DE69838647T2

DE69838647T2 - Behandlung von fettleibigkeit

Info

Publication number: DE69838647T2
Application number: DE69838647T
Authority: DE
Inventors: Frank Man-Woon Kew NG; Woei-Jia Clayton JIANG
Original assignee: Metabolic Pharmaceuticals Pty Ltd
Current assignee: Metabolic Pharmaceuticals Pty Ltd
Priority date: 1997-09-08
Filing date: 1998-09-04
Publication date: 2008-08-28
Anticipated expiration: 2018-09-05
Also published as: CN1275132A; JP2002501004A; NZ502993A; WO1999012969A1; CN1195776C; ATE377026T1; CA2303395C; BR9811755A; DE69838647D1; EP1012189B1; JP4334761B2; EP1012189A1; ES2296342T3; RU2223970C2; CA2303395A1; US6737407B1; US20040192608A1; EP1012189A4

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft die Behandlung von Fettsucht bei Tieren. Insbesondere betrifft die Erfindung die Behandlung von Fettsucht beim Menschen, obwohl es selbstverständlich sein soll, daß sich die vorliegende Erfindung auch auf die Behandlung von Fettsucht bei nicht-humanen Säugern erstreckt, um z. B. die Fleischqualität bei Zuchttieren zu verbessern, die für die Nahrungsmittelproduktion verwendet werden.
Allgemeiner Stand der Technik
Die entscheidende Rolle des Human-Wachstumshormons (hGH) beim postnatalen Wachstum beim Menschen ist allgemein bekannt. Weniger offensichtlich ist der Einfluß dieses Hormons auf die Regelung des Lipid- und des Kohlehydratstoffwechsels, weil detaillierte molekulare Studien fehlen.
Es ist ausreichend dokumentiert, daß die vorherrschende Form von hGH ein globuläres Protein mit einem Molekulargewicht von 22000 Dalton (22 kD) ist und aus 191 Aminosäureresten in einer einzigen Kette besteht, die durch 2 Disulfidbindungen mit einer kleinen Schleife am Carboxy-Terminus zwischen den Resten 182 und 189 gefaltet ist. Neuere kristallographische Untersuchungen zeigen auch, daß das hGH-Molekül vier antiparallele α-Helices enthält, die in einem linksgedrehten, fest gepackten Helixbündel angeordnet sind ¹. Die Auffassung, daß es einzelne funktionelle Domänen innerhalb des hGH-Moleküls gibt, die für bestimmte Stoffwechselwirkungen des Hormons verantwortlich sind, ist allgemein anerkannt. Der Amino-Terminus ist als funktionelle Domäne identifiziert worden, die für insulinähnliche Wirkungen des hGH-Moleküls verantwortlich ist ^2,3.
Die Technologie der rekombinanten DNA eröffnet den Weg zur kommerziellen Massenproduktion des Human-Wachstumshormons, und das rekombinante hGH hat anscheinend eine äquivalente biologische Wirksamkeit und äquivalente pharmakokinetische Eigenschaften ^4,5. Die gegenwärtige Bereitstellung dieses multifunktionellen Hormons schränkt die Arten und Anzahl der experimentellen Therapien beim Menschen und beim Tier nicht mehr ein. Die Verwendung von hGH für die Behandlung von kleinwüchsigen Kindern und Erwachsenen hat sich allgemein durchgesetzt ⁶. Es ist auch von der therapeutischen Wirkung von hGH bei der femalen Infertilität berichtet worden ^7,8. Die Behandlung der Fettsucht beim Menschen mit hGH stößt auf eine Vielzahl von Problemen. Ergebnisse liegen nahe, daß dieses multifunktionelle Hormon durch verschiedene biologisch aktive Domänen innerhalb der Moleküle oft gleichzeitig einige nachteilige Wirkungen in vivo ausübt ^9,10.
Die Regelung des Lipidstoffwechsels durch GH wurde 1959 von Raben und Rollenberg zum ersten Mal beschrieben ¹¹. Die regelnde Rolle des Hormons beim Lipidstoffwechsel wurde später durch Untersuchungen des Körperaufbaus von Menschen ^12,13 und Schweinen ^14,15 mit GH-Mangel und GH-Behandlung begründet. Die Erkenntnis von Gertner liegt nahe, daß hGH durch eine Reihe von Wechselwirkungen, die als der "GH-Fettzyklus" bekannt sind, mit der Verteilung von adipösem Gewebe verbunden ist ¹⁶. Die molekularen Vorgänge, die sich bis zu diesen biochemischen und physiologischen Veränderungen ereignen, blieben jedoch weitestgehend unbekannt. Die Stoffwechseleffekte von GH auf adipöse und andere Gewebe in vivo sind variabel und komplex, wobei sie anscheinend aus mindestens zwei Komponenten bestehen, einem frühen insulinähnlichen Effekt, dem ein späterer, stärker ausgeprägter Antiinsulineffekt folgt ¹⁷. Die Ergebnisse des letzteren Effektes können sowohl eine Stimulation der Lipolyse als auch eine Hemmung der Lipogenese einschließen. Der antilipogene Effekt von hGH ist mit Nachweisen der Abnahme der Expression des Glucosetransporters GLUT 4 in Adipocyten ¹⁸, die Hemmung der Aktivität von Acetyl-CoA-Carboxylase in adipösen Geweben ^19,20 und die Verringerung der Einführung von Glucose in Lipid sowohl in isolierten Zellen als auch Geweben ^21,22 nachgewiesen worden.
Angesichts der multifunktionellen Effekte von intaktem hGH und der bei den klinischen Anwendungen des intakten Hormons auftretenden Probleme richtete sich die zur vorliegenden Erfindung führende Arbeit auf die Erforschung, ob hGH-Derivate synthetisiert werden können, die die gewünschten biologischen Wirkungen beibehalten und denen die unerwünschten Nebenwirkungen fehlen.
Die Untersuchungen bezüglich Struktur-Funktion von hGH bei synthetischen hormonalen Fragmenten haben gezeigt, daß der Carboxy-Terminus des hGH-Moleküls anscheinend die funktionelle Domäne des Hormons für die Regelung des Lipidstoffwechsels ist ^20,23, und bei einem Labormodell mit fettleibigen Tieren ist nachgewiesen worden, daß ein synthetisches Peptid mit einer Sequenz, die auf der Carboxy-Endregion basiert, die Körpergewichtszunahme und die Masse von adipösem Gewebe verringert.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Peptid bereit, das ein Analogon der Carboxy-Endsequenz des Human-Wachstumshormons ist und die folgende Aminosäuresequenz aufweist:
Tyr-Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe.
Wie vorstehend beschrieben, schließt die Carboxy-Endsequenz des Wachstumshormons eine biologisch aktive Domäne für den Lipidstoffwechsel ein.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Zusammensetzung für die Verwendung bei der Behandlung von Fettsucht bereit, die eine wirksame Menge des Peptids, das ein Analogon der Carboxy-Endsequenz eines Wachstumshormons aufweist, wie es vorstehend beschrieben ist, zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Trägern und/oder Verdünnungsmitteln umfaßt.
Nach einem weiteren Gesichtspunkt gibt die vorliegende Erfindung die Verwendung des Peptids, das ein Analogon der Carboxy-Endsequenz eines Wachstumshormons aufweist, wie es vorstehend beschrieben ist, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Fettsucht bei einem Tier an.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Der Begriff "Fettsucht" wird in dieser Beschreibung durchweg sowohl für ein übermäßiges Körpergewicht als auch eine übermäßige Masse an adipösem Gewebe bei einem Tier verwendet, und folglich schließen Hinweise auf die Behandlung von Fettsucht sowohl eine Verringerung der Körpergewichtszunahme als auch eine Verringerung der Masse von adipösem Gewebe bei einem fettleibigen Tier ein.
Das erwartete Resultat irgendeiner Behandlung der Fettsucht ist eine Verringerung des Körpergewichts, insbesondere der Masse von adipösem Körpergewebe. Die Verringerung der Masse von adipösem Körpergewebe wird durch zwei biochemischen Prozesse direkt geregelt – die Lipogenese (Fettproduktion) und die Lipolyse (Fettverminderung) – und es ist allgemein selbstverständlich, daß diese biochemischen Prozesse von Schlüsselenzymen für den Stoffwechsel gesteuert werden, insbesondere das fettreduzierende Schlüsselenzym (hormonempfindliche Lipase) und das fettproduzierende Schlüsselenzym (Acetyl-CoA-Carboxylase).
Die hier genannten Erfinder haben gezeigt, daß hGH 177–191 bei der Stimulation des fettreduzierenden Schlüsselenzyms, der hormonempfindlichen Lipase, und bei der Hemmung des fettproduzierenden Schlüsselenzyms, Acetyl-CoA-Carboxylase, wirksam ist. Das wird ferner durch Werte unterstützt, die zeigen, daß der Fettverbrauch in Gegenwart von hGH 177–191 beschleunigt wird, während die Fettproduktion verringert wird, was anhand von Stoffwechselendprodukten in vitro sowie auch in vivo gemessen wurde. Außerdem ist nachgewiesen worden, daß sich der Mechanismus dieser molekularen Wirkungen aus der Aktivierung der Produktion des zellulären zweiten Messengers Diacylglycerol ergibt.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Peptid gemäß Anspruch 1 bereit.
Zu Peptiden, die die Aminosäurereste 177–191 des natürlichen Human-Wachstumshormons (hGH 177–191) aufweisen, gehört die folgende Sequenz (Bezugsnr. 9401):
Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe (Sequenzidentifizierungsnr.: 1).
Ein solches natürliches Peptid kann in der cyclischen Disulfidform vorliegen und ein Additionssalz einer organischen oder anorganischen Säure umfassen.
Das Elongations-Analogon gemäß der vorliegenden Erfindung, das besonders deutliche Eigenschaften gegen Fettsucht zeigt, ist das folgende (Bezugsnr. 9604):
Tyr-Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe (Sequenzidentifizierungsnr.: 19).
Die Bindung zwischen den Aminosäuren 182 und 189 des hGH kann eine Disulfidbindung sein.
Falls geeignet, kann das vorstehend beschriebene Analogon ein Additionssalz einer organischen oder anorganischen Säure umfassen.
Der hier benutzte Begriff "wirksame Menge" steht für die Menge des Peptids, die ausreicht, um bei der Behandlung von Fettsucht beim Tier die gewünschte Wirkung zu erzielen, die jedoch keine so große Menge ist, daß es zu ernsthaften Nebenwirkungen oder schädlichen Reaktionen kommt.
Nach einem weiteren Gesichtspunkt gibt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Peptids, das ein Analogon der Carboxy-Endsequenz eines Wachstumshormons aufweist, wie es vorstehend beschrieben ist, bei der Behandlung von Fettsucht bei einem Tier oder bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Fettsucht bei einem Tier an.
Nach einem weiteren Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung für die Verwendung bei der Behandlung von Fettsucht bei einem Tier bereit, die eine wirksame Menge eines Peptids, das ein Analogon der Carboxy-Endsequenz eines Wachstumshormons aufweist, wie es vorstehend beschrieben ist, zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Trägern und/oder Verdünnungsmitteln umfaßt.
Das Peptid, das der wirksame Bestandteil bzw. Wirkstoff der pharmazeutischen Zusammensetzung dieses Gesichtspunkts der Erfindung ist, zeigt eine vorteilhafte therapeutische Wirkung bei der Behandlung von Fettsucht bei einem Tier, wenn es in einer Menge verabreicht wird, die für diesen bestimmten Fall geeignet ist. Es können z. B. etwa 0,5 μg bis etwa 20 mg pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag verabreicht werden. Die Dosierungsbereiche können so eingestellt werden, daß für die optimale prophylaktische oder therapeutische Reaktion gesorgt wird. Es können z. B. ein oder mehrere Teildosen täglich, wöchentlich, monatlich oder in anderen geeigneten Zeitabständen verabreicht werden oder die Dosis kann proportional verringert werden, so wie es die Dringlichkeit der klinischen Situation erfordert.
Der wirksame Bestandteil kann in irgendeiner geeigneten Art und Weise verabreicht werden, wie auf oralem, parenteralem (einschließlich einer intraperitonealen, intravenösen, subkutanen, intramuskulären und intramedullären Injektion), intranasalem, intradermalem Weg oder mittels Zäpfchen oder durch Implantation (z. B. unter Verwendung von langsam freisetzenden Vorrichtungen). Für eine einfache Verabreichung ist die orale Verabreichung bevorzugt, die parenterale Verabreichung ist jedoch ebenfalls recht bequem. In Abhängigkeit vom Verabreichungsweg kann es erforderlich sein, daß der wirksame Bestandteil mit einem Material überzogen ist, das diesen Bestandteil vor der Einwirkung von Enzymen, Säuren und anderen natürlichen Bedingungen schützt, die diesen Bestandteil inaktivieren können. Aufgrund einer geringen Lipophilie des Bestandteils kann er z. B. im Magendarmtrakt von Enzymen, die Peptidbindungen spalten können, und im Magen durch Säurehydrolyse zerstört werden. Um die Zusammensetzung durch eine andere als die parenterale Verabreichung verabreichen zu können, kann der wirksame Bestandteil mit einem Material überzogen oder verabreicht werden, das dessen Inaktivierung verhindert.
Der wirksame Bestandteil kann auch in Dispersionen verabreicht werden, die in Glycerol, flüssigen Polyethylenglycolen und/oder Gemischen davon und in Ölen hergestellt sind. Unter üblichen Bedingungen der Lagerung und Verwendung enthalten diese Präparate gewöhnlich ein Konservierungsmittel, um das Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern.
Zu pharmazeutischen Formen, die für die Verwendung durch Injektion geeignet sind, gehören sterile wäßrige Lösungen (wenn wasserlöslich) oder Dispersionen und sterile Pulver für die extemporierte Zubereitung von sterilen injizierbaren Lösungen oder einer Dispersion. In allen Fällen muß die Form steril und derart fluid sein, daß sie sich leicht spritzen läßt. Sie muß unter den Bedingungen der Herstellung und Lagerung stabil sein und gegenüber einer verunreinigenden Wirkung von Mikroorganismen, wie Bakterien und Pilzen, konserviert sein. Der Träger kann ein Lösungsmittel oder Dispersionsmittel sein, das z. B. Wasser, Ethanol, Polyol (z. B. Glycerol, Propylenglycol und flüssiges Polyethylenglycol und dgl.), geeignete Gemische davon und pflanzliche Öle enthält. Die geeignete Fluididität kann z. B. durch die Verwendung einer Beschichtung, wie Lecithin, durch Beibehaltung der erforderlichen Partikelgröße im Falle einer Dispersion und durch die Verwendung von grenzflächenaktiven Mitteln aufrechterhalten werden. Die Verhinderung der Einwirkung von Mikroorganismen kann durch verschiedene antibakterielle und antifungizide Mittel, z. B. Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure, Thiomorosal und dgl., erreicht werden. In vielen Fällen ist es bevorzugt, isotonische Mittel, z. B. Zucker oder Natriumchlorid, aufzunehmen. Eine längere Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann z. B. durch die Verwendung von die Absorption verzögernden Mitteln in den Zusammensetzungen erreicht werden.
Sterile injizierbare Lösungen werden hergestellt, indem der wirksame Bestandteil in der erforderlichen Menge falls erforderlich mit verschiedenen der anderen vorstehend aufgeführten Bestandteile im geeigneten Lösungsmittel aufgenommen wird, darauf folgt die Filtersterilisation. Dispersionen werden im allgemeinen hergestellt, indem der sterilisierte wirksame Bestandteil in einen sterilen Träger eingebracht wird, der das grundsätzliche Dispersionsmittel und die erforderlichen weiteren Bestandteile aus den vorstehend aufgeführten enthält. Im Falle von sterilen Pulvern für die Herstellung von sterilen injizierbaren Lösungen sind die bevorzugten Herstellungsverfahren das Vakuumtrocknungs- und das Gefriertrocknungsverfahren, die ein Pulver des wirksamen Bestandteils plus irgendeines weiteren erwünschten Bestandteils aus einer bereits steril filtrierten Lösung davon ergeben.
