CN1275132A - 肥胖症的治疗 - Google Patents

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Abstract

用于治疗动物如人肥胖症的方法,包括给予动物有效量的肽,该肽包含生长激素羧基端序列类似物,特别是含有氨基酸残基177—191的人生长激素羧基端序列类似物。还公开了用于肥胖症治疗的药物组合物。

Description

肥胖症的治疗
发明领域
本发明涉及动物肥胖症的治疗。尽管，应理解的是本发明还扩展到非人哺乳动物肥胖症的治疗，例如，用于改善食物生产中所用的农业动物的肉类质量，本发明特别地涉及人肥胖症的治疗。
发明背景
已充分认识到人生长激素(hGH)在人出生后生长中的重要作用。由于缺乏详细的分子研究，这种激素对脂类和糖类代谢的调节的影响不太清楚。
充分证实的是hGH的主要形式是分子量为22,000道尔顿(22-KD)的球状蛋白质，为由191个氨基酸残基组成的单链，通过2个二硫键以羧基端残基182和189之间的小环折叠。最近，晶体学研究也表明hGH分子含有左手螺旋状的、紧密排列的螺旋束中的4个反平行的α-螺旋1。一般认为，在hGH分子中存在负责激素的特异代谢作用的不连续功能结构域这样的概念。已证明氨基端是负责hGH分子的胰岛素样作用的功能结构域2，3。
重组DNA技术为人生长激素的大规模商业生产打通了道路，而且重组的hGH表现出具有等同的生物学效能和药物代谢动力学特征4，5。目前这种多功能激素的供应不再限制人和动物中实验性治疗的类型和数目。已确定hGH用于治疗儿童和成年人身材矮小的用途6。也已报道了hGH在女性不孕中的治疗效果7，8。用hGH治疗人肥胖症遇到多种问题。证据表明，此多功能激素经常通过分子中的多种生物活性结构域在体内发挥副作用9，10。
GH调节脂类代谢由Raben和Hollenberg于1959年首次描述11。激素在脂类代谢中的调节作用随后得到用GH-缺乏的和GH-治疗的人12， 13和猪的身体组合物研究支持14，15。Gertner的发现提示，hGH通过一系列已知的“GH-脂肪循环”的相互作用与脂肪组织分布相关。然而，揭示这些生物化学和生理学变化的分子事件大部分不清楚。体内GH对于脂肪和其它组织的代谢作用是多种多样且复杂的，表面上包括至少两部分，早期的胰岛素样效应，随后是晚些的更显著的抗胰岛素效应17。后一效应的结果可包括脂解的刺激作用和脂肪生成的抑制作用。hGH的抗脂肪生成效应已由脂肪细胞中葡萄糖转运蛋白GLUT4表达下降18、脂肪组织中乙酰-CoA羧化酶活性抑制19，20、和分离的细胞和组织中葡萄糖掺入脂类减少21，22的证据所证实。
鉴于完整hGH的多功能作用和完整激素在临床应用中遇到的问题，已进行了导致本发明的工作来研究是否能合成保留所需的生物活性而缺少不需要的副作用的hGH衍生物。
用合成的激素片段进行的结构-功能研究已揭示，hGH分子的羧基末端似乎为用于脂类代谢调节的激素的功能结构域20，23，而且已表明具有基于羧基端区域序列的合成肽降低了实验室肥胖动物模型的体重增加和脂肪组织量。
1994年11月15日的美国专利申请系列号08/340389的全部内容，包括说明书、权利要求书和附图，在此全文引用作为参考。
发明概述
本发明提供了一种包括生长激素的羧基端序列类似物的肽。此肽可包括人生长激素或非人哺乳动物种的生长激素的羧基端序列的类似物。如上述的，生长激素的羧基端序列含有生物活性脂类代谢结构域。在本发明的一个实施方案中，此肽包括含有氨基酸残基177-191的人生长激素的羧基端序列的类似物，或者非人哺乳动物生长激素的相应序列的类似物。类似物可通过对人生长激素(或非人哺乳动物种的生长激素)的天然羧基端序列进行氨基酸插入、删除或替代或者化学修饰而获得。
另一方面，本发明提供用于治疗肥胖症的方法，包括给予病人有效量的如上面所述的含有生长激素的羧基端序列类似物的肽。此治疗可施用于任何动物，包括人。
本发明还提供用于治疗肥胖症的药物组合物，其包含有效量的上述生长激素的羧基端序列类似物的肽，以及一种或多种药学上可接受的载体和/或稀释剂。
又一方面，本发明提供含有如上述生长激素羧基端序列类似物的肽的用途，其用于动物肥胖症治疗的药物组合物的生产。优选的实施方案描述
根据本发明的一方面，在此提供用于治疗动物肥胖症的方法，包括给予动物有效量的含有生长激素羧基端序列类似物的肽。
尽管本发明也扩展到非人哺乳动物的治疗，优选地，动物是人。还优选地，此肽包括含有氨基酸残基177-191的人生长激素的(下文中称为hGH 177-191)羧基端序列类似物。另外，此肽可包括其它非人哺乳动物种的生长激素，如牛、猪、羊、马、猫或犬生长激素的羧基端序列类似物，相当于hGH 177-191肽。
如整个说明书中所用的，术语“肥胖症”用于包括动物体重过度和脂肪组织量过度，并且相应地，述及的肥胖症的治疗包括肥胖动物体重增加的下降和脂肪组织量的降低。
任何肥胖症治疗的期望结果是体重、尤其是身体脂肪组织量的下降。身体脂肪组织量的下降直接受两种生物化学过程-脂肪生成(脂肪产生)和脂解(脂肪减少)调节，并且一般理解，这些生物化学过程由关键的代谢酶，特别是脂肪减少关键酶(激素敏感脂酶)和脂肪产生关键酶(乙酰-CoA羧化酶)调控。
本发明人已证明hGH 177-191对于刺激脂肪减少关键酶、激素敏感脂酶和抑制脂肪产生关键酶乙酰-CoA羧化酶有效。这进一步得到根据体外和体内代谢终产物所测定的结果的支持，其表明在hGH 177-191存在情况下，脂肪利用加速而脂肪产生减少。另外，已经明确了这些分子相互作用的机制是细胞第二信使二酰甘油产生活化的结果。
当然，应知晓本发明扩展到比生长激素特定序列177-191更长的氨基酸序列类似物的应用，例如人生长激素序列172-191或者其它非人哺乳动物种的生长激素的相应序列的类似物。
生物科学中已熟知种间氨基酸序列相符合的概念，并且通过对比可相比的序列(包括如果必需的理论缺失)来匹配同功或同构氨基酸，从而使同源性最大化。下面应用标准单个字母符号将公开的所选哺乳动物的生长激素的C末端区域的相应序列制成表格26。
GH种                     序列
位置             170    180    190
人              FRKDMDKVETFLRIVQCR.SVEGSCGF
人的变体        FRKDMDKVETFLRIVQCR.SVEGSCGF
人CS            FRKDMDKVETFLRMVQCR.SVEGSCGF
猴子，猕猴      FRKDMDKIETFLRIVQCR.SVEGSCGF
大鼠            FKKDLHKAETYLRVMKCRRFAESSCAF
小鼠            FKKDLHKAETYLRVMKCRRFVESSCAF
仓鼠            FKKDLHKAEIYLRVMKCRRFVESSCAF
鲸，鳍          FKKDLHKAETYLRVMKCRRFVESSCAF
鲸，sei         FKKDLHKAETYLRVMKCRRFVESSCAF
狐狸、狗、猫    FKKDLHKAETYLRVMKCRRFVESSCAF
水貂            FKKDLHKAETYLRVMKCRRFVESSCAF
牛              FRKDLHKTETYLRVMKCRRFGEASCAF
绵羊            FRKDLHKTETYLRVMKCRRFGEASCAF
山羊            FRKDLHKTETYLRVMKCRRFGEASCAF
猪              FKKDLHKAETYLRVMKCRRFVESSCAF
羊驼            FKKDLHKAETYLRVMKCRRFVESSCAF
马              FKKDLHKAETYLRVMKCRRFVESSCAF
大象            FKKDLHKAETYLRVMKCRRFVESSCAF
祖先哺乳动物    FKKDLHKAETYLRVMKCRRFVESSCAF
本发明扩展到天然的人生长激素或其它动物种的生长激素的羧基端序列类似物的肽的用途，以及来自天然或合成(包括重组的)来源的肽的用途，只要得到的肽保留了此处描述的天然羧基端序列的生物学活性，即减少肥胖动物的体重增加和脂肪组织量的能力。尤其是，这些类似物可表现出可能由二硫键导致的环状构型。
本发明的类似物可来自天然羧基端序列中的氨基酸延伸、插入、删除或置换，或者其化学修饰，或者在其氨基酸侧链之间导入环酰胺键。氨基酸插入类似物包括氨基端和/或羧基端融合，以及单个或多个(例如最多10个，优选地最多5个)氨基酸的序列内插入。尽管对所得产物合适的筛选也可能随机插入，但是插入的氨基酸序列类似物是其中一个或多个氨基酸残基导入蛋白质的预定位点的那些。删除类似物的特征是一个或多个(例如最多5个、优选最多3个)氨基酸从序列去除。置换氨基酸类似物是那些序列中至少一个氨基酸残基、优选一个或两个被二十个基本蛋白质氨基酸中的另外一个或者一个非蛋白氨基酸所取代的。天然羧基端序列的化学修饰包括氨基末端乙酰化，和/或羧基末端酰胺化，和/或天然羧基端序列的侧链环化。
可期望特殊地保留了与天然羧基端序列相同的构象、结构和带电特征的人生长激素(或其它动物种的生长激素)的天然羧基端序列类似物表现出与天然序列相同的或相似的生物学活性，尤其是减少肥胖动物的体重增加和脂肪组织量的能力。
尽管下文的详细描述具体涉及hGH 177-191的类似物，要理解的是本发明扩展到如上述的非人哺乳动物生长激素的相应肽的相似类似物。
含有天然的人生长激素的氨基酸残基177-191的肽(hGH 177-191)包括下面的序列(Ref No.9401)：
Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe
                                                         (SEQ ID NO：1)
这种天然肽可是环状二硫醚(disulfide)形式，并且可包括其有机或无机酸加成盐。
hGH 177-191肽类似物可通过在沿着天然序列的任意位置删除或插入一个或多个氨基酸残基，并保留如上述的抗肥胖症特性而获得。优选地，类似物是环状构型。
另外，hGH 177-191肽类似物可通过在沿着天然序列的任意位置置换一个或多个氨基酸残基而获得。
采用丙氨酸置换扫描和此处报道的其它方法的体外和体内活性筛选，揭示了在如上述的生物活性中重要的hGH 177-191中氨基酸之间的位置和关系。本发明的优选类似物包括hGH 177-191的肽类似物，其中
(i)位于hGH的位置182和189的氨基酸通过键连接以促成环状构象；和/或
(ii)位于hGH的位置183和186的氨基酸通过成盐(salt bridge)或共价键连接。
hGH的182和189氨基酸之间的键可以是二硫键，这种情况时hGH位置182和189的氨基酸可优选地是L-或D-Cys或Pen。
当在hGH位置183和186的氨基酸通过成盐连接时，这些氨基酸可优选地分别是(X和Y)或(Y和X)，其中：
X是带正电荷的氨基酸如L-或D-Arg、Lys或Orn，和
Y是带负电荷的氨基酸如L-或D-Asp或Glu。
当位于hGH位置183和186的氨基酸通过共价键连接时，该键可以是酰胺键，在这种情况时这些氨基酸可分别优选地是(X和Y)或者(Y和X)，其中：
X选自L-或D-Lys和Orn，和
Y选自L-或D-Asp和Glu。
在hGH位置178的氨基酸优选带正电荷的氨基酸，如L-或D-Arg、Lys或Orn。
类似物也可通过在氨基酸残基的一端或两端延伸天然hGH 177-191肽序列来获得，例如用一个或多个亲水氨基酸来增加在水溶液中的溶解度。这些类似物包括下列序列，优选环状二硫醚形式：
X1m-Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe-X2n
                                                        (SEQ ID NO：2)其中X1和X2各自选自L-或D-Arg、His和Lys，而且m和n各自是0、1、2或3，前提是至少m或n是1。[在整个说明书中，下划线的元素表示与天然的hGH 177-191序列不同，并且除非另有说明，在相当于182和189位置的氨基酸通过二硫键连接]。
一种不是用亲水氨基酸延伸的但是却表现出特殊的增强的抗肥胖症特性的延伸类似物如下(Ref No.9604)：
Tyr-Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe.
