CN102898514A - 重组人神经生长因子缺失突变体及其制备方法和用途 - Google Patents
重组人神经生长因子缺失突变体及其制备方法和用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102898514A CN102898514A CN2011102136708A CN201110213670A CN102898514A CN 102898514 A CN102898514 A CN 102898514A CN 2011102136708 A CN2011102136708 A CN 2011102136708A CN 201110213670 A CN201110213670 A CN 201110213670A CN 102898514 A CN102898514 A CN 102898514A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- growth factor
- cell
- nerve growth
- ngf
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 title claims abstract description 59
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 title claims abstract description 58
- 238000012217 deletion Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 230000037430 deletion Effects 0.000 title claims abstract description 28
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 title claims abstract description 24
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 28
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 19
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 14
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 42
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 18
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 10
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 claims description 9
- 101150064037 NGF gene Proteins 0.000 claims description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 6
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 5
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 4
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 10
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 abstract description 7
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 abstract description 5
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 abstract description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 7
- 101100404651 Mus musculus Ngf gene Proteins 0.000 description 6
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 101001111439 Homo sapiens Beta-nerve growth factor Proteins 0.000 description 4
- 102000046917 human NGF Human genes 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 3
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 3
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 210000001913 submandibular gland Anatomy 0.000 description 3
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 2
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 208000010886 Peripheral nerve injury Diseases 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 101100380241 Caenorhabditis elegans arx-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101150111783 NTRK1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 208000030768 Optic nerve injury Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 101150092805 actc1 gene Proteins 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 208000014337 facial nerve disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000000933 neural crest Anatomy 0.000 description 1
