CN105008393A - 用于筛选的方法 - Google Patents

用于筛选的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105008393A
CN105008393A CN201380072527.9A CN201380072527A CN105008393A CN 105008393 A CN105008393 A CN 105008393A CN 201380072527 A CN201380072527 A CN 201380072527A CN 105008393 A CN105008393 A CN 105008393A
Authority
CN
China
Prior art keywords
peptide
methods
drug candidates
amino acid
hours
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201380072527.9A
Other languages
English (en)
Inventor
J·奥尔森
C·梅林
M·司特劳德
J·西蒙
C·科伦提
P·帕迪森
R·斯特朗
D·梅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fred Hutchinson Cancer Center
Original Assignee
Fred Hutchinson Cancer Research Center
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fred Hutchinson Cancer Research Center filed Critical Fred Hutchinson Cancer Research Center
Publication of CN105008393A publication Critical patent/CN105008393A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1767—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43513—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae
    • C07K14/43522—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae from scorpions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0083—Miscellaneous (1.14.99)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/99—Miscellaneous (1.14.99)
    • C12Y114/99003—Heme oxygenase (1.14.99.3)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/20—Screening for compounds of potential therapeutic value cell-free systems

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)

Abstract

本发明公开了用于发现药物候选物的方法和系统。方法和系统可包括产生潜在药物候选物的文库(例如肽文库)，其可以是被筛选以鉴别具有所选药理学性质的潜在药物候选物的子文库(例如肽子文库)。还提供了制备和使用肽文库的方法。还提供了D-氨基酸氯毒素和D-氨基酸氯毒素变体。

Description

用于筛选的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2012年12月10日提交的美国临时申请No.61/735,516和于2013年3月15日提交的美国临时申请No.61/794,685的权益，这两个临时申请以全文引用的方式并入。
关于联邦政府赞助研究的陈述
本发明在美国政府的支持下根据美国国家卫生研究院的合同号R01CA135491、NIH ROI AI059543、AI094419以及AI097786进行。
发明背景
对药物发现作出的努力持续使用大量的技术和财政资源来鉴别和开发新的并且有用的药物。不幸地，发现新药仍旧有困难。举例来说，开发损害更少、更精确靶向的癌症疗法是为减轻患者的痛苦并且提高治疗成功率所必需的。但甚至在研究数十年之后，科学家仍努力鉴别具有医学和癌症靶向性质的恰当组合的治疗性化合物。
已研究和探求了多种类型的化合物用于不同治疗目的。举例来说，小化学分子和更大生物制品(例如抗体)已用于多血症的治疗性应用，并且取得了不同的成功。一些更小的肽例如借助于其天然功效也已显示可作为药物。
尽管有许多已发现的药物的实例，但仍需要新药发现平台、对具有例如改善的药理学性质的有用药物的进一步鉴别以及改进的用于制备和分析潜在药物候选物的方法。
发明概述
本发明涉及药物发现平台和方法。在一些方面，本发明涉及产生潜在药物候选物的文库(例如肽文库)的方法，所述潜在药物候选物的文库可以被筛选以鉴别具有所选药理学性质的潜在药物候选物的子文库(例如肽子文库)。在某些方面，本发明涉及鉴别药物候选物(例如肽)的方法，所述药物候选物可以是通过额外改变所鉴别的候选物的药理学性质用于进一步药物开发的先导化合物。本发明还包括制备潜在药物候选物的文库(例如肽文库)的方法。在各个方面，本公开涉及用于鉴别具有药理学性质的药物候选物的方法，所述方法包括，分析在向受试者施用多种药物候选物之后从受试者分离的样品；以及在所分离的样品中鉴别具有所述药理学性质的至少一种药物候选物。
在一些方面，本公开涉及用于鉴别具有药理学性质的药物候选物的方法，所述方法包括向受试者施用包含多种药物候选物的组合物；从受试者获得包含多种药物候选物中的至少一些的样品；以及分析样品以确定具有所述药理学性质的药物候选物中的至少一些的身份。
在一些方面，本公开涉及产生质量定义型药物候选物文库的方法，其中所述方法包括产生多种药物候选物，所述药物候选物中的至少一些各具有独特质量标签或消化片段质量标签，以及使用质谱法分析多种药物候选物以测量药物候选物中的至少一些的独特质量标签或消化片段质量标签。在某些实施方案中，所述方法包括产生包含多种药物候选物中的至少一些的质量定义型药物候选物文库，药物候选物文库是基于药理学性质而产生，其中质量定义型药物候选物文库中的药物候选物的身份可以用药物候选物中的每一种的独特质量标签或消化片段质量标签来确定。
在一些方面，本公开涉及用于鉴别具有药理学性质的药物候选物的文库的方法，其中所述方法包括分析在向受试者施用多种药物候选物之后从受试者分离的样品。在某些实施方案中，药物候选物的文库来自本文所提供的质量定义型药物候选物文库。在某些实施方案中，所述方法包括在分离的样品中鉴别具有所述药理学性质的至少一种药物候选物。
在一些方面，本公开涉及用于鉴别具有药理学性质的文库药物候选物的方法，其中所述方法包括向受试者施用多种文库药物候选物，其中文库药物候选物来自本文所提供的质量定义型药物候选物文库，从受试者获得包含多种文库药物候选物中的至少一些的样品；以及分析样品以确定具有所述药理学性质的多种文库药物候选物中的至少一些的身份。
在一些方面，本公开提供确定通过不同施用途径向受试者施用的打结肽(knotted-peptide)的分布曲线的方法，其中所述方法包括向受试者施用轻打结肽，轻打结肽通过第一递送途径施用并且与具有与轻打结肽相同的序列的重打结肽相比具有更低分子量；向受试者施用重打结肽，重打结肽通过不同于第一递送途径的第二递送途径施用；以及比较获自受试者的组织或流体样品的轻打结肽的量与重打结肽的量，从而确定受试者中分别基于第一和第二递送途径的轻打结肽和重打结肽的分布曲线。
在一些方面，本公开提供用于使受试者中的肿瘤显像的肽，所述肽包含含有具有至少三个D-氨基酸的氨基酸序列的氯毒素并且，并且所述肽具有被配置成结合于肿瘤的二级结构，其中所述肽进一步包含可检测标记。
在本公开的一些方面，提供用于治疗与表达氯毒素靶标的细胞相关的疾病的方法，所述方法包括：向有需要的受试者施用治疗有效量的包含根据本公开的肽的药物组合物或包含本公开的肽的组合物，从而治疗疾病。