Wenn der wirksame Bestandteil geeignet geschützt ist, wie es vorstehend beschrieben ist, kann die Zusammensetzung oral verabreicht werden, z. B. mit einem inerten Verdünnungsmittel oder mit einem assimilierbaren eßbaren Träger, oder sie kann in einer Gelatinekapsel mit har ter oder weicher Hülle enthalten sein oder sie kann zu Tabletten gepreßt sein oder sie kann direkt im Nahrungsmittel der Diät enthalten sein. Für die orale Verabreichung kann der wirksame Bestandteil mit Trägern eingeführt und in Form von einnehmbaren Tabletten, Mundtabletten, Pastillen, Kapseln, Elixieren, Suspensionen, Sirups, Oblaten und dgl. verwendet werden. Solche Zusammensetzungen und Präparate sollten mindestens 0,01 Gew.-% und stärker bevorzugt mindestens 0,1 bis 1 Gew.-% des wirksamen Bestandteils enthalten. Der Prozentsatz der Zusammensetzungen und Präparate kann natürlich geändert werden und kann geeigneterweise zwischen etwa 5 und etwa 80% des Gewichts der Einheit liegen. Die Menge des wirksamen Bestandteils in den pharmazeutischen Zusammensetzungen ist derart, daß eine geeignete Dosis erhalten wird. Geeignete Zusammensetzungen oder Präparate gemäß der vorliegenden Erfindung können z. B. so hergestellt werden, daß die Form einer oralen Dosierungseinheit etwa 0,5 μg bis 200 mg und stärker bevorzugt 10 μg bis 200 mg des wirksamen Bestandteils enthält.
Die Tabletten, Pastillen, Pillen, Kapseln und dgl. können auch folgendes enthalten: ein Bindemittel, wie Tragantgummi, Gummi arabicum, Maisstärke oder Gelatine; Träger, wie Dicalciumphosphat; ein Sprengmittel, wie Maisstärke, Kartoffelstärke, Alginsäure und dgl.; ein Gleitmittel, wie Magnesiumstearat; und ein Süßungsmittel, wie Saccharose, Lactose oder Saccharin, kann zugesetzt werden, oder ein Geschmacksstoff, wie Pfefferminz, Gaultheriaöl oder Kirschgeschmack. Wenn die Form der Dosierungseinheit eine Kapsel ist, kann sie zusätzlich zu den Materialien des vorstehend genannten Typs einen flüssigen Träger enthalten. Verschiedene andere Materialien können als Beschichtungen oder für eine anderweitige Modifizierung der physikalischen Form der Dosierungseinheit vorhanden sein. Tabletten, Pillen oder Kapseln können z. B. mit Schellack, Zucker oder beidem überzogen sein. Ein Sirup oder Elixier kann die wirksame Verbindung, Saccharose als Süßungsmittel, Methyl- und Propylparabene als Konservierungsmittel, einen Farbstoff und einen Geschmacksstoff, wie Kirsch- oder Orangengeschmack, enthalten. Natürlich sollte jedes Material, das bei der Herstellung irgendeiner Form einer Dosierungseinheit verwendet wird, pharmazeutisch rein und in den verwendeten Mengen im wesentlichen nicht-toxisch sein. Der wirksame Bestandteil kann außerdem in Präparate und Formulierungen mit Langzeitwirkung eingeführt werden.
Hier gehören zu pharmazeutisch akzeptablen Trägern und Verdünnungsmitteln irgendein und alle Lösungsmittel, Dispersionsmittel, wäßrige Lösungen, Beschichtungen, antibakteriellen und antifungiziden Mittel, isotonischen und die Absorption verzögernden Mittel und dgl. Die Verwendung solcher Medien und Mittel für pharmazeutisch wirksame Substanzen ist auf diesem Fachgebiet allgemein bekannt und z. B. in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Aufl., Mack Publishing Company, Pennsylvania, USA beschrieben. Außer wenn irgendwelche her kömmlichen Medien oder irgendein herkömmliches Mittel nicht mit dem wirksamen Bestandteil kompatibel ist, wird deren Verwendung in den erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen in Betracht gezogen. Zusätzliche wirksame Bestandteile können ebenfalls in die Zusammensetzungen eingebracht werden.
Es ist besonders vorteilhaft, Zusammensetzungen in Form einer Dosierungseinheit für eine einfache Verabreichung und Gleichmäßigkeit der Dosis zu formulieren. Die Form einer Dosierungseinheit steht hier für physikalisch einzelne Einheiten, die als Einheitsdosierungen für die zu behandelnden Personen geeignet sind; jede Einheit enthält eine bestimmte Menge des wirksamen Bestandteils, die so berechnet ist, daß die gewünschte therapeutische Wirkung erzeugt wird, in Verbindung mit dem erforderlichen pharmazeutischen Träger und/oder Verdünnungsmittel. Die Vorschriften für die neuen erfindungsgemäßen Formen einer Dosierungseinheit werden von folgendem bestimmt oder sind direkt davon abhängig: (a) den bestimmten Eigenschaften des wirksamen Bestandteils und der bestimmten zu erzielenden therapeutischen Wirkung und (b) den Einschränkungen, die dem Fachgebiet des Vermischens eines solchen wirksamen Bestandteils für die Behandlung von Fettsucht eigen sind.
Wenn es der Zusammenhang nicht anders erfordert, soll das Wort "umfassen" oder Varianten, wie "umfaßt" oder "umfassend" in dieser Beschreibung und den darauf folgenden Ansprüchen durchweg bedeuten, daß ein festgelegtes Ganzes oder eine Gruppe von Ganzen eingeschlossen ist, jedoch irgendein anderes Ganzes oder eine Gruppe von Ganzen nicht ausgeschlossen ist.
Weitere Einzelheiten der vorliegenden Erfindung werden anhand des folgenden Beispiels und der beigefügten Zeichnungen deutlich, die als Erläuterung, jedoch keineswegs als Einschränkungen der Erfindung enthalten sind.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Es zeigen:
1A und 1B: die Wirkung des Peptids hGH 177–191 auf die kumulative Körpergewichtszunahme bei männlichen (1A) und weiblichen (1B) Mäusen C57BL/6J (ob/ob) während eines 18tägigen Behandlungszeitraums; die Tiere erhielten eine tägliche intraperitoneale Injektion von 0,1 ml von entweder Kochsalzlösung oder hGH 177–191 (200 μg/kg Körpergewicht); jeder Punkt steht für den Durchschnittswert ± SEM von 6 Tieren;
2A und 2B: die durchschnittliche tägliche Nahrungsaufnahme (g/Maus/Tag) von Mäusen C57BL/6J (ob/ob) während eines 18tägigen Behandlungszeitraums mit hGH 177–191; die Behandlung für die vier Gruppen von Tieren war wie in den 1A und 1B beschrieben; jeder Punkt steht für den Durchschnittswert ± SEM von 6 Tieren; zu keinem Zeitpunkten wurde eine Signifikanz zwischen den Gruppen beobachtet;
3A und 3B: die Wirkung des Peptids hGH 177–191 auf die Körpergewichtszunahme von 14 bis 15 Wochen alten männlichen fettleibigen Zucker-Ratten (fa/fa) während des 20- oder 27tägigen Behandlungszeitraums; die Tiere erhielten eine tägliche intraperitoneale Injektion von entweder Kochsalzlösung oder dem Peptid (500 μg/kg Körpergewicht) (3A) oder ihnen wurde im unteren Quadranten des Abdomens der Tiere intradermal eine Tablette mit langsamer Freisetzung (500 μg/Tag/kg Körpergewicht) implantiert; der Kontrollgruppe wurde in der gleichen Art und Weise eine Placebotablette implantiert; jeder Punkt steht für den Durchschnittswert ± SEM von 6 Tieren;
4A und 4B: die durchschnittliche tägliche Nahrungsaufnahme (g/Ratte/Tag) von fettleibigen Zucker-Ratten während des Behandlungszeitraums mit dem Peptid hGH 177–191; die Behandlung war für die vier Gruppen von Tieren wie bei den 3A und 3B beschrieben; jeder Punkt steht für den Durchschnittswert ± SEM von 6 Tieren; zwischen den Testgruppen und den geeigneten Kontrollen wurde zu keinem Zeitpunkt eine Signifikanz beobachtet;
5A und 5B: den ex vivo Effekt auf die Lipogenese in adipösen Geweben von männlichen (5A) und weiblichen (5B) Mäusen C57BL/6J (ob/ob) nach einer 18tägigen Behandlung mit hGH 177–191; die Werte zeigen die Rate der [C¹⁴]-Lipidsynthese und sind als [C¹⁴]-Glucose, die in das Lipid eingeführt ist, angegeben (pMol/mg Gewebe/min); die Werte sind der Durchschnittswert ± SEM von 12 Bestimmungen von 6 Tieren aus jeder Gruppe; die Unterschiede zwischen den mit hGH 177–191 behandelten und mit Kochsalzlösung behandelten Kontrollgruppen waren statistisch signifikant;
6A und 6B: den ex vivo Effekt auf die Lipolyse im adipösen Gewebe von männlichen (6A) und weiblichen (6B) Mäusen C57BL/6J (ob/ob) nach einer 18tägigen Behandlung mit hGH 177–191; die Werte zeigen die Rate der Glycerolfreisetzung aus adipösen Geweben (pMol/mg Gewebe/min); die Werte sind der Durchschnittswert ± SEM von 12 Bestimmungen von 6 Tieren aus jeder Gruppe; die Unterschiede zwischen den mit hGH 177–191 behandelten und mit Kochsalzlösung behandelten Kontrollgruppen waren statistisch signifikant;
7: den in vitro Effekt von hGH 177–191 auf die Fettsäureoxidation in isolierten adipösen Geweben von Mäusen C57BL/6J (ob/ob) mit einer Bestimmung der Rate der [C¹⁴]O₂-Produktion aus [C¹⁴]-Palmitinsäure; die Rate der [C¹⁴]-Palmitinsäure-Oxidation wurde als μMol/g Gewebe/h angegeben;
8: den in vitro Effekt von hGH 177–191 auf die Freisetzung von Diarylglycerol aus isolierten Adipocyten von normalen Ratten innerhalb eines Inkubationszeitraums von 40 min; Diacylglycerol wurde unter Anwendung eines radioenzymatischen Assays mengenmäßig erfaßt, und die Ergebnisse wurden als Zunahme gegenüber den Grundwerten in % angegeben;
9: den in vitro Effekt von hGH 177–191 auf die hormonempfindliche Lipaseaktivität in isolierten Adipocyten von männlichen fettleibigen Zucker-Ratten (fa/fa), der anhand der Menge von hydrolysierter [C¹⁴]-Oleinsäure aus [C¹⁴]-Triolein bestimmt wurde; das Enzym wurde in E/mg Protein angegeben, wobei die Freisetzung von 1 nMol Oleinsäure pro Stunde als 1 Einheit der Enzymaktivität angesehen wurde;
10A und 10B: den in vitro Effekt von hGH 177–191 auf Acetyl-CoA-Carboxylase in den isolierten Adipocyten (10A) und Hepatocyten (10B) von normalen Ratten, der anhand der [C¹⁴]-Bicarbonat-Fixierungsreaktion bestimmt wurde und als mE/g Trockengewicht der Zellen angegeben ist, wobei 1 Einheit von Acetyl-CoA-Carboxylase als Carboxylierung von 1 μMol Acetyl-CoA pro Minute definiert wurde;
11A: die Wirkung des Analogons, Bezugsnr. 9403 (Sequenzidentifizierungsnr.: 6) auf die Körpergewichtszunahme von 26 Wochen alten Mäusen C57BL/6J (ob/ob) während eines 18tägigen Behandlungszeitraums; die Tiere erhielten eine tägliche intraperitoneale Injektion von entweder Kochsalzlösung (als Kontrolle) oder dem Peptid-Analogon (500 μg/kg Körpergewicht); jeder Punkt steht für den Durchschnittswert ± SEM von 6 Tieren;
11B: die durchschnittlich tägliche Nahrungsaufnahme (g/Maus/Tag) von 26 Wochen alten Mäusen C57BL/6J (ob/ob) während des Behandlungszeitraums mit dem Analogon Bezugsnr. 9403 (Sequenzidentifizierungsnr.: 6); die Behandlung war für die beiden Gruppen von Tieren wie in 11A beschrieben; jeder Punkt steht für den Durchschnittswert ± SEM von 6 Tieren; zwischen der Testgruppe und der Kontrolle wurde zu keinem Zeitpunkt eine Signifikanz beobachtet;
12: den Einfluß auf die Körpergewichtszunahme bei der chronischen Behandlung von 16 Wochen alten Mäusen C57BL/6J (ob/ob) mit den Analoga, Bezugsnr. 9604 (Sequenzidentifizierungsnr.: 19) und 9605 (Sequenzidentifizierungsnr.: 20);
13: die Wirkung der oralen Langzeitverabreichung des Analogons Bezugsnr. 9604 auf ob/ob-Mäuse.
Der Bezug auf Analoga, die von 9604 (Sequenzidentifizierungsnr.: 19) verschieden sind, dient nur der Erläuterung.
Beispiel
Materialien und Verfahren
Tiere und Behandlungen
Fettleibige Mäuse C57BL/6J (ob/ob) und fettleibigen Zucker-Ratten (fa/fa) dienten dazu, die biologischen Effekte des synthetischen hGH 177–191 und von Analoga nachzuweisen. Die Tiere im gleichen Alter und vom gleichen Geschlecht wurden willkürlich in zwei Gruppen aufgeteilt, zu sechst pro Käfig gehalten und bei einem normalen 12stündigen Hell/Dunkel-Zyklus bei einer konstanten Raumtemperatur von 25°C im Tierhaus des Department of Biochemistry and Molecular Biology, Monash University, Clayton, Australien gehalten. Die Tiere wurden nach Belieben mit einer vorbestimmten Menge Tierpellets (Clark King, Melbourne, Australien) gefüttert und hatten jederzeit ungehinderten Zugang zu Wasser. Die Tiere erhielten über eine geeignete Anzahl von Tagen eine tägliche intraperitoneale (i. p.) Injektion von 0,1 ml von entweder dem synthetischen Peptid (200 bis 500 μg/kg Körpergewicht) oder dem äquivalenten Volumen einer physiologischen Kochsalzlösung (0,9% Natriumchlorid). Die i. p. Injektion wurde mit einer 30G × 1/2'' (0,31 × 13 mm) Nadel auf 1 ml Tuberculin-Einwegspritzen verabreicht, und die Injetionsstelle war der untere linke Quadrant des Abdomens der Tiere. Um die Wirkungen einer kontrollierten Verabreichung von hGH 177–191 und der Analoga zu untersuchen, wurden Peptidpellets mit einer langsamen Freisetzung mit einem Durchmesser von 3 mm unter Anästhesie intradermal im Abdomenbereich der Zucker-Ratten implantiert. Das Körpergewicht und die Nahrungsaufnahme wurden während der angegebenen Zeiträume überwacht.
Peptidsynthese
Peptide wurden unter Anwendung von üblichen Festphasenverfahren mit 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) hergestellt. Die Festphasensynthese kann z. B. vom C-Terminus des Peptids eingeleitet werden, wobei eine α-Amino-geschützte Aminosäure verwendet wird. Geeignete Ausgangsmaterialien können z. B. hergestellt werden, indem die geforderte α-Aminosäure an ein Wang-Harz (4-Alkoxybenzylalkohol-Harz) oder Rink-Amidharz (2,4-Dimethoxy-4'-[carboxymethoxy]-benzhydrylamin, an ein Aminomethylharz gebunden) oder PAM-Harz (4- Hydroxymethylphenylessigsäure-Harz) gebunden wird. Die Harze sind von Auspep Pty. Ltd., Parkville, Victoria, Australien im Handel erhältlich.
Bei der Festphasenherstellung der Verbindungen wurde eine geschützte Aminosäure mit Hilfe eines Kopplungsmittels an ein Harz gekoppelt. Nach der ersten Kopplung wurde die α-Amino-Schutzgruppe bei Raumtemperatur durch Piperidin in organischen Lösungsmitteln entfernt. Nach dem Entfernen der α-Amino-Schutzgruppe wurden die restlichen geschützten Aminosäuren schrittweise in der gewünschten Reihenfolge gekoppelt. Im allgemeinen wurde bei der Reaktion mit einem geeigneten Carboxylgruppen-Aktivator, wie Diisopropylcarbodiimid (DIC) und 1-Hydroxybenzotriazol (HOB_t), ein vierfacher Überschuß jeder geschützten Aminosäure in Gemischen von Methylenchlorid (DCM) – N,N-Dimethylformamid (DMF) verwendet.
Nachdem die gewünschte Aminosäuresequenz abgeschlossen war, wurde das Peptid durch Behandlung mit einem Reagenz, wie Trifluoressigsäure (TFA) oder Trifluormethansulfonsäure (TFMSA), vom Harzträger getrennt, das das Peptid vom Harz sowie auch alle Seitenketten-Schutzgruppen, außer Cys(Acm), vom Harz abspaltet. Wenn ein Wang-Harz verwendet wurde, führte die TFA-Behandlung zur Bildung der ungebundenen Peptidsäuren. Wenn das Rink-Amidharz verwendet wurde, führte die TFA-Behandlung zur Bildung der ungebundenen Peptidamide. Wenn ein PAM-Harz verwendet wurde, führte die TFMSA-Behandlung zur Bildung der ungebundenen Peptidsäuren. Die Zielpeptide können in cyclischer Disulfidform existieren, was nach der Synthese eine Modifizierung erfordert.
Die folgenden Beispiele dienen nur der weiteren Erläuterung und sollen die offenbarte Erfindung nicht einschränken. Ein Bezug auf Peptid-Analoga, die von 9604 (Sequenzidentifizierungsnr.: 19) verschieden sind, dient nur der Erläuterung.
A. Synthese von Pentadecapeptid, das die Aminosäurereste 177–191 des natürlichen Human-Wachstumshormons umfaßt, das als hGH (177–191) bezeichnet wird (Bezugsnr. 9401):

