ES2296342T3 - Tratamiento de la obesidad. - Google Patents

Abstract

Un péptido o una sal de adición de ácido orgánico o inorgánico del mismo cuyo péptido comprende un análogo de la secuencia carboxi terminal de una hormona del crecimiento, donde el péptido tiene la secuencia de aminoácidos: Tyr-Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe o un disulfuro cíclico del mismo.

Description

Tratamiento de la obesidad.

Campo de la invención

Esta invención se refiere al tratamiento de la obesidad en animales. En particular, la invención se refiere al tratamiento de la obesidad en seres humanos, aunque se debe entender que la presente invención también se extiende al tratamiento de la obesidad en mamíferos no humanos, por ejemplo, para la mejora de las calidades de la carne en los animales de granja utilizados en la producción de alimento.

Antecedentes de la invención

Está bien reconocido el papel crítico de la hormona del crecimiento humana (hGH) en el crecimiento postnatal en seres humanos. Menos obvio es el impacto de esta hormona sobre la regulación del metabolismo de lípidos e hidratos de carbono, debido a la carencia de estudios moleculares detallados.

Está bien documentado que la forma predominante de hGH es una proteína globular con un peso molecular de 22.000 daltons (22-KD) y consiste en 191 restos aminoácido en una cadena sencilla, plegada mediante 2 puentes disulfuro con un pequeño bucle en el extremo carboxilo entre los restos 182 y 189. Estudios cristalográficos recientes también muestran que la molécula de hGH contiene cuatro hélices \alpha anti-paralelas que están dispuestas en un haz^{1} helicoidal densamente empaquetado de giro levógiro. El concepto de que existen dominios funcionales discretos dentro de la molécula de hGH responsables de acciones metabólicas específicas de la hormona es aceptado generalmente. El extremo amino ha sido identificado como el dominio funcional responsable de las acciones de tipo insulina de la molécula^{2,3} de hGH.

La tecnología de ADN recombinante abre el camino a la producción comercial a gran escala de la hormona de crecimiento humana, y parece que la hGH recombinante tiene eficacias biológicas y propiedades farmacocinéticas equivalentes^{4,5}. El suministro actual de esta hormona de funcionalidad múltiple ya no restringe los tipos y números de terapias experimentales en seres humanos y animales. El uso de hGH para el tratamiento de la baja estatura en niños y adultos está bien establecido^{6}. También se ha informado de los efectos terapéuticos de la hGH sobre la infertilidad en hembras^{7,8}. El tratamiento de la obesidad humana con hGH encuentra una variedad de problemas. La evidencia sugiere que esta hormona de funcionalidad múltiple ejerce simultáneamente a menudo in vivo, mediante diferentes dominios bioactivos en las moléculas, algunos efectos adversos^{9,10}.

La regulación del metabolismo de lípidos por la GH fue descrita en primer lugar en 1959 por Raben y Hollenberg^{11}. El papel regulador de la hormona en el metabolismo de lípidos fue apoyado con posterioridad por estudios de la composición corporal de seres humanos^{12,13} deficientes en GH y tratados con GH y cerdos^{14,15}. Los hallazgos de Gertner sugieren que la hGH está conectada a la distribución del tejido adiposo a través de una serie de interacciones conocidas como el "ciclo GH-grasa"^{16}.

No obstante, los eventos moleculares que se revelan de estos cambios bioquímicos y fisiológicos permanecen en gran parte desconocidos. Los efectos metabólicos de la GH sobre el tejido adiposo y otros tejidos in vivo son variables y complejos, constando aparentemente de al menos dos componentes, un efecto temprano de tipo insulina seguido de un posterior efecto anti-insulina más profundo^{17}. Los resultados del último efecto pueden incluir tanto una estimulación de la lipolisis como una inhibición de la lipogénesis. El efecto antilipogénico de la hGH se ha puesto de relieve con las demostraciones del descenso de la expresión del transportador de glucosa GLUT 4 en adipocitos^{18}, la inhibición de la actividad de la acetil-CoA carboxilasa en tejidos adiposos^{19,20} y la reducción de la incorporación de glucosa a lípidos en células y tejidos aislados^{21,22}.

En vista de los efectos de funcionalidad múltiple de la hGH intacta y de los problemas encontrados en las aplicaciones clínicas de la hormona intacta, se ha dirigido trabajo que conduce a la presente invención para investigar si se podrían sintetizar derivados de hGH que conservaran las bioactividades deseadas y carecieran de los efectos secundarios no deseados.

Los estudios de estructura-función de la hGH con fragmentos hormonales sintéticos han revelado que el extremo carboxilo de la molécula de hGH parece ser el dominio funcional de la hormona para la regulación del metabolismo de lípidos 20,23 y se ha mostrado que un péptido sintético que tiene una secuencia basada en la región carboxilo terminal reduce la ganancia de peso corporal y la masa de tejido adiposo en un modelo animal obeso de laboratorio.

Compendio de la invención

La presente invención proporciona un péptido que es un análogo de la secuencia carboxi terminal de la hormona del crecimiento humana y que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

1

Como se ha descrito antes, la secuencia carboxi terminal de la hormona del crecimiento incluye un dominio metabólico lipídico bioactivo.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de la obesidad que comprende una cantidad efectiva del péptido que comprende un análogo de la secuencia carboxi terminal de una hormona del crecimiento como se ha descrito antes, junto con uno o más portadores y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables.

En otro aspecto más, la presente invención proporciona el uso del péptido que comprende un análogo de la secuencia carboxi terminal de una hormona del crecimiento como se ha descrito antes, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la obesidad en un animal.

Descripción de las realizaciones preferidas

Según se utiliza a lo largo de la memoria, el término "obesidad" se utiliza para incluir el exceso de peso corporal y el exceso de masa de tejido adiposo en el animal, y correspondientemente las referencias al tratamiento de la obesidad incluyen la reducción de la ganancia de peso corporal y la reducción de la masa de tejido adiposo del animal
obeso.

El resultado esperado de cualquier tratamiento de la obesidad es la reducción de peso corporal, la masa de tejido adiposo corporal en particular. La reducción de la masa de tejido adiposo corporal está regulada directamente por dos procedimientos bioquímicos - lipogénesis (producción de grasa) y lipolisis (reducción de grasa) - y generalmente se entiende que estos procedimientos bioquímicos están controlados por enzimas metabólicas clave, específicamente la enzima clave reductora de grasa (lipasa sensible a hormonas) y la enzima clave productora de grasa (acetil CoA carboxilasa).

Los autores de la presente invención han demostrado que hGH 177-191 es eficaz en la estimulación de la enzima clave reductora de grasa, lipasa sensible a hormonas, y en la inhibición de la enzima clave productora de grasa, acetil CoA carboxilasa. Esto está apoyado adicionalmente por los datos que muestran que en presencia de hGH 177-191, la utilización de grasa se acelera mientras que la producción de grasa se reduce, según se mide mediante los productos finales metabólicos in vitro así como in vivo. Además, se ha establecido el mecanismo de estas acciones moleculares como resultado de la activación de la producción del segundo mensajero celular, el diacilglicerol.

La presente invención proporciona un péptido según la reivindicación 1.

Los péptidos que comprenden los restos aminoácido 177-191 de la hormona del crecimiento humana nativa (hGH 177-191) incluyen la siguiente secuencia (Núm. de Ref. 9401):

2

Semejante péptido nativo puede estar en forma de disulfuro cíclico, y puede comprender una sal de adición de ácido orgánico o inorgánico.

El análogo de elongación de acuerdo con la presente invención, que muestra unas propiedades anti-obesidad especialmente potenciadas es el siguiente (Núm. de Ref. 9604):

3

El enlace entre los aminoácidos en 182 y 189 de hGH puede ser un enlace disulfuro.

Cuando sea apropiado, el análogo descrito antes puede comprender una sal de ácido orgánico o inorgánico.

El término "cantidad efectiva" según se utiliza en la presente memoria significa una cantidad del péptido suficiente para lograr el efecto deseado en el tratamiento de la obesidad en el animal, pero no una cantidad tan alta como para ocasionar efectos secundarios o reacciones adversas graves.

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En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de un péptido que comprende un análogo de la secuencia carboxi terminal de una hormona del crecimiento como se ha descrito antes, en el tratamiento de la obesidad en un animal o en la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento de la obesidad en un animal.

En otro aspecto más, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de la obesidad en un animal, que comprende una cantidad efectiva de un péptido que comprende un análogo de la secuencia carboxi terminal de una hormona del crecimiento como se ha descrito antes, junto con uno o más portadores y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables.