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000003998 snake venom Substances 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002889 sympathetic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/48—Nerve growth factor [NGF]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种重组人神经生长因子缺失突变体，所述突变体是完整人神经生长因子肽链C端缺失3个氨基酸；所述突变体氨基酸序列为：如序列表SEQ ID No.1所示。或所述突变体的氨基酸序列为与SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列具有95％以上同源性且具有神经生长因子生物学活性的氨基酸序列。本发明所述的突变体采取表达C末端缺失3个氨基酸rhNGF(rhNGF-D3)的策略来保持rhNGF的C末端完整性，并且通过此改造，相比较于rhNGF，在真核细胞中rhNGF-D3蛋白表达水平提高5～10倍，生物活性保持不变，蛋白C端均一。
Description
技术领域
本发明涉及一种突变体，具体的说是一种在真核表达系统中高效表达并保持相似的生物学活性的重组人神经生长因子缺失突变体。
背景技术
神经生长因子(Nerve Growth Factor，NGF)是Levi-Montlcini于1953年在小鼠肉瘤细胞内发现的第一个神经营养因子，NGF能够维持和促进交感神经及来自神经嵴的感觉神经细胞的存活、分化和成熟以及执行功能，是参与损伤神经再生和功能修复的重要因素。
NGF存在于多种物种中，在雄性小鼠颌下腺、牛精浆、蛇毒、豚鼠前列腺和人胎盘中组织中含量丰富。其中小鼠NGF与人NGF氨基酸序列同源性达到90％。利用生物技术提取自小鼠颌下腺的鼠NGF及提取自人胎盘组织的人NGF注射液目前已在中国上市，临床上主要用于治疗视神经损伤等，例如中毒性周围神经损伤、外伤性周围神经损伤、面神经炎等疾病。考虑到鼠NGF应用于人体的种属差异性及小鼠作为原材料所具有的潜在的致病因子风险及人胎盘组织原材料的限制，发展基因工程技术制备重组人NGF(rhNGF，recomb inant human NGF)来取代提取的鼠NGF和人NGF具有很好的应用前景。
人体内成熟的NGF以同源二聚体的形式存在，每条肽链包含120个氨基酸。人NGF基因位于1号染色体短臂上，完整的NGF外显子由241个氨基酸组成，通常称为prepro NGF前体，在内质网中prepro NGF前体的信号肽被切割下来，形成pro NGF前体(223个氨基酸)，pro NGF前体在内质网中以同源二聚体形式存在，然后转移至高尔基体中，前体部分经Furin酶切，形成成熟的NGF二聚体(单体含有120个氨基酸)，被转运至细胞外，同时也有部分未经切割的pro NGF前体分泌至细胞外。
提取自小鼠颌下腺的鼠NGF通常在N端、C端有一些氨基酸缺失，例如N端缺失8个氨基酸、C端缺失2个或3个氨基酸，这几种缺失突变体同时存在于鼠NGF中，有研究表明N端或C端缺失的NGF并不影响其生物学活性。在利用真核细胞制备rhNGF时，同样发现经常存在C端缺失2到3个氨基酸的情况，会形成同源或者异源二聚体，例如120/120、118/118、117/117、120/118、117/118等，这就给rhNGF的质量控制造成了一定的困扰。
发明内容
本发明的目的在于提供一种在真核细胞中高效表达的重组人神经生长因子缺失突变体。
本发明的具体技术方案如下：
一种重组人神经生长因子缺失突变体，所述突变体是完整人神经生长因子肽链C端缺失3个氨基酸；所述突变体氨基酸序列为：
(1)如序列表SEQ ID No.1所示。或
(2)所述突变体的氨基酸序列为与SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列具有95％以上同源性且具有神经生长因子生物学活性的氨基酸序列。
编码上述重组人神经生长因子缺失突变体的基因。
所述基因如SEQ ID No.2所示。
一种制备重组人神经生长因子缺失突变体基因的方法，所述步骤如下：根据人NGF DNA序列(Genbank：NM_002506)设计引物，分离人外周血白蛋白，提取其总RNA，反转录为cDNA，以此cDNA为模板，扩增人NGF基因及缺失突变体基因。
一种表达载体，所述载体含有上述方法制备得到的基因。
所述表达载体为真核表达载体。真核细胞可以使用酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细胞等，基因导入细胞的方法可以使用稳定转染或瞬时转染。
一种含有上述表达载体的宿主细胞。
所述宿主细胞为哺乳动物细胞。所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞、人胚肾293细胞、COS细胞或Hela细胞。
一种表达上述载体的方法，是将含有重组人神经生长因子缺失突变体基因的表达载体转化至宿主细胞，培养所得重组细胞表达得到重组人神经生长因子缺失突变体。
本发明的有益效果：
本发明所述的突变体采取表达C末端缺失3个氨基酸rhNGF(rhNGF-D3)的策略来保持rhNGF的C末端完整性，并且通过此改造，相比较于rhNGF，在真核细胞中rhNGF-D3蛋白表达水平提高5～10倍，生物活性保持不变，蛋白C端均一。
本发明的可实施性和突出实质性特点以及积极效果可通过以下实例得以体现，但不限制其范围。
附图说明
图1为编码人NGF及其突变体的DNA序列；rhNGF-D3突变体序列与人NGF序列相比缺乏3′端的9bp(下划线标记的序列)；
图2为rhNGF-D3氨基酸序列；
图3为表达rhNGF或rhNGF-D3的载体结构图；
