicher Weise PEGyliert, um ein Derivat von 150 K durch Gelfiltration zu liefern.
Die PEGylierung mit N-Hydroxysuccinimidyl-PEG (NHS-PEG) und die Reinigung erfolgen durch Zugabe von NHS-PEG in einem fünffachen Molüberschuss der Gesamt-Lysinkonzentration von GH zu einer Lösung, die 2 mg/ml GH in 50 mM Natriumboratpuffer, pH 8,5, oder PBS, pH 7, enthält, und einstündiges Mischen bei Raumtemperatur. Die Produkte werden auf einer Superose 12-Größenausschlusssäule und/oder Mono Q von FPLC getrennt. Das PEGylierte GH variiert hinsichtlich der Größe je nach pH-Wert der Reaktion und reicht von etwa 300 K für den Reaktionslauf bei pH 8,5 bis zu 40 K für pH 7,0 (gemessen durch Gelfiltration). Der GH-GHBP-Komplex wird in gleicher Weise PEGyliert, wobei das resultierende Molekulargewicht von 400 bis 600 Kd (gemessen durch Gelfiltration) reicht.
Die PEGylierung der Cysteinmutanten von GH mit PEG-Maleimid erfolgt durch Bildung einer einzelnen Cysteinmutante von GH durch stellengerichtete Mutagenese, deren Sekretieren aus einem E. coli 16C9-Stamm (W3110 ΔE15 Δ(argF-lac)169 deoC2, der das deoC-Protein nicht produziert) und Reinigen auf einer Anionenaustausch-Säule.
Stamm 16C wurde genetisch konstruiert, indem das deoC2-Allel von Stamm CGSC#6092 (Nr. 6092, erhältlich beim E. coli Genetic Stock Center, New Haven, CN, USA; beschrieben von Mark et al., Molec. Gen. Genet. 155, 145–152 (1977)) mit Genotyp trxA1 recA1 ilvE720::tn5 met E70 deoC2 lacZ53 rha5 malB45 rpsL151) in einen als 7C1 bezeichneten stamm übertragen wurde.
Stamm 7C1 (mit dem Genotyp W3110 ΔtonA phoA ΔE15 Δ(argF-lac)169) wurde in verschiedenen Schritten unter Anwendung von Techniken, die Transduktionen mit Phage P1kc, abgeleitet aus P1 (J. Miller, Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor, NY, USA: Cold Spring Harbor Laboratory, 1972)), beinhalteten, und unter Anwendung von Transposon-Genetik (Kleckner et al., J. Mol. Biol. 116, 125– 159 (1977)) konstruiert. E. coli K12 W3110, das ein K12-Stamm ist, der F-, λ– ist (die Wildform ist F+ λ+) (Bachmann, Bact. Rev. 36, 525–557 (1972)) wurde als Anfangswirt verwendet.
Zunächst wurde das tonA-Gen (fhuA) (Kadner et al., J. Bact. 143, 256–264 (1980; Bachmann, Microbiol. Rev. 47, 180–230 (1983)) durch Insertion und anschließende unpräzise Exzision eines Tn10-Transposons in das tonA-Gen deletiert. Im ersten Schritt dieses Verfahrens wurde E. coli W3110 mit λ::Tn10 transduziert, um einen Tn10 Hop-Pool von E. coli W3110 zu erzeugen (Kleckner et al., J. Mol. Biol., s. o.).
Der E. coli W3110::Tn10 Hop Pool wurde in L-Brühe bei 37°C bis zu einer Zelldichte von etwa 1 × 10⁹/ml gezüchtet. Eine Gesamtmenge von 0,5 ml der Kultur wurde zentrifugiert und das Pellet in 0,2 ml eines λphi80-Lysats mit 7,0 × 10⁹ pfu resuspendiert. Der Phage wurde 30 Minuten lang bei 37°C adsorbiert. Die Suspension wurde dann auf EMB-Platten ausgebreitet, die mit Tetracyclin ergänzt waren (15 μg/ml). Nach der Inkubation über Nacht bei 37°C wurden die Kolonien in 3 ml L-Brühe gepoolt, über Nacht bei 37°C gezüchtet, zweimal gewaschen und in L-Brühe resuspendiert. Ein Bakteriphage-P1kc-Lysat wurde auf dieser Kultur gebildet (Miller, J. H., Experiments in Molecular Biology, s. o., S. 304).
E. coli AT982 (Nr. 4546, E. coli Genetic Stock Center, New Haven, CN, USA) wurde durch dieses P1kc-Lysat in Tetracyclin-Resistenz transduziert. Transduktanten wurden auf L-Brühe-Platten, ergänzt mit Tetracyclin (15 μg/ml und 40 ug/ml Diaminopimelinsäure (dap), ausgewählt. Die resultierenden Transduktanten wurden auf Tetracyclin-Resistenz und die Regeneration des dap-Gens (dap⁺, tet^R) gescreent. dap⁺, tet^R Transduktanten wurden dann auf λphi80-Resistenz getestet.
P1kc-Lysate wurden dann auf verschiedenen dap⁺, tet^R, λphi80-resistenten Stämmen gebildet. Die Lysate dienten dazu, E. coli W3110 in Tetracyclin-Resistenz zu transduzieren. Die Transduktanten wurden auf λphi80-Resistenz gescreent und selektiert.
Tetracyclin-sensitive Isolate wurden aus W"3110 tonA::Tn10-λphi80R-Transduktanten selektiert. Maloy und Nunn, J. Bacteriol. 145, 1110 (1981). Diese Isolate wurden auf λ80phi80-Resistenz und Tetracyclin-Sensitivität nach Einzelkoloniereinigung überprüft.
DNA wurde aus mehreren Tetracyclin-sensitiven λphi80-resistenten Mutanten isoliert und mit SstII verdaut. Die mit SstII-verdaute DNA wurde durch das Southern Blot-Verfahren unter Verwendung von radioaktiv markierter und mit SstII verdauter λ::Tn10-DNA als Sonde charakterisiert, um zu bestimmen, ob Tn10 exzidiert worden war. Davis et al., Advances Bacterial Genetics (Gold Spring Harbor Laboratory, NY, USA, 1980). Es wurde aufgezeigt, dass eines der Tetracyclin-sensitiven Isolate zwei der Tn10-Hybridisierungsbanden im Vergleich zur Hybridisierung zwischen DNA aus λ::Tn10 und dem Elternstamm W3110tonA::Tn10 λphi80R verloren hatte. Eine dritte Hybridisierungsbande besaß veränderte Mobilität – ein Indikator dafür, dass die durch unpräzise Exzision von Tn10 bewirkte Deletion eingetreten war.
SDS-Gel-Elektrophorese von äußeren Membranpräparaten aus dem Stamm mit einer unpräzisen Tn10-Exzision deckte auf, dass die Bande, von der man annahm, sie sei das TonA-Protein, geänderte elektrophonetische Mobilität im Vergleich zum TonA-Protein der Wildform aufwies. Das resultierende Protein war als λphi80-Phage-Rezeptorprotein nicht-funktionell. Ein zweiter unabhängiger Stamm, der ebenfalls unpräzise Exzision von Tn10 erfahren hatte, wies kein TonA-Protein auf dem SDS-Gel auf.
Keiner dieser Stämme wies Umkehr zur Tetracyclin-Resistenz oder λ80phi80-Suszeptibilität auf, was darauf schließen lässt, dass eine unpräzise Exzision des gesamten oder eines Teils des Tn10-Transposons gemeinsam mit partieller oder kompletter Deletion des tonA-Gens erfolgt war. Somit wurde das TonA-Protein (Molekulargewicht 78.000) aus der äußeren Membran eliminiert, wodurch der W3110 tonA-Stamm gegenüber verschiedenen Bakteriophagen resistent wurde.
Dann wurden zwei weitere Deletionsmutanten, phoA ΔE 15 (Sarthy et al., J. Bact. 145, 288–292 (1981) und Δ (argF-lac)-169 (Schweizer et al., Mol. Gen. Genet. 192, 293–294 (1983) durch genetische Verbindung mit einem Kanamycin-Resistenz-Transposon (insertiert in ein biosynthetisches Prolin-Gen (proC::Tn5)), gleichzeitig in W3110 tonA übertragen.
Das Transposon wurde durch Selektieren hinsichtlich einer spontanen prototrophen (pro⁺) Revertante auf auf Glucose-minimalen Agarplatten eliminiert. Die Einführung der phoA-Mutation wurde als Transduktanten erkannt, die weiße Kolonien auf Glucose-minimalen Agarplatten mit 0,2 mM Phosphat und 20 mg/l 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat bilden. Ebenso bewirkt die Δ(argF-lac)169-Mutation den Verlust des Enzyms β-Galactosidase und führt zu Zellen, die weiße Kolonien auf MacConkey-1% Lactose-Agarplatten bilden. Das Ergebnis war Stamm 7C1.
Schließlich wurde die deoC-Mutatin (Bachmann, s. o.) unter Entfernung der Aldolase in 7C1 eingeführt, wobei dies mittels eines aus mehreren Schritten bestehenden Verfahrens von Transduktionen unter Verwendung von Phage-P1kc erfolgte. Es wurden Standardverfahren zur Transduktion angewendet. Zunächst wurde Threonin-Auxotrophie in 7C1 eingeführt, um ein Mittel zur positiven Selektion transduzierter chromosomaler Segmente in der Region des doC-Gens bereitzustellen; dies fand wie folgt statt:
P1kc wurde auf einem Threonin-Auxotrophen gezüchtet, z. B. auf den Auxotrophen, die von Clare N. Berg und Douglas E. Berg, Microbiology-1981, Bacterial Transposons, Amer. Soc. for Microbiology, Washington, DC, USA, 107–116 (1981)) beschrieben sind.
Das resultierende Lysat diente zum Transduzieren von Stamm 7C1 zu Tetracyclin-Resistenz, wobei auf Transduktanten auf LB-Platten selektiert wurde, die 25 μg/ml Tetracyclin enthielten. Der resultierende Stamm mit der Bezeichnung 14A9 (tonAΔ, phoAΔE15 Δ(argF-lac)169 thr::tn10) revertierte spontan und mit hoher Frequenz zu Prototrophie, sodass Fusarsäureplatten (J. Bact. 145, 1110 (1981)) dazu dienen, einen stabilen Tetracyclin-sensitiven Threonin-Auxotrophen, den Stamm 16C4, zu selektieren.
P1kc wurde auf Stamm CGSC#6092, s. o., gezüchtet.
Das resultierende Lysat diente dazu, Stamm 16C4 zu Prototrophie zu transduzieren, wobei hier hinsichtlich Wachstum auf Glucose-minimalen Agarplatten selektiert wurde. Um ein mit hoher Frequenz transduzierendes Lysat aus dem Stamm 2D4 zu erhalten, musste der P1kC-Phage hinsichtlich Wachstum zweimal auf diesem Wirt zykliert werden. Fünf prototrophe Transduktanten des Stamms 16C4 wurden isoliert, gereinigt und auf Wachstum auf Thymidin-minimalen Agarplatten getestet. Vier von fünf dieser Isolate konnte auf Thymidin nicht wachsen und erhielt daher die deoC2-Mutation, die Synthese des deoC-Proteins eliminiert. Eines dieser vier Isolate wurde gerettet und als Stamm 16C9 bezeichnet (ΔtonA, phoA, ΔE15, Δ(argF-lac)169, deoC2).
PEG-Maleimid wird durch Umsetzen von Monomethoxy-PEG-amin mit Sulfo-MBs in 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,5, eine Stunde lang bei Raumtemperatur und Pufferaustausch zu Phosphatpuffer, pH 6,2, hergestellt. Als nächstes wird GH mit einem freien zusätzlichen Cystein eine Stunde lang beigegeben und das Endgemisch auf einer Mono Q-Säule wie beim mit Me-PEG-aldehyd PEGylierten GH getrennt.
Da Esterbindungen chemisch und physiologisch labil sind, kann es vorzuziehen sein, ein PEG-Reagens in der Konjugationsreaktion zu verwenden, das keine Esterfunktionalität enthält. Beispielsweise kann eine Carbamat-Bindung gebildet werden, in dem PEG-Monomethylether mit Phosgen umesetzt wird, um das PEG-Chlorformiat zu ergeben. Dieses Reagens könnte dann in glicher Weise wie der NHS-Ester verwendet werden, um Lysin-Seitenkettenamine zu funktionalisieren. In einem weiteren Beispiel wird eine Harnstoffbindung durch Umsetzen eines Amino-PEG-monomethylethers mit Phosgen geschaffen. Dies würde ein PEG-Isocyanat bilden, das mit Lysinaminen reagiert.
Eine bevorzugte Methode zur Herstellung von PEG-GH, das keinen spaltbaren Ester im PEG-Reagens enthält, ist die folgende: Methoxypoly(ethylenglykol) wird durch Titration mit Natriumnaphthalin in Carbonsäure umgewandelt, um das Alkoxid zu erzeugen, gefolgt von der Behandlung mit Bromethylacetat zur Bildung des Ethylesters, gefolgt von der Hydrolyse zur entsprechenden Carbonsäure durch Behandlung mit Natriumhydroxid und Wasser; siehe Brückmann et al., Macromol. Chem. 182, 1379–1384 (1981). Die resultierende Carbonsäure wird dann in einen für die Acylierung von GH geeigneten PEG-N-hydroxysuccinimidylester umgewandelt; dies erfolgt durch Reaktion der resultierenden Carbonsäure mit Dicyclohexylcarbodiimid und NHS in Ethylacetat.
Das resultierende NHS-PEG-Reagens wird dann mit 12 mg/ml GH unter Verwendung eines 30fachen Molüberschusses gegenüber GH in einem Natriumboratpuffer, pH 8,5, bei Raumtemperatur eine Stunde lang umgesetzt, auf eine Q Sepharose-Säule in Tris-Puffer aufgebracht und mit einem Salzgradienten eluiert. Dann wird es auf eine zweite Säule (Phenyl-Toyopearl), äquilibriert in 0,3 M Natriumcitratpuffer, pH 7,8, geladen. Das PEGylierte GH wird dann mit einem reversen Salzgradienten eluiert, gepoolt und mittels einer G25-Entsalzungssäule in einen Mannit-, Glycin- und Natriumphosphatpuffer, pH 7,4, pufferausgetauscht, um ein in geeigneter Weise formuliertes PEG7-GH zu erhalten.
Die PEGylierten GH-Moleküle und der GH-GHBP-Komplex können durch SDS-PAGE, Gelfiltration, NMR, tryptisches Kartieren, Flüssigchromatographie-Massenspek trophotometrie und biologischen in vitro-Test charakterisiert werden. Das Ausmaß der PEGylierung wird günstigerweise zuerst durch SDS-PAGE und Gelfiltration aufgezeigt und dann durch NMR analysiert (besitzt einen spezifischen Resonanzpeak für die Methylenwasserstoffe von PEG). Die Anzahl an PEG-Gruppen auf jedem Molekül kann anhand des NMR-Spektrums oder Massenspektrometrie errechnet werden. Polyacrylamidgel-Elektrophorese in 10% SDS erfolgt günstigerweise in 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl als Elutionspuffer. Um aufzuzeigen, welcher Rest PEGyliert ist, kann Trypsin-Kartierung durchgeführt werden. Somit wird PEGyliertes GH mit Trypsin bei einem Protein-Enzym-Verhältnis von 100 : 1 auf mg-Basis bei 37°C vier Stunden lang in 100 mM Natriumacetat, 10 mM Tris-HCl, 1 mM Calciumchlorid, pH 8,3, verdaut und auf pH < 4 angesäuert, um Verdau vor dem Trennen auf HPLC Nucleosil C-18 (4,6 × 150 mm, 5 μ, 100 Å) zu stoppen. Das Chromatogramm wird mit jenem des nicht-PEGylierten Ausgangsmaterials verglichen. Jeder Peak kann dann durch Massenspektrometrie analysiert werden, um die Größe des Fragments im Peak zu verifizieren. Das bzw. die Fragmente) mit PEG-Gruppen bleibt bzw. bleiben nach der Injektion üblicherweise nicht auf der HPLC-Säule und verschwindet bzw. verschwinden aus dem Chromatogramm. Ein solches Verschwinden aus dem Chromatogramm ist ein Indikator für die PEGylierung auf diesem bestimmten Fragment, das zumindest einen Lysinrest enthalten sollte. PEGyliertes GH kann dann mittels herkömmlicher Verfahren auf seine Fähigkeit untersucht werden, sich an den GHBP zu binden.