El péptido que es el ingrediente activo de la composición farmacéutica de este aspecto de la invención muestra una actividad terapéutica ventajosa en el tratamiento de la obesidad en un animal cuando se administra en una cantidad apropiada para el caso concreto. Por ejemplo, se pueden administrar de aproximadamente 0,5 \mug a aproximadamente 20 mg por kilogramo de peso corporal por día. Los regímenes de dosificación se pueden ajustar para proporcionar la respuesta profiláctica o terapéutica óptima. Por ejemplo, se pueden administrar una o más dosis divididas diariamente, semanalmente, mensualmente o en otros intervalos de tiempo adecuados o la dosis se puede reducir proporcionalmente según sea indicado por las exigencias de la situación clínica.

El ingrediente activo se puede administrar de cualquier manera conveniente tal como las rutas oral, parenteral (incluyendo inyección intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intramuscular e intramedular), intranasal, intradérmica o mediante supositorio o mediante implante (p. ej. utilizando dispositivos de liberación lenta). Por facilidad de administración, se prefiere la administración oral, no obstante la administración parenteral también es bastante conveniente. Dependiendo de la ruta de administración, se puede requerir que el ingrediente activo esté recubierto de un material que proteja dicho ingrediente de la acción de enzimas, ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar dicho ingrediente. Por ejemplo, el bajo carácter lipófilo del ingrediente puede permitir que se le destruya en el tracto gastrointestinal mediante enzimas capaces de escindir los enlaces peptídicos y en el estómago mediante la hidrólisis ácida. Con el fin de administrar la composición mediante otra distinta de la administración parenteral, el ingrediente activo se puede recubrir, o administrar, con un material que prevenga su inactivación.

El ingrediente activo también se puede administrar en dispersiones preparadas en glicerol, polietilenglicoles líquidos, y/o mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contendrán usualmente un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.

Las formas farmacéuticas adecuadas para el uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles (cuando sean solubles en agua) y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe se estéril y debe ser fluida hasta el grado de que exista una fácil aplicabilidad mediante jeringa. Debe ser estable en condiciones de fabricación y almacenamiento y se debe preservar de la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un medio disolvente o de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos se puede producir mediante diferentes agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede producir, por ejemplo, mediante el uso en las composiciones de agentes retardadores de la absorción.

Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando el ingrediente activo en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con algunos de los otros ingredientes enumerados antes, según se requiera, seguido de esterilización mediante filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el ingrediente activo esterilizado a un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados antes. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son el secado a vacío y la técnica de liofilización que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de la solución previamente filtrada en condiciones estériles del mismo.

Cuando el ingrediente activo se protege adecuadamente como se ha descrito antes, la composición se puede administrar oralmente, por ejemplo, con un diluyente inerte o con un portador comestible asimilable, o se puede meter en una cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda, o se puede comprimir en comprimidos, o se puede incorporar directamente al alimento de la dieta. Para la administración oral, el ingrediente activo se puede incorporar a excipientes y utilizar en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas, y similares. Tales composiciones y preparaciones deben contener al menos 0,01% en peso y más preferiblemente al menos 0,1-1% en peso de ingrediente activo. El porcentaje de las composiciones y las preparaciones, por supuesto, puede variar y puede estar convenientemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 80% del peso de la unidad. La cantidad de ingrediente activo en las composiciones farmacéuticas es tal que se puede obtener una dosificación adecuada. Las composiciones o preparaciones preferidas de acuerdo con la presente invención se pueden preparar, por ejemplo, de manera que una forma unitaria de dosificación oral contiene entre aproximadamente 0,5 \mug y 200 mg y más preferiblemente 10 \mug y 20 mg de ingrediente activo.

Los comprimidos, trociscos, píldoras, cápsulas y similares pueden contener también lo siguiente: un aglutinante tal como goma de tragacanto, acacia, almidón de maíz o gelatina; excipientes tales como fosfato dicálcico; un agente disgregante tal como almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico, y similares; un lubricante tal como estearato de magnesio; y se puede añadir un agente edulcorante tal como sacarosa, lactosa o sacarina o un agente aromatizante tal como menta, aceite de gaulteria, o aroma de cereza. Cuando la forma de dosificación unitaria es una cápsula, ésta puede contener, además de las sustancias del tipo anterior, un portador líquido. Pueden estar presentes otras sustancias en forma de recubrimientos o modificando de otro modo la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, los comprimidos, las píldoras, o las cápsulas pueden estar recubiertas con goma laca, azúcar o ambos. Un jarabe o elixir puede contener el compuesto activo, sacarosa como agente edulcorante, metil- y propilparabenos como conservantes, un colorante y un aromatizante tal como aroma de cereza o naranja. Por supuesto, cualquier material utilizado al preparar cualquier forma de dosificación debe ser farmacéuticamente puro y sustancialmente no tóxico en las cantidades empleadas. Además, el ingrediente activo se puede incorporar a preparaciones y formulaciones de liberación sostenida.

Según se utiliza en la presente memoria, los portadores y diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, soluciones acuosas, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, y similares. El uso de tales medios y agentes para las sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica, y se describe, a modo de ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Company, Pennsilvania, USA. Excepto hasta que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla el uso de los mismos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención. También se pueden incorporar a las composiciones ingrediente activos suplementarios.

Es especialmente ventajoso formular las composiciones en una forma de dosificación unitaria para facilitar la administración e igualar la dosificación. La forma de dosificación unitaria según se utiliza en la presente memoria hace referencia a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos humanos que se vayan a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de ingrediente activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado asociado con el portador y/o diluyente farmacéutico requerido. Las especificaciones para las formas de dosificación unitarias novedosas de la invención están dictadas por y son directamente dependientes de (a) las características únicas del ingrediente activo y el efecto terapéutico concreto que se vaya a lograr, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica para formar semejante ingrediente activo para el tratamiento de la obesidad.

A lo largo de esta memoria y de las especificaciones que siguen, a no ser que el contexto requiera otra cosa, se entenderá que la palabra "comprende", o variaciones tales como "comprenden" o "que comprende", implican la inclusión de un número entero o grupo de números enteros establecidos pero no la exclusión de otro múmero entero o grupo de números enteros cualesquiera.

Resultarán evidentes detalles adicionales de la presente invención a partir del siguiente Ejemplo y de los dibujos adjuntos que están incluidos a modo de ilustración, no a modo de limitación, de esta invención.

Breve descripción de los dibujos

En los dibujos:

Las Figuras 1A y 1B muestran el efecto del péptido hGH 177-191 sobre las ganancias de peso corporal cumulativas en ratones C57BL/6J (ob/ob) macho (1A) y hembra (1B) durante el período de tratamiento de 18 días. A los animales se les administró una inyección intraperitoneal diaria de 0,1 ml de solución salina o de hGH 177-191 (200 \mug/kg peso corporal). Cada punto representa la media \pm ETM de 6 animales.

Las Figuras 2A y 2B muestran el consumo diario medio de alimento (g/ratón/día) de ratones C57BL/6J (ob/ob) durante un período de tratamiento de 18 días con hGH 177-191. El tratamiento para los cuatro grupos de animales fue como el descrito en las figuras 1A y 1B. Cada punto representa la media \pm ETM de 6 animales. En ningún momento se observó significación entre los grupos.

Las Figuras 3A y 3B demuestran el efecto del péptido hGH 177-191 sobre la ganancia de peso corporal de ratas Zucker macho obesas (fa/fa) de 14-15 semanas de edad durante el período de tratamiento de 20 o 27 días. A los animales se les inyectó una inyección intraperitoneal diaria de solución salina o del péptido (500 \mug/kg peso corporal) (3A) o se implantó intradérmicamente un comprimido de liberación lenta (500 \mug/día/kg peso corporal) en el cuadrante inferior del abdomen de los animales. Al grupo de control se le implantó un comprimido placebo de la misma manera. Cada punto representa la media \pm ETM de 6 animales.

Las Figuras 4A y 4B demuestran el consumo de alimento diario medio (g/rata/día) de ratas Zucker obesas durante el período de tratamiento con el péptido hGH 177-191. El tratamiento para los cuatro grupos de animales fue el que se describe en las Figuras 3A y 3B. Cada punto representa la media \pm ETM de 6 animales. No se observó significación entre los grupos de ensayo y los controles apropiados en ningún momento.

Las Figuras 5A y 5B describen el efecto ex vivo sobre la lipogénesis en tejidos adiposos de los ratones macho C57BL/6J (ob/ob) (5A) y los ratones hembra (5B) luego del tratamiento de 18 días con hGH 177-191. Los datos indican la tasa de síntesis de lípidos [C^{14}] y se expresan como glucosa-[C^{14}] incorporada a los lípidos (pmoles/mg tejido/min). Los valores son la media \pm ETM de 12 determinaciones de 6 animales de cada grupo. Las diferencias entre los grupos tratados con hGH 177-191 y con solución salina de control fueron estadísticamente significativas.