图4为1F1G8和2F5重组细胞系在10L WAVE生物反应器中的细胞生长曲线；1F1G8表达rhNCF，2F5细胞表达rhNCF-D3；细胞培养采取流加培养模式，共培养12天；
图5为rhNCF和rhNCF-D3蛋白表达水平；
图6为rhNCF蛋白纯化结果；
图7为rhNCF-D3蛋白纯化结果；
图8为rhNCF-D3蛋白N端氨基酸序列测定结果；
图9为rhNCF-D3蛋白分子量测定结果；
图10为瞬时转染情况下rhNCF和rhNCF-D3蛋白表达水平分析。
具体实施方式
实施例1重组人神经生长因子缺失突变体(rhNCF-D3)基因克隆及载体构建
根据已公布的人NGF DNA序列(Genbank：NM_002506)设计引物，分离人外周血白蛋白，利用TriZol(购自Invitrogen)，提取其总RNA，反转录为cDNA，反转录体系为模板RNA 2μg，5×反应液4μl，dNTP混合液(10mM，each)1μl，RNase inhibitor(20U/μl)，随机引物2μl，M-MLV反转录酶(200U/μl)1μl，加水补足总体积至20μl。室温放置10min后，42℃反应1h。以此cDNA为模板，扩增人NGF基因及缺失突变体基因，扩增上游引物为“5’-atgaa ttcca ccatgtccat gttgt tctac actc t ga-3’”，下游引物分别为“5’-atccc gggtt atcaggctct tctca cagcc ttcct gct-3’(用于全长NGF基因扩增)”和“5’-atcccgggtt atcac acagc cttcc tgctg agca cac-3’(用于NGF缺失突变体基因扩增)”。起始密码子处设有Kozak序列(CCACCATG)，PCR扩增条件为94℃-3min；94℃-30s，58℃-30s，72℃-1min，30个循环；72℃-7min。
得到人NGF基因全长726bp，包括人NGF的prepro序列部分，NGF缺失突变体基因全长717bp，序列如SEQ ID No.2所示。如图1所示，在人NGF全长基因的3′端缺失AGAAGAGCCT(代表C末端的3个氨基酸)。以此基因表达的人神经生长因子突变体蛋白氨基酸序列(117个氨基酸SEQ ID No.1所示)如图2所示，编码preproNGF-D3的基因插入到表达载体中，信号肽(图中下划线标记的序列)被切割后，形成pro NGF-D3前体，再经furin酶酶切后，酶切位点如图中箭头所示，形成成熟的rhNGF-D3。成熟的rhNGF-D3蛋白含有117个氨基酸，缺乏完整人NGF蛋白C端的R、R、A三个氨基酸。
重组人神经生长因子缺失突变体(rhNGF-D3)载体构建：
将上述获得的PCR产物人NGF DNA序列及SEQ ID No.2所示的NGF缺失突变体基因序列经EcoRI和Sma I(购自NEB)双酶切后，与插入到经同样双酶切的pCI-neo载体(Invitrogen公司)连接，连接条件为16℃，过夜。将连接产物转化感受态细菌DH 5α，感受态菌铺于带有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，利用PCR鉴定挑选出阳性克隆，pCI-neo NGF及pCI-neo NGF-D3质粒经DNA测序鉴定正确，质粒结构如图3所示。
实施例2
将制备好的pCI-neo NGF及pCI-neo NGF-D3质粒经电转化至CHO S细胞(购自Invitrogen公司)，电转仪为Gene pulser Xcell(BIO-RAD公司)，电转条件为160V，150ms。培养基为DMEM加入10％胎牛血清，电转后，用培养基将电转杯内的细胞洗出，铺于35mm细胞培养皿内。第三天，培养基内加入600μg/ml6418(Sigma公司)加压筛选抗性细胞，经抗性筛选存活的单克隆细胞团，转移至96孔板内，利用dot-blot检测细胞上清中重组蛋白表达水平，挑选高表达的细胞克隆进入到悬浮培养。
宿主细胞优选为哺乳动物细胞，本实施例中使用的是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，人胚肾293细胞、COS细胞、Hela细胞等也可应用。
实施例3
选择有较好表达水平的细胞株转移至40ml摇瓶(Corning公司)中，挑选适应无血清悬浮培养的细胞株，所用培养基为SFM4(Hyclone公司)，培养条件为37℃，比较细胞生长曲线、重组蛋白表达水平(定量ELISA检测，BD公司，dy265)，最终确定重组细胞系1F1G8(表达全长重组人神经生长因子(rhNGF))和细胞系2F5(表达重组人神经生长因子C末端缺失3个氨基酸的突变体(rhNGF-D3))作为下一步研究的重组细胞系。
对细胞系1F1G8和2F5在10L WAVE生物反应器(Satorious公司)中进行了小规模的批式流加细胞培养工艺摸索，两株细胞系保持相似的生长曲线，如图4所示，但rhNGF-D3蛋白的表达水平比rhNGF高大约10倍以上，如图5所示。
实施例4
将实施例3获得的细胞液进行离心，超滤浓缩换液后，首先上样于SepharoseFastflow柱(GE公司)，利用加入1mol/l NaCl的缓冲液洗脱后，陆续上样于Phenyl Fastflow(low sub，GE公司)、Phenyl HP(GE公司)和Superdex 75分子筛凝胶柱(GE公司)，纯化仪为AKTA Purifier，得到纯度大于90％的重组蛋白，如图6和图7所示。
实施例5
NGF测活的方法使用TF-1细胞，TF-1细胞表面具体有NGF高亲和力受体TrkA，NGF能够通过剂量依赖关系促进TF-1细胞的增殖，通过MTT法来检测NGF刺激细胞增殖的能力。rhNGF活性标准品是来自于英国NIBSC的重组人NGF活性国际标准品，其比活性为1×106AU/mg，所测的rhNGF和rhNGF-D3比活性分别为9.6×105和9.8×105AU/mg。可以看出，两种蛋白生物比活性相当。
实施例6
对rhNGF-D3蛋白进行N端测定和分子量质谱测定，委托军事医学科学院仪器测定分析中心测定。N端5个氨基酸为SSSHP，与理论计算相同，如图8所示。rhNGF-D3蛋白理论分子量为13110Da，实际测定分子量为13102Da，如图9所示，相差8Da，在误差范围之内。由于该蛋白测定C端氨基酸序列较为困难，未能检测出来。但根据质谱测定分子量的结果分析，蛋白中只有单一的分子量存在，说明形成了C端均一的蛋白。
实施例7