                                                        (SEQ ID NO：19)
类似物也可通过天然hGH 177-191肽序列的化学修饰获得。这些类似物包括序列：
Y1-Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe
                                                         (SEQ ID NO：3)
其中Y1选自脱氨(desamino)形式(H)、乙酰基(CH3CO-)和其它酰基基团；或序列：
Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe-Y2
                                                         (SEQ ID NO：4)
其中Y2选自-CONH2和烷酰胺基团。
通过天然hGH 177-191肽序列的氨基酸置换、延伸或化学修饰或者将环酰胺键导入氨基酸侧链之间获得的特异的hGH 177-191类似物如下，其表现出抗肥胖症特性：
Ref No.               结构                                                          SEQ ID NO：
9502          Leu Arg Ile Val Gln Pen Arg Ser Val Glu Gly Ser Pen Gly Phe               15
9405   CH3CO-Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe               8
9410        H-Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe               12
9404          Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe-CONH2        79407              Leu Arg Ile Val Gln Cys Lys Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe  10
Figure A9881008900161
9604          Tyr Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe  199605          Lys Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe  209618      Lys Lys Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe  339607              Ala Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe  229606              Leu Lys Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe  219608              Leu Arg Ala Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe  239403              Leu Arg Lys Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe  69609              Leu Arg Ile Ala Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe  249610              Leu Arg Ile Val Ala Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe  259612              Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ala Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe  279613              Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Ala Glu Gly Ser Cys Gly Phe  289615              Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Ala Ser Cys Gly Phe  309616              Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ala Cys Gly Phe  319602              Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Ala Phe  179501          Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu D-Ala Ser Cys D-Ala Phe  149601              Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Ala  16其中所用的氨基酸残基缩写符合标准的肽命名Gly＝甘氨酸；  Ile＝异亮氨酸；Glu＝谷氨酸；  Phe＝苯丙氨酸；Cys＝半胱氨酸；Arg＝精氨酸；Gln＝谷氨酰胺；Leu＝亮氨酸；Ser＝丝氨酸；  Val＝缬氨酸；Lys＝赖氨酸；  Ala＝丙氨酸；Asp＝天冬氨酸；His＝组氨酸；Orn＝鸟氨酸；  Tyr＝酪氨酸；Pen＝青霉胺(β，β′-二甲基-半胱氨酸)。
除非作为D-绝对构型指出，除甘氨酸以外的所有氨基酸都是L-绝对构型。上面的所有的肽上都适当地在Cys(182)和Cys(189)或Pen(182)和Pen(189)之间有环状二硫键。
适当地，上面描述的类似物可包含其有机或无机酸加成盐。
此处所用的术语“有效量”意思是足够达到治疗动物肥胖所期望的效果的肽的量，但不是大到引起严重的副作用或不良反应的量。
另一方面，本发明提供含有如上述的生长激素的羧基端类似物的肽的用途，其用在动物肥胖症治疗，或用于动物肥胖症治疗的药物组合物生产中。
又一方面，本发明提供用于动物肥胖症治疗的药物组合物，包含有效量的带有如上述生长激素的羧基端序列类似物的肽，以及一种或多种药学上可接受的载体和/或稀释剂。
当以对特殊病例合适的量施用时，作为本发明这一方面的药物组合物的活性成分的肽在治疗动物肥胖症中表现出有利的治疗活性。例如，可给予每天每千克体重约0.5μg-约20mg。可调节剂量方案以提供最佳的预防或治疗效果。例如，一次或多次分开的剂量可每天、每周、每月或以其它合适的时间间隔给药，或者根据临床形势的紧急状态所指示的按比例减少剂量。
可以任何便利的方式如通过口服、肠胃外的(包括腹膜内、静脉内、皮下、肌肉内和髓内注射)、鼻内、皮内或栓剂途径或植入(如应用缓释装置)施用活性成分。为方便给药，优选口服给药，然而肠胃外给药也很方便。根据给药途径，活性成分可能需要包被到保护该成分免受可能使该成分失活的酶、酸和其它自然条件作用的材料中。例如，成分的低亲脂性使其在胃肠道内被能切割肽键的酶所破坏，且在胃内被酸水解所破坏。为了以肠胃外给药方法之外的方法施用组合物，活性成分可用防止其失活的材料包被或与其一起施用。
也可以在甘油、液体聚乙二醇、和/或其混合物以及在油中制备的分散体形式施用活性成分。在贮存和应用的通常条件下，这些制备物通常含有预防微生物生长的防腐剂。
适于注射应用的药物剂型包括无菌水溶液(当为水可溶的时)或分散体，以及用于无菌注射溶液或分散体的即用即配制备物的无菌粉末。所有情况下，该剂型必须是无菌的，并且必须是可便于注射的液体。在生产和贮存的条件下其必须是稳定的，并且必须在抗微生物(如细菌和真菌)污染作用的条件下保存。载体可以是溶剂或分散体介质，含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物以及植物油。合适的流动性可通过例如应用包衣(如卵磷脂)、维持就分散体所需的颗粒大小以及使用表面活性剂来维持。多种抗细菌和抗真菌试剂如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、thiomorosal等可防止微生物的作用。许多情况下，包含等渗试剂如蔗糖或氯化钠是优选的。可通过组合物中延缓吸收试剂的使用引起可注射的组合物延缓吸收。
将合适的溶剂中所需量的活性成分与多种上面所列举的其它成分结合，如需要随后过滤除菌，制备无菌的可注射的溶液。一般地，分散体的制备是通过将无菌活性成分掺入含有基本分散体介质和所需的上面列举的那些其它成分的无菌载体。就用于制备无菌可注射的溶液的无菌粉末而言，制备的优选方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从前面其无菌过滤的溶液获得活性成分以及任何添加的所需成分的粉末。
当按上面所描述的恰当地保护活性成分时，组合物可口服给药，例如与隋性稀释剂或可同化的可食载体一起，或者可将其包入硬或软的外壳明胶胶囊中，或者可压缩成片剂，或者可直接与饮食食物结合。对于口服给药，活性成分可与赋形剂结合，并且以可吞服的片剂、含片、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、糖米纸囊剂等剂型应用。这些组合物和制备物可含有重量比至少0.01％的以及更优选地重量比至少0.1-1％的活性成分。当然，组合物和制备物的百分比可有所变化，并且可方便地是单位重量的约5％-约80％。药物组合物中活性成分的量可以获得合适的给药剂量。例如，可制备根据本发明的优选的组合物或制备物以使口服剂量单位形式含有约0.5μg-200mg的以及更优选的10μg-20mg的活性成分。
片剂、锭剂、丸剂、胶囊等也可包含下面的成分：粘合剂如西黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂如磷酸氢二钙；崩解剂如玉米淀粉、马铃薯淀粉、褐藻酸等；润滑剂如硬脂酸镁；以及可加入甜味剂如蔗糖、乳糖或糖精；或者香味剂如胡椒薄荷、冬青油或樱桃香料。当剂量单位形式是胶囊时，除了上述类型的物质外，可含有液体载体。多种其它物质可作为包被出现或者用来修饰剂量单位的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可用紫胶、蔗糖或两者包被。糖浆或酏剂可含有活性化合物，蔗糖作为糖味剂、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯作为防腐剂、染料和香料如樱桃或桔子香料。当然，用于制备任何剂量单位形式的任何物质应该是药物纯的，并且在所用的剂量内基本无毒。另外，活性成分可掺入持续释放制备物和制剂中。
