CN102827290A - 人血清白蛋白与人生长激素脂肪分解结构域的融合蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人血清白蛋白与人生长激素脂肪分解结构域的融合蛋白，包括两个区域，其中，第一区域为人血清白蛋白，第二区域为人生长激素脂肪分解结构域，人生长激素脂肪分解结构域的氨基酸序列为LRIVQCRSVEGSCGF。本发明融合蛋白有且唯一具有促进脂肪分解的活性；在体内的半衰期较长；在酵母中表达后无需复性，便于纯化；纯化步骤简洁高效，终产品内毒素含量低，有利于临床使用；重组表达生产成本较低，效率高。

Description

人血清白蛋白与人生长激素脂肪分解结构域的融合蛋白

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种人血清白蛋白与人生长激素脂肪分解结构域的融合蛋白。

背景技术

人生长激素(human growth hormone，hGH)是由脑垂体嗜酸性细胞分泌的一种蛋白质类激素。hGH的功能复杂多样，具有调节人体的生长发育，影响蛋白质、碳水化合物以及脂肪的代谢等作用。重组hGH是临床上非常重要的一个药物，在生理剂量上被用来治疗成年人以及儿童的hGH缺乏症；在药理剂量上被用来治疗很多疾病，比如骨质疏松症、心力衰竭、慢性肾衰竭、特纳氏综合症、以及多种急慢性代谢方面的疾病等。

hGH在体内起作用主要是通过与受体的结合，而生长激素受体(growth hormone receptor，GHR)在体内的分布非常广泛，很多器官都有GHR的存在。并且hGH在体内被水解成各种活性肽段，也发挥多种作用，有些是与治疗无关甚至是毒性的。因此长期使用hGH会产生一些诸如：葡萄糖耐受性、胰岛素拮抗性、浮肿以及高血压等症状。有的甚至需要在施用hGH之后，对病人进行糖尿病治疗，这在很大程度上限制了hGH的应用。

蛋白质水解及体外多肽合成研究发现：结构完整的hGH分子包含一些独立的结构区域，每个区域都具有独立的生物化学或生理学作用。因此，具有与结构完整的hGH分子类似的功能，而没有干扰活性的多肽成为人们研究的热点。hGH_177-191是hGH分子C末端的15个氨基酸，被认为是hGH促进脂肪分解的区域。

1959年，Raben和Hollenberg首次在成年人中发现hGH具有分解脂肪的作用。实验发现，hGH缺乏的成年人，当其循环系统中hGH的表达水平下降时，会出现腹部脂肪堆积，而用hGH替代治疗后，则腹部恢复正常。这说明腹部脂肪堆积与循环系统中hGH的表达水平有密切的关系。后来实验证实，hGH能够抑制脂蛋白脂酶的活性，增加循环系统中游离脂肪酸的含量，最终减少脂肪细胞的聚集。

hGH_177-191是hGH分子C末端的15个氨基酸，被认为是hGH促进脂肪分解的区域。通过水解和酶切的方法研究hGH的C末端的片段发现：hGH_177-191是保持该生物活性最小的片段。NMR显示hGH_177-191在溶液中呈现一种环状结构，与在hGH中相似。hGH_177-191具有与hGH相同的作用原理，都是直接作用于脂肪细胞，能够加速细胞内储存脂肪的释放和燃烧，从而减少脂肪的聚集。

对hGH_177-191的体外活性研究发现：hGH_177-191对啮齿动物、猪以及人的脂肪细胞或组织都能起到急性的脂肪分解作用。体内动物实验显示：肥胖小鼠施用不同剂量的hGH_177-191后，均能在不减少食物摄入量的基础上使小鼠的体重有不同程度的减轻。人体毒性实验也发现，hGH_177-191的耐受性非常好，对人体安全无副作用。GH_177-191有且唯一具有分解脂肪的生物活性，所以具有潜在的治疗肥胖的应用价值。

hGH_177-191仅由15个氨基酸组成，在开发为药物的过程中，面临着一系列的问题。hGH_177-191分子量特别小，在体内的半衰期非常短，只有几分钟。为了充分发挥其药效，必需每天注射或口服。每天注射会给病人带来注射部位疼痛等痛苦，造成病人的依从性比较差。而口服后，肽段会被水解，同样不利于药效的发挥。并且，通过体外合成的方法生产hGH_177-191，其费用比较高，每天使用更增加了其成本，不利于药物的大规模推广应用。

