CN103145854B - 重组Tβ4-BP5融合肽、基因、工程菌及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了重组Tβ4-BP5融合肽、基因、工程菌及应用。该重组融合肽为胸腺素β4和法氏囊五肽BP5通过柔性Linker融合而成。本发明将重组Tβ4-BP5融合肽基因插入表达载体，转化大肠杆菌，获得高效表达重组Tβ4-BP5融合肽的基因工程菌，通过液体培养、纯化制得的重组Tβ4-BP5融合肽，该融合肽经N端带有His标签的肠激酶去除硫氧还蛋白，再经亲和层析纯化，可获得单一的重组Tβ4-BP5融合肽。本发明的重组Tβ4-BP5融合肽可作为配合疫苗使用的新型多肽免疫佐剂，能够有效增强机体细胞免疫和体液免疫水平，具有广阔的应用前景。

Description

重组Tβ4-BP5融合肽、基因、工程菌及应用

技术领域

本发明涉及一种胸腺素β4与法氏囊五肽BP5重组融合肽，同时还涉及编码该重组融合肽的基因，表达该融合肽的工程菌及应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

胸腺是免疫系统中重要的中枢免疫器官，负责细胞的分化和成熟，胸腺素是胸腺分泌的具有生物活性的多种多肽类物质的统称，亦称胸腺肽。胸腺素β4（Tβ4）是20世纪80年代从胸腺中分离得到、后来发现在许多组织中都广泛存在的一种小肽类物质。胸腺素β4是一种重要的肌动蛋白结合蛋白，含有43个氨基酸，分子量约5kD，等电点为5.1，其氨基酸序列如下：

Ser-Asp-Lys-Pro-Asp-Met-Ala-Glu-Ile-Glu-Lys-Phe-Asp-Lys-Ser-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-Glu-Lys-Asn-Pro-Leu-Pro-Ser-Lys-Glu-Thr-Ile-Glu-Gln-Glu-Lys-Gln-Ala-Gly-Glu-Ser

胸腺素β4作为一种小肽类物质，不但在胸腺依赖性淋巴细胞的调节与分化方面具有重要功能，可显著增强胸腺细胞、骨髓细胞末端核苷酰转移酶活性，抑制巨噬细胞游走活性，胸腺素β4还可刺激下丘脑促黄体激素释放激素以及黄体激素的分泌，诱导T细胞系分型转变，在CD4细胞增殖抑制时激活CD8细胞。

法氏囊（bursa of Fabricus，BF）是禽类独有的中枢免疫器官，其功能类似于哺乳动物中的骨髓。法氏囊超滤物（1KD以下）中含有许多生物活性物质，特别是一些小肽对禽类具有免疫调节功能，能促进禽类、哺乳动物细胞的分化发育，促进免疫器官的成熟。其中的法氏囊活性五肽（BP5）是法氏囊中新分离出来的一种新的活性小肽，其氨基酸结构序列为：Cys-Lys-Asp-Val-Tyr。研究发现，BP5可以促进T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖，不但具有提高机体体液免疫和细胞免疫功能，还具有平衡Th1和Th2类型免疫反应的功能。而法氏囊活性五肽的免疫平衡作用是一般免疫增强剂所不具备的。

由于法氏囊五肽BP5只能从鸡的法氏囊组织中提取，胸腺素β4从胸腺组织中提取，来源受到很大的限制，而且其它杂蛋白含量高，纯化难度大，其实际效果也受到很大程度的影响。而化学合成的胸腺素β4或法氏囊活性五肽成本高，不适合田间推广。

发明内容

本发明的目的是提供重组Tβ4-BP5融合肽。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是提供重组Tβ4-BP5融合肽，该融合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

本发明的目的还在于提供一种重组Tβ4-BP5融合肽的基因。

本发明所采用的技术方案还在于提供一种重组Tβ4-BP5融合肽的基因，该融合肽基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；该融合肽基因由胸腺素β4基因和法氏囊五肽BP5基因通过柔性连接肽Linker基因串联而成，并在5’端加有肠激酶识别位点基因序列。

