CN101189257A - 脂质运载蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明的依据是发现本文中称为INSP181蛋白的人蛋白质是一种脂质运载蛋白。

Description

脂质运载蛋白
本发明涉及在本文中鉴别为脂质运载蛋白(lipocalin)的一种新型蛋白质(称为INSP181)及其衍生物，以及这种蛋白质、来自其编码基因的核酸序列在诊断、预防和治疗疾病中的应用。
本文中引用的所有出版物、专利、专利申请全部纳入本文作为参考。
发明背景
随着功能性基因组学时代的来临，药物递送方法正经历一场根本性革命。术语“功能性基因组学”指利用生物信息学手段确定感兴趣蛋白序列的功能的方法。随着序列数据产生的速度迅速超越研究实验室确定这些蛋白序列功能的能力，而日益需要这些方法。
随着生物信息学方法的强度和精确度提高，这些方法正迅速替代生物化学表征法中的常规技术。实际上，用于鉴定本发明的高级生物信息学方法现已能输出高度可信的结果。
由于序列数据的可获得性，各个研究所和商业组织正对这些序列数据进行研究，并在发展着的基础上取得了重大发现。然而，仍然需要继续鉴定和特征分析可作为药物研究和开发靶标的其它基因及其编码的多肽。
脂质运载蛋白是一种小分泌蛋白质，据信其参与了疏水性小分子的转运。脂质运载蛋白的特征是具有多功能域(multi-domain)结构，包括：典型性地参与结合疏水小分子的配体结合功能域；和典型性地参与结合某些推测的细胞表面受体的保守性细胞表面受体结合功能域，这些受体可以是一种以上脂质运载蛋白的共同受体；可形成大分子复合物的折叠结构的开放端，该复合物可能包含细胞表面受体。
尽管在序列水平上具有很大的多样性，脂质运载蛋白仍然是结构同系物：带有α-螺旋的单个8条反平行链β-圆桶结构构成了独特的“脂质运载蛋白支架”。圆桶的一端开口朝向溶剂并含有一个配体结合位点。连接串连链的一组四个环赋予了配体结合特异性。
该脂质运载蛋白家族关系最密切的成员都有三个特征性保守序列基序。该组成员包括：视黄醇结合蛋白、红紫素、视黄酸结合蛋白、α-2-微球蛋白、主要的尿蛋白、胆汁三烯结合蛋白、α-甲壳蓝蛋白、妊娠蛋白14、β-乳球蛋白、中性白细胞脂质运载蛋白和脉络丛蛋白。对外围脂质运载蛋白(outlierlipocalin)进行相同的归类，因为它们具有两个或更少保守序列基序，这些蛋白包括：气味结合蛋白(odorant-binding protein)、冯埃布纳氏(von Ebner’s)腺蛋白、前列腺组织特异蛋白(probasin)和阿弗洛底辛(aphrodisin)。
因此，脂质运载蛋白的鉴定，对于深入了解导致下文所述特定疾病状况和相关疾病状况的潜在途径以及开发治疗这些疾病的更有效基因和/或药物治疗，是极其重要的。
发明内容
本发明的依据是发现本文中称为INSP181蛋白的人蛋白质是一种脂质运载蛋白。
本发明依据发现本发明的多肽能上调T辅助细胞2(Th2)细胞因子，更具体说是白介素-10(IL-10)、白介素-4(IL-4)和白介素-5(IL-5)。已检测到INSP181多肽可影响由有丝分裂原伴刀豆球蛋白A(ConA)激活的人外周血单个核细胞(PBMC)分泌细胞因子。发现当用稀释度1∶10检测时(此试验为46.2μg)，此多肽能刺激由伴刀豆球蛋白A激活的人外周血单个核细胞分泌IL-10、IL-4和IL-5。而对IFN-γ、TNF-α或IL-2的水平未见影响。
此外，令人惊奇地发现本发明的多肽出乎意料地显示了只局限在皮肤活检组织样品、特别是牛皮癣皮肤活检组织上表达。简言之，除44份肠炎疾病的结肠和回肠活检样品和得自IL-18结合蛋白(IL18BP)临床试验的39份牛皮癣样品外，还用INSP181的特异性引物检测了一组约100份正常和患者组织样品的原代细胞和细胞系。结果见表3和表4所示和图12及图13中的图解说明。令人惊讶的是只在皮肤(0.16％的GAPDH)(表5，图12)和牛皮癣患者皮肤活检样品(19/39样品阳性)(表4，图13)中检测到低水平的INSP181表达。用外显子4/6特异性的第二对引物(外显子4的正向引物和外显子6的反向引物)确证了此种皮肤特异性。
第一方面，本发明提供了一种多肽，该多肽：
i)含有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：18、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：66或SEQ ID NO：70所列的氨基酸序列或由这些序列组成的氨基酸序列；
ii)是以上序列的片段，其为一种脂质运载蛋白，或含有与(i)所述一种或多种多肽共同的抗原决定簇；或
iii)是(i)或(ii)所述多肽的功能等价物。
本发明第一方面的多肽优选包含SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：24所列的氨基酸序列或由其组成，是具有脂质运载蛋白功能的片段，或具有这种多肽共同的抗原决定簇；或是这种多肽的功能等价物。
具有SEQ ID NO：2所列序列的多肽在下文中称为“INSP181外显子1多肽”。具有SEQ ID NO：4所列序列的多肽在下文中称为“INSP181外显子2多肽”。具有SEQ ID NO：6所列序列的多肽在下文中称为“INSP181外显子3多肽”。具有SEQ ID NO：8所列序列的多肽在下文中称为“INSP181-SV1外显子3多肽”。具有SEQ ID NO：10所列序列的多肽在下文中称为“INSP181-SV1外显子4多肽”。具有SEQ ID NO：12所列序列的多肽在下文中称为“INSP181外显子4多肽”。具有SEQ ID NO：14所列序列的多肽在下文中称为“INSP181外显子5多肽”。具有SEQ ID NO：16所列序列的多肽在下文中称为“INSP181外显子6多肽”。
SEQ ID NO：2、4、6、12、14和16组合产生SEQ ID NO：18。具有SEQ ID NO：18所列序列的多肽在下文中称为“INSP181多肽”。
SEQ ID NO：2、4、8、10、14和16组合产生SEQ ID NO：24。具有SEQID NO：24所列序列的多肽在下文中称为“INSP181-SV1多肽”。INSP181-SV1蛋白在外显子4起始处含有插入的25个氨基酸。
鉴定到的第二个INSP181-SV1克隆(INSP181-SV1-多态物)得自含有INSP181-SV1cDNA的来自唾液腺、肾上腺、眼和Stratagene通用参考RNA模板的cDNA库。此克隆中含有导致N92T和G114S氨基酸取代的核苷酸A275C和G340A置换。推测这些取代导致了INSP181序列的多态性。
具有SEQ ID NO：36所列序列的多肽在下文中称为“INSP181外显子3N92T多态性多肽”，其含有N92T氨基酸取代。具有SEQ ID NO：38所列序列的多肽在下文中称为“INSP181-SV1外显子3 N92T多态性多肽”，其含有N92T氨基酸取代。
具有SEQ ID NO：40所列序列的多肽在下文中称为“INSP181 N92T多态性多肽”。联合SEQ ID NO：2、4、36、12、14和16产生SEQ ID NO：40。
具有SEQ ID NO：44所列序列的多肽在下文中称为“INSP181-SV1 N92T多态性多肽”。组合SEQ ID NO：2、4、38、10、14和16产生SEQ ID NO：44。
具有SEQ ID NO：56所列序列的多肽在下文中称为“INSP181-SV1外显子4G114S多态性多肽”，其含有G114S氨基酸置换。
具有SEQ ID NO：58所列序列的多肽在下文中称为“INSP181-SV1G114S多态性多肽”。组合SEQ ID NO：2、4、8、56、14和16产生SEQ IDNO：58。
虽然申请人不希望受理论的束缚，但仍假定INSP181多肽、INSP181-SV1多肽、INSP181 N92T多态性多肽、INSP181-SV1 N92T多态性多肽和INSP181-SV1 G114S多态性多肽可在其N-末端包含一个长20个氨基酸的信号肽。
没有该假定信号序列的INSP181多肽和INSP181-SV1多肽的外显子1如SEQ ID NO：20所列，在下文中称为“INSP181成熟外显子1多肽”。没有假定信号序列的INSP181多肽序列如SEQ ID NO：22所列，下文中称为“INSP181成熟多肽”.没有假定信号序列的INSP181-SV1多肽序列如SEQ IDNO：26所列，下文中称为“INSP181-SV1成熟多肽”。没有假定信号序列的INSP181 N92T多态性多肽序列如SEQ ID NO：42所列，下文中称为“INSP181N92T多态性成熟多肽”。没有假定信号序列的INSP181-SV1-N92T多态性多肽序列如SEQ ID NO：46所列，下文中称为“INSP181-SV1-N92T多态性成熟多肽”。没有假定信号序列的INSP181-SV1-G114S多态性多肽序列如SEQID NO：60所列，下文中称为“INSP181-SV1-N92T多态性成熟多肽”。
具有SEQ ID NO：66所列序列的多肽下文中称为“脂质运载蛋白功能域INSP181多肽”，其含有脂质运载蛋白功能域(domain)。具有SEQ ID NO：70所列序列的多肽下文中称为“脂质运载蛋白功能域INSP181-SV1多肽”，其含有剪接变体的脂质运载蛋白功能域。
本发明第一方面的多肽还可含组氨酸标签。优选此组氨酸标签位于多肽的C-末端。优选此组氨酸标签含1-10个组氨酸残基(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基)。更优选此组氨酸标签含6个组氨酸残基。因此优选的多肽为包含SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ IDNO：34、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：68和/或SEQ ID NO：72所列序列的多肽。
具有SEQ ID NO：28所列序列的多肽下文中称为“组氨酸标签INSP181多肽”。具有SEQ ID NO：30所列序列的多肽下文中称为“成熟组氨酸标签INSP181多肽”。具有SEQ ID NO：32所列序列的多肽下文中称为“组氨酸标签INSP181-SV1多肽”。具有SEQ ID NO：34所列序列的多肽下文中称为“成熟组氨酸标签INSP181-SV1多肽”。具有SEQ ID NO：48所列序列的多肽下文中称为“组氨酸标签INSP181 N92T多态性多肽”。具有SEQ ID NO：50所列序列的多肽下文中称为“成熟组氨酸标签INSP181 N92T多态性多肽”。具有SEQ ID NO：52所列序列的多肽下文中称为“组氨酸标签INSP181-SV1N92T多态性多肽”。具有SEQ ID NO：54所列序列的多肽下文中称为“成熟组氨酸标签INSP181-SV1 N92T多态性多肽”。具有SEQ ID NO：62所列序列的多肽下文中称为“组氨酸标签INSP181-SV1 G114S多态性多肽”。具有SEQID NO：64所列序列的多肽下文中称为“成熟组氨酸标签INSP181-SV1 G114S多态性多肽”。具有SEQ ID NO：68所列序列的多肽下文中称为“脂质运载蛋白功能域INSP181组氨酸标签多肽”，其包含带组氨酸标签的脂质运载蛋白。具有SEQ ID NO：72所列序列的多肽下文中称为“脂质运载蛋白功能域INSP181-SV1组氨酸标签多肽”，其包含带组氨酸标签的剪接变体的脂质运载蛋白功能域。
本文中所用术语“INSP181多肽”包括INSP181成熟外显子1多肽、INSP181多肽、成熟INSP181多肽、INSP181-SV1多肽、成熟INSP-SV1多肽、组氨酸标签INSP181多肽、成熟组氨酸标签INSP181多肽、组氨酸标签INSP181-SV1多肽、成熟组氨酸标签INSP181-SV1多肽、INSP181 N92多态性多肽、成熟INSP181 N92T多态性多肽、INSP181-SV1-N92T多态性多肽、成熟INSP181-SV1-N92T多态性多肽、组氨酸标签INSP181 N92T多态性多肽、成熟组氨酸标签INSP181 N92T多态性多肽、组氨酸标签INSP181-SV1 N92T多态性多肽、成熟组氨酸标签INSP181-SV1 N92T多态性多肽、组氨酸标签INSP181-SV1 G114S多态性多肽、INSP181-SV1 G114S多态性多肽、脂质运载蛋白功能域INSP181多肽和脂质运载蛋白功能域INSP181-SV1多肽及其组氨酸标签形式。包含脂质运载蛋白功能域的多肽(其包括N92T和G114S多态性的多肽)都属于本发明的范围。
INSP181和INSP181-SV1在第92位氨基酸都有相同的预计糖基化位点(图10)，该位点也是预测的N92T多态性的位点。第92位天冬酰胺的取代可以防止N-糖基化。糖部分的存在与否对INSP181多肽的功能具有重要影响。
我们还发现第90和181位半胱氨酸之间形成了二硫键。通过半胱氨酸残基间二硫键结合的本发明多肽也属于本发明的范围。
术语“脂质运载蛋白”指至少含有一个脂质运载蛋白功能域的分子。优选“脂质运载蛋白”可为含有一个检测的e-值小于0.1、0.01、0.001、0.0001、0.0002、0.00001、0.000001或0.0000001的脂质运载蛋白功能域的分子。
术语“脂质运载蛋白”优选是检测的e-值小于0.1、0.01、0.001、0.0001、0.0002、0.00001、0.000001或0.0000001，与Pfam入口的HMM构造相匹配的分子。
本发明上述任一方面的多肽优选具有脂质运载蛋白的功能。优选此脂质运载蛋白的功能域由INSP181氨基酸序列的第41-189位残基编码。此脂质运载蛋白功能域的序列见SEQ ID NO：66。
本发明的多肽还包括保留了脂质运载蛋白活性的片段，即此多肽包含图14所示(即aa 25-174，或aa 26-180，或aa 33-166)和图11所示(即aa 41-189)的脂质运载蛋白功能域以及含有形成二硫键的半胱氨酸残基的片段(即aa96-187)，或由它们组成。
本发明的另一多肽是位于INSP181的残基25与181之间的脂质运载蛋白功能域。就INSP181-SV1而言，其脂质运载蛋白的功能域位于残基25与206之间，包含SEQ ID NO：70所示序列。
“象脂质运载蛋白那样的功能”指此多肽包含的氨基酸序列或结构特征可被鉴定为蛋白质脂质运载蛋白家族多肽的保守特征，从而与全长野生型多肽的功能相比，这些多肽与其生物学伴侣的相互作用不会受到实质性的不利影响。具体说，我们指在此多肽特定位点存在的半胱氨酸可形成二硫键。
脂质运载蛋白可用作多种疾病状态的诊断和预后标志。可监测妊娠期间和包括癌症化疗、肾功能异常、心肌梗塞、关节炎和多发性硬化症在内的疾病的诊断或预后过程中AGP的血浆水平。临床上用视黄醇结合蛋白(RBP)作为肾脏肾小管重吸收的标志，用apo D作为巨囊性乳腺病(gross cysticbreast disease)的标志。
冯埃布纳氏腺蛋白也称为眼泪脂质运载蛋白，眼泪前白蛋白或VEGP。与其它脂质运载蛋白类似，VEGP是视黄醇或其它小疏水化合物的运载体。VEGP能在体外结合视黄醇，据信其在眼中具有抗微生物功能，部分是因为其能结合抑制溶菌酶活性的长链脂肪酸(Glasgow，1995 Arch.Clin.Exp.Ophthalmol.233：513-522)。此蛋白还能灭活包膜病毒，有助于脂质膜在眼中的表面伸展和/或保护上皮组织。
脂质运载蛋白家族的另一成员包括附睾视黄酸结合蛋白(ERBP)，它的三级结构与人血清中的视黄醇结合蛋白相同(Newcomer等，1990，J.Biol.Chem.265：12876-12879)。认为ERBP在精子通过附睾时的成熟过程中发挥了重要作用。已证明ERBP在体内和/或体外能结合广谱的类视黄醇，包括视黄醇(维生素A)、视黄醛、视黄醇乙酸酯、β紫罗兰酮、顺式类视黄醇、β-胡萝卜素、胆固醇、萜类化合物、β紫罗兰叉乙酸(β-lonylidene acetate)、视黄醇和视黄酸的长链酯(Flower，1996 Biochem.J.318：1-14)。已证明类视黄醇在细胞分化和增殖、视觉、生殖生物学和粘液分泌中发挥了重要作用。关于类视黄醇及其在疾病和维持内环境稳态中的作用综述参见Goodman，D.，1984 N.Engl.J.Med.310：1023-1031。
前列腺素D2合酶是脂质运载蛋白家族的成员，其通过催化前列腺素H2转变成前列腺素D2来参与大脑内前列腺素D2的合成。与其它脂质运输蛋白类似，PD2合酶是疏水性化合物的运载体。PD2合酶能在体外结合视黄醇，已提出其可作为分泌性类视黄醇的转运载体，使类视黄醇在多种体液内循环并将它们输送给它们的胞内转运体。一旦处于细胞内，类视黄醇与二聚体受体结合并最终在多种过程，例如形态发生、分化和有丝分裂，的调控中发挥生物学作用(Tanaka等，1997，同前)。
与脂质运载蛋白家族成员相关的其它活性包括：抗微生物、转运信息素、炎症的调控物、嗅觉和免疫应答的调节、神经系统发育调节和抗菌活性。
一种与免疫调节相关的脂质运载蛋白是嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)。NGAL以单体或二聚体二种形式，位于中性粒细胞的特定颗粒中(Bartsch等，1995 FEBS Letters 357：255-259)。NGAL作为典型的脂质运载蛋白能结合小疏水分子在亲水体液中转运。虽然NGAL的生理性配体还未鉴定到，但已证明其能结合细菌的趋化因子FMLP，提示该分子可结合亲脂性炎症介质(Bungaard等，1994 Biochem.Biophys.Res.Comm.202：1468-1475)。
本发明的依据是发现本发明的多肽能上调Th2细胞因子，更具体为白介素-10(IL-10)、白介素-4(IL-4)和白介素-5(IL5)。此外，还惊奇地发现本发明多肽出乎意外地显示了只限于在皮肤活检组织样品，特别是牛皮癣皮肤活检样品上表达。
可将免疫疾病分为以T辅助细胞1(Th1)或T辅助细胞2(Th2)占优势为特征的免疫疾病。药物可以影响Th1/Th2平衡以达到调节所讨论的自身免疫疾病的目的。
本文中所定义的Th1疾病选自克罗恩病(Crohn’s disease)、I型糖尿病、桥本甲状腺炎(Hashimoto’s disease)、Graves病(甲状腺炎)、牛皮癣、Th1皮肤疾病例如牛皮癣或过度角化皮肤病、类风湿关节炎、增殖和新月体肾小球肾炎(crescentic form of glomerulonephritis)、多发性硬化症、后色素层(葡萄膜)炎、伤口愈合和/或肉样瘤病。
Th1皮肤疾病优选牛皮癣。
过度角化皮肤病优选牛皮癣、红糠疹和/或汗孔角化病。
本文所定义的Th2疾病选自：变态反应，如过敏性鼻炎、哮喘、Th2皮肤疾、扁平红苔癣(lichen rubber planus)、慢性鼻窦炎、赛塞利综合征、癌症、光化性角化病、丙型肝炎、溃疡性结肠炎、膜性肾小球肾炎和/或病毒感染。
优选的Th2皮肤疾病选自：特应性皮炎、接触性皮炎、与诸如镍或金接触性变态反应、皮肤T细胞淋巴瘤、特应性湿疹、急性湿疹和/或慢性湿疹。
优选的特应性皮炎为急性特应性皮炎。
优选的癌症选自皮肤T细胞淋巴瘤、鳞状上皮细胞癌和/或基底细胞癌。
不希望受理论的束缚，本发明多肽单独或作为融合蛋白的一部分、和/或其片段可以使T细胞细胞因子从Th1型转变为Th2型。
因此，可用本发明多肽单独或作为融合蛋白的一部分、和/或其片段来治疗Th1疾病。
不希望受理论的束缚，拮抗剂，例如针对本发明多肽的抗体可以使T细胞细胞因子从Th2型转变为Th1型。
因此可用这种拮抗剂，例如针对本发明多肽的抗体来治疗Th2疾病。例如，增强Th2免疫应答和细胞因子(例如IL-4、IL-5和IL-13)的加工(elabration)在诱发变态反应和哮喘中起作用(Ngoc等Curr Opin Allergy Clin Immunol.2005年4月；5(2)：161-6.)。因此，可用拮抗剂，例如针对本发明多肽的抗体来治疗哮喘和/或变态反应。
除了靶向细胞(免疫)机制外，可通过影响伴有IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α或IFN-γ水平提高的1型占优势细胞因子的不平衡性，以体液免疫调节来治疗牛皮癣。实现此目的可通过给予外源性缺乏的反调节2型细胞因子例如IL-4、IL-10和IL-11，驱使潜在的产生1型细胞因子的T细胞分化而产生2型细胞因子，从而刺激正常免疫应答中的2型T淋巴细胞内源性分化。不希望受理论的束缚，认为本发明多肽能够以此相似方式发挥作用。
已知能调节细胞因子产生的药物，例如IL-4或IL-10，并且认为可通过给予重组细胞因子例如IL-4、IL-10和IL-11来治疗牛皮癣(Schleyer等，J EurAcad Dermatol Venereol.2005年1月；19(1)：1-20)。
例如，在用不同剂量重组IL-4的初期1b研究中表现出显著的抗牛皮癣效应(Schleyer等)。22位患者中20位患者完成了每周注射5种不同剂量的IL-4共6个星期治疗期的研究，一位患者出现II级不良反应。在6周内18位患者的PASI减少了60-80％并在6周随访期间无反弹。牛皮癣的改善是剂量依赖性的，并伴有皮肤浸润细胞减少和表皮结构正常化。这些早期数据提示通过免疫衍生特异性影响最近活化的T细胞来治疗牛皮癣可能是一种非常成功的方法。
牛皮癣病灶中存在表皮IL-10表达的相对缺乏。这种Th2细胞因子是APC功能例如T细胞增殖的强效抑制剂。它还能抑制包括IFN-γ和TNF-α在内的I型细胞因子的产生从而在控制皮肤炎症反应中发挥重要作用。
象常规治疗治疗(例如延胡索酸酯衍生物、局部应用维生素D3同系物和紫外线照射)那样，可通过上调内源性IL-10而发挥作用，认为IL-10的全身给药可通过相对重建细胞因子的平衡有效治疗牛皮癣。
研究表明可用本发明的脂质运载蛋白治疗以下疾病：
视觉障碍(如夜盲症)、免疫系统疾病(如自身免疫性疾病)、炎症、炎性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎(UC)、节段性回肠炎(克罗恩病CD)、直肠炎、细胞增殖疾病、癌症(如乳腺癌、皮肤T细胞淋巴瘤、鳞状上皮细胞癌和/或基底细胞癌)、微生物感染(如病毒、细菌和真菌感染)、肺气肿、皮肤病(如Th1皮肤病如牛皮癣或过度角化皮肤病；Th2皮肤病如特应性皮炎、接触性皮炎、对诸如镍和金的接触性变态反应、皮肤T细胞淋巴瘤、特应性湿疹、急性湿疹和/或慢性湿疹)、生殖疾病(如不育，特别是男性不育)、肾功能不全、心肌梗塞、关节炎、多发性硬化症、巨囊性乳腺病、调节神经系统的发育、I型糖尿病、桥本甲状腺炎、甲状腺相关眼病(grave′s disease，甲状腺炎)、类风湿性关节炎、增殖和新月体肾小球肾炎、后葡萄膜炎、伤口愈合、和/或肉样瘤病、红糠疹和/或汗孔角化病、变态反应例如过敏性鼻炎、哮喘、扁平红苔癣、慢性鼻窦炎、赛塞利综合征、光化性角化病、丙型肝炎、溃疡性结肠炎、膜性肾小球肾炎和/或病毒感染。
推测INSP181可能属于免疫促成素(immunocalin)亚家族，具有免疫促成素成员的功能，更具体是glycodelin(参见综述Lgdberg和Wester.BiochimBiophys Acta.2000 1482(1-2)：284-97)。此家族的成员由人基因组9号染色体q32-34区域中的基因簇编码(INSP181为q34区中)。Glycodelin参与受精、免疫调节和分化。可检测到glycodelin的三种主要同工型(GdA、GdS和GdF)，它们具有特定的功能，突出了糖基化对该免疫促成素亚家族生物学活性的重要性。
WO02/053701公开了可用脂质运载蛋白核酸和多肽(更具体而言为人EP17基因)产生雄性不育小鼠模型以用于发现药物的筛选和治疗不育相关疾病。DE19807389公开了可用于治疗癌症的抗glycodelinA单克隆抗体。
优选至少用以下一种试验来验证本发明多肽单独或作为融合蛋白的一部分、其片段和/或其拮抗剂的活性：
a)如Odashiro等综述的皮肤癌模型(Drug Discovery Today：DiseaseModels 2005；出版中)，或
b)如Gutermuth等综述的接触性皮炎或特应性湿疹模型(DrugDiscovery Today：Disease Models 2005；出版中)，或
c)如Zheng和Zhu综述的特应性皮炎模型(Curr Allergy Asthma Rep.2005年7月；5(4)：291-7)，或
d)Jamieson等公开的D6小鼠模型(Nat Immunol.2005年4月；6(4)：403-11)，或
e)实施例5中所述的测定ConA激活PBMC分泌细胞因子的试验。更具体说，如果调节了以下至少一种细胞因子，则验证了本发明多肽单独或作为融合蛋白的一部分、其片段和/或其拈抗剂的活性：IL-4、IL-5和/或IL-10。优选能调节两种(如IL-4和IL-5；IL-4和IL-10；或IL-5和IL-10)或所有三种细胞因子。优选本发明多肽单独或作为融合蛋白的一部分、和/或其片段能上调一种或多种上述细胞因子。优选拮抗剂，例如针对本发明多肽的抗体能下调一种或多种上述细胞因子。
本发明多肽例如INSP181的活性可用本发明中所述或本技术领域所熟知的任何方法进行评价。
本发明第一方面的多肽还可含一组氨酸标签。优选该组氨酸标签位于多肽的C-末端。优选该组氨酸标签包含1-10个组氨酸残基(例如：1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基)。更优选该组氨酸标签含6个组氨酸残基。
本发明的“抗原决定簇”可以是本发明多肽的一部分，其能与抗体结合位点或T-细胞受体(TCR)相结合。或者，“抗原决定簇”可以是本发明多肽表面上的一个能与一个抗体分子结合的位点。通常抗原具有几个或多个不同的抗原决定簇，并能与多种不同特异性的抗体反应。优选对本发明多肽具有免疫特异性的抗体。优选此抗体对不是融合蛋白部分的本发明多肽具有免疫特异性。优选此抗体对INSP181、INSP181-SV或其片段具有免疫特异性。抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团，如氨基酸或糖侧链组成，可具有特异的三维结构特征和特异的电荷特征。优选“抗原决定簇”指本发明多肽上具有抗原性(即能诱导特异性免疫应答)的特定化学基团。
本发明第二方面提供纯化的编码本发明第一方面多肽的核酸分子。
术语“纯化的核酸分子”优选指如下的本发明的核酸分子：(1)已经分离去掉了至少50％从来源细胞分离总核酸时天然存在的天然蛋白质、脂质、碳水化合物或其它物质，(2)此“纯化的核酸分子”不与其天然连接的所有多聚核苷酸或其一部分相连，(3)操作性连接于不与其天然相连的多聚核苷酸，或(4)不是天然产生的较大多聚核苷酸序列的一部分。本发明分离的核酸分子优选基本上不含任何其它污染性核酸，或其天然环境中存在的其它污染物，它们的存在会干扰其在多肽生产中的应用，或干扰其治疗、诊断、预防或研究应用。在一优选实施方式中，特地将基因组DNA从本发明范围中排除。优选将大于10kbp(千碱基对)、50kbp、100kbp、150kbp、200kbp、250kbp或300kbp的基因组DNA从本发明范围中特地排除。优选的“纯化核酸分子”只包括cDNA。
优选所述纯化核酸分子由如下氨基酸序列组成或包含如下氨基酸序列：SEQ ID NO：1(编码INSP181外显子1多肽)、SEQ ID NO：3(编码INSP181外显子2多肽)、SEQ ID NO：5(编码INSP181外显子3肽)、SEQ ID NO：7(编码INSP181-SV1外显子3多肽)、SEQ ID NO：9(编码INSP181-SV1外显子4多肽)、SEQ ID NO：11(编码INSP181外显子4多肽)、SEQ ID NO：13(编码INSP181外显子5多肽)、SEQ ID NO：15(编码INSP181外显子6多肽)、SEQID NO：17(编码INSP181多肽)、SEQ ID NO：19(编码INSP181成熟外显子1多肽)、SEQ ID NO：21(编码INSP181成熟多肽)、SEQ ID NO：23(编码INSP181-SV1多肽)、SEQ ID NO：22(编码成熟INSP181-SV1多肽)、SEQ IDNO：27(编码组氨酸标签INSP181多肽)、SEQ ID NO：29(编码成熟组氨酸标签INSP181多肽)、SEQ ID NO：31(编码组氨酸标签INSP181-SV1多肽)、SEQ ID NO：33(编码成熟组氨酸标签INSP181-SV1多肽)、SEQ ID NO：35(编码INSP181-外显子3 N92T多态性多肽)、SEQ ID NO：37(编码INSP181-SV1外显子3 N92T多态性多肽)、SEQ ID NO：39编码INSP181-N92T多态性多肽)、SEQ ID NO：41(编码成熟INSP181-N92T多态性多肽)、SEQ ID NO：43(编码INSP181-SV1 N92T多态性多肽)、SEQ IDNO：45(编码成熟INSP181-SV1 N92T多态性多肽)、SEQ ID NO：47(编码组氨酸标签INSP181 N92T多态性多肽)、SEQ ID NO：49(编码成熟组氨酸标签INSP181 N92T多态性多肽)、SEQ ID NO：51(编码组氨酸标签INSP181-SV1 N92T多态性多肽)、SEQ ID NO：53(编码成熟组氨酸标签INSP181-SV1 N92T多态性多肽)、SEQ ID NO：55(编码INSP181-SV1外显子4 G114S多态性多肽)、SEQ ID NO：57(编码INSP181-SV1 G114S多态性多肽)、SEQ ID NO：59(编码成熟INSP181-SV1 G114S多态性多肽)、SEQ IDNO：61(编码氨酸尾INSP181-SV1 G114S多态性多肽)、SEQ ID NO：63(编码成熟组氨酸标签INSP181-SV1 G114S多态性多肽)、SEQ ID NO：65(另一种外显子2核苷酸)、SEQ ID NO：67(编码脂质运载蛋白功能域INSP181多肽)、SEQ ID NO：69(编码脂质运载蛋白功能域INSP181组氨酸标签多肽)、SEQ IDNO：71(编码脂质运载蛋白功能域INSP181-SV1多肽)和/或SEQ ID NO：73(编码脂质运载蛋白功能域INSP181-SVl组氨酸标签多肽)。
本发明第三方面提供能在高严格条件下与本发明第二方面的核酸分子杂交的纯化核酸分子。高严格条件定义为在含50％甲酰胺、5xSSC(150mMNaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5x登哈特溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml变性剪切鲑鱼精子DNA的溶液中42℃培育过夜，随后在约65℃用0.1X SSC洗涤滤膜。
本发明第四方面提供含本发明第二或第三方面核酸分子的载体，例如表达载体。
本发明第五方面提供用本发明第四方面的载体转化的宿主细胞。
本发明第六方面提供能与本发明第一方面多肽特异结合，并优选能抑制本发明第一方面多肽转运小疏水分子的配体。
本发明多肽的配体可有多种形式，包括天然或修饰的底物、酶、受体、有机小分子例如分子量达2000Da，优选800Da或更小分子量的天然或合成的有机小分子、模拟肽、无机分子、肽、多肽、抗体、上述物质的结构或功能模拟物。
这些化合物可以用本文公开的试验和筛选方法进行鉴定。
本发明第七方面提供一种能有效改变编码本发明第一方面多肽的天然基因的表达或调节本发明第一方面多肽活性的化合物。
本发明第七方面的化合物可增强(激动)或降低(拈抗)所述基因的表达水平或所述多肽的活性。
重要的是INSP181多肽的功能鉴定可以设计出鉴定能有效治疗和/或诊断疾病的化合物的筛选方法。可用这种方法鉴定本发明第六和第七方面的配体和化合物。这些方法属于本发明的范围。
已鉴定为本发明多肽激动剂的化合物可用于在体外或体内运输疏水小分子。例如，激动性化合物可作为特定细胞培养基成分以递送疏水小分子进入细胞和防止它们被血清中的酶降解。
可用INSP181、INSP181-SV1、INSP181 N92T多态物、INSP181-SV1N92T多态物和/或INSP181-G114S多态物的拮抗剂(如抗体)来治疗癌症，更具体说治疗影响大脑、卵巢、睾丸、脾脏、胰腺、子宫、血液和/或肺的癌症。
优选用INSP181-SV1、INSP181-SV1 N92T多态物或INSP181-SV1G114S多态物(源自唾液腺、肾上腺和眼cDNA)的拮抗剂(如抗体)来治疗癌症，更具体说治疗影响唾液腺、肾上腺和/或眼的癌症。
本发明的另一方面是利用INSP181基因或多肽作为靶标来筛选候选的药物调节剂，尤其是对抗脂质运载蛋白相关疾病具有活性的候选药物。
本发明还有一方面是筛选治疗脂质运载蛋白相关疾病的化合物的方法，包括检测化合物与INSP181基因或多肽，或其片段结合的能力。
本发明还有一方面是筛选治疗脂质运载蛋白相关疾病化合物的方法，包括检测化合物对INSP181基因或多肽，或其片段活性的调节。
本发明的第八方面提供本发明第一方面的多肽，或本发明第二或第三方面的核酸分子，或本发明第四方面的载体，或本发明第五方面的宿主细胞，或本发明第六方面的配体，或本发明第七方面的化合物在治疗和诊断中的用途。
可用本发明的分子制造用于治疗某些疾病的药物，这些疾病包括但不局限于：视觉障碍(如夜盲症)、免疫系统疾病(如自身免疫性疾病)、炎症、炎性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎(UC)、节段性回肠炎(克罗恩病，CD)、直肠炎、细胞增殖疾病、癌症(如乳腺癌、皮肤T细胞淋巴瘤、鳞状上皮细胞癌和/或基底细胞癌)、微生物感染(如病毒、细菌和真菌感染)、肺气肿、皮肤病(如Th1皮肤病如牛皮癣或过度角化皮肤病；Th2皮肤病如特应性皮炎、接触性皮炎、对诸如镍和金的接触性变态反应、皮肤T细胞淋巴瘤、特应性湿疹、急性湿疹和/或慢性湿疹)、生殖疾病(如不育，特别是男性不育)、肾功能不全、心肌梗塞、关节炎、巨囊性乳腺病、调节神经系统的发育、I型糖尿病、桥本甲状腺炎、甲状腺相关眼病(Grave’s病，甲状腺炎)、类风湿性关节炎、增殖和新月体肾小球肾炎、多发性硬化症、后葡萄膜炎、伤口愈合、和/或肉样瘤病、红糠疹和/或汗孔角化病、变态反应例如过敏性鼻炎、哮喘、扁平红苔癣、慢性鼻窦炎、赛塞利综合征、光化性角化病、丙型肝炎、溃疡性结肠炎、膜性肾小球肾炎和/或病毒感染。
也可用实施例中所述的试验鉴定治疗上有用的分子。
本发明的第九方面提供诊断患者疾病的方法，包括评估所述患者的组织中编码本发明第一方面多肽的天然基因的表达水平，或本发明第一方面多肽的活性，将所述表达水平或活性与对照作比较，当所述表达水平或活性与对照水平不同时则表明患有疾病。优选在体外实施这种方法。可用类似方法来监测对患者疾病的治疗处理，当在一段时间后该多肽或核酸分子的表达水平或活性向对照水平发生变化则表明疾病消退。
与未患病者相比或当皮肤患者接触变应原时，皮肤病患者如牛皮癣患者中能检测出较高水平的该脂质运载蛋白表达。例如，接触镍或金的患者(接触性变态反应)可检测到其中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)显著增加(Moller等Contact Dermatitis.1999年4月；40(4)：200-4；)。也可以在伤口愈合后检测到例如NGAL等肽/多肽的上调，这为牛皮癣和伤口愈合中这些肽/多肽的表达提供了解释(Sorensen等，J Immunol.2003年6月1；170(11)：5583-9.)。此外，在特征为上皮细胞分化失调的多种皮肤病例如牛皮癣、红糠疹和鳞状上皮细胞癌中可见到表皮中强烈诱生了NGAL(Mallbris等，Exp Dermatol.2002年12月；11(6)：584-91)。因此，Mallbris等的结论是：NGAL是人皮肤角质细胞分化失调的一种标志。
因此，本发明某些多肽的过量表达与疾病发展和预后相关。故可用本发明的多肽作为疾病发展和/或预后的标志。
据信与相应的“标准”哺乳动物(即无Th1疾病或Th2疾病的同种哺乳动物)相比，患Th1疾病或Th2疾病哺乳动物的特定组织含有显著更高水平的INSP181蛋白基因拷贝数，INSP181蛋白和编码INSP181蛋白的mRNA的水平也显著升高。当与无Th1疾病或Th2疾病的同种哺乳动物的血清/皮肤相比时，在患Th1疾病或Th2疾病的哺乳动物的特定体液(如血清、血浆、尿液、滑膜液和骨髓液)和/或皮肤中可检测到INSP181蛋白水平升高。因此本发明提供了一种用于诊断Th1或Th2疾病的方法，此方法涉及测定哺乳动物细胞，尤其是皮肤或体液中编码INSP181蛋白的基因的表达水平或基因拷贝数，将此基因表达水平或基因拷贝数与标准的INSP181蛋白表达水平或基因拷贝数作比较，若此基因表达水平或基因拷贝数升高超过标准值表明患有特定Th1或Th2疾病。
当已按照常规方法作出Th1和Th2疾病诊断时，本发明可用作预后指标。
“检测编码INSP181蛋白的基因的表达水平”意味着直接(例如检测或评价绝对蛋白水平或mRNA水平)或相对(例如与第二生物学样品中的INSP181蛋白水平或mRNA水平相比)地定性和定量检测或评价第一生物学样品中INSP181蛋白的水平或编码INSP181的mRNA水平。“检测编码INSP181蛋白的基因的拷贝数”意味着直接(例如检测或评价绝对基因拷贝数)或相对(例如与第二生物学样品中的INSP181蛋白基因拷贝数相比)地定性和定量检测或评估第一生物学样品中的基因拷贝数。
优选检测或评价第一生物学样品中的INSP181蛋白水平、mRNA水平、或基因拷贝数，并与标准的INSP181蛋白水平、mRNA水平、或基因拷贝数相比，所述标准得自无Th1或Th2疾病个体的第二生物学样品。或者，当采用此法作为预后指标时，第一和第二生物学样品得自患Th1或Th2疾病的个体，可测定相对表达水平或拷贝数以确定预后。本技术领域将会明白，一旦知道了标准的INSP181蛋白水平、mRNA水平、或基因拷贝数，可将其重复用作比较标准。
“生物学样品”指得自个体、细胞系、组织培养物或含有INSP181蛋白或mRNA的其它来源的任何生物学样品，优选得自皮肤。从哺乳动物获得组织活检样品和体液的方法是本领域熟知的。其中生物学样品包括mRNA时，组织活检样品是其优选的来源。
可用本发明检测哺乳动物的Th1或Th2疾病。具体说本发明可在诊断或预后本发明所述的哺乳动物Th1或Th2疾病类型时使用。优选的哺乳动物包括猴、猿、猫、狗、牛、猪、马、兔和人。尤其优选人。
一种检测本发明第一方面多肽的可能方法包括步骤：(a)在适于形成配体-多肽复合物的条件下，使本发明第六方面的配体(如抗体)与生物学样品接触；和(b)检测所述复合物。
技术人员读者知道有许多不同于本发明第九方面的方法，例如核酸与短探针杂交、点突变分析、聚合酶链反应(PCR)扩增等方法和利用抗体检测异常蛋白水平的方法。可用类似方法对患者的疾病治疗进行短期或长期监测。本发明还提供用于诊断疾病的这些方法中的试剂盒。
本发明的第十方面提供了本发明第一方面的多肽作为脂质运载蛋白的用途。
可利用本发明的多肽结合例如血液或组织中的小脂肪酸，调节它们的生物学功能。可利用本发明多肽将类视黄醇或类固醇运送给其受体，具体是作为乳腺癌、肺气肿和皮肤病治疗的一部分并在再生中发挥重要作用。其它应用包括调节抗炎症反应、抗微生物活性，以及作为酶功能增强剂或本身作为酶-样分子。
可利用本发明多肽的抗微生物特性。抗微生物特性的检测可利用培养的细胞在体外进行或通过给予适当动物模型本发明权利要求所主张的分子在体内进行。检测抗微生物活性的试验是微生物特异性的，且为本领域普通技术人员所熟知。例如检测体内抗微生物活性可通过给小鼠腹膜内接种位于适当肉汤培养基中的病原微生物。接种后短期内给予含本发明多肽的组合物并记录之后7天内的死亡数。给药通常为静脉内、皮下、腹膜内或口服给药。参见例如Musiek等，Antimicrobial Agents Chemother 3：40，1973，所详述的体内和体外检测抗微生物药物方法。
本发明多肽的活性可用多种检测与疏水小分子结合能力的试验来检测。这些试验包括但不限于荧光强度变化检测试验(Cogan等，Eur.J.Biochem.65：71-78，1976)和水溶性化合物的平衡透析试验(Hase等，J.Biochem.79：373-380，1976)。
本发明分子的其它用途包括作为递送系统转运和/或稳定亲脂小分子。例如可用本发明分子对亲脂小分子进行微胶囊包裹，形成活性药物制剂，从而保护该制剂免受肠道的极端pH、接触强消化酶的破坏和克服活性成分不能渗透通过胃肠道膜。该药物制剂胶囊化的其它优点包括防止过早激活该制剂或免受胃刺激。
近年来利用脂质运载蛋白骨架来工程改造蛋白质使之对非天然配体具有规定的特异性。这样设计的脂质运载蛋白可看作模拟抗体而因此命名为“anticalin”(参见Skerra，Biochim Biophys Acta.2000年10月，18；1482(1-2)：337-50的综述)。因此本发明多肽可用于合成“anticalin”。
本发明第十一方面提供一种药物组合物，其包括本发明第一方面的多肽，或本发明第二或第三方面的核酸分子，或本发明第四方面的载体，或本发明第五方面的宿主细胞，或本发明第六方面的配体，或本发明第七方面的化合物；以药物学上可接受运载体。
本发明第十二方面提供本发明第一方面的多肽，或本发明第二或第三方面的核酸分子，或本发明第四方面的载体，或本发明第五方面的宿主细胞，或本发明第六方面的配体，或本方面第七方面的化合物在制造诊断或治疗以下疾病的药物中的用途，这些疾病包括：视力疾病(例如夜盲症)、免疫系统疾病(例如自身免疫疾病)、炎症、炎性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎(UC)、克罗恩病(CD)、直肠炎、细胞增殖疾病、癌症(例如乳腺癌)、微生物感染(例如病毒、细菌和真菌感染)、肺气肿、皮肤病、生殖疾病(例如不育，尤其是男性不育)、肾功能障碍、心肌梗塞、关节炎和多发性硬化症、巨囊性乳腺病和调节神经系统的发育。
本发明第十三方面提供治疗患者疾病的方法，包括给予患者本发明第一方面的多肽，或本发明第二或第三方面的核酸分子，或本发明第四方面的载体，或本发明第五方面的宿主细胞，或本发明第六方面的配体，或本方面第七方面的化合物。
本发明的多肽可单独使用，作为融合蛋白(如Fc融合蛋白)中的组分，和/或与一种或多种用作Th1下调剂的药物联用。其拈抗剂，例如针对本发明多肽的抗体，可单独使用，或与一种或多种用作Th2下调剂的药物联用。
具有用作Th1和Th2下调剂的药物是本领域熟知的，不限于以下所列药物。
优选的用作Th1下调剂的药物选自：细胞免疫调节剂、体液免疫调节剂、多肽T、牝牛分枝杆菌、他佐罗汀、贝沙罗汀、曲格列酮、利阿唑、冉巴唑(rambazole)、精氨酸、一氧化氮、环孢霉素、氨甲喋呤、维生素D3类似物、类视黄醇、皮质激素、蒽林、焦油、补骨脂素加UVA(PUVA)、姜黄、多足蕨(polypodium)、leucotomas、糖皮质激素(例如泊尼松，predisone)、和/或Th1/Th2(适应原)平衡剂如大豆异黄酮、植物甾醇、植物甾醇甙，益生菌(probiotics)和/或孕烯二酮。
优选的细胞免疫调节剂选自：DAB389IL-2、霉酚酸吗乙酯、VX-497、来氟米特、依法利珠(efalizumab)、OKTcdr4a、CTLA4-Ig、MEDI 507、LFA3TIP、达(克)珠单抗、巴利昔单抗、他克莫司、吡美莫司和/或西罗莫司。
优选的体液免疫调节剂选自：IL-4、IL-10、IL-11、英夫利昔单抗、依那西普、奥那西普和/或阿达木单抗。
优选的用作Th2下调剂的药物选自：趋化因子受体CCR3或CCR4的拮抗剂(例如抗体)、CXCR4拮抗剂、抗-TARC、黏附分子VLA-4的抑制剂、PPAR-γ激动剂、环戊烯酮前列腺素、噻唑烷二酮(thiazolodinediones)、SB203580、SB239063、RWJ67657、维生素D3类似物、糖皮质激素、分枝杆菌、抗-IL-5/IL-13/IL-9、可溶性IL-4R、CD80/86抑制剂、ICOS配体、Toll-样受体(TLR)-9激动剂如CpG DNA、CTLA4-Ig、反义GATA3寡核苷酸、分枝杆菌卡介苗(BCG)、牝牛分枝杆菌、抗-IgE、β受体激动剂、皮质激素、紫苏子、槲皮(黄)素、黄色黄素、异黄酮、糖皮质激素例如泊尼松，和/或Th1/Th2(适应原)平衡剂如大豆异黄酮、植物甾醇、植物甾醇甙、益生菌和/或孕烯二酮。