以引用的方式并入
本说明书中提到的所有出版物、专利以及专利申请以引用的方式并入本文中，所达到的程度与指示各单个出版物、专利或专利申请具体地并且个别地以引用的方式并入一样。
附图简述
本发明的新颖特征详细陈述于随附权利要求书中。参考以下阐述使用本发明原理的说明性实施方案的详细描述以及其附图将获得对本发明的特征和优点的更充分理解：
图1提供根据本发明的一个实施方案显示多种骨架的凝胶图像。
图2描绘了从PCR组装到蛋白质收获的初始文库创建的示意图。示出了表面残基的一个潜在斑块(DHQ环)以说明初始肽文库的随机诱变方法。残基K15和K23已突变为丙氨酸以促进化学缀合。
图3说明根据本发明的一个实施方案产生肽文库的示例性方法。
图4示出根据本发明的一个实施方案产生肽文库的示例性方法。
图5描绘了根据本发明的一个实施方案可用于制备打结素(例如起泡蛋白(bubble protein))的示例性融合系统。
图6示出根据本发明的一个实施方案使用质谱法对大文库的分析。
图7示出根据本发明的一个实施方案使用噬铁蛋白融合来表达打结素变体的示例性方法。
图8描绘了根据本发明的实施方案对表达打结素骨架的SDS-PAGE分析。
图9提供根据本发明的一个实施方案的汇集文库制备的示意图。图9B是图9A的展开图。
图10描述来自根据本发明的一个实施方案的克隆打结素文库的代表性测序资料。
图11示出根据本发明的实施方案对3000个成员的打结素文库的SDS-PAGE分析。
图12示出根据本发明的实施方案通过反向蛋白质组学对突变耐受性的评估。
发明详述
本公开涉及用于药物发现的系统和方法。在某些方面，本公开涉及用于鉴别具有所需药理学性质的药物候选物的方法。在另外方面，本公开涉及产生质量定义型药物候选物文库的方法。在另外方面，本公开涉及确定通过不同施用途径向受试者施用的打结肽的分布曲线的方法。
产生所选文库
在一方面，本发明涉及用于产生潜在药物候选物的文库(例如小化学分子、生物制品、肽以及其任何衍生物或片段的文库)的方法和系统，所述潜在药物候选物的文库可被筛选以鉴别具有所选药理学性质的潜在药物候选物的子文库(例如小化学分子、生物制品、肽以及其任何衍生物或片段的子文库)。与一次筛选一种潜在药物候选物的常规药物筛选法相反，本发明首次筛选潜在药物候选物的文库(例如大于100个候选物)以寻找文库中的候选物中的一些或全部的某些药物样品质。文库的筛选可包括向受试者施用文库中的潜在药物候选物中的一些或全部并且确定药物候选物中哪些具有目标药理学性质。举例来说，可筛选潜在药物候选物的大文库的某些药理学性质，诸如但不限于口服生物利用率、药代动力学、分布、靶向能力、血清半衰期、组织穿透率、肿瘤穿透率和/或血脑屏障穿透率。文库的初始筛选可用于鉴别共有至少一种药理学性质的潜在药物候选物的子文库，从而产生多组优化药物候选物用于后续基于靶标的筛选或表型筛选。在一些实施方案中，文库的筛选可用于鉴别共有超过一种药理学性质的潜在药物候选物。在一些实施方案中，多种肽中的至少一种肽包含缀合至至少一种肽的N端的疏水部分，其中至少一种肽与缺乏疏水部分的至少一种肽相比展现增加的半衰期。在某些实施方案中，疏水部分包含疏水性荧光染料或者饱和或不饱和烷基。
在本公开的一些方面，多种药物候选物包括多种肽。
在本公开的一些方面，多种药物候选物包括多种小化学分子。
在本公开的一些方面，多种药物候选物包括多种生物制品。
在一些实施方案中，药理学性质包括口服生物利用率、穿过血脑屏障的能力、血脑屏障排阻、血清半衰期、穿透细胞的能力、进入亚细胞器或其它细胞结构域的能力或其组合。在某些实施方案中，药理学性质包括口服生物利用率。
如本文所用，术语“药物候选物”意指可潜在地引发对靶标或受试者的作用的任何药剂。在一些方面，药物候选物可具有治疗作用。示例性药物候选物可包括但不限于小化学分子、生物制品、肽以及其任何衍生物或片段。
如本文所用，“药理学性质”是药物候选物可用于表征药物候选物引发对靶标或受试者的作用的潜力的性质。示例性药理学性质可包括但不限于口服生物利用率、穿过血脑屏障的能力、血脑屏障排阻、血清半衰期、穿透细胞的能力、进入亚细胞器或其它细胞结构域的能力等。
在一些实施方案中，文库的筛选可用于鉴别共有2种药理学性质、3种药理学性质、4种药理学性质、5种药理学性质、6种药理学性质、7种药理学性质、8种药理学性质、9种药理学性质或10种药理学性质的候选物。在一些实施方案中，文库的筛选可用于鉴别共有超过10种药理学性质的潜在药物候选物。
可向受试者施用大量药物候选物并且进行筛选以确定例如哪些药物候选物具有目标药理学性质。举例来说，所述方法可包括施用超过五种药物候选物、超过十种药物候选物、超过50种药物候选物、超过100种药物候选物、超过500种药物候选物、超过1000种药物候选物、超过1500种药物候选物、超过2000种药物候选物、超过3000种药物候选物、超过5000种药物候选物、超过8000种药物候选物或超过10000种药物候选物。
在一些实施方案中，文库筛选可用于鉴别具有穿过血脑屏障的能力的候选物。在某些实施方案中，筛选可用于基于血清半衰期、口服生物利用率、蛋白水解降解、毒性、清除率、穿透细胞的能力或进入亚细胞器的能力鉴别候选物。在一些实例中，筛选可用于鉴别文库中具有超过一种所需药理学性质的成员。举例来说，筛选可用于鉴别展现诸如以下的性质中的两种或更多种的候选物：穿过血脑屏障的能力、血脑屏障排阻、最佳血清半衰期、口服生物利用率、降低的蛋白水解降解、穿透细胞的能力或进入亚细胞器的能力、靶向器官或组织的能力和/或靶向癌组织的能力。在一些实施方案中，可进行肽的筛选以鉴别哪些肽展现抑制蛋白质：蛋白质相互作用、抑制受体的拮抗作用、抑制激动剂与受体的结合、调控离子通道、抑制信号传导通路、活化信号传导通路和/或抑制蛋白质：小分子相互作用的活性。肽的活性(例如蛋白质：蛋白质相互作用)可与诸如以下疾病或病症有关：癌症、传染疾病、炎性疾病、免疫疾病、代谢疾病、心脏疾病、年龄相关疾病以及神经疾病。
如本文所用，术语“蛋白质：蛋白质相互作用”意指一种蛋白质与另一种蛋白质之间的可能是短暂的或永久的物理接触。第一蛋白质与第二蛋白质的相互作用可引起对第一或第二蛋白质的作用，使得所述作用以可检测的方式改变第一蛋白质或第二蛋白质或两种蛋白质。
在一些方面，产生本发明的文库的方法可包括逐渐富集具有诸如上文所描述的那些的一种或多种类药物性质的药物候选物(例如小化学分子、生物制品、肽以及其任何衍生物或片段)的子文库的迭代过程。举例来说，在第一次筛选中，可测试数千种候选物(例如小化学分子、生物制品、肽以及其任何衍生物或片段)的诸如以下药理学性质中的一种或多种：细胞穿透率、口服生物利用率、血清半衰期、血脑屏障穿透率、血脑屏障排阻、靶向器官或组织的能力和/或靶向癌组织的能力。然后所鉴别的具有某些性质的药物候选物可被再次筛选以产生具有其它药理学性质的后续候选物文库。后续筛选可包括任何所需数目的由第一次筛选鉴别的药物候选物。另一个候选物子文库可在对第一次筛选和第二次筛选迭代之后产生。可使用任何数量的迭代。在一些实施方案中，本发明的筛选方法包括1次迭代、2次迭代、3次迭代、4次、5次迭代、6次迭代、7次迭代、8次迭代、9次迭代、10次迭代、11次迭代、12次迭代、13次迭代、14次迭代、15次迭代、16次迭代、17次迭代、18次迭代、19次迭代或20次迭代。在多次迭代中所测试的类药物性质在每次迭代中可相同或不同。举例来说，在一次循环中，可测试候选物(例如肽)的文库穿过血脑屏障的能力。在第二次迭代中，可测试文库的一种或多种药理学性质，包括血清半衰期。
此外，通过例如迭代建模和结构分析，可鉴别某些规则，以允许对用于先导化合物鉴别的药物的更佳选择。在肽文库情况下，例如肽可具有导致肽具有某些类药物性质的多种共同特征。可鉴别某些规则来帮助限定哪些肽可更可能具有类药物性质。举例来说，规则可包括酸性/碱性氨基酸比率、疏水性/亲水性比率或绝对百分比、相邻氨基酸取代和/或肽中结构环的长度。
在一些方面，药物候选物是小化学分子。在小化学分子文库情况下，例如小化学品可具有导致小化学分子具有某些类药物性质的多种共同特征。可鉴别某些规则来帮助限定小化学分子中哪些可更可能具有类药物性质。在各个方面，规则可包括关于吸收、分布、代谢以及排泄的参数，其指示作为潜在药物的功效。举例来说，规则可包括氢键合、亲脂性、分子量、pKa、极性表面积、形状、反应性、溶解性、穿透性、化学稳定性、代谢(阶段I和II)、蛋白质和组织结合、运输(例如摄取、流出)、清除率、半衰期、生物利用率、药物-药物相互作用、LD50等。