Die verschiedenen PEGylierungsverfahren erzeugten verschiedene Arten von PEGyliertem GH der Wildform mit scheinbaren Molekulargewichten von 35 K, 51 K, 250 K und 300 K durch Größenausschluss-Chromatographie (sollten an ihr natives hydrodynamisches Volumen heranreichen). Sie wurden als PEG1-GH, PEG2-GH, PEG3-GH bzw. PEG7-GH bezeichnet. Anhand der Ergebnisse der Trypsin-Kartierung erkannte man, dass in PEG-1-GH und PEG-2-GN das aus 9 Aminosäuren bestehende N-terminale Fragment aus dem Chromatogramm fehlte und möglicherweise PEGyliert war, was durch die Massenspektrometrie der großen molekularen Spe zies bestätigt werden konnte, die sich im Durchfluss des Flüssigchromatographen befanden. Anhand der Molekulargewichte auf SDS-PAGE kann PEG1-GH ein PEG auf dem N-terminalen Amin und das PEG2-GH zwei PEG-Moleküle auf dem N-terminalen Amin aufweisen, wodurch ein tertiäres Amid entsteht. Das PEG3-GH besitzt etwa fünf PEG-Gruppen pro Molekül (basierend auf dem NMR-Ergebnis) und auf der tryptischen Karte fehlten zumindest fünf Peptidfragmente, was den Schluss zulässt, dass sie PEGyliert sind. Man geht anhand der Massenspektrometrie davon aus, dass das PEG7-GH-Molekül sechs bis sieben PEG-Gruppen pro Molekül besitzt.
Die Stellen für die Zugabe von PEG-Gruppen zum GH – es handelt sich hier um bevorzugte Reste für eine derartige Konjugation – sind N-terminales Methionin oder Phenylalanin, Lysin 38, Lysin 41, Lysin 70, Lysin 140, Lysin 145, Lysin 158 und Lysin 168. Zwei Lysine, die nicht PEGyliert zu sein schienen, waren Lysin 115 und Lysin 172.
Das GH wird durch günstigerweise durch Retardsysteme verabreicht. Beispiele für hierin geeignete Depot- bzw. Retardzusammsnesetzungen sind halbdurchlässige Polymermatrizen in der Gestalt von Formteilen, z. B. Filme oder Mikrokapseln. Depotmatrizen sind z. B. Polylactide (US-Patent 3.773.919, EP 58.481 ), Copolymere von L-Glutaminsäure und γ-Ethyl-L-glutamat (Sidman et al., Biopolymers 22, 547–556 (1983), Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15, 167–277 (1981); Langer, Chem. Tech. 12, 98–105 (1982)), Ethylenvinylacetat (Langer et al., s. o.) oder Poly-D-(–)-3-hydroxybuttersäure ( EP 133.988 ) oder PLGA-Mikrokügelchen.
Depot-GH-Zusammensetzungen enthalten auch liposomal eingeschlossenes GH. Liposome mit GH werden durch an sich bekannte Verfahren hergestellt: DE 3.218.121 ; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688–3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030–4034 (1980); EP 52.322 ; EP 313.676; EP 88.046 ; EP 143.949 ; EP 142.641 ; JP-A 83-118008; US-Patente 4.485.045 und 4.544.545; und EP 102.324. Üblicherweise sind Liposome vom kleinen unilamellaren Typ (etwa 200–800 Å), worin der Lipidanteil mehr als etwa 30 Mol-% Cholesterin beträgt, wobei der ausgewählte Anteil so eingestellt ist, dass die Therapie optimiert werden kann. Außerdem kann eine biologisch aktive Depotformulierung aus einem Addukt des GH hergestellt werden, das kovalent an aktiviertes Polysaccharid gebunden ist (siehe US-Patent 4.857.505 vom 15. August 1989). US-Patent 4.837.381 beschreibt eine Mikrokügelchen-Zusammensetzung aus Fett oder Wachs oder ein Gemisch davon sowie GH für Retardzwecke.
In einer weiteren Ausführungsform werden die oben identifizierten Patienten mit einer wirksamen Menge an IGF-1 behandelt. Im Allgemeinen liegt die gesamte pharmazeutisch wirksame Menge an parenteral verabreichtem ITG-I pro Dosis im Bereich von etwa 50 bis 240 μg/kg/Tag, vorzugsweise 100 bis 200 μg/kg/Tag, Patientenkörpergewicht, obwohl – wie oben erwähnt – der therapeutische Handlungsspielraum des behandelnden Arztes sehr groß ist. Vorzugsweise wird IGF-I einmal oder zweimal pro Tag durch subkutane Injektion verabreicht.
Der IGF-1 kann durch jedes beliebige Mittel verabreicht werden, z. B. durch Injektionen (einzelne oder mehrere, z. B. 1-4/Tag) oder Infusionen. Wie im Fall von GH kann der IGF-I solcherart formuliert sein, dass er kontinuierlich im Behandlungsverlauf im Blut vorhanden ist. Er kann somit an einem Polymer befestigt oder zu einer Depotformulierung gebildet sein (s. o.).
Außerdem wird der IGF-I günstigerweise gemeinsam mit einem oder mehreren seiner Bindungsproteine verabreicht, z. B. mit den derzeit bekannten, d. h. IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-5 oder IGFBP-6. Der IGF-I kann zwecks Verabreichung auch an einen Rezeptor oder Antikörper oder Antikörperfragment gekoppelt sein. Das bevorzugte Bindungsprotein für IGF-I ist hierin IGFBP-3, das in US-Patent 5 258.287 sowie von Martin und Baxter, J. Biol. Chem. 261, 8754–8760 (1986) beschrieben ist. Dieses glykosylierte IGFBP-3-Protein ist eine säurestabile Komponen te von etwa 53 Kd auf einem nicht-reduzierenden SDS-PAGe-Gel eines 125–150 Kd-Glykoprotein-Komplex, der sich in menschlichem Plasma befindet, die meisten endogenen IGF aufweist und auch durch GH reguliert wird.
Die Verabreichung des IGF-Bindungsproteins mit IGF-I kann gemäß dem Verfahren von US-Patent 5.187.151 erfolgen. Zusammenfassend gesagt werden IGF-I und IGFBP in wirksamen Mengen durch subkutane Bolusinjektion in einem Molverhältnis von etwa 0,5 : 1 bis etwa 3 : 1, vorzugsweise von etwa 1 : 1, verabreicht.
In einer weiteren Ausführungsform können sowohl IGF-I als auch GH an den Patienten in wirksamen Mengen oder jeweils in Mengen, die suboptimal, aber in Kombination wirksam sind, verabreicht werden. Vorzugsweise betragen solche Mengen etwa 50 bis 100 μg/kg/Tag IGF-1 und etwa 0,3 mg/kg/Woche GH. Vorzugsweise erfolgt die Verabreichung von IGF-I und GH über Injektion, z. B. auf intravenösem oder subkutanem Weg. Noch bevorzugter erfolgt die Verabreichung sowohl für IGF-I als auch für GH durch subkutane Injektion, vorzugsweise durch tägliche Injektionen.
Es ist zu beachten, dass Praktiker, die Dosen von IGF-I und GH festlegen, die bekannten Nebenwirkungen der Behandlung mit diesen Hormonen berücksichtigen sollten. Im Fall von GH umfassen die Nebenwirkungen Natriumretention und Expansion des extrazellulären Volumens (Ikkos et al., Acta Endocrinol. (Copenhagen) 32, 341–361 (1959); Biglieri et al., J. C. E. M. 21, 361–370 (1961)) sowie Hyperinsulinämie und Hyperglykämie. Die auffälligste Nebenwirkung von IGF-1 ist Hypoglykämie. Guler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 2868–2872 (1989). Die Kombination von IGF-1 und GH kann zu einer Verringerung unerwünschter Nebenwirkungen beider Mittel (z. B. Hypoglykämie für IGF-I und Hyperinsulinämie für GH) und zu einer Wiederherstellung der Blutspiegel von GH, dessen Sekretion durch IGF-I unterdrückt wird, führen.
Für die parenterale Verabreichung werden in einer Ausführungsform IGF-1 und GH im Allgemeinen formuliert, indem beide im erwünschten Reinheitsgrad in einer in Dosierungseinheiten injizierbaren Form (Lösung, Suspension oder Emulsion) mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger vermischt werden, d. h. einem, der für die Rezipienten in den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nicht-toxisch ist und mit den anderen Komponenten der Formulierung verträglich ist. Beispielsweise enthält die Formulierung vor keine Oxidationsmittel und andere Verbindungen, die bekanntermaßen für Polypeptide schädlich sind.
Im Allgemeinen werden die Formulierungen durch gleichmäßiges und enges In-Kontakt-Bringen des IGF-I und GH mit flüssigen Trägern und/oder feinteiligen festen Trägern hergestellt. Falls erforderlich, wird das Produkt zur erwünschten Formulierung geformt. Vorzugsweise ist der Träger ein parenteraler Träger, noch bevorzugter eine Lösung, die mit dem Blut des Rezipienten isotonisch ist. Beispiele für solche Trägervehikel sind Wasser, Salzlösung, Ringer-Lösung und Dextroselösung. Nichtwässrige Vehikel wie z. B. fixierte Öle und Ethyloleat sind hierin ebenso wie Liposomen auch geeignet.
Der Träger enthält günstigerweise kleine Mengen an Additiven wie z. B. Substanzen, die die Isotonie und chemische Stabilität steigern. Solche Materialien sind für Rezipienten bei den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nicht-toxisch und enthalten Puffer wie z. B. Phosphat, Citrat, Succinat, Essigsäure und andere organische Säuren oder ihre Salze; Antioxidanzien wie z. B. Ascorbinsäure; niedermolekulare (d. h. weniger als etwa zehn Reste umfassende) Polypeptide, z. B. Polyarginin oder Tripeptide; Proteine wie z. B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere wie z. B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren wie z. B. Glycin, Glutaminsäure, Asparaginsäure oder Argini; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, z. B. Cellulose oder ihre Derivate, Glucos, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner wie z. B. EDTA; Zuckeralkohole wie z. B. Mannit oder Sorbit; Gegenio nen wie z. B. Natrium; und/oder nicht-ionische Tenside wie z. B. Polysorbate, Poloxamere oder PEG.
IGF-I und GH werden typischerweise individuell in solchen Vehikeln in einer Konzentration von etwa 0,1 mg/ml bis 100 mg/ml, vorzugsweise 1–10 mg/ml, mit einem pH-Wert von etwa 4,5–8 formuliert. IGF-1 voller Länge wird vorzugsweise mit einem pH-Wert von etwa 5–6 formuliert, und des(1-3)-IGF-I wird vorzugsweise mit einem pH-Wert von etwa 3,2–5 formuliert. GH wird vorzugsweise mit einem pH-Wert von 7,4– 7,8 formuliert. Es ist zu beachten, dass die Verwendung bestimmter der obigen Exzipienten, Träger oder Stabilisatoren zur Bildung von IGF-I- oder GH-Salzen führt.
Während GH durch jedes zweckmäßige Verfahren formuliert werden kann, sind die bevorzugten Formulierungen für GH wie folgt: Für met-GH (Markenname Protropin^®) enthält die vorlyophilisierte Gesamtlösung 2,0 mg/ml met-GH, 16,0 mg/ml Mannit, 0,14 mg/ml Natriumphosphat und 1,6 mg/ml Natriumphosphat (einbasiges Monohydrat), pH 7,8. Das 5 mg-Fläschchen met-GH enthält 5 mg met-GH, 40 mg Mannit und 1,7 mg Gesamt-Natriumphosphat (Trockengewicht) (zweibasig wasserfrei), pH 7,8. Das 10 mg-Fläschchen enthält 10 mg met-GH, 80 mg Mannit und 3,4 mg Gesamt-Natriumphosphat (Trockengewicht) (zweibasig wasserfrei), pH 7,8. Für metloses GH (Markenname Nutropin^®) enthält die vorlyophilisierte Gesamtlösung 2,0 mg/ml GH, 18,0 mg/ml Mannit, 0,68 mg/ml Glyin, 0,45 mg/ml Natriumphosphat und 1,3 mg/ml Natriumphosphat (einbasiges Monohydrat), pH 7,4. Das 5 mg-Fläschchen enthält 5 mg GH, 45 mg Mannit, 1,7 mg Glycin und 1,7 mg Gesamt-Natriumphosphate (Trockengewicht) (zweibasig wasserfrei), pH 7,4. Das 10 mg-Fläschchen enthält 10 mg GH, 90 mg Mannit, 3,4 mg Glycin und 3,4 mg Gesamt-Natriumphosphate (Trockengewicht) (zweibasig wasserfrei).
Alternativ dazu kann eine flüssige Formulierung für Nutropin^®-hGH verwendet werden, z. B.: 5,0 ± 0,5 mg/ml rhGH; 8,8 ± 0,9 mg/ml Natriumchlorid; 2,0 ± 0,2 mg/ml Polysorbat 20; 2,5 ± 0,3 mg/ml Phenol; 2,68 ± 0,3 mg/ml Natriumcitratdihydrat; und 0,17 ± 0,02 mg/ml Citronensäure wasserfrei (die Gesamtmenge von wasserfreiem Natriumcitrat/Citronensäure beträgt 2,5 mg/ml oder 10 mM); pH 6,0 ± 0,3. Diese Formulierung wird günstigerweise in ein 10 mg-Fläschchen gefüllt, das eine 2,0 ml-Füllung der obigen Formulierung in einem 3 cm³-Glasfläschchen ist. Alternativ dazu kann eine 10 mg-Patrone (2 ml) mit der obigen Formulierung in einen Injektionsstift gesetzt werden, damit dem Patienten flüssiges GH injiziert werden kann.
Während IGF-I in jeder zur Verabreichung geeigneten Weise formuliert sein kann, enthält die bevorzugte Formulierung etwa 2–20 mg/ml IGF-1, etwa 2–50 mg/ml eines Osmolyten, etwa 1–15 mg/ml eines Stabilisators und eine gepufferte Lösung mit einem pH-Wert von etwa 5–5,5. Vorzugsweise ist der Osmolyt ein anorganisches Salz bei einer Konzentration von etwa 2–10 mg/ml oder ein Zuckeralkohol bei einer Konzentration von etwa 40–50 mg/ml, der Stabilisator ist Benzylalkohol oder Phenol oder beides, und die gepufferte Lösung ist eine Essigsäuresalz-gepufferte Lösung. Noch bevorzugter ist der Osmolyt Natriumchlorid und das Essigsäuresalz Natriumacetat. Noch bevorzugter beträgt die Menge an IGF-1 etwa 8–12 mg/ml, die Menge an Natriumchlorid etwa 5–6 mg/ml, die Menge an Benzylalkohol etwa 8–10 mg/ml, die Menge an Phenol etwa 2–3 mg/ml und die Menge an Natriumacetat etwa 50 mM, so dass der pH-Wert etwa 5,4 beträgt. Außerdem kann die Formulierung etwa 1–5 mg/ ml eines Tensids, vorzugsweise Polysorbat oder Poloxamer, in einer Menge von etwa 1–3 mg/ml enthalten.
Überdies kann IGF-I und GH, vorzugsweise IGF-I voller Länge, gemeinsam in einem geeigneten Trägervehikel formuliert sein, um eine pharmazeutische Zusammensetzung zu bilden, die vorzugsweise keine Zellen enthält. In einer Ausführungsform hängt der für die Formulierung verwendete Puffer davon ab, ob die Zusammensetzung unmittelbar nach dem Mischen verwendet oder zwecks späterer Verwendung gelagert wird.
Wenn das Gemisch von IGF-I voller Länge und GH unmittelbar nach dem Vermischen verwendet wird, kann es in Mannit, Glycin und Phosphat, pH 7,4, formuliert sein. Wenn das Gemisch gelagert werden soll, ist es in einem Puffer mit einem pH-Wert von etwa 6, z. B. Citrat, mit einem Tensid formuliert, das die Löslichkeit des GH bei diesem pH-Wert erhöht, z. B. 0,1% Polysorbat 20 oder Poloxamer 188. Das Endpräparat kann eine stabile Flüssigkeit oder ein lyophilisierter Feststoff sein.