为了进一步明确人NGF C端缺失3个氨基酸对重组蛋白表达水平的影响，说明我们以上获得的rhNGF和rhNGF-D3的表达水平差异不是由于不同细胞克隆的表达水平差异造成的，我们进行了两种蛋白的瞬时表达水平的检测。表达系统为FreeStyleTM MAX 293 Expression System(Invitrogen公司)，将pCI-neo NGF及pCI-neo NGF-D3质粒转染至293F细胞，蛋白表达在40ml摇瓶中进行，使用无血清悬浮培养，每种蛋白进行三个重复，利用ELISA检测上清中的NGF表达量，计算平均值及标准差。重组蛋白表达水平见图10。
从图中可以看出，rhNGF-D3的表达水平明显高于rhNGF，相对于rhNGF，rhNGF-D3的表达水平提高了5～10倍。说明基因的变化对重组蛋白表达水平起着决定性的作用。
Claims (10)
1.一种重组人神经生长因子缺失突变体，其特征在于，所述突变体是完整人神经生长因子肽链C端缺失3个氨基酸；所述突变体氨基酸序列为：
(1)如序列表SEQ ID No.1所示。或
(2)所述突变体的氨基酸序列为与SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列具有95％以上同源性且具有神经生长因子生物学活性的氨基酸序列。
2.编码权利要求1或2所述重组人神经生长因子缺失突变体的基因。
3.根据权利要求3所述的编码重组人神经生长因子缺失突变体的基因，其特征在于，所述基因如SEQ ID No.2所示。
4.一种制备权利要求2或3所述重组人神经生长因子缺失突变体基因的方法，其特征在于，所述步骤如下：根据人NGF DNA序列(Genbank：NM_002506)设计引物，分离人外周血白蛋白，提取其总RNA，反转录为cDNA，以此cDNA为模板，扩增人NGF基因及缺失突变体基因。
5.一种表达载体，其特征在于，所述载体含有权利要求4制备得到的基因。
6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为真核表达载体。
7.一种表达权利要求5或6所述载体的方法，其特征在于，将含有重组人神经生长因子缺失突变体基因的表达载体转化至宿主细胞，培养所得重组细胞表达得到重组人神经生长因子缺失突变体。
8.含有权利要求5或6所述表达载体的宿主细胞。
9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。
10.根据权利要求9所述的宿主细胞，其特征在于，所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞、人胚肾293细胞、COS细胞或Hela细胞。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110213670.8A CN102898514B (zh) | 2011-07-28 | 2011-07-28 | 重组人神经生长因子缺失突变体及其制备方法和用途 |
| PCT/CN2012/079188 WO2013013626A1 (zh) | 2011-07-28 | 2012-07-26 | 重组人神经生长因子缺失突变体及其制备方法和用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110213670.8A CN102898514B (zh) | 2011-07-28 | 2011-07-28 | 重组人神经生长因子缺失突变体及其制备方法和用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102898514A true CN102898514A (zh) | 2013-01-30 |
| CN102898514B CN102898514B (zh) | 2015-04-29 |
Family
ID=47571030
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201110213670.8A Active CN102898514B (zh) | 2011-07-28 | 2011-07-28 | 重组人神经生长因子缺失突变体及其制备方法和用途 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102898514B (zh) |
| WO (1) | WO2013013626A1 (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108300736A (zh) * | 2016-09-12 | 2018-07-20 | 中国食品药品检定研究院 | 高效表达重组人β-NGF-Fc融合蛋白的CHO细胞株及其构建方法 |
| CN113845583A (zh) * | 2020-06-28 | 2021-12-28 | 江苏中新医药有限公司 | 一种修饰的重组人神经生长因子及其制备方法 |
| CN114671941A (zh) * | 2016-03-18 | 2022-06-28 | 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 | 神经生长因子突变体 |
| CN115813951A (zh) * | 2022-11-10 | 2023-03-21 | 广州连达科技有限公司 | 转基因干细胞及其用于治疗失眠症或睡眠障碍的用途 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1079992A (zh) * | 1992-03-06 | 1993-12-29 | 哈肯·本特·佩尔松 | 具有经改变的受体结合特性的神经营养因子 |
| CN101260398A (zh) * | 2007-03-07 | 2008-09-10 | 舒泰神（北京）药业有限公司 | 神经生长因子基因定位改造动物及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| HU222666B1 (hu) * | 1996-11-15 | 2003-09-29 | Genentech, Inc. | Eljárás neuorotrofinok tisztítására |
-
2011
- 2011-07-28 CN CN201110213670.8A patent/CN102898514B/zh active Active