本发明的目的还在于提供一种重组Tβ4-BP5融合肽的工程菌。

本发明所采用的技术方案还在于提供一种重组Tβ4-BP5融合肽的工程菌，该工程菌的构建方法包括以下步骤：

1）重组Tβ4-BP5融合肽基因SOE-PCR扩增

根据猪大肠杆菌偏嗜密码子设计重组Tβ4-BP5融合肽基因，并针对该融合肽基因设计引物F₁、F₂和F₃，然后进行SOE-PCR扩增；将PCR扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切下目的条带进行回收，回收产物中片段大小为159bp的为重组Tβ4-BP5融合肽基因；

2）携带重组Tβ4-BP5融合肽基因的工程菌的构建

将重组Tβ4-BP5融合肽基因和质粒载体pET32a用EcoRI、XbaI双酶切，并将酶切的重组Tβ4-BP5融合肽基因和质粒载体pET32a连接，连接产物转化E.coli DH5α；提取质粒，并将重组表达质粒进行HindIII缺失酶鉴定；酶切鉴定为阳性的质粒测序，命名为pET32a-Tβ4-BP5；将重组质粒pET32a-Tβ4-BP5转化进入大肠杆菌BL21中，筛选阳性克隆，即为表达重组Tβ4-BP5融合肽的工程菌。

所述引物

F₁：5’-CCGGAATTCACTGACAAACCTGACATGGCCGAGATCGAGAAATTCGACAAATCGAAGCTCAAGAAGACTGA-3’；

F₂：5’-TCTCCTGCTCGATCGTCTCCTTCGATGGTAGTGGATTCTTCTCTTGAGTCTCAGTCTTCTTG-3’；

F₃：5’-TCGAGCAGGAGAAGCAAGCTGGCGAGTCCGGCGGCGGCGGCAGCTGCAAAAATGTGTATTAATCTAGATCG-3’。

本发明的目的还在于提供一种重组Tβ4-BP5融合肽的制备方法。

本发明所采用的技术方案还在于提供一种重组Tβ4-BP5融合肽的制备方法，包括以下步骤：

1）将携带重组Tβ4-BP5融合肽基因的工程菌接种到LB液体培养基培养，当菌体浓度OD₆₀₀=0.4-0.6时，加入IPTG进行诱导表达4～6h，IPTG终浓度为1mM；

2）将诱导表达的菌液12000rmp离心10min，收集沉淀，用洗涤液重悬沉淀，并超声波裂解10min；然后12000rmp离心10min，收集上清液；

3）将上清液用Ni柱亲和层析进行纯化，得到N端连有硫氧还蛋白的重组Tβ4-BP5融合肽的纯化产物；

4）将步骤3）的纯化产物通过N端带有His标签的肠激酶切去除硫氧还蛋白后，再进行Ni柱亲和层析，收集穿透峰，并用PBS进行透析，得到重组Tβ4-BP5融合肽。

本发明的目的还在于提供一种重组Tβ4-BP5融合肽在作为免疫佐剂方面的应用。

本发明所采用的技术方案还在于提供一种重组Tβ4-BP5融合肽在作为免疫佐剂方面的应用。

本发明将重组Tβ4-BP5融合肽基因插入表达载体，转化大肠杆菌，获得高效表达重组Tβ4-BP5融合肽的基因工程菌，通过液体培养、纯化制得的重组Tβ4-BP5融合肽，该融合肽经N端带有His标签的肠激酶去除硫氧还蛋白，再经亲和层析纯化，可获得单一的重组Tβ4-BP5融合肽。

将重组Tβ4-BP5融合肽与单独胸腺素β4或法氏囊五肽BP5进行免疫活性比较，结果显示，重组的重组Tβ4-BP5融合肽在体外淋巴细胞增殖试验中表现出比单独的胸腺素β4和法氏囊五肽BP5更高的刺激淋巴细胞增殖的活性。本发明的重组Tβ4-BP5融合肽可作为配合疫苗使用的新型多肽免疫佐剂，与疫苗配合单一胸腺素β4或疫苗配合单一法氏囊五肽BP5相比，具有更好的免疫佐剂效果，能够有效增强机体细胞免疫和体液免疫水平，具有广阔的应用前景。

本发明的重组Tβ4-BP5融合肽还可以与抗病毒、抗感染及抗肿瘤的药物进行混合，从而达到防治相应疾病的目的。本发明的重组Tβ4-BP5融合肽与疫苗进行混合，可以制成疫苗复合物，提高疫苗的免疫作用。