Lau¹-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe¹⁵ (cyclisches Disulfid)

Bei der Herstellung des Pentadecapeptids wurde folgendes Verfahren angewendet:
Schritt 1. Ein Wang-Harz (0,625 g, 0,5 mMol) wurde in ein 10 ml Reaktionsgefäß gegeben. Dem Reaktionsgefäß wurde DCM (4 ml) zugesetzt. Das Wang-Harz wurde 2 Minuten unter kräftigem Rühren gewaschen. Dann wurde die DCM-Lösung aus dem Reaktionsgefäß abgelassen. Dieses Waschen wurde zweimal wiederholt.
Schritt 2. Fmoc-L-Phenylalanin (Fmoc-Phe, 0,388 g, 1,0 mMol) in 2,4 ml NMP-DCM (1:5, V./V.) und DIC (0,135 g, 1,0 mMol) in 1,0 ml NMP wurden 10 Minuten in einem Reaktionsgefäß gemischt. Dem Gemisch wurde 4-Dimethylaminopyridin (DMAP, 0,074 g, 0,06 mMol) in 0,6 ml DMF zugesetzt. Die Reaktion in der Lösung konnte 68 Minuten bei Raumtemperatur andauern. Dann wurde die Lösung abgelassen, das Harz wurde gründlich mit NMP (4 ml × 3) und DCM (4 ml × 3) gewaschen. Der Komplex von Fmoc-Phe-Wang-Harz wurde über Nacht vakuumgetrocknet, wodurch 0,781 g des Materials erhalten wurden. Der Kopplungswert der Aminosäure an das Harz wurde unter Anwendung einer Spektrophotometriemessung des Fmoc-Piperidin-Addukts mit 0,80 mMol/g Harz bestimmt.
Schritt 3. Das Fmoc-Phe-Wang-Harz (0,263 g, 0,20 mMol) wurde in das 10 ml Reaktionsgefäß gegeben. Es wurde DMF (8 ml) zugesetzt, damit das Harz gewaschen wird und quillt, indem es 2 Minuten gerührt wurde. Dann wurde die Lösung aus dem Reaktionsgefäß abgelassen.
Schritt 4. Eine 25%ige Lösung von Piperidki/DMF (4 ml) wurde in das Reaktionsgefäß gegeben. Das entstandene Gemisch wurde 2 Minuten gerührt. Die Lösung wurde aus dem Reaktionsgefäß abgelassen. Dieses Verfahren zum Entfernen der Schutzgruppe wurde einmal wiederholt, jedoch mit einer längeren Rührzeit (18 min). Die Lösung wurde aus dem Reaktionsgefäß abgelassen.
Schritt 5. Dem Reaktionsgefäß wurde DMF (8 ml) zugesetzt. Die entstandene Lösung wurde 2 Minuten gerührt. Die Lösung wurde aus dem Harz im Reaktionsgefäß abgelassen. Dieses Waschverfahren wurde zweimal wiederholt. Dem Reaktionsgefäß wurde DMF (2 ml) zugesetzt, damit das Harz gequollen bleibt.
Schritt 6. Fmoc-Glycin (Fmoc-Gly, 0,238 g, 0,8 mMol), HOB_t (108 mg, 0,8 mMol) und DIC (128 μl, 0,8 mMol) wurden in ein 10 ml Teströhrchen gegeben, das 2 ml DMF enthielt. Das Gemisch wurde 10 Minuten gerührt, damit die Aktivierung der Aminosäure beginnt. Dann wurde die Lösung dem Harz zugesetzt, das sich ursprünglich im Reaktionsgefäß befand. Das entstandene Gemisch wurde 1,5 h oder so lange gerührt, bis ein negativer Ninhydrintest erhalten wurde. Denn wurde die Lösung aus dem Reaktionsgefäß abgelassen.
Schritt 7. Dem Reaktionsgefäß wurde DMF (8 ml) zugegeben. Die entstandene Lösung wurde 2 Minuten kräftig gerührt. Dann wurde die Lösung aus dem Reaktionsgefäß abgelassen. Das Waschverfahren wurde zweimal wiederholt.
Danach wurden die Schritte 4 bis 7 wiederholt, wobei die folgende Reihenfolge der Aminosäuren verwendet wurde:
Fmoc-Cys(Acm)
Fmoc-Ser(t-Bu)
Fmoc-Gly
Fmoc-Glu(O-tBu)
Fmoc-Val
Fmoc-Ser(t-Bu)
Fmoc-Arg(Pmc)
Fmoc-Cys(Acm)
Fmoc-Gln
Fmoc-Val
Fmoc-Ile
Fmoc-Arg(Pmc)
Fmoc-Leu
Nach Abschluß der Synthese des gewünschten Peptid-Harzes wurde das Reaktionsgefäß, das das Peptid-Harz enthielt, in einen Exsikkator gegeben und über Nacht vakuumgetrocknet. Die Ausbeute des Peptid-Harzes betrug 0,635 g. Das getrocknete Peptid-Harz wurde aus dem Reaktionsgefäß genommen und in einen 50 ml Rundkolben gegeben, der einen Magnetrührstab enthielt. Die Spaltung des Peptids vom Harz mit TFA wurde nach folgendem Verfahren durchgeführt: Eine Fängerlösung, die 0,75 g Phenol, 0,5 ml H₂O, 0,5 ml Thioanisol und 0,25 ml Ehtandithio enthielt, wurde in den Rundkolben gegeben. Das entstandene Gemisch wurde 5 Minuten gerührt. Man ließ 10 ml TFA in den Kolben tropfen, wobei weiterhin kräftig gerührt wurde. Das entstandene Gemisch wurde 2,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
Das Gemisch wurde durch einen Filter mit mittlerer Porosität, Glasfilternutsche, filtriert. Die TFA-Peptid-Lösung wurde in einen weiteren 500 ml Rundkolben abgesaugt, der 200 ml kalten Diethylether enthielt, indem ein Vakuum angelegt wurde. Es wurde Fällung des Peptids in der Etherlösung bei 4°C über Nacht ermöglicht, dann wurde es aufgefangen, indem das Gemisch durch eine feinporige Glasfilternutsche filtriert wurde. Das Peptidpellet auf dem Filter wurde mit kaltem Ether (10 ml × 3) gewaschen, um den Fänger zu entfernen. Dann wurde das Pep tidpellet mit 25%iger wäßriger Essigsäure gelöst und danach gefriergetrocknet, so daß das unbehandelte Peptid erhalten wurde (etwa 400 mg Trockengewicht, Reinheit ~80%).
Das unbehandelte Peptid wurde durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie (RP-HPLC) gereinigt. Die Reinigung erfolgte über einer präparativen Säule 21,2 × 250 mm Supelcosil PLC-18 (Octadecyl, C₁₈) (Porengröße 120 Angström, Partikelgröße 12 μm, Oberfläche 190 m²/g, Supelco, Bellefonte, PA, USA) bei einer Strömungsrate von 5,0 ml/min bei Raumtemperatur. Es wurde ein Programm mit linearem Gradienten verwendet, wobei das Lösungsmittel A Wasser mit 0,1% TFA und das Lösungsmittel B Acetonitril-Wasser (50/50 V./V., enthielt 0,1% TFA) war. Der Gradient bildete sich innerhalb von 80 Minuten von 20 auf 100% aus. Die Trennkurven wurden aufgezeichnet und mit einem Integrator Perkin-Elmer LC-100 analysiert. Die gewünschte Peptidkomponente wurde eluiert und mit dem automatischen Fraktionssammler Pharmacia Modell FRAC-100 (Uppsala, Schweden) aufgefangen. Die Fraktionen der identischen Komponente wurden gemischt und gefriergetrocknet. Das gereinigte Peptid (275 mg Trockengewicht, Reinheit >98%), Cys(Acm)^6,13-Pentadecapeptid, wurde bei –20°C im gefrorenen Zustand gehalten.
Für den Ringschluß der Disulfidbrücke der Peptide wurde eine Iodoxidation in 80%iger wäßriger Essigsäure angewendet, um die Cystein-Schutzgruppen, Acm, zu entfernen und dies lieferte gleichzeitig die intramolekulare Disulfidbrücke. Das Cys(Acm)^6,13-Pentadecapeptid (275 mg, 0,155 mMol) wurde in 50 ml 80%iger wäßriger Essigsäure gelöst. Diese Lösung wurde langsam in einen 250 ml Rundkolben gegeben, der Iod (378 mg, 1,4 mMol) in 100 ml 80%iger wäßriger Essigsäure enthielt, indem kräftig gerührt wurde. Die Reaktion konnte 2 Stunden bei Raumtemperatur andauern und wurde beendet, indem der entstandenen Lösung Ascorbinsäure (Vitamin C) zugesetzt wurde. Dann wurde das Flüssigkeitsvolumen durch Rotationsverdampfung verringert, und das Peptid wurde durch Gefriertrocknen gewonnen. Das einem Ringschluß unterzogene Peptid wurde dann durch RP-HPLC gereinigt, wie es bei der Reinigung des linearen Peptids beschrieben ist. Nach dem Gefriertrocknen wurden 165 mg cyclisches Pentadecapeptid mit einer Reinheit von 96% erhalten. Die gesamte Ausbeute der Synthese betrug etwa 46%. B. Synthese von Pentadecapeptid (Bezugsnr. 9404):
Es wurde das in Beispiel A aufgeführte Verfahren angewendet. Die Modifizierung bestand darin, daß das Wang-Harz weggelassen und durch das Rink-Amidharz ersetzt wurde.
C. Synthese des Pentadecapeptids (Bezugsnr. 9410):

H-Lau¹-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe¹⁵ (cyclisches Disulfid)