如此处所用的，药学上可接受的载体和稀释剂包括任一和所有的溶剂、分散介质、水溶液、包被、抗细菌和抗真菌试剂、等渗和吸收延迟试剂等。本领域熟知用于药学上活性物质的这些介质和试剂的应用，它的描述见于，举例如Remington′s制药科学，第18版，Mack出版公司，Pennsylvania，美国。除外任何与活性成分不相容的传统介质或试剂，也构思了其在本发明的药物组合物中的用途。补充的活性成分也可结合到组合物中。
将组合物按方便给药和剂量一致的剂量单位形式制成制剂有特殊的优点。如此处所用的剂量单位形式指的是作为单位剂量适合于所治疗的人受试者的物理分散单位；每单位含有经计算产生期望治疗效果的预定量的活性成分，其还结合了所需的药学上的载体和/或稀释剂。用于本发明的新的剂量单位形式的详细说明的确定是根据并直接取决于(a)活性成分的独特特征和要达到的特殊治疗效果，以及(b)本领域中配成用于肥胖症治疗的这种活性成分固有的限制。
在整个说明书和随后的权利要求书中，除非上下文中需要其它说明，单词“包含”或其变体如“包含”应理解为用来指包括陈述的整体或整体集团，而不是排除任何其它整体或整体集团。
从下面的实施例和以本发明的举例说明方式而不是限制的方式包括的附图看，本发明的更多的细节会显而易见。
附图简述
图中：
图1A和1B表示在18天的治疗期间，hGH 177-191肽对雄性(1A)和雌性(1B)C57BL/6J(ob/ob)小鼠累积的体重增加的影响。每天给动物腹膜内注射0.1ml的盐水或hGH 177-191(200μg/kg体重。每个点代表6只动物的均值±SEM。
图2A和2B表示用hGH 177-191治疗的C57BL/6J(ob/ob)小鼠在18天治疗期间的平均每天食物消耗量(g/小鼠/天)。4组动物的治疗如图1A和1B中所描述的。每个点表示6只动物的均值±SEM。整个时间未观察到组间有显著性。
图3A和图3B表明在20或27天的治疗期间，hGH 177-191肽对14-15周龄的雄性Zucker肥胖(fa/fa)大鼠的体重增加的影响。每天给动物腹膜内注射盐水或肽(500μg/kg体重)(3A)，或者在动物的下腹部皮内植入缓释片剂(500μg/天/kg体重)。对照组以同样方式植入安慰剂片剂。每个点代表6只动物的均值±SEM。
图4A和4B表示用hGH 177-191肽治疗的Zucker肥胖大鼠在整个治疗期间的平均每天的食物消耗量(g/大鼠/天)。4组动物的治疗如图3A和3B中所描述的。每个点代表6只动物的均值±SEM。整个时间内未观察到实验组与合适的对照之间有显著性。
图5A和5B表示用hGH 177-191治疗18天后对C57BL/6J(ob/ob)雄性小鼠(5A)和雌性小鼠(5B)的脂肪组织脂肪生成的离体影响。资料显示[C14]-脂类合成速率，并且以掺入脂类的[C14]-葡萄糖表示(pmol/mg组织/分钟)。数值是来自每组6只动物的12次测定的均值±SEM。hGH 177-191治疗组和盐水对照组之间的差异有统计学显著性。
图6A和6B表示用hGH 177-191治疗18天后对C57BL/6J(ob/ob)雄性小鼠(6A)和雌性小鼠(6B)的脂肪组织脂肪生成的离体影响。资料显示从脂肪组织释放甘油的速率(pmol/mg组织/分钟)。数值是来自每组6只动物的12次测定的均值±SEM。hGH 177-191治疗组和盐水对照组之间的差异有统计学显著性。
图7说明用测定从[14C]-棕榈酸产生[14C]O2的速率表示的C57BL/6J(ob/ob)小鼠分离的脂肪组织中hGH 177-191对脂肪酸氧化的体外影响。[C14]-棕榈酸氧化以μmol/g组织/小时表示。
图8说明在40分钟温育时间内hGH 177-191对正常大鼠从分离的脂肪细胞释放二酰甘油的体外影响。二酰甘油的定量采用放射酶学测定，并且结果以基础水平上增高％表示。
图9表示根据从[C14]-三油酸甘油酯的水解[C14]-油酸的量测定的hGH 177-191对雄性Zucker肥胖(fa/fa)大鼠分离的脂肪细胞中激素敏感的脂酶活性的体外影响。酶用U/mg蛋白质来表示，其中每小时释放1纳摩尔油酸认为是1单位酶活性。
图10A和10B表示根据[C14]-碳酸氢盐固定反应测定的hGH 177-191对分离的脂肪细胞(10A)和正常大鼠肝细胞(10B)的乙酰-CoA羧化酶的体外影响，以mU/g细胞干重表示，其中规定1单位的乙酰-CoA羧化酶为每分钟1微摩尔乙酰-CoA羧化。
图11A表明在18天的治疗期间，类似物Ref.No.9403(SEQ ID NO：6)对26周龄的C57BL/6J(ob/ob)小鼠体重增加的影响。每天给动物腹膜内注射盐水(作为对照)或肽类似物(500μg/kg体重)。每个点代表6只动物的均值±SEM。
图11B表示用类似物RefNo.9403(SEQ ID NO：6)治疗期间26周龄C57BL/6J(ob/ob)小鼠的平均每日食物消耗量(克/小鼠/天)。两组动物处理如图11A中所描述。每个点代表6只动物的均值±SEM。整个时间内未观察到试验组和对照组之间有显著性。
图12表示用类似物RefNos.9604(SEQ ID NO：19)和9605(SEQ IDNO：20)长期治疗对16周龄C57BL/6J(ob/ob)小鼠体重增加的影响。
图13表示类似物RefNo.9604长期口服施用对ob/ob小鼠的影响。
                      实施例
                    材料与方法动物及处理
采用肥胖C57BL/6J(ob/ob)小鼠和肥胖Zucker(fa/fa)大鼠证明合成的hGH 177-191和类似物的生物学效应。同年龄同性别的动物随机分为两组，每笼6只并且在澳大利亚，Clayton，Monash大学生物化学和分子生物学系的动物房中于25℃恒定室温、正常12小时白天/黑夜周期下饲养。给动物预定量的动物饲料(Clark king，Melbourne，澳大利亚)随意食水饲养并允许在整个过程中随意饮水。每天给动物腹膜内(i.p)注射0.1ml的合成肽(200-500μg/kg体重)或者等体积的生理盐水(0.9％氯化钠)，注射合适的天数。用1ml一次性结核菌素注射器上的30G×1/2″(0.31×13mm)针进行腹膜内注射，注射部位在动物的左下腹部。为研究hGH 177-191和类似物受控递送的效果，在麻醉下将直径3mm的缓释肽丸植入Zucker大鼠腹部区皮内。监测指定时间期间的体重和食物摄取。肽的合成
采用标准9-芴甲氧羰基(Fmoc)固相技术制备本发明的肽。固相合成，例如可应用α-氨基保护的氨基酸从肽的C端开始。合适的起始物质可通过如将所需α-氨基酸加到Wang树脂(4-烷氧苄基醇树脂)或Rink酰胺树脂(与氨基甲基树脂连接的2，4-二甲氧基-4′-[羧甲基氧基]-二苯甲基胺)或者PAM树脂(4-羟甲苯基-乙酸树脂)上来制备。树脂可从Auspep Pty.Ltd.，Parkville，Victoria，澳大利亚商业获得。
固相制备本发明的化合物中，被保护的氨基酸借助于偶联剂与树脂连接。在起初连接之后，于室温下在有机溶剂中用哌啶去除α-氨基保护基团。去除α-氨基保护基团之后，剩下的被保护氨基酸按期望的顺序逐步连接。在二氯甲烷(DCM)-N，N二甲基甲酰胺(DMF)混合物中一般应用四倍过量的每种被保护的氨基酸与合适的羧基基团激活剂如二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)反应。
在希望的氨基酸序列完成之后，通过用能从树脂剪切肽的试剂如三氟乙酸(TFA)或三氟甲磺酸(TFMSA)从树脂支持物上剪切下肽以及所有侧链保护基团，除了Cys(Acm)。当使用Wang树脂时，TFA处理引起游离肽酸形成。当使用Rink酰胺树脂时，TFA处理引起游离肽酰胺形成。当使用PAM树脂时，TFMSA处理引起游离肽酸形成。目标肽可能以需要合成后修饰的环状二硫醚形式存在。
提供下面的实施例仅仅用于进一步说明的目的而不是用来对公开的发明的限制。A.含有天然人生长激素氨基酸残基177-191的十五肽(被称为hGH(177-191))(Ref No.9401)的合成：
Leu1-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe15(环状二硫醚)
在制备此十五肽中应用了下面的步骤：步骤1.将Wang树脂(0.625g，0.5mmol)置于10ml反应容器内。向反应容器内加入DCM(4ml)。剧烈搅拌2分钟洗涤Wang树脂。然后从反应容器中沥干DCM溶液。重复洗涤两次。步骤2.在反应容器中混合2.4ml NMP-DCM(1∶5，v/v)中的Fmoc-L-苯丙氨酸(Fmoc-Phe，0.388g，1.0mmol)和1.0ml NMP中的DIC(0.135g，1.0mmol)10分钟。将0.6ml DMF中的4-二甲氨基吡啶(DMAP，0.074g，0.06mmol)加到此混合物中。在室温下使溶液中的反应持续68分钟。然后沥干溶液，用NMP(4ml×3)和DCM(4ml×3)彻底洗涤树脂。在真空中过夜干燥Fmoc-Phe-Wang树脂复合物以收获0.781g物质。应用Fmoc-吡啶加合物分光光度测定法测定的氨基酸与树脂结合水平为0.80mmol/g树脂。步骤3.将Fmoc-Phe-Wang树脂(0.263g，0.20mmol)置于10ml反应容器中。加入DMF(8ml)洗涤并且搅拌2分钟使树脂膨胀，然后将溶液排出反应容器。步骤4.将25％哌啶/DMF溶液(4ml)加入反应容器。得到的混合物搅拌2分钟。从反应器排出溶液。重复此脱保护过程一次，但延长搅拌时间(18分钟)。从反应容器排出溶液。步骤5.将DMF(8ml)加入反应容器。得到的溶液搅拌2分钟。从反应容器的树脂中排出溶液。重复此洗涤过程两次。将DMF(2ml)加到反应容器中以保持树脂膨胀。步骤6.将Fmoc-甘氨酸(Fmoc-Gly，0.238g，0.8mmol)、HOBt(108mg；0.8mmol)和DIC(128μl；0.8mmol)加到含有2ml DMF的10ml试管中。搅拌混合物10分钟以起动氨基酸活化。然后将溶液加到最初置于反应容器中的树脂中。搅拌得到的混合物1.5小时或者直到获得阴性茚三酮试验结果。然后从反应容器排出溶液。步骤7.将DMF(8ml)加到反应容器中。剧烈搅拌得到的溶液2分钟。然后从反应容器排出溶液。此洗涤过程重复两次。
然后应用下面的氨基酸顺序重复步骤4到7：
                Fmoc-Cys(Acm)
                Fmoc-Ser(t-Bu)
                Fmoc-Gly
                Fmoc-Glu(O-tBu)
                Fmoc-Val
                Fmoc-Ser(t-Bu)
                Fmoc-Arg(Pmc)
                Fmoc-Cys(Acm)