Las Figuras 6A y 6B describen el efecto ex vivo sobre la lipolisis en tejido adiposo de los ratones macho C57BL/6J (ob/ob) (6A) y los ratones hembra (6B) luego del tratamiento de 18 días con hGH 177-191. Los datos indican la tasa de liberación de glicerol desde los tejidos adiposos (pmoles/mg tejido/min). Los valores son de la media \pm ETM de 12 determinaciones de 6 animales de cada grupo. Las diferencias entre los grupos tratados con hGH 177-191 y con solución salina de control fueron estadísticamente significativas.

La Figura 7 ilustra el efecto in vitro de hGH 177-191 sobre la oxidación de ácidos grasos en tejidos adiposos aislados de ratones C57BL/6J (ob/ob) con la determinación de la tasa de producción de O_{2}-[C^{14}] a partir de ácido palmítico-[C^{14}]. La tasa de oxidación del ácido palmítico-[C^{14}] se expresó como \mumoles/g tejido/hr.

La Figura 8 ilustra el efecto in vitro de hGH 177-191 sobre la liberación de diacilglicerol a partir de adipocitos aislados de ratas normales a lo largo de un período de incubación de 40 min. El diacilglicerol se cuantificó utilizando un análisis radioenzimático y los resultados se expresaron como % de incremento sobre los niveles basales.

La Figura 9 muestra el efecto in vitro de hGH 177-191 sobre la actividad lipasa sensible a hormonas en adipocitos aislados de ratas Zucker macho obesas (fa/fa) determinado mediante la cantidad de ácido oleico-[C^{14}] hidrolizado a partir de trioleína-[C^{14}]. La enzima se expresó como U/mg de proteína, donde la liberación de 1 nmol de ácido oleico por hora se consideró como 1 Unidad de actividad enzimática.

Las Figuras 10A y 10B muestran el efecto in vitro de hGH 177-191 sobre la acetil-CoA carboxilasa en adipocitos aislados (10A) y hepatocitos (10B) de ratas normales determinado mediante la reacción de fijación de bicarbonato-[C^{14}] y expresado como mU/g de peso seco celular, donde 1 Unidad de acetil-CoA carboxilasa se definió como la carboxilación de 1 \mumol de acetil-CoA por minuto.

La Figura 11A demuestra el efecto del análogo con el Núm. Ref. 9403 (SEQ ID NO: 6) sobre la ganancia de peso corporal de ratones C57BL/6J (ob/ob) de 26 semanas de edad durante el período de tratamiento de 18 días. A los animales se les administró una inyección intraperitoneal diaria de solución salina (como control) o de análogo peptídico (500 \mug/kg peso corporal). Cada punto representa la media \pm ETM de 6 animales.

La Figura 11B muestra el consumo de alimento diario medio (g/ratón/día) de ratones C57BU6J (ob/ob) de 26 semanas de edad durante el período de tratamiento con el análogo con el Núm. de Ref. 9403 (SEQ ID NO: 6). El tratamiento para los dos grupos de animales fue el descrito en la Figura 11A. Cada punto representa la media \pm ETM de 6 animales. No se observó significación entre el grupo de ensayo y el control en ningún momento.

La Figura 12 muestra el efecto sobre la ganancia de peso corporal del tratamiento crónico de ratones C57BL/6J (ob/ob) de 16 semanas de edad con análogos con los Núms. de Ref. 9604 (SEQ ID NO: 19) y 9605 (SEQ ID NO: 20).

La Figura 13 muestra el efecto de la administración oral a largo plazo del análogo con el Núm. de Ref. 9604 a ratones ob/ob.

Las referencias a análogos distintos de 96404 (SEQ ID NO: 19) son sólo ilustrativas.

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Ejemplo

Materiales y métodos Animales y tratamientos

Se utilizaron ratones C57BL/6J (ob/ob) obesos y ratas Zucker (fa/fa) obesas para demostrar los efectos biológicos de hGH 177-191 sintético y análogos. Los animales de la misma edad y del mismo sexo se dividieron al azar en dos grupos, se alojaron 6 por jaula y se mantuvieron en un ciclo de 12 horas de luz/oscuridad normal a una temperatura constante de la sala de 25ºC en el alojamiento para animales del Department of Biochemistry and Molecular Biology, Monash University, Clayton, Australia. Los animales se alimentaron ad libitum con una cantidad predeterminada de gránulos para animales (Clark King, Melbourne, Australia) y se les dejó libre acceso al agua en todo momento. A los animales se les administró una inyección intraperitoneal (i.p.) diaria de 0,1 ml de péptido sintético (200-500 \mug/kg peso corporal) o de un volumen equivalente de solución salina fisiológica (cloruro de sodio al 0,9%) durante un número apropiado de días. La inyección i.p. se administró con una aguja 0,31 x 13 mm (30G x ½'') en jeringas de tuberculina de 1 ml desechables, y el sitio de inyección fue el cuadrante inferior izquierdo del abdomen de los animales. Para estudiar los efectos de la liberación controlada de hGH 177-191 y de los análogos, se implantaron intradérmicamente gránulos de péptido de liberación lenta de un diámetro de 3 mm en la región abdominal de ratas Zucker bajo anestesia. Se vigilaron el peso corporal y la absorción de alimentos durante los períodos de tiempo indicados.

Síntesis Peptídica

Los péptidos se prepararon utilizando técnicas en fase sólida con 9-fluorenilmetiloxicarbonil(Fmoc) normalizadas. La síntesis en fase sólida, por ejemplo, podría comenzar a partir del extremo C-terminal del péptido utilizando un aminoácido con el grupo \alpha-amino protegido. Una sustancia de partida adecuada se podría preparar, por ejemplo, anclando el \alpha-aminoácido requerido a una resina Wang (resina de alcohol 4-alcoxibencíclico), o resinas de amida Rink (2,4-dimetoxi-4'-[carboximetiloxi]-benzidrilamina unida a una resina aminometílica) o resina PAM (resina de ácido 4-hidroximetilfenilacético). Las resinas estuvieron disponibles en el mercado de Auspep Pty. Ltd., Parkville, Victoria, Australia.

En la preparación en fase sólida de los compuestos, se acopló un aminoácido protegido a una resina con la ayuda de un agente de acoplamiento. Después del acoplamiento inicial, el grupo protector de \alpha-amino se eliminó con piperidina en disolventes orgánicos a temperatura ambiente. Después de la eliminación del grupo protector de \alpha-amino, los aminoácidos protegidos restantes se acoplaron por etapas en el orden deseado. Se utilizó generalmente un exceso de 4 veces de cada aminoácido protegido en la reacción con un activador del grupo carboxilo apropiado tal como diisopropilcarbodiimida (DIC) y 1-hidroxibenzotriazol (HOBt), en mezclas de cloruro de metileno (DCM)-N,N-dimetilformamida (DMF).

Después de completar la secuencia de aminoácidos deseada, el péptido se escindió después del soporte de resina mediante tratamiento con un reactivo tal como ácido trifluoroacético (TFA) o ácido trifluorometanosulfónico (TFMSA) que escindió el péptido de la resina, así como todos los grupos protectores de las cadenas laterales, excepto para Cys(Acm). Cuando se utilizó una resina Wang, el tratamiento con TFA dio como resultado la formación de ácidos del péptido libres. Cuando se utilizó la resina de amida Rink, el tratamiento con TFA dio como resultado la formación de amidas del péptido libres. Cuando se utilizó una resina PAM, el tratamiento con TFMSA dio como resultado la formación de ácidos del péptido libres. Los péptidos diana podrían existir en forma de disulfuro cíclico que requiere modificación post-síntesis.

Los siguientes ejemplos se proporcionan sólo con el fin de ilustrar adicionalmente y no se pretende que limiten la invención descrita. Las referencias a análogos peptídicos distintos de 9604 (SEQ ID NO: 19) son sólo para ilustrar.

A. Síntesis del pentadecapéptido que comprende los restos aminoácido 177-191 de la hormona del crecimiento humana nativa, designado hGH (177-191) (Núm. de Ref. 9401) Leu^{1}-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe^{15} (disulfuro cíclico)

Para preparar el pentadecapéptido se empleó el siguiente procedimiento:

Etapa 1

La resina Wang (0,625 g, 0,5 mmoles) se colocó en una vasija de reacción de 10 ml. Se añadió DCM (4 ml) a la vasija de reacción. La resina Wang se lavó con agitación vigorosa durante 2 minutos. La solución en DCM se drenó después de la vasija de reacción. Éste lavado se repitió dos veces.