Die bevorzugte kombinierte Zusammensetzung umfasst IGF-I und GH in einem Gewichtsverhältnis von IGF-I : GH von zwischen 1 : 1 und 100 : 1 (w/w), etwa 0,05–0,3 mM eines Osmolyten, etwa 0,1–10 mg/ml eines Stabilisators, etwa 1–5 mg/ml eines Tensids und etwa 5–100 mM eines Puffers mit einem pH-Wert von etwa 1–5. Vorzugsweise ist der Osmolyt ein anorganisches Salz und das Tensid nicht-ionisch. Noch bevorzugter ist das anorganische Salz Natriumchlorid oder Kaliumchlorid, der Stabilisator ist Phenol oder Benzylalkohol, das Tensid ist Polysorbat oder Poloxamer, der Puffer ist Natriumacetat oder Natriumcitrat oder beides, und die Mengen an IGF-I und GH betragen etwa 2–20 mg/ml bzw. 0,2–10 mg/ml, wobei das Gewichtsverhältnis zwischen IGF-I und GH von etwa 1 : 1 bis 50 : 1 reicht. Noch bevorzugter beträgt die Menge an IGF-1 etwa 5–10 mg/ml, die Menge an GH beträgt etwa 1–5 mg/ml, das Gewichtsverhältnis zwischen IGF-I und GH reicht von etwa 1 : 1 bis 4 : 1, die Menge an Natriumchlorid beträgt etwa 5–7 mg/ml, die Menge an Phenol beträgt etwa 0,1–3 mg/ ml, die Menge an Benzylalkohol beträgt etwa 6–10 mg/ml, das Tensid ist Polysorbat und liegt in einer Menge von etwa 1–3 mg/ml vor, die Menge an Natriumacetat beträgt etwa 2,5–4 mg/ml, und die Menge an Natriumcitrat beträgt etwa 0,1–1 mg/ml.
Zur therapeutischen Verabreichung zu verwendender IGF-I und GH sind vorzugsweise steril. Die Sterilität wird durch Filtration durch sterile Filtrationsmembranen (z. B. 0,2 μm-Membranen) erreicht. Therapeutische IGF-1- und GH-Zusammensetzungen werden im Allgemeinen in einen Behälter mit steriler Zugangsöffnung gefüllt, z. B. einen Beutel für intravenöse Lösungen oder ein Fläschchen mit einem Stopfen, den eine Nadel zur subkutanen Injektion durchstechen kann.
IGF-1 und GH werden üblicherweise in Einzel- oder Mehrfachdosisbehältern, z. B. in abgedichteten Ampullen oder Fläschchen, als wässrige Lösung oder als lyophilisierte Formulierung zur Rekonstitution gelagert. Als Beispiel einer lyophilisierten Formulierung werden 10 ml-Fläschchen mit 5 ml sterilfiltrierten 1% (w/v) wässrigen IGF- und GH-Lösungen befällt und das resultierende Gemisch lyophilisiert. Die Infusionslösung wird durch Rekonstituieren des lyophilisierten IGF-1 und GH unter Verwendung von bakteriostatischem Water-for-Injection hergestellt.
Die Erfindung wird nun unter Bezugnahm auf die folgenden Beispiele näher erläutert. Sie schränken allerdings den erfindungsgemäßen Schutzumfang keinesfalls ein. Alle Literatur- und Patentangaben sind hierin ausdrücklich durch Verweis aufgenommen.
Beispiel 1
In diesem Beispiel wurden die Serumkonzentrationen von GHBP in einer großen Anzahl an Proben aus kleinwüchsigen Kindern mit definierter Ätiologie ihres Wachstumsversagens (GHD oder TS) oder ISS gemessen und mit den GHBP-Spiegeln in normalen Vergleichspersonen verglichen.
Vergleichspersonen
Um den normalen Bereich für GHBP in Serum festzulegen, wurden die Proben aus 773 Kindern, 366 Mädchen und 407 Jungen, analysiert. Das Alter reichte von 3 bis 16 Jahren; in einigen Fällen wurde das Alter eines bestimmten Probanden auf- bzw. abgerundet. Die Mehrheit der Proben stammten aus einer normalen Population im Schulkinderalter; die Proben wurden durch ein Screening-Programm für die Detektion von Antikörpern gegenüber β-Zellen gezogen (Pasco Co. School System, FL, USA), und weitere Proben wurden freundlicherweise von Dr. Juan Sotos vom Children's Hospital of Columbus, OH, USA sowie von Dr. Rebecca Kirkland vom Baylor College of Medicine, Houston, TX, USA zur Verfügung gestellt. Die Kinder waren gesund, und man kann davon ausgehen, dass sie einen Querschnitt der amerikanischen Bevölkerung in Hinblick auf Körperwuchs darstellen.
Probanden mit Wachstumsverlangsamung
Serumproben aus Kindern mit Wachstumsverlangsamung (1 bis 17 Jahre alt) wurden anlässlich einer Anfangsbewertung von 776 Probanden gezogen, die an der Kontrollstudie nach der Vermarktungsphase, der NCGS, teilnahmen. Die Proben stammten von 106 der an dieser Studie beteiligten Zentren.
Alle analysierten Kinder mit GHD und ISS besaßen eine Körpergröße, die 2 oder mehr SDS unter dem Mittel für ihr Alter und Geschlecht lag. Die Probanden wurden von ihrem behandelnden Arzt als GHD-Patienten eingestuft. Keines der Kinder mit GHD wies maximale stimulierte oder endogene GH-Spiegel über 10 μg/l auf (Daten vom behandelnden Arzt mittels eines unspezifierten Tests erhoben oder bei Genentech, Inc. mittels eines doppelten monoklonalen immunradiometrischen Tests (Tandem-R HGH, Hybritech, San Diego, CA, USA) gemessen). Probanden mit organischer Ursache für GHD, z. B. mit Tumoren des Zentralnervensystems (ZNS), waren ausgeschlossen.
Als ISS in der NCGS-Datenbank klassifizierte Patienten wurden entweder vom behandelnden Arzt als solches bezeichnet (unter Angabe verschiedener Ausdrücke), oder sie besaßen einen stimulierten oder endogenen GH-Spiegel > 10 μg/l ohne organische Ätiologie der Kleinwüchsigkeit. Patienten mit TS wurden vom behandelnden Arzt als solches identifiziert, wobei diese Gruppe Patienten mit verschiedenen Formen von Mosaizismus umfasst. Keiner der in der Studie aufgenommenen Probanden hatte vorher eine Art der GH-Therapie erfahren.
GHBP-Messungen
GHBP wurde wie oben beschrieben durch LIFA gemessen. Zusammenfassend gesagt wurden 96-Napf-Mikrotiterplatten (Corning Glass Works, Corning, NY, USA) mit einem gegen GHBP gerichteten monoklonalen Antikörper (MAb 263, Agen, Australien) bestrichen, indem über Nacht Inkubation bei 4°C mit 100 μl/Napf Antikörper bei 10 g/ml in 50 mMol/l Carbonatpufter, pH 9,6, erfolgteμ. Die bestrichenen Näpfe wurden mit 150 μl PBS, pH 7,2, umfassend Rinderserumalbumin (BSA) (5 g/l), blockiert und gewaschen. Standards (rekombinantes hGHBP) oder Proben (50 μl/Napf) wurden gemeinsam mit 50 μl/Napf rekombinantem hGH (200 μg/l; Genentech, Inc.) und Mäuse-Immunglobulin G (10 g/l; Fitzgerald Industries, Chelmsford, MA, USA) in die beschichteten Näpfe eingebracht.
Die Platten wurden abgedichtet, bei Raumtemperatur 2 h lang unter leichtem Schütteln inkubiert und vor der Zugabe eines mit Meerrettich-Peroxidase konjugierten monoklonalen Anti-GH-Antikörpers (MAb MCB, Genentech, Inc.; 100 μl/Napf) gewaschen. Nach einer weiteren zweistündigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Platten sechs Mal mit Waschpuffer gewaschen. Frisch gebildete Substratlösung (0,4 g o-Phenylendiamindihydrochlorid in 1 l PBS plus 0,4 ml 30% Wasserstoffperoxid) wurde den Platten zugesetzt (100 μl/Napf) und die Inkubation im Dunkeln 15 min lang bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 100 μl 2,25 Mol/l Schwefelsäure abgebrochen und die Extinktion bei 490 nm bestimmt. Der Detektionsbereich im LIFA betrug 15,6–1000 pMol/l. Die Intra- und Interassay-Variationskoeffizienten betrugen etwa 7 bzw. 11%. Ale Proben wurden in Doppelbestimmungen gemessen.
GH-Messungen
Um spontane GH-Sekretion in unterschiedlichen Gruppen zu bewerten, wurden GH-Konzentrationen in Serumproben gemessen, die in 20-Minuten-Intervallen 12 h lang (8:00 bis 20:00) aus 851 Kindern gezogen wurden. Es wurden die Mittelwerte für jeden Probanden errechnet. GH-Konzentrationen wurden unter Anwendung des Antikörperbasierten immuniadiometrischen Assays (IRMA) mit einer Detektionsgrenze von 0,5 ug/l gemessen (Tandem-R, HGH, Hybritech).
IGF-I-Messungen
Die IGF-I-Konzentrationen wurden in Serumproben gemessen, die aus 858 Kindern zu Beginn während der über Nacht durchgeführten GH-Probenentnahme gezogen wurden; dabei kam ein RIA nach Säureethanol-Extraktion (IGF-I RIA Kit, Nichols Institute, San Juan Capistrano, CA, USA) zur Anwendung.
Statistische Analyse
Der standardisierte Körpergrößen-Score (SDS) wurde anhand des alters- und geschlechtsspezifischen Mittelwerts und der Standardabweichungen errechnet, die aus den normativen Daten für amerikanische Kinder des National Center for Health Statistics (HCHS) abgeleitet sind. Hamill et al., Am. J. Clin. Nutrition 32, 607–629 (1979). Der Body Mass Index (BMI) wurde unter Heranziehung der folgenden Formel errechnet: Gewicht (kg)/[Körpergröße (m)]². Die Mittel- und SD-Werte für Alter, Körpergrößen-SDS und BMI für Kinder mit Wachstumsverzögerung wurden anhand der in den NCGS-Studienaufnahmeblättern erhobenen Daten errechnet.
Die Mittelwerte und Standardabweichungen für GHBP-Konzentrationen (Tabellen 1 und III) sowie für mittlere 12-Stunden-GH-Konzentrationen (Tabelle IV) wurden nach log-Transformation infolge der Datenverzerrung errechnet. Die Antilog-Werte des Mittelwerts, des Mittelwerts ±2 SD (GHBP, Tabelle I) und des Mittelwerts ±1 SD (GHBP, Tabelle III sowie mittleres 12-h-GH, Tabelle IV) wurden dann errechnet, um die angeführten Werte zu ergeben. Die Einflüsse von Alter und Geschlecht auf log- GHBP-Konzentrationen in der Vergleichsgruppe wurden durch Varianzanalyse ermittelt (ANOVA).
Die Berechnung standardisierter GHBP-Werte (SDS) basierte auf den Mittelwerten und assoziierten SD-Werten aus den Daten der Vergleichsprobanden, gruppiert nach Geschlecht und Alter, und erfolgte mittels der unten angeführten Formel. Für eine GHBP-Konzentration in einem Individuum im Alter von 3–15 Jahren (der Altersbereich, für den die Vergleichsproben zur Verfügung standen)
worin Mittelwert (log (GHBP) | Alter, Geschlecht) der durchschnittliche log-Wert von GHBP für Vergleichspersonen des gleichen Alters und Geschlechts wie das Individuum ist und SD (log (GHBP) | Alter, Geschlecht) der assoziierte SD-Wert ist. Nach der Umwandlung in SDS wurden die GHBP-Konzentrationen in Kindern mit GHD-, ISS- und TS-Diagnose miteinander und mit Vergleichspersonen des gleichen Geschlechts mittels ANOVA verglichen. Der GHBP-SDS wurde auch auf der Basis des Knochenalters anstelle des chronologischen Alters errechnet.
Beim Vergleichen zwischen den Gruppen bezüglich verschiedener Variablen wurden Bonferroni-Einstellungen der p-Werte für die statistische Signifikanz durchgeführt, um einen Gesamtwert der Signifikanz von 0,05 für den Test aufrechtzuerhalten. Nominale p-Werte für die signifikanten statistischen Vergleiche sind im Text enthalten.
Ergebnisse
Der normale Bereich (Mittlwert ± 2 SD) für Serum-GHBP-Konzentrationen in Kindern zwischen 3 und 15 Jahren ist aus Tabelle I ersichtlich. Infolge technischer Probleme stehen die Daten für Kinder von 5 Jahren nicht zur Verfügung. Sowohl das After als auch das Geschlecht hatte auf die GHBP-Konzentrationen eine maßgebliche Auswir kung. Mädchen hatten höhere GHBP-Konzentrationen als Jungen (p < 0,0001). Bei beiden Geschlechtern nahmen die GHBP-Konzentrationen mit dem Alter zu (p < 0,0001).
Tabelle 1 Normaler Bereich für Serum-GHBP-Konzentration (pMol/l)
Tabelle II zeigt die Mittelwerte (±SD) für das Alter, den Körpergrößen-SDS und den BMI für jede Gruppe von Probanden (die Daten betreffend die Körpergröße und BMI standen nicht für alle Vergleichsprobanden zur Verfügung). Das mittlere Alter war in allen Gruppen ähnlich (etwa 11 Jahre). Die mittleren Körpergrößen-SDS-Werte waren unter den weiblichen GHD-, ISS- und TS-Testpersonen oder den männlichen GHD- und ISS-Testpersonen statistisch nicht unterschiedlich. Die mittleren BMI-Werte waren in den ISS-Gruppen im Vergleich zu den anderen Gruppen mit Wachstumsverzögerung sowohl bei den Mädchen (p = 0,0137) als auch bei den Jungen (p < 0,0001) signifikant niedriger.
Tabelle II Alter, Körpergrößen-SDS und BMI (Mittelwert ± SD)
Die 1A–1E zeigen die Serum-GHBP-Konzentrationen in einzelnen Kindern mit GHD, ISS und TS im Vergleich zum normalen Bereich für das gleiche Geschlecht (–2SD bis +2SD). Die entsprechenden mittleren GHBP-Konzentrationen und mittleren SDS-Werte in allen Gruppen sind in Tabelle III angeführt.
Im Fall von Jungen mit GHD oder ISS war der mittlere GHBP-SDS niedriger als jener der männlichen Vergleichsprobanden (beide Male p < 0,0001), und der mittlere SDS war bei Jungen mit ISS niedriger als jener von Jungen mit GHD (p < 0,0001). Der mittlere SDS für Mädchen mit ISS und GHD war niedriger als jener von weiblichen Vergleichsprobanden (p < 0,0001 bzw. p = 0,0046). Außerdem war der mittlere SDS bei Mädchen mit ISS niedriger als bei Mädchen mit GHD (p = 0,0039). Wenn die GHD-Gruppen auf Probanden mit maximal stimulierten GH-Spiegeln = 5 μg/l beschränkt waren (n = 23), war der GHBP-SDS vom Vergleichsmittel nicht deutlich unterschiedlich.
Aufgrund von Differenzen im BMI zwischen den GHD- und ISS-Gruppen und der anerkannten Beziehung zwischen BMI- und GHBP-Werten erfolgte eine ANCOVA unter Verwendung von BMI als Co-Variante, um zu bestimmen, ob die Unterschiede der GHBP-Werte zwischen den Gruppen von den BMI-Differenzen abhängen oder nicht. Sowohl bei Jungen als auch bei Mädchen blieben die Differenzen des GHBP zwischen den GHD- und der ISS-Gruppen signifikant (p < 0,02).
In 91% der männlichen ISS-Versuchspersonen und 92% der weiblichen (SS-Versuchspersonen lagen die GHBP-Konzentrationen unter dem Mittelwert von Vergleichspersonen des gleichen Alters und Geschlechts. Die Differenz zwischen ISS- und GHD-Probanden war besonders bei Jungen auffällig, wo 79 von 394 (20,1%) der Jungen mit ISS Werte > 2 SDS unter dem Mittel aufwiesen (gegenüber nur 6 von 69 (8,7%) Jungen mit GHD).
Im Gegensatz zu den Mädchen mit GHD oder ISS unterschied sich der mittlere GHBP-SDS in Kindern mit TS nicht signifikant von jenem der weiblichen Vergleichspersonen. GHBP-SDS, errechnet für alle Gruppen mit Wachstumsverzögerung auf Basis des Knochenalters und nicht des chronologischen Alters, zeigte geringe Unterschiede (Tabelle III).
Tabelle III Serum-GHBP-Konzentrationen (pMol/l)

n/a: keine Daten
CA: chronologisches Alter
BA: Knochenalter

Für mittlere GH-Konzentrationen, erhalten während 12-stündiger GH-Probennahme über Nacht (Tabelle IV), zeigte ANCOVA mit Ätiologie, Geschlecht und Alter, dass nur die Ätiologie einen signifikanten Einfluss auf den mittleren 12-stündigen GH-Spiegel hat. Wie erwartet, war der Mittelwert bei Kindern mit GHD signifikant niedriger als jener von Vergleichspersonen (p < 0,0001). Der Wert für Mädchen mit TS war höher als jener für Mädchen mit GHD (p < 0,001) und niedriger als jener für Mäd chen mit ISS oder weibliche Vergleichspersonen (jeweils p < 0,002). Die mittlere 12-Stunden-GH-Konzentration in Probanden mit ISS unterschied sich statistisch nicht von jenem der Vergleichspersonen. Doch ISS-Probanden mit GHBP-Werten > 2SD unter dem Mittelwert besaßen höhere mittlere 12-Stunden-GH-Werte als jene mit normalen GHBP-Spigel (2,8 gegenüber 2,3 μg/l, p < 0,005). Die mittleren IGF-I-Werte waren in GHD-Patienten am niedrigsten und waren niedriger als die Vergleichswerte für ISS- und TS-Patienten.