附图说明

图1为重组Tβ4-BP5融合肽的表达设计图；

图2为重组表达质粒pET32a-Tβ4-BP5的缺失酶鉴定图；

图中，1：DL2000DNA Marker；2：HindIII酶切重组质粒pET32a-Tβ4-BP5；3：重组质粒pET32a-Tβ4-BP5

图3为重组Tβ4-BP5融合肽表达载体的构建示意图；

图4为重组Tβ4-BP5融合肽在大肠杆菌中的SDS-PAGE电泳图；

图中，1：低分子量蛋白质Marker；2：0.25mmol/L IPTG诱导的重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET32a-Tβ4-BP5；3：0.5mmol/L IPTG诱导的重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET32a-Tβ4-BP5；4：0.75mmol/L IPTG诱导的重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET32a-Tβ4-BP5；5：1mmol/L IPTG诱导的重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET32a-Tβ4-BP5；6：1.25mmol/L IPTG诱导的重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET32a-Tβ4-BP5；7：1.5mmol/L IPTG诱导的重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET32a-Tβ4-BP5

图5为重组Tβ4-BP5融合肽在大肠杆菌BL21中的表达的SDS-PAGE分析图；

图中，1：低分子量蛋白质Marker；2：诱导的大肠杆菌BL21(DE3)的超声波裂解上清；3：诱导大肠杆菌BL21（DE3）的超声波裂解沉淀；4：诱导的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET32a-Tβ4-BP5的超声波裂解上清；5：诱导的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET32a-Tβ4-BP5的超声波裂解沉淀

图6为猪PRRSV GP5抗体的检测结果；

图7为猪PRRSV抗体亚型IgG1的检测结果；

图8为猪PRRSV抗体亚型IgG2a的检测结果；

图9为小鼠脾脏淋巴细胞增殖分析结果；

图10为小鼠血清中细胞因子IFN-γ含量测定；

图11为小鼠血清中细胞因子IL-4含量测定。

具体实施方式

实施例1

1、设计引物

根据猪大肠杆菌偏嗜密码子设计重组Tβ4-BP5融合肽基因，如下：5’-ACTGACAAACCTGACATGGCCGAGATCGAGAAATTCGACAAATCGAAGCTCAAGAAGACTGAGACTCAAGAGAAGAATCCACTACCATCGAAGGAGACGATCGAGCAGGAGAAGCAAGCTGGCGAGTCCGGCGGCGGCGGCAGCTGCAAAAATGTGTAT-3’（SEQ ID NO:1）

并针对该融合肽基因设计引物F₁、F₂和F₃，其中在引物F₁中加上EcoRI酶切位点，引物F₃中加上终止密码子和XbaI酶切位点。重组Tβ4-BP5融合肽的表达设计图见图1，引物由上海Invitrongen公司合成，如下：

F₁：5’-CCGGAATTCACTGACAAACCTGACATGGCCGAGATCGAGAAATTCGACAAATCGAAGCTCAAGAAGACTGA-3’（SEQ ID NO:2），其中下划线部分为EcoRI酶切位点；

F₂：5’-TCTCCTGCTCGATCGTCTCCTTCGATGGTAGTGGATTCTTCTCTTGAGTCTCAGTCTTCTTG-3’（SEQ ID NO:3）；

F₃：5’-TCGAGCAGGAGAAGCAAGCTGGCGAGTCCGGCGGCGGCGGCAGCTGCAAAAATGTGTATTAATCTAGATCG-3’（SEQ ID NO:4），其中下划线部分为XbaI酶切位点。

2、SOE-PCR扩增

PCR反应体系：10×PCR Buffer5μL，MgCl23μL，10mmol/L的dNTP1μL，终浓度为20pmol/L的引物F₁、F₂和F₃各2μL，TaKaRa ExTaq0.5μL，灭菌超纯水34.5μL，反应总体积50μL。

PCR反应程序：94℃预变性2min，进入PCR循环：94℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸6min，其中变性和退火共30个循环。