Es wurde das in Beispiel A aufgeführte Verfahren angewendet. Die Modifizierung bestand darin, daß Fmoc-Leu durch 4-Methylpentacarbonsäure ersetzt wurde, was zur Synthese des Desaminopentadecapeptids führte. D. Synthese des Pentadecapeptids (Bezugsnr. 9405):
Es wurde das in Beispiel A aufgeführte Verfahren angewendet. Nach Abschluß der Synthese des gewünschten deblockierten Peptid-Harzes wurden 5 ml einer Lösung von 20% Essigsäureanhydrid in DMF zugesetzt. Nach 5 Minuten wurden 71 μl (0,4 mMol) Diisopropylethylamin (DIEA) zugegeben, um die entstandenen Protonen zu neutralisieren. Die Acetylierung des Peptids wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt. Das Peptid-Harz wurde zweimal mit DMF und zweimal mit DCM gewaschen, und das N-Acetylpeptid-Harz war für die TFA-Spaltung bereit, wie sie in Beispiel A dargestellt ist. E. Synthese des Dicyclopentadecapeptids (Bezugsnr. 9408):
Bei der Herstellung des Pentadecapeptids wurde folgendes Verfahren angewendet:
Schritt 1. Das Boc-L-Phenylalanin-PAM-Harz (0,400 g, 0,2 mMol, Auspep, Melbourne, Australien; Kat.#5290F, Charge#494123) wurde in ein 10 ml Reaktionsgefäß gegeben. Das Harz wurde unter kräftigem 2 minütigem Rühren mit DCM (4 ml) gewaschen. Dann wurde die DCM-Lösung aus des Reaktionsgefäß abgelassen. Diese Wäsche wurde einmal wiederholt.
Schritt 2. Dem Reaktionsgefäß wurde eine 50%ige TFA/DCM-Lösung (4 ml) zugesetzt. Das entstandene Gemisch wurde 2 Minuten gerührt. Danach wurde die Lösung aus dem Reaktionsgefäß abgelassen. Das Verfahren zum Entfernen der Schutzgruppe wurde einmal bei einer Rührzeit von 18 Minuten wiederholt. Die Lösung wurde aus dem Reaktionsgefäß abgelassen. Dem Reaktionsgefäß wurde DCM (4 ml) zugesetzt, und der Inhalt konnte 2 Minuten stehenbleiben. Die Lösung wurde erneut aus dem Harz abgelassen. Dieses Waschverfahren wurde zweimal wiederholt. Dem Reaktionsgefäß wurde 10% DIEA/DMF (4 ml) zugesetzt. Das entstandene Gemisch wurde konnte 1 Minute stehenbleiben, und die Lösung wurde wie vorstehend entfernt. Dieses Verfahren zum Entfernen der Schutzgruppe wurde einmal wiederholt. Dem Harzkomplex im Reaktionsgefäß wurde DMF (4 ml) zugesetzt. Die entstandene Lösung konnte 2 Minuten stehenbleiben, danach wurde die Lösung aus dem Gefäß entfernt. Dieses Waschverfahren wurde viermal wiederholt. Schließlich wurde dem Reaktionsgefäß DMF (2 ml) zugesetzt, damit das Harz gequollen bleibt.
Schritt 3. Fmoc-Glycin (Fmoc-Gly, 0,238 g, 0,8 mMol), HOB_t (108 mg, 0,8 mMol) und DIC (128 μl, 0,8 mMol) wurden in ein 10 ml Teströhrchen gegeben, das 2 ml DMF enthielt. Das Gemisch wurde 10 Minuten gerührt, um die Aminosäure zu aktivieren. Dann wurde die Lösung zu dem Harz im Reaktionsgefäß gegeben. Das entstandene Gemisch wurde 1,5 Stunden oder so lange gerührt, bis ein negativer Ninhydrintest erhalten wurde. Dann wurde die Lösung aus dem Reaktionsgefäß abgelassen.
Schritt 4. DMF (8 ml) wurde in das Reaktionsgefäß gegeben. Die entstandene Lösung wurde 2 Minuten kräftig gerührt, danach wurde der Überstand entfernt. Das Waschverfahren wurde zweimal wiederholt.
Schritt 5. Eine 25%ige Piperidin/DMF-Lösung (4 ml) wurde in das Reaktionsgefäß gegeben. Das entstandene Gemisch wurde 2 Minuten gerührt. Die Lösung wurde aus dem Reaktionsgefäß abgelassen. Das Verfahren zum Entfernen der Schutzgruppe wurde einmal bei 18 minütigem Rühren wiederholt. Die Lösung wurde aus dem Reaktionsgefäß abgelassen.
Schritt 6. Dem Reaktionsgefäß wurde DMF (8 ml) zugesetzt. Die entstandene Lösung wurde 2 Minuten gerührt. Die Lösung wurde aus dem Harz im Reaktionsgefäß abgelassen. Das Waschverfahren wurde zweimal wiederholt. Dem Reaktionsgefäß wurden 2 ml DMF zugesetzt, damit das Harz gequollen bleibt.
Dann wurden die Schritte 3 bis 6 mit der folgenden Reihenfolge der Aminosäuren wiederholt:
Fmoc-Cys(Acm)
Fmoc-Ser(Bzl)
Fmoc-Gly
Fmoc-Glu(O-tBu)
Fmoc-Val
Fmoc-Ser(Bzl)
Schritt 7. Die Schritte 3 und 4 wurden wiederholt, um Fmoc-Lys(Boc) an Ser in der Position 184 zu koppeln. Nach Abschluss der Kopplung wurde das Reaktionsgefäß, das das Peptid-Harz enthielt, in einen Exsikkator gegeben und über Nacht vakuumgetrocknet. Dann wurde das Peptid-Harz in ein 10 ml Reaktionsgefäß gegeben. Dem Reaktionsgefäß wurde DCM (4 ml) zugesetzt. Das Harz wurde 2 Minuten unter kräftigem Rühren gewaschen. Dann wurde die DCM-Lösung aus dem Reaktionsgefäß abgelassen. Dieses Waschen wurden einmal wiederholt.
Schritt 8. Der Schritt 2 diente dem Entfernen der Boc-Gruppe und der t-Bu-Gruppe von der Seitenkette des Lysins bzw. der Glutaminsäure.
Schritt 9. 1 ml 1,5% DIEA/DMF wurde in das Reaktionsgefäß gegeben. Benzotriazo-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)phosphoniumhexafluorphosphat (BOP) (400 mg, 0,90 mMol), HOB_t (122 mg, 0,90 mMol) und DIEA (400 μl, 2,25 mMol) wurden in 3,4 ml 1,5% DIEA/DMF gelöst und danach in das Reaktionsgefäß gegeben. Das entstandene Gemisch wurde 3 Stunden oder so lange gerührt, bis ein negativer Ninhydrintest erhalten wurde, ehe der Überstand aus dem Reaktionsgefäß entfernt wurde. Dann wurde dem Reaktionsgefäß DMF (8 ml) zugesetzt. Die entstandene Lösung wurde 2 Minuten kräftig gerührt. Dann wurde die Lösung aus dem Reaktionsgefäß abgelassen. Das Waschverfahren wurde zweimal wiederholt.
Schritt 10. Dann wurden die Schritte 5 bis 6 wiederholt, um die Fmoc-Gruppe von der α-Aminogruppe des Lysinrests im Peptid-Harz zu entfernen.
Dann wurden die Schritte 3 bis 6 mit der folgenden Reihenfolge der Aminosäuren wiederholt:
Fmoc-Cys(Acm)
Fmoc-Gln
Fmoc-Val
Fmoc-Ile
Fmoc-Arg(Pmc)
Fmoc-Leu
Nach Abschluß der Synthese des wünschten Peptid-Harzes wurde der Schritt 4 wiederholt, um die Fmoc-Gruppe von Leu zu entfernen und das deblockierte Peptid-Harz zu erhalten. Das das Peptid-Harz enthaltende Reaktionsgefäß wurde dann in einen Exsikkator gegeben und über Nacht vakuumgetrocknet. Es wurden 604 mg Peptid-Harz erhalten. Das getrocknete Peptid-Harz wurde aus dem Reaktionsgefäß genommen und in einen 25 ml Rundkolben gegeben, der einen Magnetrührstab enthielt. Es wurde das Spaltungsprotokoll mit Trifluormethansulfonsäure (TFMSA)/TFA angewendet, um das Peptid vom PAM-Harz abzuspalten. Dem Kolben wurde eine Fängerlösung zugesetzt, die 500 μl Thioanisol und 250 μl Ethandithio enthielt. Das entstandene Gemisch wurde 10 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Man ließ 5 ml TFA in den Kolben tropfen, wobei weiter kräftig gerührt wurde. Das entstandene Gemisch wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Der Kolben wurde in ein Eisbad gegeben, und danach wurden langsam 500 ml TFMSA zugesetzt, wobei weiterhin kräftig gerührt wurde. Das entstandene Gemisch wurde 10 Minuten im Eisbad und weitere 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Dem Kolben wurde kalter Diethylether (50 ml) zugesetzt, um die Reaktion zu unterbrechen und das abgespaltene Peptid zu fällen. Das Peptid wurde aufgefangen, indem das Gemisch durch eine feinporige Glasfilternutsche filtriert und mit kaltem Ether (10 ml × 3) gewaschen wurde, um den Fänger zu entfernen. Das Peptidpellet wurde mit 30 ml 50%igem Acetonitril/H₂O gelöst, darauf folgte die Zugabe von 5 ml kaltem 10%igem NH₄HCO₃, um die Lösung zu neutralisieren. Das unbehandelte Peptid wurde nach dem Gefriertrocknen erhalten (519 mg, Reinheit ~69%).
Die Herstellung des Peptids in Form eines cyclischen Disulfids und die Reinigung des unbehandelten Endprodukts sind wie in Beispiel A angegeben.
F. Synthese des erfindungsgemäßen Hexadecapeptids (Bezugsnr. 9604):

Tyr-Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe (cyclische Disulfid)