在一些实施方案中，规则可包括使得文库成员的第一残基是甘氨酸以促进融合蛋白的裂解。规则还可以包括脯氨酸和半胱氨酸残基未突变或避免了α螺旋中的甘氨酸突变。规则可包括避免将全部氨基酸残基变为高度疏水性氨基酸的突变方案。疏水性酸的实例包括苯基丙氨酸、色氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸以及甲硫氨酸。在其它情况下，规则可指示偏向于常见蛋白质-蛋白质热点残基的突变。此类残基可包括酪氨酸、色氨酸、苯基丙氨酸、异亮氨酸、组氨酸、天冬氨酸以及精氨酸部分。在一些实施方案中，规则还可以有利于结构上相邻的残基的突变。举例来说，规则可要求α螺旋中的突变偏向于具有高α螺旋形成倾向以避免突变的氨基酸。此类氨基酸的实例包括甲硫氨酸、丙氨酸、亮氨酸、谷氨酸、赖氨酸、丙氨酸以及异亮氨酸)。规则还可以避免α螺旋中的甘氨酸和脯氨酸的突变。规则可包括在结构上相邻的残基处的突变。规则还可以包括维持半胱氨酸残基不突变和/或移动以保留可能存在于肽中的任何半胱氨酸结。
在一些实施方案中，规则还可以包括鉴别每个肽构建体的突变数目。在一些方面，规则可包括在每个肽构建体4-8个氨基酸突变范围内的许多突变。在一些方面，规则可包括每个肽构建体约4个氨基酸突变、约5个氨基酸突变、约6个氨基酸突变、约7个氨基酸突变或约8个氨基酸突变。在一些方面，规则可包括没有赖氨酸存在于肽序列中以促进在N端处肽文库的缀合。规则还可以被设计成促使肽文库更容易鉴别和分析。举例来说，规则可包括使每种肽可通过独特质量标签或独特片段质量标签按次序鉴别的或帮助通过MS鉴别。
如本文所用，术语“片段”是指通过衍生片段的肽或蛋白质的裂解产生的肽或蛋白质的一部分。
如本文所用，术语“质量标签”是指通过质谱仪通过进行至少一种蛋白质或至少一种肽的片段的分析输出的峰的模式。对于各片段来说质量标签可以是独特的，或者对于一些片段来说质量标签可以是相同的。
除产生所选文库之外，本发明提供针对发现基于打结素(或打结肽)的药物的其它进步。举例来说，本发明可提供具有更长血清半衰期的打结肽(例如通过缀合)、具有更佳溶解性的打结肽、用于产生在数十至数百至数千以及更多种肽范围内的变体文库多样性的时间和成本有效的方式、用于产生适当折叠的打结肽的方法以及用于产生高产率的打结肽(例如毫克量)的方法。
在一些方面，产生文库的方法提供对潜在药物候选物的更有效并且集中的选择，所述潜在药物候选物可具有更高的被证实为用于进一步药物开发的先导化合物的几率。举例来说，常规药物发现最初典型地集中于靶标并开发在体外具有功效的药物先导物。不幸的是，体外鉴别的药物先导物可具有例如药理学性质或在体内施用时给药的问题。举例来说，常规方法鉴别特定药物候选物的生物功能，并且然后将血脑屏障穿透率、血清半衰期等问题留到后面解决。在大多数情况下，固定活性分子的任何尝试均破坏活性。本发明的方法在某种意义上调转药物发现的方向，例如通过筛选针对生物相关性质选择的体内“预选”文库、引导所需类药物和药理学性质的修饰/演变以及实现数千种变体的有效并且快速的合成，所述变体可被进一步测试和筛选以更有效并且选择性地鉴别目标先导化合物。限制额外的筛选例如已经具有最终分子所需要的类药物品质的分子可帮助避免选择在常规方法中直到后期才可能被鉴别的缺乏必需的药理学性质的药物候选物。
产生本发明的文库的方法可用于任何类型的潜在药物候选物。潜在药物候选物的实例可包括例如在受试者中局部或全身起作用的任何生物、生理或药理学活性物质。举例来说，可筛选(例如体外或体内)小化学分子、肽和/或更大生物制品(例如抗体)的文库。举例来说，可选择现有小分子药物的文库并且向受试者施用以鉴别具有目标药理学性质的小分子药物的子文库。类似地，可选择现有生物制品(例如抗体)的文库并且向受试者施用以鉴别具有某些药理学性质的小分子药物的子文库。如本文将进一步描述，本发明进一步包括筛选与小化学分子和/或大生物制品(例如抗体)相比可提供独特性质的肽。在一个实例中，目标特定靶标可针对已经预先选择为具有与靶标的那些性质相符的类药物性质的文库(例如肽文库)进行筛选。举例来说，如果靶标在中枢神经系统(CNS)中，那么可针对CNS靶标筛选穿过血脑屏障的药物候选物的文库。或者，针对骨关节炎的药物筛选可使用被设计成靶向软骨的文库。一旦鉴别了先导物，那么可合成变体(例如数千种变体)并且以相同方式筛选以减少潜在先导化合物的数目。
在一些实施方案中，本发明的方法可用于产生潜在药物候选物的小分子文库。举例来说，药物候选物可包括已知药物，诸如描述于诸如默克索引(Merck Index)、医生桌上参考手册(the Physicians Desk Reference)以及治疗剂的药理学基础(The Pharmacological Basis of Therapeutics)等熟知的参考文献中的药物，并且它们包括但不限于药剂；维生素；矿物补充物；用于治疗、预防、诊断、治愈或缓和疾病或病害的物质；影响身体的结构或功能的物质；或前药，所述前药在其已放置于生理环境中之后变得具生物活性或更有活性。候选物还可以包括例如小分子、抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂、烯二炔、重金属络合物、激素拮抗剂、非特异性(非抗体)蛋白质、糖寡聚物、适体、寡核苷酸(例如结合于靶核酸序列(例如mRNA序列)的反义寡核苷酸)、siRNA、shRNA、肽、蛋白质、放射性核素以及基于转录的药物。在一些实施方案中，潜在药物候选物可包括核酸、肽、小分子化合物(例如药物化合物)以及肽模拟物。
在某些方面，药物候选物可由合成或天然化合物(例如药物小分子化合物和/或肽)的大文库提供。一个实例是FDA批准的可由人使用的化合物的文库。此外，合成化合物文库可自包括以下的许多公司商购获得：MaybridgeChemical Co.(Trevillet，Cornwall，UK)、Comgenex(Princeton，N.J.)、BrandonAssociates(Merrimack，N.H.)以及Microsource(New Milford，Conn.)，而稀有化学品文库可购自Aldrich(Milwaukee，Wis.)。组合文库是可获得的并且可制备。或者，呈细菌、真菌、植物以及动物提取物形式的天然化合物的文库也是可获得的，例如Pan Laboratories或MycoSearch，或者可通过本领域中熟知的方法容易地制备。分离自包括树叶、树皮以及海洋样品的诸如动物、细菌、真菌、植物来源等天然来源的化合物可作为候选物进行关于潜在有用药剂的存在的测定。若干商业文库可立即用于筛选。此类文库可包括天然存在的或合成的小分子的类似物。天然存在的小分子的非限制性实例包括生物碱、糖苷、脂质、吩嗪、苯酚、聚酮、萜烯、四吡咯或非核糖体肽。
待作为潜在药物候选物进行筛选的小分子的分子量可在200-1000Da范围内。在一些实施方案中，潜在药物候选物的分子量可在以下范围内：约200-900Da、约200-800Da、约200-700Da、约200-600Da、约200-500Da、约200-400Da、约200-300Da、约300-1000Da、约300-900Da、约300-800Da、约300-700Da、约300-600Da、约300-500Da、约300-400Da、约400-1000Da、约400-900Da、约400-800Da、约400-700Da、约400-600Da、约400-500Da、约500-1000Da、约500-900Da、约500-800Da、约500-700Da、约500-600Da、约600-1000Da、约600-900Da、约600-800Da、约600-700Da、约700-1000Da、约700-900Da、约700-800Da、约800-1000Da、约800-900Da、约900-1000Da、约1000-1500Da、约1500-2000Da、约2000-2500Da、约2500-3000Da、约3000-3500Da、约3500-4000Da、约4000-4500Da或约4500-5000Da。
在一些方面，本发明包括用于产生打结肽(也称为″打结素″)的大文库的方法和系统。这些种类的肽往往存在于有毒动物的毒液中并且历经数百万年已进化成具有显著血清稳定性并且结合特定靶标。在一个示例性实施方案中，本发明涉及打结肽，其可包括15-40或在一些实施方案中11-57个氨基酸、类毒素、二硫连接肽作为潜在药物骨架。可产生这些打结肽的文库并且然后通过从那些具有适当的诸如药代动力学、分布、口服利用率、特定组织分布或靶向能力(例如肿瘤)等“类药物性质”的肽候选物的文库进行体内选择来进一步分类。所产生的肽文库和/或单个药物肽的一些所选性质可包括1)GI稳定性/口服生物利用率，2)可控制/可程序化药代动力学，3)破坏蛋白质/蛋白质相互作用的能力，4)穿过血脑屏障的能力，5)穿透细胞的能力、穿透特定细胞器和/或细胞区室的能力，6)可选组织/器官靶向的潜力，7)特异性缀合于显像剂或药物的能力，8)“可程序化多样性”(例如DNA编码可固定、可变或选择性可变的特定位置，9)容易工程化(因为肽可通过DNA编码序列“程序化”)，以及10)可程序化细胞内靶向(例如核易位序列的并入)的潜力。