                Fmoc-Gln
                Fmoc-Val
                Fmoc-Ile
                Fmoc-Arg(Pmc)
                Fmoc-Leu
目的肽-树脂的合成完成之后，将含有肽-树脂的反应容器置于干燥器中真空下干燥过夜。肽-树脂产量为0.635g。从反应容器中移出干燥的肽-树脂，置于含有磁力搅拌棒的50ml圆底烧瓶中。用TFA从树脂剪切肽，方法如下：将含有0.75g苯酚、0.5ml H2O、0.5ml茴香硫醚和0.25ml二硫代乙烷的清除剂溶液加到圆底烧瓶中。搅拌得到的混合物5分钟。在保持剧烈搅拌的同时将10ml TFA逐滴加到烧瓶中。在室温下搅拌得到的混合物2.5小时。
将此混合物通过中等孔隙度滤器的、多孔玻璃漏斗过滤。应用真空将TFA-肽溶液吸到含有200mL冷乙醚的另外一个500ml圆底烧瓶中。4℃过夜使肽在乙醚溶液中沉淀，然后通过微细孔隙度滤器的多孔玻璃漏斗过滤混合物收集肽。用冷乙醚(10ml×3)洗涤滤器上的肽沉淀物以去除清除剂。然后用25％含水乙酸溶解肽沉淀物，冻干以获得粗肽(约400mg干重、纯度～80％)。
用反相高效液相层析(RP-HPLC)纯化粗肽。在室温下在制备型21.2×250mm Supelcosil PLC-18(十八烷基，C18)柱(120埃孔大小，12μm颗粒大小，190m2/g表面积；Supelco，Bellefonte，PA，美国)上以5.0ml/分钟的流速进行纯化。采用线性梯度程序，其中溶剂A是含有0.1％TFA的水，溶液B是乙腈-水(50/50：体积/体积，含有0.1％TFA)。梯度变化是80分钟内从20到100％。记录分离曲线，用Perkin-Elmer LC-100积分仪分析。洗脱所需的肽成分，用Pharmacia Model FRAC-100自动分部收集器(Uppsala，瑞典)收集。合并相同成分的级分并冻干。在-20℃冷冻保存纯化的肽(275mg干重，纯度＞98％)Cys(Acm)6，13-十五肽。
为了肽的二硫键环化，利用80％含水乙酸中的碘氧化作用去除半胱氨酸保护基团Acm，同时装备分子内二硫键。在50ml 80％含水乙酸中溶解Cys(Acm)6，13-十五肽(275mg、0.155毫摩尔)。剧烈搅拌下将此溶液缓慢加到含有100ml 80％含水乙酸中的碘(378mg，1.4毫摩尔)的250ml圆底烧瓶中。使反应在室温下持续2小时，通过向得到的溶液中加入抗坏血酸(维生素C)来终止。然后用旋转蒸发减少液体体积，采用冷冻干燥回收肽。然后按线性肽纯化中所描述的用RP-HPLC纯化环化的肽。冷冻干燥后，收获到纯度为96％的165mg的环十五肽。合成的总产量约为46％。B.十五肽(Ref No.9404)合成：
Leu1-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe15-CONH2
(环状二硫醚)
应用实施例A中所述的方法。修饰包括省去Wang树脂，用Rink酰胺树脂替代之。C.十五肽(Ref No.9410)合成：
H-Leu1-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe15
(环状二硫醚)
应用实施例A中所述的方法。修饰包括Fmoc-Leu置换以及用4-甲基-五羧酸，引起脱氨十五肽合成。D.十五肽(Ref No.9405)合成：
CH3CO-Leu1-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe15
(环状二硫醚)
应用实施例A中所述的方法。在目的去封闭肽-树脂合成完成之后，加入5ml的DMF中的20％乙酸酐。5分钟后，加入70μl(0.4mmol)的二异丙基乙胺(DIEA)以中和产生的质子。在室温下进行肽的乙酰化30分钟。用DMF洗肽树脂两次，用DCM洗两次，则N-乙酰肽树脂可用于如实施例A中所示TFA剪切。E.二环-十五肽(Ref No.9408)合成：
                  |        |
Leu1-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Lys-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe15
(环状二硫醚)
应用下面的方法制备此十五肽：步骤1.将Boc-L-苯丙氨酸-PAM树脂(0.400g，0.2mmol；Auspep，Melbourne，澳大利亚；Cat#5290F，Batch#494123)置于10ml反应容器中。用DCM(4ml)剧烈搅拌2分钟洗涤树脂。然后将DCM溶液排出反应容器。重复洗涤一次。步骤2.将50％TFA/DCM溶液(4ml)加入反应容器中。搅拌得到的混合物2分钟。然后将溶液排出反应容器。以18分钟的搅拌时间再次重复去保护过程。从反应容器中排出溶液将DCM(4ml)加到反应容器中并使内容物放置2分钟。再次将溶液从树脂排出。重复两次洗涤步骤。将10％DIEA/DMF(4ml)加入反应容器得到的混合物放置1分钟并象以前一样去除溶液。重复一次去保护方法。将DMF(4ml)加到反应容器中的树脂复合物上。得到的溶液放置2分钟，随后从容器中去除溶液。洗涤步骤重复4次。最后，将DMF(2ml)加到反应容器中以保持树脂鼓起。步骤3.将Fmoc-甘氨酸(Fmoc-Gly，0.238g，0.8mmol)、HOBt(108mg；0.8mmol)和DIC(128μl；0.8mmol)加到含有2ml DMF的10ml试管中。搅拌混合物10分钟以激活氨基酸。然后将溶液加到反应容器中的树脂上。搅拌得到的混合物1.5小时或者直到获得阴性茚三酮试验。然后将溶液排出反应容器。步骤4.将DMF(8ml)加到反应容器中。剧烈搅拌所得溶液2分钟，随后去除上清液。重复洗涤过程两次。步骤5.将25％哌啶/DMF溶液(4ml)加到反应容器中。搅拌得到的溶液2分钟。将溶液排出反应容器。搅拌18分钟重复去保护步骤一次。将溶液排出反应容器。步骤6.将DMF(8ml)加到反应容器中。搅拌得到的溶液2分钟。将溶液从反应容器树脂中排出。重复此洗涤过程两次。向反应容器中加入2mlDMF以保持树脂膨胀。
然后以下面的氨基酸顺序重复步骤3到6：
          Fmoc-Cys(Acm)
          Fmoc-Ser(Bzl)
          Fmoc-Gly
          Fmoc-Glu(O-tBu)
          Fmoc-Val
          Fmoc-Ser(Bzl)步骤7.重复步骤3和4使Fmoc-Lys(Boc)和Ser在位置184连接。连接完成之后，将含有肽-树脂的反应容器置于干燥器中真空下干燥过夜。然后将肽-树脂转移到10ml反应容器。将DCM(4ml)加到反应容器中。剧烈搅拌洗涤树脂2分钟。然后将DCM溶液从反应容器排出。重复此洗涤一次。步骤8.利用步骤2分别从赖氨酸和谷氨酸侧链去除Boc基团和t-Bu基团。步骤9.向反应容器中加入1ml的1.5％DIEA/DMF。将苯并三唑-1-基-氧-三-(二甲氨基)磷鎓六氟磷酸盐(BOP)(400mg；0.90mmol)、HOBt(122mg，0.90mmol)和DIEA(400μl，2.25mmol)溶解于3.4ml的1.5％DIEA/DMF中，然后加到反应容器中。在从反应容器中去除上清液之前，搅拌得到的混合物3小时或者直到获得阴性茚三酮试验。然后将DMF(8ml)加到反应容器中。剧烈搅拌得到的溶液2分钟。然后将溶液排出反应容器。重复洗涤过程两次。步骤10.重复步骤5到6以从肽-树脂中赖氨酸残基的α-氨基基团去除Fmoc基团。然后按下面的氨基酸顺序重复步骤3到6：
          Fmoc-Cys(Acm)
          Fmoc-Gln
          Fmoc-Val
          Fmoc-Ile
          Fmoc-Arg(Pmc)
          Fmoc-Leu
在目的肽树脂合成完成之后，重复步骤4以从Leu去除Fmoc基团，得到去封闭的肽树脂。将含有肽树脂的反应容器置于干燥器中在真空下干燥过夜。收获到604mg肽树脂。将干燥的肽树脂从反应容器出移出，置于含有磁力搅拌棒的25ml圆底烧瓶中。采用三氟甲磺酸(TFMSA)/TFA剪切方案从PAM树脂剪切下肽：将含有500μl茴香硫醚和250μl二硫代乙烷的清除剂溶液加到烧瓶中。室温下搅拌得到的混合物10分钟。维持剧烈搅拌的同时将5ml TFA逐滴加入烧瓶中。室温下搅拌得到的混合物15分钟。将烧瓶置于冰浴中，然后在维持剧烈搅拌的同时缓慢加入500ml TFMSA。在冰浴中搅拌得到的混合物10分钟，在室温下再搅拌15分钟。向烧瓶中加入冷乙醚(50ml)以终止反应，沉淀剪切下的肽。将混合物通过微细孔隙度多孔玻璃漏斗过滤，收集肽并用冷乙醚(10mL×3)洗涤除去清除剂。用30ml 50％乙腈/水溶解肽沉淀物，随后加入5ml冷的10％NH4HCO3以中和溶液。冷冻干燥后可获得粗肽(519mg，纯度～69％)。
环状二硫醚形式肽的制备和纯终产物的纯化见实施例A中所示。F.十六肽(Ref No.9604)合成
Tyr-Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe(环状二硫醚)
应用实施例A中所述的步骤，经修改，添加应用Fmoc-Tyr(t-Bu)的重复的步骤4-7。累积体重增加和食物消耗
根据每三天间隔测定体重和笼中剩余的未食用食物来测定累积体重增加和食物消耗量。将动物置于覆盖着的小室中以最低限度地减少在称量期间的活动。从最初的食物中减去笼中剩余的未食用的食物量得到食物消耗量的资料。血浆甘油三酯和总胆固醇测定
hGH 177-191最后一次剂量施用12小时后用戊巴比妥钠(80mg/kg体重)麻醉动物。给予麻醉剂45分钟后从麻醉动物的尾静脉收集血样本。2000xg离心5分钟后，从样本中移出血浆并用于代谢物测定。采用酶-分光光度法测定血浆中甘油三酯和总胆固醇。试剂是根据修饰的甘油磷酸氧化酶(GPO)-Trinder′s型颜色反应24或胆固醇氧化酶-4-氨基安替比林方法25。用包含自动移液器、离心分析器和记录分光光度计的CentrifiChem System 400(Union Carbide)进行所有测定。SeronormLipid(Nycomed Pharma Co.，Oslo，Norway)用作标准。脂肪组织重量测定：
在以前的GH-缺陷(lit/lit)小鼠附睾生长的研究中，建立了用于分离和测定完整的附睾脂肪垫的方法。本研究中，采用以前描述22的相同的技术在处死之后立即从小鼠切除白色脂肪组织，其可以是整个附睾的也可是子宫旁的脂肪垫。在冷的生理盐水中洗组织，吸干并称重。应用不含血管的脂肪组织部分用于离体脂肪生成测定。激素敏感脂酶(HSL)测定
利用分离的脂肪细胞的激素敏感脂酶(HSL)活性作为模型来评价hGH 177-191肽和类似物的脂解作用。测定中，用[C14]-三油酸甘油酯作为HSL的底物。测定水解的[C14]-油酸的量并用作HSL活性指数。