对于体内编码本发明第一方面多肽的天然基因表达和本发明第一方面多肽的活性低于健康人的表达水平或活性的疾病患者，给予该患者的多肽、核酸分子、配体或化合物应为激动剂。相反，对于体内(编码)该多肽的天然基因表达和该多肽的活性高于健康人的表达水平或活性的疾病患者，给予该患者的多肽、核酸分子、配体或化合物应为拮抗剂。这种拮抗剂的例子包括反义核酸分子、核酶和配体，例如抗体。
INSP181多肽是脂质运载蛋白，因此对多种疾病具有作用。对INSP181多肽的拮抗剂特别感兴趣，因为它们提供了调节这些疾病的方法。
本发明第十四方面提供转基因或基因敲除非人动物，它们经转化而能表达更高，更低水平或不表达本发明第一方面多肽。这种转基因动物对疾病研究是非常有用的模型，还可用于鉴定能有效治疗或诊断这类疾病的化合物的筛选方案中。
本文中所用“功能等价物”指具有与本发明多肽或核酸分子基本相似的功能或结构特征的蛋白质或核酸分子。蛋白质的功能等价物可含有修饰，这取决于该修饰对发挥其特定功能的必要性。术语“功能等价物”意味包括分子化学衍生物、片段、突变体、杂交体、变异体、或类似物。
优选的“功能等价物”为具有本发明多肽一种或多种功能活性的蛋白质或核酸分子。
优选的“功能等价物”为在检测生物学活性和功能的适当试验中显示具有与INSP181或其片段基本相似活性的蛋白质或核酸分子。优选的“功能等价物”为在检测生物学活性和功能的适当试验中显示比INSP181或其片段具有相同的或更高活性的蛋白质或核酸分子。优选的“功能等价物”为在检测生物学活性和功能的适当试验中显示具有INSP181或其片段的50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、100％或更高活性的蛋白质或核酸分子。
优选的“功能等价物”为在体内或体外能显示与本发明多肽基本相似活性的蛋白质或多肽。优选的“功能等价物”为能以本发明多肽相应部分基本相似的方式与其它胞内或胞外分子相互反应的蛋白质或多肽。例如在免疫试验中“功能等价物”应能够减少抗体与本发明多肽的对应肽(即该肽的氨基酸经过修饰而获得的“功能等价物”)结合或与本发明多肽本身的结合，其中所述抗体为抗本发明多肽的对应肽的抗体。等摩尔浓度的功能等价物应能减少上述对应肽的结合至少约5％，优选减少约5-10％，更优选减少约10-25％，还要优选减少约25-50％，最优选减少约40-50％。
例如，功能等价物可具有全部功能或缺乏一种或多种活性功能。因此在本发明中，变异会影响功能，例如影响可反映多肽是否具有脂质运载蛋白功能域的多肽活性。
以下总结了为了实施本发明，而可利用的标准技术和程序。应认识到本发明不限于所述的具体方法、方案、细胞系、载体和制剂。也应认识到本文中所用术语只是为了描述具体实施方式不意味这些术语是限制本发明的范围。本发明的范围只受附带的权利要求书的限制。
在此说明书中使用了核苷酸和氨基酸的标准缩写。
除非另有指出，实施本发明将采用常规分子生物学、微生物学、重组DNA技术和免疫学技术，这些技术属于本领域技术人员所知范围。
这些技术在文献中有充分说明。例如特别适合参考的教课书包括：Sambrook的“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”(《分子克隆：实验室手册》，第二版(1989)；“DNA Cloning”(《DNA克隆》)，第I和II卷(D.NGlover编.1985)；“Oligonucleotide Synthesis”(《寡核苷酸合成》(，M.J.Gait编著.1984)；“Nucleic Acid Hybridization”(《核酸杂交》，B.D.Hames&S.J.Higgins编著.1984)；“Transcription and Translation”(《转录和翻译》，B.D.Hames&S.J.Higgins编著1984)；“Animal Cell Culture”(《动物细胞培养》，R.I.Freshney编著.1986)；“Immobilized Cells and Enzymes”(《固定化细胞和酶》，IRL Press，1986)；B.Perbal的“Practical Guide to Molecular Cloning”(《分子克隆实践指南》，1984)；“the Methods in Enzymology series”(《酶学系列方法》，Academic Press，Inc.)专卷154&155；“Gene Transfer Vectors forMammalian Cells”(《哺乳动物细胞的基因转运载体》，J.H.Miller和M.P.Calos编著1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；“Immunochemical Methods inCell and Molecular Biology”(《细胞和分子生物学中的免疫化学方法》，Mayer和Walker，编著.1987，Academic Press，London)；Scopes，(1987)“ProteinPurification：Principles and Practice”(《蛋白质纯化：原理和实践》，第二版，Springer Verlag，N.Y.)；和“Handbook of Experimental Immunology”(《实验免疫学手册》，第I-IV卷，D.M.Weir和C.C.Blackwell编著1986)。
本文所用术语“多肽”包括含有两个或多个通过肽键或修饰的肽键(即肽的电子等排体)彼此相连的氨基酸的多肽或蛋白质。该术语不仅指短链(肽和寡聚肽)还指长链(蛋白质)。
本发明多肽可以是成熟蛋白形式，或可以是通过剪切前-、原-或前原-部分活化该前-、原-或前原-蛋白而产生的成熟多肽。在这种多肽中，前-、原-或前原-序列可以是引导序列或分泌序列或者是可用于成熟多肽序列纯化的序列。
本发明第一方面的多肽可构成融合蛋白的一部分。例如通常优选包含一个或多个额外的氨基酸序列，这些序列包括分泌或引导序列、原-序列、有助于纯化的序列、或可赋予蛋白质更高稳定性(例如在生产重组产物时)的序列。或者或此外，可将所述成熟多肽与另一化合物融合，例如与能增加多肽半衰期的化合物(例如聚乙二醇)融合。
具体说，该融合蛋白可包含一个或多个其它氨基酸序列和本发明多肽的片段。该片段优选脂质运载功能域，例如SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：70所列的序列，或SEQ ID NO：18的25-174氨基酸、26-180氨基酸、33-166氨基酸或41-189氨基酸，或SEQ ID NO：24的25-206氨基酸。
包含与INSP181多肽至少有85％序列同源性的本发明多肽优选为融合蛋白。这种融合蛋白可通过读框内克隆编码包含与INSP181多肽至少85％同源的序列的多肽的多核苷酸和异源蛋白编码序列而获得。
本文所用的术语“异源性”指非人INSP181多肽的其它任何多肽。例如异源性序列可包含在融合蛋白的N端或C端，包括膜结合蛋白的胞外区、免疫球蛋白的恒定区(Fc区)、多聚化区域、胞外蛋白结构域、信号序列、运输序列和用于亲和层析纯化的序列。
这些异源序列中的许多可从商品化表达质粒中获得，因为它们常被包含在融合蛋白中以赋予融合对比额外的性能，但不会损伤与其融合蛋白质的特定生物学活性(Terpe K，2003，Appl Microbiol Biotechnol，60：523-33)。这种额外性能的例子是延长其在体液中的半衰期、胞外定位、或通过由一段组氨酸形成的所谓“组氨酸标签”(Gentz等1989，Proc Natl Acad Sci USA，86：821-4)或通过流感血凝素蛋白的“HA”标签表位(Wilson等.1994，Cell，37：767-78)而易于纯化。当需要时，可通过蛋白酶解切割去除该异源性序列，例如在蛋白质和异源序列之间插入一个蛋白酶切割点，并使纯化的融合蛋白接触适合的蛋白酶。这些特点对于融合蛋白尤其重要，因为有利于它们的生产和在制备药物组合物中的应用。例如，在实施例中所用的蛋白(成熟INSP181多肽；SEQ ID NO：22)可通过融合于INSP181C末端的6组氨酸肽而纯化。当融合蛋白包含免疫球蛋白结构域时，可直接融合或通过1-3个氨基酸残基的短接头肽或更长的(例如长13个氨基酸残基)接头肽融合。例如，所述接头可以是加入到本发明多肽序列与免疫球蛋白序列之间的E-F-M(Glu-Phe-Met)三肽序列，或含Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met的13氨基酸接头序列。获得的融合蛋白具有改进的性能，例如在体液中停留时间延长(即半衰期增加)、特异性活性增强、表达水平提高，或有利于融合蛋白的纯化。
在一优选实施方案中，将所述蛋白与Ig分子的恒定区融合。优选与重链区，如人IgG1的CH2和CH3结构域，融合。Ig分子的其它同种型，如IgG2或IgG4同种型，或其它Ig类，如IgM或IgA类也适合用于产生本发明的融合蛋白。融合蛋白可以是单体或多聚体，异质或同质多聚体。
在还有一种优选实施方案中，所述功能性衍生物包含至少一个连接于一个或多个官能团的部分，其以氨基酸残基上的一个或多个侧链形式存在。优选该部分为聚乙二醇(PEG)部分，可用已知方法实施PEG化，例如WO99/55377中描述的方法。
该多肽可包含20个基因编码氨基酸以外的氨基酸，它们是通过天然过程(如翻译后加工修饰)或通过本领域所熟知的化学修饰技术加入的。本发明多肽中可存在的常用已知修饰有：糖基化、脂连接、硫酸化、γ羧化，例如谷氨酸残基、羟(基)化、ADP核糖基化。其它可能的修饰包括：乙酰化、酰化、酰胺化、与黄素共价连接、与haeme分子共价连接、与核苷酸或核苷酸衍生物共价连接、与脂衍生物共价连接、与磷脂酰肌醇共价连接、交联、环化、二硫键形成、脱甲基、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、形成GPI锚定、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白酶解加工、磷酸化、异戊烯化、消旋、硒基化(selenoylation)、由转运RNA介导的向蛋白质中加入氨基酸(如精氨酰化)、和遍在蛋白化。
修饰可发生在多肽的任何位点，包括多肽骨架、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。实际上，通过共价修饰封闭多肽的氨基或羧基末端或两个末端在天然产生的和合成的多肽中常见，本发明多肽中可存在这些修饰。
多肽中发生的修饰常取决于该多肽是如何形成的。对于重组制备的多肽，修饰的性质和程度大多数由特定宿主细胞的翻译后修饰能力和所述多肽氨基酸序列中存在的修饰信号所决定。例如不同类型的宿主细胞之间的糖基化模式不同。
可以任何合适的方式制备本发明多肽。这种多肽包括分离的天然产生的多肽(例如从细胞培养物中纯化)、重组产生的多肽(包括融合蛋白)、合成产生的多肽或者通过这些方法组合产生的多肽。
本发明第一方面的功能等价多肽可以与INSP181多肽的同源。如果两种多肽中的一种多肽的序列与另一多肽的序列具有足够高程度的相同性或相似性，本文中术语就称这两种多肽“同源(homologous)”。“相同”指对比的序列的任何特定位点处，序列之间的氨基酸残基相同。“相似”指对比序列的任何特定位点处，序列之间的氨基酸残基类型相似。不难计算相同和相似的程度。(“Computational Molecular Biology”《计算分子生物学》，Lesk，A.M.，编，Oxford University Press，New York，1988；“Biocomputing.Informatics andGenome Projects”《生物计算机信息学与基因组计划》，Smith，D.W.编，Academic Press，New York，1993；“Computer Analysis of Sequence Data”《序列数据的计算机分析》，第1部分，Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.编，HumanaPress，New Jersey，1994；“Sequence Analysis in Molecular Biology”《分子生物学中的序列分析》，von Heinje，G.，Academic Press，1987；以及“SequenceAnalysis Primer”《序列分析引物》，Gribskov，M.和Devereux，J.编，M StocktonPress，New York，1991)。
因此同源多肽包括INSP181多肽的天然生物学变体(例如产生该多肽的同一种动物的等位基因变体或地理学变体)和突变体(例如含氨基酸取代、插入或缺失的突变)。这种突变体包括一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)取代的多肽，这种取代的氨基酸残基可以是或不是由遗传密码所编码的。通常这种取代发生在Ala，Val，Leu和Ile之间；Ser和Thr之间；Asp和Glu酸性残基之间；Asn和Gln之间；Lys和Arg碱性残基之间；或Phe和Tyr芳香残基之间。特别优选的变体中几个氨基酸，即5-10、1-5、1-3、1-2个或只有一个氨基酸以任何组合的形式取代、缺失或插入。特别优选不改变蛋白质特性和活性的沉默取代、插入和缺失。在这点上也特别优选保守性取代。
这些突变体也包括含带有取代基团的一个或多个氨基酸残基的多肽。
按照本发明，任何取代优选“保守性”或“安全”取代，这种取代通常定义为引入化学特性充分相似的氨基酸的取代(例如碱性、正电荷氨基酸应用另一碱性正电荷氨基酸取代)以保持分子的结构和生物学功能。
文献提供了多种模型，在这些模型中可在蛋白序列和/或结构的统计学和物理化学研究基础上选择保守性氨基酸取代(Rogov SI和Nekrasov AN，2001)。蛋白设计实验表明，采用氨基酸的特定亚组可产生折叠的具有活性的蛋白质，这有助于“同义”氨基酸取代的分类，这种同义取代更易为蛋白质结构所容纳，并可用于检测功能和结构同系物和类似物(Murphy LR等，2000)。同义氨基酸分组和更优选的同义氨基酸分组见表1。
也可出于不同目的将特定的非保守性突变导入本发明多肽。能降低CD24-样蛋白的亲和力的突变可以提高其再使用和再循环的能力，可能提高其治疗能力(Robinson CR，2002)。可探索最终存在于本发明多肽中的免疫原性表位来开发疫苗(Stevanovic S，2002)，或者通过已知筛选突变方法修饰它们的的序列来消除这些表位从而提高蛋白质的稳定性，以及对它们进行校正(van den Burg B和Eijsink V，2002；WO 02/05146，WO 00/34317，WO98/52976)。
另外，模拟肽中包含的氨基酸衍生物优选的同义分组见表2中的定义。氨基酸衍生物的非穷尽罗列还包括：氨基异丁酸(Aib)、羟(基)脯氨酸(Hyp)、1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-COOH、二氢吲哚-2羧酸、4-二氟-脯氨酸、L-四氢噻唑-4-羧酸、L-高脯氨酸、3，4-脱氢-脯氨酸、3，4-二羟苯丙氨酸、环己基-甘氨酸、和苯基甘氨酸。
“氨基酸衍生物”指20种遗传编码天然氨基酸以外的任何一种氨基酸或氨基酸样化学单元。具体说，氨基酸衍生物可含取代或非取代、线性、分支、或环状烷基部分，可包括一个或多个杂原子。可从头制备氨基酸衍生物或从商业来源获得(Calbiochem-Novabiochem A G，Switzerland；Bachem，USA)。
利用体内和体外翻译系统将非天然氨基酸衍生物掺入蛋白质中以探索和/或改进蛋白质结构和功能的各种方法在文献中有所描述(Dougherty DA，2000)。模拟肽以及非模拟肽的合成和开发技术也是本领域熟知的(Golebiowski A等，2001；Hruby VJ和Balse PM，2000；Sawyer TK，的“Structure Based Drug Design”《基于结构的药物设计》，Veerapandian P，编著Marcel Dekker Inc.，557-663页，1997)。
通常认为两条多肽之间相同性超过30％是功能等价的标志。优选本发明第一方面的功能等价多肽与INSP181多肽或其活性片段的序列相同程度高于70％或80％。更优选多肽的相同程度分别高于85％、90％、95％、98％、98.5％、99％或99.5％。
本发明第一方面的功能等价多肽也可以是经过一种或多种结构对比技术鉴定的多肽。例如，形成用于产生Biopendium研究数据库的研究工具之一的Inpharmatica Genome Threader技术可用于鉴定目前未知功能的多肽(参见WO 01/67507)，该未知功能多肽与INSP181外显子多肽或INSP181多肽(SEQ ID NO：14和18)相比序列相同性虽低，但由于其与INSP181外显子多肽、INSP181多肽、INSP181-SV1多肽、INSP181-SV1多肽、INSP181成熟多肽、INSP181-SV1成熟多肽、INSP181 N92T多态性多肽、成熟INSP181多态性多肽、INSP181-SV1 N92T多态性多肽、成熟INSP181 N92T多态性多肽、INSP181-SV1G114S多态性多肽或成熟INSP181-SV1 G114S多态性多肽具有显著的结构同源性而被预测为脂质运载蛋白。
“显著的结构同源性”指用Inpharmatica Genome ThreaderTM预测的两种蛋白质或蛋白质区域所具有的结构同源性确定值至少有10％，更优选至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和更高。Inpharmatica GenomeThreaderTM的确定值按下文计算。采用专门用于已知结构的序列的Inpharmatica Genome ThreaderTM先进行一系列比较。一些比较是已知相关联(根据结构)的蛋白质之间的比较。根据最佳地区分获自CATH结构分类(www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/cath)的已知相关(relationship)与已知不相关之间的需要对神经网络进行培训(train)。所得的神经网络评分在0和1之间。但是，由于知道相关蛋白的数目和不相关蛋白的数量，就有可能将神经网络的结果划分入信息包中和经验性计算出正确结果的百分率。以此种方式，Biopendium研究数据库中的任何真实预测均附带有神经网络评分，并且可信度百分率反映了Inpharmatica Genome ThreaderTM在培训/检测集合(set)中如何成功。
本发明第一方面的多肽还包括INSP181多肽的片段和INSP181多肽功能等价物的片段，只要这些片段是脂质运载蛋白或具有与INSP181多肽、INSP181成熟多肽、INSP181-SV1多肽、INSP181-SV1成熟多肽、INSP181N92T多态性多肽、成熟INSP181多态性多肽、INSP181-SV1 N92T多态性多肽、成熟INSP181 N92T多态性多肽、INSP181-SV1G114S多态性多肽、成熟INSP181-SV1 G114S多态性多肽、INPS181脂质运载蛋白结构域或INSP181-SV1脂质运载蛋白结构域相同的抗原决定簇。
保持了脂质运载蛋白活性的片段的例子有那些包含如SEQ ID NO：66所提供的或如图12所示的脂质运载蛋白结构域(即任一全长INSP181序列的25-174氨基酸、26-180氨基酸和/或33-166氨基酸)的片段或由它们组成，以及含有组成二硫键的半胱氨酸残基的片段(即任一全长INSP181序列的96-187氨基酸)。优选二硫键形成于90与181位点的半胱氨酸之间。
本文中所用术语“片段”指具有与INSP181多肽或其功能等价物之一氨基酸序列的一部分相同而不是全部相同的氨基酸序列的多肽。所述片段应至少包含该序列的n个连续氨基酸，根据具体序列，n优选是7或者更多(例如8、10、12、14、16、18、20或更多)。小片段可构成抗原决定簇。本发明的片段长度可为1-100个氨基酸，优选5-50个氨基酸，更优选7-20个氨基酸。
按照本发明的核酸长度优选10-1000个核苷酸，优选50-800个核苷酸，优选100-600个核苷酸，优选200-550个核苷酸，优选300-500个核苷酸。本发明的多肽氨基酸长度优选5-500个氨基酸，优选50-400个氨基酸，优选100-300个氨基酸，优选150-250个氨基酸。
全长INSP181多肽的片段可分别由INSP1813多肽序列中的1或2、3、4、5...个相邻外显子序列的组合构成。这些外显子还可以与本发明的其它成熟片段组合。例如这种组合包括外显子1和2等等。这种片段属于本发明。所述片段还可由INSP181蛋白的不同功能域组成。这些片段可由上文所述的INSP181不同脂质运载蛋白结构域组成。这种片段可以是“游离的(free-standing)”的，即不是其它氨基酸或多肽的一部分或与之融合，或者它们可包含在更大的多肽中，构成其一部分或一个区域。当包含在更大的多肽中时，本发明片段最优选形成一个单独的连续区域。例如某些优选实施方案中，涉及具有融合于所述片段的氨基末端的前-和/或原多肽区域的片段和/或具有融合于所述片段的羧基末端的其它区域的片段。但是，多个片段也可包含在一个大的多肽中。
可用本发明的多肽或它们的免疫原性片段(包括至少一个抗原决定簇)来产生对该多肽具有免疫特异性的配体，例如多克隆抗体或单克隆抗体。这种抗体可以用来分离或鉴定表达本发明多肽的克隆或用于通过亲和层析来纯化本发明多肽。专业读者知道除了其它应用之外，还可采用这种抗体来帮助诊断或治疗。
术语“免疫特异性”指所述抗体对本发明多肽的亲和力大大高于对其对现有技术中其它相关多肽的亲和力。本文所用术语“抗体”指能结合所讨论抗原决定簇的完整分子及其片段，例如有Fab、F(ab′)2和Fv。因此这种抗体能与本发明第一方面的多肽结合。
“大大高于的亲和力”指与对现有技术中其它相关多肽(例如已知的脂质运载蛋白)的亲和力相比，对本发明多肽的亲和力有可测得的提高。
优选对本发明多肽的亲和力比对现有技术中其它相关多肽的亲和力至少高1.5倍、2倍、5倍、10倍、100倍、103倍、104倍、105倍、106倍或更多倍。
优选与已知的脂质运载蛋白相比，对本发明多肽的亲和力存在可测量的提高。
优选与天然的脂质运载蛋白相比，对本发明多肽的亲和力存在可测量的提高。
如需要多克隆抗体，可用本发明第一方面的多肽免疫所选择的哺乳动物，例如小鼠、兔、山羊或马。用于免疫动物的多肽可通过重组DNA技术或化学合成获得。如需要可将此多肽与载体蛋白偶联。可通过化学方法与该多肽偶联的常用载体包括：牛血清白蛋白、甲状腺球蛋白和匙孔血蓝蛋白。然后用偶联蛋白免疫动物。收集免疫动物的血清，按照已知方法(例如免疫亲和层析法)处理。
本领域技术人员也不难得到抗本发明第一方面多肽的单克隆抗体。用杂交瘤技术制备单克隆抗体的通用技术是众所周知的(例如参见Kohler，G.和Milstein，C，Nature 256：495-497(1975)；Kozbor等，Immunology Today 4：72(1983)；Cole等，“Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy”《单克隆抗体与癌症治疗》中的77-96，Alan R.Liss，Inc.(1985)。
可对产生的抗本发明第一方面多肽的多组单克隆抗体的各种特性进行筛选，例如同种型、表位、亲和力等。单克隆抗体在纯化它们各自针对的各多肽中特别有用。或者，例如可用本领域已知的PCR技术从杂交瘤中分离编码感兴趣单克隆抗体的基因，克隆，并在合适的载体中表达。
也可采用非人可变区连接或融合于人恒定区的嵌合抗体(例如参见Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，3439，1987)。
可以修饰抗体使其在个体中的免疫原性降低，例如通过人源化(参见Jones等，Nature，321，522(1986)；Verhoeyen等，Science，239，1534(1988)；Kabm等，J.Immunol.，147，1709(1991)：Queen等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，86，10029(1989)；Gorman等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，88，34181(1991)；和Hodgson等，Bio/Technology，9，421(1991))。本文所用术语“人源化抗体”指抗体分子中的非人供体抗体的重链和/或轻链可变区中的所选其它氨基酸和CDR氨基酸用人抗体的等价氨基酸替代。因此人源化抗体十分类似于人抗体但具有供体抗体的结合能力。
还有另一种情况中，所述抗体为“双特异性抗体”，即该抗体具有两个不同抗原结合功能域，每个功能域针对不同的表位。
可用噬菌体展示技术，对通过PCR扩增产生的用于筛选具有相关抗体的人淋巴细胞V基因文库进行筛选或对最初的文库(na
Figure S2006800153195D00291
ve library)进行筛选，来筛选对本发明多肽具有结合活性的抗体的编码基因(McCaffeny，J.等，(1990)，Nature 348，552-554；Marks，J.等，(1992)Biotechnology 10，779-783).也可通过链改组(chain shuffling)来改进这些抗体的亲和力(Clackson，T.等，(1991)Nature 352，624-628)。
上述技术产生的抗体，不论多克隆或单克隆抗体，都具有额外的用途，它们可用作免疫试验、放射免疫试验(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)中的试剂。在这些应用中，可用可分析检测的试剂例如放射性同位素、荧光分子或酶来标记这些抗体。
优选本发明第二和第三发明的核酸分子是编码SEQ ID NO：2，SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ IDNO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48、SEQ IDNO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66或SEQ IDNO：68所列多肽序列和功能等价多肽的核酸分子。这些核酸分子可用于本文所述的方法和应用。本发明的核酸分子优选含本文所述序列中的至少n个连续核苷酸，取决于具体序列，n为10或者更多(例如12、14、15、18、20、25、30、35、40或更多)。
本发明的核酸分子还包括与上述核苷酸分子互补的序列(例如为了反义或探针的目的)。
本发明的核酸分子可以是RNA形式，例如mRNA；或DNA形式，包括例如cDNA、合成的DNA或基因组DNA。这些核酸分子可以通过克隆、化学合成技术或它们的组合获得。可通过例如固相亚磷酰胺化学合成技术，从基因组或cDNA文库或通过从生物体分离来制备此核酸分子。通常通过DNA序列的体外或体内转录产生RNA分子。
核酸分子可以是双链或单链。单链DNA可以是编码链也称为有义链；或可以是非编码链也称为反义链。
术语“核酸分子”还包括DNA和RNA的同类物，例如含修饰骨架的那些核酸和肽核酸(PNA)。本文所用术语“PNA”指包含与氨基酸残基肽骨架相连的长度至少5个核苷酸的寡聚核苷酸的反义分子或反基因制剂，优选末端为赖氨酸。末端赖氨酸可赋予此组合物可溶性。可聚乙二醇化PNA以延长其在细胞内的寿命，在细胞内它们优先结合互补的单链DNA和RNA而中止转录延伸(Nielsen，P.E.等，(1993)Anticancer Drug Des.8：53-63)。
编码本发明多肽的核酸分子可与本文公开的一种或多种核酸分子的编码序列相同。
由于遗传密码子的简并性，这些分子也可能具有不同于编码如SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10，SEQ IDNO：12，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：20，SEQ IDNO：22，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：30，SEQID NO：32，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：48，SEQ IDNO：50，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：58，SEQID NO：60，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：66 or SEQ ID NO：68所列多肽和功能等价多肽的序列。
这些核酸分子可包括但不限于：成熟多肽本身的编码序列；成熟多肽的编码序列和额外的编码序列，例如那些编码引导或分泌序列(如编码前-、原-或前原-多肽的序列)；含或不含上述额外编码序列的成熟多肽编码序列，其带有其它额外非编码序列，包括非编码的5′和3′序列，例如对转录(包括终止信号)、核糖体结合和mRNA稳定性具有作用的转录而不翻译序列的成熟多肽编码序列。该核酸分子还可包含编码额外氨基酸(例如那些能提供额外功能的氨基酸)的编码序列。
本发明第二和第三方面的核酸分子也可编码本发明第一方面的多肽和其片段的片段或功能等价物。这种核酸分子可以是天然产生的变体如天然产生的等位基因变体，或该分子可以是未知的天然产生的变体。这种的核酸分子的非天然产生的变体可通过对包括核酸分子、细胞或生物体应用的诱变技术制备。
关于这点所说的变体是一类与上述核酸分子通过核苷酸取代、缺失或插入而不同。取代、缺失或插入可涉及一个或多个核苷酸。而所述变体的编码或非编码区或两者可改变。编码区的改变可产生保守或非保守氨基酸取代、缺失或插入。
鉴于多种原因，也可用本领域通常所知的方法，工程改造本发明的核酸分子，包括对基因产物(多肽)的克隆、加工和/或表达进行改变。包括了通过随机片段化和基因片段的PCR重新组装及合成寡核苷酸进行的DNA改组，作为可用于工程改造核苷酸序列的技术。可用定点诱变插入新的限制性位点、改变糖基化模式、改变密码子的偏好性、产生剪接变体、导入突变等等。
可将编码本发明第一方面多肽的核酸分子连接于异源序列，使该组合的核酸分子编码融合蛋白。这种组合的核酸分子属于本发明的第二或第三方面。例如，为了筛选肽库中的多肽活性抑制剂，可利用这种组合的核酸分子表达可用商品化购得的抗体识别的融合蛋白。也可工程改造融合蛋白使本发明多肽序列和异源蛋白序列之间包含切割位点，从而可对本发明多肽进行切割并纯化去除异源蛋白。
本发明核酸分子还包括与本发明多肽的编码核酸分子部分互补，从而能与该编码核酸分子杂交(杂化)的反义分子。本领域普通技术人员应能知晓可将这种反义分子(例如寡核苷酸)设计为能识别编码本发明多肽的靶核酸、能与其特异性结合和预防其转录(例如参见Cohen，J.S.，Trends in Pharm.Sci.，10，435(1989)；Okano，J.Neurochem.56，560(1991)；O′Connor，J.Neurochem 56，560(1991)；Lee等，Nucleic Acids Res 6，3073(1979)；Cooney等，Science 241，456(1988)；Dervan等，Science 251，1360(1991)。
本文所用的术语“杂交”指两核酸分子彼此通过氢键相结合。通常，一个分子固定于固体载体而另一分子游离于溶液中。然后将两分子置于可彼此接触并有利于氢键形成的条件下。影响这种结合的因素包括：溶液的类型和体积、反应温度、杂交时间、搅拌、封闭液相分子非特异性粘附固相载体的试剂(登哈特试剂或BLOTTO)、分子浓度、使用化合物提高分子结合速率(硫酸葡聚糖或聚乙二醇)、和杂交后洗涤条件的严格性(参见Sambrook等，同上)。
可用本领域已知的杂交试验检测对完全互补分子与靶分子杂交的抑制(例如参见Sambrook等，同上)。如Wahl，G.M.和S.L.Berger(1987；MethodsEnzymol.152：399-407)，以及Kimmel，A.R.(1987；Methods Enzymol.152：507-511)所教导：在各种严格性条件下基本上同源的分子将竞争而抑制完全同源的分子与靶分子的结合。
“严格性”指有利于非常类似的分子而不利于不同分子结合的杂交反应条件。高度严格杂交条件的定义为在含50％甲酰胺、5XSSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5x登哈特溶液、10％硫酸葡聚糖和20微克/毫升变性剪切鲑鱼精子DNA的溶液中42℃培育过夜，然后在约65℃下用0.1X SSC洗涤滤膜。低严格条件包括在35℃实施杂交反应(参见Sambrook等，同上)。优选使用的杂交条件为高严格性条件。
本发明该方面的优选实施方式是全长与编码INSP181多肽(SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ IDNO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ IDNO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：68)的核酸分子序列至少70％相同的核酸分子，以及与这些核酸分子基本上互补的核酸分子。优选本发明该方面的核酸分子包括全长中包含与具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ IDNO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ IDNO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ IDNO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67或SEQ ID NO：69所列序列至少80％相同的区域的核酸分子，或与它们互补的核酸分子。关于这一点，尤其优选全长的至少90％、优选至少95％、更优选至少98％、98.5％、99％或99％与上述序列相同的核酸分子。此方面的优选实施方式是编码基本上保留了与INSP181多肽、INSP181成熟多肽、INSP-SV1多肽、INSP181-SV1成熟多肽、INSP181 N92T多态性多肽、成熟INSP181多态性多肽、INSP181-SV1 N92T多态性多肽、成熟INSP181 N92T多态性多肽、INSP181-SV1G114S多态性多肽、成熟INSP181-SV1 G114S多态性多肽或脂质运载蛋白功能域INSP181多肽相同的生物学功能或活性的多肽的核酸分子。
本发明还提供检测本发明核酸分子的方法，包括步骤：(a)在杂交条件下使本发明的核酸探针与生物样品接触形成双链体；和(b)检测任何形成的此种双链体。
如下文结合本发明所用试验中讨论的那样，上述核酸分子可用作RNA、cDNA、或基因组DNA的杂交探针来分离编码INSP181多肽的全长cDNA序列和基因克隆，以及分离与编码这些多肽的基因具有高度序列相似性的同源或直向同源基因的cDNA和基因克隆。
关于这一点，可采用以下本领域的其他已知技术并为阐述目的在下文中讨论。DNA测序和分析的方法是本领域熟知的和普遍利用的，可实际地用于实施本文所述的许多实施方式。这种方法可采用酶，例如DNA聚合酶I的Klenow片断、测序酶(US Biochemical Corp，Cleveland，OH)、Taq聚合酶(Perkin Elmer)、热稳定T7聚合酶(Amersham，Chicago，IL)、或联用聚合酶和校正阅读核酸外切酶(例如可见Gibco/BRL(Gaithersburg，MD)的市售ELONGASE扩增系统中的酶)。优选用机器自动化进行此测序程序，例如Hamilton Micro Lab 2200(Hamilton，Reno，NV)、Peltier热循环仪(PTC200；MJ Research，Watertown，MA)和ABI催化剂以及373和377 DNA测序仪(Perkin Elmer)。
分离具有INSP181多肽等价功能的多肽的编码核酸分子的方法之一，是用本领域熟知的标准程序以天然或人工设计的探针探测基因组或cDNA文库(例如参见“Current Protocols in Molecular Biology”《分子生物学的当前方法》，Ausubel等编.Greene Publishing Association and John Wiley Interscience，New York，1989，1992)。包含至少15个、优选至少30个，更优选至少50个与相应编码基因的核酸序列(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ IDNO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ IDNO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67和/或SEQ IDNO：69)相对应或互补的毗连碱基的探针是特别有用探针。可用可分析检测的试剂标记这种探针以有利于其鉴定。有用的试剂包括但不限于：放射性同位素、荧光染料和能催化形成可检测产物的酶。利用这些探针，本领域普通技术人员能分离编码人、哺乳动物或其它来源的感兴趣蛋白质的基因组DNA、cDNA或RNA多聚核苷酸的互补拷贝，和筛选该来源的相关序列，例如该家族、类型和/或亚型的其它成员。
在许多例子中，分离的cDNA序列是不完全的序列，其中的编码本发明多肽的区域通常在5’末端被切短。有几种方法可以用来获得全长cDNA序列或延长短的cDNA序列。延伸这种序列可采用局部核苷酸序列和采用多种本领域已知的检测上游序列(例如启动子和调控元件)的方法。例如可用的一种方法是基于快速扩增cDNA末端的方法(RACE；参见例如，Frohman等，PNAS USA 85，8998-9002，1988)。最近通过MarathonTM技术(ClontechLaboratories Inc.)实施的这种技术的改进，例如能显著简化对更长cDNA序列的搜寻。一种称为“限制性位点”PCR的略有不同的技术采用通用引物来搜寻毗邻于已知位点的未知核苷酸序列(Sarkar，G.(1993)PCR MethodsApplic.2：318-322)。也可采用基于已知区域的反向引物进行反向PCR来扩增或延伸序列(Triglia，T.等(1988)NucleicAcids Res.16：8186)。另一种可用的方法是包括用PCR扩增毗邻于人和酵母菌人工染色体DNA的已知序列的DNA片段的捕获PCR法(Lagerstrom，M.等(1991)PCR Methods Applic.，1，111-119)。另一种可用于搜寻未知序列的方法是Parker，J.D.等(1991)，NucleicAcids Res.19：3055-3060所述的方法。此外，可采用PCR、嵌套引物、和PromoterFinderTM文库寻查基因组DNA(Clontech，Palo Alto，CA)。这种方法不需要筛检文库而可用于发现内含子/外显子接合处。
当筛检全长cDNA序列时，优选利用已经过分子大小选择的含大的cDNA序列的文库。还优选随机引导文库，因为它们包含更多的含基因5’区域的序列。在寡d(T)文库不能产生全长cDNA的情况下，尤其优选采用随机引导文库。可利用基因组文库将序列延伸到5’非转录调控区。
在本发明的一实施方式中，可用本发明核酸分子作染色体定位。在这种技术中，核酸分子特异性靶向人个体染色体上的特定位点并能与之杂交。根据本发明绘制的染色体上的相关序列是确认这些序列与基因相关疾病关系的重要步骤。一旦某序列在该图上精确定位于染色体位点，可将该序列在染色体上的物理位置以与遗传图谱数据相关联(通过Johns Hopkins UniversityWelch医学库在线获得)。随后可通过联锁分析(物理毗邻基因的共遗传)鉴定作图定位于同一染色体区域的基因与疾病之间的关系。这给使用定位克隆或其它基因发现技术寻找疾病基因的研究者提供了有价值的信息。一旦疾病或症状通过遗传联锁初步定位于某特定基因组区域，任何作图定位于该区域的序列可能代表要进一步研究的相关基因或调控基因。也可利用此核酸分子来检测正常人、携带者、或感染个体之间由于基因转座、倒置等导致的染色体位点中的差异。
本发明核酸分子对于组织定位也有应用价值。这种技术可通过检测编码组织中多肽的mRNA来测定组织中该多肽的表达模式。这些技术包括原位杂交技术和核苷酸扩增技术，例如PCR。这些研究的结果可提供生物体中该多肽的正常功能指标。此外，mRNA序列的正常表达模式与突变基因编码mRNA的表达模式的比较研究，可提供关于突变蛋白在疾病中作用的有价值观点。这种不恰当表达可能具有短暂的、空间或定量性质。
也可考虑用基因沉默方法来下调本发明多肽编码基因的内源性表达。RNA干扰(RNAi)(Elbashir，SM等，Nature 2001，411，494-498)是一种可用的序列特异性转录后基因沉默方法。将体外合成的短双链RNA寡核苷导入细胞中。这些双链RNA寡核苷酸的特异性结合激发了靶mRNA的降解，减少或消除了靶蛋白的表达。
可通过检测多肽的表达(例如通过免疫印迹法)和在RNA水平上用基于TaqMan的方法评估上述基因沉默方法的效果。
包含本发明核酸分子的本发明载体可以是克隆载体或表达载体。可用本发明载体转染、转化或转导本发明的宿主细胞，这些宿主细胞可以是原核或真核细胞。
可在宿主细胞所含的载体中表达编码本发明多肽的核酸分子制备重组形式的本发明多肽。这种表达方法是本领域技术人员熟知的，许多方法在Sambrook等(同上)和Fernandez&Hoeffler(1998，编“Gene expressionsystems.Using nature for the art of expression”.Academic Press，San Diego，London，Boston，New York，Sydney，Tokyo，Toronto))中有详细描述。
通常可采用适合在所需宿主中保持、增殖或表达核酸分子以产生多肽的系统或载体。可将合适的核酸序列用多种熟知和常规技术中的任一种，例如Sambrook等，(同上)描述的方法插入到表达系统中。通常将编码基因置于控制元件如启动子、核糖体结合位点(细菌表达)和任选的操纵子控制下，使编码所需多肽的DNA序列在经转化的宿主细胞中转录成RNA。
合适的表达系统的例子包括：染色体、游离体、病毒衍生系统包括例如衍生自以下物质的系统：细菌质粒、噬菌体、转座子、酵母游离体、插入元件、酵母染色体元件、病毒(如杆状病毒、乳多空病毒如SV40、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、伪狂犬病毒和逆转录病毒或它们的组合，例如那些衍生自质粒和噬菌体遗传元件的表达系统，包括粘粒和噬菌粒。也可用人工的人染色体(HACs)来递送可包含并在质粒中表达的较大片段DNA。载体pCR4-TOPO-INSP181、pCR4-TOPO-INSP181-SV1、pDONR221_INSP181-6HIS、pDONR221_INSP181SV1-6HIS、pEAK_INSP181-6HIS、pEAK_INSP181SV1-6HIS、pDEST12.2_INSP181-6HIS和pDEST12.2_INSP181SV1-6HIS是优选的合适载体的例子，可用于涉及INSP181的本发明的各个方面。