Etapa 2

Se mezclaron Fmoc-L-fenilalanina (Fmoc-Phe, 0,388 g, 1,0 mmoles) en 2,4 ml de NMP-DCM (1:5, v/v) y DIC (0,135 g, 1,0 mmoles) en 1,0 ml NMP en una vasija de reacción durante 10 minutos. A la mezcla, se le añadió 4-dimetilaminopiridina (DMAP, 0,074 g, 0,06 mmoles) en 0,6 ml de DMF. Se dejó que la reacción en la solución continuara durante 68 minutos a temperatura ambiente. La solución se secó después, la resina se lavó cuidadosamente con NMP (4 ml x 3) y DCM (4 ml x 3). El complejo de Fmoc-Phe-Resina Wang se secó a vacío durante la noche para producir 0,781 g de material. El nivel de acoplamiento del aminoácido a la resina se determinó para que fuera de 0,80 mmol/g de resina utilizando la medición espectrofotométrica del aductos de Fmoc-piperidina.

Etapa 3

Se colocó Fmoc-Phe-Resina Wang (0,263 g, 0,20 mmoles) en la vasija de reacción de 10 ml. Se añadió DMF (8 ml) para lavar y dilatar la resina agitando durante 2 minutos. La solución se drenó después de la vasija de reacción.

Etapa 4

Una solución de piperidina 25%/DMF (4 ml) se añadió a la vasija de reacción. La mezcla resultante se agitó durante 2 minutos. La solución se drenó de la vasija de reacción. Este procedimiento de desprotección se repitió una vez con un período de agitación prolongado (18 min). La solución se drenó de la vasija de reacción.

Etapa 5

Se añadió DMF (8 ml) a la vasija de reacción. La solución resultante se agitó durante 2 minutos. La solución se drenó de la resina en la vasija de reacción. Este procedimiento de lavado se repitió dos veces. Se añadió DMF (2 ml) se añadió a la vasija de reacción para mantener la resina dilatada.

Etapa 6

Se añadieron Fmoc-glicina (Fmoc-Gly, 0,238 g, 0,8 mmoles), HOBt (108 mg; 0,8 mmoles) y DIC (128 \mul; 0,8 mmoles) a un tubo de ensayo de 10 ml que contenía 2 ml de DMF. La mezcla se agitó durante 10 minutos para comenzar la activación del aminoácido. La solución se añadió después a la resina que originalmente se colocó en la vasija de reacción. La mezcla resultante se agitó durante 1.5 horas o hasta que se obtuvo una prueba de la ninhidrina negativa. La solución se drenó después de la vasija de reacción.

Etapa 7

Se añadió DMF (8 ml) a la vasija de reacción. La solución resultante se agitó vigorosamente durante 2 minutos. La solución se drenó después de la vasija de reacción. El procedimiento de lavado se repitió dos veces.

Se repitieron después las etapas 4 a 7 empleando el siguiente orden de aminoácidos:

Fmoc-Cys(Acm)

Fmoc-Ser(t-Bu)

Fmoc-Gly

Fmoc-Glu(O-tBu)

Fmoc-Val

Fmoc-Ser(t-Bu)

Fmoc-Arg(Pmc)

Fmoc-Cys(Acm)

Fmoc-Gln

Fmoc-Val

Fmoc-Ile

Fmoc-Arg(Pmc)

Fmoc-Leu

Una vez completada la síntesis del péptido-resina deseado, la vasija de reacción que contenía el péptido-resina se colocó después en un desecador y se secó durante la noche a vacío. El rendimiento del péptido-resina fue de 0,635 g. El péptido-resina seco se retiró de la vasija de reacción y se colocó en un matraz de fondo redondo de 50 ml que contenía una varilla agitadora magnética. La escisión del péptido de la resina con TFA se llevó a cabo con el procedimiento siguiente: Una solución de captador, que contenía 0,75 g de fenol, 0,5 ml de H_{2}O, 0,5 ml de tioanisol, y 0,25 ml etanoditiol, se añadió al matraz de fondo redondo. La mezcla resultante se agitó durante 5 minutos. Se añadieron gota a gota 10 ml de TFA en el matraz mientras se seguía agitando vigorosamente. La mezcla resultante se agitó durante 2,5 horas a temperatura ambiente.

La mezcla se filtró a través de un filtro de porosidad media, un embudo de vidrio fritado. La solución de TFA-péptido se aspiró a otro matraz de fondo redondo de 500 ml que contenía 200 mL de éter dietílico frío aplicando vacío. Se dejó que el péptido precipitara en la solución de éter a 4ºC durante la noche, después se recogió filtrando la mezcla a través de un embudo fritado, de porosidad fina. El sedimento de péptido del filtro se lavó con éter frío (10 ml x 3) para eliminar el captador. El sedimento de péptido se disolvió después con ácido acético acuoso al 25% y después se liofilizó para producir el péptido bruto (aproximadamente 400 mg de peso seco, pureza \sim80%).

El péptido bruto se purificó mediante cromatografía líquida de alto rendimiento en fase reversa (RP-HPLC). La purificación se llevó a cabo en una columna preparativa Supelcosil PLC-18 (octadecil, C_{18}) de 21, x 250 mm (tamaño de poro de 120 Angstrom, tamaño de partícula de 12 \mum, área de superficie de 190 m^{2}/g; Supelco, Bellefonte, PA, U.S.A.) a una velocidad de flujo de 5,0 ml/min a temperatura ambiente. Se utilizó un programa de gradiente lineal donde el disolvente A fue agua con TFA al 0,1%, y el disolvente B fue acetonitrilo-agua (50/50: v/v, que contenía TFA al 0,1%). El gradiente se desarrolló del 20 al 100% a lo largo de 80 min. Los perfiles de separación se registraron y se analizaron utilizando un integrador Perkin-Elmer LC-100. El componente peptídico deseado se extrajo y se recogió con el colector de fracciones automático de Pharmacia Modelo FRAC-100 (Uppsala, Suecia). Las fracciones de componente idéntico se combinaron y se liofilizaron. El péptido purificado (275 mg de peso seco, pureza >98%), Cys(Acm)^{6,13}-pentadecapéptido, se mantuvo congelado a -20ºC.

Para la ciclación del puente disulfuro de los péptidos, se utilizó la oxidación con yodo en ácido acético acuoso al 80% para eliminar los grupos protectores de cisteína, Acm, y proporcionar el puente disulfuro intramolecular simultáneamente. El Cys(Acm)^{6,13}-pentadecapéptido (275 mg, 0,155 mmoles) se disolvió en 50 ml de ácido acético acuoso al 80%. Esta solución se añadió rápidamente a un matraz de fondo redondo de 250 ml que contenía yodo (378 mg, 1,4 mmoles) en 100 ml de ácido acético acuoso al 80% agitando vigorosamente. Se dejó que continuara la reacción durante 2 horas a temperatura ambiente y se terminó añadiendo el ácido ascórbico (Vitamina C) a la solución resultante. El volumen de líquido se redujo después mediante evaporación rotatoria y el péptido se recuperó mediante liofilización. El péptido ciclado se purificó después mediante RP-HPLC como se ha descrito en la purificación del péptido lineal. Después de la liofilización, se produjeron 165 mg de pentadecapéptido cíclico con una pureza del 96%. El rendimiento total de la síntesis fue de aproximadamente 46%.

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B. Síntesis del pentadecapéptido (Núm. de Ref. 9404)

4

Se empleó el procedimiento mostrado en el EJEMPLO A. La modificación consistió en omitir la resina Wang y reemplazarla por la resina de amida Rink.

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C. Síntesis del pentadecapéptido (Núm. de Ref. 9410)

5

Se empleó el procedimiento mostrado en el EJEMPLO A. La modificación consistió en la reposición de Fmoc-Leu con ácido 4-metil-pentacarboxílico, dando como resultado la síntesis del pentadecapéptido desaminado.

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D. Síntesis del pentadecapéptido (Núm. de Ref. 9405)

6

Se empleó el procedimiento mostrado en EJEMPLO A. Una vez completada la síntesis del péptido-resina desbloqueado deseado, se añadieron 5 ml de solución de anhídrido acético al 20% en DMF. Al cabo de 5 minutos, se añadieron 71 \mul (0,4 mmoles) de diisopropiletilamina (DIEA) para neutralizar los protones que se generaron. La acetilación del péptido se realizó a temperatura ambiente durante 30 minutos. El péptido-resina se lavó dos veces con DMF y dos veces con DCM y el péptido-resina N-acetilado estuvo preparado para la escisión con TFA como se muestra en el Ejemplo A.

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E. Síntesis del diciclo-pentadecapéptido (Núm. de Ref. 9408)

7

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El siguiente procedimiento se empleó para preparar el pentadecapéptido:

Etapa 1

El Boc-L-fenilalanina-resina PAM (0,400 g, 0,2 mmol; Auspep, Melbourne, Australia; Núm. de Cat. 5290F, Número de Lote 494123) se colocó en una vasija de reacción de 10 ml. La resina se lavó con DCM (4 ml) mediante agitación vigorosa durante 2 minutos. La solución en DCM se drenó después de la vasija de reacción. Este lavado se repitió una vez.