-
2012
- 2012-07-26 WO PCT/CN2012/079188 patent/WO2013013626A1/zh active Application Filing
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1079992A (zh) * | 1992-03-06 | 1993-12-29 | 哈肯·本特·佩尔松 | 具有经改变的受体结合特性的神经营养因子 |
| CN101260398A (zh) * | 2007-03-07 | 2008-09-10 | 舒泰神（北京）药业有限公司 | 神经生长因子基因定位改造动物及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| BURTON L.等: "Activity and Biospecificity of Proteolyzed Forms and Dimeric Combinations of Recombinant Human and Murine Nerve Growth Factor", 《JOURNAL OF NEUROCHEMISTRY》 * |
| DRINKWATER C.等: "The Carboxyl Terminus of Nerve Growth FactorI s Required for Biological Activity", 《JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 * |
| REYNOLDS P.D.等: "Glucocorticoid Resistance in the Squirrel Monkey Is Associated with Overexpression of the Immunophilin FKBP51", 《JOURNAL OF CLINICAL ENDOCRINOLOGY AND METABOLISM》 * |
| 俞萍等: "神经生长因子结构与功能研究进展", 《生物化学与生物物理进展》 * |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114671941A (zh) * | 2016-03-18 | 2022-06-28 | 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 | 神经生长因子突变体 |
| CN114671941B (zh) * | 2016-03-18 | 2023-09-26 | 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 | 神经生长因子突变体 |
| CN108300736A (zh) * | 2016-09-12 | 2018-07-20 | 中国食品药品检定研究院 | 高效表达重组人β-NGF-Fc融合蛋白的CHO细胞株及其构建方法 |
| CN108300736B (zh) * | 2016-09-12 | 2021-05-14 | 中国食品药品检定研究院 | 高效表达重组人β-NGF-Fc融合蛋白的CHO细胞株及其构建方法 |
| CN113845583A (zh) * | 2020-06-28 | 2021-12-28 | 江苏中新医药有限公司 | 一种修饰的重组人神经生长因子及其制备方法 |
| WO2022001818A1 (zh) * | 2020-06-28 | 2022-01-06 | 江苏中新医药有限公司 | 一种修饰的重组人神经生长因子及其制备方法 |
| CN113845583B (zh) * | 2020-06-28 | 2023-08-11 | 江苏中新医药有限公司 | 一种修饰的重组人神经生长因子及其制备方法 |
| CN115813951A (zh) * | 2022-11-10 | 2023-03-21 | 广州连达科技有限公司 | 转基因干细胞及其用于治疗失眠症或睡眠障碍的用途 |
| CN115813951B (zh) * | 2022-11-10 | 2023-07-21 | 北京昱龙盛世生物科技有限公司 | 转基因干细胞及其用于治疗失眠症或睡眠障碍的用途 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102898514B (zh) | 2015-04-29 |
| WO2013013626A1 (zh) | 2013-01-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101189257A (zh) | 脂质运载蛋白 | |
| WO2024002149A1 (zh) | 一种重组iii型胶原蛋白及其制备方法 | |
| EP3380508B1 (en) | Thermostable fgf2 polypeptide, use thereof | |
| Luporini et al. | Chemical signaling in ciliates | |
| KR20200020708A (ko) | 형질전환 대식세포, 키메라 항원 수용체, 및 관련 방법 | |
| CN102898514B (zh) | 重组人神经生长因子缺失突变体及其制备方法和用途 | |
| CN103074374B (zh) | 人β-NGF的重组表达载体及含该载体的重组细胞株 | |
| AU2016359722A1 (en) | Thermostable FGF2 polypeptide, use thereof | |
| WO1999007738A2 (en) | Human orphan receptor ntr-1 | |
| CN111217903A (zh) | 一种重组人纤连蛋白ⅲ1-c及其制备方法和应用 | |
| CN103710367B (zh) | 一种重组人激肽释放酶1及其编码基因和制备方法 | |
| CN101775072A (zh) | 一种融合穿透肽的神经细胞营养因子gdnf | |
| Mayer et al. | A cDNA clone from the sea lamprey Petromyzon marinus coding for a scavenger receptor Cys-rich (SRCR) domain protein | |