尤其适合的表达系统包括：微生物，例如用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母菌；感染病毒表达载体(例如杆状病毒)的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒CaMV、烟草花叶病毒TMV)或细菌表达载体(例如Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统，或动物细胞系统。也可用无细胞翻译系统来产生本发明的多肽。
可用许多标准实验室手册上描述的方法将编码本发明多肽的核酸分子导入宿主细胞中，例如Davis等，“Basic Methods in Molecular Biology”《分子生物学基本方法》(1986)和Sambrook等，[同上]。尤其适合的方法包括磷酸钙转染、DEAE-右旋糖苷介导的转染、转毒作用(transvection)、显微注射、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、划痕加载(scrape loading)、轰击导入或感染(参见Sambrook等1989[同上])；Ausubel等，1991[同上]；Spector，Goldman&Leinwald，1998)。在真核细胞中，根据对此系统的需要，表达系统可以瞬时表达(例如游离体)或持久表达(染色体整合)。
当需要时，例如为了使翻译的多肽分泌入内质网内腔、周质间隙或胞外环境，编码核苷酸分子可包含或不包含控制序列(如信号肽或引导序列)的编码序列。这些信号对本发明多肽可以是内源或异源信号。引导序列可通过细菌宿主的翻译后加工除去。
除控制序列外，可能需要加入调控序列以调节与宿主细胞生长相关的多肽表达。调控序列的例子是在对化学或物理刺激(包括存在调节性化合物或对不同温度或代谢条件)的反应中能导致基因表达增加或减少的序列。调控序列是载体非翻译区的序列，例如增强子、启动子和5’与3’非翻译区。它们与宿主细胞蛋白的相互作用实现了转录和翻译。这些调控序列的强度和特异性可以不同。根据所用的载体系统和宿主，可采用任何数目的合适转录和翻译元件，包括组成型和可诱导型启动子。例如在细菌系统中克隆时，可采用诱导型启动子如Bluescript噬菌粒的杂交lacZ启动子(Stratagene，LaJolla，CA)或pSportlTM质粒(Gibco BRL)等。在昆虫细胞中可采用杆状病毒多角体蛋白启动子。可将衍生自植物基因组(例如热激、二磷酸核酮糖氧合酶/羧化酶(RUBISCO)和储藏蛋白基因)或植物病毒(例如病毒启动子或引导序列)的启动子或增强子克隆入此载体。在哺乳动物细胞系统中，优选源自哺乳动物基因或哺乳动物病毒的启动子。如果需要产生包含多拷贝所述序列的细胞系时，可采用带合适选择性标记的基于SV40或EBV的载体。
构建表达载体使特定核酸编码序列位于载体中并含合适的调控序列，相对于调控序列而言，编码序列的位置和方向应使编码序列可处在调控序列的“控制”下转录，即结合于DNA分子控制序列处的RNA聚合酶转录编码序列。在一些例子中，可能需要修饰该序列使其以适当的取向连接于调控序列，即维持阅读框。
可将控制序列和其它调节序列连接于所述核酸编码序列然后插入载体中。或者，可将编码序列直接克隆入已含有控制序列和合适限制性位点的表达载体中。
为了长时间高产量生产重组多肽，优选稳定的表达。例如，可用表达载体转化稳定表达感兴趣多肽的细胞系，这些表达载体可含有病毒来源的复制和/或内源表达元件，并可在同一载体或不同载体上包含选择性标记。导入载体后，在富集培养基中培养细胞1-2天，然后转移到选择性培养基中。可选择标记的目的是赋予选择抗性，它的存在使成功表达导入序列的细胞得以生长和回收。可用适合该细胞类型的组织培养技术增殖稳定转化细胞的抗性克隆。
本领域已知可获得的作为宿主的哺乳动物细胞系，包括可从美国典型微生物保藏中心(ATCC)获得的多种无限生殖细胞系，包括但不限于：中国仓鼠卵巢(CHO)、HeLa(海拉)、幼仑鼠肾(BHK)、猴肾(COS)、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowes黑素瘤和人肝细胞癌(例如Hep G2)细胞和众多其它细胞系。
在杆状病毒系统中，用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料可以市售试剂盒形式购得，尤其是Invitrogen，San Diego CA(″MaxBac″试剂盒)。这些技术普遍为本领域技术人员所知，在Summers and Smith，TexasAgricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987)中有全面描述。尤其适合用于这种系统的宿主细胞包括昆虫细胞如果蝇S2和草地贪夜蛾Sf9细胞。
本领域已知有多种植物细胞培养物和全植物遗传表达系统。合适的植物细胞遗传表达系统的例子包括专利US 5,693,506、US 5,659,122和US5,608,143中所述的那些系统。其它植物细胞培养物遗传表达的例子在Zenk，Phytochemistry 30，3861-3863(1991)中已有描述。
具体说，可采用能分离原生质体并培养获得再生的全植株，从而可恢复含转移基因的完整植株的所有植物。事实上所有植物都可从培养的细胞或组织再生，包括但不限于甘蔗、甜菜、棉花、水果和其它树木、豆科植物和蔬菜等所有主要种类。
尤其优选的细菌宿主细胞例子包括：链球菌(streptococci)、葡萄球菌(staphylococci)、大肠杆菌(E.Coli)、链霉菌属(Streptomyces)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)细胞。
尤其适合真菌表达的宿主细胞包括：酵母细胞(例如啤酒酵母，S.cerevisiae)和曲霉(Aspergillus)细胞。
可采用本领域所熟知的任何数量的选择系统来回收转化的细胞系。例子包括可分别用于tk-或aprt±细胞的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler，M.等(1977)Cell 11：223-32)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy，I.等(1980)Cell22：817-23)基因。
此外，可利用对代谢剂、抗生素或除草剂的抗性作为选择的基础，例如赋予对甲氨喋呤抗性的二氢叶酸还原酶(Wigler，M.等，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.77：3567-70)；赋予对氨基糖甙类新霉素和G-418抗性的npt(Colbere-Garapin，F.等(1981)J.Mol.Biol.150：1-14)和分别赋予对氯磺隆(chlorsulfuron)与草苷磷(phosphinotricin)乙酰转移酶抗性的als或pat。其它选择基因也已有描述，本领域技术人员清楚它们的例子。
虽然标记基因表达的存在与否提示感兴趣基因也可能存在，但其存在和表达仍需加以确认。例如，如果将相关序列插入标记基因序列中，包含该相应序列的转化细胞可通过标记基因功能的缺失而得到鉴定。或者，可将标记基因与编码本发明多肽的序列串连放置在一个启动子的控制下。在响应诱导或选择时，该标记基因的表达通常可表明该串连基因的表达。
或者，可用本领域技术人员已知的各种方法鉴定包含编码本发明多肽的核酸序列且能表达所述多肽的宿主细胞。这些方法包括但不限于：DNA-DNA或DNA-RNA杂交和蛋白质生物学试验，例如荧光激活细胞分选术(FACS)或免疫测定技术(例如酶联免疫吸附试验[ELISA]和放射免疫试验[RIA])，用于检测和/或定量核酸或蛋白质的技术包括膜、溶液或基于芯片的技术(参见Hampton，R.等，(1990)“Serological Methods，a Laboratory Manual”《血清学方法，实验室指南》，APS Press，St Paul，MN)和Maddox，D.E.等，(1983)J.Exp.Med，158，1211-1216)。
本领域技术人员已知的各种各样的标记和偶联技术，并可用于各种核酸和氨基酸试验中。产生用于检测涉及编码本发明多肽的核酸分子序列的标记杂交物或PCR探针的方法，包括寡聚标记、缺口翻译、末端标记或用标记的聚核苷酸进行PCR扩增。或者，可将本发明多肽的编码序列克隆入载体以产生mRNA探针。这种载体是本领域已知的，且是商业上可获得的，并通过添加合适的RNA聚合酶(如T7、T3或SP6)和标记核苷酸可用来体外合成RNA探针。这些过程可用多种市售试剂盒进行(Pharmacia&Upjohn，(Kalamazoo，MI)；Promega(Madison WI)；和U.S.Biochemical Corp.，Cleveland，OH))。
可采用易于检测的合适报告分子或标记，包括放射性核素、酶和荧光、化学发光或产色试剂以及底物、辅因子、抑制剂、磁性粒子等。
也可用本发明的核酸分子来产生转基因动物，尤其是啮齿动物。这种转基因动物构成本发明的另一方面。可通过修饰体细胞、或通过生殖细胞治疗，掺入遗传修饰来局部进行(转基因)。这种转基因动物对产生可用作研究本发明多肽调节剂的药物分子效力的动物模型特别有用。
可通过熟知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化所述多肽，方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析。高效液相色谱尤其适用于纯化。当所述多肽在分离和纯化过程中发生变性时，可用熟知技术重折叠蛋白质以重新产生活性构象。
可根据需要通过例如将本发明多肽的编码序列连接于有利于可溶性蛋白质纯化的多肽结构域的编码核苷酸序列，用专用载体构建物来促进所需蛋白质的纯化。这种有利于纯化的结构域例子包括：金属螯合肽，如可使纯化在固定金属上进行的组氨酸-色氨酸组件(module)、可使纯化在固定的免疫球蛋白上进行的蛋白A结构域、和FLAGS延伸/亲和纯化系统中所用的结构域(Immunex Corp.，Seattle，WA)。将可剪切的接头序列(如那些对因子XA和肠激酶特异性的接头序列，Invitrogen，San Diego，CA)加入纯化结构域和本发明的多肽之间有助于纯化进行。一种如此的表达载体提供了融合蛋白的表达，该融合蛋白含有位于硫氧还蛋白或肠激酶切割位点之前的融合于几个组氨酸残基的本发明多肽。这些组氨酸残基有利于用IMAC纯化(固定化金属离子亲和层析，如Porath，J.等(1992)，Prot.Exp.Purif.3：263-281所述)，而硫氧还蛋白或肠激酶切割位点提供了从融合蛋白中纯化此多肽的方法。Kroll，D.J.等.(1993；DNA Cell Biol.12：441-453)提供了含融合蛋白的载体的论述。
如果要将表达的该多肽用于筛选试验，通常优选其产生于表达它的宿主细胞的表面。在这种情况中，可先收获宿主细胞然后用于筛选试验，例如用于荧光激活细胞分选术(FACS)或免疫亲和技术。如果要使该多肽分泌到培养基中，可回收培养基来回收和纯化所表达的多肽。如果要在胞内产生该多肽，必须先裂解细胞再回收多肽。
如上所述，本发明还提供了筛选候选药物或前导药物的新靶标和方法。这些筛选方法包括结合试验和/或功能试验，可在体外、细胞系统中或动物中实施。
关于这一点，本发明的一个具体目的是利用INSP181多肽作为筛选治疗或预防脂质运载蛋白相关疾病的候选药物的靶标。
本发明的另一目的是建立一种选择生物活性化合物的方法，所述方法包括使候选化合物与INSP181基因或多肽接触，和选择能与所述基因或多肽结合的化合物。
本发明还有另一目的是建立一种选择生物活性化合物的方法，所述方法包括使候选化合物与表达INSP181多肽的重组宿主细胞接触，选择能与所述细胞表面的所述INSP181多肽结合的化合物，和/或能调节INSP181多肽活性的化合物。
“生物学活性”化合物指在对象中具有生物学活性的任何化合物，优选有治疗活性，更优选具有脂质运载蛋白活性的化合物，还要优选可用于治疗INSP181相关疾病的化合物，或能导致开发治疗脂质运载蛋白相关疾病药物的化合物。“生物学活性”化合物优选能调节INSP181活性的化合物。
可用各种装置和条件在体外进行上述方法，包括固定化的试剂，还可包括在脂质运载蛋白相关疾病的模型(例如动物模型)中检测所选择化合物的活性的额外试验步骤。
优选的化合物是INSP181的激动剂，即能结合INSP181模拟其内源性配体活性的化合物。
本发明还有一目的是建立一种选择生物活性化合物的方法，所述方法包括在体外使测试化合物与本发明的INSP181多肽接触，和检测所述测试化合物调节所述INSP181多肽活性的能力。
本发明还有一目的是建立一种选择生物活性化合物的方法，所述方法包括在体外使测试化合物与本发明的INSP181基因接触，和检测所述测试化合物调节所述INSP181基因的表达，优选刺激其表达的能力。
在另一实施方案中，本发明涉及筛选、选择或鉴定活性化合物的方法，具体是对多发性硬化症或相关疾病具有活性的化合物，此方法包括使测试化合物与含有报告构建物的重组宿主细胞接触和选择能调节(例如刺激或减少，优选刺激)该报告基因表达的测试化合物，所述报告构建物含有在INSP181基因启动子控制下的报告基因。
可利用本发明多肽以任一种药物筛选技术筛检化合物文库。这种化合物可以活化(激动)或抑制(拮抗)本发明基因的表达水平或本发明多肽的活性，构成了本发明的另一个方面。优选的化合物能有效改变编码本发明第一方面多肽的天然基因的表达，或能调节本发明第一方面多肽的活性。
激动或拮抗化合物可以分离自例如细胞、无细胞制剂、化学文库或天然产物混合物。这些激动剂或拮抗剂可以是天然或修饰的底物、配体、酶、报告子或结构或功能模拟物。这种筛选技术的合适综述可参见Coligan等，Current Protocols in Immunology 1(2)：第5章(1991)。
结合靶基因或多肽表明该化合物调节所述靶标活性，从而影响导致对象脂质运载蛋白相关疾病的途径的能力。可用各种种技术，如标记候选化合物、与标记的参考配体竞争等方法检测结合。可采用基本纯形式、在悬浮液、固定于支持物或在膜中表达(完整细胞、膜制剂、脂质体等)的多肽进行体外结合试验。
活性的调节包括但不限于刺激INSP181报告子的表面表达，调节所述报告子的多聚化(例如与其它亚单位形成多聚复合物)等。试验所用的细胞可以是任何重组细胞(即包含编码INSP181多肽的重组核酸的任何细胞)或任何表达内源性INSP181多肽的细胞。这些细胞的例子包括但不限于：原核细胞(例如细菌)和真核细胞(例如酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等)。具体例子包括：大肠杆菌(E.Coli)、巴斯德毕赤酵母菌(Pichia pastoris)、多形汉森酵母菌(Hansenula polymorpha)、粟酒裂殖酵母菌属(Schizosaccharomycespombe)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)或酿酒酵母菌(Saccharomycesyeast)、哺乳动物细胞(如Vero细胞、CHO细胞、3T3细胞、COS细胞等)以及原代或建立的哺乳动物细胞培养物(例如产生自成纤维细胞、胚胎细胞、上皮细胞、神经细胞、脂肪细胞等)。
最可能是良好拮抗剂的化合物是能结合本发明多肽而与其结合时不诱导该多肽生物效应的分子。可能的拮抗剂包括能结合本发明多肽从而抑制或消除其活性的有机小分子、肽、多肽和抗体。以这种方式可抑制该多肽与正常细胞结合分子的结合，从而阻止该多肽的正常生物学活性。
用于这种筛选技术的本发明多肽可以游离于溶液中、附着于固体支持物、负载于细胞表面或位于细胞内。通常这种筛选方法可包括利用合适表达该多肽的细胞或细胞膜与测试化合物接触来观察结合，或对功能性应答的刺激或抑制。然后将与测试化合物接触的细胞的功能性应答与不接触测试化合物的对照细胞作比较。利用合适的检测系统，这种试验可以评估测试化合物能否导致因激活该多肽而产生信号。通常在存在已知激动剂时检测对激活的抑制子和观察在存在测试化合物时激动剂对激活的作用。
鉴定本发明多肽的激动剂和拮抗剂化合物的优选方法包括：
(a)在允许与本发明第一方面多肽结合的条件下，使表达(任选在细胞表面)该多肽的细胞与待筛选的化合物接触，其中该多肽连接有响应测试化合物与该多肽的结合而能提供可检测信号的第二成分；和
(b)通过测定此化合物与该多肽相互反应产生的信号水平检测此化合物是否结合该多肽和是否活化或抑制该多肽。
在本文所述的这种类型试验中用于产生可检测信号的方法是本领域技术人员已知的。一具体实施例是将表达本发明多肽的构建物、或其片段如LBD，(与GAL4 DNA结合功能构域融合)，与报告子质粒(其一个例子为pFR-Luc，Stratagene Europe，Amsterdam，The Netherlands)一同转染入细胞中。此特殊质粒包含携带有5个GAL4结合位点串连重复序列的合成启动子，能控制荧光素酶基因的表达。当在此细胞中加入一可能的配体时，它将结合GAL4-多肽融合物，并诱导荧光素酶基因的转录。可用发光读数仪通过其活性监测荧光素酶基因的表达水平(例如参见Lehman等，JBC，270，12953，1995；Pawar等，JBC，277，39243，2002)
另一优选的鉴定本发明多肽的激动剂或拮抗剂的方法包括：
(a)使标记或未标记的化合物与固定在任何固体支持物(例如珠、板、基质支持物、芯片)上的该多肽接触，和测量标记物或此化合物本身的存在来检测此化合物：或
(b)通过人工锚定该多肽于细胞膜，或构建连接有第二成分的嵌合受体，在允许结合该多肽的条件下，使表达该多肽于细胞表面的细胞与待筛选的化合物接触；其中所述第二成分响应化合物与该多肽的结合而能提供可检测信号；和
(c)比较此化合物与多肽相互作用产生的信号水平与不存在此化合物时的信号水平，检测此化合物是否能结合该多肽和能否活化或抑制该多肽。
例如可采用检测在存在肽共活化剂时配体结合该多肽的FRET方法(Norris等，Science 285，744，1999)。
另一优选的鉴定本发明多肽的激动剂或拈抗剂的方法包括：
(a)在允许与该多肽结合的条件下，使表达(任选在细胞表面)该多肽的细胞与待筛选化合物接触，其中该多肽连接有响应测试化合物与该多肽的结合而能提供可检测信号的第二成分；和
(b)通过比较此化合物与多肽相互作用产生的信号水平与不存在此化合物时的信号水平来检测此化合物是否能结合该多肽和能否活化或抑制该多肽。
在另一优选实施方式中，上述通用方法还可包括在存在该多肽的标记或未标记的配体时进行激动剂或拮抗剂的鉴定。
在另一实施方式中，鉴定本发明多肽的激动剂或拮抗剂的方法包括：
在允许与该多肽结合的条件下，检测候选化合物存在对配体结合表达本发明多肽的细胞(任选在其表面上具有本发明的多肽)、或包含该多肽的细胞膜的抑制；和检测结合该多肽的配体数量。能够导致配体结合减少的化合物被认为是激动剂或拮抗剂。优选所述配体是标记的配体。
更具体说，筛选多肽激动剂或拮抗剂化合物的方法包括以下步骤：
(a)将标记的配体与表达本发明多肽的完整细胞(任选在细胞表面表达)或含有本发明多肽的细胞膜一起培育；
(b)检测与完整细胞或细胞膜结合的标记配体数量；
(c)在步骤(a)所述的标记配体和完整细胞或细胞膜的混合物中加入候选化合物并使混合物获得平衡；
(d)检测步骤(c)后与完整细胞或细胞膜结合的标记配体数量；
(e)比较步骤(b)和步骤(d)所述结合的标记配体数量差异，能导致步骤(d)所述结合减少的化合物被认为是激动剂或拮抗剂。
类似地，此处提供一种筛选多肽的拮抗剂或激动剂化合物的方法，该方法包括以下步骤：
(a)将标记的配体与固定在任何固相支持物上的或细胞表面上的本发明多肽，或含有本发明多肽的细胞膜一起培育；
(b)检测与固相支持物上、完整细胞或细胞膜上该多肽结合的标记配体数量；
(c)在步骤(a)所述的标记配体和固定在固相支持物、完整细胞或细胞膜上的多肽的混合物中加入候选化合物，并使混合物获得平衡；
(d)检测步骤(c)后与该固定多肽或完整细胞或细胞膜结合的标记配体数量；和
(e)比较步骤(b)和步骤(d)所述结合的标记配体数量差异，能导致步骤(d)所述结合减少的化合物被认为是激动剂或拮抗剂。
发现INSP181多肽在上述试验中以剂量依赖方式调节了多种生理学和病理学过程。因此，本发明多肽的“功能等价物”包括在上述试验中以剂量依赖方式显示出任何相同调节活性的多肽。虽然剂量依赖活性的程度不需要与本发明多肽相同，优选“功能等价物”在给定的试验中与本发明多肽相比显示基本上相似的剂量依赖性。
在上述某些实施方式中，可采用简单的结合试验，在该试验中通过与测试化合物直接或间接相连的标记，或在与标记的竞争物的竞争试验中，检测测试化合物与携带该多肽的表面的粘附。在另一实施方式中，可采用竞争性药物筛选试验，在该试验中能特异性结合该多肽的中和抗体与测试化合物竞争结合。以此种方式，用抗体检测是否存在对该多肽具有特异性结合亲和力的任何测试化合物。
也可设计试验来检测加入的测试化合物对细胞产生编码该多肽mRNA的影响。例如，可构建ELISA用本领域已知的标准方法以单克隆或多克隆抗体检测该多肽的分泌水平或细胞相关水平，可用这种ELISA来研究能抑制或增强适当操作的细胞或组织产生该多肽的化合物。然后可检测该多肽与待测化合物之间形成的结合复合物。
也可设计试验来检测加入的测试化合物对细胞产生编码该多肽mRNA的影响。例如，可构建ELISA用本领域已知的标准方法以单克隆或多克隆抗体检测该多肽的分泌水平或细胞相关水平，可用这种ELISA来研究能抑制或增强适当操作的细胞或组织产生该多肽的化合物。然后可检测该多肽与待测化合物之间形成的结合复合物。
那些涉及将本发明基因和多肽用于过表达或消除试验的试验方法也包括在本发明定义中。这些试验包括操作细胞中的这些基因/多肽的水平和评价这种操作对受操作细胞的生理学影响。例如这些实验可揭示涉及特定基因/多肽的信号传递和代谢途径的详情，产生关于能与所研究多肽相互作用的多肽的身份信息，提供相关基因和蛋白调节方法的线索。
可采用另一种药物筛选技术来提供高通量筛选对感兴趣的多肽具有合适结合亲合力的化合物(参见国际专利申请WO84/03564)。在此方法中，在固体基材上合成大量的不同小分子测试化合物，然后与本发明多肽反应并洗涤。固定该多肽的一种方法是利用非中和抗体。结合的多肽随后可用本领域熟知的方法检测。也可将纯化多肽直接包被用于上述药物筛选技术的测试板。
通过本领域已知的标准受体结合技术可用本发明多肽鉴定膜-结合或可溶性受体，所述技术为例如配体结合和交联试验，在这些试验中该多肽可用放射性同位素标记、对其进行化学修饰、或使其融合于有利于其检测和纯化的肽序列，并使其与推定的受体(例如细胞组分、细胞膜、细胞培养上清液、组织提取物、或体液)来源一起培育。可通过生物物理技术，如表面等离子共振和光谱学检测结合效率。结合试验可用于受体的纯化和克隆，也可用于鉴定能与该多肽竞争结合其受体的该多肽的激动剂和拮抗剂。本领域熟知实施筛选试验的标准方法。
在另一实施方式中，本发明涉及利用INSP多肽或其片段来分离或产生INSP181多肽的激动剂或刺激剂治疗免疫相关疾病，其中所述片段优选INSP181基因特异片段，所述激动剂或刺激剂选自：
1.其特异抗体或其片段，包括：
嵌合抗体
人源化抗体，或
完全的人抗体，以及
2.双特异或多特异抗体
3.单链(例如scFv)抗体，或
4.单结构域抗体，或
5.衍生自所述抗体的肽-或非肽模拟物，或
6.抗体模拟物，如a)anticalin或b)基于纤连蛋白的结合分子(例如trinectin或adnectin)。
从抗体产生的肽-或非肽模拟物为本领域所熟知(Saragovi等，1991和Saragovi等，1992)。
Anticalin也为本领域所知(Vogt等，2004)。基于纤连蛋白的结合分子在专利US6818418和WO2004029224中已公开。
此外，测试化合物可以是各种来源、性质和组分，例如分离形式或混合或组合形式的任何小分子、核酸、脂质、肽、多肽，包括抗体如嵌合抗体、人源化抗体或完全的人抗体或抗体片段、衍生自它们的肽-或非肽模拟物、双特异性或多特异性抗体、单链(例如scFv)抗体或单结构域抗体、或抗体模拟物、例如acticalin或基于纤连蛋白的结合分子(例如trinectin或adnectin)等。
本发明还包括用于鉴定上述激动剂、拮抗剂、配体、受体、底物、酶的方法中的筛选试剂盒。
本发明包括用上述方法发现的能调节本发明多肽活性或抗原性的激动剂、拮抗剂、配体、受体、底物、酶和其它化合物。
如上所述，认为可用本发明的多种成分(即本发明第一方面的多肽，本发明第二或第三方面的核酸分子、本发明第四方面的载体、本发明第五方面的宿主细胞、本发明第六方面的配体、本发明第七方面的化合物)治疗和诊断疾病。为了评估本发明的成分治疗或诊断疾病的用途，可进行以下一种或多种试验。注意，虽然以下某些试验中涉及的测试化合物是蛋白质/多肽，但本领域技术人员仍能够很容易地调整以下试验，从而使得本发明的其它部分也可用作“测试化合物”。
本发明还提供了包含本发明多肽、核酸、配体或化合物以及合适的药物学载体的药物组合物。这些组合物适合作为治疗或诊断试剂、疫苗、或其它免疫原性组分，见下文详细描述。
按照本文中所用的术语学，当某组合物中X占X+Y总重的至少85％时，包含多肽、核酸、配体或化合物的该组合物(X)为“基本上没有”杂质(本文中为Y)。优选X占该组合物X+Y总重的至少约90％，更优选至少占总重的95％、98％、98.5％或甚至99％。
该药物组合物优选应包括治疗有效量的本发明多肽、核酸、配体或化合物。本文所用术语“治疗有效量”指治疗、改善或预防目标疾病或病情、或显示具有可检测的治疗或预防效果所需的治疗剂用量。对任何化合物，可最初使用细胞培养试验(例如癌细胞)或在动物模型(常用小鼠、兔、狗或猪)中估计治疗有效剂量。也可用动物模型来确定给药的合适浓度范围和途径。然后利用这些信息确定人体给药的剂量和途径。
人体对象的精确有效用量取决于疾病情况的严重程度、对象的总体健康状况、年龄、体重和性别、饮食、给药时间和频率、药物组合、反应敏感度、和对治疗的耐受/响应。此用量可通过常规实验确定并属于临床医生的判断之内。常用的有效剂量为0.01mg/kg-50mg/kg，优选0.05mg/kg-10mg/kg。可将组合物单独给予患者或与其它制剂、药物或激素联合给予。
药物组合物也可含有药学上可接受的载体以给予治疗药物。这类载体包括抗体和其它多肽、基因和其它治疗剂例如脂质体，只要该载体本身不会诱导产生对接受此组合物的个体有害的抗体，并且给予后无过度毒性。合适的载体可以是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物和灭活的病毒颗粒。
可采用药学上可接受的盐，例如矿物酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；和有机酸盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。关于药学上可接受运载体的全面论述可参见“Remington′s PharmaceuticalSciences”(《雷明顿药物科学》，Mack Pub.Co.，N.J.1991)。
治疗组合物中的药学上可接受的载体另可包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。此外这类组合物中可存在辅助物质，如增湿剂或乳化剂、pH缓冲剂等。此种载体能将该药物组合物配制成可供患者摄取的片剂、丸剂、糖锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等。
一旦配制好本发明的组合物可将其直接给予对象。要治疗的对象可以是动物，尤其可用于治疗人。
本发明所用的药物组合物可通过许多途径给药，包括但不限于：口服、静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、经皮或透皮给药(例如见WO98/20734)、皮下、腹膜内、鼻内、肠道内、局部、舌下、阴道内或直肠内给药。也可用基因枪或无针注射器给予本发明药物组合物。通常将此治疗组合物制备成可注射剂型，作为液体溶液或悬浮液；也可制备成适合在注射前用液体载体配制成溶液或悬浮液的固体剂型。
所述组合物的直接递送通常通过皮下、腹膜内、静脉内或肌肉内注射进行，或递送至组织内部间隙。也可将该组合物递送至病灶处。治疗剂量可以是单剂量方案或多剂量方案。
如果对某具体疾病本发明多肽的活性过高，有几种方法可采用。一种方法包括给予对象有效量的上述抑制化合物(拮抗剂)以及药学上可接受的载体以抑制该多肽的功能，如阻断配体、底物、酶、受体的结合，或抑制第二信号，从而缓解异常状况。这种拮抗剂优选抗体。最优选这种抗体是上述的嵌合和/或人源化抗体以最大程度减少其免疫原性。
另一种方法，可给予保留了对所讨论的所述配体、底物、酶、受体结合亲和力的可溶形式多肽。通常可以保留了相关(活性)部分的片段形式给予该多肽。
在另一种方法中，可利用表达阻断技术，如利用内部产生的或另外给予的反义核酸分子(如上所述)，来抑制所述多肽编码基因的表达。用设计的针对所述多肽编码基因控制、5’端或调控区(信号序列、启动子、增强子和内含子)的互补序列或反义分子(DNA、RNA或PNA)来调节基因表达。类似地，可用“三螺旋”碱基配对方法实现这种抑制。采用三螺旋配对是因为它能抑制双螺旋打开到足以使聚合酶、转录因子、或调节分子结合。文献中已报导了近年利用三螺旋DNA治疗的进展(Gee，JE等，1991，登于：Huber，B.E.和B.I.Carr：Molecular and Immunologic Approaches，Futura Publishing Co.，Mt.Kisco，NY)。也可设计互补序列或反义分子通过阻止转录本与核糖体结合而阻断mRNA的翻译。可给予或通过体内表达原位产生这种寡核苷酸。
此外，可用对编码本发明多肽的mRNA序列具有特异性的核酶来防止本发明多肽的表达。核酶是具有催化活性的RNA，可以是天然产生的或合成的(见例如Usman，N等，Curr.Opin.Struct.Biol(1996)6(4)，527-33)。可用设计的合成核酶在所选位点特异性切割mRNA从而防止该mRNA翻译成功能性多肽。可合成含有通常在RNA分子中所见的天然核糖磷酸骨架和天然碱基的核酶。或者，可合成含有非天然骨架的核酶，如2’-甲基RNA来保护其不受核糖核酸酶的降解，和可含有经过修饰的RNA分子。
可修饰RNA分子来提高其胞内稳定性和半寿期。可能的修饰包括但不限于：在该分子的5’和/或3’末端加入侧翼序列，或在该分子的骨架中采用硫代磷酸酯键或2’O-甲基键而不是磷酸二酯键。这是产生PNA时的原先观点，但可扩展到含非传统碱基，如内切核酸不易识别的肌苷、queosine和butosine，及乙酰基、甲基、硫代修饰和类似修饰的腺苷、胞苷、鸟苷、胸苷和尿苷。
为治疗与本发明多肽低表达因而其活性低下相关的异常疾病，有几种方法可利用。一种方法包括给予对象治疗有效量的能活化该多肽的化合物，即上述激动剂来缓解所述异常。或者，可给予治疗的该多肽与合适的药学载体的组合物来恢复该多肽的相关生理平衡。
可采用基因治疗来影响对象相关细胞内源产生该多肽。基因治疗可通过用校正的治疗基因替代有缺陷的基因而永久性治疗该多肽产生的失调。
可在体内或离体进行本发明的基因治疗。离体基因治疗需要分离和纯化患者的细胞和引入治疗基因，再将基因已改变的细胞返回给该患者。相反，体内基因治疗不需要分离和纯化患者的细胞。
通常要“包装”治疗基因以给予患者。基因递送载体可以是非病毒如脂质体，或复制缺陷型病毒如Berkner，K.L.Curr.Top.Microbiol.Immunol.158，39-66(1992)所述的腺病毒，或Muzyczka，N.，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158，97-129(1992)和美国专利No.5,252,479所述的腺伴随病毒(AAV)载体。例如，可工程改造编码本发明多肽的核酸分子使之适合在复制缺陷型逆转录病毒载体中表达。可分离此表达构建物，将其引入用含有编码该多肽的RNA的逆转录病毒载体质粒转导的包装细胞中，从而使得这种包装细胞即能产生含感兴趣基因的感染性病毒颗粒。可给予对象这些生产细胞，以在体内工程改造其细胞而在体内表达所述多肽(见Human Molecular Genetics(1996)，T Strachan和A P Read，BIOS Scientific Publishers Ltd的第20章，“基因治疗和其它以分子遗传学为基础的治疗方法”及其中引用的参考文献)。
另一方法是给予“裸DNA”，其中将治疗基因直接注射入血流或肌肉组织中。
在本发明的多肽或核酸分子是致病因子的情况下，本发明可利用它们作为疫苗来产生对抗此种致病因子的抗体。
本发明的疫苗可以是预防性(即防止感染)或治疗性(即治疗感染所致疾病)疫苗。这类疫苗含有一种或多种免疫用抗原、免疫原、多肽、蛋白质或核酸，常与上述药学上可接受的载体(其包括本身不会诱导接受该组合物的个体产生对其有害作用抗体的任何载体)相组合应用。此外，这些载体可起着免疫刺激剂(“佐剂”)作用。另外，可将抗原或免疫原偶联于细菌类毒素，如来自白喉、破伤风、霍乱、幽门螺杆菌(H.pylori)和其它病原体的类毒素。
由于多肽在胃内会被降解，故含多肽的疫苗宜通过胃肠道外(如皮下、肌肉内、静脉内或皮内注射)给药。适合胃肠道外给药的剂型包括含水或无水的灭菌可注射溶液，可含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和赋予制剂与接受者血液等渗的溶质。含水和非水无菌悬浮液可包含悬浮剂或增稠剂。
本发明的疫苗制剂可装在单剂或多剂型容器中。例如密封安瓿和小瓶中，可以冻干状态贮存，临用时只需要加入无菌液体载体即可使用。剂量取决于疫苗的比活，该比活不难用常规实验确定。
通过基因递送能结合本发明多肽的抗体也是有效的，例如国际专利申请WO98/55607所述。此疫苗组合物制剂也可采用称为瞬时注射的技术(例如参见www.powderject.com)。
国际专利申请WO00/29428中描述了许多疫苗接种的合适方法和疫苗递送系统。
本发明也涉及本发明核酸分子作为诊断试剂的应用。检测与功能失调相关的以本发明核酸分子突变为特征的突变形式基因可提供诊断工具，帮助或明确患有因该基因表达低下、过度表达或改变表达的空间或时间改变所导致的疾病，或怀疑患有此类疾病的诊断。可用各种技术在DNA水平上检测携带有该基因突变的个体。
诊断用核酸分子可获自对象的细胞，如血液、尿液、唾液、组织活检样品或尸检材料中的细胞。可直接检测基因组DNA，或可用PCR、连接酶链反应(LCR)、链置换扩增(SDA)或其它扩增技术扩增基因组DNA(见Saiki等，Nature，324，163-166(1986)；Bej，等，Crit.Rev.Biochem.Molec.Biol.，26，301-334(1991)；Birkenmeyer等，J.Virol.Meth.35，117-126(1991)；Van Brunt，J.Bio/Technology，8，291-294(1990))，然后进行分析。
在一实施方式中，本发明此方面提供诊断患者疾病的方法，包括评估编码本发明多肽的天然基因的表达水平，将所述表达水平与对照水平作比较，当表达水平与所述对照水平有差异时表明患病。此方法包括以下步骤：
a)在允许本发明核酸分子与探针形成杂交复合物的严格条件下使患者的组织样品接触核酸探针；
b)在与步骤a)相同的条件下使对照样品接触所述探针；
c)和检测所述样品中杂交复合物的存在；
其中检测到患者样品中的复合物水平不同于对照样品中的杂交复合物水平时，表明患有疾病。
本发明另一方面包括一种诊断方法，其包括：
a)获得要检测疾病的患者组织样品；
b)分离所述组织样品中的本发明核酸分子；和
c)通过检测与疾病相关的核酸分子中突变的存在，诊断患者的疾病。
为有助于上述方法中对核酸分子的检测，可包括扩增步骤，如用PCR扩增。
可通过扩增产物与正常基因型比较下的大小变化，检测缺失和插入。可使扩增的DNA与本发明的标记RNA、或标记的本发明反义DNA序列杂交，来鉴定点突变。可用RNA酶消化或评估解链温度的差异来鉴别完全匹配的序列与错配的双链体。可如下检测患者中是否存在所述突变：使患者的DNA与核酸探针接触，该探针能在严格条件下与该DNA杂交，从而形成杂交双链分子，该杂交双链分子在对应于与疾病相关突变的任何部分中存在不能与核酸探针链杂交的部分；检测该探针链是否存在未杂交部分，可作为DNA链相应部分中是否存在疾病相关突变的指标。
这种诊断对出生前甚至新生儿检测特别有用。
可用其它熟知的技术，如直接DNA测序或单链构象多态性分析，来鉴定参比基因与“突变”基因之间的点突变和其它序列差别(见Orita等，Genomics，5，874-879(1989))。例如，可采用测序引物与双链PCR产物或改良PCR法产生的单链模板分子。用放射标记的核苷酸以常规方法或用荧光标记的自动化测序方法测定序列。将克隆的DNA区段用作探针来检测特定DNA区段。当与PCR结合时此法的灵敏度大大提高。此外，可如上所述，例如通过采用等位基因-特异性寡核苷酸进行只有一个核苷酸不同的序列的PCR扩增，来检测点突变和其它序列差异，如多态性。
也可通过在加有或没有变性剂的凝胶中DNA片段电泳迁移率的变化，或直接DNA测序来检测DNA序列的差异(如Myers等，Science(1985)230：1242)。也可用核酸酶保护试验，如RNA酶和S1保护，或化学切割方法来揭示特定位置的序列变化(见Cotton等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)85：4397-4401)。
除常规凝胶电泳和DNA测序列外，也可用原位分析检测微小缺失(microdeletion)、非整倍体、转位、倒置等突变(见例如，Keller等，“DNAProbes”《DNA探针》，第2版.，Stockton Press，New York，N.Y.，USA(1993))，原位分析是不需要分离DNA或RNA序列和/或将其固定在膜上即可分析细胞中中DNA或RNA序列的突变。原位荧光杂交(FISH)是最常用的方法，有许多关于FISH的综述可参考(见例如Trachuck等，Science，250，559-562(1990)，和Trask等，Trends，Genet，7，149-154(1991))。
在本发明另一实施方式中，可构建含本发明核酸分子的寡核苷酸探针阵列来有效筛检基因变异、突变和多态性。阵列技术方法是众所周知的并已广泛应用，可用来解决分子遗传学的多种问题，包括基因表达、遗传连锁和遗传变异(见例如M.Chee等，Science(1996)，274卷：610-613)。
在一实施方式中，采用PCT申请WO95/11995(Chee等)；Lockhart，D.J.等.(1996)Nat.Biotech.14：1675-1680)和Schena，M.等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci，93：10614-10619)所述的方法制备和使用所述阵列。寡核苷酸对的数目范围从二对至超过一百万对。用光导化学方法在基材指定区域上合成寡聚物。所述基材可以是纸、尼龙膜或其它类型的膜、滤膜、芯片、玻璃载玻片或任何其它适合的固相支持物。另一方面，可用化学偶联方法和喷墨施加装置(如PCT申请WO95/25116，Baldeschweiler等所述)在基材表面合成寡核苷酸。另一方面，可采用类似于斑点(或窄缝)的“栅格”阵列，用真空系统、热、UV、机械或化学粘合方法将cDNA片段或寡核苷酸安置和连接于基材表面。可用手工或可利用的装置(窄缝式点杂交法或斑点印迹装置)、材料(任何合适的固相支持物)和机器(包括机器人设备)来产生上述阵列，此阵列可含有8、24、96、384、1536或6144种寡核苷酸，或二至超过一百万之间的任何其它数目的寡核苷酸，使其本身能有效利用商品化设备。
除上述方法外，诊断疾病的方法包括测定对象样品中多肽或其mRNA水平的异常降低或升高。在RNA水平检测表达的降低或升高可采用本领域熟知的定量测定多聚核苷酸的方法，例如核酸扩增，如PCR、RT-PCR、RNA酶保护、RNA印染法和其它杂交方法。
可用于测定来自宿主的样品中本发明多肽水平的试验技术是本领域技术人员熟知的，在以上章节中有一些详述(包括放射免疫试验、竞争结合试验、蛋白质印染分析和ELISA试验)。本发明此方面提供的诊断方法，包括步骤：(a)使上述配体在适合形成配体-多肽复合物的条件下接触生物样品；和(b)检测所述复合物。
检测多肽水平的诸如ELISA、RIA和FACS等方法还可提供诊断多肽表达水平改变或异常的依据。在适合复合物形成的条件下，使取自正常哺乳动物(优选人)的体液或细胞提取物与抗该多肽的抗体结合而建立此多肽表达的正常值或标准值。可用各种方法如光度测定法，定量测定形成的标准复合物量。
可用能特异性结合本发明多肽的抗体来诊断以该多肽表达(异常)为特征的疾病，或用于试验来监测用本发明多肽、核酸分子、配体和其它化合物治疗的患者(病情)。可用与以上疗法所述相同的方法制备诊断用的抗体。该多肽的诊断试验包括利用抗体和标记物检测人的体液或细胞、组织提取物中的该多肽。可采用含有修饰或没有修饰的所述抗体，和可将抗体与报告分子共价或非共价结合来标记这种抗体。可采用本领域熟知的各种报告分子，其中几种前文已有描述。
将对象、对照和患病活检组织样品中表达的该多肽含量与标准值作比较。标准值与对象值之间的差异可提供诊断疾病的参数。可用诊断试验鉴别此多肽的存在与否及过量表达，和在治疗干预期间对此多肽水平的调节进行监测。也可在动物研究、临床试验或监测患者个体的治疗中用此种试验评价具体治疗方案的疗效，。
一种本发明的诊断试剂盒装有：
(a)本发明的核酸分子；
(b)本发明的多肽；或
(c)本发明的配体。
在本发明一个方面，诊断试剂盒中包含：第一容器，其装有能在严格条件下与本发明核酸分子杂交的核酸探针；第二容器，其装有扩增该核酸分子用的引物；和使用所述探针和引物进行疾病诊断的说明书。该试剂盒还可包含第三个容器，其装有用于消化未杂交RNA的试剂。
在本发明的另一方面，诊断试剂盒可装有核酸分子阵列，此阵列中至少一种是本发明的核酸分子。
为检测本发明的多肽，诊断试剂盒可装有能结合本发明多肽的一种或多种抗体；和用于检测所述抗体与该多肽之间结合反应的试剂。
用此试剂盒可诊断的疾病或对疾病的易感性，具体包括但不限于：视力疾病(如夜盲)、免疫系统疾病(如自身免疫病)、炎症、炎性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎(UC)、克罗恩病(CD)、直肠炎、细胞增殖疾病、癌症(如乳腺癌)、微生物感染(如病毒、细菌和真菌感染)、肺气肿、皮肤病、生殖疾病(如不育，特别是男性不育)、肾功能失调、心肌梗塞、关节炎、多发性硬化症、巨囊性乳腺病和调节神经系统的发育。
现通过实施例并具体参考INSP181多肽来更详细描述本发明的各个方面内容和实施方式。
应理解可对详述作出修改但不脱离本发明的范围。
附图简要说明
图1：INSP181与公众蛋白质数据库的BLAST结果。
图2：INSP18与blast最高命中序列的对比。
图3：INSP181的信号P输出。
图4：INSP181与含相关脂质运载蛋白功能域序列的多序列对比。
图5：INSP181的DNA和蛋白质序列。箭头指出PCR引物的位置和方向(sense)。
图6：用INSP181-CP3和INSP181-CP4 PCR引物克隆的cDNA与预计的INSP181的核苷酸序列对比。
图7：用INSP181-CP3和INSP181-CP4 PCR引物克隆的cDNA与预计的INSP181的氨基酸序列对比。
图8：用引物INSP181-CP3和INSP181-CP4克隆的INSP181 PCR产物的核苷酸序列和翻译。
图9：用引物INSP181-CP3和INSP181-CP4克隆的INSP181-SV PCR产物的核苷酸序列和翻译。
图10：INSP181的NetNGyc结果。糖基化位点标出在92位。
图11：INSP181序列的翻译和特征。
图12：通过RT-PCR(TaqMan)测定的INSP181在人的主要组织中表达。
图13：通过RT-PCR(TaqMan)测定的INSP181在获自IL18BP临床试验的患病皮肤活检组织中表达。
图14：显示INSP181中预测的脂质运载蛋白功能域的结构域专业信息(Domain Professor inforation)。