用胶原酶消化从雄性Zucker肥胖(fa/fa)大鼠的附睾脂肪垫制备脂肪细胞。将脂肪垫(5g)很细地切成小(2-3mm)块，置于含有10ml消化培养液的硅化玻璃小瓶中。消化培养液含有半Ca2+强度、2％(w/v)牛血清白蛋白(BSA组分V)的Krebs-Ringer磷酸盐缓冲液(pH7.4)中浓度为1mg/ml的微生物胶原酶(II型)。在95％O2/5％CO2的大气下、37℃消化1小时后，用尖端孔为3-4mm的5.0ml的移液尖轻轻上下吸打悬液，使脂肪细胞从所有剩下的脂肪组织块释放出来。然后将从组织释放出的脂肪细胞通过尼龙薄绸过滤进入硅化玻璃试管，用6ml无胶原的白蛋白缓冲液洗涤两次。用10ml无胶原缓冲液重新悬浮分离的细胞，根据计数显微镜载物片上一部分预定体积的细胞估计脂肪细胞浓度。正常地在Krebs-Ringer磷酸盐缓冲液(pH7.4)中有约109个细胞/ml的脂肪细胞。
于37℃，在含有10微摩磷酸盐缓冲液(pH7.0)、15微摩尔乳化[C14]-三油酸甘油酯和108个细胞的200μl终体积中测定HSL活性1小时。用未标记的三油酸甘油酯预先乳化底物[C14]-三油酸甘油酯，以保证最终乳剂每0.1ml内含有三油酸甘油酯为15微摩尔且cpm为375,000。加入不同浓度的hGH 177-191肽或类似物以评价它们对HSL活性的影响。加入1ml含有50μg油酸的氯仿-甲醇-苯(2∶2∶4∶1)的脂肪酸提取混合物，然后加入67μl 0.5N NaOH，中止反应。为提取和分离游离脂肪酸，涡旋样本20秒钟并以1000xg离心5分钟。将含有脂肪酸的碱性上层水相的200μl部分转移到硅化小瓶中。用液闪计数器测定[C14]-放射活性。剩下的细胞悬液用于测定蛋白含量。HSL活性以U/mg蛋白质表示，其中规定每小时释放1纳摩尔油酸为1U的酶活性。乙酰-CoA羧化酶测定
乙酰-CoA羧化酶在脂肪酸合成中催化关键步骤。测定在hGH 177-191肽或类似物存在时分离的脂肪细胞和肝细胞的乙酰-CoA羧化酶活性，用于评价肽的抗脂肪生成效应。用[C14]-碳酸氢盐固定反应-乙酰测定乙酰-CoA羧化酶活性，其中乙酰CoA的掺入速度依赖H[14C]O3掺入[14C]-丙二酸单酰-CoA。
用HSL测定中描述的方法制备脂肪细胞。用胶原酶消化从雄性Wistar大鼠肝脏制备的肝细胞。用剪刀将肝脏切得很细，转移到250ml的含有30ml消化培养液的Erlenmeyer培养瓶中。消化培养液含有无钙Krebs-Ringer磷酸盐缓冲液(pH7.4)和葡萄糖(5mM)中的浓度为30mg/ml的微生物胶原酶(IV型)。在95％O2/5％CO2大气下、于37℃消化15分钟后，通过尼龙薄绸过滤从组织释放出来的肝细胞，使进入硅化玻璃管中，用新鲜无胶原消化培养液洗两次。将分离的细胞重新悬浮于45ml的含有补充的EDTA(0.45毫摩)、明胶(0.7ml)、2-{[三(羟甲基)甲基]氨基}乙磺酸(TES)(0.9毫摩)的培养基中，并在使用之前通95％O2/5％CO2气。
首先将分离的细胞在含有50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)、10mM枸橼酸钾、10mM MgCl2、1mM二硫苏糖醇(DTT)和BSA(0.8mg/ml)的混合物中于37℃下预温育30分钟。然后向含有50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)、10mM枸橼酸钾、10mM MgCl2、1mM二硫苏糖醇(DTT)、BSA(0.8mg/ml)、3.75mM ATP、0.125mM乙酰-CoA和12.5mM NaH[C14]O3(0.44μCi/μmol)的测定混合物(终体积500μl)中加入一部分温育的细胞以起动反应。37℃下温育10分钟后，用0.1ml 6M HCl终止反应。然后将反应混合物置于真空干燥器中30分钟以去除未反应的NaH[C14]O3，随后以1500g离心10分钟除去不溶物质。取0.5ml的上清液并移至闪烁瓶。用液闪计数器测定[C14]放射活性。剩下的细胞悬液用于蛋白质含量测定。酶的比活性以mU/g细胞干重表示，其中规定1U乙酰-CoA羧化酶为每分钟催化1微摩尔乙酰-CoA羧化的量。测定脂解活性
用37℃下温育期间甘油和游离脂肪酸(FFA)释放到培养基中来表明hGH 177-191和类似物对分离的脂肪组织的脂解作用。
从动物取下脂肪组织并切成每个约200mg的切片。然后在37℃、Carbogen(95％O2/5％CO2)空气下、含有2ml Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液、4％脱脂BSA和5.5mM葡萄糖的25ml小瓶中预温育所述组织1小时。然后将组织转移到含有新鲜培养液的其它小瓶中，向瓶中加入hGH177-191肽或类似物开始温育。混合物在37℃下温育90分钟。温育之后除去组织，将从培养液中取出的部分样本(200μl)用于测定甘油或游离脂肪酸(FFA)含量，采用酶测定法(甘油激酶)或者比色(铜染料)光谱测定法。然后分别根据340nm和610nm的吸收监测产生的NADH或颜色。测定游离脂肪酸的氧化
根据从C14-棕榈酸转化的[C14]O2的测定来评价hGH 177-191或类似物对脂肪组织中游离脂肪酸(FFA)的氧化作用。FFA氧化的终产物[C14]O2用氢氧化季铵盐捕获并用液闪计数器测定。然后根据放射活性确定FFA氧化速度。
将从实验室动物上取出的脂肪组织切成每个约200mg的切片。于37℃、在Carbogen空气(95％O2/5％CO2)下，含有2ml Krebs-Ringer磷酸盐(KRP)缓冲液和2％脱脂牛血清白蛋白(BSA)的25ml小瓶中预温育组织30分钟。然后将组织转移到含有0.15mM[C14]-棕榈酸钠(终[14C]比活性，0.20μCi/μmol)和hGH 177-191肽或类似物(1-1000nM)的新鲜温育培养液的Konte瓶内。将滤纸卷置于瓶内部孔中，然后用橡胶隔片瓶塞封瓶。在37℃、Carbogen空气下持续温育1小时并且然后用针通过橡胶隔片向培养瓶的培养液中注射250μl的4.5M H2SO4，向中央孔的滤纸卷注射250μl氢氧化季铵盐来中止温育。再温育培养瓶1小时以使[C14]O2完全被氢氧化季铵盐吸收。然后取出滤纸卷转移到闪烁瓶中。用液闪计数器测定[C14]放射活性。计算[C14]-棕榈酸氧化成[C14]O2的速率并以μmol/组织/小时表示。测定脂肪生成活性
测定脂肪组织中外源[C14]-葡萄糖掺入总脂的速率作为hGH 177-191抗脂肪生成活性指数。
将脂肪组织切成每个约200mg的切片，然后将其置于含有2％脱脂BSA和葡萄糖(0.1mg/ml)的Krebs-Ringer碳酸氢盐(KRB)缓冲液(pH7.4)中，在37℃下通95％O2-5％CO2气。1小时预温育之后，将组织转移到另外的2ml含有[C14]-葡萄糖(终比活性0.05μCi/μmol)和0.3μMhGH 177-191、存在或不存在胰岛素(0.1mU/ml)的新鲜培养液中继续温育90分钟(条件如上)。然后移出组织，用KRB缓冲液彻底洗涤，并用5ml的氯仿/甲醇(2∶1，体积/体积)提取脂类。用2ml含有0.1％MgCl2的MeOH-H2O溶液洗涤提取物溶液。取出2.5ml的一份洗涤过的提取溶液并将其移至闪烁瓶中。用液闪计数器测定[C14]放射活性。总脂类合成速率以掺入脂类/g组织/小时的μmol[C14]-葡萄糖表示。测定二酰甘油(DAG)释放
用大肠杆菌DAG激酶和用来溶解DAG的混合微团条件以允许其在[33P]-γ-ATP存在时定量转化成[33P]磷脂酸，采用放射酶学测定法定量从分离的脂肪组织或脂肪细胞释放的二酰甘油。许多用来去除未反应的[33P]-γ-ATP的提取步骤之后，应用1ml Am-PrepTM微型柱完成[33P]磷脂酸的分离。统计学分析
采用Student′st-检验分析结果。所有数据以均值±SEM表示。＜0.05的P值认为有统计学显著性。结果
根据大量包括累积体重增加和每天食物消耗量的参数的测定，评价用合成的hGH 177-191和类似物对肥胖小鼠和大鼠的长期治疗。治疗期间，观察到当与合适的对照组相比较时，用hGH 177-191治疗的雄性以及雌性动物累积体重增加明显下降(图1A，1B)。当分析数据并以每天体重增加表示时，治疗的雄性动物体重增加下降了0.22±0.03-0.16±0.04g/天，雌性动物下降了0.30±0.02-0.22±0.04g/天。雄性和雌性治疗动物的平均每天体重增加都表现出比合适的对照组低约27％。然而，未观察到4组的平均每天食物消耗量之间有明显差异(图2A、2B)。每天500μg/kg/天口服给药也观察到相似的阳性结果。肥胖小鼠中观察到以Ref.No.9403为代表的(图11A)不同类似物的种种抗肥胖症作用。合成类似物控制体重增加而不影响受治疗动物的食欲(图11B)。在经每天腹膜内注射或者皮内植入缓释片剂hGH 177-191治疗期间的Zucker肥胖(fa/fa)大鼠中也发现相似的体重增加下降(图3A，3B)。在整个治疗期间治疗的Zucker大鼠的食物消耗量无变化(图4A，4B)。这些数据清楚地表明，给予hGH 177-191肽的长期治疗降低了体重的增加而不影响食物消耗量。
如附睾和子宫旁脂肪垫的测量所表明的，与同性别的对照组相比，受治疗的雄性小鼠的脂肪组织明显降低达20％，雌性降低达12％(表1)。脂肪生成受前体代谢物如葡萄糖和乙酸的供应影响。因此通过测定分离的脂肪组织中[14C]-葡萄糖掺入脂类来测定hGH 177-191或类似物的作用。与对照肥胖Zucker大鼠的分离的脂肪组织相比，肽hGH 177-191和类似物(表5)使体外脂肪生成活性下降超过25％。从hGH 177-191治疗的小鼠分离的脂肪组织的脂肪生成下降是明显的(图5A，5B)。雄性小鼠组织脂肪生成活性下降为2.80±0.33-2.33±0.21pmol/mg组织/分钟，而雌性小鼠下降为3.36±0.13-2.99±0.21pmol/mg组织/分钟。发现两种性别的用hGH 177-191治疗的肥胖动物脂肪组织中的脂解活性都明显增高(图6A，6B)。这些结果与以前观察到的脂肪组织量和累积体重增加的减少一致。
表2描述了hGH 177-191治疗对甘油三酯和胆固醇循环水平曲线的影响。在雄性动物中血浆总胆固醇明显从4.44±0.56降至3.52±0.39mmol/l，而在受治疗的雌性动物中胆固醇血浆水平仅仅轻微低于对照动物的胆固醇水平。另一方面，hGH 177-191不影响两种性别动物的甘油三脂的血浆水平。在hGH 177-191和不同的类似物存在时，从肥胖动物分离出的脂肪组织中脂肪酸氧化(图7)和甘油的释放(表4)增强。这与给予hGH 177-191治疗的脂肪组织脂解活性增高相一致。所有这些合成的hGH 177-191和类似物对脂类代谢的体内和体外作用看起来是细胞信使二酰甘油(图8)释放的刺激的结果，其又反过来调节目标器官中关键的脂解酶激素敏感脂酶(图9)和脂肪生成酶乙酰-CoA羧化酶(图10A，10B)。
表6和7表示hGH 177-191和两种代表性的类似物(Ref Nos.9604和9605)对人脂肪组织的体外抗脂肪生成和脂解的活性。