Es wurde das in Beispiel A aufgeführte Verfahren angewendet, das modifiziert wurde, indem es durch eine weitere Wiederholung der Schritte 4 bis 7 unter Verwendung von Fmoc-Tyr(t-Bu) ergänzt wurde.
Kumulative Gewichtszunahme und Nahrungsaufnahme
Die kumulative Gewichtszunahme und die Nahrungsaufnahme wurden in 3tägigen Abständen bestimmt, indem das Körpergewicht und das in den Käfigen verbliebene ungefressene Futter gemessen wurden. Die Tiere wurden in eine abgedeckte Kammer gegeben, um die Bewegung während des Wiegeprozesses zu minimieren. Die Werte der Nahrungsaufnahme wurden erhalten, indem die Menge des in den Käfigen verbliebenen ungefressenen Futters von der ursprünglichen Gabe abgezogen wurde.
Assays für Triglycerid und gesamtes Cholesterin im Plasma
Die Tiere wurden 12 Stunden nach der letzten Dosis von hGH 177–191 mit Natriumpentobarbiton (80 mg/kg Körpergewicht) anästhesiert. 45 Minuten nach der Verabreichung des Anästhetikums wurden Blutproben aus der Schwanzvene der anästhesierten Tiere entnommen. Nach 5minütigem Zentrifugieren mit 2000 × g wurde das Plasma aus den Proben entfernt und für die Assays der Stoffwechselprodukte verwendet. Triglycerid und das gesamte Cholesterin im Plasma wurden durch Enzym-Spektrophotometrieverfahren gemessen. Die Reagenzien basieren entweder auf einer modifizierten Farbreaktion vom Glycerolphosphatoxidase (GOP)-Trinder-Typ²⁴ oder auf einem Cholesteroloxidase-4-aminoantipyrin-Verfahren²⁵. Alle Assays erfolgten mit dem CentrifiChem System 400 (Union Carbide), das ein automatisiertes Pipettiergerät, ein Zentrifugenanalysegerät und ein Aufzeichnungsspektrophotometer enthielt. Als Kalibrator wurde Seronorm Lipid (Nycomed Pharma Co., Oslo, Norwegen) verwendet.
Bestimmung des Gewichts des adipösen Gewebes
Das Verfahren zur Abtrennung und Messung von intakten Epididymis-Fettpolstern war in früheren Untersuchungen zum Epididymiswachstum von Mäusen mit GH-Mangel (lit/lit) erstellt worden. In der vorliegenden Studie wurden aus den Mäusen unmittelbar nach der Tötung weiße adipöse Gewebe, entweder die gesamten Epididymis- oder parametriale Fettpolster, nach identischen Verfahren herausgeschnitten, wie sie bereits beschrieben wurden ²². Die Gewebe wurden in kalter physiologischer Kochsatzlösung gewaschen, abgetupft und ge wogen. Für lipogene Assays ex vivo wurden die Bereiche der adipösen Gewebe ohne Blutgefäße verwendet.
Assay der hormonempfindlichen Lipase (HSL)
Die Aktivität der hormonempfindlichen Lipase (HSL) von isolierten Adipocyten diente als Modell, um die fettspaltende Wirkung des Peptids hGH 177–191 und von Analoga auszuwerten. Bei diesem Assay wurde [C¹⁴]-Triolein als Substrat der HSL verwendet. Die Menge der hydrolysierten [C¹⁴]-Oleinsäure wurde bestimmt und als Index der HSL-Aktivität verwendet.
Die Adipocyten wurden aus den Epididymis-Fettpolstern von männlichen fettleibigen Zucker-Ratten (fa/fa) durch Collagenaseaufschluß präpariert. Die Fettpolster (5 g) wurden fein zu kleinen Stücken (2 bis 3 mm) zerschnitten und in eine mit Silicon behandelte Glasampulle gegeben, die 10 ml Aufschlußmedium enthielt. Das Aufschlußmedium enthielt mikrobielle Collagenase (Typ II) in einer Konzentration von 1 mg/ml in Krebs-Ringer-Phosphatpuffer (pH = 7,4) bei der Ca²⁺-Halbsättigung, bei 2% (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin (BSA-Fraktion V). Nach einem 1stündigen Aufschluß bei 37°C unter einer Atmosphäre aus 95% O₂/5% CO₂ wurden die Adipocyten aus allen restlichen Stücken des adipösen Gewebes freigesetzt, indem die Suspension mit einer 5,0 ml Pipette mit einer Öffnung der Spitze von 3 bis 4 mm langsam aufgesaugt und abgelassen wurde. Die aus dem Gewebe freigesetzten Adipocyten wurden dann durch Nylonchiffon in ein mit Silicon behandeltes Glasröhrchen filtriert und zweimal mit 6 ml collagenfreiem Albuminpuffer gewaschen. Die abgetrennten Adipocyten wurden erneut mit 10 ml collagenfreiem Puffer suspendiert, und die Adipocytenkonzentration wurde bestimmt, indem eine aliquote Menge eines vorher bestimmten Volumens von Zellen auf einem Objektträger eines Mikroskops gezählt wurde. Das ergab normalerweise etwa 10⁹ Zellen/ml Adipocyten im Krebs-Ringer-Phosphatpuffer (pH = 7,4).
Die HSL-Aktivität wurde 1 Stunde bei 37°C in einem Endvolumen von 200 μl gemessen, das 10 μMol Phosphatpuffer (pH = 7,0), 15 μMol emulgiertes [C¹⁴]-Triolein und 10⁸ Zellen enthielt. Das Substrat, [C¹⁴]-Triolein wurde vorher mit unmarkiertem Triolein emulgiert, so daß die abschließende Emulsion bereitgestellt wurde, die 15 μMol Triolein und 375000 cpm in 0,1 ml enthielt. Es wurden unterschiedliche Konzentrationen des Peptids hGH 177–191 oder der Analoga zugesetzt, um deren Wirkungen auf die HSL-Aktivität auszuwerten. Die Reaktion wurde unterbrochen, indem 1 ml des Fettsäureextraktionsgemischs von Chloroform-Methanol-Benzol mit 2:2:4:1 zugegeben wurde, das 50 μg Oleinsäure enthielt, darauf folgte die Zugabe von 67 μl 0,5 n NaOH. Um die ungebundene Fettsäure herauszulösen und abzutrennen wurden die Proben 20 Sekunden verwirbelt und dann 5 Minuten mit 1000 × g zentrifugiert.
Eine 200 μl Portion der oberen wäßrigen alkalischen Phase, die Fettsäuren enthielt, wurde in Szintillationsampullen gegeben. Die [C¹⁴]-Radioaktivität wurde mit einem Flüssigkeitsszintillationszählgerät gemessen. Die restliche Zählsuspension wurde auf den Proteingehalt überprüft. Die HSL-Aktivität wurde als E/mg Protein angegeben, wobei die Freisetzung von 1 nMol Oleinsäure pro Stunde als eine Enzymaktivität von 1 E definiert wurde.
Assay der Acetyl-CoA-Carboxylase
Acetyl-CoA-Carboxylase katalysiert den kritischen Schritt bei der Fettsäuresynthese. Die Acetyl-CoA-Carboxylase-Aktivität von isolierten Adipocyten als auch Hepatocyten in Gegenwart des Peptids hGH 177–191 und von Analoga wurde gemessen, um die antilipogene Wirkung der Peptide auszuwerten. Die Acetyl-CoA-Carboxylase-Aktivität wurde durch die [C¹⁴]-Bicarbonat-Fixierungsreaktion – die Rate der Einführung von Acetyl-CoA-abhängigem H[C¹⁴]O₃ in [C¹⁴]-Malonyl-CoA – bestimmt.
Die Adipocyten wurden nach dem Verfahren präpariert, das im HSL-Assay beschrieben ist. Hepatocyten wurden durch Collagenaseaufschluß aus der Leber von männlichen Wistar-Ratten präpariert. Die Leber wurde mit Scheren fein zerschnitten und in einen 250 ml Erlenmeyerkolben gegeben, der 30 ml Aufschlußmedium enthielt. Das Aufschlußmedium enthielt mikrobielle Collagenase (Typ IV) in einer Konzentration von 30 mg/ml in calciumfreiem Krebs-Ringer-Phosphatpuffer (pH = 7,4) und Glucose (5 mM). Nach einem 15minütigen Aufschluß bei 37°C unter einer Atmosphäre aus 95% O₂/5% CO₂ wurden die aus dem Gewebe freigesetzten Hepatocyten durch Nylonchiffon in ein mit Silicon behandeltes Glasröhrchen filtriert und zweimal mit frischem collagenfreiem Aufschlußmedium gewaschen. Die abgetrennten Zellen wurden erneut in 45 ml Medium suspendiert, das zusätzliches EDTA (0,45 mMol), Gelatine (0,7 ml) 2-{[Tris(hydroxymethyl)methyl]amino}ethansulfonsäure (TES) (0,9 mMol) enthielt und vor der Verwendung mit 95% O₂/5% CO₂ begast worden war.
Die abgetrennten Zellen wurden zuerst 30 Minuten bei 37°C in einem Gemisch vorinkubiert, daß 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH = 7,5), 10 mM Kaliumcitrat, 10 mM MgCl₂, 1 mM Dithiothreitol (DTT) und BSA (0,8 mg/ml) enthielt. Dann wurde die Reaktion eingeleitet, indem eine aliquote Menge der vorinkubierten Zellen zu einem Assaygemisch gegeben wurde (Endvolumen, 500 μl), das 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH = 7,5), 10 mM Kaliumcitrat, 10 mM MgCl₂, 1 mM Dithiothreitol (DTT), BSA (0,8 mg/ml), 3,75 mM ATP, 0,125 mM Acetyl-CoA und 12,5 mM NaH[C¹⁴]O₃ (0,44 μCi/μMol) enthielt. Nach 10minütigem Inkubieren bei 37°C wurde die Reaktion mit 0,1 ml 6 m HCl beendet. Das Reaktionsgemisch konnte dann 30 Minuten in einem Vakuumexsikkator stehenbleiben, um das unreagierte NaH[C¹⁴]O₃ zu ent fernen, und danach wurde es 10 Minuten mit 1500 g zentrifugiert, um das unlösliche Material zu beseitigen. Eine aliquote Menge von 0,5 ml des Überstands wurde entnommen und in Szintillationsampullen gegeben. Die [C¹⁴]-Radioaktivität wurde mit einem Flüssigkeitsszintillationszählgerät gemessen. Die restliche Zellsuspension wurde auf den Proteingehalt geprüft. Die spezifische Wirkung des Enzyms wurde als mE/g Trockengewicht der Zellen angegeben, wobei 1 E Acetyl-CoA-Carboxylase als die Menge definiert wird, die die Carboxylierung von 1 μMol Acetyl-CoA pro Minute katalysiert.
Assay der fettspaltenden Wirkung
Die fettspaltende Wirkung von hGH 177–191 und von Analoga auf die isolierten adipösen Gewebe wurde durch die Freisetzung von Glycerol und ungebundener Fettsäure (FFA) in das Medium während der Inkubation bei 37°C nachgewiesen.
Adipöse Gewebe wurden den Tieren entnommen und zu Segmenten mit jeweils etwa 200 mg zerschnitten. Dann wurden die Gewebe in 25 ml Ampullen, die 2 ml Krebs-Ringer-Bicarbonat(KRB)-Puffer, 4% entfettetes BSA und 5,5 mM Glucose enthielten, 1 Stunde bei 37°C unter einer Carbogenatmosphäre (95% O₂/5% CO₂) vorinkubiert. Danach wurden die Gewebe in andere Ampullen mit frischem Medium gegeben, und die Inkubation wurde eingeleitet, indem das Peptid hGH 177–191 oder Analoga in die Ampullen gegeben wurden. Dann wurden die Gemische 90 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Gewebe entnommen und aliquote Mengen (200 μl) der Proben, die aus dem Medium abgezogen worden waren, wurden entweder durch Enzymassay (Glycerol-Kinase) oder kolorimetrische Spektrometrie (Kupferfarbstoff) auf den Gehalt an Glycerol oder ungebundener Fettsäure (FFA) überprüft. Dann wurde NADH oder die erzeugte Farbe durch die Absorption bei 340 nm bzw. 610 nm überwacht.
Assay der Oxidation von ungebundener Fettsäure
Der Einfluß von hGH 177–191 oder von Analoga auf die Oxidation von ungebundenen Fettsäuren (FFA) in adipösen Geweben wird ausgewertet, indem das umgewandelte [C¹⁴]O₂ von [C¹⁴]-Palmitinsäure gemessen wird. Das [C¹⁴]O₂, ein Endprodukt der FFA-Oxidation, wurde mit Hyaminhydroxid eingefangen und mit einem Flüssigkeitsszintillationszählgerät gemessen. Danach wurde die Rate der FFA-Oxidation durch die [C¹⁴]-Radioaktivität bestimmt.