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Etapa 2

Se añadió una solución de TFA 50%/DCM (4 ml) a la vasija de reacción. La mezcla resultante se agitó durante 2 minutos. La solución se drenó después de la vasija de reacción. Este procedimiento de desprotección se repitió una vez con un tiempo de agitación de 18 minutos. La solución se drenó de la vasija de reacción. Se añadió DCM (4 ml) a la vasija de reacción y el contenido se dejó estar durante 2 minutos. La solución se drenó de nuevo de la resina. Este procedimiento de lavado se repitió dos veces. Se añadió DIEA 10%/DMF (4 ml) a la vasija de reacción. La mezcla resultante se dejó estar durante 1 minuto y la solución se eliminó como antes. Este procedimiento de desprotección se repitió una vez. Se añadió DMF (4 ml) al complejo de resina de la vasija de reacción. La solución resultante se dejó estar durante 2 minutos, seguido de la eliminación de la solución de la vasija. Este procedimiento de lavado se repitió cuatro veces. Finalmente, se añadió DMF (2 ml) a la vasija de reacción para mantener la resina dilatada.

Etapa 3

Se añadieron Fmoc-glicina (Fmoc-Gly, 0,238 g, 0,8 mmoles), HOBt (108 mg; 0,8 mmoles) y DIC (128 \mul; 0,8 mmoles) a un tubo de ensayo de 10 ml que contenía 2 ml de DMF. La mezcla se agitó durante 10 minutos para activar el aminoácido. La solución se añadió después a la resina en la vasija de reacción. La mezcla resultante se agitó durante 1,5 horas o hasta que se obtuvo una prueba de la ninhidrina negativa. La solución se drenó después de la vasija de reacción.

Etapa 4

Se añadió DMF (8 ml) a la vasija de reacción. La solución resultante se agitó vigorosamente durante 2 minutos, seguido de la eliminación del sobrenadante. El procedimiento de lavado se repitió dos veces.

Etapa 5

Se añadió una solución de piperidina 25%/DMF (4 ml) a la vasija de reacción. La mezcla resultante se agitó durante 2 minutos. La solución se drenó de la vasija de reacción. Este procedimiento de desprotección se repitió una vez agitando durante 18 minutos. La solución se drenó de la vasija de reacción.

Etapa 6

Se añadió DMF (8 ml) a la vasija de reacción. La solución resultante se agitó durante 2 minutos. La solución se drenó de la resina de la vasija de reacción. Este procedimiento de lavado se repitió dos veces. Se añadieron 2 ml DMF a la vasija de reacción para mantener la resina dilatada.

Las Etapas 3 a 6 se repitieron después con el siguiente orden de aminoácidos:

Fmoc-Cys(Acm)

Fmoc-Ser(Bzl)

Fmoc-Gly

Fmoc-Glu(O-tBu)

Fmoc-Val

Fmoc-Ser(Bzl)

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Etapa 7

Las Etapas 3 y 4 se repitieron para acoplar Fmoc-Lys(Boc) a Ser en la posición 184. Una vez completado el acoplamiento, la vasija de reacción que contenía el péptido-resina se colocó después en a desecador y se secó durante la noche a vacío. El péptido-resina se transfirió después a una vasija de reacción de 10 ml. Se añadió DCM (4 ml) a la vasija de reacción. La resina se lavó con agitación vigorosa durante 2 minutos. La solución en DCM se drenó después de la vasija de reacción. Este lavado se repitió una vez.

Etapa 8

La Etapa 2 se utilizó para eliminar el grupo Boc y el grupo t-Bu de la cadena lateral de la lisina y del ácido glutámico, respectivamente.

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Etapa 9

Se añadió 1 ml de DIEA 1,5%/DMF a la vasija de reacción. Se disolvieron hexafluorofosfato de benzotriazo-1-il-oxi-tris-(dimetilamino)fosfonio (BOP) (400 mg; 0,90 mmoles), HOBt (122 mg, 0,90 mmoles), y DIEA (400 \mul, 2,25 mmoles) en 3,4 ml de DIEA al 1,5%/DMF y después se añadieron a la vasija de reacción. La mezcla resultante se agitó durante 3 horas o hasta que se obtuvo una prueba de la ninhidrina negativa antes de la eliminación del sobrenadante de la vasija de reacción. después se añadió DMF (8 ml) a la vasija de reacción. La solución resultante se agitó vigorosamente durante 2 minutos. La solución se drenó después de la vasija de reacción. El procedimiento de lavado se repitió dos veces.

Etapa 10

Las Etapas 5 a 6 se repitieron después para eliminar el grupo Fmoc del grupo \alpha-amino del resto lisina en el péptido-resina.

Las Etapas 3 a 6 se repitieron después con el siguiente orden de aminoácidos:

Fmoc-Cys(Acm)

Fmoc-Gln

Fmoc-Val

Fmoc-Ile

Fmoc-Arg(Pmc)

Fmoc-Leu

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Una vez completada la síntesis de la resina peptídica deseada, se repitió después la Etapa 4 para eliminar el grupo Fmoc de la Leu y obtener la resina peptídica desbloqueada. La vasija de reacción que contenía la resina peptídica se colocó después en un desecador y se secó durante la noche a vacío. Se produjeron 604 mg de péptido-resina. La resina peptídica seca se retiró de la vasija de reacción y se colocó en un matraz de fondo redondo de 25 ml que contenía una varilla agitadora magnética. Se utilizó el protocolo de escisión con ácido trifluorometanosulfónico (TFMSA)/TFA para escindir el péptido de la resina PAM: Se añadió al matraz una solución de captador, que contenía 500 \mul de tioanisol, y 250 \mul de etanoditiol. La mezcla resultante se agitó durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron gota a gota 5 ml de TFA al matraz mientras se seguía agitando vigorosamente. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se colocó el matraz en un baño de hielo y después se añadieron lentamente 500 ml de TFMSA mientras se seguía agitando vigorosamente. La mezcla resultante se agitó en el baño de hielo durante 10 minutos y a temperatura ambiente otros 15 minutos. Se añadió éter dietílico (50 ml) al matraz para detener la reacción y precipitar el péptido escindido. El péptido se recogió filtrando la mezcla a través de un embudo de vidrio fritado, de porosidad fina y se lavó con éter frío (10 mL x 3) para eliminar el captador. El sedimento peptídico se disolvió con 30 ml de acetonitrilo 50%/H_{2}O seguido de la adición de 5 ml de NH_{4}HCO_{3} al 10% frío para neutralizar la solución. El péptido bruto (519 mg, pureza \sim69%) se obtuvo después de la liofilización.

La preparación del péptido con la forma de disulfuro cíclico y la purificación del producto final puro se muestran en el Ejemplo A.

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F. Síntesis del hexadecapéptido (Núm. de Ref. 9604) de la presente invención

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Se empleó el procedimiento mostrado en Ejemplo A, se modificó mediante la adición de una repetición adicional de las etapas 4 a 7 utilizando Fmoc-Tyr(t-Bu).

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Ganancia de peso cumulativa y consumo de alimento

La ganancia de peso cumulativa y el consumo de alimento se determinaron a intervalos de 3 días mediante las mediciones del peso corporal y del alimento no ingerido que quedaba en las jaulas. Los animales se colocaron en una cámara cubierta para minimizar el movimiento durante el procedimiento de pesaje. Los datos de consumo de alimento se obtuvieron restando la cantidad de alimento no ingerido que quedaba en las jaulas de la provisión original.

Análisis de triglicéridos y colesterol total en plasma

Los animales se anestesiaron con pentobarbitona sódica (80 mg/kg peso corporal) 12 hr después de la última dosis de hGH 177-191. Se recogieron muestras de sangre de la vena de la cola de los animales anestesiados 45 min después de la administración del anestésico. Después de centrifugarlo a 2000 x g durante 5 minutos, el plasma se retiró de las muestras y se utilizó para los análisis de los metabolitos. Los triglicéridos y el colesterol total se midieron mediante métodos espectrofotométricos para enzimas. Los reactivos están basados en una reacción de color de tipo Trinder con glicerol fosfato oxidasa (GPO) modificada^{24} o un método con colesteroloxidasa-4-aminoantipirina^{25}. Todos los análisis se realizaron con el CentrifiChem System 400 (Union Carbide) que contenía un pipeteador automático, un analizador centrífugo y un espectrofotómetro con registro. Se utilizó Seronorm Lipid (Nycomed Pharma Co., Oslo, Norway) como calibrador.