表8表示对猪脂肪组织的相似的阳性脂解作用。这些结果支持如下论点的可能性，即：在一种哺乳动物种中表现有效的hGH 177-191和其肽的变体在所有哺乳动物中均具有功效。因为非人哺乳动物的相应序列是人序列的有效肽变体，因此也期望那些相应序列在其它哺乳动物包括人中是有效的。
图12表示类似物Ref No.9604和9605累积体重增加结果特别是Ref.No.9604的特殊功效。此体内结果与和表6、7和8中所示的hGH 177-191(RefNo.9401)相比，RefNo.9604和％05的增高的体外活性相一致。
图13表示通过口服管饲法给ob/ob小鼠每天500μg/kg的类似物RefNo.9604长期口服给药的结果。
体内和体外测定结果表明，非环状肽类似物一般是无活性的。(RefNos.9402、9411、9611和9617是非环状的)。无活性也可由位置178、183和186的丙氨酸置换产生，但对于包括一种带有两个D-丙氨酸置换(RefNo.9501)的所有其他受试丙氨酸置换(除了在位置182和189导致非环状的)活性得以保留。其中位置178的Arg被Lys置换的Ref.No.9606和Arg(183)被Lys置换的Ref No.9407以及另外在Lys(183)和Glu(186)之间具有酰胺键的RefNo.9408也保留了活性。
具有位置183和186的丙氨酸置换的肽的无活性与稳定hGH 177-191中Arg(183)和Glu(186)相反电荷之间成盐相互作用的重要性一致。RefNo.9408(Lys(183)和Glu(186)之间有酰胺键)以及RefNo.9407(Arg(183)被相似的带正电荷的Lys(183)置换)的活性的保持符合稳定位置183和186之间的键(共价键或是成盐)的需要。
                          表1
18天长期治疗后合成的hGH177-191肽对肥胖小鼠体重和脂肪组织量的影响。每天给动物腹膜内注射hGH177-191(200μg/kg体重)或等体积的盐水作为对照。所有数据表示6只动物的均值±SEM(*P＜0.1；**P＜0.05)
    项目                   雄性                   雌性
    对照组     治疗组     对照组     治疗组
最初体重(克)     47.5±3.1     48.6±2.0     46.7±3.6     48.2±3.4
最终体重(克)     51.4±3.0     51.5±2.3     52.1±3.2     52.2±2.9
体重增加(克)(a)     3.9±0.6     2.9±0.6*     5.4±0.4     4.0±0.6**
脂肪组织(克)(b)     3.18±0.43.     2.52±0.25**     3.67±0.54     3.26±0.25**
(a)认为最初体重和最终体重之间的差为体重增加。(b)完整的附睾或子宫旁脂肪垫是代表性的脂肪组织。
                          表2
18天长期治疗后合成的hGH177-191肽对肥胖小鼠甘油三酯和总胆固醇血浆水平的影响。从麻醉动物切开的尾尖部收集血样本。数据代表6只动物的均值±SEM(*P＜0.05)
    项目               雄性                雌性
    对照组     治疗组     对照组     治疗组
甘油三酯(mmol/l)   0.63±0.26   0.58±0.16   0.41±0.19   0.38±0.11
胆固醇(mmol/l)   4.44±0.56   3.52±0.39*   3.01±0.52   2.84±0.29
                              表3
将26周龄的雌性C57BL/6J(ob/ob)小鼠随机分为两组(样本数＝每组6只)。每天给小鼠腹膜内注射Ref No.9403(500μg/kg体重)类似物或盐水，注射18天。18天后，再给予所有动物盐水18天。
项目             治疗(0-18天)            治疗后(20-36天)
药物   Ref No：9403     盐水   Ref No：9403     盐水
最初体重(克)   54.74±4.96   51.50±2.61   54.70±4.15   54.08±2.77
最终体重(克)   54.42±4.66   53.72±2.46   56.70±4.45   56.14±2.42
体重增加(克)   -0.32±0.23   2.22±0.22   2.00±0.24   2.06±0.25
平均食物消耗量(克/小鼠/天)   4.82±0.22   4.88±0.29   5.03±0.13   5.03±0.14
血葡萄糖(mM)   6.2±0.8   5.8±0.9   6.0±1.0   5.7±0.07
甘油三酯(mM)   0.49±0.10   0.60±0.11   0.54±0.15   0.57±0.08
                               表4
在脂解过程中，肽类似物对甘油释放的体外影响。从雄性Zucker肥胖(fa/fa)大鼠(12-14周龄)分离脂肪组织并与不同浓度的肽或盐水温育。每个实验组含6个样本。
肽浓度(μm)                       甘油释放(μmol/克组织/小时)
                                类似物
  Ref No.9401   Ref No.9403   Ref No.9407   Ref No.9404
 0                                1.42±0.04
 0.1   1.82±0.02   1.80±0.03   1.83±0.11     1.75±0.12
 1.0   1.86±0.12   1.88±0.13   1.79±0.07     1.94±0.12
                                表5
肽类似物对脂肪生成抑制的体外影响。从雄性Zucker肥胖(fa/fa)大鼠(12-14周龄)分离的脂肪组织与肽(0.3μM)在含有外源胰岛素(0.1mU/ml)的KRB缓冲液中温育。测定[C14]-葡萄糖掺入[C14]-脂类的速率(nmol/g组织/小时)作为脂肪组织脂肪生成活性。每个实验组包括6次测定。
化合物           体外脂肪生成
Ref No.(描述)     SEQID No. Nmol/g组织/小时 对照组的％   活性
缓冲液对照     -     243±13     100   无活性
9401(hGH 177-191)     1     181±10     75   有活性
9402(Cys(Acm)在182&189)     5     222±9     91   无活性
9403(Lys在179)     6     167±28     69   有活性
9404(CONH2)     7     187±18     77   有活性
9405(CH3CO)     8     164±17     68   有活性
9406(Ala在183)     9     263±17     97   无活性
9407(Lys在183)     10     174±16     71   有活性
9408(Lys(183)-Glu(186)酰胺键)     11     173±16     71   有活性
9410(脱氨)     12     143±20     59   有活性
9411(Cys(SH)在182&189)     13     225±15     93   无活性
9501(D-Ala在187&190)     14     185±6     76   有活性
9502(Pen在182，189)     15     174±5     72   有活性
9601(Ala在191)     16     185±24     76   有活性
9602(Ala在190)     17     176±27     73   有活性
9603(Ala在178)     18     225±18     93   无活性
9604(Tyr延伸)     19     118±16     49   有活性
9605(Lys延伸)     20     184±41     76   有活性
9606(Lys在178)     21     187±19     77   有活性
9607(Ala在177)     22     198±12     82   有活性
9608(Ala在179)     23     173±12     71   有活性
9609(Ala在180)     24     188±13     78   有活性
9610(Ala在181)     25     192±14     79   有活性
9611(Ala在182)     26     224±19     93   无活性
9612(Ala在184)     27     191±20     79   有活性
9613(Ala在185)     28     189±16     78   有活性
9614(Ala在186)     29     233±13     96   无活性
9615(Ala在187)     30     183±17     76   有活性
9616(Ala在188)     31     203±19     84   有活性
9617(Ala在189)     32     223±16     92   无活性
9618(LysLys延伸)     33     188±19     77   有活性
表6人腹部脂肪组织中的抗脂肪生成活性
    14C掺入(平均DPM/mg组织/小时)
 对照(BSA+胰岛素0.1Mu/ml)     63±5
 hGH177-191 0.1μM     40±3
 RefNo9605 0.1μM     36±2
 RefNo9604 0.1μM     28±3
表7人皮下脂肪组织中的脂解活性
    释放的甘油(nmol/mg组织/小时)
 对照     480±80
 hGH177-191 0.5μM     1000±80
 Ref No9605 0.5μM     1100±80
 Ref No9604 0.5μM     1200±80
表8猪脂肪组织中的脂解活性
    释放的甘油(nmol/mg组织/小时)
 对照     300±8
 hGH 177-191 0.5μM     1300±160
 Ref No9605 0.5μM     1350±80
 Ref No9604 0.5μM     1600±20
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                     序列表(1)一般信息：(i)申请人：NG，Frank M.