将PCR产物经含有溴化乙锭（Ethidium Bromide，EB）1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切下目的条带，随后按胶回收试剂盒（大连TaKaRa公司）使用说明进行回收，并对回收产物进行电泳鉴定，片段大小为159bp的即为重组Tβ4-BP5融合肽基因，对基因序列测定后，推导其编码的重组Tβ4-BP5融合肽为53个氨基酸。

实施例2

将实施例1的重组Tβ4-BP5融合肽基因和质粒载体pET32a用EcoRI、XbaI双酶切，并置于37℃水浴2h，将酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，胶回收试剂盒进行回收鉴定。经过酶切的重组Tβ4-BP5融合肽基因和质粒载体pET32a按摩尔比1:3的比例在4℃过夜连接。取连接产物加入含有100μL感受态DH5α的聚丙烯离心管中，轻轻混匀后冰浴30min。将聚丙烯离心管从冰中取出后42℃热休克90s，然后立即冰浴2min。取出加入37℃预热的LB培养基800μL中，于37℃振摇（120rpm）45min。取100μL菌液均匀涂布在含氨苄青霉素(Amp)50μg/mL的琼脂LB平板上，37℃放置20min后，倒置培养18h。

按《分子克隆实验指南》上的碱裂解法提取质粒。对提取的质粒用HindIII对质粒进行缺失酶鉴定，即将酶切产物进行DNA电泳鉴定，DNA电泳结果显示质粒没有被HindIII切出相应条带，表明重组质粒已经缺失HindIII酶切位点，如图2所示。并将重组阳性质粒命名为pET32a-Tβ4-BP5，如图3所示。将重组质粒pET32a-Tβ4-BP5送上海Invitrongen公司测序。

实施例3

取实施例2得到的阳性的重组原核表达载体pET32a-Tβ4-BP5接到含有200μL感受态细胞BL21的聚丙烯离心管中，轻轻混匀后冰浴30min。取出放置在42℃水浴中，热休克90s，然后立即冰浴2min。加入37℃预热的LB培养基800μL，于37℃振摇45min。取100μL菌液均匀涂布在琼脂LB平板（1μg/mL氨苄青霉素）上，在37℃正置20min后，倒置培养18h。

从琼脂LB平板（1μg/mL氨苄青霉素）上挑取单个菌落，接种到3mL LB培养基（1μg/mL氨苄青霉素）中，37℃振荡培养过夜，次日转入5mL LB培养基（1μg/mL氨苄青霉素）中37℃振荡培养3h，取菌液3mL，参照质粒快速提取试剂盒说明书提取质粒。筛选阳性克隆，即为表达Tβ4-BP5融合肽的工程菌，命名为BL21（DE3）/pET32a-Tβ4-BP5。

实施例4

1、将表达重组Tβ4-BP5融合肽的工程菌接种到3mL LB液体培养基（50μg/mL氨苄青霉素）中，于37℃振摇培养过夜；第二天从中取出菌液加到3mL LB液体培养基中，使菌体浓度达到OD₆₀₀≈0.1后，37℃振摇培养，当菌体浓度OD₆₀₀≈0.4-0.6时，加入IPTG进行诱导表达4h，IPTG的终浓度为1mM；每隔1小时收集100μL菌液，对重组Tβ4-BP5融合肽在大肠杆菌中不同IPTG终浓度的表达量进行SDS-PAGE分析，如图4所示。将菌液4000rpm离心10min，收集菌体，将收集的菌体用100μL PBS重悬后，加等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液（100mmol/L Tris·Cl(pH6.8)、200mmol/L二硫苏糖醇(DTT)、4%SDS(电泳级)、0.2%溴酚蓝及20%甘油），100℃煮沸5min以使蛋白质变形，然后取10μL进行SDS-PAGE凝胶电泳，SDS-PAGE电泳凝胶的配制及电泳条件参照分子克隆手册，具体步骤如下：

1）分离胶（15%）的配制：水3.4mL；30%丙烯酰胺溶液4.0mL；1.5M Tris·HCl（pH8.8）2.5mL；10%SDS0.10mL；10%过硫酸铵0.05mL；TEMED0.01mL。

按以上顺序加样后快速灌胶，小心地在液面上覆盖一层去离子水。在室温下放置10min待胶凝固后弃取水，用吸水纸吸干。

2）浓缩胶（5%）的配制：水5.7mL；30%丙烯酰胺溶液1.7mL；1.5M Tris·HCl（pH6.8）2.5mL；10%SDS0.1mL；10%过硫酸铵0.05mL；TEMED0.01mL。