Die den Labortieren entnommenen adipösen Gewebe wurden zu Segmenten mit jeweils etwa 200 mg zerschnitten. Die Gewebe wurden 30 Minuten bei 37°C in 25 ml Ampullen, die 2 ml Krebs-Ringer-Phosphat(KRP)-Puffer und 2% entfettetes Rinderserumalbumin (BSA) enthielten, unter einer Carbogenatmosphäre (95% O₂/5% CO₂) vorinkubiert. Dann wurden die Gewebe in Konte-Kolben mit einem frischen Inkubationsmedium mit 0,15 mM Natrium-[C¹⁴]-palmitat (abschließende spezifische [C¹⁴]-Aktivität 0,20 μCi/μMol) und dem Peptid hGH 177–191 oder Analoga (1 bis 1000 nM) gegeben. Eine Filterpapierrolle wurde in eine Vertiefung im Inneren des Kolbens gegeben, und dann wurde der Kolben mit einem Stopfen mit einer Gummimembran abgedichtet. Die Inkubation bei 37°C unter einer Carbogenatmosphäre dauerte 1 Stunde und wurde dann beendet, indem 250 μl 4,5 m H₂SO₄ mit einer Nadel durch die Gummimembran in das Medium des Kolbens injiziert wurden, und 250 μl Hyaminhydroxid wurden in die Filterpapierrolle in der mittleren Vertiefung injiziert. Die Kolben wurden eine weitere Stunde inkubiert, um die Absorption von [C¹⁴]O₂ durch Hyaminhydroxid zu beenden. Danach wurden die Filterpapierrollen entnommen und in Szintillationsampullen gegeben. Die [C¹⁴]-Radioaktivität wurde mit einem Flüssigkeitsszintillationszählgerät gemessen. Es wurde die Rate der [C¹⁴]-Palmitinsäure-Oxidation zu [C¹⁴]O₂ berechnet und in μMol/g Gewebe/h angegeben.
Assay der lipogenen Wirkung
Die Rate der Einführung von exogener [C¹⁴]-Glucose in das gesamte Lipid in adipösem Gewebe wurde als Index der anti-lipogenen Wirkung von hGH 177–191 gemessen.
Adipöse Gewebe wurden in Segmente mit jeweils etwa 200 mg zerschnitten und dann in Krebs-Ringer-Bicarbonat(KRB)-Puffer (pH = 7,4) gegeben, der 2% entfettetes BSA und Glucose (0,1 μg/ml) enthielt, und bei 37°C mit 95% O₂ – 5% CO₂ begast. Nach einer einstündigen Vorinkubation wurden die Gewebe für eine weitere 90minütige Inkubation in Gegenwart von Insulin (0,1 mE/ml) oder ohne dieses (Bedingungen wie oben) in weitere 2 ml frisches Medium gegeben, das [C¹⁴]-Glucose (abschließende spezifische Aktivität 0,05 μCi/μMol) und 0,3 μM hGH 177–191 enthielt. Dann wurden die Gewebe entnommen, gründlich mit KRB-Puffer gewaschen, und das Lipid wurde mit 5 ml Chloroform/Methanol (2:1, V./V.) herausgelöst. Die Extraktionslösung wurde mit 2 ml einer MeOH-H₂O-Lösung gewaschen, die 0,1% MgCl₂ enthielt. Eine aliquote Menge von 2,5 ml der gewaschenen Extraktionslösung wurde entnommen und in Szintillationsampullen gegeben. Die [C¹⁴]-Radioaktivität wurde mit einem Flüssigkeitsszintillationszählgerät gemessen. Die Raten der gesamten Lipidsynthese wurden als in das Lipid eingeführte μMol [C¹⁴]-Glucose/g Gewebe/h angegeben.
Assays der Freisetzung von Diarylglycerol (DAG)
Das aus dem abgetrennten adipösen Gewebe oder den Adipocyten freigesetzte Diacylglycerol wurde mit einem Radioenzymassay mengenmäßig erfaßt, wobei E. coli DAG-Kinase und Bedingungen von definierten gemischten Micellen verwendet wurden, um das DAG löslich zu machen und dessen quantitative Umwandlung in [³³p]-Phosphatidinsäure in Gegenwart von [³³p]-γ-ATP zu ermöglichen. Nach einer Anzahl von Extraktionsschritten, um das unreagierte [³³p]-γ-ATP zu entfernen, wurde die Abtrennung von [³³p]-Phosphatidinsäure erreicht, wobei 1 ml Minisäulen Am-Prep^® verwendet wurden.
Statistische Analyse
Für eine Analyse der Ergebnisse wurde der Student-t-Test angewendet. Alle Werte sind als Durchschnittswert ± SEM angegeben. p-Werte von < 0,05 werden als statistisch signifikant anerkannt.
Ergebnisse
Die chronische Behandlung von fettleibigen Mäusen und Ratten mit dem synthetischen hGH 177–191 und Analoga wurde durch Messungen einer Anzahl von Parametern ausgewertet, wozu die kumulative Körpergewichtszunahme und die tägliche Nahrungsaufnahme gehören. Während des Behandlungszeitraums wurde bei den mit hGH 177–191 behandelten männlichen sowie auch weiblichen Tieren im Vergleich mit der geeigneten Kontrolle eine deutliche Verringerung der kumulativen Körpergewichtszunahme beobachtet (1A, 1B). Wenn die Daten analysiert und als tägliche Körpergewichtszunahme angegeben werden, verringerten die behandelten männlichen Tiere ihre Körpergewichtszunahme von 0,22 ± 0,03 auf 0,16 ± 0,04 g/Tag und die weiblichen Tiere von 0,30 ± 0,02 auf 0,22 ± 0,04 g/Tag. Die durchschnittliche tägliche Körpergewichtszunahme von sowohl männlichen als auch weiblichen behandelten Tieren war etwa 27% geringer als die der geeigneten Kontrollgruppen. Innerhalb der vier Gruppen wurde jedoch kein signifikanter Unterschied bei der durchschnittlichen täglichen Nahrungsaufnahme beobachtet (2A, 2B). Ähnliche positive Ergebnisse wurden auch bei der täglichen oralen Verabreichung mit 500 μg/kg/Tag beobachtet. Diese gegen Fettsucht gerichteten Wirkungen verschiedener Analoga, wie z. B. die Bezugsnr. 9403 (11A) wurden bei fettleibigen Mäusen beobachtet. Die synthetischen Analoga steuern die Körpergewichtszunahme ohne den Appetit der behandelten Tiere zu beeinflussen (11B). Eine ähnliche Verringerung der Körpergewichtszunahme wurde auch bei fettleibigen Zucker-Ratten (fa/fa) während der Behandlung mit hGH 177–191 entweder durch tägliche intraperitoneale Injektion oder intradermale Implantation eines Pellets mit langsamer Freisetzung festgestellt (3A, 3B). Die Nahrungsaufnahme der behandelten Zucker-Ratten war während des gesamten Behandlungszeitraums unverändert (4A, 4B). Diese Werte zeigten deutlich, daß die chronische Behandlung mit dem Peptid hGH 177–191 die Körpergewichtszunahme verringerte, ohne die Nahrungsaufnahme zu beeinflussen.
Wie Messungen der Epididymis- und parametrialen Fettpolster zeigen, verringerten die behandelten Mäuse das Gewicht ihres adipösen Gewebes bei männlichen Tieren deutlich bis zu 20% und bei weiblichen bis zu 12%, verglichen mit den Kontrollen vom gleichen Geschlecht (Tabelle 1). Die Lipogenese ist von der Zuführung von Stoffwechselvorläuferverbindungen, wie Glucose und Acetat, abhängig. Folglich wurde der Einfluß von hGH 177–191 oder Analoga bestimmt, indem die Einführung von [C¹⁴]-Glucose in Lipid in abgetrennten adipösen Geweben gemessen wurde. Das Peptid hGH 177–191 und Analoga (Tabelle 5) verringerten die lipogene Wirkung in vitro in abgetrennten Geweben von fettleibigen Zucker-Ratten im Vergleich mit der Kontrolle mehr als 25%. Es wurde die Abnahme der Lipogenese des adipösen Gewebes deutlich, das von mit hGH 177–191 behandelten Mäusen abgetrennt worden war (5A, 5B). Die lipogene Wirkung des Gewebes nahm bei männlichen Mäusen von 2,80 ± 033 auf 2,33 ± 0,21 pMol/mg Gewebe/min und bei weiblichen Mäusen von 3,36 ± 0,13 auf 2,99 ± 0,21 pMol/mg Gewebe/min ab. Es wurde festgestellt, daß die fettspaltende Wirkung in adipösen Geweben der mit hGH 177–191 behandelten fettleibigen Tiere bei beiden Geschlechtern deutlich zunahm (6A, 6B). Diese Ergebnisse stimmen mit der Verringerung der Masse von adipösem Gewebe und der kumulativen Körpergewichtszunahme überein, die bereits beobachtet worden waren.
Tabelle 2 zeigt die Wirkung der Behandlung mit hGH 177–191 auf die Profile der zirkulierenden Mengen von Triglycerid und Cholesterin. Das gesamte Cholesterin im Plasma war bei den männlichen Tieren deutlich von 4,44 ± 0,56 auf 3,52 ± 0,39 mMol/l verringert worden, bei behandelten weiblichen Tieren waren die Plasmawerte von Cholesterin jedoch nur wenig niedriger als die der Kontrolltiere. Andererseits beeinflußte hGH 177–191 die Plasmawerte von Triglycerid bei beiden Geschlechtern nicht. In Gegenwart von hGH 177–191 und verschiedener Analoga waren die Oxidation von Fettsäuren (7) und die Freisetzung von Glycerol (Tabelle 4) in adipösen Geweben stärker, die von fettleibigen Tieren abgetrennt worden waren. Das stimmt mit der Zunahme der fettspaltenden Wirkung der mit hGH 177–191 behandelten adipösen Gewebe überein. All diese Wirkungen in vivo und in vitro auf den Lipidstoffwechsel durch das synthetische hGH 177–191 und Analoga sind anscheinend das Ergebnis der Stimulation der Freisetzung des Zellmessengers Diacylglycerol (8), der wiederum das fettspaltende Schlüsselenzym, die hormonempfindliche Lipase (9) und die lipogenen Enzyme Acetyl-CoA-Carboxylase (10A, 10B) in Zielorganen moduliert.
Die Tabellen 6 und 7 zeigen die antilipogene und fettspaltende Wirkung in vitro von hGH 177–191 und von zwei repräsentativen Analoga (Bezugs-Nr. 9604 und 9605) auf adipöses Gewebe vom Menschen.
Tabelle 8 zeigt ähnlich positive Ergebnisse bei der Fettspaltung bei adipösem Gewebe vom Schwein. Diese Ergebnisse unterstützen die Erwartung, daß hGH 177–191 und Peptidvarianten davon, die sich bei einer Sängerspezies als wirksam gezeigt haben, bei allen Säugern wirksam sind. Da entsprechende Sequenzen von vom Menschen verschiedenen Säugern effektive Peptidvarianten der Human-Sequenz sind, wird folglich auch erwartet, daß jene entsprechenden Sequenzen bei anderen Säugern, einschließlich dem Menschen, wirksam sind.
12 zeigt die Ergebnisse der kumulativen Gewichtszunahme für die Analoga Bezugsnr. 9604 und 9605, wobei sie insbesondere die herausragende Wirksamkeit der Bezugsnr. 9604 zeigt. Dieses Ergebnis in vivo stimmt mit der verstärkten in vitro Aktivität der Bezugsnr. 9604 und 9605 im Vergleich mit hGH 177–191 (Bezugsnr. 9401) überein, die in den Tabellen 6, 7 und 8 aufgeführt ist.
13 zeigt das Ergebnis einer täglichen oralen Verabreichung des Analogons Bezugsnr. 9604 mit 500 μg/kg über lange Zeit durch orale Abgabe an ob/ob-Mäuse.
Die Ergebnisse des in vivo und in vitro Assays zeigen, daß nicht-cyclische Peptid-Analoga im allgemeinen inaktiv sind (die Bezugs-Nr. 9402, 9411, 9611 und 9617 sind nicht cyclisch). Die Inaktivität ergibt sich auch aus der Analin-Substitution an der Position 178, 183 und 186, wobei die Aktivität bei allen anderen getesteten Alanin-Substitutionen (außer bei 182 und 189, die zu keinem Ringschluß führt), einschließlich einer mit zwei d-Alanin-Substitutionen (Bezugsnr. 9501), erhalten blieben. Die Bezugsnr. 9606, bei der Arg an der Position 178 durch Lys ersetzt ist, behält ebenfalls die Aktivität bei, dies gilt auch für die Bezugsnr. 9407, bei der Arg (183) durch Lys ersetzt ist, und die Bezugsnr. 9408, die zwischen Lys (183) und Glu (186) zusätzlich eine Amidbindung aufweist.