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Determinación del peso de tejido adiposo

El procedimiento para el aislamiento y la medición de los depósitos de grasa epididimaria se estableció en estudios previos de crecimiento epididimario de ratones carentes de GH (lit/lit). En el presente estudio, se extirparon tejidos adiposos de color blanco, depósitos de grasa epididimaria o paramétricos con técnicas idénticas a las descritas previamente^{22} de los ratones inmediatamente después del sacrificio. Los tejidos se lavaron en solución salina fisiológica fría, se transfirieron y se pesaron. Para los análisis lipogénicos ex vivo, se utilizaron las porciones de los tejidos adiposos sin vasos sanguíneos.

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Análisis de lipasa sensible a Hormonas (HSL)

La actividad de la lipasa sensible a hormonas (HSL) de adipocitos aislados se utilizó como modelo para evaluar el efecto lipolítico del péptido hGH 177-191 y análogos. En este análisis se utilizó trioleina-[C^{14}] como sustrato para la HSL. Se determinó la cantidad de ácido oleico-[C^{14}] hidrolizado y se utilizó como índice de actividad HSL.

Los adipocitos se prepararon de los depósitos de grasa epidimaria de ratas Zucker macho obesas (fa/fa) mediante digestión con colagenasa. Los depósitos de grasa (5 g) se cortaron finamente en pequeñas piezas (2-3 mm) y se colocaron en un vial de vidrio siliconizado que contenía 10 ml de medio de digestión. El medio de digestión contenía colagenasa microbiana (Tipo II) a una concentración de 1 mg/ml en tampón fosfato Krebs-Ringer (pH 7,4) a una dureza de Ca^{2+} media, con seralbúmina bovina al 2% (p/v) (Fracción V de BSA). Después de la digestión a 37ºC durante 1 hr en una atmósfera con 95% O_{2}/5% CO_{2}, los adipocitos se liberaron de cualquier pieza de tejido adiposo restante succionando suavemente la suspensión arriba y abajo con una pipeta de 5,0 ml con una apertura de la punta de 3 - 4 mm. Los adipocitos liberados del tejido se filtraron después a través de un tejido de nailon en un tubo de vidrio siliconizado y se lavaron dos veces con 6 ml de tampón de albúmina sin colágeno. Los adipocitos aislados se resuspendieron con 10 ml de tampón sin colágeno y la concentración de adipocitos se estimó contando una alícuota de un volumen predeterminado de células sobre un porta de microscopio. Esto produjo normalmente 10^{9} células/ml de adipocitos en tampón fosfato Krebs-Ringer (pH 7,4).

La actividad HSL se midió a 37ºC durante 1 hora en un volumen final de 200 \mul, que contenía 10 \mumoles de tampón fosfato (pH 7,0), 15 \mumoles de trioleína-[C^{14}] emulsionada, y 10^{8} células. El sustrato, trioleína-[C^{14}], se emulsionó con trioleína no marcada para proporcionar la emulsión final que contenía 15 \mumoles de trioleína y 375.000 cpm en 0,1 ml. Las diferentes concentraciones del péptido hGH 177-191 o de los análogos se añadieron para evaluar sus efectos sobre las actividades de HSL. La reacción se detuvo añadiendo 1 ml de la mezcla de extracción de ácido graso de cloroformo-metanol-benceno 2:2:4:1 que contenía 50 \mug de ácido oleico, seguido de la adición de 67 \mul de NaOH 0,5 N. Para extraer y aislar el ácido graso libre, las muestras se sometieron a vórtice durante 20 segundos y después se centrifugaron a 1.000 x g durante 5 minutos. Una porción de 200 \mul de la fase superior acuosa alcalina que contenía ácidos grasos se transfirió a viales de centelleo. La radiactividad [C^{14}] se midió mediante un contador de centelleo líquido. La suspensión celular restante se analizó en cuanto al contenido de proteína. La actividad HSL se expresó como U/mg proteína, donde la liberación de 1 nmol de ácido oleico por hora se definió como 1 U de actividad enzimática.

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Análisis de la Acetil-CoA Carboxilasa

La acetil-CoA carboxilasa cataliza la etapa crítica en la síntesis de ácidos grasos. Las actividades acetil-CoA carboxilasa de los adipocitos y hepatocitos aislados en presencia de péptido hGH 177-191 o análogos se midieron para la evaluación del efecto antilipogénico de los péptidos. La actividad acetil-CoA carboxilasa se determinó mediante la reacción de fijación de bicarbonato-[C^{14}] - la velocidad de incorporación de H[C^{14}]O_{3} dependiente de acetil-CoA a malonil-CoA-[C^{14}].

Los adipocitos se prepararon con el método descrito en el análisis HSL. Los hepatocitos se prepararon a partir de los hígados de ratas Wistar macho mediante digestión con colagenasa. El hígado se cortó finamente con tijeras y se transfirió a un matraz Erlenmeyer de 250 ml que contenía 30 ml de medio de digestión. El medio de digestión contenía colagenasa microbiana (Tipo IV) a una a concentración de 30 mg/ml en tampón fosfato de Krebs-Ringer sin calcio (pH 7,4) y glucosa (5 mM). Después de la digestión durante 15 minutos a 37ºC en una atmósfera con 95% O_{2}/5% CO_{2} los hepatocitos liberados del tejido se filtraron después a través de un tejido de nailon en un tubo de vidrio siliconizado y se lavaron dos veces con medio de digestión sin colágeno. Las células aisladas se resuspendieron en 45 ml de medio que contenía EDTA extra (0,45 mmoles), gelatina (0,7 ml), ácido 2-{[tris(hidroximetil)metil]amino}etanosulfónico (TES) (0,9 mmoles), y se gasificó con 95% O_{2}/5% CO_{2} antes de su uso.

Las células aisladas se preincubaron primero a 37ºC durante 30 minutos en una mezcla que contenía tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), citrato de potasio 10 mM, MgCl_{2} 10 mM, ditiotreitol (DTT) 1 mM, y BSA (0,8 mg/ml). La reacción se inició después añadiendo una alícuota de las células preincubadas a una mezcla de análisis (volumen final, 500 \mul) que contenía tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), citrato de potasio 10 mM, MgCl_{2} 10 mM, ditiotreitol (DTT) 1 mM, BSA (0,8 mg/ml), ATP 3,75 mM, acetil-CoA 0,125 mM, y NaH[C^{14}]O_{3} (0,44 \muCi/\mumol) 12,5 mM. Después de la incubación a 37ºC durante 10 minutos, la reacción se terminó con 0,1 ml de HCl 6M. La mezcla de reacción se dejó estar después en un desecador de vacío durante 30 minutos para eliminar el NaH[C^{14}]O_{3} que no había reaccionado y seguido de centrifugación a 1500 g durante 10 minutos para eliminar la materia insoluble. Se recogió una alícuota de 0,5 ml del sobrenadante y se transfirió a viales de centelleo. La radiactividad [C^{14}] se midió con un contador de centelleo líquido. La suspensión celular restante se analizó en cuanto al contenido de proteína. La actividad específica de la enzima se expresó como mU/g de peso seco celular, donde 1 U de acetil-CoA carboxilasa se definió como aquella cantidad que catalizaba la carboxilación de 1 \mumol de acetil-CoA por minuto.

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Análisis de la actividad lipolítica

La acción lipolítica de hGH 177-191 y análogos sobre los tejidos adiposos aislados se demostró mediante la liberación de glicerol y ácidos grasos libres (FFA) en el medio durante la incubación a 37ºC.

Los tejidos adiposos se retiraron de los animales y se fraccionaron en segmentos de aproximadamente 200 mg cada uno. Después los tejidos se pre-incubaron en viales de 25 ml que contenían 2 ml de tampón bicarbonato Krebs-Ringer (KRB), BSA desengrasada al 4% y glucosa 5,5 mM en una atmósfera de carbógeno (95% O_{2}/5% CO_{2}) a 37ºC durante 1 hora. Los tejidos se transfirieron después a otros viales con medio de nueva aportación y la incubación se inició añadiendo péptido hGH 177-191 o análogos a los viales. Las mezclas se incubaron después a 37ºC durante 90 minutos. Después de la incubación, los tejidos se retiraron y se analizaron las alícuotas (200 \mul) de las muestras retiradas del medio en cuanto a los contenidos de glicerol o ácido graso libre (FFA) mediante análisis enzimático (glicerol quinasa) o espectrometría colorimétrica (cobre-colorante). El NADH o color producido se verificó después mediante la absorción a 340 nm y 610 nm, respectivamente.

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Análisis de Oxidación de Ácidos Grasos Libres

El efecto de hGH 177-191 o análogos sobre la oxidación de ácidos grasos libres (FFA) en los tejidos adiposos se evalúa mediante la medición del O_{2}-[C^{14}] convertido del ácido palmítico-C^{14}. El O_{2}-[C^{14}], un producto final de la oxidación de FFA, se atrapó mediante hidróxido de hiamina y se midió mediante un contador de centelleo líquido. La velocidad de oxidación de FFA se determinó después mediante la radiactividad [C^{14}].