将浓缩胶液体混匀后覆盖在分离胶之上，随后插入梳子，于室温下放置10min待胶凝固后，拔去梳子，向电泳槽内倒入Tris-甘氨酸电泳缓冲液（25mmol/L Tris、250mmol/L甘氨酸(电泳级)(pH8.3)、0.1%SDS），加样结束后接通电源。电源负极端接上槽，正极端接下槽。在浓缩胶中电压为80V，进入分离胶中电压调整为120V。直到样品到达分离胶底部后关闭电源，取出凝胶，用考马斯亮蓝染色1h，随后在脱色摇床上脱色1-2h，观察SDS-PAGE电泳蛋白染色结果。

2、将诱导表达的菌液12000rmp离心10min，收集菌体，用洗涤液（5mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，pH7.9）重悬菌体，后经超声波裂解10min，12000rmp离心10min，收获包涵体沉淀和上清液。SDS-PAGE电泳鉴定表达产物主要以可溶性表达，如图5所示。将此上清液用Ni柱亲和层析进行纯化，具体操作过程如下：

将树脂摇匀后，向柱子里加入5.0mL树脂悬液，置于室温下使其自然沉降，确保柱床体积为2.5mL，随后分别加入3倍体积的纯水、5倍体积1×Charge buffer、3倍体积1×Bindingbuffer。当1×Binding buffer流到柱床底部时，向柱子里加入上清液，控制流速，以每小时25mL的流量过柱，确保蛋白能充分地结合到柱子上。接着加入25mL1×Bingding buffer进行洗涤，随后用15mL1×Wash buffer洗涤，最终用15mL的1×Elute buffer洗脱蛋白，即得到重组Tβ4-BP5融合肽的纯化产物，分子量约26KDa。该融合蛋白在重组Tβ4-BP5融合肽N端连有硫氧还蛋白。

3、将重组Tβ4-BP5融合肽的纯化产物通过N端带有His标签的肠激酶切去除硫氧还蛋白，可获得保持天然N端的重组Tβ4-BP5融合肽。再次进行Ni柱亲和层析，收集穿透峰，将纯化的蛋白用PBS进行透析，得到纯度极高的重组Tβ4-BP5融合肽。将得到的重组Tβ4-BP5融合肽在蛋白核酸测定仪（型号GeneQuant pro RNA/DNA Calculator）定量后冷冻干燥。

实验例、重组Tβ4-BP5融合肽作为猪繁殖与呼吸综合症疫苗的免疫佐剂的效果分析

将本发明的重组Tβ4-BP5融合肽配合猪繁殖与呼吸综合症（PRRS）疫苗联合免疫，分析其免疫增强效果。猪繁殖与呼吸综合症灭活疫苗（NVDC-JXAI株）购自杭州荐里兽用生物制品有限公司。

将6周龄雌性BALB/c小鼠分为5组，分别为灭活疫苗组、灭活疫苗+单独法氏囊五肽BP5组、灭活疫苗+单独胸腺素β4组、灭活疫苗+重组Tβ4-BP5融合肽组及PBS对照组，每组10只，重组Tβ4-BP5融合肽、单独胸腺素β4和单独法氏囊活性肽BP5使用剂量均为10μg/鼠。采用腹膜内注射，间隔两周免疫一次，共免疫三次，最后一次免疫一周后尾静脉采血。分别测定不同组中猪PRRS病毒抗体亚型、血清中IL-4和IFN-γ的含量，并同时分离小鼠脾脏淋巴细胞检测脾淋巴细胞增殖，结果如下：

（1）通过间接ELISA试验检测各组小鼠血清的猪PRRSV GP5抗体的OD值，结果显示，猪PRRS商用疫苗组和猪PRRS疫苗+Tβ4-BP5试验组小鼠在首免后7d、14d、21d均有明显的猪PRRSV GP5抗体产生，随着免疫天数的增加，在首免后28d、35d，猪PRRS疫苗+Tβ4-BP5试验组的抗体滴度与猪PRRS疫苗+胸腺素β4组和猪PRRS疫苗+法氏囊五肽BP5组相比差异显著(p<0.05)，如图6所示。而猪PRRSV抗体亚型IgG1和IgG2a水平，在一次、二次加强免疫后7d，猪PRRS疫苗+Tβ4-BP5试验组猪PRRSV IgG2a抗体的滴度显著地高于猪PRRS疫苗+胸腺素β4组和猪PRRS疫苗+法氏囊五肽BP5组(p<0.05)。重组Tβ4-BP5融合肽在二次加强免疫后能明显促进IgG1抗体的分泌，如图7、8。