Tabelle IV Mittlere 12-Stunden-GH- und IGF-I-Konzentrationen (μg/l)
Die Serum-GHBP-Konzentrationen sind bei einigen Kindern mit ISS niedriger als jene bei Vergleichspersonen des gleichen Altern. Im Vergleich zu den Vergleichspersonen wiesen Kinder mit GHD auch niedrigere GHBP-Konzentrationen auf, doch die Reduktion war weniger stark ausgeprägt als bei Kindern mit ISS. Bei Mädchen mit TS, einem Zustand, dessen Diagnose auf der Gegenwart einer chromosomalen Anomalie beruht und daher absolut ist, warn die GHBP-Werte von jenen der Vergleichsgruppe nicht unterschiedlich – ein Indikator dafür, dass die GHBP-Werte nicht einfach mit Kleinwüchsigkeit korrelieren.
Zusätzlich zu geografisch und genetisch gut definierten Populationen mit eingeschränkter peripherer GH-Wirkung, z. B. Patienten mit Laron-Syndrom und afrikanische Pygmäen, gibt es Probanden mit subtileren Formen von GH-Unempfindlichkeit, die am wahrscheinlichsten eine Vielzahl molekularer Defekte darstellen. Trotz der wahrscheinlichen Heterogenität der Ursachen für die Wachstumsverzögerung bei Kindern mit ISS zeigen die obigen Ergebnisse, dass sie als Gruppe reduzierte Serum-GHBP-Konzentrationen aufweisen, wobei eine signifikante Untergruppe (20 %) GHBP-Werte von 2 SD oder mehr unter dem normalen Mittel für ihr Alter und Geschlecht aufweist.
Die untersuchten Kinder mit ISS unterschieden sich hinsichtlich der GH-Sekretion nicht von der Vergleichsgruppe und besaßen deutlich niedrigere GHBP-Konzentrationen als die Gruppe mit GHD. Als GHD definierte Patienten (die Basis dafür war ein willkürlicher Cutoff von maximalem GH < 10 μg/l) wiesen einen niedrigeren GHBP-Spiegel auf als Vergleichsprobanden. Doch bei GHD-Patienten mit maximalem GH = 5 μg/l war der mittlere GHBP-SDS höher als jener in der GHD-Gruppe mit GH > 5 μg/l und unterschied sich nicht von jenem der Vergleichsprobanden.
Beispiel 2
Die Patienten, die in einer nach der Vermarktung durchgeführten Kontrollstudie, der National Cooperative Growth Study (NCGS), beobachtet wurden, wurden untersucht, um die Wachstumsraten von GHD-Patienten mit jenen von ISS-Patienten zu vergleichen, die man mit verschiedenen GH-Dosen behandelte. Die ISS-Patienten umfas sen sowohl jene mit normalem GHBP-Spiegel als auch jene mit niedrigem GHBP-Spiegel. Die rgebnisse der ISS-Patienten (siehe 2) zeigen, dass eine deutlich höhere Wachstumsrate bei Kindern erzielt wurde, die mit 0,25 ± 0,025 mg/kg/Woche GH behandelt wurden, als bei jenen, die mit 0,20 mg/kg/Woche oder weniger behandelt wurden. Der Vergleich mit den GHD-Patienten macht deutlich, dass die normalen GH-Dosen von bis zu 0,20 mg/kg/Woche nicht ausreichten, um den Patienten einen mittleren Wachstumsraten-Bereich zu ermöglichen, der an jenen der GHD-Patienten heranreicht. Dosen von 0,25 ± 0,025/mg/kg/Woche führten jedoch zu einer mittleren Wachstumsrate, die näher an den Bereich bei GHD-Patienten heranreicht (etwa 10 cm/Jahr). Somit ist die GH-Dosis von mehr als etwa 0,20 mg/kg/Woche für zumindest einige der hierin identifizierten Patienten günstig.
Beispiel 3
Patienten mit ISS (definiert durch einen maximalen GH-Spiegel > 10 μg/l und einen Körpergrößen-SDS < –2) besitzen gegenüber normalen Vergleichsprobanden einen niedrigen GHBP-Spiegel (bestimmt durch LIFA). Dies war bei kleinwüchsigen Kindern mit GHD oder TS nicht der Fall.
Um die Nützlichkeit des GHBP-Tests bei der Klassifizierung kleinwüchsiger Kinder zu beurteilen, wurden ISS-Patienten je nach ihrem GHBP-SDS gruppiert. Patienten mit niedrigem GHBP-SDS, definiert als < –2, wurden mit Patienten mit normalem GHBP-Spiegel (GHBP-SDS > –2) verglichen, um zu bestimmen, ob Hinweise auf beeinträchtigte Empfindlichkeit gegenüber GH-Behandlung in der ersteren Gruppe vorliegen.
Patientenpopulation
Es wurden Serumproben an 96 Stellen aus 511 Kindern mit ISS gezogen, die anschließend mit Protropin^®-hGH behandelt wurden (die mittlere ± SD-Dosis von GH betrug 0,26 ± 0,07 mg/kg/Woche und wurde durch parenterale Injektion an Patienten mit 1-Jahres-Wachstumsdaten verabreicht, wobei die GH-Dosierung und deren Zeitplan im Ermessensspielraum des jeweiligen klinischen Forschers liegt) und Aufnahme in die NCGS fanden. Um in diese Studie aufgenommen zu werden, mussten die Patienten einen maximal stimulierten GH-Spiegel > 10 μg/l, einen Körpergrößen-SDS = –2 besitzen und durften keine andere bekannte Ätiologie von Kleinwüchsigkeit aufweisen. Die Ergebnisse der GHBP-Messungen waren vor dem Einsetzen der GH-Therapie nicht bekannt. Für Analysen mit Wachstumsreaktionen, die während der GH-Behandlung zu beobachten waren, wurden nur präpubertäre Patienten zugelassen.
Testverfahren
GHBP wurde unter Einsatz des LIFA untersucht, wie dies von Carlsson et al., s. o., beschrieben ist. Es wurden monoklonale Antikörper gegen GHBP (MAb 263) und GH (MAb MCB) verwendet. Die GHBP-Werte wurden unter Einsatz normativer Daten für den LIFA nach Alter und Geschlecht standardisiert; dies erfolgte auf der Basis von Proben, die von Dr. Thomas Merimee von der University of Florida, Division of Endocrinology and Metabolism, Health Science Center, P.O. Box 100226, Gainesville, FL, USA, 32610–0226 und von Dr. Sotos und Dr. Kirkland, s. o., stammten. Diese Werte wurden bereits früher in der Literatur angeführt. Carlsson et al., J. C. E. M. 78, 1325– 1330 (1994). Über Nacht gezogene Proben für GH wurden unter Anwendung des doppelten monoklonalen immunradiometrischen Assays (Tandem-R HGH, Hybritech, San Diego, CA, USA) untersucht. Die für die GH-Stimulationstests erfassten Werte wurden mittels verschiedener GH-Tests gemessen.
IGF-I wurde durch Radioimmunassay nach Säureethanol-Extraktion (IGF-I by Extraction, Nichols Institute, San Juan Capistrano, CA, USA) gemessen und mittels der zur Verfügung gestellten normativen Daten nach Alter und Geschlecht standardisiert.
Statistische Verfahren
Die Körpergrößen wurden nach Alter und Geschlecht standardisiert und die Gewichte auf Basis von Normen, die aus veröffentlichten Daten über amerikanische Kinder stammen, ebenfalls nach Körpergröße und Geschlecht standardisiert. Hamill et al., Am. J. Clin. Nutrition 32, 607–629 (1979). Der Körpergrößen-SDS der Mütter und Väter wurden auf der Basis von Körpergrößen-Percentilen normaler Erwachsene berechnet. Hamill et al., s. o.
Multiple lineare Regression diente zur Bestimmung, welche erklärenden Variablen allenfalls linear mit GHBP-SDS assoziiert waren. Außerdem wurden die Probanden in zwei Gruppen eingeteilt (auf der Basis ihrer GHBP-SDS-Werte (= –2SD und > –2SD)), um die allfällige Signifikanz von GHBP-Werten zu bestimmen, die unter dem normalen Bereich liegen. Die zwei Gruppen wurden hinsichtlich der Mittel- oder Medianwerte mehrerer Co-Variate miteinander verglichen (siehe Tabelle VI). Univariate Tests der Signifikanz zwischen den Gruppen erfolgten unter Einsatz von einem von drei Tests: des t-Tests (für Gauss-verteilte Variablen), des Wilcoxon-Rangsummentests (für Nicht-Gauss-verteilte Variablen) oder des Chi-Quadrattests (für kategorische Variablen). Um mehrere Vergleiche zu ermöglichen, wurden p-Werte < 0,005 als statistisch signifikant eingestuft. ANCOVA diente dazu, Differenzen zwischen den zwei GHBP-Gruppen zu untersuchen, nachdem bezüglich anderer signifikanter Variablen korrigiert worden waren.
Ergebnisse
Patienten in der Gruppe mit niedrigem GHBP-Spiegel waren jünger und hatten einen niedrigeren Gewicht-Körpergrößen-SDS und BMI als die normale GHBP-Gruppe (Tabelle V). Der mittlere SDS betrug in beiden Gruppen –2,9, wobei die Werte von –5,8 bis zu –2,0 reichten. Etwa ¾ der Patienten waren männlich; eine ähnliche Geschlechterverteilung lässt sich bei Durchsicht der gesamten NCGS-Datenbank erkennen. August et al., J. Pediatr. 116, 899–903 (1990). 72% der Patienten waren zu Beginn präpubertär.
Tabelle V Patienteneigenschaften zu Beginn
Es gab 101 Patienten mit GHBP-SDS = –2 (Mittel –2,5) und 410 Patienten mit GHBP-SDS > –2 (Mittel –0,9) (Tabelle VI). Die zwei Gruppen wiesen vergleichbare mediane GH-Maximalwerte auf; diese Werte sind jedoch aufgrund der Durchführung verschiedener GH-Tests schwierig auszuwerten. Der Durchschnitt für die mittleren 12-Stunden-GH-Konzentrationen (unter Verwendung des Hybritech-Tests) war signifikant höher als die Gruppe mit niedrigem GHBP-Spiegel, während der IGF-I-SDS in dieser Gruppe signifikant niedriger war (jeweils p = 0,0001, Tabelle VI).
3 zeigt, dass jene mit niedrigem GHBP-SDS niedrigere IGF-I-SDS-Werte ( 3A) und höhere mittlere 12-Stunden-GH-Werte (3B) aufwiesen. Von allen ISS-Patienten korrelierte GHBP-SDS positiv mit IGF-I-SDS (r = 0,285, p = 0,0001) und negativ mit dem mittleren 12-Stunden-GH-Spiegel (r = –0,17, p = 0,0001).
ANCOVA, die bezüglich des Alters, des Gewicht-Körpergrößen-SDS und des mittleren 12-Stunden-GH-Spiegels korrigiert, zeigte, dass Patienten mit GHBP-SDS = –2 einen signifikant niedrigeren IGF-I-SDS aufwiesen als jene mit GBHP-SDS > –2 (p = 0,0001). Ebenso besaß die Gruppe mit niedrigem GHBP-Spiegel einen signifikant höheren mittleren 12-Stunden-GH-Wert als die Gruppe mit normalem GHBP (p = 0,0001) (nach Korrektur bezüglich Alter, Gewicht-Körpergrößen-SDS und IGF-I-SDS).
Tabelle VI Ausgangs-GHBP-, IGF-I- und GH-Konzentrationen (Mittelwert ± SD)
Die Analysen der Wachstumsraten waren auf Patienten beschränkt, die während der in Betracht gezogenen Behandlungsdauer präpubertär blieben. Es bestand keine signifikante lineare Korrelation von GHBP-SDS und der Wachstumsrate oder der Veränderung des Körpergrößen-SDS während jedes der ersten drei Behandlungsjahre. Die mittlere Wachstumsrate vor der Behandlung betrug ungeachtet des GHBP-SDS etwa 4 cm/Jahr. Die mittlere Wachstumsrate während des ersten Jahrs der GH-Therapie betrug etwa 8 cm/Jahr. 4 zeigt die Wachstumsraten des ersten Jahrs für mit GH behandelte präpubertäre Patienten, aufgetragen über ihren GHBP-SDS-Werten. Es bestand keine statistisch signifikante Korrelation zwischen den beiden (r = 0,047, p = 0,55, n = 166). Die Abbildung zeigt, dass die Patienten, die gemäß der Erfindung behandelt werden können, jene unterhalb des schraffierten Bereichs sind, sofern sie auch den GH-, IGF-I- und Körpergrößenanforderungen entsprechen, die für diese Subpopulation gelten. Die Ergebnisse zeigen, dass die Patienten mit niedrigen GHBP-SDS-Werten, die auch den Kriterien der vorliegenden Endung entsprachen, auf die pharmakologische Verabreichung von GH ansprachen.
Die 5 und 6 vergleichen die Wachstumsraten der Patienten vor der Behandlung und während des ersten Jahres der Patienten (und in 5 auch die das zweite Jahr betreffenden Wachstumsraten). Diese Abbildungen lassen erkennen, dass es einen klaren Anstieg des Wachstums in mit GH behandelten Patienten gibt – gleichgültig ob der GHBP-SDS des jeweiligen Patienten –2 oder > –2 beträgt.
Tabelle VII zeigt die Wachstumsreaktions-Daten für die Gruppe mit niedrigem GHBP-SDS im Vergleich zur Gruppe mit normalem GHBP-SDS. Die zwei Gruppe besaßen während des ersten Therapiejahrs ähnliche mittlere GH-Dosis- und Injektions-Zeitpläne. Es bestanden keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen hinsichtlich der Wachstumsrate vor der Behandlung oder der Wachstumsraten während der ersten 4 Jahre der GH-Therapie. Die mittlere Veränderung des Körpergrößen-SDS war zwischen den beiden Gruppen statistisch ebenfalls nicht unter schiedlich; die mittlere Zunahme in den 4 Jahre lang beobachteten Personen betrug 1,5 ± 0,6 (n = 13) in der Gruppe mit niedrigem GHBP-Spiegel und 1,7 ± 0,6 (n = 21) in der Gruppe mit normalem GHBP-Spiegel.
Tabelle VII Wachstumsrate und Veränderung des Körpergrößen-SDS ab dem Beginn der GH-Therapie in präpubertären Patienten
Obwohl Kleinwüchsigkeit in unterschiedlicher Wese definierbar ist, z. B. dass der betreffende Patient unterhalb eines bestimmten Percentils für Standardkörpergrößen liegt, repräsentieren die Patienten in dieser Studie eine eingeschränktere Gruppe. Sie erhielten alle GH-Therapie verschrieben und durchliefen demnach ein von den behandelnden Ärzten durchgeführtes Screening- und Auswahlverfahren. Außerdem wurden Patienten mit Körpergrößen-SDS von über –2 in diese Studie nicht aufgenommen. Die resultierende Gruppe besaß einen mittleren SDS von –2,9, eine mittlere Knochenalterverzögerung von 2,4 Jahren und eine mittlere Wachstumsrate von 4,2 cm/Jahr (diese Werte ähneln anderen ebenfalls in der Literatur beschriebenen und mit GH behandelten ISS-Patienten). Hopwood et al., J. Pediatr. 123, 215–222 (1993); Albertsson-Wikland, Acta Paediatr. Scand. Suppl. 343, 77–84 (1988). In dieser ausgewählten Gruppe stellte man fest, dass einige einen niedrigen GHBP-Spiegel besaßen (nach Standardisierung nach Alter und Geschlecht und Korrektur bezüglich Knochenafter). Carlsson et al., J. C. E. M., 78, s. o.
Es wurde aufgezeigt, dass GHBP aus dem gleichen Gen stammt wie GHR und Sequenzhomologie mit seiner extrauzellulären Domäne besitzt. Leung et al., Nature 330, 537–543 (1987). Die unter Anwendung des funktionellen Tests gemessenen Serum-GHBP-Werte waren bei Patienten mit komplettem GHIS niedrig oder undetektierbar. Fielder et al., J. C. E. M. 74, 743–750 (1992). In diesem Beispiel wurde der normale Bereich von GHBP-Werten in Kindern anhand von Alter und Geschlecht bestimmt, wobei ermittelt wurde, dass die niedrigen GHBP-Werte bei Patienten mit ISS deutlich niedriger waren als jene bei normalen oder GH-defizienten Personen oder im Fall von TS. Carlsson et al., J. C. E. M., 78, s. o.