Die Inaktivität von Peptiden mit Analin-Substitutionen an den Positionen 183 und 186 stimmt mit der Bedeutung der stabilisierenden Salzbrücken-Wechselwirkung zwischen entgegengesetzten Ladungen an Arg (183) und Glu (186) in hGH 177–191 überein. Der Erhalt der Aktivität bei der Bezugsnr. 9408 (mit einer Amidbindung zwischen Lys (183) und Glu (186)) und bei der Bezugsnr. 9407 (bei der Arg (183) durch das ähnlich positiv geladene Lys (183) ersetzt ist) stimmt mit der Notwendigkeit einer stabilisierenden Bindung, entweder kovalent oder eine Salzbrücke, zwischen der Position 183 und 186 überein. Tabelle 1 Einfluß des synthetischen Peptids hGH 177–191 auf das Körpergewicht und die Masse von adipösem Gewebe von fettleibigen Mäusen nach einer 18tägigen chronischen Behandlung. Die Tiere erhielten eine tägliche i. p. Injektion von entweder hGH 177–191 (200 μg/kg Körpergewicht) oder ein äquivalentes Volumen einer Kochsalzlösung als Kontrolle. Alle Werte sind der Durchschnittswert ± SEM von 6 Tieren (*p < 0,1, **p < 0,05).