本发明进一步包括例如可用作产生肽文库的起点的肽骨架。在一些实施方案中，这些骨架可衍生自多种打结肽(或打结素)。如本文所提到，“打结肽”或“打结素”包括例如以二硫化物-二硫化物结(disulfide throughdisulfide knot)为特征的小的富含二硫化物的蛋白质。这种结可以是例如在一个二硫桥穿过由另外两个二硫化物和互连主链形成的大环时获得。在一些方面，打结肽可包括例如生长因子胱氨酸结或抑制剂胱氨酸结。其它可能的肽结构包括具有通过两个二硫桥键连接而没有β-折叠的两个平行螺旋的肽(例如禾富毒素(hefutoxin))。一些适用于骨架的肽可包括但不限于氯毒素、布拉齐因(brazzein)、环杆菌素(circulin)、斯戴克里斯普(stecrisp)、哈那毒素(hanatoxin)、中期因子(midkine)、禾富毒素、马铃薯羧肽酶抑制剂、起泡蛋白、吸引素(attractin)、α-GI、α-GID、μ-PIIIA、ω-MVIIA、ω-CVID、χ-MrIA、ρ-TIA、芋螺睡眠肽(conantokin)G、芋螺迟缓肽(contulakin)G、GsMTx4、玛格毒素(margatoxin)、shK、毒素K、糜蛋白酶抑制剂(CTI)以及EGF表皮调节素核心。如图1中所示，这些骨架中的若干，例如表皮调节素、禾富毒素、起泡蛋白、氯毒素以及CTI可使用本发明的方法产生并且在凝胶上鉴别。
基于特定骨架，可产生骨架变体的更大文库(例如多样性为数十、数百、数千、成千上万、成百上千或更多不同骨架变体)。例如，可使用随机或预先限定的诱变来设计骨架变体的文库。在一些情况下，所述方法可包括鉴别肽骨架中的保守氨基酸残基以及参与形成三级结构的残基，然后在存在受控制的可变性的情况下通过用设计成保留必需氨基酸而改变其它位置的核苷酸编码肽来生物合成肽。举例来说，可在骨架的整个环区域中对氨基酸进行系统性扫描，从而对三个残基斑块施加诱变并且通过串联的质谱判断结果。一旦突变耐受区域确定，那么可使用这一信息通过更大数目的残基的突变来制备更大的文库。
在一些实施方案中，本文所描述的方法可使用多于10个肽变体、20个肽变体、30个肽变体、40个肽变体、50个肽变体、60个肽变体、70个肽变体、80个肽变体、90个肽变体、100个肽变体、110个肽变体、120个肽变体、130个肽变体、140个肽变体、150个肽变体、160个肽变体、170个肽变体、180个肽变体、190个肽变体、200个肽变体、210个肽变体、220个肽变体、230个肽变体、240个肽变体、250个肽变体、260个肽变体、270个肽变体、280个肽变体、290个肽变体、300个肽变体、350个肽变体、400个肽变体、450个肽变体、500个肽变体、550个肽变体、600个肽变体、650个肽变体、700个肽变体、750个肽变体、800个肽变体、850个肽变体、900个肽变体、950个肽变体、1000个肽变体、1100个肽变体、1200个肽变体、1300个肽变体、1400个肽变体、1500个肽变体、1600个肽变体、1700个肽变体、1800个肽变体、1900个肽变体、2000个肽变体、2500个肽变体、3000个肽变体、3500个肽变体、4000个肽变体、4500个肽变体、5000个肽变体、6000个肽变体、7000个肽变体、8000个肽变体、9000个肽变体、10,000个肽变体、11,000个肽变体、12,000个肽变体、13,000个肽变体、14,000个肽变体、15,000个肽变体、16,000个肽变体、17,000个肽变体、18,000个肽变体、19,000个肽变体、20,000个肽变体、21,000个肽变体、22,000个肽变体、23,000个肽变体、24,000个肽变体、25,000个肽变体、26,000个肽变体、27,000个肽变体、28,000个肽变体、29,000个肽变体、30,000个肽变体、34,000个肽变体、35,000个肽变体、36,000个肽变体、37,000个肽变体、38,000个肽变体、39,000个肽变体、40,000个肽变体、41,000个肽变体、42,000个肽变体、43,000个肽变体、44,000个肽变体、45,000个肽变体、46,000个肽变体、47,000个肽变体、48,000个肽变体、49,000个肽变体、50,000个肽变体、5,5000个肽变体、60,000个肽变体、65,000个肽变体、70,000个肽变体、75,000个肽变体、80,000个肽变体、85,000个肽变体、90,000个肽变体、95,000个肽变体、100,000个肽变体、110,000个肽变体、120,000个肽变体、130,000个肽变体、140,000个肽变体、150,000个肽变体、160,000个肽变体、170,000个肽变体、180,000个肽变体、190,000个肽变体、200,000个肽变体、210,000个肽变体、220,000个肽变体、230,000个肽变体、240,000个肽变体、250,000个肽变体、260,000个肽变体、270,000个肽变体、280,000个肽变体、290,000个肽变体或300,000个肽变体。在一些实施方案中，可根据本发明的方法产生和/或使用多于约300,000个肽变体。
在一些实施方案中，可产生和/或使用约100-15,000个肽变体、100-14,000个肽变体、100-13,000个肽变体、100-12,000个肽变体、100-11,000个肽变体、100-10,000个肽变体、100-9000个肽变体、100-8000个肽变体、100-7000个肽变体、100-6000个肽变体、100-5000个肽变体、100-4000个肽变体、100-3000个肽变体、100-2000个肽变体、100-1000个肽变体、100-900个肽变体、100-800个肽变体、100-700个肽变体、100-600个肽变体、100-500个肽变体、100-400个肽变体、100-300个肽变体、100-200个肽变体。
在一些实施方案中，可使用少于100个肽变体。在一些实施方案中，在本发明的方法中可使用约10-100个肽变体、约10-90个肽变体、约10-80个肽变体、约10-70个肽变体、约10-60个肽变体、约10-50个肽变体、约10-50个肽变体、约10-40个肽变体、约10-30个肽变体、约10-20个肽变体、约20-100个肽变体、约20-90个肽变体、约20-80个肽变体、约20-70个肽变体、约20-60个肽变体、约20-50个肽变体、约20-40个肽变体、约20-30个肽变体、约30-100个肽变体、约30-90个肽变体、约30-80个肽变体、约30-70个肽变体、约30-60个肽变体、约30-50个肽变体、约30-40个肽变体、约40-100个肽变体、约40-90个肽变体、约40-80个肽变体、约40-70个肽变体、约40-60个肽变体、约40-50个肽变体、约50-100个肽变体、约50-90个肽变体、约50-80个肽变体、约50-70个肽变体、约50-60个肽变体、约60-100个肽变体、约60-90个肽变体、约60-80个肽变体、约60-70个肽变体、约70-100个肽变体、约70-90个肽变体、约70-80个肽变体、约80-100个肽变体、约80-90个肽变体或约90-100个肽变体。在一些实施方案中，在本发明的方法中可使用少于约90个肽变体、约80个肽变体、约70个肽变体、约60个肽变体、约50个肽变体、约40个肽变体、约30个肽变体、约20个肽变体或约10个肽变体。