12-Stunden-über-Nacht-Reihenprobenentnahme-Profile für GH wurden von allen Kindern in dieser Studie erhalten, wobei die Mittelwerte normal waren. Dies lässt – ohne sich auf eine bestimmte Theorie beschränken zu wollen – schließen, dass neurosekretorische Dysfunktion in den meisten der Patienten nicht vorhanden war. Die mittleren 12-Stunden-GH-Werte zeigten eine negative Korrelation mit mittleren GHBP-SDS, wie dies für normale Individuen beschrieben wurde. Martha et al., J. C. E. M. 73, 175–181 (1991) : IGF-I-SDS korrelierte hingegen positiv mit GHBP- SDS. Somit besaßen die Patienten mit niedrigerem GHBP-Spiegel höhere GH-, jedoch niedriger IGF-I-Werte, was mit der GH-Unempfindlichkeit übereinstimmt.
Ein signifikanter Prognosefaktor der GHBP-Konzentration ist die Körperzusammensetzung, die sowohl unter Heranziehung von BMI als auch von Gewichtsstandards für Körpergröße und Alter bewertet wurde. In einer ANCOVA stellte man fest, dass GHBP ein signifikanter Prognosefaktor von mittlerem 12-Stunden-GH-Wert und IGF-I-SDS nach der Korrektur bezüglich Alter und Gewicht-Körpergrößen-SDS blieb.
Die für präpubertäre Patienten in der NCGS-Datenbank zur Verfügung stehenden Wachstumsdaten zeigten keine signifikante lineare Korrelation zwischen Ausgangs-GHBP-SDS und der Wachstumsrate vor der Behandlung oder dem Ausgangs-Körpergrößen-SDS. Ohne sich auf eine bestimmte Theorie beschränken zu wollen, liegt eine mögliche Erklärung darin, dass die Wachstumsrate und das Gewicht üblicherweise dazu dienen, Patienten für die Behandlung mit GH auszuwählen, und somit in dieser Patientenpopulation einheitlich niedrig sind.
Eine interessante Beobchtung ist der Mangel an Korrelation von GHBP-SDS und Wachstumsreaktion auf GH-Therapie. Da die GH-Sekretion und die GHBP-Werte bei normal wachsenden Kindern offenbar negativ korrelieren (Martha et al., s. o.), kann ein normaler Bereich vorgeschlagen werden (siehe 7). Man kann erwarten, dass jene mit übermäßigem GH im Verhältnis zu ihrem GHBP-Spiegel übermäßiges Wachstum aufweisen und jene, deren GH-Spiegel für ihren GHBP-Spiegel zu niedrig ist, mangelhaftes Wachstum aufweisen. Derzeit ist GHD willkürlich definiert und beruht lediglich auf Messungen der GH-Sekretion; es ist denkbar, dass einige Patienten mit GH-Werten oberhalb dieses willkürlichen Schwellenwerts (und innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung) inadäquate Mengen an GH im Verhältnis zu ihrem GHBP-Spiegel aufweisen, was zu mangelhaftem Wachstum führt. Man könnte erwarten, dass die Verabreichung von exogenem GH an diese Untergruppe von Patienten (mit niedrigeren GHBP- und IGF-I-Werten und höheren mittleren 12-Stunden- GH-Werten als normale Patienten, was partielle GH-Unempfindlichkeit vermuten lässt) ihren GH-Spiegel im Blutkreislauf auf Werte ansteigen lässt, die für ihre niedrigen GHBP-Werte angemessener sind, wodurch ihr partiell resistenter Zustand überwunden werden kann.
Beispiel 4
Einleitung
Die Ätiologie des Wachstumsversagens in der Mehrzahl kleinwüchsiger Kinder ohne GHD (nicht-GH-defiziente Kinder mit Kleinwüchsigkeit) ist nur mangelhaft definiert. Diese ansonsten normalen Kinder mit ISS produzieren normale Mengen an GH als Reaktion auf pharmakologische Stimulation, verzeichnen aber kein normales Wachstumsmuster. Lippe und Nakamoto, Rec. Prog. Norm. Res. 48, 179–235 (1993). Einige mit GH verbundene Defekte wurden als Erklärung für ihr Wachstumsversagen vorgeschlagen, z. B. neurosekretorische Dysfunktion (Spiliotis et al., J. Am. Med. Assoc. 251, 2223–2230 (1984); Zadik et al., Pediatrics 76, 355–360 (1985)) und immunologisch reaktives, doch biologisch inaktives GH. Kowarski et al., J. C. E. M. 47, 461-464 (1978); Valenta et al., N. Engl. J. Med. 31, 214–217 (1985). Während diese Mechanismen möglicherweise für das Fehlen von normalem Wachstum in einigen ISS-Patienten verantwortlich sind, scheinen die meisten Patienten keine auffälligen Defekte der GH-Sekretion oder -Funktion aufzuweisen. Lanes, Am. J. Dis. Child. 143, 1284–1286 (1989; Ilondo et al., J. C. E. M. 70, 1445–1451 (1990).
Eine andere Möglichkeit besteht darin, dass ISS-Patienten normale Sekretionsmuster von bioaktivem GH aufweisen und dass der Defekt die Fähigkeit von Zielzellen betrifft, auf GH zu reagieren. Solche Defekte könnten auch die Menge an GHR oder die Mediatoren der GH-Signalisierung betreffen, z. B. IGF-1 oder IGF-I-Rezeptor. Änderungen im IGF-I-Gen sind in Wachstumsstörungen ungewöhnlich. Lajara et al., J. C. E. M. 70, 687–692 (1990). Die Resistenz gegenüber GH könnte auf die Reduktion der Affinität des GHR für GH, die eingeschränkte Fähigkeit, ein Signal als Reaktion auf die Bindung von GH zu verbreiten, oder auf Defekte zurückzuführen sein, die eine reduzierte Zahl an Zelloberflächenrezeptoren verursachen. Das im Humanserum vorhandene hochaffine GHBP ist mit der extrazellulären Domäne des GHF identisch, und man geht davon aus, dass es aus durch proteolytische Spaltung aus dem Rezeptor produziert wird. Sotiropoulos et al., Endobrinol. 132, 1863–1865 (1993). Immunfunktionelle GHBP-Spiegel (Carlsson et al., J. C. E. M. 73, s. o.) liegen bei 90 % der ISS-Patienten unter dem Mittel und bei 20% dieser Kinder mehr als 2 SDs unter dem Mittel. Carlsson et al., J. C. E. M. 78, s. o.; Mauras et al., Metabolism 43, 357–359 (1994). Ohne sich auf eine bestimmte Theorie beschränken zu wollen, ist zu beachten, dass Anomalien bezüglich des GHR, die die Menge an funktionellem GHBP reduzieren, in ISS-Patienten vorhanden sein können.
Ein Phänotyp von partiellem GHIS in ISS wird durch die Beobachtung in Beispiel 3 festgelegt, wonach ISS-Patienten mit niedrigerem GHBP-Spiegel niedrigere IGF-I-Werte und höhere 12-Stunden-GH-Werte als jene mit normalem GHBP-Spiegel aufweisen. Ohne sich auf eine bestimmte Theorie beschränken zu wollen, legt dies eine Defizienz der Signalisierung über GHR nahe, was zu reduzierter IGF-I-Produktion und reduziertem negativen Feedback von IGF-I auf GH-Sekretion führt. Die meisten ISS-Kinder sprechen auf GH-Rekombinationsbehandlung mit einer steigenden Wachstumsrate an (Hopwood et al., s. o.); doch diese Reaktion ist weniger ausgeprägt als jene, die hierin bei mit der gleichen GH-Dosis behandelten Patienten mit GHD (GH-defizienten Patienten) auftritt, was wiederum, ohne sich auf eine Theorie beschränken zu wollen, partielle Inempfindlichkeit gegenüber GH bei ISS-Patienten nahe legt.
Die hohe Frequenz inaktivierender Mutationen im GHF-Gen in komplettem GHIS oder Laron-Syndrom (LS) zeigt auf, dass die meisten Fälle von komplettem GHIS durch einen Mangel an funktionellem GHR erklärbar sind. Den meisten LS-Patienten besitzen einen Mangel an detektierbarer GHBP-Aktivität in ihrem Blut (Baumann et al., J. C. E. M. 65, 814–816 (1987); Daughaday et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4636–4640 (1987)), und bei der Messung wird festgestellt, dass sie keine oder sehr niedrige Werte spezifischer GH-Bindung an hepatische Mikrosome aufweisen. Eshet et al., Isr. J. Med. Sci. 20, 8–11 (1984). Es gibt 17 charakterisierte GHR-Mutationen, die mit in der extrazellulären Domäne des Proteins konzentriertem LS assoziiert sind (ein Überblick wird von Rosenfeld et al., Endocrinol. Rev. 15, 359–390 (1994) gegeben).
Um zu bestimmen, ob der mildere Phänotyp von partiellem GHIS durch disruptive Mutationen in GHR verursacht werden könnte und ob die reduzierten Mengen an zirkulierendem GHBP in der ISS-Population als Marker für partielles GHIS dienen und Mutationen im GHR anzeigen könnten, wurde eine Untergruppe von ISS-Patienten mit höherem GHBP-Spiegel als 2 SD unter dem Mittelwert ausgewählt und die Kodierregion des GHR-Gens auf Mutationen analysiert. Unter Anwendung von Einzelstrang-Konformationsanalyse (SSCA) und Sequenzieren von Polymerase-Kettenreaktions- (PCR-) Produkten mit geänderter Mobilität wurden Mutationen in 4 von 14 Patienten in der extrazellulären Domäne des Rezeptors detektiert.
Probanden
14 ISS-Patienten wurden aus zwei Teilstudien der NCGS ausgewählt, und sie wiesen einige oder alle der folgenden Kriterien auf: 1) Körpergrößen-SDS < –2,5; 2) Serum-IGF-I-Spiegel unter normalem Mittelwert (gemessen durch Säure-Ethanol-Extraktion, Nichols Institute); 3) Serum-GH > 10 μg/l (bestimmt mit einem oder mehreren provokativen Tests); 4) maximaler Serum-GHBP-SDS = –2 (gemessen durch LIFA, beschrieben in Carlsson et al., J. C. E. M. 73, s. o., oder durch Holzkohletrennung, beschrieben in Amit et al., J. C. E. M. 71, 474–479 (1990)) im Fall von Patient 1); 5) Wachstumsrate vor der Behandlung < 4 cm/Jahr; und 6) Fehlen von zugrunde liegender systemischer Krankheit. Weitere Informationen wurden – falls sie verfügbar waren – ebenfalls berücksichtigt, z. B. mittlerer 12-Stunden-GH-Spiegel (Hybritech-Assay), Wachstumsrate während des ersten Jahrs mit GH-Behandlung und IGFBP-3-Werte (Endocrine Sciences). Das Scoring-System, das zur Auswahl der Patienten aus der NCGS-Datenbank zur Anwendung kam, ist aus Tabelle VIII ersichtlich. Von einem maximalen Score von 12 erzielten die Patienten 4–10, und alle besaßen GHBP-SDS = –2. Verwandte von zwei Patienten (Nr. 2 und NR. 4) wurden untersucht, um die Vererbbarkeit der Mutationen zu bestätigen. 24 normale erwachsene Freiwillige, deren Körpergrößen-SDS in den normalen Bereich fiel oder darüber lag (–2,0 bis +3,5 SDS) dienten als Vergleich. Die statistische Signifikanz von Populationsdifferenzen wurde mit einem Fischer Exact-Test berechnet.
Tabelle VIII Kriterien zur Patientenauswahl
Die mit hGH behandelten Patienten (jene in Tabelle IX, die in der „GH-reaktiv"-Spalte nicht als „na" angeführt sind), wurden mit Protropin^®-GH (alle behandelten Patienten mit Ausnahme von Patient 2) und Nutropin^®-GH (Patient 2) mit ewt 0,3 mg/kg/Woche zumindest 6 Monate lang subkutan injiziert.
Probenvorbereitung und PCR-Amplifikation
Lymphozyten wurden aus 1,5–10 ml Blut von jedem Patienten entweder mittels LeucoPREP-Zelltrennungsröhrchen (Becton Dickenson) oder LSM-Lymphozyten-Trennungsmedium (Organon Teknika) isoliert und durch Epstein-Bari-Virus (EBV) transformiert. Katz et al., J. Infect. Dis. 160, 589–598 (1989). DNA wurde aus EBV-transformierten Lymphozyten oder direkt aus frischen Lymphozyten isoliert; dies erfolgte mit dem QIAamp Blood Kit (Quiagen, Inc.). Genomische Fragmente des GHR, spezifisch für die kodierenden Exons 2 bis 9 und ihre flankierenden Spleißstellen, wurden durch PCR mittels intronischer Primer amplifiziert. Der Kodierabschnitt von Exon 10 wurde in 3 überlappenden Fragmenten amplifiziert, um die Fragmentgröße auf weniger als 400 Basenpaare (bp) einzuschränken.
Die Position und Sequenz der intronischen Primer sind wie folgt:
DNA (100 ng) wurde in 50 μl, umfassend 0,2 mM dNTPs, 2 Einheiten Taq Polymerase (Perkin Elmer Corp.), 1,5 mM MgCl₂, 7 μCi ³³P-α-dATP (duPont New England Nuclear) und 15 ng jedes Primers über 40 Zyklen amplifiziert (1 min, 94°C; 1 min 55°C; 1 min 72°C mit 5 s pro Zyklus hinzugefügt). An den Endzyklus schloss sich 1 min bei 94°C und Abkühlen auf 22°C über den Zeitraum von 30 min. PCR-Produkte wurden in 2% Agarose elektrophoresiert, um auf Kontaminierung zu untersuchen und die Fragmentgröße zu bestätigen.
Voll-RNA (5–10 μg) wurde aus den EBV-transformierten Lymphozyten durch das Säure-Phenol-Verfahren (Chomczynski und Sasshi, Anal. Biochem. 162, 156–159 (1987) produziert und revers transkribiert (Perkin Elmer Corp., RT-Set), wobei hier zufallsverteilt bindende Primer (Promega Corp.) zum Einsatz kamen. Die PCR-Amplifikation der GHF-cDNA erfolgte durch eine ineinander geschachtelte PCR-Strategie. Exons 3–10 wurden in 3 Fragmenten amplifiziert. Verschachtelte Primer dienten dazu, kleinere Fragmente (220–415 bp) zu erzeugen. Die Zyklusbedingungen waren wie folgt: Denaturieren bei 95°C 1 min lang; bei 72°C 1 min lang; und schließlich bei 72°C 10 min lang. Die Sequenzen der in der verschachtelten Primer-Technik verwendeten Primer waren wie folgt:
3 RT-PCR-Fragmente (5' bis 3'):
Interne verschachtelte PCR-Produkte
Interne verschachtelte PCR-Produkte
Interne verschachtelte PCR-Produkte
Einzelstrang-Konformationsanalyse
Es wurde SSCA auf den Produkten jeder PCR-Reaktion durchgeführt. 2–4 μl des Reaktionsgemisches wurden mit einem gleichen Volumen Ladungspuffer vermischt, bei 100°C 2 min lang denaturiert und auf Eis gelegt. Proben wurden bei Raumtemperatur in 0,5 × MDE-Gelen (AT Biochem Inc.) mit 1 oder 10% Glycerin gemäß den Anweisungen des Herstellers elektrophoresiert. Die Gele wurden auf Filterpapier getrocknet und ein Autoradiogramm angefertigt.
DNA-Sequenzierung
Als abweichende Banden durch SSCA detektierte Mutationen wurden durch Sequenzierung bestätigt. Direktes Zyklussequenzieren der PCR-Produkte erfolgte mit den Amplifikationsprimern oder den oben beschriebenen internen (verschachtelten) Primern und mittels Farbstoff-Terminator-Chemie auf dem ABI373-Sequenzierer (Applied Biosystems Division von Perkin Elmer Corp.) gemäß herkömmlicher Arbeitsvorschriften oder unter Anwendung des Ampli-Cycle-Sets (Perkin Elmer Corp.) und ³³P-α-dATP (duPont New England Nuclear). Außerdem wurden mehrere Subklone aus jedem Fragment, die vermutlich eine Mutation enthielten, in M13mp19 oder pBluescript KD+ erzeugt, mit dem M13-21-Farbstoffprimer sequenziert und auf dem ABI373-Sequenzierer analysiert.