         JIANG，Woel-Jia(ii)发明名称：肥胖症的治疗(iii)序列数：33(iv)联系地址：
(A)收件人：Metabolic Pharmaceuticals Ltd.
(B)街道：10 Wallace Avenue
(C)城市：Toorak
(D)州：Victoria
(E)国家：澳大利亚
(F)邮政编码：3142(v)计算机可读形式：
(A)介质类型：磁盘
(B)计算机：IBM PC兼容机
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatnetIn Release#1.0 Version#1.25(vi)当前申请信息：
(A)申请号：
(B)递交日：(vii)在先申请信息：
(A)申请号：PO9001
(B)递交日：1997年9月8日
(C)申请号：PP0398
(D)递交日：1997年11月13日(viii)代理机构/代理人信息：
(A)姓名：Davies Collison Cave
(B)注册号：
(C)文献/卷号：2093266(ix)通讯信息：
(A)电话：+613 9254 2777
(B)传真：+613 9254 2770(2)SEQ.ID.NO.1的信息：(i)序列特征：
(A)长度：15个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性或环状(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：hGH177-191
Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
1               5                   10                  15(2)SEQ.ID.NO.2的信息：(i)序列特征：
(A)长度：17个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性或环状(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：
X1m Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe X2n
1                5                   10                  15(2)SEQ.ID.NO.3的信息：(i)序列特征：
(A)长度：15个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性或环状(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：
Y1 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
    1               5                   10                  15(2)SEQ.ID.NO.4的信息：(i)序列特征：
(A)长度：15个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性或环状(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：
Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe  Y2
1               5                   10                  15(2)SEQ.ID.NO.5的信息：(i)序列特征：
(A)长度：15个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：在位置182和189带有Cys(Acm)的hGH177-191
   Leu Arg Ile Val Gln Cys(Acm) Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys(Acm) Gly
Phe
 1              5                        10                       15(2)SEQ.ID.NO.6的信息：(i)序列特征：
(A)长度：15个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：环状(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：在位置179为Lys的hGH177-191
Leu Arg Lys Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
1               5                   10                  15(2)SEQ.ID.NO.7的信息：(i)序列特征：
(A)长度：15个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：环状(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：用CONH2替代COOH的hGH177-191
Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe-CONH2
1                5                   10                  15(2)SEQ.ID.NO.8的信息：(i)序列特征：
(A)长度：15个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：环状(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：用CH3CO-NH替代NH2的hGH177-191
CH3CO-HN Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
          1               5                   10                  15(2)SEQ.ID.NO.9的信息：(i)序列特征：
(A)长度：15个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：环状(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：在位置183为Ala的hGH177-191
Leu Arg Ile Val Gln Cys Ala Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
1               5                   10                  15(2)SEQ.ID.NO.10的信息：(i)序列特征：
(A)长度：15个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：环状(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：在位置183为Lys的hGH177-191
Leu Arg Ile Val Gln Cys Lys Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
1               5                   10                  15(2)SEQ.ID.NO.11的信息：(i)序列特征：
(A)长度：15个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：双环(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：在位置183为Lys，在位置183和186之间为酰胺键的hGH177-191
                         |           |
Leu Arg Ile Val Gln Cys Lys Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
 1               5                   10                  15(2)SEQ.ID.NO.12的信息：(i)序列特征：
(A)长度：15个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：环状(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：用H替代NH2的hGH177-191
H  Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
   1             5                     10                  15(2)SEQ.ID.NO.13的信息：(i)序列特征：
(A)长度：15个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性  (ii)分子类型：肽(xi)序列描述：在位置182和189带有Cys(SH)的hGH177-191
Leu Arg Ile Val Gln Cys(SH) Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys(SH) Gly Phe
1               5                        10                      15(2)SEQ.ID.NO.14的信息：(i)序列特征：
(A)长度：15个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：环状(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：在位置187和190带有D-Ala的hGH177-191
Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu D-Ala Ser Cys D-Ala Phe
1               5                   10                      15(2)SEQ.ID.NO.15的信息：(i)序列特征：
(A)长度：15个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：环状(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：在位置182和189带有Pen的hGH177-191
Leu Arg Ile Val Gln Pen Arg Ser Val Glu Gly Ser Pen Gly Phe
1               5                   10                  15(2)SEQ.ID.NO.16的信息：(i)序列特征：
(A)长度：15个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：环状(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：在位置191带有Ala的hGH177-191
Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Ala
1               5                   10                  15(2)SEQ.ID.NO.17的信息：(i)序列特征：
(A)长度：15个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：环状(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：在位置190带有Ala的hGH177-191
Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Ala Phe
1               5                   10                  15(2)SEQ.ID.NO.18的信息：(i)序列特征：
(A)长度：15个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：环状(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：在位置178带有Ala的hGH177-191
Leu Ala Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
1               5                   10                  15(2)SEQ.ID.NO.19的信息：(i)序列特征：
(A)长度：16个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：环状(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：Tyr-hGH177-191
Tyr Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
1                5                   10                  15(2)SEQ.ID.NO.20的信息：(i)序列特征：
(A)长度：16个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：环状(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：Lys-hGH177-191
Lys Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
1                5                   10                  15(2)SEQ.ID.NO.21的信息：(i)序列特征：
(A)长度：15个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：环状(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：在位置178带有Lys的hGH177-191
Leu Lys Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
1               5                   10                  15(2)SEQ.ID.NO.22的信息：(i)序列特征：
(A)长度：15个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：环状(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：在位置177带有Ala的hGH177-191
Ala Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
1               5                   10                  15(2)SEQ.ID.NO.23的信息：(i)序列特征：
(A)长度：15个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：环状(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：在位置179带有Ala的hGH177-191
Leu Arg Ala Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
1               5                   10                  15(2)SEQ.ID.NO.24的信息：  (i)序列特征：
(A)长度：15个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：环状(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：在位置180带有Ala的hGH177-191
Leu Arg Ile Ala Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
1               5                   10                  15(2)SEQ.ID.NO.25的信息：(i)序列特征：
(A)长度：15个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：环状(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：在位置181带有Ala的hGH177-191
Leu Arg Ile Val Ala Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
1               5                   10                  15(2)SEQ.ID.NO.26的信息：(i)序列特征：
(A)长度：15个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：环状(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：在位置182带有Ala的hGH177-191
Leu Arg Ile Val Gln Ala Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
1               5                   10                  15(2)SEQ.ID.NO.27的信息：(i)序列特征：
(A)长度：15个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：环状(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：在位置184带有Ala的hGH177-191
Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ala Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
1               5                   10                  15(2)SEQ.ID.NO.28的信息：(i)序列特征：
(A)长度：15个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：环状(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：在位置185带有Ala的hGH177-191
Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Ala Glu Gly Ser Cys Gly Phe
1               5                   10                  15(2)SEQ.ID.NO.29的信息：(i)序列特征：
(A)长度：15个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：环状(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：在位置186带有Ala的hGH177-191
Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Ala Gly Ser Cys Gly Phe
1               5                   10                  15(2)SEQ.ID.NO.30的信息：(i)序列特征：
(A)长度：15个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：环状(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：在位置187带有Ala的hGH177-191
Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Ala Ser Cys Gly Phe
1               5                   10                  15(2)SEQ.ID.NO.31的信息：(i)序列特征：
(A)长度：15个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：环状(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：在位置188带有Ala的hGH177-191
Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ala Cys Gly Phe
1               5                   10                  15(2)SEQ.ID.NO.32的信息：(i)序列特征：
(A)长度：15个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：环状(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：在位置189带有Ala的hGH177-191
Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Ala Gly Phe
1               5                   10                  15(2)SEQ.ID.NO.33的信息：(i)序列特征：
(A)长度：17个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：环状(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：Lys-Lys-hGH177-191
Lys Lys Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu G1y Ser Cys Gly Phe
1               5                   10                   15

Claims (36)

1.一种包含生长激素的羧基端序列类似物的肽。
2.根据权利要求1的肽，其包含人生长激素的羧基端序列类似物。
3.根据权利要求1的肽，其包含非人哺乳动物生长激素羧基端序列类似物。
4.根据权利要求1的肽，其包括含有氨基酸残基177-191的人生长激素的羧基端序列类似物，
Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe，或者非人哺乳动物生长激素的相应序列，其环状二硫醚或其有机或无机酸加成盐。
5.根据权利要求1的肽，其是通过在含有氨基酸残基177-191的人生长激素天然羧基端序列内进行氨基酸延伸、插入、删除或置换、或者对其进行化学修饰、或者在其氨基酸侧链之间导入环状酰胺键获得的肽，或其环状二硫醚或其无机或有机酸加成盐。
6.根据权利要求5的肽，其中
(i)在hGH位置182及189的氨基酸以键连接以促成环状构象；和/或
(ii)在hGH位置183和186的氨基酸以成盐或共价键连接。
7.根据权利要求6的肽，其中在hGH位置182和189的氨基酸之间的键是二硫键。
8.根据权利要求6的肽，其中在hGH位置182和189的氨基酸选自L-Cys、D-Cys、L-Pen和D-Pen。
9.根据权利要求6的肽，其中在hGH位置183和186的氨基酸以成盐连接，并且分别是(X和Y)或(Y和X)，其中
X是带正电荷氨基酸，以及
Y是带负电荷氨基酸。
10.根据权利要求9的肽，其中X选自L-或D-Arg、Lys和Orn，Y选自L-或D-Asp和Glu。
11.根据权利要求6的肽，其中hGH位置183和186的氨基酸以酰胺共价键连接。
12.根据权利要求11的肽，其中在hGH位置183和186的氨基酸分别是(X和Y)或者(Y和X)，其中：
X选自L-或D-Lys和Orn，以及
Y选自L-或D-Asp和Glu。
13.根据权利要求5的肽，其是如下序列，或者其环状二硫醚或者其有机或无机酸加成盐：
X1m-Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe-X2n
其中X1和X2各自选自L-或D-Arg、His、Lys和Tyr，而且m和n各自是0、1、2或3，前提条件是至少m或n是1。
14.根据权利要求5的肽，其是如下序列，或者其环状二硫醚或者其有机或无机酸加成盐：
Y1-Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe
其中Y1选自脱氨形式(H)、乙酰基(CH3CO-)和其它的酰基基团。
15.根据权利要求5的肽，其是如下序列，或者其环状二硫醚或者其有机或无机酸加成盐：
Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe-Y2
其中Y2选自CONH2和烷酰胺基团。
16.根据权利要求5的肽，其选自如下序列，或者其有机或无机酸加成盐：
Ref No.                        结构
9502          Leu Arg Ile Val Gln Pen Arg Ser Val Glu Gly Ser Pen Gly Phe
9405   CH3CO-Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
9410            H-Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
9404              Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe-CONH2
9407              Leu Arg Ile Val Gln Cys Lys Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
9604          Tyr Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
9605          Lys Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
9618      Lys Lys Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
9607              Ala Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
9606              Leu Lys Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
9608              Leu Arg Ala Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
9403              Leu Arg Lvs Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
9609              Leu Arg Ile Ala Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
9610              Leu Arg Ile Val Ala Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
9612              Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ala Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
9613              Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Ala Glu Gly Ser Cys Gly Phe
9615              Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Ala Ser Cys Gly Phe
9616              Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ala Cys Gly Phe
9602              Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Ala Phe
9501              Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu D-Ala Ser Cys D-Ala Phe
9601              Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Ala其中所用的氨基酸残基缩写与标准的肽命名一致：Gly＝甘氨酸；  Ile＝异亮氨酸；
Glu＝谷氨酸；  Phe＝苯丙氨酸；
Cys＝半胱氨酸；Arg＝精氨酸；
Gln＝谷氨酰胺；Leu＝亮氨酸；
Ser＝丝氨酸；  Val＝缬氨酸；
Lys＝赖氨酸；  Ala＝丙氨酸；
Asp＝天冬氨酸；His＝组氨酸；
Orn＝鸟氨酸；  Tyr＝酪氨酸；
Pen＝青霉胺(β，β′-二甲基-半胱氨酸)。
其中除非作为D-纯对构型指出，除甘氨酸外的所有氨基酸都是L-绝对构型，并且此肽适当地在Cys(182)和Cys(189)或Pen(182)和Pen(189)之间有环状二硫键。
17.一种用于动物肥胖症治疗的方法，包括给予动物有效量的含有生长激素羧基端序列类似物的肽。
18.根据权利要求17的方法，其中动物是人。
19.根据权利要求17或权利要求18的方法，其中肽含有人生长激素羧基端序列类似物。
20.根据权利要求17或权利要求18的方法，其中肽含有非人哺乳动物生长激素羧基端序列类似物。
21.根据权利要求17或权利要求18的方法，其中肽包含带有氨基酸残基177-191
Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe，的人生长激素羧基酸类似物、或非人哺乳动物生长激素的相应序列，或者其环状二硫醚或者其有机或无机酸加成盐。
22.根据权利要求17或权利要求18的方法，其中类似物是通过对含有氨基酸残基177-191的人生长激素天然羧基端序列进行氨基酸延伸、插入、删除或置换，或者在氨基酸侧链之间导入环酰胺键或者进行化学修饰而获得的，或其环状二硫醚或其有机或无机酸加成盐。
23.根据权利要求22的方法，其中类似物包含这样的肽，其中：
(i)hGH位置182和189的氨基酸以键连接以促成环状构象；和/或
(ii)hGH位置183和186的氨基酸以成盐或共价键连接。
24.根据权利要求23的方法，其中在hGH位置182和189的氨基酸之间的键是二硫键。
25.根据权利要求23的方法，其中hGH位置182和189的氨基酸选自L-Cys、D-Cys、L-Pen和D-Pen。
26.根据权利要求23的方法，其中hGH位置183和186的氨基酸以成盐连接，并且分别是(X和Y)或者(Y和X)，其中：
X是带正电荷氨基酸，且
Y是带负电荷氨基酸。
27.根据权利要求26的方法，其中X选自L-或D-Arg、Lys和Orn，Y选自L-或D-Asp和Glu。
28.根据权利要求23的方法，其中hGH位置183和186的氨基酸以酰胺共价键连接。
29.根据权利要求28的方法，其中hGH位置183和186的氨基酸分别是(X和Y)或者(Y和X)，其中：
X选自L-或D-Lys和Orn，和
Y选自L-或D-Asp和Glu。
30.根据权利要求22的方法，其中类似物包含如下序列的肽，或者其环状二硫醚或者其有机和无机酸加成盐：
X1m-Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe-X2n
其中X1和X2各自选自L-或D-Arg、His、Lys和Tyr，m和n各自为0、1、2或3，前提条件是至少m或n是1。
31.根据权利要求22的方法，其中类似物包括如下序列的肽，或者其环状二硫醚或者其有机或无机酸加成盐：
Y1-Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe
其中Y1选自脱氨形式(H)、乙酰基(CH3CO-)和其它的酰基基团。
32.根据权利要求22的方法，其中类似物包括如下序列的肽，或者其环状二硫醚或者其有机或无机酸加成盐：
Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe-Y2其中Y2选自CONH2和烷酰胺基团。
33.根据权利要求20的方法，其中类似物包括选自下面的肽，或者其有机或无机酸加成盐：
Ref No.                         结构
9502            Leu Arg Ile Val Gln Pen Arg Ser Val Glu Gly Ser Pen Gly Phe
9405     CH3CO-Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
9410          H-Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
9404            Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe-CONH2
9407            Leu Arg Ile Val Gln Cys Lys Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
Figure A9881008900071
9604        Tyr Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
9605        Lys Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
9618    Lys Lys Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
9607            Ala Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
9606            Leu Lys Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
9608            Leu Arg Ala Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
9403            Leu Arg Lys Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
9609            Leu Arg Ile Ala Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
9610            Leu Arg Ile Val Ala Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
9612            Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ala Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
9613            Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Ala Glu Gly Ser Cys Gly Phe
9615            Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Ala Ser Cys Gly Phe
9616            Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ala Cys Gly Phe
9602            Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Ala Phe
9501            Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu D-Ala Ser Cys D-Ala Phe
9601            Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Ala其中所用的氨基酸残基缩写与标准的肽命名一致：
Gly＝甘氨酸；  Ile＝异亮氨酸；
Glu＝谷氨酸；  Phe＝苯丙氨酸；
Cys＝半胱氨酸；Arg＝精氨酸；
Gln＝谷氨酰胺；Leu＝亮氨酸；
Ser＝丝氨酸；  Val＝缬氨酸；
Lys＝赖氨酸；  Ala＝丙氨酸；
Asp＝天冬氨酸；His＝组氨酸；
Orn＝鸟氨酸；  Tyr＝酪氨酸；
Pen＝青霉胺(β，β′-二甲基-半胱氨酸)。
其中，除非作为D-绝对构象指出，除甘氨酸之外的所有氨基酸都是L-绝对构型，并且适当地此肽在Cys(182)和Cys(189)或Pen(182)和Pen(189)之间有环状二硫键。
34.根据权利要求17～33中任一项的方法，其中此肽是口服给药。
35.根据权利要求1～16中任一项的肽在制备用于治疗动物肥胖症的药物组合物中的用途。
36.一种用于动物肥胖症治疗的药物组合物，其包含有效量的根据权利要求1-16中任一项的肽，以及一种或多种药学上可接受的载体和/或稀释剂。
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