图15：脂质运载蛋白功能域的家族/残基信息，显示预测的二级结构和二硫键位置。
表1
    氨基酸  同义组  更优选的同义组
    Ser  Gly，Ala，Ser，Thr，Pro  Thr，Ser
    Arg  Asn，Lys，Gln，Arg，His  Arg，Lys，His
    Leu  Phe，Ile，Val，Leu，Met  Ile，Val，Leu，Met
    Pro  Gly，Ala，Ser，Thr，Pro  Pro
    Thr  Gly，Ala，Ser，Thr，Pro  Thr，Ser
    Ala  Gly，Thr，Pro，Ala，Ser  Gly，Ala
    Val  Met，Phe，Ile，Leu，Val  Met，Ile，Val，Leu
    Gly  Ala，Thr，Pro，Ser，Gly  Gly，Ala
    Ile  Phe，Ile，Val，Leu，Met  Ile，Val，Leu，Met
    Phe  Trp，Phe，Tyr  Tyr，Phe
    Tyr  Trp，Phe，Tyr  Phe，Tyr
    Cys  Ser，Thr，Cys  Cys
    His  Asn，Lys，Gln，Arg，His  Arg，Lys，His
    Gln  Glu，Asn，Asp，Gln  Asn，Gln
    Asn  Glu，Asn，Asp，Gln  Asn，Gln
    Lys  Asn，Lys，Gln，Arg，His  Arg，Lys，His
    Asp  Glu，Asn，Asp，Gln  Asp，Glu
    Glu  Glu，Asn，Asp，Gln  Asp，Glu
    Met  Phe，Ile，Val，Leu，Met  Ile，Val，Leu，Met
    Trp  Trp，Phe，Tyr  Trp
表2
    氨基酸  同义组
    Ser  D-Ser，Thr，D-Thr，别-Thr(allo-Thr)，Met，D-Met，Met(O)，D-Met(O)，L-Cys，D-Cys
    Arg  D-Arg，Lys，D-Lys，高-Arg，D-高-Arg，Met，Ile，D-.Met，D-Ile，Orn，D-Orn
    Leu  D-Leu，Val，D-Val，AdaA，AdaG，Leu，D-Leu，Met，D-Met
    Pro  D-Pro，L-I-噻唑烷(thioazolidine)-4-羧酸，D-或L-1-噁唑烷-4-羧酸
    Thr  D-Thr，Ser，D-Ser，别-Thr，Met，D-Met，Met(O)，D-Met(O)，Val，D-Val
    Ala  D-Ala，Gly，Aib，B-Ala，Acp，L-Cys，D-Cys
    Val  D-Val，Leu，D-Leu，Ile，D-Ile，Met，D-Met，AdaA，AdaG
    Gly  Ala，D-Ala，Pro，D-Pro，Aib，β.-Ala，Acp
    Ile  D-Ile，Val，D-Val，AdaA，AdaG，Leu，D-Leu，Met，D-Met
    Phe  D-Phe，Tyr，D-Thr，L-Dopa，His，D-His，Trp，D-Trp，反式-3，4，或5-苯基脯氨酸，AdaA，AdaG，顺式-3，4，或5-苯基脯氨酸，Bpa，D-Bpa
    Tyr  D-Tyr，Phe，D-Phe，L-Dopa，His，D-His
    Cys  D-Cys，S--Me--Cys，Met，D-Met，Thr，D-Thr
    Gln  D-Gln，Asn，D-Asn，Glu，D-Glu，Asp，D-Asp
    Asn  D-Asn，Asp，D-Asp，Glu，D-Glu，Gln，D-Gln
    Lys  D-Lys，Arg，D-Arg，高-Arg，D-高-Arg，Met，D-Met，Ile，D-Ile，Orn，D-Orn
    Asp  D-Asp，D-Asn，Asn，Glu，D-Glu，Gln，D-Gln
    Glu  D-Glu，D-Asp，Asp，Asn，D-Asn，Gln，D-Gln
    Met  D-Met，S--Me--Cys，Ile，D-Ile，Leu，D-Leu，Val，D-Val
实施例
实施例1：INSP181
对NCBI非冗余序列数据库用INSP181多肽序列作BLAST查询。图1显示BLAST查询得到的10个最匹配序列。图2显示INSP181查询序列与blast命中的最匹配(序列)的排列对比。克隆的INSP181cDNA可在原核或真核表达系统中表达INSP181蛋白质，并可随后对其进行纯化和特征鉴定。例如，利用重组INSP181来产生INSP181的特异性单克隆或多克隆抗体，这些抗体可用于INSP181的生物化学特征鉴定。或者，重组INSP181可用于各种筛选试验，包括上述那些试验和以下实施例5中所述的那些试验。
实施例2：克隆INSP181和INSP181SV
2.1制备人cDNA模板
用Superscript II或SuperScript III RNA酶H-逆转录酶(Invitrogen)按厂商方案从各种人组织总RNA样品(Clontech，Stratagene，Ambion，BiochainInstitutr和自己制备)中制备第一链cDNA。
对于SuperScript II：在1.5ml Eppendorf小管中混合寡聚(dT)15引物(1μl，500μg/ml)(Promega)、2μg人总RNA、1μl10mM dNTP混合液(dATP、dGTP、dCTP和dTTP各10mM，中性pH)和灭菌双蒸水至最终体积12μl，65℃加热5分钟，冰上冷却。简单离心收集内含物，加入4μl 5x第一链缓冲液、2μl 0.1MDTT和1μl RNA酶OUTTM重组核糖核酸酶抑制剂(40单位/μl，Invitrogen)。轻轻混合管中的内容物，42℃孵育2分钟，然后加入1μl(200单位)SuperScriptIITM酶，轻轻抽吸混合。42℃孵育该混合物50分钟，然后70℃加热15分钟灭活。为去除与该cDNA互补的RNA，加入1μl(2单位)大肠杆菌RNA酶H(Invitrogen)，37℃孵育反应混合物20分钟。
对于SuperScript III：在1.5ml Eppendorf小管中混合1μ寡聚(dT)20引物(50M，Invitrogen)、2μg人总RNA、1μl10mM dNTP混合液(dATP、dGTP、dCTP和dTTP各10mM，中性pH)和灭菌双蒸水至最终体积10μl，65℃加热5分钟，冰上冷却。对于各RT反应，如下制备cDNA合成混合物：在一独立试管中混合2μl 10X RT缓冲液、4μl 25mM MgCl2、2μl 0.1M DTT、1μl RNA酶OUTTM(40U/μl)和1μl SuprtScript IIITMRT酶，然后将10μl该混合物加入到含RNA/引物混合液的试管中。轻轻混合试管内容物，简单离心收集，50℃孵育50分钟。80℃孵育5分钟终止反应，然后冰上冷却反应混合物，简单离心收集。为去除与该cDNA互补的RNA，加入1μl(2单位)大肠杆菌RNA酶H(Invitrogen)，37℃孵育反应混合物20分钟。
加入179μl灭菌水稀释21μl最终反应混合物至总体积200μl。混合合并RNA样品，各合并物(pool)含5个不同的cDNA样品。取各cDNA合并物5μl用作PCR的模板，最终反应体积50μl，该合并物由各cDNA样品1μl组成。这代表了约20ng的各个cDNA模板。
2.2cDNA库
人cDNA库(于噬菌体λ载体中)购自Stratagene，Clontech或Invitrogen，或在Serono Pharmaceutical Research Institute按照厂商(Stratagene和Clontech)方案用λZAP、λGT10、λGT11或Trip1Ex2载体制备。用Wizard Lambda PrepsDNA纯化系统，按厂商说明书(Promega.Corporation，Madison WI)从感染大肠杆菌宿主菌株小规模培养物中制备噬菌体λDNA。
2.3基因特异性克隆PCR引物
用引物设计软件(Scientific&Educational Software，PO Box 72045，Durham，NC27722-2045，USA)设计长18-30个碱基的两对PCR引物，用于扩增INSP181的预测cds。优化该PCR引物使其Tm接近55±10℃，GC含量为40-60％。选择对靶序列(INSP181)有高度选择性而不会或极少发生非特异性引导的引物。设计的引物可形成两个嵌套引物对，使INSP181-CP3/INSP181-CP4引物位于INSP181-CP1/INSP181-CP2引物之内。
2.4以人cDNA为模板用PCR扩增INSP181
设计基因特异性克隆引物INSP181-CP1和INSP181-CP2(表1，图5)来扩增含INSP181 cds的540bp cDNA片段。该对引物与一组cDNA库一起应用，以合并的人cDNA样品作为PCR模板。此PCR1的最终体积为50μl，含1XAmpliTaqTM缓冲液、200μM dNTP、50pM的各克隆引物、2.5单位AmpliTaqTM酶(Applied Biosystems)和约20ng的cDNA库模板或100ng cDNA合并模板，采用MJ RESEARCH DNA ENGINE，扩增程序如下：94℃2分钟后，40轮：94℃1分钟，55℃1分钟和72℃1分钟，然后1轮：72℃7分钟，和4℃的保持循环。
然后用各PCR1产物作为PCR2的模板，所用扩增引物为INSP181-CP3/INSP181-CP4(表1，图5-9)，该引物设计用其扩增INSP181-CP1/INSP181-CP2产物中496bp的cDNA片段。PCR2的最终体积为50μl，含1XAmpliTaqTM缓冲液、200μM dNTP、50pM的各克隆引物、2.5单位AmpliTaqTM(Applied Biosystems)和1μl PCR产物1，采用MJ RESEARCHDNA ENGINE，扩增程序如下：94℃2分钟后，40轮：94℃1分钟，59℃1分钟和72℃1分钟，然后1轮：72℃7分钟，和4℃的保持循环。
取30μl各PCR1和PCR2扩增产物在0.8％琼脂糖凝胶上(Invitrogen)于1XTAE缓冲液(Invitrogen)中显示观察。用Wizard PCR Preps DNA纯化系统(Promega)，以50μl水洗脱，从凝胶中纯化得到接近预计分子量(对于PCR1为540bp，对于PCR2为496bp)的产物，直接亚克隆。
2.5亚克隆PCR产物
用购自Invitrogen公司的TA克隆试剂盒，将PCR产物亚克隆到拓扑异构酶I修饰的克隆载体(pCR4-TOPO)中，所用条件按厂商确定。简言之，室温孵育4μl凝胶纯化的PCR产物与1μl TOPO载体和1μl盐溶液15分钟。然后如下用该反应混合物转化大肠杆菌菌株TOP10(Invitrogen)：在冰上融化50μl一份的One Shot TOP10细胞，加入2μl TOPO反应液。冰上孵育该混合物15分钟，然后42℃精确孵育30秒热激此混合物。样品重置冰上加入250μl温热(室温)的SOC培养液。37℃摇动(220rpm)孵育样品1小时。然后将该转化混合物接种于含氨苄青霉素(100μg/ml)的L-肉汤(LB)平板上，37℃孵育过夜。
2.6菌落PCR
用灭菌牙签将菌落接种入50μl灭菌水中。然后取10μl一份接种物作PCR，总反应体积20μl，含1X AmpliTaqTM缓冲液、200μM dNTP、20pM T7引物、20pM T3引物、1单位AmpliTaqTM(Applied Biosystema)，采用MJResearch DNA Engine，循环条件如下：94℃2分钟；然后30轮：94℃30秒，48℃30秒和72℃1分钟，样品维持在4℃(保持循环)，然后作进一步分析。
在1％琼脂糖凝胶上于1X TAE缓冲液中分析PCR产物。将能产生接近预计分子量(540bp或，因加入了多克隆位点(MCS)的496bp+105bp)PCR产物的菌落在含氨苄青霉素(100μg/ml)的5ml L-肉汤(LB)中37℃、220rpm振摇生长过夜。
2.7质粒DNA的制备和测序
用Biorobot 8000 robotic系统(Qiagen)或Wizard Plus SV Minipreps试剂盒(Promega，目录号1460)，按厂商说明书以5ml培养物制备小量质粒DNA。用80μl灭菌水洗脱得到质粒DNA。用EppendrofBO光度计或Spectramax 190光度计(Molecular Devices)测定DNA浓度。用BigDye Terminator系统(AppliedBiosystems，目录号4390246.)和测序引物T7和T3，按厂商说明书对质粒DNA(200-500ng)的DNA测序。用Dye-Ex柱(Qiagen)或Montage SEQ 96提纯平板(Miliipore，目录号LSKS09624)纯化测序反应物，然后在Applied Biosystems3700测序仪上分析。
序列分析鉴定到一个在PCR2中从含有衍生自粥样硬化斑和嗜碱粒细胞的cDNA的合并物扩增得到的克隆，其含有预计的INSP181-CP3/INSP181-CP4 PCR产物序列。此克隆的cDNA片段的序列见图8。此克隆的PCR产物位于质粒pCR4-TOPO-INSP181中。
鉴定到的第二个克隆是在PCR2中从含有衍生自唾液腺、肾上腺、眼睛、和Stratagene通用参考RNA模板的合并物扩增得到的，其含有预计的INSP181-CP3/INSP181-CP4产物，但在外显子4起点处插入有25个氨基酸。此插入导致F113V氨基酸取代。与基因组DNA序列比较，此克隆也含有N92T和G114S氨基酸取代，这可能是PCR诱导产生的错误，虽然在此阶段也不能排除多态性。此克隆cDNA片段的序列见图9。此克隆的PCR产物位于质粒pCR4-TOPO-INSP181-SV1中。
表1
 引物  序列(5’-3’)
 INSP181-CP1  CCC TGG AGA AAG GCC CGC TCC TG
 INSP181-CP2  AGG GTG GGG GAC ATG GGC CAT C
 INSP181-CP3  GCT GCT GGC CCT TGG CCT GG
 INSP181-CP4  TAT GTT GAA GAC CGG GGC TTT CTG
 T7  TAA TAC GAC TCA CTA TAG G
 T3  ATT AAC CCT CAC TAAAGG
实施例3：产生融合于框内6HIS标签序列的Gateway相容性INSP181 ORF
用嵌套式PCR方法克隆INSP181，因此插入在pCR4-TOPO克隆(质粒pCR4-TOPO-INSP181)中的cDNA失去了编码序列5’末端的26bp和3’末端的21bp。通过在PCR扩增所用的引物中包括相应的核苷酸，实现了掺入丢失的核苷酸、6HIS标签和终止密码子。克隆用的PCR引物序列见表2。
表2
Figure S2006800153195D00631
下划线序列＝Kozak序列。黑体字＝终止密码子。斜体字序列＝His标签。
将质粒pCR4-TOPO-INSP181用作PCR的模板，产生含C-末端6HIS标签和终止密码子的全长ORF。此Gateway克隆方法的第一阶段包括二步PCR反应，产生5’末端侧接一个attB1重组位点和Kozak序列和3’末端侧接编码框内6组氨酸(6HIS)标签、终止密码子和attB2重组位点的INSP181的全长ORF(Gateway相容性cDNA)。第一步PCR的反应物PCR1(最终体积50μl)分别含有：1μl(25ng)质粒pCR4-TOPO-INSP181、4.0μl dNTP(10mM)、5μl 10XPfx聚合酶缓冲液、1μl MgSO4(50mM)、1.0μl各基因特异性引物(至最终100pM)(INSP181 MAT FP和INSP181 MAT RP)和0.5μl Platinum Pfx DNA聚合酶(Invitrogen)。进行PCR反应所用的最初变性步骤为95℃2分钟，然后30轮：94℃30秒、64℃30秒和68℃1分钟，最终延伸循环为68℃5分钟和4℃的保持循环。用Perfectprep Gel提纯试剂盒(Eppendrof)，按厂商说明书直接纯化扩增产物，以50μl灭菌水回收。取一份2μl用1X TAE缓冲液在1.6％琼脂糖凝胶上电泳观察验证产物的预期分子量(543bp+24bp＝567bp)。
第二步PCR反应(最终体积50μl)含有1μl稀释的纯化PCR1产物(终浓度10ng)、4.0μl dNTP(10mM)、5μl 10X Pfx聚合酶缓冲液、1μl MgSO4(50mM)、1.0μl各Gateway转变引物(至终浓度100pM)(INSP181 ATTB1 FP和ATTB1 PCR RP)和0.5μl Platinum Pfx DNA聚合酶。第二步PCR反应的条件是：95℃2分钟，然后30轮：94℃30秒、60℃30秒和68℃1分钟，最终延伸循环为68℃5分钟和4℃的保持循环。用Perfectprep Gel提纯试剂盒(Eppendrof)，按厂商说明书凝胶纯化PCR产物，以50μl灭菌水回收。取一份2μl用1X TAE缓冲液在1.6％琼脂糖凝胶上电泳观察以验证产物的预期分子量(567bp+64bp＝631bp)。
3.1将Gateway相容性INSP181-6HIS ORF亚克隆到Gateway进入质粒(entryvector)pDONR221中
Gateway克隆方法的第二阶段包括如下将Gateway修饰的PCR产物亚克隆到Gateway进入载体pDONR221(Invitrogen)中：将PCR2的5μl凝胶提取产物与1.5μl pDONR221载体(0.1μg/μl)、2μl BP缓冲液、1.5μl BP克隆酶(clonase enzyme)混合物(Invitrogen)混合，终体积10μl，室温孵育1小时。加入1μl蛋白酶K(2μg/μl)终止反应，37℃再孵育10分钟。如下用1份该反应物(2μl)转化DH5α菌株(Invitrogen)：冰上融化50μl一份DH5α细胞，加入2μl反应混合物。冰上孵育该混合物30分钟，42℃精确孵育30秒热激该混合物。样品返回置冰上，加入250μl温热的SOC培养液(室温)。37℃振摇(250rpm)孵育样品1小时。将转化混合物接种到含卡那霉素(40μg/ml)的L-肉汤(LB)平板上37℃培养过夜。
挑取5个转化子接种到含卡那霉素(40μg/ml)的LB琼脂平板上，37℃培养过夜。将一勺接种板生长培养物重悬于50μl水中，煮沸5分钟裂解细胞。离心细胞裂解液去除细胞碎片，将获得的上清液用作菌落PCR筛选的模板。
该PCR混合物(终体积25μl)含10μl离心后的细胞裂解物、2.0μldNTP(10mM)、2.5μl Taq聚合酶缓冲液、0.5μl筛选引物(至终浓度100pM)(21M13FP和ATTB1 PCR RP)和0.5μl Taq DNA聚合酶。
筛选PCR反应的条件是：95℃2分钟，然后30轮：94℃30秒、60℃30秒和72℃1分钟，最终延伸循环72℃5分钟和4℃的保持循环。将PCR产物加到1.6％琼脂糖凝胶上电泳验证片段大小。
选择一个阳性克隆，用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen)以5ml培养物制备小量质粒DNA。用CEQ Dye Terminator Cycle快速起动测序试剂盒(Beckman Coulter P/N 608120)按厂商说明书对所述质粒DNA(150-200ng)进行DNA测序，引物采用21M13和M13Rev。所述引物的序列见表2。在CEQ2000 XL DNA分析系统(Beckman Coulter P/N608450)上分析测序反应物。证实插入物pDONR221_INSP181-6HIS序列后用其产生表达克隆。
3.2将Gateway相容性INSP181 ORF亚克隆到表达载体pEAK12d和pDEST12.2中
然后将pDONR221_INSP181-6HIS的质粒DNA(2μl或约150ng)用于重组反应，该反应含1.5μl pEAK12d载体或pDEST12.2载体(0.1μg/μl)、2μlLR缓冲液和1.5μl LR克隆酶(Invitrogen)，终体积10μl。
加入1μl蛋白酶K(2μg/μl)终止反应，37℃再孵育10分钟。如下用一份反应物(2μl)转化DH5α菌株：冰上融化50μl一份DH5αα细胞，加入2μl反应混合物。冰上孵育该混合物30分钟，然后42℃精确孵育30秒热激该混合物。样品返回置冰上，加入250μl温热的SOC培养液(室温)。37℃振摇(250rpm)孵育样品1小时。将转化混合物接种到含氨苄青霉素(100μg/ml)的L-肉汤(LB)平板上37℃培养过夜。
挑取5个转化子接种到含氨苄青霉素(10μg/ml)的LB琼脂平板上，37℃培养过夜。将一勺接种板生长培养物重悬于50μl水中煮沸5分钟裂解细胞。离心细胞裂解液去除细胞碎片，获得的上清液用作菌落PCR筛选的模板。
该PCR混合物(终体积25μl)含10μl离心后的细胞裂解物、2.0μldNTP(10mM)、2.5μl Taq聚合酶缓冲液、0.5μl筛选引物(至终浓度100pM)和0.5μl Taq DNA聚合酶。用引物pEAK12 FP和INSP181 MAT RP筛选pEAK12d克隆，用引物21M13FP和INSP181 MAT RP筛选pDEST12.2克隆。
筛选PCR反应的条件是：95℃2分钟，然后30轮：94℃30秒、60℃30秒和72℃1分钟，最终延伸循环72℃5分钟和4℃的保持循环。将PCR产物加到1.6％琼脂糖凝胶上电泳验证片段大小。
选择一个阳性克隆，从5ml培养物用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen)制备小量质粒DNA。
对pEAK12d载体中的质粒DNA(150-200ng)进行DNA测序，测序引物为上述pEAK12 FP和pEAK12 RP。对pDEST12.2载体中的质粒DNA(150-200ng)进行DNA测序，测序引物为上述21M13 FP和M13Rev RP。
将经序列验证的克隆命名为：pEAK12d_INSP181-6HIS和pDEST12.2_INSP181-6HIS。
用Qiagen Maxi prep试剂盒按厂商说明书用500ml经序列验证的克隆pEAK12d_INSP181-6HIS培养物大量制备DNA。将该质粒DNA重悬于TE缓冲液中，浓度1μg/μl，-20℃贮存。
用EndoFree Plasmid Mega试剂盒(Qiagen)按厂商说明书用500ml经序列验证的克隆(pDEST12.2_INSP181-6HIS)培养物大量制备无内毒素DNA。将纯化的该质粒DNA重悬于无内毒素TE缓冲液中，最终浓度至少3μg/μl，-20℃贮存。
实施例4：产生融合于框内6HIS标签序列的Gateway相容性INSP181SV1 ORF
用嵌套式PCR方法克隆INSP181SV1，因此插入在pCR4-TOPO克隆(质粒pCR4-TOPO-INSP181-SV1)中的cDNA失去了编码序列5’末端的26bp和3’末端的21bp。还在测序时检测到导致氨基酸改变(N92T和G114S)的二个突变，这些突变需要纠正。通过在PCR扩增所用的引物中包括相应的核苷酸，完全实现了掺入丢失的核苷酸、6HIS标签和终止密码子。产生全长INSP181SV1进入克隆后，进行定点诱变纠正这二个突变。
将质粒pCR4-TOPO-INSP181-SV1用作PCR的模板，产生含C-末端6HIS标签和终止密码子的全长ORF。此Gateway克隆方法第一阶段包括二步PCR反应，产生5’末端侧接一个attB1重组位点和Kozak序列、3’末端侧接编码框内6组氨酸(6HIS)标签、终止密码子和attB2重组位点的INSP181的全长ORF(Gateway相容性cDNA)。第一步PCR的反应物PCR1(最终体积50μl)分别含有：1μl(25ng)质粒pCR4-TOPO-INSP181-SV1、4.0μl dNTP(10mM)、5μl 10X Pfx聚合酶缓冲液、1μl MgSO4(50mM)、1.0μl各基因特异性引物(至最终浓度100pM)(INSP181 MAT FP和INSP181 MAT RP)和0.5μl PlatinumPfx DNA聚合酶(Invitrogen)。进行PCR反应所用的最初变性步骤为95℃2分钟，然后30轮：94℃30秒、64℃30秒和68℃1分钟，最终延伸循环68℃5分钟和4℃的保持循环。用Perfectprep Gel提纯试剂盒(Eppendrof)，按厂商说明书直接纯化扩增产物，以50μl灭菌水回收。取一份2μl用1X TAE缓冲液在1.6％琼脂糖凝胶上电泳观察验证产物的预期分子量(618bp+24bp＝642bp)。
第二步PCR反应(最终体积50μl)含有1μl稀释的纯化PCR1产物(至终浓度10ng)、4.0μl dNTP(10mM)、5μl 10x Pfx聚合酶缓冲液、1μlMgSO4(50mM)、1.0μl各Gateway转变引物(至终浓度100pM)(INSP181ATTB1 FP和ATTB1 PCR RP)和0.5μl Platinum Pfx DNA聚合酶。第二步PCR反应的条件是：95℃2分钟，然后30轮：94℃30秒、60℃30秒和68℃1分钟，最终延伸循环68℃5分钟和4℃的保持循环。用Perfectprep Gel提纯试剂盒(Eppendorf)，按厂商说明书凝胶纯化PCR产物，以50μl灭菌水回收。取一份2μl用1X TAE缓冲液在1.6％琼脂糖凝胶上电泳观察验证产物的预期分子量(642bp+64bp＝706bp)。
4.1将Gateway相容性INSP181SV1-6HIS ORF亚克隆到Gateway进入质粒pDONR221中
Gateway克隆方法的第二阶段包括如下将Gateway修饰的PCR产物亚克隆到Gateway进入载体pDONR221(Invitrogen)中：将PCR2的5μl凝胶提取产物与1.5μl pDONR221载体(0.1μg/μl)、2μl BP缓冲液和1.5μl BP克隆酶混合物(Invitrogen)混合，终体积10μl，室温孵育1小时。加入1μl蛋白酶K(2μg/μl)终止反应，37℃再孵育10分钟。如下用1份该反应物(2μl)转化DH5α菌株(Invitrogen)：冰上融化50μl一份DH5α细胞，加入2μl反应混合物。冰上孵育该混合物30分钟，42℃精确孵育30秒热激该混合物。样品返回置冰上，加入250μl温热的SOC培养液(室温)。37℃振摇(250rpm)孵育样品1小时。将转化混合物接种到含卡那霉素(40μg/ml)的L-肉汤(LB)平板上37℃培养过夜。
挑取5个转化子接种到含卡那霉素(40μg/ml)的LB琼脂平板上，37℃培养过夜。将一勺接种板生长培养物重悬于50μl水中，煮沸5分钟裂解细胞。离心细胞裂解液去除细胞碎片，获得的上清液用作菌落PCR筛选的模板。
该PCR混合物(终体积25μl)含10μl离心后的细胞裂解物、2.0μldNTP(10mM)、2.5μl Taq聚合酶缓冲液、0.5μl筛选引物(至终浓度100pM)(21M13 FP和ATTB1 PCR RP)和0.5μl Taq DNA聚合酶。
筛选PCR反应的条件是：95℃2分钟，然后30轮：94℃30秒、60℃30秒和72℃1分钟，最终延伸循环为72℃5分钟和4℃的保持循环。将PCR产物加到1.6％琼脂糖凝胶上电泳验证片段大小。
选择一个阳性克隆，以5ml培养物用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen)制备少量质粒DNA。用CEQ Dye Terminator Cycle快速起动测序试剂盒(Beckman Coulter P/N 608120)按厂商说明书对质粒DNA(150-200ng)进行DNA测序，引物为21M13和M13Rev。所述引物的序列见表2。在CEQ 2000XL DNA分析系统(Beckman Coulter P/N 608450)上分析测序反应物。序列验证后，将pDONR221_INSP181SV1(N92T，G114S)-6HIS用作模板进行定点诱变以纠正这二个突变。
4.2INSP181SV1-6HIS的定点诱变
通过PCR克隆的INSP181SV1序列与预计的INSP181SV1不同处在于，有二个不同位点发生取代(A275C和G340A)，这导致氨基酸突变N92T和G114S。认为这些突变是该PCR克隆方法所致，因为它们在基因组DNA(Celera或Genbank)中没检测到。为了产生含正确INSP181SV1序列的pDONR221克隆，采用pDONR221_INSP181SV1(N92T，G114S)-6HIS克隆作为模板进行定点诱变。
4.3定点诱变INSP181SV1的基因特异性克隆引物
设计了二对PCR引物：INSP181SV1(T92N)FP与INSP181SV1(T92N)RP，和INSP181SV1(S114G)FP与INSP181SV1(S114G)RP(表2)，使这些引物与pDONR221_INSP181SV1-(N92T，G114S)-6HIS序列的相反链退火，各引物与待突变氨基酸二侧中任一侧的15-25个碱基退火。按照QuickChangeII XL定点诱变试剂盒(Stratagene)中说明手册的说明设计PCR引物。
4.4定点诱变INSP181SV1
用QuickChangeII XL定点诱变试剂盒(Stratagene)按厂商说明书进行定点诱变-1。对照反应的终体积为50μl，含1X反应缓冲液、10ng pWhitescript4.5kb对照质粒、125ng寡核苷酸对照引物#1、125ng对照引物#2、1μl dNTP混合液和2.5单位的PfuUltra HF DNA聚合酶。样品反应液的终体积为50μl，含1X反应缓冲液、10ng质粒模板DNA(pDONR221_INSP181SV1-(N92T，G114S)-6HIS)、125ng INSP181SV1(T92N)FP、125ng INSP181SV1(T92N)RP、1μl dNTP混合液和2.5单位的PfuUltra HF DNA聚合酶。用MJRESEARCH DNA ENGINE进行热循环，扩增程序如下：95℃1分钟，然后18轮：95℃30秒，60℃1分钟和68℃3分30秒，然后最后延伸68℃7分钟和4℃保持循环。
用Dpn I消化甲基化或半甲基化的亲代DNA模板(样品反应液中含质粒pDONR221_INSP181SV1-6HIS)。在对照和样品扩增反应的产物中加入1μl Dpn I限制性内切酶(10U/μl，Stratagene)。轻轻搅拌反应物，37℃孵育1小时。如下用各反应混合物转化XL1-Blue超感受态细胞(Stratagene)：冰上融化50μl一份XL1-Blue细胞，加入1μl Dpn I-处理的DNA。冰上孵育该混合物30分钟，然后42℃精确孵育45秒热激该混合物。样品回置冰上2分钟，加入250μl预温热(42℃)的NZY培养液。37℃振摇(220rpm)孵育样品1小时。将对照转化混合物接种于含氨苄青霉素(100μg/ml)、X-gal(80μg/ml)和20mMIPTG的L-肉汤(LB)平板。而将样品转化混合物(250μl，各2块板)接种于含卡那霉素(40μg/ml)的L-肉汤(LB)平板，37℃培养过夜。
4.5质粒DNA的制备和测序
选择一个阳性转化体，以5ml培养物用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen)制备小量质粒DNA。用CEQ Dye Terminator Cycle快速起动测序试剂盒(Beckman Coulter P/N 608120)按厂商说明书对质粒DNA(150-200ng)进行DNA测序，引物为21M13和M13Rev。所述引物的序列见表2。在CEQ2000 XL DNA分析系统(Beckman Coulter P/N 608450)上分析测序反应物。验证插入物具有纠正突变的序列后，将pDONR221_INSP181 SV1-(G114S)-6HIS用作模板进行第二次纠正(S114G)。用上述方案和条件进行定点诱变-2。定点诱变-2所用引物为INSP181SV1(S114G)FP和INSP181SV1(S114G)RP。序列分析鉴定到一个含有预期INSP181SV1插入序列的克隆(pDONR221_INSP181SV1-6HIS)。
4.6将Gateway相容性INSP181SV1 ORF亚克隆到表达载体pEAK12d和pDEST12.2中
然后将pDONR221_INSP181SV1-6HIS质粒DNA(2μl或约150ng)用于重组反应，该反应含1.5μl的pEAK12d载体或pDEST12.2载体(0.1μg/μl)、2μl LR缓冲液和1.5μl LR克隆酶(Invitrogen)，最终体积10μl。
加入1μl蛋白酶K(2μg/μl)终止反应，37℃再孵育10分钟。如下用1份该反应物(2μl)转化DH5α菌株(Invitrogen)：冰上融化50μl一份DH5α细胞，加入2μl反应混合物。冰上孵育该混合物30分钟，42℃精确孵育30秒热激该混合物。样品返回置冰上，加入250μl温热的SOC培养液(室温)。37℃振摇(250rpm)孵育样品1小时。将转化混合物接种到含氨苄青霉素(100μg/ml)的L-肉汤(LB)平板上，37℃培养过夜。
挑取5个转化子接种于含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板上，37℃培养过夜。将一勺接种板生长培养物重悬于50μl水中，煮沸5分钟裂解细胞。离心细胞裂解液去除细胞碎片，获得的上清液用作菌落PCR筛选的模板。
该PCR混合物(终体积25μl)含10μl离心后的细胞裂解物、2.0μldNTP(10mM)、2.5μl Taq聚合酶缓冲液、0.5μl筛选引物(至终浓度100pM)和0.5μl Taq DNA聚合酶。用引物pEAK12 FP和INSP181 MAT RP筛选pEAK12d克隆，用引物21M13FP和INSP181 MAT RP筛选pDEST12.2克隆。
筛选PCR反应的条件是：95℃2分钟，然后30轮：94℃30秒、60℃30秒和72℃1分钟，最终延伸循环72℃5分钟和4℃保持循环。将PCR产物加到1.6％琼脂糖凝胶上电泳验证片段大小。
选择一个阳性克隆，以5ml培养物用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen)制备小量质粒DNA。
用上述测序引物pEAK12 FP和pEAK12 RP对pEAK12d载体中的质粒DNA(150-200ng)进行DNA测序。用上述测序引物21M13 FP和M13Rev RP对pDEST12.2载体中的质粒DNA(150-200ng)进行DNA测序。
将经序列验证的二克隆命名为pEAK12d_INSP181SV1-6HIS和pDEST12.2_INSP181SV1-6HIS。
用Qiagen Maxi prep试剂盒按厂商说明书以500ml经序列验证的克隆pEAK12d_INSP181-6HIS培养物大量制备DNA。将该质粒DNA重悬于TE缓冲液中，浓度为1μg/μl，-20℃贮存。
用EndoFree Plasmid Mega试剂盒(Qiagen)按厂商说明书以500ml经序列验证的克隆pDEST12.2_INSP181-6HIS培养物大量制备无内毒素DNA。将纯化的该质粒DNA重悬于无内毒素TE缓冲液中，最终浓度至少3μg/μl，-20℃贮存。
实施例5：适合研究INSP181功能的生物学相关性的试验
相信本发明的部分对治疗或诊断生殖系统疾病/失调和自身免疫疾病/失调特别有用。认为可用以下试验来检测具有有用生物学作用的组分。注意，虽然以下某些试验测定的化合物是蛋白质/多肽，但本领域技术人员很容易调整以下试验，使本发明的其它组分也用作“测试化合物”。
A生殖健康试验
JEG-3移植试验
此试验采用2-室系统，当将Ishikawa细胞或Ishikawa条件培养液放置到下室时，荧光标记的JEG-3细胞从上室通过基质胶(Matrigel)包被的多孔膜侵入下室。用平板读数仪定量测定迁移的细胞。目的是鉴定能提高JEG-3细胞侵入的蛋白质将其用于协助体内移植。
骨桥蛋白珠试验(Ishikawa细胞)
此试验中，包被骨桥蛋白的荧光珠代表胚泡，用雌二醇处理Ishikawa细胞使它们能接受结合。目的是鉴定能提高Ishikawa细胞结合骨桥蛋白珠能力的蛋白质，以有助于提高移植时子宫内膜的感受性。
HuF6试验
该试验目的是鉴定能提高HuF6细胞产生PGE2(子宫脱膜的一种标志)的蛋白质，作为增强早孕期间脱膜的一种方法。
子宫内膜异位试验
在子宫内膜异位中，腹膜TNFa的作用是诱导从子宫脱落的子宫内膜细胞粘附在腹膜间质细胞上并增殖。此试验中，用TNFa处理BEND细胞，提高其结合纤连蛋白包被荧光珠的能力，作为子宫内膜异位中的粘附试验。目的是鉴定能降低或抑制TNFa刺激细胞与珠结合的能力的蛋白质。
采用以hLHR稳定转染的猪JC-410颗粒细胞的环化AMP试验
在多囊性卵巢综合征中，由垂体产生的LH相对较高，并诱导了雄性激素从卵巢卵泡膜细胞中输出。在该试验中寻找LH信号传导的抑制剂，其可在PCOS期间用于降低卵巢中的LH活性。用人LH受体稳定转染猪JC-410颗粒细胞系。用LH处理导致cAMP的产生。
采用以hFSHR稳定转染的猪JC-410颗粒细胞的环化AMP试验
用人FSHR稳定转染猪JC-410颗粒细胞系。此试验检测用FSH处理刺激了cAMP的产生。目的是鉴定能增强FSH在猪颗粒细胞中作用的蛋白质。
LβT2(小鼠)垂体细胞试验
LβT2是一种永生的小鼠垂体促性腺细胞系。单用活化素或用GnRH+活化素刺激(该细胞)可导致分泌FSH。可用GnRH+Bioscreen蛋白处理该细胞来寻找能与GnRH协同刺激产生FSH的蛋白质，或单用Bioscreen蛋白处理来寻找能像单用活化素那样刺激FSH分泌的蛋白质。
卵丘扩张试验
可利用小鼠卵丘-卵母细胞复合体开发鉴定能促进扩张的组分的试验。
RWPE增殖试验
良性前列腺增生的特征是前列腺上皮和基质的生长和凋亡失去平衡，导致器官增大。RWPE是一种用HPV-18(转染)而永生的常规人前列腺上皮细胞系，可用于替代不能总是能得到的原代人前列腺上皮细胞。
HT-1080纤维肉瘤侵入试验
在一个2-室系统的上室中培养荧光标记的HT-1080人纤维肉瘤细胞，刺激该细胞使其通过多孔基质胶包被膜侵入下室，并定量测定下室的细胞数。目的是鉴定能抑制这种入侵的组分。
原代人子宫平滑肌试验
子宫纤维样疾病的一个标志是子宫平滑肌细胞因胶原沉积而变成平滑肌瘤(leioymyomas)。用TGFb处理刺激原代人子宫平滑肌细胞可产生胶原，可用Rebif阻断TGFb的作用。目的是发现能抑制此种纤维化表型的蛋白质。
人平骨肌瘤细胞增殖试验
在增殖试验中利用人平滑肌瘤细胞作为子宫纤维样疾病的模型。该细胞生长很慢，但可用雌二醇和生长因子刺激。目的是鉴定能抑制平滑肌瘤细胞雌二醇依赖性生长的蛋白质。
U937迁移试验
子宫内膜病灶分泌细胞因子可募集免疫细胞到腹膜腔，随后介导了子宫内膜异位常见的炎症症状。已证明RANTES由子宫内膜基质细胞所产生并存在于腹腔液中。在此试验中，U937细胞(作为活化的巨噬细胞模型的一种单核细胞系)可经低水平2-腔室系统处理诱导，从上室迁移(到下室)。如果预先用荧光染料加载该细胞，可在下室定量测定该细胞。目的是鉴定能抑制U937细胞迁移的蛋白质。
JEG3人滋养层细胞试验
胚泡的滋养层细胞可产生I类HLA分子HLA-G，认为HLA-G在防止母体对胚胎的免疫排斥中至关重要。在子痫发生前期，HLA-G水平低或不存在。JEG-3人滋养层细胞系可产生HLA-G，并可用于鉴定能提高HLA-G产生的组分。
大鼠卵巢原代分散质试验
可测定用FSH和/或LH处理后，获自未成熟大鼠或其它啮齿动物全卵巢的细胞培养物产生的雌二醇量。目的是鉴定能增强促性腺素刺激的类固醇生成作用的蛋白质，或单独使用能提高这些培养物生成类固醇的蛋白质。
小鼠IVF试验
此试验中，通过测定精子使卵细胞受精的能力来衡量精子的功能，目的是寻找能刺激精子受精潜能的蛋白质。这类试验可采用例如小鼠精子和卵子。
人原代前列腺基质细胞增殖试验
已建立了用于BHP上皮细胞组分的试验(见上述RWPE)。此试验采用原代人前列腺基质细胞作为BPH期间这些细胞增殖的模型。目的是鉴定能抑制这些细胞增殖的蛋白质。
人原代子宫平滑肌增殖试验
可测试蛋白质和其它组分来鉴定能抑制人原代子宫平滑肌细胞增殖的组分。子宫平滑肌细胞的增殖是在子宫纤维样疾病中发展成肿瘤的前兆。
B自身免疫试验
细胞和刺激  读出   生物学原理 目标疾病
T淋巴细胞 Fas-配体诱导的Jurkat T细胞死亡.  释放LDH. 调节T细胞死亡 自身免疫疾病
用超抗原TSST刺激的人PBMC  增殖   调节T细胞增殖 自身免疫疾病
 细胞因子分泌   调节T细胞细胞因子分泌 自身免疫疾病
T淋巴细胞和抗原递呈细胞 人和小鼠MLR  增殖   调节T细胞增殖 自身免疫疾病
 细胞因子分泌   调节T细胞细胞因子分泌 自身免疫疾病
用ConA或PHA刺激人PBMC  细胞因子分泌   调节T细胞细胞因子分泌 自身免疫疾病
单核细胞、巨噬细胞和粒细胞 用LPS刺激人PBMC  细胞因子分泌   调节巨噬细胞和粒细胞细胞因子分泌 自身免疫疾病
单核细胞 THP-1(细胞)中RANTES-诱导的钙流.  FlipR诱导钙流 诱导单核细胞活化 自身免疫疾病
中性粒细胞 用IL-8刺激的人中性粒细胞  细胞骨架重建 调节中性粒细胞迁移 自身免疫疾病
B淋巴细胞 用羊抗人IgM抗体和rhIL-4刺激人B细胞 存活 调节B细胞存活 自身免疫疾病
用羊抗人IgM抗体、rhIL-4和可溶性rhBAFF刺激人B细胞 增殖 调节B细胞共刺激 自身免疫疾病
小神经胶质细胞 M-CSF活化的小神经胶质细胞系 增殖   调节小神经胶质细胞活性 MS
靶向T淋巴细胞应答的试验
●Fas-配体诱导的T细胞死亡。此试验可揭示受体介导细胞死亡的新型调节剂。此试验中，重组的6组氨酸标签Fas配体与单克隆抗6-his抗体联用刺激Jurkat细胞诱导了T细胞凋亡。通过LDH(细胞死亡时释放到培养基中的一种胞浆酶)的释放来定量测定细胞死亡。已证明在许多自身免疫疾病中T细胞具有致病作用，故控制抗原特异性T细胞死亡是一种治疗策略。
●人-MLR：增殖和细胞因子分泌。此基于细胞的试验可检测新蛋白质对淋巴细胞增殖和细胞因子分泌的影响，或对另一供体PBMC刺激作用(同种异体反应性)的抑制。
●用超抗原TSST刺激人PBMC。在此细胞试验中，通过TCR特异性靶向T淋巴细胞的激活，但其要求与T细胞对经典抗原的应答所要求的不同(具体为适应共刺激分子)。
●用ConA或PHA刺激人PBMC。这些基于细胞的试验可测定新蛋白质对作用于不同细胞上的二种不同刺激物诱导的细胞因子分泌的影响，采用细胞因子珠阵列(CBA)试验(IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-5、IL-4和IL-10)检测。
靶向单核细胞/巨噬细胞和粒细胞应答的试验
●用LPS刺激人PBMC。此基于细胞的试验可测定新型蛋白质对通过由LPS作用于单核细胞/巨噬细胞和粒细胞而诱导的细胞因子分泌(IFN-γ、TNF-α)的影响。
靶向中性粒细胞应答的试验
中性粒细胞的组织渗出依赖于伴有这些细胞细胞形态特定改变的细胞骨架元件重组。此基于细胞的试验可测定新蛋白质对人中性粒细胞细胞骨架重组的影响。
靶向B淋巴细胞应答的试验
●B细胞增殖。此基于细胞的试验可测定新蛋白质对B细胞存活的影响。
●B细胞共刺激。此基于细胞的试验可测定新蛋白质对B细胞共刺激的影响。
靶向单核细胞和小神经胶质细胞应答反应的试验
●THP-1钙流(试验)。THP-1细胞Ca+流试验可测定新蛋白质触发胞内钙从内质网释放(普通的第二信使事件)的能力。
●小神经胶质细胞增殖试验。在小神经胶质细胞祖细胞增殖时，已知有许多集落刺激因子，包括某些细胞因子起着关键作用。其中M-CSF是影响巨噬细胞/小神经胶质细胞最后成熟步骤的关键因子，任何其它因子不可替代。评价这种生物学反应可提供影响小神经胶质细胞活性的方法，从而有可能鉴定到具有治疗MS潜力的分子。本领域技术人员有能力开发检测小神经胶质细胞系对M-CSF的增殖反应的基于细胞的试验。