GH-Bindungstest
Um die Bindung von GH an die Rezeptormutanten zu untersuchen, wurden rekombinante extrazelluläre GHR-Domänen erzeugt, die die Mutationen umfassten. Dies erfolgte mittels Oligonucleotid-mediierter stellengerichteter Mutagenese, Expression in E. coli und Reinigung. Clackson und Wells, Science 267, 383–386, 1995; Fuh et al., J. Biol. Chem. 265, 3111–3115 (1990); Bass et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4498–4502 (1991). Affinität für GH wurde durch kompetitive Verlagerung von GH aus den Rezeptormutanten mittels radiojodiertem GH als Tracer bestimmt. Spencer et al., J. Biol. Chem. 263, 7862–7867 (1988). Die Dissoziationskonstanten (Kds) wurden durch Scatchard-Analyse berechnet. Monoklonaler Anti-GHR-Antikörper (Mab) 5 (Barnard et al., Endocrinology 115, 1805 (1984); Cunningham et al., Science 254, 821 (1991)) diente dazu, den GHR:GH-Komplex zu fällen. Mab 5 verhindert die Rezeptor-Homodimerisierung, wodurch die Kd für die anfängliche 1 : 1-Wechselwirkung frei von den Auswirkungen der Dimerisierung bestimmt werden kann. Clackson und Wells, s. o., Cunningham et al., s. o.
14 Kinder mit ISS wurden mit einem Kernscore von 4 oder darüber gemäß den Selektionskriterien ausgewählt (Tabelle VIII). Die klinischen Daten betreffend diese Patienten sind aus Tabelle IX ersichtlich. Der niedrige funktionelle Serum-GHBP-Spiegel in diesen Patienten führte zur Suche nach subtilen Mutationen im GHR-Gen durch eine Kombination von PCR-Amplifikation und SSCA. Fragmente, die mit veränderter Mobilität wandern, wurden in vier Patienten festgestellt – 1, 2, 4 und 7 -, während keine Anomalien im GHR-Locus von 24 normalen erwachsenen Vergleichspersonen detektiert wurden (mit Ausnahme bekannter Polymorphismen in Exons 6 und 10; siehe Leung et al., Nature 330, 537–543 (1987); Godowski et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 8083–8087 (1989)): Somit lag eine signifikante Zunahme der Veränderungen im GHR-Gen bei ISS-Patienten mit reduziertem GHBP-Spiegel gegenüber einer normalen Population statt (p = 0,014). Jedes der genomischen PCR-Fragmente, das vermutlich eine Mutation trug, wurde sequenziert, um die die aberrante Bande bewirkende Änderung zu charakterisieren. Siehe 8-11. Patienten 1 bis 9 wurden auch durch RT-PCR (Exons 3–10) analysiert, und alle Fragmente besaßen die vorhergesagte Größe , wodurch das Spleißen von Änderungen ausgeschlossen wurde.
Patient 4 wies abnormale Banden von SSCA-Gelen auf, als Exons 4 und 6 oder RT-PCR-Fragmente (bedeckten diese Region) analysiert wurden. Die DNA wurde sequenziert, und man stellte fest, dass das Kind kombiniert-heterozygot bezüglich eines Guanosin-Adenosin-Übergangs in Exon 4 (führte ein Lysin anstelle einer Glutaminsäure an Position 44 (E44K) im reifen Protein ein (8, Allel 2 und Tabelle X)) und eines Cytosin-Thymidin-Übergangs in Exon 6 (bewirkte eine Arginin-Cystein-Substitution an Rest 161 (R161C; 8, Allel 1 und Tabelle X) war. Exons 4–6 überspannende RT-PCR-Produkte wurden subkloniert und sequenziert. Die zwei Mutationen befanden sich in unterschiedlichen Subklonen; somit wurde eine Mutation in jedem der zwei Allele festgestellt. Außerdem ergab die genetische Analyse von Familienmitgliedern, dass die Exon 4-Modifikation von der väterlichen Seite der Familie und die Exon 6-Mutation von der mütterlichen Verwandtschaft vererbt worden war.
Der Vater und die Großmutter väterlicherseits wiesen beide die gleiche SSCA-Bandenverschiebung für Exon 4 auf wie der Proband, und das Sequenzieren bestätigte, dass beide die identische E44K-Mutation trugen. Ebenso bestätigten SSCA und Sequenzieren die Gegenwart der Exon 6-Punktmutation, die zur R161C-Veränderung in der Mutter und einem Onkel mütterlicherseits führte. Patient 4 sprach auf exogenes GH nicht mit einer signifikanten Steigerung der Wachstumsrate an; seine Wachstumsrate vor der Behandlung betrug 5,5 cm/Jahr und seine Wachstumsrate nach GH-Behandlung 5,8 cm/Jahr.
Die Einflüsse dieser Aminosäuresubstitutionen auf die Fähigkeit des Rezeptors, GH in einem 1 : 1-Komplex zu binden, wurden unter Verwendung der extrazellulären und in E. coli exprimierten Rezeptormutanten-Domäne untersucht. Rest E44 ist an direkten Kontakten mit GH beteiligt (deVos et al., Science 255, 306–312 (1992), und die Mutation zu Alanin reduzierte die Ligandenbindung (Kd_MUT/Kd_WT = 17,4). Clackson und Wells, s. o. Es wurde festgestellt, dass die Einführung eines Lysins an Position 44 die Bindung um das 330fache in Bezug auf die extrazelluläre Rezeptordomäne der Wildform reduziert (Tabelle X). Im Gegensatz dazu befindet sich Rest 161 an keiner intermolekularen Grenzfläche im Human-GH-GHR-Komplex (deVos et al., s. o.), und seine Mutation zu Cystein bewirkte eine 2,1fache Reduktion der Bindung (Tabelle X).
DNA aus Patient 2 wies eine SSCA-Bandenverschiebung mit genomischen Exon 5-PCR-Fragmenten auf. Das DNA-Sequenzieren identifizierte eine Thymidin-Adenosin-Transversion an Position 418 in der cDNA, wodurch ein Stopcodon anstelle von Cystein 122 eingesetzt wurde (C122X). Siehe 9. Das Subklonieren und Sequenzieren mehrerer genomischer PCR-Produkte aus allen Exons von Patient 2 ergab nur die Sequenz der Wildform, und das Gleicht trifft auf direktes Sequenzieren der genomischen PCR-Fragmente zu. Die Wahrscheinlichkit, dass dieser Patient eine zweite Mutation trägt, die nicht detektiert werden konnte, ist daher gering. Die Analyse der DNA der Mutter und des Vaters von Patient 2 zeigte, dass er die Stopcodon-Muta tion von seiner Mutter geerbt hatte. Während des ersten Behandlungsjahrs mit GH nahm seine Wachstumsrate von 4,1 cm/Jahr auf 5,7 cm/Jahr zu (Tabelle IX) – ein Anzeichen für die Reaktion auf exogenes GH. Ein mit der Pubertät assoziierter Wachstumsschub von 10,3 cm/Jahr trat während des zweiten Behandlungsjahrs mit exogenem GH ein.
Die Patienten 1 und 7 tragen beide heterozygote Einzelbasenpaar-Veränderungen, die Aminosäure-Modifikationen im GHR gegenüber einem Allel bewirken. In Patient 1 wurde eine aberrante Bande mit genomischen Exon 7-PCR-Fragmenten beobachtet. Ein Guaunosin-Adenosin-Übergang an Basenpaar 686 bewirkte, dass ein Argininrest mit einem Histidin an Aminosäure 211 ersetzt wurde (R211H). Siehe 10, Allel 2. Patient 1 sprach auf GH an; er erzielte ein positives Ergebnis auf den IGF-I-Produktionstest (IGF-1 betrug zu Beginn 56 μg/l und stieg nach viertägiger Behandlung mit 0,1 Einheiten GH/kg/Injektion auf einen Peak von 179 μg/l an). Außerdem nahm seine Wachstumsrae von 2,0 cm/Jahr auf 3,0 cm/Jahr bei Gabe von 0,03 mg GH/kg/Tag und auf 6,0 cm/Jahr bei Gabe von 0,05 mg GH/kg/Tag zu (Tabelle IX).
Patient 7 wird ebenfalls durch die Veränderung in einem einzigen Allel beeinflusst. Eine Guanosin-Cytosin-Transversion an Basenpaar 726 führt eine Asparaginsäure anstelle der Glutaminsäure der Wildform an Position 224 ein (E224D). Siehe 11, Allel 2. Patient 7 war niemals mit GH behandelt wurden. Weder SSCA noch direktes Sequenzieren der extrazellulären Domäne des GHR detekierte eine zweite Veränderung in diesen Patienten.
Rest R211 liegt an der Rezeptoroberfläche weg von der molekularen Grenzfläche frei. deVos et al., s. o. Die Histidinmutante produzierte ein Potein mit einer Affinität, die mit Rezeptor der Wildform vergleichbar ist (Kd_MUT/Kd_WT = 1,4). Es trat jedoch eine auffällige Reduktion des Expressionsausmaßes der Proteinmutante ein; sie wurde in einem Ausmaß von etwa 10^–4 gegenüber der Wildform exprimiert. Die LS-assoziierte Arginin-211-Glycin-Mutation (siehe Amselem et al., Hum. Mol. Genet. 2, 355–359 (1993)) führt zu einem undetektierbaren Expressionsniveau. Eine ähnliche Wirkung auf die Affinität des Rezeptors für GH wurde für die R224D-Substitution beobachtet (Tabelle X). Man erwartete nicht, dass die konservative E224D-Substitution die GH-Bindung beeinträchtigen würde; es stellte sich heraus, dass die Substitution mit Asparaginsäure (Kd_MUT/Kd_WT = 1,6) einen sehr geringen Einfluss auf die Affinität hatte.
Tabelle X Mutationen im GHR-Gen
Beispiel 5
Die Ätiologie des Wachstumsversagens ist bei vielen Kindern mit auffällig kleiner Statur unbekannt. Daten aus letzter Zeit lassen erkennen, dass heterozygote extrazelluläre GHR-Gen-Mutationen in einigen aufgrund ihres niedrigen GHBP-Spiegels ausgewählten Kindern mit ISS möglicherweise partielles GHIS bewirkt; NEJM 333, 1093–1098 (1995). Um zu bewerten, ob partielles GHIS infolge heterozygoter GHR-Gen-Mutationen in einer weniger selektiven Population von ISS-Kindern vorliegt, analysierten die Anmelder das GHR-Gen in 34 von 121 ISS-Kindern, die an einem Langzeitversuch über die TH-Therapie teilnahmen. Alle Kinder in der Studie besaßen stimuliertes GH > 100 μg/l; die mittlere Körpergröße betrug zu Studienbeginn –2,8 SDS und der IGF-I-Spiegel –0,9., Diese Patienten waren bis zu 9 Jahre lang mit GH behandelt worden (0,3 mg/kg/Woche). Die Anmelder analysierten zusätzliche 11 Patienten mit ISS, die nicht Teil des klinischen Versuchs waren und zu denen weniger Wachstumsdaten zur Verfügung standen. Keines dieser Kinder besaß die phänotypischen Merkmale von Laron-Syndrom.
Es wurde genomische DNA aus mit Epstein-Barr-Virus transformierten Lymphozyten extrahiert, und es wurden die Exons 2–10 des GHR-Gens durch PCR amplifiziert. Die amplifizierten Sequenzen wurden mittels Einzelstrang-Konformationspolymorphismus- (SSCP-) Analyse auf MDE-Gelen mit 0 oder 10% Glycerin auf subtile Mutationen untersucht. Orita et al., Genomics 5, 874–879 (1989); Soto und Sukamar, PCR Meth. Appl. 2, 96–98 (1992). Aberrante SSCP-Banden wurden reamplifiziert und die DNA-Sequenz durch Standard-Farbstoff-Terminator-Chemie und Trennung auf dem ABD373- oder ABD377-Automatiksequenzierer bestimmt. Die SSCP-Analyse beruht auf Differenzen der Sekundärstruktur einzelstrangiger DNA-Moleküle, die sich nur um eine einzige Basenänderung unterscheiden. Diese Differenzen der Sekundärstruktur führen zur Variation der elektrophoretische Mobilität in nicht-denaturierenden Acrylamid-basierten Gelen. Der Wirkungsgrad des Detektierens von Mutationen mit SSCP-Analyse variiert zwischen etwa 90% für Fragmente unter 200 by und 70–80 für den Größenbereich von 200–400 bp. Prosser, Tibtech 11, 238–246 (1993). 9 der 44 Kinder mit ISS in dieser weniger selektierten Population trugen Mutationen im GHR-Gen. Keine Anomalien wurden im GHR-Locus in 7 Vergleichskindern und 34 Vergleichserwachsenen detektiert.
3 ISS-Patienten besaßen Mutationen der extrazellulären Domäne, und 6 trugen Mutationen in der intrazellulären Domäne des GH-Rezeptors (Tabelle 1).
Patient 13 besaß mit 6 10/12 Jahren schwere Wachstumsverzögerung (–4 SDS), verzögertes Knochenalter (4 6/12 Jahre) und eine Wachstumsrate von 3,8 cm/Jahr. Der GH-Spiegel war ebenso normal wie der IGF-BP3- und der GHBP-Spiegel. Seine IGF-I-Werte waren allerdings niedrig und stiegen im IGF-I-Produktionstest (GH bei 0,06 mg/kg/Tag 5 Tage lang) nicht an (Tabelle 1). GH wurde mit einer Dosis von 0,6 mg/kg/Woche versuchsweise verabreicht. Der Patient reagierte mit einer Wachstumsrate während des ersten Jahrs von 10 cm/Jahr, und seine IGF-I-Werte nahmen signifikant zu (57 ng/ml auf 339 ng/ml; normaler Bereich 88–474). Die Analyse des GHR-Gens zeigte, dass er zwei Einzelbasenpaar-Veränderungen trug – eine in jedem Allel des GHR-Gens: eine stille Basenpaarveränderung in Codon 473 (kodiert für einen Serinrest; 12) und eine G-zu-A-Substitution in Codon 478 (führt ein Threonin anstelle des normalen Alanins ein (Ala478Thr); 14). Der Ser473-Polymorphismus wurde in 3 anderen kleinwüchsigen Individuen beobachtet (bei einem IUGR-Patienten, einem ISS-Patienten und einem kleinwüchsigen Erwachsenen, der Großtante mütterlicherseits des Probanden) und bei keiner der Vergleichspersonen mit normaler Statur. Es muss noch ermittelt werden, ob dies eine Auswirkung auf die GHR-mRNA-Prozessierung oder -Stabilität hat.
Patienten 27 und 32 trugen beide zwei Einzelbasenpaar-Veränderungen in Exon 10. Eine ändert Cystein 422 in Phenylalanin um (Cys422Phe; 15), die zweite ersetzt Prolin 561 mit Threonin (Pro561Thr; 16). Patient 27 ist für diese zwei Änderungen homozygot oder hemizygot, sodass beide Mutationen im gleichen Allel des Gens vorliegen. Patient 32 ist für die zwei Veränderungen heterozygot. Den Anmeldern ist nicht bekannt, ob diese zwei Mutationen im gleichen Allel liegen oder nicht. Es stehen für Patient 27 keine Wachstumsdaten zur Verfügung. Patient 32 wies schwere Kleinwüchsigkeit (Körpergröße –3,4 SDS), normalen GH-Spiegel sowie GHBP-, IGF-I- und IGF-BP3-Werte auf, die an das Mittel heranreichen (Tabelle 1). Patient 32 sprach gut auf die GH-Therapie an, seine Wachstumsrate vor der Behandlung betrug 4,4 cm/Jahr und verbesserte sich während des ersten auf 9,1 cm/ Jahr während des ersten Therapiejahrs; sein Wachstumsdiagramm (17) zeigt sein langfristiges Ansprechen auf GH-Therapie. Die Kombination dieser zwei Mutationen wurde bereits für einen Patienten mit Wachstumsversagen und niedrigem GHBP-Spiegel sowie inkonistenter Reaktion auf GH berichtet. J. C. E. M. 76, 54–59 (1993).
Patient 44 trägt zwei Einzelbasenpaar-Veränderungen. Threonin 306 ist infolge einer Einzelbasenpaar-Mutation durch ein Prolin ersetzt (18). Dieser Patient trägt auch den bei Patient 13 beobachteten Ser473-Polymorphismus (1). Es stehen den Anmeldern keine klinischen oder die Wachstumsreaktion betreffenden Daten zu diesem Patienten zur Verfügung. Patient 48 ist bezüglich einer Aminosäuresubstitution heterozygot; Cystein 422 ist durch Phenylalanin ersetzt (Cys422Phe; 15). Dies ist auf die gleiche Basenpaarsubstitution wie bei Patienten 27 und 32 zurückzuführen. Die klinischen Daten (Tabelle 1) zeigen, dass dieses Mädchen Kleinwüchsigkeit (–2,8 SDS), einen niedrigen GHBP- und IGF-I-Spiegel sowie einen normalen IGF-BP3-Spiegel aufwies. Es sprach auf die GH-Therapie mit einer Zunahme der Wachstumsrate von 4,1 cm/Jahr vor der Behandlung auf 8,2 cm/Jahr während des ersten Therapiejahrs an. Seine Wachstumskurve (19) zeigt seine kontinuierliche Reaktion auf GH und das Erreichen einer endgültigen Körpergröße innerhalb des Bereichs, den man anhand der Körpergröße der Eltern des Mädchens vorhersagen konnte.