（2）第三次免疫猪PRRS疫苗后7d处死小鼠，分离脾脏淋巴细胞，检测淋巴细胞的增殖情况。结果显示，PBS空白对照组小鼠的脾淋巴细胞的增殖情况不明显；猪PRRS商用疫苗组小鼠脾淋巴细胞的增殖情况明显好于PBP5空白对照组；而重组Tβ4-BP5融合肽作为佐剂配合猪PRRS疫苗的联合免疫组小鼠脾淋巴细胞的增殖能力最强，明显高于猪PRRS疫苗+胸腺素β4组和猪PRRS疫苗+法氏囊五肽BP5组，如图9所示，表明重组Tβ4-BP5融合肽具有促进免疫小鼠脾淋巴细胞增殖的功能。

（3）应用定量ELISA对血清中的IL-4和IFN-γ进行定量分析发现重组Tβ4-BP5融合肽作为佐剂对猪PRRS疫苗免疫小鼠血清中的IL-4和IFN-γ的分泌均有明显的促进作用，尤其是促进IFN-γ的分泌；而且猪PRRS疫苗+重组Tβ4-BP5融合肽促进小鼠血清中分泌IL-4和IFN-γ的能力好于猪PRRS疫苗+胸腺素β4组和猪PRRS疫苗+法氏囊五肽BP5组，如图10、11所示。

Claims (5)

1.重组Tβ4-BP5融合肽，其特征在于，该融合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

2.一种编码权利要求1所述的重组Tβ4-BP5融合肽的基因，其特征在于，该融合肽基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求2所述的一种编码重组Tβ4-BP5融合肽的基因，其特征在于，所述融合肽基因由胸腺素β4基因和法氏囊五肽BP5基因通过柔性连接肽Linker基因串联而成，并在5’端加有肠激酶识别位点基因序列。

4.一种表达权利要求1所述的重组Tβ4-BP5融合肽的工程菌，其特征在于，该工程菌的构建方法包括以下步骤：

1)重组Tβ4-BP5融合肽基因SOE-PCR扩增

根据猪大肠杆菌偏嗜密码子设计重组Tβ4-BP5融合肽基因，并针对该融合肽基因设计引物F₁、F₂和F₃，然后进行SOE-PCR扩增；将PCR扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切下目的条带进行回收，回收产物中片段大小为159bp的为重组Tβ4-BP5融合肽基因；

2)携带重组Tβ4-BP5融合肽基因的工程菌的构建

将重组Tβ4-BP5融合肽基因和质粒载体pET32a用EcoRI、XbaI双酶切，并将酶切的重组Tβ4-BP5融合肽基因和质粒载体pET32a连接，连接产物转化E.coli DH5α；提取质粒，并将重组表达质粒进行HindIII缺失酶鉴定；酶切鉴定为阳性的质粒测序，命名为pET32a-Tβ4-BP5；将重组质粒pET32a-Tβ4-BP5转化进入大肠杆菌BL21中，筛选阳性克隆，即为表达重组Tβ4-BP5融合肽的工程菌；

所述的引物为：

F₁：5’-CCGGAATTCACTGACAAACCTGACATGGCCGAGATCGAGAAATTCGACAAATCGAAGCTCAAGAAGACTGA-3’；

F₂：5’-TCTCCTGCTCGATCGTCTCCTTCGATGGTAGTGGATTCTTCTCTTGAGTCTCAGTCTTCTTG-3’；

F₃：5’-TCGAGCAGGAGAAGCAAGCTGGCGAGTCCGGCGGCGGCGGCAGCTGCAAAAATGTGTATTAATCTAGATCG-3’。

5.一种如权利要求1所述的重组Tβ4-BP5融合肽在制备免疫佐剂方面的应用。