在一些实施方案中，本发明的方法中所用的肽可包括约2-100个氨基酸。在一些实施方案中，本发明的肽可包括约10-100个氨基酸、约10-90个氨基酸、约10-80个氨基酸、约10-70个氨基酸、约10-60个氨基酸、约10-50个氨基酸、约10-40个氨基酸、约10-30个氨基酸、约10-20个氨基酸、约20-30个氨基酸、约20-40个氨基酸、约20-50个氨基酸、约20-60个氨基酸、约20-70个氨基酸、约20-80个氨基酸、约20-90个氨基酸、约20-100个氨基酸、约30-40个氨基酸、约30-50个氨基酸、约30-60个氨基酸、约30-70个氨基酸、约30-80个氨基酸、约30-90个氨基酸、约30-100个氨基酸、约40-50个氨基酸、约40-60个氨基酸、约40-70个氨基酸、约40-80个氨基酸、约40-90个氨基酸、约40-100个氨基酸、约50-60个氨基酸、约50-70个氨基酸、约50-80个氨基酸、约50-90个氨基酸、约50-100个氨基酸、约50-100个氨基酸或约60-70个氨基酸、约60-80个氨基酸、约60-90个氨基酸、约60-100个氨基酸、约70-80个氨基酸、约70-90个氨基酸、约70-100个氨基酸、约80-90个氨基酸、约80-100个氨基酸或约90-100个氨基酸。在一些实施方案中，本发明的肽可包括约10个氨基酸、约11个氨基酸、约12个氨基酸、约13个氨基酸、约14个氨基酸、约15个氨基酸、约16个氨基酸、约17个氨基酸、约18个氨基酸、约19个氨基酸、约20个氨基酸、约21个氨基酸、约22个氨基酸、约23个氨基酸、约24个氨基酸、约25个氨基酸、约26个氨基酸、约27个氨基酸、约28个氨基酸、约29个氨基酸、约30个氨基酸、约31个氨基酸、约32个氨基酸、约33个氨基酸、约34个氨基酸、约35个氨基酸、约36个氨基酸、约37个氨基酸、约38个氨基酸、约39个氨基酸、约40个氨基酸、约41个氨基酸、约42个氨基酸、约43个氨基酸、约44个氨基酸、约45个氨基酸、约46个氨基酸、约47个氨基酸、约48个氨基酸、约49个氨基酸或约50个氨基酸。
在一些实施方案中，本发明的方法用于产生打结肽的文库。在某些实施方案中，本发明的打结肽可包括约10-60个氨基酸(例如11-57个氨基酸)。在一些实施方案中，本发明的打结肽可包括约10-45个氨基酸、约10-40个氨基酸、约10-35个氨基酸、约10-30个氨基酸、约10-35个氨基酸、约10-20个氨基酸、约10-25个氨基酸、约15-50个氨基酸、约15-45个氨基酸、约15-40个氨基酸、约15-35个氨基酸、约15-30个氨基酸、约15-25个氨基酸、约15-20个氨基酸、约20-50个氨基酸、约20-45个氨基酸、约20-40个氨基酸、约20-35个氨基酸、约20-30个氨基酸、约20-25个氨基酸、约25-50个氨基酸、约25-45个氨基酸、约25-40个氨基酸、约25-35个氨基酸、约25-30个氨基酸、约30-50个氨基酸、约30-45个氨基酸、约30-40个氨基酸、约30-35个氨基酸、约35-50个氨基酸、约35-45个氨基酸、约35-40个氨基酸、约40-50个氨基酸、约40-45个氨基酸、约45-50个氨基酸或约50-60个氨基酸。在一些实施方案中，本发明的打结肽由约10个氨基酸、约11个氨基酸、约12个氨基酸、约13个氨基酸、约14个氨基酸、约15个氨基酸、约16个氨基酸、约17个氨基酸、约18个氨基酸、约19个氨基酸、约20个氨基酸、约21个氨基酸、约22个氨基酸、约23个氨基酸、约24个氨基酸、约25个氨基酸、约26个氨基酸、约27个氨基酸、约28个氨基酸、约29个氨基酸、约30个氨基酸、约31个氨基酸、约32个氨基酸、约33个氨基酸、约34个氨基酸、约35个氨基酸、约36个氨基酸、约37个氨基酸、约38个氨基酸、约39个氨基酸、约40个氨基酸、约41个氨基酸、约42个氨基酸、约43个氨基酸、约44个氨基酸、约45个氨基酸、约46个氨基酸、约47个氨基酸、约48个氨基酸、约49个氨基酸、约50个氨基酸、约51个氨基酸、约52个氨基酸、约53个氨基酸、约54个氨基酸、约55个氨基酸、约56个氨基酸或约57个氨基酸组成。
在一些实施方案中，本发明的肽可包括二硫键。本文所提供的肽可包括1-10个二硫键。在一些实施方案中，本文所提供的肽可具有1-9个二硫键、1-8个二硫键、1-7个二硫键、1-6个二硫键、1-5个二硫键、1-4个二硫键、1-3个二硫键、1-2个二硫键、2-3个二硫键、2-4个二硫键、2-5个二硫键、2-6个二硫键、2-7个二硫键、2-8个二硫键、2-9个二硫键、2-10个二硫键、3-4个二硫键、3-5个二硫键、3-6个二硫键、3-7个二硫键、3-8个二硫键、3-9个二硫键、3-10个二硫键、4-5个二硫键、4-6个二硫键、4-7个二硫键、4-8个二硫键、4-9个二硫键、5-6个二硫键、5-7个二硫键、5-8个二硫键、5-9个二硫键、5-10个二硫键、6-7个二硫键、6-8个二硫键、6-9个二硫键、6-10个二硫键、7-8个二硫键、7-9个二硫键、7-10个二硫键、8-9个二硫键、8-10个二硫键或9-10个二硫键。在本发明的一些实施方案中，打结肽具有1个二硫键、2个二硫键、3个二硫键、4个二硫键、5、6个二硫键、7个二硫键、8个二硫键、9个二硫键或10个二硫键。
在一些实施方案中，肽(例如打结肽)的分子量可在约0.5kDa至约20kDa范围内。在一些实施方案中，本文所描述的肽(例如打结肽)的分子量可在以下范围内：约0.5-15kDa、约0.5-10kDa、约0.5-5kDa、约1-20kDa、约1-15kDa、约1-10kDa、约1-5Ka、约5-20kDa、约5-15kDa、约5-10kDa、约10-20kDa、约10-15kDa或约15-20kDa。在一些实施方案中，本文所描述的肽(例如打结肽)的分子量可在以下范围内：约0.5-10kDa、约0.5-9kDa、约0.5-8、约0.5-7kDa、约0.5-6kDa、约0.5-5kDa、约0.5-4kDa、约0.5-3kDa、约0.5-2kDa、约0.5-1kDa、约1-2kDa、约1-3kDa、约1-4kDa、约1-5kDa、约1-6kDa、约1-7kDa、约1-8kDa、约1-9kDa、约1-10kDa、约2-3kDa、约2-4kDa、约2-5kDa、约2-6kDa、约2-7kDa、约2-8kDa、约2-9kDa、约2-10kDa、约3-4kDa、约3-5kDa、约3-6kDa、约3-7kDa、约3-8kDa、约3-9kDa、约3-10kDa、约4-5kDa、约4-6kDa、约4-7kDa、约4-8kDa、约4-9kDa、约4-10kDa、约5-6kDa、约5-7kDa、约5-8kDa、约5-9kDa、约5-10kDa、约6-7kDa、约6-8kDa、约6-9kDa、约6-10kDa、约7-10kDa、约7-8kDa、约7-9kDa、约7-10kDa、约8-9kDa、约8-10kDa或约9-10kDa。
肽(例如打结肽)变体可以是随机的(经由诸如简并密码子或易错PCR技术)或完全限定的。基于芯片的寡核苷酸合成的发展已使得DNA文库的产生是便宜并且常规的，从而使得由DNA形成的肽文库的组合物是完全限定的。通过将肽设计成各自具有独特质量或胰蛋白酶片段，可使用质谱法来同时筛选肽中的每一种的存在情况。
在一些方面，本公开提供用于使受试者中的肿瘤显像的肽，所述肽包含含有具有至少三个D-氨基酸的氨基酸序列的氯毒素，并且所述肽具有被配置成结合于肿瘤的二级结构，其中肽进一步包含可检测标记。
在本公开的其它方面，肽中的氨基酸中的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％是D-氨基酸。
在一些方面，本发明的肽的氨基酸序列可与以下序列至少80％、83％、86％、89％、90％或92％相同：MCMPCFTTDHQMARXCDDCCGGXGRGXCYGPQCLCR，其中X选自K、A以及R。
在一些方面，本发明的肽，肽包含与以下序列至少80％相同的氨基酸序列：MCMPCFTTDHQMARXCDDCCGGXGRGXCYGPQCLCR，其中氨基酸序列中的氨基酸中的至少三个是D-氨基酸，其中X选自K、A以及R。
在另外方面，本公开的肽的肽中氨基酸中的至少50％、至少60％或至少70％是D-氨基酸。
在一些方面，本公开的肽进一步包含可检测标记。
在本公开的一些方面，给定肽中的全部氨基酸均是D-氨基酸。
在本公开的一些方面，可检测标记缀合至肽的N端或缀合至肽中的赖氨酸残基。
在本公开的其它方面，可检测标记包括近红外染料。
在本公开的其它方面，可检测标记包括花青染料。
在本公开的各个方面，可产生包含本文所描述的肽中的任一种或其组合的组合物。
在本公开的一些方面，提供用于检测受试者中的肽的方法，所述方法包括：向受试者施用有效量的本公开的肽或其组合物，并且检测其中所含的可检测标记。
在另外方面，本公开进一步包括通过检测可检测标记获得受试者中的一个区域的图像。在另外方面，检测包括癌组织的术中可视化。在另外方面，可检测标记的可视化指导受试者中的肿瘤的手术移除。