发明内容

本发明提供了一种人血清白蛋白与人生长激素脂肪分解结构域的融合蛋白及其制备方法，解决了现有人生长激素脂肪分解结构域在体内的半衰期短，口服易被水解，药效不易发挥的问题。

一种融合蛋白，包括两个区域，其中，第一区域为人血清白蛋白，第二区域为人生长激素脂肪分解结构域，人生长激素脂肪分解结构域的氨基酸序列为LRIVQCRSVEGSCGF。

人血清白蛋白(Human Serum Albumin，简称HSA)HSA是由585个氨基酸残基组成的蛋白质，分子量约为66.5KD，是血浆的主要成分，正常情况下不易透过肾小球，在血浆中的半衰期较长，可达14～20天，而且体内分布极广，没有酶学和免疫学活性，是一种理想的生物活性蛋白载体。

人血清白蛋白与人生长激素脂肪分解结构域可以直接连接，也可以通过连接肽连接。连接肽的长短以及氨基酸组成等对融合蛋白的表达水平、产率、稳定性以及活性等有影响，所述连接肽的长度优选2～100个氨基酸，更优选为5～50个氨基酸，最优选为14～30个氨基酸。所述连接肽的氨基酸序列优选为[GlyGlyGlyGlySer]_n，其中n为1～10的自然数，更优选为1～5的自然数。

所述人血清白蛋白作为蛋白载体与人生长激素脂肪分解结构域融合形成的融合蛋白分子量较大，不易被肾小球滤过，能够延长半衰期。所述HSA的氨基酸序列优选为如SEQ ID NO.2所示，hGH_177-191与该序列的HSA融合在延长多肽作用半衰期的基础上较大程度的保留了其活性和功能。所述HSA的氨基酸序列也可以与SEQ ID NO.2具有85％同源性，优选为具有95％的同源性。

本发明还提供了编码所述融合蛋白的基因，根据真菌密码子偏好性，其碱基序列优选为SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了一种包含所述融合蛋白的基因的重组质粒。

所述重组质粒的原始载体可以选用pPIC系列载体，优选为pPIC9K，pPICZα等分泌型载体，最优选为pPIC9。pPIC9载体上的醇氧化酶操纵子(AOX1)5’序列和3’序列，能高密度发酵，重组蛋白表达量高。pPIC9载体能对表达后的外源蛋白进行加工处理，将外源蛋白分泌到细胞外，提高表达蛋白的活性，也便于重组蛋白的纯化。

在单个重组质粒中，人血清白蛋白基因和人生长激素脂肪分解结构域基因的相对顺序可以任意，而且其中人生长激素脂肪分解结构域基因的拷贝数可以是两个或两个以上，所述重组质粒结构可以为pPIC9-HSA-hGH_177-191，pPIC9-hGH_177-191-HSA，pPIC9-HSA-L-hGH_177-191，pPIC9-hGH_177-191-L-HSA，pPIC9-hGH_177-191-HSA-hGH_177-191或pPIC9-hGH_177-191-L-HSA-L-hGH_177-191。

本发明还提供了一种包含所基因的表达系统。

所述的表达系统选择的宿主可以为细菌、酵母、动物细胞或植物细胞，优选为酵母，更优选为毕赤酵母GS115。

本发明还提供了一种所述融合蛋白的制备方法，包括：

(1)构建包含融合蛋白基因的重组表达载体；

具体可以为：以人胎肝组织DNA为模板，扩增得到HSA基因片段，连接到载体中，接着设计带hGH_177-191基因的引物，然后以上述带有HSA基因的重组载体为模板，扩增得到整个融合蛋白基因，最后将融合蛋白基因连接到pPIC9中。

(2)将重组表达载体酶切线性化，转入毕赤酵母GS115，获得转化子；

酶切线性化所用的内切酶为SalI，所述的转化的方法可以采用电穿孔法、化学法、原生质体生成法或全细胞法。

(3)对转化子细胞进行诱导培养，从培养基中分离纯化所述融合蛋白。

本发明的融合蛋白可以有各种衍生物，这些衍生物可以是但不局限于其不同形式的盐、修饰产物等。如在多肽的氨基、羧基、巯基上进行再修饰，所用修饰剂可以但不局限于聚乙二醇、葡萄糖等。

本发明的有益效果为：①本发明的融合蛋白有且唯一具有促进脂肪分解的活性；②该融合蛋白在体内的半衰期较长；③融合蛋白在酵母中表达，表达后无需复性，便于纯化；④纯化步骤简洁高效，终产品内毒素含量低，有利于临床使用；⑤重组表达生产成本较低，效率高。