	Männlich		Weiblich
Einzelheit	Kontrolle	Behandelt	Kontrolle	Behandelt
Anfängl. Körpergewicht (g)	47,5 ± 3,1	48,6 ± 2,0	46,7 ± 3,6	48,2 ± 3,4
Abschließ. Körpergewicht (g)	51,4 ± 3,0	51,5 ± 2,3	52,1 ± 3,2	52,2 ± 2,9
Körpergewichtszunahme (g)^(a)	3,9 ± 0,6	2,9 ± 0,6*	5,4 ± 0,4	4,0 ± 0,6**
Adipöses Gewebe (g)^(b)	3,18 ± 0,43	2,52 ± 0,25**	3,67 ± 0,54	3,26 ± 0,25**

(a) Der Unterschied zwischen dem anfänglichen und dem abschließenden Körpergewicht wurde als Körpergewichtszunahme angesehen.
(b) Die intakten Epididymus- oder parametrialen Fettpolster stellten die repräsentativen adipösen Gewebe dar.

	Männlich		Weiblich
Einzelheit	Kontrolle	Behandelt	Kontrolle	Behandelt
Triglycerid (mMol/l)	0,63 ± 0,26	0,58 ± 0,16	0,41 ± 0,19	0,38 ± 0,11
Cholesterin (mMol/l)	4,44 ± 0,56	3,52 ± 0,39*	3,01 ± 0,52	2,84 ± 0,29

Einzelheit	Behandlung (Tag 0–18)		Nachbehandlung (Tag 20–36)
Wirkstoff	Bezugsnr.: 9403	Kochsalzlösung	Bezugsnr.: 9403	Kochsalzlösung
Anfängl. Körpergewicht (g)	54,74 ± 4,96	51,50 ± 2,61	54,70 ± 4,15	54,08 ± 2,77
Abschließt Körpergewicht (g)	54,42 ± 4,66	53,72 ± 2,46	56,70 ± 4,45	56,14 ± 2,42
Körpergewichtszunahme (g)	–0,32 ± 0,23	2,22 ± 0,22	2,00 ± 0,24	2,06 ± 0,25
Durchschnittl. Nahrungsverbrauch (g/Maus/Tag)	4,82 ± 0,22	4,88 ± 0,29	5,03 ± 0,13	5,03 ± 0,14
Glucose im Blut (mM)	6,2 ± 0,8	5,8 ± 0,9	6,0 ± 1,0	5,7 ± 0,07
Triglycerid (mM)	0,49 ± 0,10	0,60 ± 0,11	0,54 ± 0,15	0,57 ± 0,08

Peptidkonzentration (μMol)	Glycerolfreisetzung (μMol/g Gewebe/h)
	Analoga
	Bezugsnr. 9401	Bezugsnr. 9403	Bezugsnr. 9407	Bezugsnr. 9404
0	1,42 ± 0,04
0,1	1,82 ± 0,02	1,80 ± 8,03	1,83 ± 0,11	1,75 ± 0,12
1,0	1,86 ± 0,12	1,88 ± 0,13	1,79 ± 0,07	1,94 ± 0,12

¹⁴

Verbindung		in vitro Lipogenese
Bezugsnr. (Beschreibung)	Sequenzidentifizierungsnr.	nMol/ g Gewebe/h	% der Kontrolle	Aktivität
Puffer Kontrolle	-	243 ± 13	100	inaktiv
9401 (hGH 177–191)	1	181 ± 10	75	aktiv
9402 (Cys(Acm) bei 182 und 198)	5	222 ± 9	91	inaktiv
9403 (Lys bei 179)	6	167 ± 28	69	aktiv
9404 (CONH₂)	7	187 ± 18	77	aktiv
9405 (CH₃CO)	8	164 ± 17	68	aktiv
9406 (Ala bei 183)	9	236 ± 17	97	inaktiv
9407 (Lys bei 183)	10	174 ± 16	71	aktiv
9408 (Lys(183)-Glu(186)-Amidbindung)	11	173 ± 16	71	aktiv
9410 (Desamino)	12	143 ± 20	59	aktiv
9411 (Cys(SH) bei 182 und 198)	13	225 ± 15	93	inaktiv
9501 (D-Ala bei 187 u. 190)	14	185 ± 6	76	aktiv
9502 (Pen bei 182, 189)	15	174 ± 5	72	aktiv
9601 (Ala bei 191)	16	185 ± 24	76	aktiv
9602 (Ala bei 190)	17	176 ± 27	73	aktiv
9603 (Ala bei 178)	18	225 ± 18	93	inaktiv
9604 (Tyr-Elongation)	19	118 ± 16	49	aktiv
9605 (Lys-Elongation)	20	184 ± 41	76	aktiv
9606 (Lys bei 178)	21	187 ± 19	77	aktiv
9607 (Ala bei 177)	22	198 ± 12	82	aktiv
9608 (Ala bei 179)	23	173 ± 12	71	aktiv
9609 (Ala bei 180)	24	188 ± 13	78	aktiv
9610 (Ala bei 181)	25	192 ± 14	79	aktiv
9611 (Ala bei 182)	26	224 ± 19	93	inaktiv
9612 (Ala bei 184)	27	191 ± 20	79	aktiv
9613 (Ala bei 185)	28	189 ± 16	78	aktiv
9614 (Ala bei 186)	29	233 ± 13	96	inaktiv
9615 (Ala bei 187)	30	183 ± 17	76	aktiv
9616 (Ala bei 188)	31	203 ± 19	84	aktiv
9617 (Ala bei 189)	32	223 ± 16	92	inaktiv
9618 (LysLys-Elongation)	33	188 ± 19	77	aktiv

	¹⁴C-Einführung (Durchschn. DPM/mg Gewebe/h)
Kontrolle (BSA + Insulin 0,1 Mu/ml	63 ± 5
hGH 177–191 0,1 μM	40 ± 3
Bezugsnr. 9605 0,1 μM	36 ± 2
Bezugsnr. 9604 0,1 μM	28 ± 3

	Freigesetztes Glycerol (nMol/mg Gewebe/h)
Kontrolle	480 ± 80
hGH 177–191 0,5 μM	1000 ± 80
Bezugsnr. 9605 0,5 μM	1100 ± 80
Bezugsnr. 9604 0,5 μM	1200 ± 80

	Freigesetztes Glycerol (nMol/mg Gewebe/h)
Kontrolle	300 ± 8
hGH 177–191 0,5 μM	1300 ± 160
Bezugsnr. 9605 0,5 μM	1350 ± 80
Bezugsnr. 9604 0,5 μM	1600 ± 20

Dokumente:

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Sequenzprotokolle

Claims

Ein Peptid oder ein organisches oder anorganisches saures Additionssalz davon, wobei das Peptid ein Analogon der Carboxy-Endsequenz eines Wachstumshormons aufweist, wobei das Peptid die folgende Aminosäuresequenz hat: Tyr-Leu-Arg-Ile-Val-Gin-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe oder ein cyclisches Disulfid davon.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung von Fettsucht bei einem Tier, wobei die Zusammensetzung eine wirksame Menge eines Peptids nach Anspruch 1 aufweist, gemeinsam mit einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Trägern und/oder Verdünnungsmitteln.
Verwendung eines Peptids nach Anspruch 1 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Fettsucht bei einem Tier.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei das Tier ein Mensch ist.
Verwendung nach Anspruch 3 oder Anspruch 4, wobei das Medikament zur oralen Verabreichung bestimmt ist.