在本公开的一些方面，提供用于治疗与表达氯毒素靶标的细胞相关的疾病的方法，所述方法包括：向有需要的受试者施用治疗有效量的包含根据本公开的肽的药物组合物或包含本公开的肽的组合物，从而治疗疾病。
在另外方面，肽组合物进一步包含细胞毒性剂、毒素、反义核苷酸、癌症药物、核苷酸药物、代谢调节剂、放射致敏剂、肽治疗剂、肽-药物缀合物或其组合。在另外方面，疾病包括与以下相关的癌组织：神经胶质瘤、皮肤癌、肺癌、淋巴瘤、成神经管细胞瘤、前列腺癌、胰腺癌、乳房癌、乳腺癌、结肠癌、肉瘤、口腔鳞状细胞癌、血管外皮瘤或其组合。
在一些方面，肽变体可使用广泛范围的技术产生。在某些实施方案中，可在存在受控制的可变性的情况下通过例如用被设计成使必需氨基酸保守而改变其它位置的核苷酸编码肽来制备肽文库。在变体中保留的氨基酸可通过例如丙氨酸扫描技术来鉴别，其中丙氨酸可系统地取代至各氨基酸位置中。这种策略鉴别产生活性肽的天然序列中的氨基酸。必需氨基酸的取代可使得肽活性降低，并且活性的降低程度可例如用作正在取代的氨基酸的重要性的相对度量。
在所鉴别的保留的氨基酸的情况下，可围绕那些保留的氨基酸残基产生肽的大文库。举例来说，肽文库可通过围绕保留的氨基酸的侧翼残基的系统截断来产生。文库可以是通过用所有其它天然氨基酸以鸟枪法随机并且同时取代原始肽上的所选位置而产生的随机文库。在一些实施方案中，所产生的文库可以是定位肽文库，其中肽序列中的所选的一个或多个位置各自系统地用不同氨基酸代替。此方法可显示特定位置处的氨基酸取代的作用。肽文库还可以通过在原始肽的序列上进行排列而构建成乱序文库。此类文库具有提供所有可能的替代方案并且提供肽文库的最高可变度的潜能。
可使用多种筛选技术来鉴别药物候选物的各种文库。举例来说，体外和/或体内测定可单独或以组合形式使用，以鉴别具有本文所描述的各种药理学性质的药物候选物。在一个示例性实施方案中，可分析文库的口服生物利用率。举例来说，可向受试者(例如动物、大鼠、小鼠、人或猪)饲喂数百或数千肽的肽文库(例如小于约1g/mL或100mg/mL)。可在肽文库已在胃中加工并且可能传送至血液中之后的时间点分析受试者的例如血液。在此实例中，文库中存在于血液中的肽可被鉴别(例如通过质谱法)为能够化学上承受胃的酸性环境并且能够穿入受试者的血流中。在此类分析之后，然后可使用更大文库的子文库来鉴别具有口服生物利用率的药物。
可针对具有另一种药理学性质的药物的更大文库和/或子文库鉴别其它药理学性质。举例来说，还可以分析血清半衰期以确定具有所需血清半衰期的药物候选物(例如打结肽)的子文库。在一些实施方案中，药物候选物(例如肽)的子文库可具有在约15分钟至约72小时范围内的血清半衰期。同样，可鉴别更短和更长半衰期。在一个示例性实施方案中，可将药物候选物(例如打结肽)的文库注射(例如小于约1g/mL或100mg/mL)至受试者的血流中，并且然后在确定的时间点(例如每15分钟、每小时、每4小时或其它进度)之后，可自受试者取得样品(例如血液、尿液、粘液、脊髓液或组织)并且进行分析(例如使用质谱法)以测定在注射之后仍存在的药物候选物。来自受试者的组织样品可包括活检和/或尸检组织。组织样品还可以包括来自脑、肺、肾脏、肌肉、肝脏、心脏、胃、胰腺或任何其它器官的组织。视时间点而定，可测定血清半衰期并且可鉴别具有特定血清半衰期的药物候选物(例如打结肽)的子文库。
在一些实施方案中，对具有某些药理学性质的药物候选物的鉴别可依次或平行进行。举例来说，一个子文库可被鉴别为具有特定血清半衰期。然后可如上所述筛选所述子文库的口服生物利用率。或者，可由受试者摄取文库并且然后进行分析以确定子文库是否是口服生物可用的以及子文库中的药物候选物是否具有所需血清半衰期。
筛选过程也不限于关于药物候选物的子文库可鉴别的类药物性质的类型。其它示例性筛选可用于鉴别例如可穿过血脑屏障、穿透某些细胞类型和/或穿透亚细胞器或细胞区室的药物候选物(例如打结肽)的子文库。举例来说，可向受试者施用文库并且然后可分析(例如通过质谱法)脑组织以确定药物候选物(例如打结肽)的子文库能够穿过血脑屏障。在一些实施方案中，可产生具有展现其它特征的候选物的子文库。举例来说，如果药物候选物(例如肽)不利地靶向关键器官，从而产生一定不利因素，那么可将它们从文库中排除。或者，可视药物候选物是否结合血清白蛋白和/或IgG和/或FcRn(例如通过pH敏感性结合)而选择或取消选择药物候选物。
在一些实施方案中，举例来说，打结素肽药物候选物的文库可在特定动物模型中表达以筛选所要效应或治疗性地治疗动物。举例来说，所述表达可使用病毒转导系统(例如慢病毒、腺病毒或腺相关病毒)实现，以将肽的文库递送至特定器官，或身体中将掺入病毒材料并且表达打结素肽的区域。在一些方面，这些方法可用于确定实验动物系统中的治疗有用肽。举例来说，打结素的文库可在被基因工程化成发展神经退行性疾病(例如亨廷顿氏病(Huntington’s disease))或肌肉疾病(例如肌肉减少症)的小鼠的脑细胞中表达。可与变性区域相比鉴别神经元保持健康的区域，并且然后可鉴别(例如经由从健康区域提取的组织的质谱分析)此区域中局部分泌的肽。
如上文所提到的，本发明包括用于确定具有某些药理学性质的药物候选物的子文库的多种方法。在本发明的一些方面，然后可筛选具有所选药理学性质并且使用体外和/或体内筛选鉴别的药物候选物的子文库，以鉴别一种或多种先导药物候选物，其然后可被修饰以潜在地改进某些特征，以最终设计结合于目标靶标(例如治疗靶标)的有用药物。
在一个示例性实施方案中，可使用寡核苷酸组装法(本文进一步所描述)产生肽文库，其中特定表面残基位置将使用简并密码子靶向以产生随机诱变(图2)。在一方面，所述方法可包括通过使十个独特的或重叠的三氨基酸子域突变来分析整个骨架。一旦我们已确定了哪些位点将耐受突变，那么将建成更大的随机化文库。然后这些文库可单个地或以汇集形式进行筛选。组装反应可用例如含有XhoI/BamHI位点的引物扩增，并且纯化PCR产物可克隆至载体(例如代达罗斯载体(Daedalus vector)pCVL-sUCOE-SFFV-IRES-GFP)中。所得慢病毒文库可用于转导细胞(例如HEK 293 Freestyle细胞)以产生分泌变体的细胞的多克隆群。所分泌的构建体可被工程化为具有N端分泌信号和C端标签(例如STREPII标签(SAWSHPQFEK))。可使用例如尺寸排阻或亲和色谱法从培养物上清液收获所分泌的肽。使用这种方法可产生具有有限多样性或广泛多样性的若干文库。纯化的肽汇集物可使用串联质谱法分析以计量所分泌的蛋白质文库的多样性并且确定下游筛选应用的检测限。
在一些实施方案中，产生文库的方法可以是迭代和平行的。如图3中所示，举例来说，可平行进行单个实验以测试数千种肽的细胞穿透率、口服生物利用率、血清半衰期、血脑屏障穿透率以及组织归巢(tissue homing)。具有有利的性质的那些肽可形成制备具有相同和略微改变的序列的肽的后续文库的基础。此集合的尺寸可以是数千并且可平行测试所有这些有利的(“类药物”)品质。并且此群组中的最佳者将形成所述集合的基础。此方法可用于产生针对其它类药物肽的产生具有预示价值的一般原理。
肽缀合物
在一些方面，本发明包括肽缀合物的文库。举例来说，肽的文库中的一些或全部可缀合至所选部分以改变肽的性质。
在某些方面，本发明包括在N端缀合于疏水性(例如亲脂性)部分的打结素或打结肽的文库。打结素中的全部或一些可缺乏内部赖氨酸，例如以避免在内部赖氨酸位置处的缀合，从而允许缀合至肽的氨基端。在一些实施方案中，疏水部分附接至N端可用于延长打结肽的半衰期。在一些实施方案中，简单碳链(例如通过豆蔻酰化和/或棕榈酰化)可缀合至肽。亲脂性部分可通过可逆结合于血清白蛋白来延长半衰期。在某些实施方案中，还可以进行近红外染料与肽的N端的附接以使得能够示踪缀合肽。在某些实施方案中，还可以进行近红外染料与肽的赖氨酸的附接以允许示踪缀合肽。染料的抗体可进一步使得染料实现示踪标记与检索柄(retrieval handle)的双重作用。缀合肽还可以缀合至其它部分，其可起到其它作用，诸如提供用于从组织或流体中检索肽的亲和力柄(例如生物素)。
可使用其它修饰。举例来说，打结肽可包括翻译后修饰(例如甲基化和/或酰胺化)，或者打结肽还可以由一些或全部D-氨基酸组成，这可影响例如血清半衰期。在一些实施方案中，文库中的肽可缀合至例如可修饰肽或实现对肽的性质的改变的其它部分。缀合部分可例如是通过可逆结合于血清白蛋白来延长肽的半衰期的亲脂性部分。在一些实施方案中，亲脂性部分可以是胆甾醇或胆甾醇衍生物，包括胆甾烯、胆甾烷、胆甾二烯以及氧化甾醇。在一些实施方案中，肽可缀合至肉豆蔻酸(十四酸)或其衍生物。