其它可用的试验包括细胞因子表达调节试验。简言之，用细胞因子珠阵列(CBA)试验检测测试的蛋白质(或其它测试组分)对伴刀豆球蛋白A作用于不同人外周血单个核细胞(hPMBC)诱导细胞因子分泌(IL-2、IFN-γ，TNF-α、IL-5、IL-4和IL-10)的影响。利用这类试验可确定“最佳抑制的”细胞因子，而在文献中可寻找到与该细胞因子相关的疾病。
实施例5：INSP181对ConA刺激PBMC分泌细胞因子的影响
5.1简述
检测INSP181对有丝分裂原伴刀豆球蛋白A(ConA)刺激人外周血单个核细胞(PBMC)分泌细胞因子的影响。当用1/10稀释度(试验用46.2ug)测定时，INSP181-6HIS能刺激ConA激活的人PBMC分泌IL-10、IL-4和IL-5。而没有观察到对IFN-γ、TNF-α或IL-2.水平的影响。
5.2材料和试剂
全血离心后收集的白细胞层
DMEM GIBCO Ref：21331-020
人AB型血清SIGMA Ref：H1513
L-谷氨酰胺GIBCO Ref：250030-020
青霉素-链霉素GIBCO Ref：150070-063
Ficoll PHARMACIA Ref：17-1440-03
细胞培养96孔微量滴定板COSTAR Ref：3596
伴刀豆球蛋白A SIGMA Ref：C0412
地塞米松水溶液SIGMA Ref：D2915
人Th1/Th2细胞因子CBA试剂盒Becton-Dickinson Ref：550749
PBS GIBCO Ref：14190-094
FALCON 50ml无菌Becton-Dickinson Ref：2070
甘油MERCK Ref：1-04092-2500
96孔尖底微量滴定板NUNC Ref：249570
5.3方法
5.3.1从白细胞层中纯化人PBMC
用DEME稀释1∶2稀释白细胞层。
将25ml稀释的血慢慢加到50ml Falcon离心管中的15ml Ficoll层上面。
离心该试管(2000rpm，20分钟，室温，不制动)。
收集介面层(环形)，用25ml DEME洗涤细胞后再离心(1200rpm，5分钟)，重复3次。一份白细胞层可得到共600×106个细胞。
5.3.2活力测定
将用DMEM+2.5％人血清+1％L-谷氨酰胺+1％青霉素-链霉素稀释的80μl细胞(每ml 1.25×106个细胞)加入96孔微量滴定板中。
每孔加入10μl(每孔一种条件)：用PBS+20％甘油配制的AS902285/1。
每孔加入10μl：ConA 50μg/ml(ConA终浓度为5μg/ml)。
48小时后收集细胞上清液，用人Th1/Th2细胞因子CBA试剂盒Becton-Dickinson检测人细胞因子。
5.3.3CBA分析
按供货商说明书(CBA试剂盒Becton-Dickinson Ref：550749)制备人Th1/Th2捕获珠混合物，简言之：
-确定实验所需的试管数目。
-混合前强烈旋涡振荡各捕获珠悬液数秒钟。
-对各待分析的试验，将10μl一份各捕获珠加入一个标记为“混合的捕获珠”的试管中。
-充分涡旋振荡该珠混合物。
制备试验样品
-用试验稀释液1∶5稀释上清液(20μl上清液+60μl试验稀释液)
-混合样品稀释液，然后将样品转移到96孔尖底微量滴定板(Nunc)中人Th1/Th2细胞因子CBA试验程序
-将50μl稀释的上清液加入96孔尖底微滴板(Nunc)中
-加入50μl混合的捕获珠
-加入50μl人Th1/Th2 PE检测试剂
-室温孵育96孔板3小时，防止直接暴露于光
-1500rpm离心5分钟
-小心倾去上清液
-各孔加入200μl洗涤缓冲液，1500rpm离心5分钟
-小心倾去上清液
-各孔加入200μl洗涤缓冲液，1500rpm离心5分钟
-小心倾去上清液
-各孔加入130μl洗涤缓冲液重悬沉降珠
-在流式细胞计数仪上分析样品
-用CBA应用软件、Activity Base和Microsoft Excel软件分析数据
-结果表示为分泌细胞因子的细胞百分比，与由ConA刺激的细胞(100％)与不刺激细胞(0％)相比获得的细胞因子水平相比较。
5.4结果
一实施例中，用CBA试验检测，INSP181-6HIS刺激了ConA激活的PBMC分泌IL-10(196％)和Th2细胞因子IL-4(257％)及IL-5(165％)，但对IFN-γ、TNF-α或IL-2分泌没有作用(表3)。因此本发明的依据是发现本发明的多肽能上调Th2细胞因子，特别是白介素-10(IL-10)、白介素-4(IL-4)和白介素-5(IL-5)。此外，这种上调对Th2细胞因子是特异性的，因为Th1细胞因子水平(即IFN-γ、TNF-α或IL-2)维持不变。这种细胞因子表达的特定模式使得本发明的多肽可能用于治疗Th1疾病，而其拈抗剂可用于治疗Th2疾病。
表3.INSP181-6HIS对ConA刺激人PBMC分泌细胞因子的作用
试验   方案  板/孔     重复  ％刺激   标准偏差 浓度
CELL-CBA   CON-HPBL-IFN-10-02  MP-9089/G05     1  96.00％   N/A .1稀释
CELL-CBA   CON-HPBL-IL10-10-02  MP-9089/G05     1  196.00％   N/A .1稀释
CELL-CBA   CON-HPBL-IL2-10-02  MP-9089/G05     1  107.00％   N/A .1稀释
CELL-CBA   CON-HPBL-IL4-10-02  MP-9089/G05     1  257.00％   N/A .1稀释
CELL-CBA   CON-HPBL-IL5-10-02  MP-9089/G05     1  165.00％   N/A .1稀释
CELL-CBA   CON-HPBL-TNF-10-02  MP-9089/G05     1  138.00％   N/A .1稀释
实施例6
6.1用实时PCR(Taqman)分析INSP181基因表达水平
RT-PCR采用Superscript III第一链合成系统(Invitrogen，目录号18080-051)逆转录各样品的总RNA，最终反应体积20μl。将2μg总RNA与50ng随机六聚体引物、dATP、dGTP、dCTP和dTTP各10mM以及DEPC-处理的水混合，体积10μl。65℃孵育该混合物5分钟，冰上冷却1分钟。在另外的试管中制备以下10μl cDNA合成混合物：2μl 10XRT缓冲液、4μl 25mM MgCl2、2μl 0.1M DTT、1μl RNA酶OUTTM(40单位/μl)和1μl SuperScriptTM III RT酶(200单位/μl)。将该cDNA合成混合物加入到RNA/引物混合物中，轻轻混合，25℃孵育10分钟，然后50℃孵育50分钟。85℃下搅拌孵育5分钟灭活RT酶。冰上冷却该混合物然后加入1μl大肠杆菌RNA酶H(2单位/μl)，37℃孵育该混合物20分钟。冰上冷却该混合物用无菌水作1/250稀释。在TaqMan仪(PEBiosystems 7700)上对逆转录酶反应物的稀释液进行实时PCR分析。用引物表达软件(PE Biosystems)设计人INSP181和对照磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)管家基因的PCR引物。正向引物设计于外显子1中。反向引物设计于外显子2中。该引物不能区分INSP181与INSP181SV。
引物的序列见表4。通过检测INSP181引物对质粒pEAK12d-INSP181-6HIS和pEAK12d-INSP181SV-6HIS的系列稀释液(的作用)确定TaqMan分析的特异性和所用引物的最佳浓度。用GAPDH内含子序列的特异性引物进行PCR反应排除cDNA中可能污染的基因组DNA。用4％琼脂糖凝胶(电泳)分析PCR产物来控制不发生非特异性扩增，以确保产生预期分子量的单一条带。
进行SYBR Green实时PCR反应，反应体积50μl，含25μl SYBR GreenPCR主混合物(PE Biosystems)(已预先加入了0.5单位的AmpErase尿嘧啶N-糖基化酶，UNG，PE Biosystems)、300nM的各扩增引物和5μl RT-PCR产物。用ABI PRISM 7700(TaqMan)检测系统进行循环，程序如下：一轮50℃2分钟，一轮95℃10分钟，40轮：95℃15秒、60℃1分钟。各反应一式二份进行，结果以平均值表示。
扩增逆转录cDNA样品的引物特异性区域，测定它们的循环域值(Ct)。如下将各cDNA的Ct值按管家基因GAPDH标准化：以Ct值的差异表示各cDNA样品中GAPDH基因与INSP181基因之间表达水平的差异，即Delta(δ)Ct＝Ct(GAPDH)-Ct(INSP181)。各样品的结果表示为检测INSP181基因表达所需的循环轮次数与GAPDH相比的差异倍数，按公式：差异倍数＝2(-δCt)计算。最后将各cDNA样品的INSP181表达水平与GAPDH基因表达水平作比较，GAPDH表达水平＝100％，除以100，再除以INSP181的差异倍数。
6.2结果
用INSP181引物测试了获自IL18BP临床试验的39份牛皮癣的活检组织、44份炎性肠病的结肠和回肠活检组织，此外还检测了一组约100份人正常和患病组织样品、原代细胞和细胞系。结果见表5和6及图12和13。令人惊奇的是，只在牛皮癣患者的皮肤(GAPDH的0.16％)(表5，图12)和皮肤活检组织中检测到低水平的INSP181表达(19/39样品阳性)。用外显子4/6的第二对特异性引物(外显子4的正向引物和外显子6的反向引物)证实对皮肤具有特异性。表达结果出乎意外地显示ISNP181限于在皮肤活检组织样品和牛皮癣皮肤活检组织中表达。
从这种特定表达模式得到的结论是INSP181参与皮肤疾病。该皮肤病优选Th1或Th2皮肤病。Th1皮肤病优选牛皮癣。
本发明多聚核苷酸或相应多肽特征性的这些令人惊奇的性能使它们特别适合制备药物或药物组合物。由此出乎意外地发现本发明的多聚核苷酸或相应多肽只限于在特定组织中表达。
表4-TaqMan PCR引物序列
引物  Sequence(5’-3’)
h-INSP181-57F4  TGCCCAGAAGGCTCTGGAA
h-INSP181-199R4  GAGTGGAGAGCGAGCCTCAG
hGAPDH-F  CCACCCATGGCAAATTCC
hGAPDH-R  GATGGGATTTCCATTGATGACA
内含子-hGAPDH-F  CCTAGTCCCAGGGCTTTGATT
内含子-hGAPDH-R  CTGTGCTCCCACTCCTGATTT
表5用RT-PCR(TaqMan)检测人主要组织中的INSP181表达
 正常人组织   CthGAPDH   CthINSP181 δct   差异倍数    与GAPDH相比(＝100)
 S76脑   19.44   35.87 -16.43   88307.33     0.00
 S77心   20.16   36.81 -16.65   102847.63     0.00
 S78肾   19.41   34.71 -15.30   40248.46     0.00
 S79肝   20.93   37.96 -17.03   133696.30     0.00
 S80肺   21.65   36.46 -14.81   28811.12     0.00
 S81胎盘   21.71   33.42 -11.71   3345.11     0.03
 S82骨骼肌   15.59   37.22 -21.63   3251044.79     0.00
 S83小肠   18.27   35.85 -17.59   196700.49     0.00
 S84脾   21.63   35.17 -13.54   11885.82     0.01
 S85胸腺   19.36   33.64 -14.28   19884.13     0.01
 S86子宫   19.76   38.67 -18.91   493684.90     0.00
 S89脊髓   19.75   35.61 -15.87   59718.96     0.00
 S90宫颈   22.17   34.98 -12.81   7179.00     0.01
 S91结肠   19.67   36.65 -16.99   129964.13     0.00
 S92卵巢   20.84   37.72 -16.88   120767.86     0.00
 S93前列腺   19.80   35.88 -16.08   69164.90     0.00
 S94睾丸   20.05   35.80 -15.75   55167.63     0.00
 S95皮肤   23.39   32.72 -9.33   641.93     0.16
 S113胰腺   21.12   36.18 -15.06   34140.49     0.00
 S119乳腺   20.28   39.91 -19.62   806755.23     0.00
 S120胃   21.80   38.54 -16.74   109334.52     0.00
 S122眼   21.16   37.70 -16.54   95534.29     0.00
 S147膀胱   19.21   33.69 -14.48   22777.41     0.00
表6用RT-PCR(TaqMan)
检测获自IL18BP临床试验的患病皮肤活检组织中的INSP181表达
牛皮癣     CthGAPDH     CthINSP181   δct   差异倍数     与GAPDH相比(＝100)
#11 A2872102-2     20.90     34.36   -13.46   11306.74     0.01
#16 A2872103-1     24.39     29.31   -4.92   30.19     3.31
#28 A2872023-1     22.85     38.42   -15.57   48690.17     0.00
#36 A2872028-1     25.37     34.04   -8.67   406.67     0.25
#39 A2872025-1     22.41     34.00   -11.59   3089.02     0.03
#59 E1328972-3     23.46     31.89   -8.44   346.19     0.29
#60 E1328972-2     21.22     37.35   -16.12   71255.76     0.00
#61 E1329004     25.11     38.12   -13.00   8203.29     0.01
#63 E1328973-3     23.15     40.00   -16.85   118472.89     0.00
#64 E1329003-2     21.05     36.32   -15.27   39647.25     0.00
#66 E1328974-4     22.28     32.06   -9.78   881.12     0.11
#68 E1328975-3     22.80     28.83   -6.03   65.14     1.54
#69 E1328975-4     23.75     39.20   -15.45   44792.00     0.00
#70 E1329006-1     25.60     36.62   -11.02   2075.71     0.05
#71 E1328976-3     24.41     32.68   -8.27   308.23     0.32
#72 E1328976-4     23.01     35.38   -12.37   5282.35     0.02
#73 E1329005-1     23.67     34.77   -11.10   2193.42     0.05
#74 E1328977-2     24.00     32.14   -8.14   282.24     0.35
#75 E1328977-3     21.88     32.04   -10.16   1146.47     0.09
#77 E1348411-3     23.19     31.49   -8.30   315.93     0.32
#78 E1348411-2     23.19     31.63   -8.44   346.92     0.29
#79 E1348411-1     18.93     35.83   -16.91   122965.58     0.00
#80 E1348414-2     21.24     29.00   -7.76   216.69     0.46
#81 E1348414-1     21.07     40.00   -18.93   500034.81     0.00
#82 E1348446-1     20.77     28.87   -8.10   274.63     0.36
#83 E1348415-3   20.77     29.81 -9.04   526.35     0.19
#84 E1348415-2   18.54     32.15 -13.60   12438.44     0.01
#85 E1348442-1   19.84     34.46 -14.61   25074.26     0.00
#86 E1348416-3   21.58     28.59 -7.02   129.48     0.77
#88 E1348445-1   21.55     39.17 -17.61   200512.76     0.00
#91 E1317749-2   24.51     32.70 -8.20   293.22     0.34
#95 E1317719-2   25.37     33.66 -8.29   312.71     0.32
#96 E1317719-3   23.52     40.00 -16.48   91584.99     0.00
#97 E1317751-2   22.80     35.40 -12.60   6201.23     0.02
#98 E1317723-2   25.21     35.90 -10.70   1657.76     0.06
#99 E1317723-3   23.86     32.91 -9.06   532.89     0.19
#101 E1317718-2   20.80     30.04 -9.24   606.53     0.16
#102 E1317718-3   22.86     36.13 -13.27   9887.33     0.01
#103 E1317750-2   20.94     35.46 -14.52   23478.87     0.00
实施例7：微阵列研究
用Agilent Technologies’(Agilent Technologies Inc，Palo Alto，CA)的非接触原位合成印制(print)长60mer的寡核苷酸探针的方法，按数字序列文件的逐个碱基地制备定制微阵列。这可通过采用能递送待形成斑点的极小而精确体积(皮升量)化学物质形成微小斑点的喷墨技术来实现。反应所用的标准亚磷酰胺化学物在合成全长寡核苷酸的各步骤中能保持极高的连接效率。在“作业中(on the fly)”重复沉积精确量的化学物质。这种工程化技艺无需停顿以使(化学物质)接触载玻片的表面和不会使接触表面的特征异常，从而产生一致的斑点均一性和示踪能力(Hughes等(2001)Nat.Biotech.4月；19(4)：342-7，“Expression profiling using microarrays fabricated by an ink-jet oligonucleotidesynthesizer”《用喷墨寡核苷酸合成仪制作的微阵列的表达模式》)。
探针合成
按Agilent说明书中的方法进行。基本而言，cDNA的合成和随后用T7聚合酶扩增花青3(5)-CTP标记的cRNA探针，采用可Agilent的低RNA输入荧光线性扩增试剂盒，从5μg总RNA模板按试剂盒中提供的方案(2003年8月第2版，Agilent，Palo Alto，CA)进行。然后按Agilent方案(Agilent 60-聚寡核苷酸微阵列生产方案2004年4月4.1版，Agilent，Palo Alto，CA)，用Agilent附带的原位杂交试剂盒片段化此cRNA，并进行杂交。
微阵列芯片设计
●阵列上有10,536种探针
●设计的5557种探针能特异性检测主要感兴趣的分泌序列
●设计的1000种探针是阴性对照
●设计的500种探针是阳性对照
●其余探针的设计针对已公开的功能域序列进行，这些功能域序列为已知含有与胞外环境接触的胞外功能域的分泌性可溶胞外蛋白或膜结合蛋白。
对INSP181的具体研究
从分离组分外显子形成INSP181。我们意图采用合成的10种正常组织、骨髓、脑、肺、卵巢、PBMC、胎盘、前列腺、脾脏和睾丸的探针来构建芯片。获得以逐个外显子为基础的表达报告。
用一步Tukey Bi-Weight算法(“Data Analysis and Regression：A SecondCourse in Statistics”《数据分析与回归：统计学的第二过程》，Mosteller和Tukey，Addison-Wesley，1977：203-209；也见Affymetrix MAS5.0算法)对数据进行平均。目的是明确对数据集组平均值的粗评价。此时我们的数据集组包括一个外显子的多种探针表达值。
采用这种定制阵列有多种理由。首先可验证转录物的存在与序列。其次可评价INSP181多肽序列的组织分布和明确该多肽在疾病中的作用。也可将此阵列作为诊断工具来诊断具有与此多肽相关病状的患者所患的疾病。通常可利用此外显子特异性探针来评价特定组织中和特定疾病状态中此多肽序列剪接变体的表达差异。
序列信息
将位于越过外显子边界处的密码子所代表的氨基酸加到5′外显子。
序列表
<110>阿雷斯贸易股份有限公司(ARES TRADING S.A)
<120>脂质运载蛋白
<130>P040084WO
<150>GB0504767.5
<151>2005-03-08
<160>73
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>111
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
atggccctgg agaaaggccc gctcctgctg ctggcccttg gcctgggcct ggcgggtgcc      60
cagaaggctc tggaagaggt accggtacag ccgggcttca atgcgcagaa g              111
<210>2
<211>37
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>2
Met Ala Leu Glu Lys Gly Pro Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly Leu Gly
1               5                   10                  15
Leu Ala Gly Ala Gln Lys Ala Leu Glu Glu Val Pro Val Gln Pro Gly
            20                  25                  30
Phe Asn Ala Gln Lys
       35
<210>3
<211>137
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>3
gtggaggggc gctggctcac cctgcagctg gcagccaacc acgcagacct ggtctccccg      60
gccgaccccc tgaggctcgc tctccactcc atccggacca gggacggcgg ggacgtggac     120
ttcgtgctgt tctggaa                                                    137
<210>4
<211>46
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>4
Val Glu Gly Arg Trp Leu Thr Leu Gln Leu Ala Ala Asn His Ala Asp
1               5                   10                  15
Leu Val Ser Pro Ala Asp Pro Leu Arg Leu Ala Leu His Ser Ile Arg
            20                  25                  30
Thr Arg Asp Gly Gly Asp Val Asp Phe Val Leu Phe Trp Lys
        35                  40                  45
<210>5
<211>74
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>5
gggagaaggg gtgtgtaaag aaacaaacat caccgtccat ccaacccagt tgcaaggcca     60
gtaccaaggc tcat                                                       74
<210>6
<211>25
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>6
Gly Glu Gly Val Cys Lys Glu Thr Asn Ile Thr Val His Pro Thr Gln
1               5                   10                  15
Leu Gln Gly Gln Tyr Gln Gly Ser Phe
            20                  25
<210>7
<211>74
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>7
gggagaaggg gtgtgtaaag aaacaaacat caccgtccat ccaacccagt tgcaaggcca     60
gtaccaaggc tcat                                                       74
<210>8
<211>25
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>8
Gly Glu Gly Val Cys Lys Glu Thr Asn Ile Thr Val His Pro Thr Gln
1               5                   10                   15
Leu Gln Gly Gln Tyr Gln Gly Ser Trp
            20                  25
<210>9
<211>183
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>9
ggcatggggg ggtccagggc ctgggggacg gaggagagag gcatcgtgca tcagctggcc     60
cggggtctcc aacagtcgag ggcggcagca tgcacgtatg cttcgtcagc accgactaca    120
gcaacctcat tctttacgtg cgctttgagg atgatgagat caccaacctg tgggtgctgc    180
tgg                                                                  183
<210>10
<211>61
<211>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>10
His Gly Gly Val Gln Gly Leu Gly Asp Gly Gly Glu Arg His Arg Ala
1               5                   10                  15
Ser Ala Gly Pro Gly Ser Pro Thr Val Glu Gly Gly Ser Met His Val
            20                  25                  30
Cys Phe Val Ser Thr Asp Tyr Ser Asn Leu Ile Leu Tyr Val Arg Phe
        35                  40                  45
Glu Asp Asp Glu Ile Thr Asn Leu Trp Val Leu Leu Ala
    50                  55                  60
<210>11
<211>108
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>11
tcgagggcgg cagcatgcac gtatgcttcg tcagcaccga ctacagcaac ctcattcttt     60
acgtgcgctt tgaggatgat gagatcacca acctgtgggt gctgctgg                 108
<210>12
<211>36
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>12
Glu Gly Gly Ser Met His Val Cys Phe Val Ser Thr Asp Tyr Ser Asn
1               5                   10                  15
Leu Ile Leu Tyr Val Arg Phe Glu Asp Asp Glu Ile Thr Asn Leu Trp
            20                  25                  30
Val Leu Leu Ala
        35
<210>13
<211>96
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>13
cgagaagaat gctggaggac cccaaatggc tgggaagata cttggagtac gtggagaaat    60
tccacctgca gaaagccccg gtcttcaaca tagatg                              96
<210>14
<211>32
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>14
Arg Arg Met Leu Glu Asp Pro Lys Trp Leu Gly Arg Tyr Leu Glu Tyr
1               5                   10                  15
Val Glu Lys Phe His Leu Gln Lys Ala Pro Val Phe Asn Ile Asp Gly
            20                  25                  30
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>15
gcccatgtcc cccaccctga                                                20
<210>16
<211>5
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>16
Pro Cys Pro Pro Pro
1               5
<210>17
<211>546
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>17
atggccctgg agaaaggccc gctcctgctg ctggcccttg gcctgggcct ggcgggtgcc    60
cagaaggctc tggaagaggt accggtacag ccgggcttca atgcgcagaa ggtggagggg   120
cgctggctca ccctgcagct ggcagccaac cacgcagacc tggtctcccc ggccgacccc   180
ctgaggctcg ctctccactc catccggacc agggacggcg gggacgtgga cttcgtgctg   240
ttctggaagg gagaaggggt gtgtaaagaa acaaacatca ccgtccatcc aacccagttg   300
caaggccagt accaaggctc attcgagggc ggcagcatgc acgtatgctt cgtcagcacc   360
gactacagca acctcattct ttacgtgcgc tttgaggatg atgagatcac caacctgtgg   420
gtgctgctgg cgagaagaat gctggaggac cccaaatggc tgggaagata cttggagtac   480
gtggagaaat tccacctgca gaaagccccg gtcttcaaca tagatggccc atgtccccca   540
ccctga                                                              546
<210>18
<211>181
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>18
Met Ala Leu Glu Lys Gly Pro Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly Leu Gly
1               5                   10                  15
Leu Ala Gly Ala Gln Lys Ala Leu Glu Glu Val Pro Val Gln Pro Gly
            20                  25                  30
Phe Asn Ala Gln Lys Val Glu Gly Arg Trp Leu Thr Leu Gln Leu Ala
        35                  40                  45
Ala Asn His Ala Asp Leu Val Ser Pro Ala Asp Pro Leu Arg Leu Ala
    50                  55                  60
Leu His Ser Ile Arg Thr Arg Asp Gly Gly Asp Val Asp Phe Val Leu
65                  70                  75                  80
Phe Trp Lys Gly Glu Gly Val Cys Lys Glu Thr Asn Ile Thr Val His
                85                  90                  95
Pro Thr Gln Leu Gln Gly Gln Tyr Gln Gly Ser Phe Glu Gly Gly Ser
            100                 105                 110
Met His Val Cys Phe Val Ser Thr Asp Tyr Ser Asn Leu Ile Leu Tyr
        115                 120                 125
Val Arg Phe Glu Asp Asp Glu Ile Thr Asn Leu Trp Val Leu Leu Ala
    130                 135                 140
Arg Arg Met Leu Glu Asp Pro Lys Trp Leu Gly Arg Tyr Leu Glu Tyr
145                 150                 155                 160
Val Glu Lys Phe His Leu Gln Lys Ala Pro Val Phe Asn Ile Asp Gly
                165                 170                 175
Pro Cys Pro Pro Pro
            180
<210>19
<211>51
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>19
cagaaggctc tggaagaggt accggtacag ccgggcttca atgcgcagaa g              51
<210>20
<211>17
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>20
Gln Lys Ala Leu Glu Glu Val Pro Val Gln Pro Gly Phe Asn Ala Gln
1               5                   10                  15
Lys
<210>21
<211>486
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>21
cagaaggctc tggaagaggt accggtacag ccgggcttca atgcgcagaa ggtggagggg     60
cgctggctca ccctgcagct ggcagccaac cacgcagacc tggtctcccc ggccgacccc    120
ctgaggctcg ctctccactc catccggacc agggacggcg gggacgtgga cttcgtgctg    180
ttctggaagg gagaaggggt gtgtaaagaa acaaacatca ccgtccatcc aacccagttg    240
caaggccagt accaaggctc attcgagggc ggcagcatgc acgtatgctt cgtcagcacc    300
gactacagca acctcattct ttacgtgcgc tttgaggatg atgagatcac caacctgtgg    360
gtgctgctgg cgagaagaat gctggaggac cccaaatggc tgggaagata cttggagtac    420
gtggagaaat tccacctgca gaaagccccg gtcttcaaca tagatggccc atgtccccca    480
ccctga                                                               486
<210>22
<211>161
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>22
Gln Lys Ala Leu Glu Glu Val Pro Val Gln Pro Gly Phe Asn Ala Gln
1               5                   10                  15
Lys Val Glu Gly Arg Trp Leu Thr Leu Gln Leu Ala Ala Asn His Ala
            20                  25                  30
Asp Leu Val Ser Pro Ala Asp Pro Leu Arg Leu Ala Leu His Ser Ile
        35                  40                  45
Arg Thr Arg Asp Gly Gly Asp Val Asp Phe Val Leu Phe Trp Lys Gly
    50                  55                  60
Glu Gly Val Cys Lys Glu Thr Asn Ile Thr Val His Pro Thr Gln Leu
65                  70                  75                  80
Gln Gly Gln Tyr Gln Gly Ser Phe Glu Gly Gly Ser Met His Val Cys
                85                  90                  95
Phe Val Ser Thr Asp Tyr Ser Asn Leu Ile Leu Tyr Val Arg Phe Glu
            100                 105                 110
Asp Asp Glu Ile Thr Asn Leu Trp Val Leu Leu Ala Arg Arg Met Leu
        115                 120                 125
Glu Asp Pro Lys Trp Leu Gly Arg Tyr Leu Glu Tyr Val Glu Lys Phe
    130                 135                 140
His Leu Gln Lys Ala Pro Val Phe Asn Ile Asp Gly Pro Cys Pro Pro
145                 150                 155                 160
Pro
<210>23
<211>618
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>23
atggccctgg agaaaggccc gctcctgctg ctggcccttg gcctgggcct ggcgggtgcc     60