Das GHR-Gen in Patient 49 ist durch zwei Einzelbasenpaar-Mutationen beeinträchtigt. Eine führt zum Ersetzen des Threonins 306 mit einem Prolin (Thr306Pro; 18); dies ist die gleiche Mutation wie bei Patient 44. Die zweite Mutation bewirkt, dass Cystein 518 mit einem Stopcodon (Cys518Stop) ersetzt ist (20), was zu einem gekürzten Protein ohne die Carboxy-terminalen 107 Aminosäuren führt. Dieser Patient besaß –1,9 SDS, einen normalen GH- und einen niedrigen GHBP-, IGF-I- und IGF-BP3-Spiegel (Tabelle 1). Seine Wachstumskurve (21) spiegelt seine verbesserte Wachstumsrate nach GH-Therapie (von 4,7 cm/Jahr auf 9,0 cm/Jahr während des ersten Therapiejahrs) sowie das Erreichen einer endgültigen Körper größe wider, die innerhalb des Bereichs liegt, den man aufgrund der Körpergröße seiner Eltern vorhersagen konnte.
Diese Daten legen nahe, dass heterogene intrazelluläre GH-Rezeptordefekte möglicherweise die Ursache für mangelhaftes Wachstum in einer Untergruppe nicht-GH-defizienter Patienten mit Kleinwüchsigkeit sind. Diese GH-Rezeptordefekte unterscheiden sich von den extrazellulären Mutationen, die man bei kompletter GH-Unempfindlichkeit (Laron-Syndrom) beobachtet, da sie die intrazelluläre Domäne des Proteins betreffen.
Tabelle 1 ISS-Patienten mit intrazellulären Mutationen

na: nicht verfügbar
het: heterozygot
hom: homozygot
hem: hemizygot

Laron-Syndrom (LS) ist ein seltener autosomaler rezessiver Zustand, der durch schwere GH-Resistenz gekennzeichnet ist (1). Die klinischen Hauptmerkmale dieses Syndroms sind extremes postnatales Wachstumsversagen, kombiniert mit einem typischen Gesichtserscheinungsbild, das durch Hypoplasie im mittleren Gesichtsbereich und eine flache Nasenbrücke gekennzeichnet ist. Kleinkinder können auch an Hypoglykämie-Episoden leiden (1, 2). Biochemisch manifestiert sich die GH-Resistenz in erhöhten GH-Werten im Blutstrom, kombiniert mit niedrigem oder undetektierbarem IGF-1- und niedrigem IGFBP-3-Spiegel, die beide nicht auf exogenes Human-GH ansprechen (1).
Der Defekt bei LS liegt im GHR-Spiegel (3–9). Dieser Rezeptor gehört der GH-Prolactin-Cytokin-Rezeptor-Überfamilie an und besteht aus 3 Domänen: einer extrazellulären Domäne, die für Hormonbindung und Rezeptordimerisierung verantwortlich ist, einer transmembranen Domäne und einer intrazellulären Domäne, die intrazelluläres Signalisieren initiiert (10, 11). Obwohl der erste bei LS identifizierte Defekt im GHR eine komplexe Gen-Deletion war (3), waren alle später identifizierten signifikanten Defekte das Ergebnis von Punktmutationen, die auf die extrazelluläre Domäne des Rezeptors beschränkt waren (4–9). Kou et al. beschrieben einen LS-Patienten mit 2 heterozygoten DNA-Polymorphismen innerhalb der intrazellulären Domäne auf dem gleichen Allel, doch die funktionelle Signifikanz dieser Varianten muss noch bestimmt werden (12).
Eine lösliche Form des GHR (GHBP hoher Affinität) ist im Blutstrom normaler Individuen vorhanden und dient als Reservoir und Puffer für zirkulierendes GH (10, 13, 14). Man geht davon aus, dass es beim Menschen infolge der proteolytischen Spaltung der extrazellulären Domäne aus dem Rest des Rezeptorproteins produziert wird, obwohl er Berichten zufolge bei Nagetieren aufgrund alternativen Spleißens produziert wird (15, 16). Die Anfangsmessung von GHBP in LS-Probanden zeigte fehlende oder extrem niedrige Werte, was mit der Hypothese übereinstimmt, dass die molekularen Defekte im Rezeptor die Bindung von GH schwächten (17).
Es wurde in letzter Zeit bewiesen, dass bis zu 20% ansonsten klassischer LS-Patienten mit normalem oder sogar erhöhtem GHBP-Spiegel GHBP-„positiv" sind (1, 18). In dieser Untergruppe wurde nur eine GHR-Mutation identifiziert, die die homozygote Substitution eines hochkonservierten Aspartatrests durch ein Histidin an einer Position in der extrazellulären Domäne des Rezeptors umfasst, das bekanntermaßen für die Rezeptor-Homodimerisierung entscheidend ist (D152H). Duquesnoy et al. zeigten, dass das Versagen der Rezeptor-Dimerisierung der Wirkmechanismus dieser Mutation ist und dass GH-Bindung davon nicht betroffen wurde, was den normalen GHBP-Spiegel erklärt (9).
Kein LS-Individuum mit einem funktionell signifikanten Defekt außerhalb der extrazellulären Domäne des GHR wurde beschrieben, obwohl Mutagenese-Experimente belegten, dass der Großteil der intrazellulären Domäne des GHR erforderlich ist, um die volle zelluläre Reaktionsfähigkeit auf GH zu mediieren (19–22). Daher kann man erwarten, dass natürlich vorkommende Mutationen, die zur Deletion oder schweren Beeinträchtigung der intrazellulären Domäne des Rezeptors führen, hohe GH-Resistenz unter Beibehaltung von GHB-Aktivität bewirken.
Die Anmelden beschreiben hierin zwei verwandte LS-Patienten, die hohe GH-Resistenz und überhöhte GHBP-Aktivität aufweisen. Die Analyse des GHR beider Individuen zeigte, dass sie für eine Arginin-Threonin-Substitution am N-terminalen Ende der intrazellulären Domäne des GHR homozygot sind. Da die Nucleotidsubstitution an einer kritischen Position in der 5'-Spleißdonorstelle von Exon 8 vorliegt, führt die Mutation zum Überspringen von Exon 8, was eine GHR-Mutante ohne funktionelle transmembrane oder intrazelluläre Domäne schafft.
Verfahren
Patienten: Patienten 1 und 2 sind Kusinen ersten Grades aus einer aus Kaschmir (Pakistan) stammenden Familie mit einem hohen Ausmaß an Blutsverwandtschaft.
NS manifestierte sich im alter von 2,5 Jahren mit starker Kleinwüchsigkeit (Körpergrößen-SDS –5,4) und einem typischen Gesichtsphänotyp. Der GH-Spiegel war deutlich erhöht (Basalwert 638 mU/l). Die IGF-I-Basalwerte waren bei < 20 ng/ml (NR 40–150 ng/ml) undetektierbar, und die IGFBP-3-Werte lagen mit 180 ng/ml unter dem 5. Percentil (NR 1410–297 ng/ml) (23). Die Verabreichung von exogenem hGN (0,1 IU/kg/Tag subkutan 4 Tage lang) lieferte weder betreffend den IGF-1- noch den IGFBP-3-Spiegel eine signifikante Response, was die schwere GH-Resistenz bestätigte. GHBP war mit 78,2% (mit normaler GH-Bindungsaffinität) > 95. Percentil für das betreffende Alter (1). Die erneute Messung von GHBP nach 6 Monaten IGF-I-Therapie zeigte keine Veränderung (der Wert betrug 82,1%), obwohl die Patientin gut auf die Therapie ansprach (die Wachstumsrate nahm auf 8,7 cm/Jahr zu). Ihre Eltern waren Cousins ersten Grades mit normaler Körpergröße. Ihre Mutter gebar kürzlich eine weitere Tochter, die in diesem Stadium normalwüchsig ist. Patient 2, ein Cousin ersten Grades, weist Wachstumsversagen (Körpergrößen-SDS –5,2), die typischen Gesichtsmerkmale von LS und – im Alter von 2,2 Jahren – einen Mikropenis auf. Die ersten Untersuchungen ergaben einen GH-Basalwert von 810 mU/l und IGF-I-Basalwerte von < 20 ng/ml.
Amplifikation genomischer DNA durch PCR und DNA-Sequenzieren: Genomische Leukozyten-DNA wurde aus Patienten und Familienmitgliedern mittels Standardverfahren produziert. In Patient 1 wurden Exons 4–10 (einschließlich der Intron-Exon-Grenzen) durch PCR mittels Primerpaaren (der Antisese war biotiniliert), abgeleitet aus der veröffentlichten DNA-Sequenz, individuell amplifiziert (3) (Sequenzen auf Anfrage verfügbar). Die PCR-Produkte wurden direktem genomischen Festphasen-Sequenzieren mittels Streptavidin-beschichteter paramagentischer Perlen (Dynal, Oslo, Norwegen) und einzelstrangiger Sequenaee-Technologie (U.S. Biochemical Corp., Cleveland, OH, USA) unterzogen. DNA-Sequenzen aus der ³⁵S-Autoradiographie wurden mit der veröffentlichten GHR-Sequenz verglichen (3).
Restriktionsenzym-Analyse: Die Mutation R274T schafft eine Restriktinsstelle für Mae II. Oligonucleotidprimer 8a und 8b dienten dazu, Exon 8 des GHR von Patienten 1 und 2 sowie von den Eltern von Patient 1 aus genomischer Leukozyten-DNA mittels PCR zu amplifizieren (die Primersequenzen sind in Tabelle 1 aufgelistet). Die Plazenta-DNA der neugeborenen Schwester von Patient 1 wurde mittels der gleichen Primer ebenfalls amplifiziert. 10 μl dieses PCr-Produkts wurden dann mit Mae II verdaut und auf einem 6% Polyacrylamidgel getrennt. DNA wurde durch Ethidiumbromid-Einfärbung visualisiert.
cDNA-Analyse
Lymphoblasten-Zelllinien wurden aus den Lymphozyten von Patient 1 durch Epstein-Barr-Virus- (EBV-) Transformation unter Anwendung von Standardverfahren erzeugt. Zelluläre RNA wurde von diesen mit EBV transformierten Lymphozyten isoliert und Vergleichslymphozyten aus peripherem Blut eines normalen Probanden unter Anwendung eines aus einem Schritt bestehenden Verfahrens entnommen (Biogenesis, Bournemouth, England). 15 μg dieser RNA wurde dann in einer durch Zufallshexamere geprimten reversen Transkriptionsreaktion in cDNA umgewandelt. GHR-cDNA (überspannt Exons 7–10) wurde mittels der ineinander geschachtelten PCR-Technik (siehe 3a) amplifiziert. Die Sequenz von PCR-Primern ist in Tabelle A angeführt. In der letzten PCR-Runde wurde Primer P6 biotiniliert, und man erhielt einzelne Stränge für das direkte Sequenzieren, das wie oben erfolgte.
GH-, IGF-1-, IGFBP-3 und GHBP-Analyse: GH wurde durch ELISA bestimmt. IGF-1 wurde durch spezifischen Radioimmunassay (RIA) Nach Säure-Ethanol-Extraktion gemessen (24). IGFBP-3 wurde auch unter Anwendung eines spezifischen RIA gemessen (25). GHBP wurde durch HPLC-Gelfiltration gemäß dem von Postel-Vinay et al. (26) beschriebenen Verfahrens gemessen. Es erfolgte keine Korrektur bezüglich hoher GH-Konzentration.
Messung der GHBP-Bindungsaffinität
Ein Scatchard-Graph wurde aus Kompetitionsbindungs-Versuchen unter Verwendung von 50 μl Plasma erhalten. Die Analyse erfolgte mittels des Programms Ligand (27).
Ergebnisse
Identifikation einer Missense-Mutation an der -1-Position der 5'-Donorspleißstelle von Exon 8 des GHR: Das Sequenzieren des GHR in Patienten 1 und 2 ergab die homozygote Substitution eines G durch ein C an Nucleotid 91 von Exon 8 (22; befindet sich an der -1-Position der 5'-Spleißdonorstelle). DNA-Sequenzieren zeigte keine weitere Veränderung gegenüber der veröffentlichten Sequenz oder geegenüber jener einer Vergleichsperson. Die Eltern von Patient 1 waren bezüglich dieser Mutation heterozygot.
Diese Nucleotidsubstitution führt zur Ersetzung von Arginin (ARG) durch Threonin (ACG) an Aminosäure 274 des reifen GHR (R274T), der vorhergesagten 4. Aminosäure der intrazellulären Domäne des Rezeptorproteins (10).
Restriktionsenzym-Kartierung
Die Mutation schafft eine Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym Mae II. Die Amplifikation eines 199 bp-Fragments von Exon 8-GHR (umfasst diese Mutation), gefolgt von Verdau mit Mae II, liefert 154 und 45 by große Fragmente, während das normale Fragment ungeschnitten bleibt. Wie aus 23 ersichtlich, ergab die Restriktionsenzym-Analyse der Eltern von Patient 1 ein gemischtes Verdaumuster, was ihren heterozygoten Status bestätigte, während betreffend Patienten 1 und 2 nur das kürzere 154 bp-Fragment ihre Homozygosität für die Mutation aufzeigt. Verdau von GHR Exon 8 aus der Plazenta-DNA des neugeborenen Bruders von Patient 1 deckt auf, dass er bezüglich der Mutation heterozygot ist.
cDNA-Analyse
Die cDNA-Amplifikation aus Vergleichslymphozyten mit Primern P4 und P5 erzeugte wie erwartet eine Bande von 267 bp. Aus den mit EBV transformierten Lymphozyten von Patient 1 wurde nur ein kleineres Produkt von 176 by erhalten. Das direkte Sequenzieren dieser RT-PCR-Produkte zeigte, dass in der aus Patient 1 erhaltenen GHR-mRNA Exon 8 übersprungen wird, was dazu führt, dass Exon 7 in Exon 9 spleißt (24), während die GHR-mRNA aus den Vergleichslymphozyten normal mit Exon 8 nach Exon 7 gespleißt war.
Eigenschaften des Serum-GHBP
Die GH-Bindungsaffinität des GHBP von Patient 1 lag innerhalb normaler Grenzen, wobei die Assoziationskonstante (Ka) 3,09 × 10^–8 M betrug (normaler Bereich bei Erwachsenen: 3,6–7,4 × 10^–8 M). Die maximale Bindungskapazität von Plasma für GH (Bmax) war deutlich erhöht (317 ng/ml Plasma; normaler Bereich bei Erwachsenen: 24–86 ng/ml). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Zunahme des messbaren GHBP ein absolute Zunahme des im Blutstrom befindlichen Bndungsprotens widerspiegelt. Der ¹²⁵I-hGH-GHBP-Komplex eluierte zum erwarteten Zeitpunkt aus der HPLC-Säule, was nahe legt, dass das Molekulargewicht des GHBP im Plasma von Patient 1 mit jenem normaler Probanden vergleichbar ist.
Diskussion
Die vorliegenden Ergebnisse dokumentieren zum ersten Mal LS in Assoziation mit einem homozygoten Defekt in der intrazellulären Domäne des GHR. Diese Mutation an der 5'-Donorspleißstelle von Exon 8 führt zum Überspringen von Exon 8, das für die transmembrane Domäne des GHR kodiert. Die betroffenen Kinder besitzen abgesehen vom GHBP im Probanden, der deutlich über dem normalen Bereich liegt, einen klassischen Phänotyp. Die Eltern, deren Heterozygosität die Anmelder belegten, sind von normaler Statur.
Die Beobachtung der Anmelder, dass diese G-C-Transvesion an der -1-Position der 5'-Donorspleißstelle zum Überspringen des Exons führt, kam nicht überraschend. Das Nucleotid G an der -1-Position ist in 78% aller 5'-Donorstellen konserviert, und man kann davon ausgehen, dass es für normales Spleißen entscheidend ist. Shapiro und Senapathy (28) verglichen Daten von 62 anderen Punktmutationen an 5'-Spleißstellen in anderen Genen: In mehr als der Hälfte dieser Arbeiten, die Daten über ihre Auswirkung auf mRNA enthalten, war das Exon-Überspringen das einzige aberrante Transkriptionsprodukt (28). Die einzige andere Konsequenz einer solchen Mutation ist die kryptische Spleißstellen-Verwendung, doch dies scheint bei dieser Mutation nicht der Fall gewesen zu sein, da die Anmelder keine anderen abnormalen RT-PCR-Fragmente detektieren konnten.