在一些实施方案中，肽可缀合至可检测标记以实现示踪检测或显现缀合肽的生物分布。可检测标记可以是荧光标记(例如荧光染料)。在某些实施方案中，荧光标记可具有特定应用所需要的发射特征。举例来说，荧光标记可以是荧光染料，其发射波长最大值在500nm至1100nm的范围之间、600nm至1000nm的范围之间、600至800nm的范围之间、650nm至850nm的范围之间、700nm至800nm的范围之间、720至780nm的范围之间或720至750nm的范围之间。举例来说，在某些条件下，花青5.5可具有约695nm的发射最大值，IRdye 800可具有约800nm的发射最大值，并且吲哚菁绿可具有约820nm的发射最大值。本领域一般技术人员将了解可用作可检测标记并且具有以上发射特征的各种染料。
如本文所用，术语“可检测标记”意指一种标签或修饰，其可附接于小化学分子、肽、蛋白质或其片段或部分，使得小化学分子、肽、蛋白质或其片段使用允许检测标签或修饰的装置、设备或方法可识别。
在一些方面，可检测标记是荧光染料。可在本公开中用作缀合分子的荧光染料的非限制性实例包括罗丹明(rhodamine)、对甲氨基酚(rhodol)、荧光素、硫代荧光素、氨基荧光素、羧基荧光素、氯代荧光素、甲基荧光素、磺基荧光素、氨基对甲氨基酚、羧基对甲氨基酚、氯代对甲氨基酚、甲基对甲氨基酚、磺基对甲氨基酚；氨基罗丹明、羧基罗丹明、氯代罗丹明、甲基罗丹明、磺基罗丹明以及硫代罗丹明、花青、吲哚碳花青、氧杂碳花青、硫杂碳花青、部花青、花青染料(例如花青2、花青3、花青3.5、花青5、花青5.5、花青7)、噁二唑衍生物、吡啶基噁唑、硝基苯并噁二唑、苯并噁二唑、芘衍生物、瀑布蓝、噁嗪衍生物、尼罗红(Nile red)、尼罗蓝(Nileblue)、甲酚紫、噁嗪170、吖啶衍生物、原黄素、吖啶橙、吖啶黄、芳基甲川(arylmethine)衍生物、呫吨染料(xanthene dye)、磺化呫吨染料、AlexaFluor(例如Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor700)、金胺、结晶紫、孔雀绿、四吡咯衍生物、卟啉、酞菁以及胆红素。在一些实施方案中，染料可以是近红外染料，包括例如Cy5.5、IRdye 800、DyLight 750或吲哚菁绿(ICG)。在一些实施方案中，近红外染料可包括花青染料(例如花青2、花青3、花青3.5、花青5、花青5.5、花青7)。在某些实施方案中，可检测标记可包括呫吨染料或磺化呫吨染料，诸如AlexaFluor(例如Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor700)。如果可发现染料的抗体，那么缀合染料可用作示踪、检测或显现标记以及用作检索柄。
本发明的文库中的肽还可以缀合至生物素。除了延长半衰期，生物素还可以充当用于从组织或其它位置检索所述肽的亲和力柄。在一个实施方案中，肽可用PEG接头缀合至例如耐生物素化物酶生物素(例如耐NHS-dPEG4-生物素化物酶生物素)。在一些实施方案中，可使用可用作可检测标记与亲和力柄两者的荧光生物素缀合物。可商购获得的荧光生物素缀合物的非限制性实例包括Atto 425-生物素、Atto 488-生物素、Atto 520-生物素、Atto-550生物素、Atto 565-生物素、Atto 590-生物素、Atto 610-生物素、Atto 620-生物素、Atto 655-生物素、Atto 680-生物素、Atto 700-生物素、Atto 725-生物素、Atto 740-生物素、荧光素生物素、生物素-4-荧光素、生物素-(5-荧光素)缀合物以及生物素-B-藻红蛋白、alexa fluor 488生物胞素、alexa flour 546、alexa fluor 549、荧光黄尸胺生物素-X、荧光黄生物胞素、俄勒冈绿(Oregon green)488生物胞素、生物素-罗丹明以及四甲基罗丹明生物胞素。在一些其它实例中，缀合物可包括化学发光化合物、胶态金属、发光化合物、酶、放射性同位素以及顺磁性标记。
本发明的文库中的肽可缀合至典型地可存在于从胃、小肠或结肠吸收至血流中的食物中的维生素或其它分子。实例包括但不限于维生素A、维生素C、维生素B2、维生素B3、维生素B6、维生素B12、维生素D、维生素E、维生素K。这些缀合的目标是改善肽的口服生物利用率或从胃肠系统的吸收。
在一些情况下，可鉴别似乎帮助某些肽穿过诸如胃肠道、血脑屏障、细胞膜、核膜等生物屏障的所选系列的氨基酸，并且出于帮助新的肽穿过相同生物屏障的目的将其通过基因或物理方式移植至其它肽上。在其它情况下，可使用相同方法将序列移植至肽上，这将防止新的肽穿过某些生物屏障。举例来说，可以此方式修饰药物以防止BBB穿透并且因此降低中枢神经系统副作用的可能性。
肽文库的对映异构体
本发明进一步包括肽文库的对映异构体。举例来说，肽可包括所有天然存在的L-氨基酸。在某些实施方案中，肽中的氨基酸中的一些或全部可以是D-氨基酸。
在一些方面，本发明包括具有D-氨基酸并且基于氯毒素骨架的肽，例如D-氨基酸氯毒素和/或D-氨基酸氯毒素变体。基于氯毒素的肽可包括变化量的D-氨基酸。氯毒素的天然肽具有以下氨基酸序列：MCMPCFTTDHQMARKCDDCCGGKGRGKCYGPQCLCR。肽可通过在序列中所存在的半胱氨酸残基间形成的四个二硫键进一步交联。天然肽包括所有L-氨基酸。化学上，除了在诸如体内存在的那些手性环境的手性环境中，全部-D-氨基酸形式的氯毒素可能不可区别于全部-L-氨基酸形式的氯毒素。由于D-氨基酸本质上是相当稀有的，所以包括D-氨基酸的肽可耐蛋白水解。因此，D-氨基酸氯毒素可抵抗裂解，例如在向受试者施用之后的生物流体中。因此，D-氨基酸肽可例如经口施用并且可具有更低免疫原性反应。D-氨基酸还可以帮助防止抗原加工和展示，从而降低抗原性。用于本发明中的D-氨基酸可包括例如dArg、dHis、dLys、dAsp、dGlu、dSer、dThr、dAsn、dGln、dCys、dGly、dPro、dAla、dVal、dIle、dLeu、dMet、dPhe、dTyr以及dTrp。
在一些实施方案中，肽可包括具有与天然氯毒素序列相同的序列的肽，其中序列中的氨基酸中的至少三个包括D-氨基酸而不是天然氨基酸。在一些实施方案中，肽可包括氯毒素变体，例如突变氯毒素肽，其中序列中的氨基酸中的至少三个包括D-氨基酸而不是天然氨基酸。在一些实施方案中，序列中的氨基酸中的至少四个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个或至少35个可包括D-氨基酸而不是天然氨基酸。在某些实施方案中，基于氯毒素骨架的肽中的氨基酸中的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％可以是D-氨基酸。在一方面，本发明包括基于氯毒素骨架的肽，其中肽中的所有氨基酸均是D-氨基酸。
根据例如本发明的制备肽的方法，可产生氯毒素的多种变体。举例来说，使用常规诱变和基于合成的系统，可基于氯毒素的天然存在的氨基酸序列制备数千种氯毒素D-氨基酸变体。在一些实施方案中，本发明的肽可包括与以下序列至少60％、65％、70％、75％、80％、83％、85％、86％、89％、90％、92％或95％相同的氨基酸序列：MCMPCFTTDHQMARKCDDCCGGKGRGKCYGPQCLCR，其中氨基酸中的一些或全部是D-氨基酸。在一些实施方案中，氯毒素变体的序列中的氨基酸中的至少三个可以是D-氨基酸而不是天然氨基酸。在一些实施方案中，氯毒素变体的序列中的氨基酸中的至少四个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个或至少35个可包括D-氨基酸而不是天然氨基酸。在某些实施方案中，氯毒素变体的序列中的氨基酸中的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％可包括D-氨基酸而不是天然氨基酸。
在一个实施方案中，所有D-氨基酸肽均可具有下式：H-dMet-dCys-dMet-dPro-dCys-dPhe-dThr-dThr-dAsp-dHis-dGln-dMet-dAla-dArg-dXaa-dCys-dAsp-dAsp-dCys-dCys-dGly-dGly-dXaa-dGly-dArg-dGly-dXaa-dCys-dTyr-dGly-dPro-dGln-dCys-dLeu-dCys-dArg-OH乙酸盐(二硫键，空气氧化)，其中dXaa是dArg、dAla或dLys。