附图说明

图1为质粒pPIC9-HSA-hGH_177-191的构建过程；

图2为质粒pPIC9-HSA-L-hGH_177-191的构建过程；

图3为质粒pPIC9-hGH_177-191-HSA-hGH_177-191的构建过程；

图4为pPIC9载体和融合基因的双酶切电泳结果；

图5为毕赤酵母重组转化子的PCR鉴定结果；

图6为纯化后的融合蛋白的SDS-PAGE分析；

图7为融合蛋白PVDF膜免疫印迹分析；

图8为融合蛋白促进脂肪分解活性检测结果。

具体实施方式

实施例1：HSA cDNA的克隆

用PCR方法从人胎肝cDNA文库中获得不带有信号肽编码序列的HSAcDNA。

设计的引物为：

HSA up：5’ATGCGAATTCGATGCACACAAGAGTGAGGTT 3’

HSA dn：5’ATGCGGATCCTAAGCCTAAGGCAGCTTGACT 3’

上下游引物分别引入EcoRI和BamHI位点和保护碱基，划线处为内切酶识别序列。

PCR反应条件：100μL反应体系中，加入1.5μL肝组织cDNA(经RNA提取试剂盒提取后逆转录而得到)，20μmol/L的上下游引物各1.5μL，10mmol/L的dNTP(脱氧核苷酸)1μL，10×反应缓冲液10μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，剩余用ddH₂O补足。

用EPPENDORF公司的(型号为Matstercycler Gradient)PCR仪，PCR反应条件为94℃预变性5min；94℃变性40s；54℃退火45s；72℃延伸2min，共33个循环以后，再72℃延伸10min。通过0.8％凝胶电泳分析得到预期为1.8kb的条带。

PCR产物电泳纯化用DNA片段回收试剂盒回收纯化目的条带。取纯化的HSA cDNA 3μL，加入1μL pGEM-T载体，5μL 2×反应缓冲液，1μLT4DNA连接酶，16℃反应过夜，转化新鲜制作的DH5α感受态细胞。转化菌铺于x-gal、IPTG和氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃培养过夜。挑取白色菌落，接种至5mL含50μg/ml LB液体培养基中，37℃培养过夜，用试剂盒进行小量质粒抽提，用EcoRI和BamHI双酶切后进行电泳鉴定挑选片段插入的阳性克隆。

从pGEM-T载体的多克隆位点两端分别测序，完成HSAcDNA全长测序，获得了含有序列正确的HSAcDNA的克隆。

实施例2：融合表达载体的构建

hGH_177-191是hGH的C末端的15个AA，其氨基酸序列为：H₂N-Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe-OH。根据酵母偏爱的密码子推导hGH_177-191的核苷酸序列为：ctg aga atc gtt cag tgcaga tct gtt gag ggt tct tgt ggt ttc，构建的重组质粒，如图1、2、3所示。

以实施例1中构建的pGEM-T-HSA质粒为模板，PCR体外扩增得到HSA基因和hGH_177-191片段的融合基因。用引物1和4互为上下游引物扩增得到融合基因HSA-L-hGH_177-191，用引物3和2互为上下游引物扩增得到融合基因hGH_177-191-HSA-hGH_177-191。用引物1和2互为上下游引物扩增得到融合基因HSA-hGH_177-191。

表1：用于重组表达载体构建的引物

表1中上游引物中引入XhoI酶切位点(下划线部分为限制性酶切位点)，下游引物引入EcoRI酶切位点(下划线部分为限制性酶切位点)。粗体字部分为毕赤酵母中蛋白酶Kex2的识别位点氨基酸Lys和Arg的密码子，加入这两个氨基酸密码子可以使表达的蛋白序列只含有预期的融合蛋白的肽序列。

体外扩增的PCR反应体系为(Total 50μL)

PCR反应条件为：94℃预变性3min，94℃变形30s，62℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次，72℃延伸10min，4℃保持。

反应完成后，胶回收纯化PCR产物。通过0.8％凝胶电泳分析，分别得到预期为1.8kb左右的条带。PCR产物电泳纯化后，用XhoI/EcoRI酶切，电泳回收；pPIC9质粒同样用Xhol/EcoRI酶切，回收线性化片段，结果见图4。泳道1是融合片段HSA-hGH_177-191，泳道2是融合片段hGH_177-191-HSA-hGH_177-191，泳道3是融合片段HSA-L-hGH_177-191，泳道4是融合片段HSA-hGH_166-191，泳道5和6是表达载体pPIC9。将融合片段和表达载体用T4DNA连接酶连接，转化入DH5α，挑选阳性克隆。具体步骤如下：