Das Überspringen von Exon 8 in der GHR-mRNA führt auch dazu, dass Exon 9 (das für den Beginn der intrazellulären Domäne kodiert) außerhalb des Rahmens mit einem Stopcodon 5 Aminosäuren stromab transkribiert ist. Daher sagen die Anmelder voraus, dass die durch diese Individuen produzierte GHR-Proteinmutante keine transmembrane Domäne und keine funktionelle intrazelluläre Domäne besitzen würde. Diese Erkenntnis stimmt mit der hohen GH-Resistenz überein, die man bei den Patienten vorfindet, da ein derartiges Molekül zur Signaltransduktion nicht in der Lage wäre.
Der Mangel einer transmembranen Domäne würde dazu führen, dass der Rezeptor nicht mehr in der Zellmembran verankert ist, doch mit einer normalen extrazellulären Domäne sollte er zur GH-Bindung fähig sein. Der erhöhte GHBP-Spiegel in Patient 1 kann daher insofern erklärt werden, als das gesamte von ihr produzierte GHR-Pro tein in den Blutstrom freigesetzt wird und als GHBP messbar ist. Die Entdeckung normaler GH-Bindungsaffinität im Serum legt nahe, dass dieser erhöhte Wert an GHBP nicht auf eine Zunahme der Affinität der Rezptormutante, sondern auf eine absolute Zunahme im Blutstrom befindlicher Rezeptoren zurückzuführen ist, die zur Bindung von GH zur Verfügung stehen.
Diese direkte Beziehung zwischen Rezeptorzahl und gemessenem GHBP bietet die einzigartige Möglichkeit, die Wirkung von IGF-I auf das Ausmaß der GHR-Gen-Expression zu bewerten. In normalen Probanden wurde vorgeschlagen, dass eine Veränderung des GHBP-Serumspiegels auf Veränderungen zellulärer GHR-Werte, der Rezeptorproteolyse oder der GHBP-Clearance schließen lässt (29). In letzter Zeit berichteten Silbergeld et al. über einen Abfall des Serum-GHBP nach IGF-I-Therapie in 3 LS-Probanden mit einem möglichen Postrezeptor-Defekt, wobei diese Erkenntnis als Beweis interpretiert wurde, dass IGF-1 ein Regulationsfaktor für Serum-GHBP sein könnte (30). Im Fall der vorliegenden Patientin jedoch fiel trotz des guten Ansprechens auf die IGF-I-Therapie in Bezug auf die Wachstumsrate ihr GHBP-Wert nur geringfügig und liegt nach wie vor deutlich über dem für ihr Alter normalen Bereich.
Zusammenfassend gesagt wurde hierin die erste homozygote Mutation beschrieben, die die intrazelluläre Domäne des Rezeptors im GHR von 2 Patienten mit LS betraf; dadurch kommt es offenbar zur Überspringung von Exon 8 und zur Produktion eines GHR ohne transmembrane oder intrazelluläre Domäne. Die Anmelder legten dar, dass sie in homozygoter Form deutlich mit dem Krankheitsphänotyp segregiert und sie wahrscheinlich die Ursache für den Defekt im GHR dieser Variante von LS mit erhöhtem GHBP-Spiegel ist. Die einzige andere Mutation, die in dieser GHBP-„positiven" Variante von LS zu identifizieren ist, wurde in der extrazellulären Domäne des Rezeptors lokalisiert, wodurch sich die molekulare Heterogenität dieser Form von LS zeigt. Weitere Studien über Patienten mit diesem Phänotyp werden wahrscheinlich wichtige Einblicke in die GHR-Funktion geben.
Literaturverweise

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Schlussfolgerungen
Eine Untergruppe von Kindern mit ISS besitzen Phänotypen, die partielles GHIS in der Ätiologie ihrer Kleinwüchsigkeit nahe legen. Die hierin aufgestellte Hypothese reduzierter GHR-Signalisierung, die sich in niedrigerem IGF-1-Spiegel und höheren GH-Konzentrationen mit höheren GHBP-Werten äußert, wurde durch Identifikation von GHR-Mutationen in kleinwüchsigen nicht-GH-defizienten Patienten (ausgewählt hinsichtlich niedrigem GHBP- und IGF-I-Spiegel) bestätigt. Keine der 24 normalen Vergleichspersonen wies durch SSCA detektierbare Sequenzveränderungen auf, während 4 von 14 ausgewählten ISS-Patienten identifizierbare Einzelbasenpaar-Veränderungen besaßen (p = 0,014). Da SSCA etwa 80 % bekannter Mutationen in Modellsystemen detektieren kann (Vidal-Puig und Moller, Biotechniques 17, 490–496 (1994); Ravnik-Glavac et al., Hum. Mol. Genet. 3, 801–807 (1994), sind möglicherweise zusätzliche Mutationen in diesen ISS-Patienten vorhanden, die nicht beachtet wurden.
2 der 4 ISS-Patienten mit GHR-Mutationen sprachen auf exogenes GH an (Patienten 1 und 2 in Tabelle IX). Die Gegenwart von Mutationen und das Ansprechen auf GH legen nahe, dass diese Patienten infolge von dysfunktionellem GHF partiell GN-unempfindlich sein können. Ohne sich auf eine bestimmte Theorie beschränken zu wollen, kann man davon ausgehen, dass die Unfähigkeit von Patient 4, auf GH anzusprechen, am wahrscheinlichsten die Beschaffenheit der zwei Mutationen in seinen GHR-Allelen widerspiegelt. Eine Änderung reduziert die Rezeptoraffinität für GH um das 330fache, wodurch dieser Rezeptor gegenüber physiologischen oder pharmakologischen GH-Mengen vermutlich unempfindlich wird. Die Auswirkung der zweiten Veränderung, R161C, ist unbekannt, doch ist diese Mutation sehr schwer; im homo zygoten Zustand bewirkt sie komplettes GHIS. Amselem et al., s. o. Der 4. Patient (Patient 7) war noch nicht mit GH behandelt worden. Es geht aus den vorliegenden Ergebnissen klar hervor, dass sich ein Kontinuum der Empfänglichkeit für GH von komplettem GHIS (wie bei LS erkennbar) über schwer unempfindliche ISS-Patienten ohne die phänotypischen Eigenschaften von LS, die aber möglicherweise nicht auf GH-Standarddosen ansprechen, ISS-Patienten mit partiellem GHIS, die auf Standard-GH-Therapie ansprechen, bis zu Personen mit normalem Phänotyp erstreckt.
Patient 4 ist kombiniert-heterozygot bezüglich der E44K- und R161C-Substitutionen, wobei jeder Elternteil bezüglich einer der zwei Mutationen heterozygot ist. Die Körpergrößen der Eltern und Großeltern liegen alle im normalen Bereich für die Erwachsenenbevölkerung; die Körpergrößen bekannter Träger einer einzelnen Mutationen liegen jedoch unter dem Mittel. Patient 2 ist heterozygot für die Cystein-Stop-Mutation an Position 122 und besitzt somit ein Allel, das ein gekürztes – vermutlich instabiles – Protein produziert. Sein Mutter trägt die gleiche Mutation. Patient 2, der nun 19 Jahre alt ist, ist von dieser Mutation schwerer betroffen (Körpergrößen-SDS –3,2) als seine Mutter (Körpergrößen-SDS –1,4). Ohne sich auf eine bestimmte Theorie beschränken zu wollen, könnte man festhalten, dass ein Proband eine noch undefinierte Mutation von seinem Vater (Körpergrößen-SDS –1,4) geerbt haben könnte, die die Expression des strukturell normalen GHR-Allels oder einen anderen Schritt entlang der GH-Achse beeinflusst hat. Familie 2 ähnelt einem mutmaßlichen LS-Patienten und seiner nicht betroffenen Mutter, von denen beide zwei Mutationen auf einem Allel des GHR-Locus trugen. Kou et al., J. C. E. M. 76, 54–59 (1993). Die Ähnlichkeit zwischen diesem Patienten und Patienten 2 legt gemäß einer Theorie nahe, dass beide die Träger einer unidentifizierten zweiten Mutation sein könnten – analog zu zahlreichen Insulin-unempfindlichen Patienten, bei denen reduzierte Mengen an Insulinrezeptor-mRNA trotz des Fehlens einer Mutation in einem Exon beobachtet wurden (einen Überblick gibt Taylor et al., Endocrine Rev. 13, 566–595 (1992)).
Zwei andere Patienten tragen heterozygote Mutationen, die zu Aminosäuresubstitutionen führen (R211 N in Patient 1 und E224D in Patient 7). Die Eltern von Patient 1 besaßen beide Körpergrößen im normalen Bereich für die erwachsene Bevölkerung. Hamill et al., Am. J. Clin. Nutrition 32, 607–629 (1979). Der Vater von Patient 7 besaß einen Körpergrößen-SDS von –0,43 und seine Mutter von +1,4.
LS ist ein autosomaler rezessiver Krankheitszustand. Die betroffenen Individuen erben üblicherweise die gleiche Mutation von blutsverwandten Eltern. Heterozygote für GHR-Mutationen (Eltern und Geschwister von LS-Patienten) weisen möglicherweise schwache Wachstumsanomalien auf. Laron, The Endocrinologist 3, 21–28 (1993); Rosenbloom et al., Acta Paediatr. Suppl. 399, 125–127 (1994). Etwa die Hälfte von heterozygoten Trägern besitzen einen GHBP-Spiegel von mehr als 2 SD unter dem Mittel für das Alter. Aguirre et al., Norm Res. 34, 4–8 (1990); Laron et al., Acta Endocrinol. 121, 603–608 (1989). Außerdem berichtete Laron, The Endocrinologist, s. o., dass die Körpergrößen von Eltern und klinisch normalen Geschwistern von LS-Patienten typischerweise unter dem 50. Percentil für ihr Geschlecht und ihren ethnischen Ursprung liegen. Ohne sich auf eine bestimmte Theorie beschränken zu wollen, könnte partielles GHIS, das zu einem Körpergrößen-SDS von weniger als –2 führt, in Trägern heterozygoter Mutationen des GHR unter dem Einfluss bestimmter Genotypen an noch nicht identifizierten Modifikatorloci oder dann auftreten, wenn die Veränderungen einen dominanten negativen Phänotyp verleihen, wie dies im Fall von heterozygoten Insulinrezeptor-Mutationen in mehreren Insulin-unempfindlichen Patienten vorgeschlagen wurde.
Die 5 in den 4 Patienten identifizierten Mutationen (E44K, C11X, R161C, R211H, E224D) sind auf die extrazelluläre Domäne des Rezeptors beschränkt. Die E44K-Substitution bewirkt eine 330fache Reduktion der GH-Affinität, während Änderungen der R161-, R211- oder E224-Reste subtile Auswirkungen auf die Ligandenbindung hatten (Tabelle X).
Rest R211 ist zur Ligandenbindungs- und Dimerisierungsstelle von GHR distal gelegen. Er grenzt jedoch an das „WS-ähnliche" Motiv an, das in der gesamten Cytokinrezeptor-Überfamilie konserviert ist. Reste aus dem WS-ähnlichen Motiv sind liegen eng an R211 und anderen Aminosäure-Seitenketten an, um einen Stapel abwechselnder aromatischer und basischer Seitenketten zu bilden.
Rest E224 entspricht dem variablen Rest des WS-ähnlichen Motivs. Wie R211 liegt er außerhalb der bekannten Bindungsstellen auf dem GHR-Molekül, und die Mutationen ändern die GH-Bindung nicht signifikant (Tabelle X). Eine in Säugetierzellen in Kultur exprimierte E224A-Substitution hatte die subzelluläre Lokalisierung modifiziert. Baumgartner et al., J. Biol. Chem. 269, 29094–29101 (1994). Ein größerer Anteil des gesamten Rezeptors wurde an einer kernproximalen Position beobachtet. Es ist nicht bekannt, ob dies auf Akkumulierung von neu synthetisiertem Rezeptor oder erhöhte Rezeptor-Internalisierung schließen lässt. Ohne sich auf eine bestimmte Theorie festlegen zu wollen, könnte Folgendes festgehalten werden: Wenn die E224D-Muation eine ähnliche Wirkung hat, könnte die unkorrekte Verarbeitung zu reduzierten Rezeptorzahlen auf der Zelloberfläche und einer damit einhergehenden Reduktion des Serum-GHBP-Spiegels führen.
Mit dieser Studie wird gezeigt, dass die Selektion einer Untergruppe von ISS-Kindern mit klinischen Parametern, die partielle Unempfindlichkeit gegenüber GH nahe legen, Patienten identifiziert, die GHR-Mutationen tragen, die GHR-Funktion beeinflussen können. Da die untersuchten Patienten auf der Basis von reduziertem zirkulierendem funktionellem GHBP ausgewählt wurden, müssen die Mutationen die Ligandenbindung direkt betreffen (E44K) oder eine Reduktion der Verfügbarkeit des Zelloberflächenrezeptors verursachen (R161C, R211H und E224D), wodurch zu partiellem GHIS beigetragen wird. 2 der 3 ISS-Patienten mit GHR-Mutationen, die mit exogenem GH behandelt wurden, wiesen GN-reaktives partielles GHIS auf.
Beispiel 6
80 präpubertäre Kinder im Alter von 5–12, deren Diagnose auf eine durchschnittliche Körpergröße von weniger als –2 SD unter normaler Körpergröße, einen Serumspiegel von GHBP von zumindest 2 SD unter dem normalen Wert und einen Serumspiegel von IGF-I unter dem normalen Mittel sowie einen zumindest normalen mittleren oder maximalen stimulierten Serumspiegel von GH lautet, werden wie folg behandelt: 20 mit IGF-1 alleine, 20 mit GH alleine, 20 mit GH und IGF-1 gemeinsam und 20 mit Plazebo. Wenn die Medikamente alleine verabreicht werden, wird IGF-1 einmal täglich durch subkutane Injektion in einer Dosis von 150 μg/kg/Tag und GH einmal täglich durch subkutane Injektion in einer Dosis von 0,70 mg/kg/Woche verabreicht. Im Fall einer Kombination von Medikamenten, wird IGF-1 einmal täglich durch subkutane Injektion in einer Dosis von 75 μg/kg/Tag und GH einmal täglich durch subkutane Injektion in einer Dosis von 0,35 mg/kg/Woche verabreicht. Die IGF-I-Formulierung ist entweder (a) 10 mg/ml IGF-1 in 20 mM Natriumacetatpuffer, 2,5 mg/ml (0,25 %) Phenol, 45 mg/ml Mannit, pH 5,0; oder (b) 10 mg/ml IGF-1 in 50 mM Natriumacetatpuffer, 2,5 mg/ml Phenol, 5,84 mg/ml NaCl un d9 mg/ml Benzylalkohol, pH 5,4. Die GH-Formulierung ist entweder Nutropin^® oder Protropin^® GH von Genentech, Inc. Die Patienten werden gemäß dieser Arbeitsvorschrift 6 Monate behandelt. Es wird die Körpergrößenzunahmefedes Patienten gemessen.
In dieser Studie kann man erwarten, dass IGF-I, GH oder die Kombination die Wachstumsraten aller Patienten gegenüber den mit Placebo behandelten Patienten erhöht.
Alernative Designs für klinische Versuche sind wie folgt: Die gleichen Gruppen und Untergruppen von Kindern werden in der gleichen Weise mit GH alleine mit 0,35 mg/kg/Woche oder 0,70 mg/kg/Woche oder mit IGF-I alleine mit 75, 100, 150 oder 200 μg/kg/Tag behandelt. Für die Kombinationsbehandlung wird GH zu 0,35 mg/kg/ Woche und IGF-I zu 75 oder 100 μg/kg/Tag mit oder ohne Verwendung eines Placebo zu Vergleichszwecken verwendet.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Identifizieren eines menschlichen Patienten, der an partiellem Wachstumshormon-Unempfindlichkeitssyndrom, nicht aber an Laron-Syndrom leidet, umfassend das Detektieren eines heterogenen Gendefekts innerhalb der intrazellulären Domäne des Wachstumshormonrezeptor- (GHR-) Gens in einer vom Patienten erhaltenen biologischen Probe.
Verfahren nach Anspruch 1, worin zumindest eine der folgenden Mutationen detektiert wird: 5473-Polymorphie, A478T, C422F, P561T, T306P und C518Stop.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin der Patient eine Körpergröße hat, die weniger als –2 Standardabweichungen unterhalb der für das Alter und Geschlecht normalen liegt, einen IGF-1-Spiegel im Serum aufweist, der unterhalb normalen mittleren Mengen liegt, und einen mittleren oder maximalen stimulierten GH-Spiegel im Serum aufweist, der zumindest normal ist.