| CN101190944A (zh) | 人类新细胞因子及其用途 | |
| CN100457778C (zh) | 睫状神经营养因子(cntf)突变体及其生产方法和其用途 | |
| CN103917655A (zh) | 核心蛋白聚糖组合物及其用途 | |
| CN109627316A (zh) | 草鱼IFN-γ2基因及其编码的重组蛋白和应用 | |
| CN105384828B (zh) | 长效干扰素-α及其改造方法 | |
| CN107557366B (zh) | 一种斜带石斑鱼天然免疫受体tlr13基因及其真核表达载体与应用 | |
| CN108484749B (zh) | 一种重组可溶性人源骨靶向干扰素γ-1b及其制备方法 | |
| CN103012578B (zh) | 一种重组猪白细胞介素2及其编码基因和表达方法 | |
| CN103509100B (zh) | 一种白细胞介素‑1受体拮抗剂突变体 | |
| CN101897953B (zh) | 无创性高穿透性表皮生长因子及其应用 | |
| CN102993289A (zh) | 少棘蜈蚣多肽毒素kappa-SLPTX-Ssm4a及其基因和应用 | |
| CN113151182A (zh) | 基于msc的基因重组细胞的制备方法及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: BEIJING HUAAN KANGTAI BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Effective date: 20130122 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20130122 Address after: 100071 Fengtai District East Street, No. 20, Beijing Applicant after: INSTITUTE OF BIOTECHNOLOGY, ACADEMY OF MILITARY MEDICAL SCIENCES, CHINA Applicant after: BEIJING HUAAN KANGTAI BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Address before: 100071 Fengtai District East Street, No. 20, Beijing Applicant before: INSTITUTE OF BIOTECHNOLOGY, ACADEMY OF MILITARY MEDICAL SCIENCES, CHINA |
|
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20151207 Address after: 100071 Fengtai District East Street, No. 20, Beijing Patentee after: INSTITUTE OF BIOTECHNOLOGY, ACADEMY OF MILITARY MEDICAL SCIENCES, CHINA Patentee after: Chongqing nine health medical technology Co.,Ltd. Address before: 100071 Fengtai District East Street, No. 20, Beijing Patentee before: INSTITUTE OF BIOTECHNOLOGY, ACADEMY OF MILITARY MEDICAL SCIENCES, CHINA Patentee before: BEIJING HUAAN KANGTAI BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. |
|
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 100071 Fengtai District East Street, No. 20, Beijing Co-patentee after: Chongqing nine health medical technology Co.,Ltd. Patentee after: Institute of Bioengineering Military Medical Research Institute Academy of Military Sciences Address before: 100071 Fengtai District East Street, No. 20, Beijing Co-patentee before: Chongqing nine health medical technology Co.,Ltd. Patentee before: INSTITUTE OF BIOTECHNOLOGY, ACADEMY OF MILITARY MEDICAL SCIENCES, CHINA |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20190722 Address after: 100071 Fengtai District East Street, No. 20, Beijing Co-patentee after: Shenzhen Changzhi Information Consulting Co.,Ltd. Patentee after: Institute of Bioengineering Military Medical Research Institute Academy of Military Sciences Address before: 100071 Fengtai District East Street, No. 20, Beijing Co-patentee before: Chongqing nine health medical technology Co.,Ltd. Patentee before: Institute of Bioengineering Military Medical Research Institute Academy of Military Sciences |