Los tejidos adiposos retirados de los animales de laboratorio se fraccionaron en segmentos de aproximadamente 200 mg cada uno. Los tejidos en viales de 25 ml que contenían 2 ml de tampón fosfato Krebs-Ringer (KRP), y seralbúmina bovina desengrasada al 2% (BSA) se pre-incubaron a 37ºC durante 30 minutos en una atmósfera de carbógeno (95% O_{2}/5% CO_{2}). Después los tejidos se transfirieron a matraces Konte con medio de incubación de nueva aportación con palmitato-[C^{14}] de sodio 0,15 mM (actividad específica final [C^{14}], 0,20 \muCi/\mumol) y péptido hGH 177-191 o análogos (1 - 1.000 nM). Se colocó un rollo de papel de filtro en un pocillo dentro de un matraz y después el matraz se selló con un tapón con septo de caucho. La incubación a 37ºC se prolongó durante 1 hora en una atmósfera de carbógeno y después se finalizó inyectando 250 \mul de H_{2}SO_{4} 4,5 M con una aguja a través del septo de caucho al medio de un matraz y se inyectaron 250 \mul de hidróxido de hiamina en el rollo de papel de filtro en el pocillo central. Los matraces se incubaron durante 1 hora adicional para completar la absorción de O_{2}-[C^{14}] mediante el hidróxido de hiamina. Los rollos de papel de filtro se retiraron después y se transfirieron a viales de centelleo. La radiactividad [C^{14}] se midió con un contador de centelleo líquido. Se calculó la velocidad de oxidación de ácido palmítico-[C^{14}] a O_{2}-[C^{14}] y se expresó como \mumol/g de tejido/hr.

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Análisis de la actividad Lipogénica

La velocidad de incorporación de glucosa-[C^{14}] exógena a los lípidos totales en tejido adiposo se midió como el índice de actividad anti-lipogénica de hGH 177-191.

Los tejidos adiposos se fraccionaron en segmentos de aproximadamente 200 mg cada uno y después se colocaron en tampón bicarbonato Krebs-Ringer (KRB) (pH 7,4) que contenía BSA desengrasada al 2%, y glucosa (0,1 mg/ml) y se gasificaron con 95% O_{2} - 5% CO_{2} a 37ºC. Después de 1 hr de preincubación, los tejidos se transfirieron a otros 2 ml de medio de nueva aportación que contenía glucosa-[C^{14}] (actividad específica final 0,05 \muCi/\mumol), y 0,3 \muM de hGH 177-191 en presencia o ausencia de insulina (0,1 mU/ml) para una incubación adicional de 90 min (las condiciones de antes). Después se retiraron los tejidos, se lavaron cuidadosamente con tampón KRB y los lípidos se extrajeron con 5 ml de cloroformo/metanol (2:1, v/v). La solución de extracción se lavó con 2 ml de MeOH-H_{2}O que contenía MgCl_{2} al 0,1%. Se recogió una alícuota de 2,5 ml de la solución de extracción lavada y se transfirió a viales de centelleo. La radiactividad [C^{14}] se midió con un contador de centelleo líquido. Las velocidades de la síntesis de lípidos totales se expresaron como \mumol de glucosa-[C^{14}] incorporados a lípido/g de tejido/hr.

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Análisis de la liberación de diacilglicerol (DAG)

El diacilglicerol liberado del tejido adiposo aislado o de adipocitos se cuantificó utilizando un análisis radioenzimático, empleando DAG quinasa de E coli y condiciones micelares mixtas definidas para solubilizar el DAG y permitir su conversión cuantitativa en ácido fosfatídico-[P^{33}] en presencia de \gamma-ATP-[P^{33}]. Después de varias etapas de extracción para eliminar el \gamma-ATP-[P^{33}]- que no había reaccionado, se logró la separación del ácido fosfatídico-[P^{33}] con el uso de minicolumnas Am-Prep^{TM} de 1 ml.

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Análisis estadístico

Se utilizó el test de la t de Student para analizar los resultados. Todos los datos se expresan como la media \pm ETM. Los valores de P <0,05 se aceptan como estadísticamente significativos.

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Resultados

El tratamiento crónico de los ratones y ratas obesos con hGH 177-191 sintética y análogos se evaluó mediante las mediciones de diversos parámetros incluyendo la ganancia de peso corporal cumulativa y el consumo diario de alimentos. Durante el período de tratamiento, se observó una clara reducción de la ganancia de peso corporal cumulativa en los animales tanto macho como hembra tratados con hGH 177-191 cuando se comparó con el control apropiado (Figuras 1A, 1B). Cuando los datos analizados y expresados como ganancia de peso corporal, los animales macho tratados redujeron su ganancia de peso corporal de 0,22 \pm 0,03 a 0,16 \pm 0,04 g/día y los animales hembra de 0,30 \pm 0,02 a 0,22 \pm 0,04 g/día. Las ganancias de peso corporal diarias medias de los animales tanto macho como hembra se mostraron aproximadamente 27% inferiores que las de los grupos de control apropiados. No obstante, no se observó una diferencia significativa en el consumo diario medio de alimento entre los 4 grupos (Figuras 2A, 2B). También se observaron resultados positivos similares con la administración oral diaria a 500 \mug/kg/día. Estas acciones anti-obesidad de diferentes análogos, como se representa mediante el Núm. de Ref. 9403 (Figura 11A) se observaron en ratones obesos. Los análogos sintéticos controlan la ganancia de peso corporal sin afectar al apetito de los animales tratados (Figura 11B). También se encontró una reducción similar de la ganancia de peso corporal en ratas Zucker obesas (fa/fa) durante el tratamiento con hGH 177-191 vía inyección intraperitoneal diaria o implante intradérmico de un gránulo de liberación lenta (Figuras 3A, 3B). El consumo de alimento de las ratas Zucker tratadas permaneció inalterado a lo largo del período de tratamiento (Figuras 4A, 4B). Estos datos demostraron claramente que el tratamiento crónico con el péptido hGH 177-191 redujo la ganancia de peso corporal sin afectar al consumo de alimento.

Como se indicó mediante las mediciones de los depósitos de grasa epididimarios y paramétricos, los ratones tratados redujeron significativamente sus pesos de tejido adiposo hasta el 20% en los machos y 12% en las hembras en comparación con los controles del mismo sexo (Tabla 1). La lipogénesis está sujeta al aporte de metabolitos precursores tales como glucosa y acetato. El efecto de hGH 177-191 o de los análogos se determinó por consiguiente midiendo la incorporación de glucosa-[C^{14}] a lípidos en tejidos adiposos aislados. El péptido hGH 177-191 y análogos (Tabla 5) redujeron la actividad lipogénica in vitro más del 25% en comparación con el control en tejidos aislados de ratas Zucker obesas. El descenso de la lipogénesis en tejido adiposo aislado de ratones tratados con hGH 177-191 fue evidente (Figuras 5A, 5B). La actividad lipogénica en el tejido se redujo de 2,80 \pm 0,33 a 2,33 \pm 0,21 pmoles/mg de tejido/min en ratones macho y de 3,36 \pm 0,13 a 2,99 \pm 0,21 pmoles/mg de tejido/min en ratones hembra. Se encontró que la actividad lipolítica en tejidos adiposos de animales obesos tratados con hGH 177-191 aumentaba significativamente en ambos sexos (Figuras 6A, 6B). Estos resultados concuerdan con la reducción de la masa de tejido adiposo y la ganancia de peso corporal cumulativa observada previamente.

La Tabla 2 describe el efecto del tratamiento con hGH 177-191 sobre los perfiles de los niveles de circulación de triglicéridos y colesterol. El colesterol total en plasma se redujo significativamente de 4,44 \pm 0,56 a 3,52 \pm 0,39 mmol/l en los animales macho pero los niveles de colesterol en plasma en los animales hembra tratados fueron sólo ligeramente inferiores a los de control. Por otra parte hGH 177-191 no tuvo influencia sobre los niveles en plasma trigliceridos en ambos sexos. En presencia de hGH 177-191 y de diferentes análogos, aumentaron la oxidación de ácidos grasos (Figura 7) y la liberación de glicerol (Tabla 4) en tejido adiposos aislados de animales obesos. Esto concuerda con el aumento de actividad lipolítica de los tejidos adiposos tratados con hGH 177-191. Todas estas acciones in vivo e in vitro sobre el metabolismo de lípidos mediante hGH 177-191 y análogos sintéticos parecen ser resultado de la estimulación de la liberación del mensajero celular diacilglicerol (Figura 8) que a su vez modula la enzima lipolítica clave lipasa sensible a hormonas (Figura 9) y las enzimas acetil-CoA carboxilasas lipogénicas (Figuras 10A, 10B) en órganos diana.