1)用XhoI/EcoRI双酶切表达载体pPIC9和融合基因。

pPIC9双酶切体系：

融合基因片段双酶切体系：

总体积为50μl，轻轻混匀，于37℃水浴酶切过夜。

2)电泳双酶切产物pPIC9和融合基因片段，再割胶回收。

3)连接pPIC9载体和融合基因片段。

分别按合适的摩尔比将双酶切后回收的质粒pPIC9和四种融合基因片段放入连接体系中，用T4连接酶催化连接。连接体系如下：

总体积10μl，轻轻混匀，于4℃冰箱连接过夜。

4)制备大肠杆菌DH5α感受态细胞。

5)将四种连接产物转化入DH5α感受态细胞，x-gal、IPTG和氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37℃培养过夜。

6)重组质粒的鉴定。

随机从琼脂平板上挑取若干个单菌落，经培养，抽提重组质粒，按设计的上下游限制性酶切位点XhoI和EcoRI双酶切鉴定提取的质粒。

酶切鉴定正确的阳性克隆菌寄送上海桑尼科技有限公司，进行测序鉴定。

实施例3重组表达质粒转化毕赤酵母GS115细胞、筛选及表达

电击转化及克隆筛选方法参照Invitrogen毕赤酵母实验手册，其中宿主细胞采用毕赤酵母GS115菌株。

根据目的基因和载体选择合适的线性化位点，选用SalI进行酶切，回收含有融合蛋白基因的片段，用此回收的片段电击转化毕赤酵母GS115细胞。转化后的GS115，铺于含有山梨醇RDB琼脂平板，30℃培养1～2天，挑取His+克隆。接种至装有25ml BMGY培养基250ml锥形瓶，250转/分钟、30℃培养48小时至OD₆₀₀＝2～6。离心后收集菌体用BMMY培养基使OD₆₀₀＝1.0左右(BMMY培养基量约100～200mL)，继续30℃培养，每24小时加1％的甲醇，诱导表达120小时，每天取样离心上清进行聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。

将毕赤酵母GS115重组细胞接种3mL YPD培养基，30℃摇床培养到OD₆₀₀约5～8之间；室温离心收集菌体于1.5mL离心管中；用灭菌水洗涤一次后再用0.5mL的SCE(1M山梨醇，1mM EDTA，10mM柠檬酸缓冲盐pH8.5)溶液悬浮菌体，并添加40μL浓度为5mg/mL的溶细胞酶和10μL巯基乙醇；37μL200r/min振荡处理1h后离心去上清，沉淀的菌体用0.5mLTris-EDTA(含50mmol/L Tris-HCl，20mmol/L乙二胺四乙酸钠)重新悬浮并添加50μL10％十二烷基磺酸钠；65℃处理20min后溶液变得粘稠，此时加入200μL 5M的醋酸钾，倒置混匀后放冰上30～60min；然后室温离心，上清加1mL无水乙醇，室温离心10s，倒去上清后倒置挥干DNA沉淀。所得的DNA用300μL的Tris-EDTA重新溶解并加入适量的Rnase A消化。37℃保温1h降解RNA。最后加入0.5mL的异丙醇，DNA沉淀析出后用灭菌的牙签挑出并置入新的离心管中，加入100μL Tris-EDTA溶解后保存。

用5’AOX1测序引物和3’AOX1测序引物对基因组进行PCR操作验证，结果如图5所示，泳道M是Marker，泳道1和2是阴性对照，泳道10是阳性对照，泳道3～9是各种毕赤酵母重组转化子用测序引物对融合蛋白酵母基因组的PCR结果。

实施例4：融合蛋白的纯化

接种经鉴定的含重组载体的毕赤酵母GS115转化子到3ml YPD培养基中，30℃、250r/min培养24h。1％的接种量接种于50ml BMGY培养基中，30℃、250r/min培养至OD₆₀₀为2～6。室温3000g离心5min，收集菌体，用BMMY重悬菌体，使OD₆₀₀为1.0左右。重悬菌液置于250ml的摇瓶中，用多层纱布封口保证通气量。放置于28～30℃，250r/min培养。每隔24h向培养基中添加100％的过滤灭菌甲醇至终浓度为1.0％，培养3天。

按照上述融合蛋白的诱导表达的方法诱导表达1L上清，取适量进行SDS-PAGE分析，有相应分子量的融合蛋白表达条带。取上清液经8000rpm离心30min后收集上清。经0.45μm滤膜过滤除菌后，过30KD的超滤膜(Millipore)超滤浓缩后用于分离纯化。