cagaaggctc tggaagaggt accggtacag ccgggcttca atgcgcagaa ggtggagggg    120
cgctggctca ccctgcagct ggcagccaac cacgcagacc tggtctcccc ggccgacccc    180
ctgaggctcg ctctccactc catccggacc agggacggcg gggacgtgga cttcgtgctg    240
ttctggaagg gagaaggggt gtgtaaagaa acaaacatca ccgtccatcc aacccagttg    300
caaggccagt accaaggctc atggcatggg ggggtccagg gcctggggga cggaggagag    360
aggcatcgtg catcagctgg cccggggtct ccaacagtcg agggcggcag catgcacgta    420
tgcttcgtca gcaccgacta cagcaacctc attctttacg tgcgctttga ggatgatgag    480
atcaccaacc tgtgggtgct gctggcgaga agaatgctgg aggaccccaa atggctggga    540
agatacttgg agtacgtgga gaaattccac ctgcagaaag ccccggtctt caacatagat    600
ggcccatgtc ccccaccc                                                  618
<210>24
<211>206
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>24
Met Ala Leu Glu Lys Gly Pro Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly Leu Gly
1               5                   10                  15
Leu Ala Gly Ala Gln Lys Ala Leu Glu Glu Val Pro Val Gln Pro Gly
            20                  25                  30
Phe Asn Ala Gln Lys Val Glu Gly Arg Trp Leu Thr Leu Gln Leu Ala
        35                  40                  45
Ala Asn His Ala Asp Leu Val Ser Pro Ala Asp Pro Leu Arg Leu Ala
    50                  55                   60
Leu His Ser Ile Arg Thr Arg Asp Gly Gly Asp Val Asp Phe Val Leu
65                  70                  75                  80
Phe Trp Lys Gly Glu Gly Val Cys Lys Glu Thr Asn Ile Thr Val His
                85                  90                  95
Pro Thr Gln Leu Gln Gly Gln Tyr Gln Gly Ser Trp His Gly Gly Val
            100                 105                 110
Gln Gly Leu Gly Asp Gly Gly Glu Arg His Arg Ala Ser Ala Gly Pro
        115                 120                 125
Gly Ser Pro Thr Val Glu Gly Gly Ser Met His Val Cys Phe Val Ser
    130                 135                 140
Thr Asp Tyr Ser Asn Leu Ile Leu Tyr Val Arg Phe Glu Asp Asp Glu
145                 150                 155                 160
Ile Thr Asn Leu Trp Val Leu Leu Ala Arg Arg Met Leu Glu Asp Pro
                165                 170                 175
Lys Trp Leu Gly Arg Tyr Leu Glu Tyr Val Glu Lys Phe His Leu Gln
            180                 185                 190
Lys Ala Pro Val Phe Asn Ile Asp Gly Pro Cys Pro Pro Pro
        195                 200                 205
<210>25
<211>558
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>25
cagaaggctc tggaagaggt accggtacag ccgggcttca atgcgcagaa ggtggagggg     60
cgctggctca ccctgcagct ggcagccaac cacgcagacc tggtctcccc ggccgacccc    120
ctgaggctcg ctctccactc catccggacc agggacggcg gggacgtgga cttcgtgctg    180
ttctggaagg gagaaggggt gtgtaaagaa acaaacatca ccgtccatcc aacccagttg    240
caaggccagt accaaggctc atggcatggg ggggtccagg gcctggggga cggaggagag    300
aggcatcgtg catcagctgg cccggggtct ccaacagtcg agggcggcag catgcacgta    360
tgcttcgtca gcaccgacta cagcaacctc attctttacg tgcgctttga ggatgatgag    420
atcaccaacc tgtgggtgct gctggcgaga agaatgctgg aggaccccaa atggctggga    480
agatacttgg agtacgtgga gaaattccac ctgcagaaag ccccggtctt caacatagat    540
ggcccatgtc ccccaccc                                                  558
<210>26
<211>186
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>26
Gln Lys Ala Leu Glu Glu Val Pro Val Gln Pro Gly Phe Asn Ala Gln
1               5                   10                  15
Lys Val Glu Gly Arg Trp Leu Thr Leu Gln Leu Ala Ala Asn His Ala
            20                  25                  30
Asp Leu Val Ser Pro Ala Asp Pro Leu Arg Leu Ala Leu His Ser Ile
        35                  40                  45
Arg Thr Arg Asp Gly Gly Asp Val Asp Phe Val Leu Phe Trp Lys Gly
    50                  55                  60
Glu Gly Val Cys Lys Glu Thr Asn Ile Thr Val His Pro Thr Gln Leu
65                  70                  75                  80
Gln Gly Gln Tyr Gln Gly Ser Trp His Gly Gly Val Gln Gly Leu Gly
                85                  90                  95
Asp Gly Gly Glu Arg His Arg Ala Ser Ala Gly Pro Gly Ser Pro Thr
            100                 105                 110
Val Glu Gly Gly Ser Met His Val Cys Phe Val Ser Thr Asp Tyr Ser
        115                 120                 125
Asn Leu Ile Leu Tyr Val Arg Phe Glu Asp Asp Glu Ile Thr Asn Leu
    130                 135                 140
Trp Val Leu Leu Ala Arg Arg Met Leu Glu Asp Pro Lys Trp Leu Gly
145                 150                 155                 160
Arg Tyr Leu Glu Tyr Val Glu Lys Phe His Leu Gln Lys Ala Pro Val
                165                 170                 175
Phe Asn Ile Asp Gly Pro Cys Pro Pro Pro
            180                 185
<210>27
<211>561
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>27
atggccctgg agaaaggccc gctcctgctg ctggcccttg gcctgggcct ggcgggtgcc     60
cagaaggctc tggaagaggt accggtacag ccgggcttca atgcgcagaa ggtggagggg    120
cgctggctca ccctgcagct ggcagccaac cacgcagacc tggtctcccc ggctgacccc    180
ctgaggctcg ctctccactc catccggacc agggacggcg gggacgtgga cttcgtgctg    240
ttctggaagg gagaaggggt gtgtaaagaa acaaacatca ccgtccatcc aacccagttg    300
caaggccagt accaaggctc attcgagggc ggcagcatgc acgtatgctt cgtcagcacc    360
gactacagca acctcattct ttacgtgcgc tttgaggatg atgagatcac caacctgtgg    420
gtgctgctgg cgagaagaat gctggaggac cccaaatggc tgggaagata cttggagtac    480
gtggagaaat tccacctgca gaaagccccg gtcttcaaca tagatggccc atgtccccca    540
ccccaccatc accatcacca t                                              561
<210>28
<211>187
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>28
Met Ala Leu Glu Lys Gly Pro Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly Leu Gly
1               5                   10                  15
Leu Ala Gly Ala Gln Lys Ala Leu Glu Glu Val Pro Val Gln Pro Gly
            20                  25                  30
Phe Asn Ala Gln Lys Val Glu Gly Arg Trp Leu Thr Leu Gln Leu Ala
        35                  40                  45
Ala Asn His Ala Asp Leu Val Ser Pro Ala Asp Pro Leu Arg Leu Ala
    50                  55                  60
Leu His Ser Ile Arg Thr Arg Asp Gly Gly Asp Val Asp Phe Val Leu
65                  70                  75                  80
Phe Trp Lys Gly Glu Gly Val Cys Lys Glu Thr Asn Ile Thr Val His
                85                  90                  95
Pro Thr Gln Leu Gln Gly Gln Tyr Gln Gly Ser Phe Glu Gly Gly Ser
            100                 105                 110
Met His Val Cys Phe Val Ser Thr Asp Tyr Ser Asn Leu Ile Leu Tyr
        115                 120                 125
Val Arg Phe Glu Asp Asp Glu Ile Thr Asn Leu Trp Val Leu Leu Ala
    130                 135                 140
Arg Arg Met Leu Glu Asp Pro Lys Trp Leu Gly Arg Tyr Leu Glu Tyr
145                 150                 155                 160
ValGlu Lys Phe His Leu Gln Lys Ala Pro Val Phe Asn Ile Asp Gly
               165                 170                 175
Pro Cys Pro Pro Pro His His His His His His
            180                 185
<210>29
<211>501
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>29
cagaaggctc tggaagaggt accggtacag ccgggcttca atgcgcagaa ggtggagggg     60
cgctggctca ccctgcagct ggcagccaac cacgcagacc tggtctcccc ggctgacccc    120
ctgaggctcg ctctccactc catccggacc agggacggcg gggacgtgga cttcgtgctg    180
ttctggaagg gagaaggggt gtgtaaagaa acaaacatca ccgtccatcc aacccagttg    240
caaggccagt accaaggctc attcgagggc ggcagcatgc acgtatgctt cgtcagcacc    300
gactacagca acctcattct ttacgtgcgc tttgaggatg atgagatcac caacctgtgg    360
gtgctgctgg cgagaagaat gctggaggac cccaaatggc tgggaagata cttggagtac    420
gtggagaaat tccacctgca gaaagccccg gtcttcaaca tagatggccc atgtccccca    480
ccccaccatc accatcacca t                                              501
<210>30
<211>167
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>30
Gln Lys Ala Leu Glu Glu Val Pro Val Gln Pro Gly Phe Asn Ala Gln
1               5                   10                  15
Lys Val Glu Gly Arg Trp Leu Thr Leu Gln Leu Ala Ala Asn His Ala
            20                  25                  30
Asp Leu Val Ser Pro Ala Asp Pro Leu Arg Leu Ala Leu His Ser Ile
        35                  40                  45
Arg Thr Arg Asp Gly Gly Asp Val Asp Phe Val Leu Phe Trp Lys Gly
    50                  55                  60
Glu Gly Val Cys Lys Glu Thr Asn Ile Thr Val His Pro Thr Gln Leu
65                  70                  75                  80
Gln Gly Gln Tyr Gln Gly Ser Phe Glu Gly Gly Ser Met His Val Cys
                85                  90                  95
Phe Val Ser Thr Asp Tyr Ser Asn Leu Ile Leu Tyr Val Arg Phe Glu
            100                 105                 110
Asp Asp Glu Ile Thr Asn Leu Trp Val Leu Leu Ala Arg Arg Met Leu
        115                 120                 125
Glu Asp Pro Lys Trp Leu Gly Arg Tyr Leu Glu Tyr Val Glu Lys Phe
    130                 135                 140
His Leu Gln Lys Ala Pro Val Phe Asn Ile Asp Gly Pro Cys Pro Pro
145                 150                 155                 160
Pro His His His His His His
                165
<210>31
<211>636
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>31
atggccctgg agaaaggccc gctcctgctg ctggcccttg gcctgggcct ggcgggtgcc     60
cagaaggctc tggaagaggt accggtacag ccgggcttca atgcgcagaa ggtggagggg    120
cgctggctca ccctgcagct ggcagccaac cacgcagacc tggtctcccc ggccgacccc    180
ctgaggctcg ctctccactc catccggacc agggacggcg gggacgtgga cttcgtgctg    240
ttctggaagg gagaaggggt gtgtaaagaa acaaacatca ccgtccatcc aacccagttg    300
caaggccagt accaaggctc atggcatggg ggggtccagg gcctggggga cggaggagag    360
aggcatcgtg catcagctgg cccggggtct ccaacagtcg agggcggcag catgcacgta    420
tgcttcgtca gcaccgacta cagcaacctc attctttacg tgcgctttga ggatgatgag    480
atcaccaacc tgtgggtgct gctggcgaga agaatgctgg aggaccccaa atggctggga    540
agatacttgg agtacgtgga gaaattccac ctgcagaaag ccccggtctt caacatagat    600
ggcccatgtc ccccacccca ccatcaccat caccat                              636
<210>32
<211>212
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>32
Met Ala Leu Glu Lys Gly Pro Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly Leu Gly
1               5                   10                  15
Leu Ala Gly Ala Gln Lys Ala Leu Glu Glu Val Pro Val Gln Pro Gly
            20                  25                  30
Phe Asn Ala Gln Lys Val Glu Gly Arg Trp Leu Thr Leu Gln Leu Ala
        35                  40                  45
Ala Asn His Ala Asp Leu Val Ser Pro Ala Asp Pro Leu Arg Leu Ala
    50                  55                  60
Leu His Ser Ile Arg Thr Arg Asp Gly Gly Asp Val Asp Phe Val Leu
65                  70                  75                  80
Phe Trp Lys Gly Glu Gly Val Cys Lys Glu Thr Asn Ile Thr Val His
                85                  90                  95
Pro Thr Gln Leu Gln Gly Gln Tyr Gln Gly Ser Trp His Gly Gly Val
            100                 105                 110
Gln Gly Leu Gly Asp Gly Gly Glu Arg His Arg Ala Ser Ala Gly Pro
        115                 120                 125
Gly Ser Pro Thr Val Glu Gly Gly Ser Met His Val Cys Phe Val Ser
    130                 135                 140
Thr Asp Tyr Ser Asn Leu Ile Leu Tyr Val Arg Phe Glu Asp Asp Glu
145                 150                 155                 160
Ile Thr Asn Leu Trp Val Leu Leu Ala Arg Arg Met Leu Glu Asp Pro
                165                 170                 175
Lys Trp Leu Gly Arg Tyr Leu Glu Tyr Val Glu Lys Phe His Leu Gln
            180                 185                 190
Lys Ala Pro Val Phe Asn Ile Asp Gly Pro Cys Pro Pro Pro His His
        195                 200                 205
His His His His
    210
<210>33
<211>576
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>33
cagaaggctc tggaagaggt accggtacag ccgggcttca atgcgcagaa ggtggagggg     60
cgctggctca ccctgcagct ggcagccaac cacgcagacc tggtctcccc ggccgacccc    120
ctgaggctcg ctctccactc catccggacc agggacggcg gggacgtgga cttcgtgctg    180
ttctggaagg gagaaggggt gtgtaaagaa acaaacatca ccgtccatcc aacccagttg    240
caaggccagt accaaggctc atggcatggg ggggtccagg gcctggggga cggaggagag    300
aggcatcgtg catcagctgg cccggggtct ccaacagtcg agggcggcag catgcacgta    360
tgcttcgtca gcaccgacta cagcaacctc attctttacg tgcgctttga ggatgatgag    420
atcaccaacc tgtgggtgct gctggcgaga agaatgctgg aggaccccaa atggctggga    480
agatacttgg agtacgtgga gaaattccac ctgcagaaag ccccggtctt caacatagat    540
ggcccatgtc ccccacccca ccatcaccat caccat                              576
<210>34
<211>192
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>34
Gln Lys Ala Leu Glu Glu Val Pro Val Gln Pro Gly Phe Asn Ala Gln
1               5                   10                  15
Lys Val Glu Gly Arg Trp Leu Thr Leu Gln Leu Ala Ala Asn His Ala
            20                  25                  30
Asp Leu Val Ser Pro Ala Asp Pro Leu Arg Leu Ala Leu His Ser Ile
        35                  40                  45
Arg Thr Arg Asp Gly Gly Asp Val Asp Phe Val Leu Phe Trp Lys Gly
    50                  55                  60
Glu Gly Val Cys Lys Glu Thr Asn Ile Thr Val His Pro Thr Gln Leu
65                  70                  75                  80
Gln Gly Gln Tyr Gln Gly Ser Trp His Gly Gly Val Gln Gly Leu Gly
                85                  90                  95
Asp Gly Gly Glu Arg His Arg Ala Ser Ala Gly Pro Gly Ser Pro Thr
            100                 105                 110
Val Glu Gly Gly Ser Met His Val Cys Phe Val Ser Thr Asp Tyr Ser
        115                 120                 125
Asn Leu Ile Leu Tyr Val Arg Phe Glu Asp Asp Glu Ile Thr Asn Leu
    130                 135                 140
Trp Val Leu Leu Ala Arg Arg Met Leu Glu Asp Pro Lys Trp Leu Gly
145                 150                 155                 160
Arg Tyr Leu Glu Tyr Val Glu Lys Phe His Leu Gln Lys Ala Pro Val
                165                 170                 175
Phe Asn Ile Asp Gly Pro Cys Pro Pro Pro His His His His His His
            180                 185                 190
<210>35
<211>74
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>35
gggagaaggg gtgtgtaaag aaacaaccat caccgtccat ccaacccagt tgcaaggcca     60
gtaccaaggc tcat                                                       74
<210>36
<211>25
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>36
Gly Glu Gly Val Cys Lys Glu Thr Thr Ile Thr Val His Pro Thr Gln
1               5                   10                  15
Leu Gln Gly Gln Tyr Gln Gly Ser Phe
            20                  25
<210>37
<211>74
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>37
gggagaaggg gtgtgtaaag aaacaaccat caccgtccat ccaacccagt tgcaaggcca     60
gtaccaaggc tcat                                                       74
<210>38
<211>25
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>38
Gly Glu Gly Val Cys Lys Glu Thr Thr Ile Thr Val His Pro Thr Gln
1               5                   10                  15
Leu Gln Gly Gln Tyr Gln Gly Ser Trp
            20                  25
<210>39
<211>546
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>39
atggccctgg agaaaggccc gctcctgctg ctggcccttg gcctgggcct ggcgggtgcc     60
cagaaggctc tggaagaggt accggtacag ccgggcttca atgcgcagaa ggtggagggg    120
cgctggctca ccctgcagct ggcagccaac cacgcagacc tggtctcccc ggccgacccc    180
ctgaggctcg ctctccactc catccggacc agggacggcg gggacgtgga cttcgtgctg    240
ttctggaagg gagaaggggt gtgtaaagaa acaaccatca ccgtccatcc aacccagttg    300
caaggccagt accaaggctc attcgagggc ggcagcatgc acgtatgctt cgtcagcacc    360
gactacagca acctcattct ttacgtgcgc tttgaggatg atgagatcac caacctgtgg    420
gtgctgctgg cgagaagaat gctggaggac cccaaatggc tgggaagata cttggagtac    480
gtggagaaat tccacctgca gaaagccccg gtcttcaaca tagatggccc atgtccccca    540
ccctga                                                               546
<210>40
<211>181
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>40
Met Ala Leu Glu Lys Gly Pro Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly Leu Gly
1               5                   10                  15
Leu Ala Gly Ala Gln Lys Ala Leu Glu Glu Val Pro Val Gln Pro Gly
            20                  25                  30
Phe Asn Ala Gln Lys Val Glu Gly Arg Trp Leu Thr Leu Gln Leu Ala
        35                  40                  45
Ala Asn His Ala Asp Leu Val Ser Pro Ala Asp Pro Leu Arg Leu Ala
    50                  55                  60
Leu His Ser Ile Arg Thr Arg Asp Gly Gly Asp Val Asp Phe Val Leu
65                  70                  75                  80
Phe Trp Lys Gly Glu Gly Val Cys Lys Glu Thr Thr Ile Thr Val His
                85                  90                  95
Pro Thr Gln Leu Gln Gly Gln Tyr Gln Gly Ser Phe Glu Gly Gly Ser
            100                 105                 110
Met His Val Cys Phe Val Ser Thr Asp Tyr Ser Asn Leu Ile Leu Tyr
        115                 120                 125
Val Arg Phe Glu Asp Asp Glu Ile Thr Asn Leu Trp Val Leu Leu Ala
    130                 135                 140
Arg Arg Met Leu Glu Asp Pro Lys Trp Leu Gly Arg Tyr Leu Glu Tyr
145                 150                 155                 160
Val Glu Lys Phe His Leu Gln Lys Ala Pro Val Phe Asn Ile Asp Gly
                165                 170                 175
Pro Cys Pro Pro Pro
            180
<210>41
<211>485
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>41
cagaaggctc tggaagaggt accggtacag ccgggcttca atgcgcagaa ggtggagggg     60
cgctggctca ccctgcagct ggcagccaac cacgcagacc tggtctcccc ggccgacccc    120
ctgaggctcg ctctccactc catccggacc agggacggcg gggacgtgga cttcgtgctg    180
ttctggaagg gagaaggggt gtgtaaagaa acaaccatca ccgtccatcc aacccagttg    240
caaggccagt accaaggctc attcgagggc ggcagcatgc acgtatgctt cgtcagcacc    300
gactacagca acctcattct ttacgtgcgc tttgaggatg atgagatcac caacctgtgg    360
gtgctgctgg cgagaagaat gctggaggac cccaaatggc tgggaagata cttggagtac    420
gtggagaaat tccacctgca gaaagccccg gtcttcaaca tagatggccc atgtccccca    480
ccctg                                                                485
<210>42
<211>161
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>42
Gln Lys Ala Leu Glu Glu Val Pro Val Gln Pro Gly Phe Asn Ala Gln
1               5                   10                  15
Lys Val Glu Gly Arg Trp Leu Thr Leu Gln Leu Ala Ala Asn His Ala
            20                  25                  30
Asp Leu Val Ser Pro Ala Asp Pro Leu Arg Leu Ala Leu His Ser Ile
        35                  40                  45
Arg Thr Arg Asp Gly Gly Asp Val Asp Phe Val Leu Phe Trp Lys Gly
    50                  55                  60
Glu Gly Val Cys Lys Glu Thr Thr Ile Thr Val His Pro Thr Gln Leu
65                  70                  75                  80
Gln Gly Gln Tyr Gln Gly Ser Phe Glu Gly Gly Ser Met His Val Cys
                85                  90                  95
Phe Val Ser Thr Asp Tyr Ser Asn Leu Ile Leu Tyr Val Arg Phe Glu
            100                 105                 110
Asp Asp Glu Ile Thr Asn Leu Trp Val Leu Leu Ala Arg Arg Met Leu
        115                 120                 125
Glu Asp Pro Lys Trp Leu Gly Arg Tyr Leu Glu Tyr Val Glu Lys Phe
    130                 135                 140
His Leu Gln Lys Ala Pro Val Phe Asn Ile Asp Gly Pro Cys Pro Pro
145                 150                 155                 160
Pro
<210>43