Las Tablas 6 y 7 muestran la actividad antilipogénica y lipolítica in vitro de hGH 177-191 y dos análogos representativos (Núms. de Ref. 9604 y 9605) en tejido adiposo humano.

La Tabla 8 muestras resultados lipolíticos positivos similares en tejido adiposo porcino. Estos resultados apoyan la expectativa de que hGH 177-191 y las variantes peptídicas del mismo que se muestran efectivos en una especie de mamífero tengan eficacia en todos los mamíferos. Puesto que las secuencias correspondientes de mamíferos no humanos son efectivamente variantes peptídicas de la secuencia humana, también se espera por consiguiente que las secuencias correspondientes sean eficaces en otros mamíferos incluyendo seres humanos.

La Figura 12 muestra los resultados de la ganancia de peso cumulativa para el análogo Núm. de Ref. 9604 y 9605, mostrando una excepcional eficacia del Núm. de Ref. 9604 en particular. Este resultado in vivo concuerda con el aumento de actividad in vitro del Núm. de Ref. 9604 y 9605 en comparación con hGH 177-191 (Núm. de Ref. 9401) mostrado en las Tablas 6, 7 y 8.

La Figura 13 muestra el resultado de la administración oral a largo plazo del análogo Núm. de Ref. 9604 a 500 \mug/kg diarios mediante gavage oral a ratones ob/ob.

Los resultados del análisis in vivo e in vitro revelan que los análogos peptídicos no cíclicos son generalmente inactivos. (los Núms. de Ref. 9402, 9411, 9611 y 9617 son no-cíclicos). La inactividad también resulta de la sustitución de la alanina de las posiciones 178, 183 y 186, conservándose la actividad para todas las otras sustituciones de alanina sometidas a ensayo (excepto en 182 y 189 que conducen a no-ciclación) incluyendo una con dos sustituciones de d-Alanina (Núm. de Ref. 9501). El Núm. de Ref. 9606, con Arg remplazada por Lys en la posición 178, también conserva la actividad, como lo hace el Núm. de Ref. 9407 con Arg (183) remplazada por Lys, y el Núm. de Ref. 9408 que tiene adicionalmente un enlace amida entre Lys (183) y Glu (186).

La inactividad de los péptidos que tienen sustituciones de alanina en las posiciones 183 y 186 concuerda con la importancia de la interacción de un puente salino establecido entre cargas opuestas en Arg (183) y Glu (186) en hGH 177-191. El mantenimiento de la actividad con Núm. de Ref. 9408 (con un enlace amida entre Lys (183) y Glu (186)) y con el Núm. de Ref. 9407 (donde Arg (183) se reemplaza por Lys(183) cargada positivamente similar) concuerda con la necesidad de establecer un enlace, ya sea covalente o puente salino, entre las posiciones 183 y 186.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Efecto del péptido hGH 177-191 sintético sobre el peso corporal y la masa de tejido adiposo de ratones obesos al cabo de 18 días de tratamiento crónico. A los animales se les administró una inyección i.p. diaria de hGH 177-191 (200 \mug/kg peso corporal) o un volumen equivalente de solución salina como control. Todos los datos representan la media \pm ETM de 6 animales (*p<0,1; **p<0,05).

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TABLA 2 Efecto de hGH 177-191 sintético sobre los niveles de triglicéridos en plasma y el colesterol total en ratones obesos al cabo de 18 días de tratamiento crónico. Las muestras de sangre se recogieron de las puntas cortadas de las colas de los animales anestesiados. Los datos representan la media \pm ETM de 6 animales (*p<0,05)

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TABLA 3 Ratones C57BL/6J (ob/ob) hembra de 26 semanas de edad se dividieron al azar en dos grupos (Número de muestra = 6 en cada grupo). A los ratones se les administró una inyección intraperitoneal (i.p.) diaria del análogo con el Núm. de Ref. 9403 (500 \mug/kg peso corporal) o solución salina durante 18 días. Al cabo de 18 días, se les administró a todos los animales solución salina durante otros 18 días

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TABLA 4 Efecto In vitro de los análogos peptídicos sobre la liberación de glicerol durante la lipolisis. Los tejidos adiposos se aislaron de ratas Zucker macho obesas (fa/fa) (12-14 semanas de edad) y se incubaron con diferentes concentraciones de péptido o solución salina. Cada grupo de ensayo contiene 6 muestras

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TABLA 5 Efecto In vitro de los análogos peptídicos sobre la inhibición de la lipogénesis. Los tejidos adiposos aislados de ratas Zucker macho obesas (fa/fa) (12-14 semanas de edad) se incubaron con péptido (0,3 \muM) en tampón KRB que contenía insulina exógena (0,1 mU/ml). La velocidad de incorporación de glucosa-[C^{14}] a lípido-[C^{14}] (nmol/g de tejido/hr) se midió como la actividad lipogénica de los tejidos adiposos. Cada grupo de ensayo contiene 6 determinaciones

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TABLA 6 Actividad antilipogénica en Tejido adiposo Abdominal Humano

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TABLA 7 Actividad Lipolítica en Tejido adiposo Subcutáneo Humano

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TABLA 8 Actividad lipolítica en Tejido adiposo Porcino

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Referencias

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<120> Tratamiento de la Obesidad

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<160> 32

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: lineal o cíclica

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<400> 1

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\sa{Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe}

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<210> 2

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (1)

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<223> resto en forma desaminada (H), o que tiene un grupo acetilo (CH3-CO) u otro grupo acilo.

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: lineal o cíclica

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<400> 2

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\sa{Xaa Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe}

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<210> 3

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: lineal o cíclica

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<221> MOD_RES

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<222> (16)

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<223> -CONH2 o grupo alquilamida

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<400> 3

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\sa{Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe Xaa}

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<210> 4

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: lineal

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<221> MOD_RES

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<222> (6)

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<223> Cys-acetamidometilo

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<221> MOD_RES

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<222> (13)

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<223> Cys-acetamidometilo

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<400> 4

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\sa{Leu Arg Ile Val Gln Xaa Arg Ser Val Glu Gly Ser Xaa Gly Phe}

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<210> 5

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cíclica

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<400> 5

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\sa{Leu Arg Lys Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe}

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<210> 6

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cíclica

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<221> MOD_RES

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<222> (15)

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<223> Phe-CONH2

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<400> 6

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\sa{Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Xaa}

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<210> 7

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cíclica

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<221> MOD_RES

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<222> (1)

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<223> CH3-CO-HN-Leu

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<400> 7

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\sa{Xaa Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe}

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<210> 8

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<211> 15

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<212> PRT

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cíclica

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<400> 8

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\sa{Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe}

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<210> 9

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<211> 15

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<212> PRT

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cíclica

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<400> 9

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\sa{Leu Arg Ile Val Gln Cys Lys Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe}

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<210> 10

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial:bicíclica

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<220>

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<221> SITE

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<222> (7)..(10)

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<223> enlace amida

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<400> 10

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\sa{Leu Arg Ile Val Gln Cys Lys Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe}

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<210> 11

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<211> 15

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cíclica

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> H-Leu

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: lineal

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cys(SH)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cys(SH)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Ile Val Gln Xaa Arg Ser Val Glu Gly Ser Xaa Gly Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cíclica

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> D-Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> D-Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Xaa Ser Cys Xaa Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cíclica

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Penicilamina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Penicilamina

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Ile Val Gln Xaa Arg Ser Val Glu Gly Ser Xaa Gly Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cíclica

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cíclica

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Ala Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cíclica

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cíclica

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cíclica

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cíclica

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Lys Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cíclica

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cíclica

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Ala Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cíclica

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Ile Ala Gln Cys Lys Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cíclica

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Ile Val Ala Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: lineal

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Ile Val Gln Ala Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cíclica

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ala Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cíclica

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Ala Glu Gly Ser Cys Gly Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cíclica

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Ala Gly Ser Cys Gly Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cíclica

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Ala Ser Cys Gly Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cíclica

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ala Cys Gly Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: lineal

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: cíclica

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Lys Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly}

\sac{Phe}

Claims (5)

1. Un péptido o una sal de adición de ácido orgánico o inorgánico del mismo cuyo péptido comprende un análogo de la secuencia carboxi terminal de una hormona del crecimiento, donde el péptido tiene la secuencia de aminoácidos:

Tyr-Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe

o un disulfuro cíclico del mismo.

2. Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de la obesidad en un animal, que comprende una cantidad efectiva de un péptido según la reivindicación 1, junto con uno o más portadores y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables.

3. El uso de un péptido según la reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento para tratar la obesidad en un animal.

4. El uso según la reivindicación 3, donde el animal es un ser humano.

5. El uso según la reivindicación 3 o la reivindicación 4, donde el medicamento es para la administración oral.