在XK 16柱中装入20ml的Blue-Sepharose填料，以20mM的Tris-HCl(pH 7.0)为流动相A，20mM Tris-HCl、2M NaCl(pH 7.0)为流动相B。用流动相A平衡Blue-Sepharose亲和柱后，以1ml/min流速将浓缩后的上清液液上Blue-Sepharose柱，上完样后先以流动相A平衡柱子，将所有未结合在柱上的组分冲干净；再用100％的流动相B洗脱目标峰。选用Hiprep^TM 16/10Q XL阴离子柱，20mM Tris-HCl(pH 7.0)为流动相A，20mM Tris-HCl、1MNaCl(pH 7.0)为流动相B。先将亲和柱目标峰用流动相A过脱盐柱脱盐后，以1ml/min的流速上样于用流动相A平衡好的Q XL柱，上完样后用流动相A平衡，再用2ml/min，20min，0～50％流动相B线性梯度洗脱，最后以的流动相B洗脱，收集目标峰。SDS-PAGE分析收集产物，融合蛋白分子量为68KD左右，如图6所示，其中，泳道M：蛋白分子量标准，泳道1：纯化的融合蛋白HSA-L-hGH_177-191，泳道3：纯化的融合蛋白HSA-hGH_177-191，泳道4：HSA对照。Western blotting分析，融合蛋白具有人生长激素促进脂肪分解结构域和HSA的结构域，如图7所示，A为以抗HSA多抗为一抗，B为以抗人生长激素多抗为一抗。其中泳道1：为纯化的HSA-hGH_177-191，泳道2：为纯化的HSA-L-hGH_177-191，泳道4：为HSA对照，泳道5：为未转化融合基因的空pPIC9载体。

实施例5：融合蛋白的生物学活性测定

脂肪细胞的分离，参照Rodbell的方法。取2只雄性Wistar大鼠，体重200～220g，断颈处死大鼠，浸泡在75％酒精中5min，取附睾及皮下脂肪组织，用含高浓度青霉素(300U/ml)和链霉素(300ng/ml)的PBS浸泡并冲洗2～3次。用眼科剪和镊子去除脂肪组织块表面可见的血管与肌肉，最后剪成1m³大小的碎块。加入5ml KRB缓冲液(含3mg/ml的I型胶原蛋白酶)消化，置于37℃摇床45min(附睾组织)，90min(皮下组织)，消化物一次通过孔径为250μm的筛网，收集滤液，400g离心1min4℃，取上清液，加入红细胞裂解液，吹打均匀，室温静置1-2min。400g离心1min 4℃，取上清液，用不含蛋白酶的KRB缓冲液悬浮并清洗3次(400g离心1min 4℃)备用检测脂肪分解活性。

通过分离的脂肪细胞释放的甘油来测定其脂肪分解活性。150μl细胞悬液(10％，v/v)加入到96孔板中于5％CO₂培养箱37℃培养60min。培养基中含有0.05μg/ml的去甲肾上腺素，不同浓度的GH_177-191和hGH标准样品。同样条件下，HSA被作为阴性对照。70℃加热10min灭活细胞中释放出的各种酶。通过甘油检测试剂盒酶法检测培养基中释放的甘油，促进脂肪分解的活性以每小时释放出的甘油量来表示(μmol/l/h)，结果如图8所示。

Claims (9)

1.一种融合蛋白，包括两个区域，其特征在于，第一区域为人血清白蛋白，第二区域为人生长激素脂肪分解结构域，人生长激素脂肪分解结构域的氨基酸序列为LRIVQCRSVEGSCGF。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，包括连接第一区域和第二区域的连接肽。

3.如权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述连接肽的氨基酸序列为[GlyGlyGlyGlySer]_n，其中n为1～10的自然数。

4.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述人血清白蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.一种编码如权利要求1～4任一所述融合蛋白的基因。

6.一种包含权利要求5所述基因的重组质粒。

7.如权利要求6所述的重组质粒，其特征在于，原始载体为pPIC9。

8.一种包含权利要求5所述基因的表达系统。

9.如权利要求1所述融合蛋白的制备方法，包括：

(1)构建包含融合蛋白基因的重组表达载体；

(2)将重组表达载体酶切线性化，转入毕赤酵母(Pichia.pastoris)GS115，获得转化子细胞；

(3)对转化子细胞进行诱导培养，从培养基中分离纯化所述融合蛋白。

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