<211>618
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>43
atggccctgg agaaaggccc gctcctgctg ctggcccttg gcctgggcct ggcgggtgcc     60
cagaaggctc tggaagaggt accggtacag ccgggcttca atgcgcagaa ggtggagggg    120
cgctggctca ccctgcagct ggcagccaac cacgcagacc tggtctcccc ggccgacccc    180
ctgaggctcg ctctccactc catccggacc agggacggcg gggacgtgga cttcgtgctg    240
ttctggaagg gagaaggggt gtgtaaagaa acaaccatca ccgtccatcc aacccagttg    300
caaggccagt accaaggctc atggcatggg ggggtccagg gcctggggga cggaggagag    360
aggcatcgtg catcagctgg cccggggtct ccaacagtcg agggcggcag catgcacgta    420
tgcttcgtca gcaccgacta cagcaacctc attctttacg tgcgctttga ggatgatgag    480
atcaccaacc tgtgggtgct gctggcgaga agaatgctgg aggaccccaa atggctggga    540
agatacttgg agtacgtgga gaaattccac ctgcagaaag ccccggtctt caacatagat    600
ggcccatgtc ccccaccc                                                  618
<210>44
<211>206
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>44
Met Ala Leu Glu Lys Gly Pro Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly Leu Gly
1               5                   10                  15
Leu Ala Gly Ala Gln Lys Ala Leu Glu Glu Val Pro Val Gln Pro Gly
            20                  25                  30
Phe Asn Ala Gln Lys Val Glu Gly Arg Trp Leu Thr Leu Gln Leu Ala
        35                  40                  45
Ala Asn His Ala Asp Leu Val Ser Pro Ala Asp Pro Leu Arg Leu Ala
    50                  55                  60
Leu His Ser Ile Arg Thr Arg Asp Gly Gly Asp Val Asp Phe Val Leu
65                  70                  75                  80
Phe Trp Lys Gly Glu Gly Val Cys Lys Glu Thr Thr Ile Thr Val His
                85                  90                  95
Pro Thr Gln Leu Gln Gly Gln Tyr Gln Gly Ser Trp His Gly Gly Val
            100                 105                 110
Gln Gly Leu Gly Asp Gly Gly Glu Arg His Arg Ala Ser Ala Gly Pro
        115                 120                 125
Gly Ser Pro Thr Val Glu Gly Gly Ser Met His Val Cys Phe Val Ser
    130                 135                 140
Thr Asp Tyr Ser Asn Leu Ile Leu Tyr Val Arg Phe Glu Asp Asp Glu
145                 150                 155                 160
Ile Thr Asn Leu Trp Val Leu Leu Ala Arg Arg Met Leu Glu Asp Pro
                165                 170                 175
Lys Trp Leu Gly Arg Tyr Leu Glu Tyr Val Glu Lys Phe His Leu Gln
            180                 185                 190
Lys Ala Pro Val Phe Asn Ile Asp Gly Pro Cys Pro Pro Pro
        195                 200                 205
<210>45
<211>558
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>45
cagaaggctc tggaagaggt accggtacag ccgggcttca atgcgcagaa ggtggagggg      60
cgctggctca ccctgcagct ggcagccaac cacgcagacc tggtctcccc ggccgacccc     120
ctgaggctcg ctctccactc catccggacc agggacggcg gggacgtgga cttcgtgctg     180
ttctggaagg gagaaggggt gtgtaaagaa acaaccatca ccgtccatcc aacccagttg     240
caaggccagt accaaggctc atggcatggg ggggtccagg gcctggggga cggaggagag     300
aggcatcgtg catcagctgg cccggggtct ccaacagtcg agggcggcag catgcacgta     360
tgcttcgtca gcaccgacta cagcaacctc attctttacg tgcgctttga ggatgatgag     420
atcaccaacc tgtgggtgct gctggcgaga agaatgctgg aggaccccaa atggctggga     480
agatacttgg agtacgtgga gaaattccac ctgcagaaag ccccggtctt caacatagat     540
ggcccatgtc ccccaccc                                                   558
<210>46
<211>186
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>46
Gln Lys Ala Leu Glu Glu Val Pro Val Gln Pro Gly Phe Asn Ala Gln
1               5                   10                  15
Lys Val Glu Gly Arg Trp Leu Thr Leu Gln Leu Ala Ala Asn His Ala
            20                  25                  30
Asp Leu Val Ser Pro Ala Asp Pro Leu Arg Leu Ala Leu His Ser Ile
        35                  40                  45
Arg Thr Arg Asp Gly Gly Asp Val Asp Phe Val Leu Phe Trp Lys Gly
    50                  55                  60
Glu Gly Val Cys Lys Glu Thr Thr Ile Thr Val His Pro Thr Gln Leu
65                  70                  75                  80
Gln Gly Gln Tyr Gln Gly Ser Trp His Gly Gly Val Gln Gly Leu Gly
                85                  90                  95
Asp Gly Gly Glu Arg His Arg Ala Ser Ala Gly Pro Gly Ser Pro Thr
            100                 105                 110
Val Glu Gly Gly Ser Met His Val Cys Phe Val Ser Thr Asp Tyr Ser
        115                 120                 125
Asn Leu Ile Leu Tyr Val Arg Phe Glu Asp Asp Glu Ile Thr Asn Leu
    130                 135                 140
Trp Val Leu Leu Ala Arg Arg Met Leu Glu Asp Pro Lys Trp Leu Gly
145                 150                 155                 160
Arg Tyr Leu Glu Tyr Val Glu Lys Phe His Leu Gln Lys Ala Pro Val
                165                 170                 175
Phe Asn Ile Asp Gly Pro Cys Pro Pro Pro
            180                 185
<210>47
<211>561
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>47
atggccctgg agaaaggccc gctcctgctg ctggcccttg gcctgggcct ggcgggtgcc      60
cagaaggctc tggaagaggt accggtacag ccgggcttca atgcgcagaa ggtggagggg     120
cgctggctca ccctgcagct ggcagccaac cacgcagacc tggtctcccc ggctgacccc     180
ctgaggctcg ctctccactc catccggacc agggacggcg gggacgtgga cttcgtgctg     240
ttctggaagg gagaaggggt gtgtaaagaa acaaccatca ccgtccatcc aacccagttg     300
caaggccagt accaaggctc attcgagggc ggcagcatgc acgtatgctt cgtcagcacc     360
gactacagca acctcattct ttacgtgcgc tttgaggatg atgagatcac caacctgtgg     420
gtgctgctgg cgagaagaat gctggaggac cccaaatggc tgggaagata cttggagtac     480
gtggagaaat tccacctgca gaaagccccg gtcttcaaca tagatggccc atgtccccca     540
ccccaccatc accatcacca t                                               561
<210>48
<211>187
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>48
Met Ala Leu Glu Lys Gly Pro Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly Leu Gly
1               5                   10                  15
Leu Ala Gly Ala Gln Lys Ala Leu Glu Glu Val Pro Val Gln Pro Gly
            20                  25                  30
Phe Asn Ala Gln Lys Val Glu Gly Arg Trp Leu Thr Leu Gln Leu Ala
        35                  40                  45
Ala Ash His Ala Asp Leu Val Ser Pro Ala Asp Pro Leu Arg Leu Ala
    50                  55                  60
Leu His Ser Ile Arg Thr Arg Asp Gly Gly Asp Val Asp Phe Val Leu
65                  70                  75                  80
Phe Trp Lys Gly Glu Gly Val Cys Lys Glu Thr Thr Ile Thr Val His
                85                  90                  95
Pro Thr Gln Leu Gln Gly Gln Tyr Gln Gly Ser Phe Glu Gly Gly Ser
            100                 105                 110
Met His Val Cys Phe Val Ser Thr Asp Tyr Ser Asn Leu Ile Leu Tyr
        115                 120                 125
Val Arg Phe Glu Asp Asp Glu Ile Thr Asn Leu Trp Val Leu Leu Ala
    130                 135                 140
Arg Arg Met Leu Glu Asp Pro Lys Trp Leu Gly Arg Tyr Leu Glu Tyr
145                 150                 155                 160
Val Glu Lys Phe His Leu Gln Lys Ala Pro Val Phe Asn Ile Asp Gly
                165                 170                 175
Pro Cys Pro Pro Pro His His His His His His
            180                 185
<210>49
<211>501
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>49
cagaaggctc tggaagaggt accggtacag ccgggcttca atgcgcagaa ggtggagggg      60
cgctggctca ccctgcagct ggcagccaac cacgcagacc tggtctcccc ggctgacccc     120
ctgaggctcg ctctccactc catccggacc agggacggcg gggacgtgga cttcgtgctg     180
ttctggaagg gagaaggggt gtgtaaagaa acaaccatca ccgtccatcc aacccagttg     240
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gtggagaaat tccacctgca gaaagccccg gtcttcaaca tagatggccc atgtccccca     480
ccccaccatc accatcacca t                                               501
<210>50
<211>167
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>50
Gln Lys Ala Leu Glu Glu Val Pro Val Gln Pro Gly Phe Asn Ala Gln
1               5                   10                  15
Lys Val Glu Gly Arg Trp Leu Thr Leu Gln Leu Ala Ala Asn His Ala
            20                  25                  30
Asp Leu Val Ser Pro Ala Asp Pro Leu Arg Leu Ala Leu His Ser Ile
        35                  40                  45
Arg Thr Arg Asp Gly Gly Asp Val Asp Phe Val Leu Phe Trp Lys Gly
    50                  55                  60
Glu Gly Val Cys Lys Glu Thr Thr Ile Thr Val His Pro Thr Gln Leu
65                  70                  75                  80
Gln Gly Gln Tyr Gln Gly Ser Phe Glu Gly Gly Ser Met His Val Cys
                85                  90                  95
Phe Val Ser Thr Asp Tyr Ser Asn Leu Ile Leu Tyr Val Arg Phe Glu
            100                 105                 110
Asp Asp Glu Ile Thr Asn Leu Trp Val Leu Leu Ala Arg Arg Met Leu
        115                 120                 125
Glu Asp Pro Lys Trp Leu Gly Arg Tyr Leu Glu Tyr Val Glu Lys Phe
    130                 135                 140
His Leu Gln Lys Ala Pro Val Phe Asn Ile Asp Gly Pro Cys Pro Pro
145                 150                 155                 160
Pro His His His His His His
                165
<210>51
<211>636
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>51
atggccctgg agaaaggccc gctcctgctg ctggcccttg gcctgggcct ggcgggtgcc     60
cagaaggctc tggaagaggt accggtacag ccgggcttca atgcgcagaa ggtggagggg    120
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ctgaggctcg ctctccactc catccggacc agggacggcg gggacgtgga cttcgtgctg    240
ttctggaagg gagaaggggt gtgtaaagaa acaaccatca ccgtccatcc aacccagttg    300
caaggccagt accaaggctc atggcatggg ggggtccagg gcctggggga cggaggagag    360
aggcatcgtg catcagctgg cccggggtct ccaacagtcg agggcggcag catgcacgta    420
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<210>52
<211>212
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>52
Met Ala Leu Glu Lys Gly Pro Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly Leu Gly
1               5                   10                  15
Leu Ala Gly Ala Gln Lys Ala Leu Glu Glu Val Pro Val Gln Pro Gly
            20                  25                  30
Phe Asn Ala Gln Lys Val Glu Gly Arg Trp Leu Thr Leu Gln Leu Ala
        35                  40                  45
Ala Asn His Ala Asp Leu Val Ser Pro Ala Asp Pro Leu Arg Leu Ala
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Leu His Ser Ile Arg Thr Arg Asp Gly Gly Asp Val Asp Phe Val Leu
65                  70                  75                  80
Phe Trp Lys Gly Glu Gly Val Cys Lys Glu Thr Thr Ile Thr Val His
                85                  90                  95
Pro Thr Gln Leu Gln Gly Gln Tyr Gln Gly Ser Trp His Gly Gly Val
            100                 105                 110
Gln Gly Leu Gly Asp Gly Gly Glu Arg His Arg Ala Ser Ala Gly Pro
        115                 120                 125
Gly Ser Pro Thr Val Glu Gly Gly Ser Met His Val Cys Phe Val Ser
    130                 135                 140
Thr Asp Tyr Ser Asn Leu Ile Leu Tyr Val Arg Phe Glu Asp Asp Glu
145                 150                 155                 160
Ile Thr Asn Leu Trp Val Leu Leu Ala Arg Arg Met Leu Glu Asp Pro
                165                 170                 175
Lys Trp Leu Gly Arg Tyr Leu Glu Tyr Val Glu Lys Phe His Leu Gln
            180                 185                 190
Lys Ala Pro Val Phe Asn Ile Asp Gly Pro Cys Pro Pro Pro His His
        195                 200                 205
His His His His
    210
<210>53
<211>576
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>53
cagaaggctc tggaagaggt accggtacag ccgggcttca atgcgcagaa ggtggagggg     60
cgctggctca ccctgcagct ggcagccaac cacgcagacc tggtctcccc ggccgacccc    120
ctgaggctcg ctctccactc catccggacc agggacggcg gggacgtgga cttcgtgctg    180
ttctggaagg gagaaggggt gtgtaaagaa acaaccatca ccgtccatcc aacccagttg    240
caaggccagt accaaggctc atggcatggg ggggtccagg gcctggggga cggaggagag    300
aggcatcgtg catcagctgg cccggggtct ccaacagtcg agggcggcag catgcacgta    360
tgcttcgtca gcaccgacta cagcaacctc attctttacg tgcgctttga ggatgatgag    420
atcaccaacc tgtgggtgct gctggcgaga agaatgctgg aggaccccaa atggctggga    480
agatacttgg agtacgtgga gaaattccac ctgcagaaag ccccggtctt caacatagat    540
ggcccatgtc ccccacccca ccatcaccat caccat                              576
<210>54
<211>192
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>54
Gln Lys Ala Leu Glu Glu Val Pro Val Gln Pro Gly Phe Asn Ala Gln
 1              5                   10                  15
Lys Val Glu Gly Arg Trp Leu Thr Leu Gln Leu Ala Ala Asn His Ala
            20                  25                  30
Asp Leu Val Ser Pro Ala Asp Pro Leu Arg Leu Ala Leu His Ser Ile
        35                  40                  45
Arg Thr Arg Asp Gly Gly Asp Val Asp Phe Val Leu Phe Trp Lys Gly
    50                  55                  60
Glu Gly Val Cys Lys Glu Thr Thr Ile Thr Val His Pro Thr Gln Leu
65                  70                  75                  80
Gln Gly Gln Tyr Gln Gly Ser Trp His Gly Gly Val Gln Gly Leu Gly
                85                  90                  95
Asp Gly Gly Glu Arg His Arg Ala Ser Ala Gly Pro Gly Ser Pro Thr
            100                 105                 110
Val Glu Gly Gly Ser Met His Val Cys Phe Val Ser Thr Asp Tyr Ser
        115                 120                 125
Asn Leu Ile Leu Tyr Val Arg Phe Glu Asp Asp Glu Ile Thr Asn Leu
    130                 135                 140
Trp Val Leu Leu Ala Arg Arg Met Leu Glu Asp Pro Lys Trp Leu Gly
145                 150                 155                 160
Arg Tyr Leu Glu Tyr Val Glu Lys Phe His Leu Gln Lys Ala Pro Val
                165                 170                 175
Phe Asn Ile Asp Gly Pro Cys Pro Pro Pro His His His His His His
            180                 185                 190
<210>55
<211>183
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>55
ggcatggggg ggtccagagc ctgggggacg gaggagagag gcatcgtgca tcagctggcc     60
cggggtctcc aacagtcgag ggcggcagca tgcacgtatg cttcgtcagc accgactaca    120
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tgg                                                                  183
<210>56
<211>61
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>56
His Gly Gly Val Gln Ser Leu Gly Asp Gly Gly Glu Arg His Arg Ala
1               5                   10                  15
Ser Ala Gly Pro Gly Ser Pro Thr Val Glu Gly Gly Ser Met His Val
            20                  25                  30
Cys Phe Val Ser Thr Asp Tyr Ser Asn Leu Ile Leu Tyr Val Arg Phe
        35                  40                  45
Glu Asp Asp Glu Ile Thr Asn Leu Trp Val Leu Leu Ala
    50                  55                  60
<210>57
<211>618
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>57
atggccctgg agaaaggccc gctcctgctg ctggcccttg gcctgggcct ggcgggtgcc     60
cagaaggctc tggaagaggt accggtacag ccgggcttca atgcgcagaa ggtggagggg    120
cgctggctca ccctgcagct ggcagccaac cacgcagacc tggtctcccc ggccgacccc    180
ctgaggctcg ctctccactc catccggacc agggacggcg gggacgtgga cttcgtgctg    240
ttctggaagg gagaaggggt gtgtaaagaa acaaacatca ccgtccatcc aacccagttg    300
caaggccagt accaaggctc atggcatggg ggggtccaga gcctggggga cggaggagag    360
aggcatcgtg catcagctgg cccggggtct ccaacagtcg agggcggcag catgcacgta    420
tgcttcgtca gcaccgacta cagcaacctc attctttacg tgcgctttga ggatgatgag    480
atcaccaacc tgtgggtgct gctggcgaga agaatgctgg aggaccccaa atggctggga    540
agatacttgg agtacgtgga gaaattccac ctgcagaaag ccccggtctt caacatagat    600
ggcccatgtc ccccaccc                                                  618
<210>58
<211>206
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>58
Met Ala Leu Glu Lys Gly Pro Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly Leu Gly
1               5                   10                  15
Leu Ala Gly Ala Gln Lys Ala Leu Glu Glu Val Pro Val Gln Pro Gly
            20                  25                  30
Phe Asn Ala Gln Lys Val Glu Gly Arg Trp Leu Thr Leu Gln Leu Ala
        35                  40                  45
Ala Asn His Ala Asp Leu Val Ser Pro Ala Asp Pro Leu Arg Leu Ala
    50                  55                  60
Leu His Ser Ile Arg Thr Arg Asp Gly Gly Asp Val Asp Phe Val Leu
65                  70                  75                  80
Phe Trp Lys Gly Glu Gly Val Cys Lys Glu Thr Asn Ile Thr Val His
                85                  90                  95
Pro Thr Gln Leu Gln Gly Gln Tyr Gln Gly Ser Trp His Gly Gly Val
            100                 105                 110
Gln Ser Leu Gly Asp Gly Gly Glu Arg His Arg Ala Ser Ala Gly Pro
        115                 120                 125
Gly Ser Pro Thr Val Glu Gly Gly Ser Met His Val Cys Phe Val Ser
    130                 135                 140
Thr Asp Tyr Ser Asn Leu Ile Leu Tyr Val Arg Phe Glu Asp Asp Glu
145                 150                 155                 160
Ile Thr Asn Leu Trp Val Leu Leu Ala Arg Arg Met Leu Glu Asp Pro
                165                 170                 175
Lys Trp Leu Gly Arg Tyr Leu Glu Tyr Val Glu Lys Phe His Leu Gln
            180                 185                 190
Lys Ala Pro Val Phe Asn Ile Asp Gly Pro Cys Pro Pro Pro
        195                 200                 205
<210>59
<211>558
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>59
cagaaggctc tggaagaggt accggtacag ccgggcttca atgcgcagaa ggtggagggg     60
cgctggctca ccctgcagct ggcagccaac cacgcagacc tggtctcccc ggccgacccc    120
ctgaggctcg ctctccactc catccggacc agggacggcg gggacgtgga cttcgtgctg    180
ttctggaagg gagaaggggt gtgtaaagaa acaaacatca ccgtccatcc aacccagttg    240
caaggccagt accaaggctc atggcatggg ggggtccaga gcctggggga cggaggagag    300
aggcatcgtg catcagctgg cccggggtct ccaacagtcg agggcggcag catgcacgta    360
tgcttcgtca gcaccgacta cagcaacctc attctttacg tgcgctttga ggatgatgag    420
atcaccaacc tgtgggtgct gctggcgaga agaatgctgg aggaccccaa atggctggga    480
agatacttgg agtacgtgga gaaattccac ctgcagaaag ccccggtctt caacatagat    540
ggcccatgtc ccccaccc                                                  558
<210>60
<211>186
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>60
Gln Lys Ala Leu Glu Glu Val Pro Val Gln Pro Gly Phe Asn Ala Gln
1               5                   10                  15
Lys Val Glu Gly Arg Trp Leu Thr Leu Gln Leu Ala Ala Asn His Ala
            20                  25                  30
Asp Leu Val Ser Pro Ala Asp Pro Leu Arg Leu Ala Leu His Ser Ile
        35                  40                  45
Arg Thr Arg Asp Gly Gly Asp Val Asp Phe Val Leu Phe Trp Lys Gly
    50                  55                  60
Glu Gly Val Cys Lys Glu Thr Asn Ile Thr Val His Pro Thr Gln Leu
65                  70                  75                  80
Gln Gly Gln Tyr Gln Gly Ser Trp His Gly Gly Val Gln Ser Leu Gly
                85                  90                  95
Asp Gly Gly Glu Arg His Arg Ala Ser Ala Gly Pro Gly Ser Pro Thr
            100                 105                 110
Val Glu Gly Gly Ser Met His Val Cys Phe Val Ser Thr Asp Tyr Ser
        115                 120                 125
Asn Leu Ile Leu Tyr Val Arg Phe Glu Asp Asp Glu Ile Thr Asn Leu
    130                 135                 140
Trp Val Leu Leu Ala Arg Arg Met Leu Glu Asp Pro Lys Trp Leu Gly
145                 150                 155                 160
Arg Tyr Leu Glu Tyr Val Glu Lys Phe His Leu Gln Lys Ala Pro Val
                165                 170                 175
Phe Asn Ile Asp Gly Pro Cys Pro Pro Pro
            180                185
<210>61
<211>636
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>61
atggccctgg agaaaggccc gctcctgctg ctggcccttg gcctgggcct ggcgggtgcc     60
cagaaggctc tggaagaggt accggtacag ccgggcttca atgcgcagaa ggtggagggg    120
cgctggctca ccctgcagct ggcagccaac cacgcagacc tggtctcccc ggccgacccc    180
ctgaggctcg ctctccactc catccggacc agggacggcg gggacgtgga cttcgtgctg    240
ttctggaagg gagaaggggt gtgtaaagaa acaaacatca ccgtccatcc aacccagttg    300
caaggccagt accaaggctc atggcatggg ggggtccaga gcctggggga cggaggagag    360
aggcatcgtg catcagctgg cccggggtct ccaacagtcg agggcggcag catgcacgta    420
tgcttcgtca gcaccgacta cagcaacctc attctttacg tgcgctttga ggatgatgag    480
atcaccaacc tgtgggtgct gctggcgaga agaatgctgg aggaccccaa atggctggga    540
agatacttgg agtacgtgga gaaattccac ctgcagaaag ccccggtctt caacatagat    600
 ggcccatgtc ccccacccca ccatcaccat caccat                             636
<210>62
<211>212
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>62
Met Ala Leu Glu Lys Gly Pro Leu Leu Leu Leu Ala Leu Gly Leu Gly
1               5                   10                  15
Leu Ala Gly Ala Gln Lys Ala Leu Glu Glu Val Pro Val Gln Pro Gly
            20                  25                  30
Phe Asn Ala Gln Lys Val Glu Gly Arg Trp Leu Thr Leu Gln Leu Ala
        35                  40                  45
Ala Asn His Ala Asp Leu Val Ser Pro Ala Asp Pro Leu Arg Leu Ala
    50                  55                  60
Leu His Ser Ile Arg Thr Arg Asp Gly Gly Asp Val Asp Phe Val Leu
65                  70                  75                  80
Phe Trp Lys Gly Glu Gly Val Cys Lys Glu Thr Asn Ile Thr Val His
                85                  90                  95
Pro Thr Gln Leu Gln Gly Gln Tyr Gln Gly Ser Trp His Gly Gly Val
            100                 105                 110
Gln Ser Leu Gly Asp Gly Gly Glu Arg His Arg Ala Ser Ala Gly Pro
        115                 120                 125
Gly Ser Pro Thr Val Glu Gly Gly Ser Met His Val Cys Phe Val Ser
    130                 135                 140
Thr Asp Tyr Ser Asn Leu Ile Leu Tyr Val Arg Phe Glu Asp Asp Glu
145                 150                 155                 160
Ile Thr Asn Leu Trp Val Leu Leu Ala Arg Arg Met Leu Glu Asp Pro
                165                 170                 175
Lys Trp Leu Gly Arg Tyr Leu Glu Tyr Val Glu Lys Phe His Leu Gln
            180                 185                 190
Lys Ala Pro Val Phe Asn Ile Asp Gly Pro Cys Pro Pro Pro His His
        195                 200                 205
His His His His
    210
<210>63
<211>576
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>63
cagaaggctc tggaagaggt accggtacag ccgggcttca atgcgcagaa ggtggagggg   60
cgctggctca ccctgcagct ggcagccaac cacgcagacc tggtctcccc ggccgacccc  120
ctgaggctcg ctctccactc catccggacc agggacggcg gggacgtgga cttcgtgctg  180
ttctggaagg gagaaggggt gtgtaaagaa acaaacatca ccgtccatcc aacccagttg  240
caaggccagt accaaggctc atggcatggg ggggtccaga gcctggggga cggaggagag  300
aggcatcgtg catcagctgg cccggggtct ccaacagtcg agggcggcag catgcacgta  360
tgcttcgtca gcaccgacta cagcaacctc attctttacg tgcgctttga ggatgatgag  420
atcaccaacc tgtgggtgct gctggcgaga agaatgctgg aggaccccaa atggctggga  480
agatacttgg agtacgtgga gaaattccac ctgcagaaag ccccggtctt caacatagat  540
ggcccatgtc ccccacccca ccatcaccat caccat                            576
<210>64
<211>192
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>64
Gln Lys Ala Leu Glu Glu Val Pro Val Gln Pro Gly Phe Asn Ala Gln
1               5                   10                  15
Lys Val Glu Gly Arg Trp Leu Thr Leu Gln Leu Ala Ala Asn His Ala
            20                  25                  30
Asp Leu Val Ser Pro Ala Asp Pro Leu Arg Leu Ala Leu His Ser Ile
        35                  40                  45
Arg Thr Arg Asp Gly Gly Asp Val Asp Phe Val Leu Phe Trp Lys Gly
    50                  55                  60
Glu Gly Val Cys Lys Glu Thr Asn Ile Thr Val His Pro Thr Gln Leu
65                  70                  75                  80
Gln Gly Gln Tyr Gln Gly Ser Trp His Gly Gly Val Gln Ser Leu Gly
                85                  90                  95
Asp Gly Gly Glu Arg His Arg Ala Ser Ala Gly Pro Gly Ser Pro Thr
            100                 105                 110
Val Glu Gly Gly Ser Met His Val Cys Phe Val Ser Thr Asp Tyr Ser
        115                 120                 125
Asn Leu Ile Leu Tyr Val Arg Phe Glu Asp Asp Glu Ile Thr Asn Leu
    130                 135                 140
Trp Val Leu Leu Ala Arg Arg Met Leu Glu Asp Pro Lys Trp Leu Gly
145                 150                 155                 160
Arg Tyr Leu Glu Tyr Val Glu Lys Phe His Leu Gln Lys Ala Pro Val
                165                 170                 175
Phe Asn Ile Asp Gly Pro Cys Pro Pro Pro His His His His His His
            180                 185                 190
<210>65
<211>137
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>65
gtggaggggc gctggctcac cctgcagctg gcagccaacc acgcagacct ggtctccccg   60
gctgaccccc tgaggctcgc tctccactcc atccggacca gggacggcgg ggacgtggac  120
ttcgtgctgt tctggaa                                                 137
<210>66
<211>149
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>66
Phe Asn Ala Gln Lys Val Glu Gly Arg Trp Leu Thr Leu Gln Leu Ala
1               5                   10                  15
Ala Asn His Ala Asp Leu Val Ser Pro Ala Asp Pro Leu Arg Leu Ala
            20                  25                  30
Leu His Ser Ile Arg Thr Arg Asp Gly Gly Asp Val Asp Phe Val Leu
        35                  40                  45
Phe Trp Lys Gly Glu Gly Val Cys Lys Glu Thr Asn Ile Thr Val His
    50                  55                  60
Pro Thr Gln Leu Gln Gly Gln Tyr Gln Gly Ser Phe Glu Gly Gly Ser
65                  70                  75                  80
Met His Val Cys Phe Val Ser Thr Asp Tyr Ser Asn Leu Ile Leu Tyr
                85                  90                  95
Val Arg Phe Glu Asp Asp Glu Ile Thr Asn Leu Trp Val Leu Leu Ala
            100                 105                 110
Arg Arg Met Leu Glu Asp Pro Lys Trp Leu Gly Arg Tyr Leu Glu Tyr
        115                 120                 125
Val Glu Lys Phe His Leu Gln Lys Ala Pro Val Phe Asn Ile Asp Gly
    130                 135                 140
Pro Cys Pro Pro Pro
145
<210>67
<211>450
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>67
ttcaatgcgc agaaggtgga ggggcgctgg ctcaccctgc agctggcagc caaccacgca   60
gacctggtct ccccggccga ccccctgagg ctcgctctcc actccatccg gaccagggac  120
ggcggggacg tggacttcgt gctgttctgg aagggagaag gggtgtgtaa agaaacaaac  180
atcaccgtcc atccaaccca gttgcaaggc cagtaccaag gctcattcga gggcggcagc  240
atgcacgtat gcttcgtcag caccgactac agcaacctca ttctttacgt gcgctttgag  300
gatgatgaga tcaccaacct gtgggtgctg ctggcgagaa gaatgctgga ggaccccaaa  360
tggctgggaa gatacttgga gtacgtggag aaattccacc tgcagaaagc cccggtcttc  420
aacatagatg gcccatgtcc cccaccctga                                   450
<210>68
<211>155
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>68
Phe Asn Ala Gln Lys Val Glu Gly Arg Trp Leu Thr Leu Gln Leu Ala
1               5                   10                  15
Ala Asn His Ala Asp Leu Val Ser Pro Ala Asp Pro Leu Arg Leu Ala
            20                  25                  30
Leu His Ser Ile Arg Thr Arg Asp Gly Gly Asp Val Asp Phe Val Leu
        35                  40                  45
Phe Trp Lys Gly Glu Gly Val Cys Lys Glu Thr Asn Ile Thr Val His
    50                  55                  60
Pro Thr Gln Leu Gln Gly Gln Tyr Gln Gly Ser Phe Glu Gly Gly Ser
 65                 70                  75                  80
Met His Val Cys Phe Val Ser Thr Asp Tyr Ser Asn Leu Ile Leu Tyr
                85                  90                  95
Val Arg Phe Glu Asp Asp Glu Ile Thr Asn Leu Trp Val Leu Leu Ala
            100                 105                 110
Arg Arg Met Leu Glu Asp Pro Lys Trp Leu Gly Arg Tyr Leu Glu Tyr
        115                 120                 125
Val Glu Lys Phe His Leu Gln Lys Ala Pro Val Phe Asn Ile Asp Gly
    130                 135                 140
Pro Cys Pro Pro Pro His His His His His His
145                 150                 155
<210>69
<211>468
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>69
ttcaatgcgc agaaggtgga ggggcgctgg ctcaccctgc agctggcagc caaccacgca     60
gacctggtct ccccggccga ccccctgagg ctcgctctcc actccatccg gaccagggac    120
ggcggggacg tggacttcgt gctgttctgg aagggagaag gggtgtgtaa agaaacaaac    180
atcaccgtcc atccaaccca gttgcaaggc cagtaccaag gctcattcga gggcggcagc    240
atgcacgtat gcttcgtcag caccgactac agcaacctca ttctttacgt gcgctttgag    300
gatgatgaga tcaccaacct gtgggtgctg ctggcgagaa gaatgctgga ggaccccaaa    360
tggctgggaa gatacttgga gtacgtggag aaattccacc tgcagaaagc cccggtcttc    420
aacatagatg gcccatgtcc cccaccctga caccatcacc atcaccat                 468
<210>70
<211>182
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>70
Glu Glu Val Pro Val Gln Pro Gly Phe Asn Ala Gln Lys Val Glu Gly
1               5                   10                  15
Arg Trp Leu Thr Leu Gln Leu Ala Ala Asn His Ala Asp Leu Val Ser
            20                  25                  30
Pro Ala Asp Pro Leu Arg Leu Ala Leu His Ser Ile Arg Thr Arg Asp
        35                  40                  45
Gly Gly Asp Val Asp Phe Val Leu Phe Trp Lys Gly Glu Gly Val Cys
    50                  55                   60
Lys Glu Thr Asn Ile Thr Val His Pro Thr Gln Leu Gln Gly Gln Tyr
65                   70                 75                  80
Gln Gly Ser Trp His Gly Gly Val Gln Gly Leu Gly Asp Gly Gly Glu
                85                  90                  95
Arg His Arg Ala Ser Ala Gly Pro Gly Ser Pro Thr Val Glu Gly Gly
            100                 105                 110
Ser Met His Val Cys Phe Val Ser Thr Asp Tyr Ser Asn Leu Ile Leu
        115                 120                 125
Tyr Val Arg Phe Glu Asp Asp Glu Ile Thr Asn Leu Trp Val Leu Leu
    130                 135                 140
Ala Arg Arg Met Leu Glu Asp Pro Lys Trp Leu Gly Arg Tyr Leu Glu
145                 150                 155                 160
Tyr Val Glu Lys Phe His Leu Gln Lys Ala Pro Val Phe Asn Ile Asp
                165                 170                 175
Gly Pro Cys Pro Pro Pro
            180
<210>71
<211>548
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>71
gaagaggtac cggtacagcc gggcttcaat gcgcagaagg tggaggggcg ctggctcacc     60
ctgcagctgg cagccaacca cgcagacctg gtctccccgg ccgaccccct gaggctcgct    120
ctccactcca tccggaccag ggacggcggg gacgtggact tcgtgctgtt ctggaaggga    180
gaaggggtgt gtaaagaaac aaacatcacc gtccatccaa cccagttgca aggccagtac    240
caaggctcat ggcatggggg ggtccagggc ctgggggacg gaggagagag gcatcgtgca    300
tcagctggcc cggggtctcc aacagtcgag ggcggcagca tgcacgtatg cttcgtcagc    360
accgactaca gcaacctcat tctttacgtg cgctttgagg atgatgagat caccaacctg    420
tgggtgctgc tggcgagaag aatgctggag gaccccaaat ggctgggaag atacttggag    480
tacgtggaga aattccacct gcagaaagcc ccggtcttca acatagatgg cccatgtccc    540
ccacccga                                                             548
<210>72
<211>188
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>72
Glu Glu Val Pro Val Gln Pro Gly Phe Asn Ala Gln Lys Val Glu Gly
1               5                   10                  15
Arg Trp Leu Thr Leu Gln Leu Ala Ala Asn His Ala Asp Leu Val Ser
            20                  25                  30
Pro Ala Asp Pro Leu Arg Leu Ala Leu His Ser Ile Arg Thr Arg Asp
        35                  40                  45
Gly Gly Asp Val Asp Phe Val Leu Phe Trp Lys Gly Glu Gly Val Cys
    50                  55                  60
Lys Glu Thr Asn Ile Thr Val His Pro Thr Gln Leu Gln Gly Gln Tyr
65                  70                  75                  80
Gln Gly Ser Trp His Gly Gly Val Gln Gly Leu Gly Asp Gly Gly Glu
                85                  90                  95
Arg His Arg Ala Ser Ala Gly Pro Gly Ser Pro Thr Val Glu Gly Gly
            100                 105                 110
Ser Met His Val Cys Phe Val Ser Thr Asp Tyr Ser Asn Leu Ile Leu
        115                 120                 125
Tyr Val Arg Phe Glu Asp Asp Glu Ile Thr Asn Leu Trp Val Leu Leu
    130                 135                 140
Ala Arg Arg Met Leu Glu Asp Pro Lys Trp Leu Gly Arg Tyr Leu Glu
145                 150                 155                 160
Tyr Val Glu Lys Phe His Leu Gln Lys Ala Pro Val Phe Asn Ile Asp
                165                 170                 175
Gly Pro Cys Pro Pro Pro His His His His His His
            180                 185
<210>73
<211>564
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>73
gaagaggtac cggtacagcc gggcttcaat gcgcagaagg tggaggggcg ctggctcacc     60
ctgcagctgg cagccaacca cgcagacctg gtctccccgg ccgaccccct gaggctcgct    120
ctccactcca tccggaccag ggacggcggg gacgtggact tcgtgctgtt ctggaaggga    180
gaaggggtgt gtaaagaaac aaacatcacc gtccatccaa cccagttgca aggccagtac    240
caaggctcat ggcatggggg ggtccagggc ctgggggacg gaggagagag gcatcgtgca    300
tcagctggcc cggggtctcc aacagtcgag ggcggcagca tgcacgtatg cttcgtcagc    360
accgactaca gcaacctcat tctttacgtg cgctttgagg atgatgagat caccaacctg    420
tgggtgctgc tggcgagaag aatgctggag gaccccaaat ggctgggaag atacttggag    480
tacgtggaga aattccacct gcagaaagcc ccggtcttca acatagatgg cccatgtccc    540
ccaccccacc atcaccatca ccat                                           564

Claims (48)

1.一种多肽，其特征在于，该多肽：
i)含有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：66或SEQ ID NO：70所列的氨基酸序列或由所述序列组成；
ii)是以上序列的片段，该片段是一种脂质运载蛋白，或含有与(i)所述一种或多种多肽共同的抗原决定簇；或
iii)是(i)或(ii)的功能等价物。
2.一种多肽，其为如权利要求1(ii)所述的片段，其特征在于，该多肽包含SEQ ID NO：18的氨基酸25-174、氨基酸26-180、氨基酸33-166或氨基酸41-189，或SEQ ID NO：24的氨基酸25-206，且是一种脂质运载蛋白。
3.一种多肽，其为如权利要求1(iii)所述的功能等价物，其特征在于，所述多肽功能等价物与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：66或SEQ ID NO：70所列的氨基酸序列同源，且是一种脂质运载蛋白。
4.一种多肽，其为如权利要求1或2所述的片段或功能等价物，其特征在于，其与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、或SEQ ID NO：66所列的氨基酸序列或其活性片段具有80％以上的序列相同性，优选具有85％、90％、95％、98％、98.5％、99％或99.5％的序列相同性。
5.一种多肽，其为权利要求1-3中任何一项所述的功能等价物，其特征在于，该多肽与含有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：66或SEQ ID NO：70所列氨基酸序列的多肽具有显著的结构同源性。
6.一种多肽，其为如权利要求1或4所述的片段，其特征在于，该多肽含有与权利要求1中(i)所述多肽部分共同的抗原决定簇，该决定簇由SEQID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：66或SEQ ID NO：70所列氨基酸序列的7个或更多个氨基酸残基组成。
7.如权利要求1-6所述的多肽，其特征在于，所述多肽含有氨基酸取代N92T和/或G114S。
8.如权利要求6所述的多肽，其特征在于，该多肽的序列如SEQ IDNO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：60所列。
9.一种融合蛋白，其含有以上任何一项权利要求所述的多肽。
10.如权利要求1-9所述的多肽，其特征在于，所述多肽含有组氨酸标签。
11.如权利要求10所述的多肽，其特征在于，该多肽的序列如SEQ IDNO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：62、SEQ IDNO：64、SEQ ID NO：68或SEQ ID NO：72所列。
12.一种纯化核酸分子，其编码以上任何一项权利要求所述的多肽。
13.如权利要求12所述的纯化核酸分子，其特征在于，该分子含有SEQID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ IDNO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ IDNO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ IDNO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71或SEQ ID NO：72所列的核酸序列或由所述序列组成，或是它们的冗余等价物或片段。
14.一种纯化核酸分子，其在高严格条件下与权利要求12或13中任何一项所述核酸分子杂交。
15.一种载体，其含有如权利要求12-14中任何一项所述的核酸分子。
16.一种宿主细胞，其是用权利要求15所述的载体转化的。
17.一种配体，其特异性结合权利要求1-11中任何一项所述的多肽，并优选调节这些多肽的活性。
18.如权利要求17所述的配体，所述配体是一种抗体。
19.一种化合物，其能提高或降低权利要求1-11中任何一项所述多肽的表达水平或活性。
20.如权利要求19所述的化合物，其特征在于，该化合物结合权利要求1-9中任何一项所述的多肽而不诱导该多肽的任何生物学作用。
21.如权利要求20所述的化合物，所述化合物是天然或修饰的底物、配体、酶、受体、或结构或功能模拟物。
22.如权利要求1-9中任何一项所述的多肽、权利要求12-14中任何一项所述的核酸分子、权利要求15所述的载体、权利要求17所述的宿主细胞、权利要求18或权利要求19所述的配体、或权利要求20-21中任何一项所述的化合物在疾病治疗或诊断中的用途。
23.一种诊断患者疾病的方法，其特征在于，所述方法包括：评估编码权利要求1-11中任何一项所述多肽的天然基因的表达水平，或评估所述患者组织中权利要求1-11中任何一项所述多肽的活性，及将所述表达水平或活性与对照水平作比较，其中所述水平与所述对照水平不同，表明患有疾病。
24.如权利要求23所述的方法，所述方法在体外进行。
25.如权利要求23或权利要求24所述的方法，其包括以下步骤：(a)在适合形成配体-多肽复合物的条件下，使权利要求17或权利要求18所述的配体与生物样品接触；和(b)检测所述复合物。
26.如权利要求23或权利要求24所述的方法，其包括以下步骤：
(a)在允许权利要求12-14中任何一项所述核酸分子与核酸探针之间形成杂交复合物的严格条件下，使患者的组织样品与该探针接触；
(b)在与步骤(a)所用的相同条件下使对照样品与所述探针接触；和
检测所述样品中存在的杂交复合物；其中，当检测到患者样品中杂交复合物的水平不同于对照样品中杂交复合物的水平时，表明患有疾病。
27.如权利要求24或权利要求25所述的方法，其包括：
(a)在允许权利要求12-15中任何一项所述的核酸分子与核酸引物之间形成杂交复合物的严格条件下，使患者组织的核酸样品与该引物接触；
(b)在与步骤(a)所用的相同条件下使对照样品与所述引物接触；和
(c)扩增取样的核酸；和
(d)检测患者和对照样品的核酸扩增水平；
其中，测到患者样品的核酸扩增水平与对照样品的核酸扩增水平显著不同，表明患有疾病。
28.如权利要求23或权利要求24所述的方法，包括：
(a)获得待检测疾病的患者的组织样品；
(b)分离所述组织样品中权利要求12-14中任何一项所述的核酸分子；和
(c)检测到该核酸分子中存在与疾病相关的突变表明患有疾病，从而诊断该患者的疾病。
29.如权利要求28所述的方法，其还包括扩增所述核酸分子形成扩增产物，和检测该扩增产物中是否存在突变。
30.如权利要求28或29所述的方法，其中通过使所述核酸分子与能与该核酸分子杂交的核酸探针在严格条件下接触，以形成杂交双链分子，该杂交双链分子在对应于与疾病相关突变的任何部分具有与核酸探针链不杂交的部分，从而检测患者是否存在所述突变；和检测该探针链是否存在此不杂交的部分，作为是否存在疾病相关突变的指标。
31.如权利要求21-30中任何一项所述的方法，其中所述疾病包括但不限于：视力疾病(如夜盲)、免疫系统疾病(如自身免疫病)、炎症、炎性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎(UC)、克罗恩病(CD)、直肠炎、细胞增殖疾病、癌症(如乳腺癌、皮肤T细胞淋巴瘤、鳞状细胞癌和/或基底细胞癌)、微生物感染(如病毒、细菌和真菌感染)、肺气肿、皮肤病(如Th1皮肤病如牛皮癣或角化过度皮肤病；Th2皮肤病如特应性皮肤病、接触性皮炎，接触诸如镍或金引起的过敏症、皮肤T细胞淋巴瘤、特应性湿疹、急性和/或慢性湿疹)、生殖疾病(如不育，特别是男性不育)、肾功能失调、心肌梗塞、关节炎、多发性硬化症、巨囊性乳腺病、调节神经系统的发育、I型糖尿病、桥本甲状腺炎、甲状腺相关眼病(甲状腺炎)、类风湿关节炎、增殖和新月体肾小球肾炎、后葡萄膜炎、伤口愈合、和/或肉样瘤病、红糠疹和/或汗孔角化病、变态反应疾病如过敏性鼻炎、哮喘、扁平红苔癣、慢性鼻窦炎、赛塞利综合征、光化性角化病、丙型肝炎、溃疡性结肠炎、膜性肾小球肾炎和/或病毒感染。
32.权利要求1-11中任何一项所述的多肽作为脂质运载蛋白的用途。
33.一种药物组合物，其含有权利要求1-11中任何一项所述的多肽、权利要求12-14中任何一项所述的核酸分子、权利要求15所述的载体、权利要求16所述的宿主细胞、权利要求17或权利要求18所述的配体、或权利要求19-21中任何一项所述的化合物。
34.一种疫苗组合物，其含有权利要求1-11中任何一项所述的多肽或权利要求12-14中任何一项所述的核酸分子。
35.如权利要求1-11中任何一项所述的多肽、权利要求12-14中任何一项所述的核酸分子、权利要求14所述的载体、权利要求16所述的宿主细胞、权利要求17或权利要求18所述的配体、权利要求19-21中任何一项所述的化合物，或权利要求27所述的药物组合物在制备治疗特定疾病的药物中的用途，所述疾病包括但不限于：视力疾病(如夜盲)、免疫系统疾病(如自身免疫病)、炎症、炎性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎(UC)、克罗恩病(CD)、直肠炎、细胞增殖疾病、癌症(如乳腺癌、皮肤T细胞淋巴瘤、鳞状细胞癌和/或基底细胞癌)、微生物感染(如病毒、细菌和真菌感染)、肺气肿、皮肤病(如Th1皮肤病如牛皮癣或角化过度皮肤病；Th2皮肤病如特应性皮肤病、接触性皮炎，接触诸如镍或金引起的过敏症、皮肤T细胞淋巴瘤、特应性湿疹、急性和/或慢性湿疹)、生殖疾病(如不育，特别是男性不育)、肾功能失调、心肌梗塞、关节炎、多发性硬化症、巨囊性乳腺病、调节神经系统的发育、I型糖尿病、桥本甲状腺炎、甲状腺相关眼病(甲状腺炎)、类风湿关节炎、增殖和新月体肾小球肾炎、后葡萄膜炎、伤口愈合、和/或肉样瘤病、红糠疹和/或汗孔角化病、变态反应疾病如过敏性鼻炎、哮喘、扁平红苔癣、慢性鼻窦炎、赛塞利综合征、光化性角化病、丙型肝炎、溃疡性结肠炎、膜性肾小球肾炎和/或病毒感染。
36.如权利要求1-11中任何一项所述的多肽、权利要求12-14中任何一项所述的核酸分子、权利要求14所述的载体、权利要求16所述的宿主细胞、权利要求17或权利要求18所述的配体、权利要求19-21中任何一项所述的化合物，或权利要求27所述的药物组合物。
37.如权利要求35所述的方法，其特征在于，当患者的所述天然基因的表达或所述多肽的活性比健康人的表达水平或活性低时，给予该患者的所述多肽、核酸分子、载体、宿主细胞、配体、化合物或组合物是激动剂。
38.如权利要求35所述的方法，其特征在于，当患者的所述天然基因的表达或所述多肽的活性比健康人的表达水平或活性高时，给予该患者的所述多肽、核酸分子、载体、宿主细胞、配体、化合物或组合物是拈抗剂。
39.一种监测患者疾病治疗处理效果的方法，其特征在于，所述方法包括：监测一定时间内所述患者组织中权利要求1-11中任何一项所述多肽的表达水平或活性，或权利要求12-14中任何一项所述核酸分子的表达水平；其中该时间内所述表达水平或活性向着对照水平发生改变，表明所述疾病消退。
40.一种鉴定能有效治疗和/或诊断疾病的化合物的方法，其特征在于，所述方法包括：使权利要求1-11中任何一项所述的多肽，或权利要求12-14中任何一项所述的核酸分子，与疑似对所述多肽或核酸分子具有结合亲和力的一种或多种化合物接触；和选择能特异性结合所述核酸分子或多肽的化合物。
41.一种用于诊断疾病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：第一容器，其中装有在严格条件下与权利要求12-14中任何一项所述核酸分子杂交的核酸探针；第二容器，其中装有用于扩增所述核酸分子的引物；和使用所述探针和引物以利于疾病诊断的说明书。
42.如权利要求41所述的试剂盒，其还包括第三容器，其中装有消化未杂交RNA的试剂。
43.一种试剂盒，其包含核酸分子阵列，所述阵列中至少一种核酸是权利要求12-14中任何一项所述的核酸分子。
44.一种试剂盒，其包含一种或多种抗体和试剂，所述抗体结合权利要求1-11中任何一项所述的多肽；而所述试剂用于检测所述抗体与所述多肽之间的结合反应。
45.一种转基因或基因敲除的非人动物，其特征在于，该动物已经过转化而表达较高、较低水平或不表达权利要求1-11中任何一项所述的多肽。
46.一种筛选有效治疗疾病的化合物的方法，其特征在于，所述方法是使权利要求45所述的非人转基因动物接触候选化合物，及检测该化合物对此动物疾病的效果。
47.INSP181多肽作为筛选治疗或预防脂质运载蛋白相关疾病候选药物的靶标的用途。
48.选择生物活性化合物的方法，其特征在于，所述方法包括：
(a)使候选化合物与表达INSP181多肽的重组宿主细胞接触；
(b)选择能与所述细胞表面上的所述INSP181多肽结合，和/或能调节INSP181多肽活性的化合物。
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