在另一个实施方案中，所有D-氨基酸肽均可具有下式：H-dMet-dCys-dMet-dPro-dCys-dPhe-dThr-dThr-dAsp-dHis-dGln-dMet-dAla-dArg-dXaa-dCys-dAsp-dAsp-dCys-dCys-dGly-dGly-dXaa-dGly-dArg-dGly-dLys-dCys-dTyr-dGly-dPro-dGln-dCys-dLeu-dCys-dArg-OH乙酸盐(二硫键，空气氧化)，其中dXaa是dArg、dAla或dLys。
在另一个实施方案中，所有D-氨基酸肽均可具有下式：H-dMet-dCys-dMet-dPro-dCys-dPhe-dThr-dThr-dAsp-dHis-dGln-dMet-dAla-dArg-dArg-dCys-dAsp-dAsp-dCys-dCys-dGly-dGly-dArg-dGly-dArg-dGly-dLys-dCys-dTyr-dGly-dPro-dGln-dCys-dLeu-dCys-dArg-OH乙酸盐(二硫键，空气氧化)；分子量：4065.6Da。
在另一个实施方案中，所有D-氨基酸肽均可具有下式：H-dMet-dCys-dMet-dPro-dCys-dPhe-dThr-dThr-dAsp-dHis-dGln-dMet-dAla-dArg-dArg-dCys-dAsp-dAsp-dCys-dCys-dGly-dGly-dAla-dGly-dArg-dGly-dLys-dCys-dTyr-dGly-dPro-dGln-dCys-dLeu-dCys-dArg-OH乙酸盐(二硫键，空气氧化)。
在另一个实施方案中，所有D-氨基酸肽均可具有下式：H-dMet-dCys-dMet-dPro-dCys-dPhe-dThr-dThr-dAsp-dHis-dGln-dMet-dAla-dArg-dAla-dCys-dAsp-dAsp-dCys-dCys-dGly-dGly-dAla-dGly-dArg-dGly-dLys-dCys-dTyr-dGly-dPro-dGln-dCys-dLeu-dCys-dArg-OH乙酸盐(二硫键，空气氧化)。
在另一个实施方案中，所有D-氨基酸肽均可具有下式：H-dMet-dCys-dMet-dPro-dCys-dPhe-dThr-dThr-dAsp-dHis-dGln-dMet-dAla-dArg-dAla-dCys-dAsp-dAsp-dCys-dCys-dGly-dGly-dArg-dGly-dArg-dGly-dLys-dCys-dTyr-dGly-dPro-dGln-dCys-dLeu-dCys-dArg-OH乙酸盐(二硫键，空气氧化)。
在另一个实施方案中，所有D-氨基酸肽均可具有下式：H-dMet-dCys-dMet-dPro-dCys-dPhe-dThr-dThr-dAsp-dHis-dGln-dMet-dAla-dArg-dXaa-dCys-dAsp-dAsp-dCys-dCys-dGly-dGly-dXaa-dGly-dArg-dGly-dLys(6-ICG己酰基)-dCys-dTyr-dGly-dPro-dGln-dCys-dLeu-dCys-dArg-OH乙酸盐(二硫键，空气氧化)，其中dXaa是dArg、dAla或dLys。
在另一个实施方案中，所有D-氨基酸肽均可具有下式：H-dMet-dCys-dMet-dPro-dCys-dPhe-dThr-dThr-dAsp-dHis-dGln-dMet-dAla-dArg-dArg-dCys-dAsp-dAsp-dCys-dCys-dGly-dGly-dArg-dGly-dArg-dGly-dLys(6-ICG己酰基)-dCys-dTyr-dGly-dPro-dGln-dCys-dLeu-dCys-dArg-OH乙酸盐(二硫键，空气氧化)；分子量：4765Da。
在另一个实施方案中，所有D-氨基酸肽均可具有下式：H-dMet-dCys-dMet-dPro-dCys-dPhe-dThr-dThr-dAsp-dHis-dGln-dMet-dAla-dArg-dArg-dCys-dAsp-dAsp-dCys-dCys-dGly-dGly-dAla-dGly-dArg-dGly-dLys(6-ICG己酰基)-dCys-dTyr-dGly-dPro-dGln-dCys-dLeu-dCys-dArg-OH乙酸盐(二硫键，空气氧化)。
在另一个实施方案中，所有D-氨基酸肽均可具有下式：H-dMet-dCys-dMet-dPro-dCys-dPhe-dThr-dThr-dAsp-dHis-dGln-dMet-dAla-dArg-dAla-dCys-dAsp-dAsp-dCys-dCys-dGly-dGly-dAla-dGly-dArg-dGly-dLys(6-ICG己酰基)-dCys-dTyr-dGly-dPro-dGln-dCys-dLeu-dCys-dArg-OH乙酸盐(二硫键，空气氧化)。
在另一个实施方案中，所有D-氨基酸肽均可具有下式：H-dMet-dCys-dMet-dPro-dCys-dPhe-dThr-dThr-dAsp-dHis-dGln-dMet-dAla-dArg-dAla-dCys-dAsp-dAsp-dCys-dCys-dGly-dGly-dArg-dGly-dArg-dGly-dLys(6-ICG己酰基)-dCys-dTyr-dGly-dPro-dGln-dCys-dLeu-dCys-dArg-OH乙酸盐(二硫键，空气氧化)。
本发明进一步包括本文所描述的D-氨基酸氯毒素和D-氨基酸氯毒素变体的缀合物。举例来说，D-氨基酸氯毒素和D-氨基酸氯毒素变体可与可例如修饰肽的药理学性质的多个部分缀合。在一些实施方案中，肽的氨基酸序列中的赖氨酸中的一些或全部可用丙氨酸或精氨酸代替以促进N端缀合(例如通过降低赖氨酸的氨基端的竞争)。
举例来说，本发明可包括具有与以下序列至少60％、65％、70％、75％、80％、83％、85％、86％、89％、90％、92％或95％相同的氨基酸序列的D-氨基酸氯毒素和D-氨基酸氯毒素变体：MCMPCFTTDHQMARXCDDCCGGXGRGXCYGPQCLCR，其中氨基酸中的一些或全部是D-氨基酸并且X可包括K、A或R。在一些实施方案中，氯毒素变体的序列中的氨基酸中的至少三个可以是D-氨基酸而不是天然氨基酸。在一些实施方案中，氯毒素变体的序列中的氨基酸中的至少四个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个或至少35个可包括D-氨基酸而不是天然氨基酸。在某些实施方案中，氯毒素变体的序列中的氨基酸中的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％可包括D-氨基酸而不是天然氨基酸。
D-氨基酸氯毒素和D-氨基酸氯毒素变体的缀合物可包括缀合至肽的各位置的部分。举例来说，部分可缀合至氯毒素序列中的赖氨酸残基(例如L-氨基酸或D-氨基酸形式)中的任一个(例如Lys-15、Lys-23和/或Lys-27)。或者，肽可以是突变成不含赖氨酸残基。在一些实施方案中，部分可缀合至D-氨基酸氯毒素肽和D-氨基酸氯毒素肽变体的N端。在一些实施方案中，部分可缀合至肽中的氨基酸中的至少一个。
在某些实施方案中，D-氨基酸氯毒素和D-氨基酸氯毒素变体可缀合至诸如可在受试者中检测(例如显现)到的可检测标记(例如染料)等部分。在一些实施方案中，D-氨基酸氯毒素和/或D-氨基酸氯毒素变体可缀合至可检测标记，以实现对缀合肽的生物分布的示踪。可检测标记可包括荧光标记(例如荧光染料)。
在某些实施方案中，荧光标记可具有为特定应用所需的发射特征。举例来说，荧光标记可以是荧光染料，其发射波长最大值在500nm至1100nm的范围之间、600nm至1000nm的范围之间、600至800nm的范围之间、650nm至850nm的范围之间、700nm至800nm的范围之间、720至780nm的范围之间或720至750nm的范围之间。本领域普通技术人员将了解可用作可检测标记并且具有以上发射特征的各种染料。举例来说，在某些条件下，花青5.5可具有约695nm的发射最大值，IRdye可具有约800nm的发射最大值，并且吲哚菁绿可具有约820nm的发射最大值。
可在本公开中用作缀合分子的荧光染料的非限制性实例包括罗丹明、对甲氨基酚、荧光素、硫代荧光素、氨基荧光素、羧基荧光素、氯代荧光素、甲基荧光素、磺基荧光素、氨基对甲氨基酚、羧基对甲氨基酚、氯代对甲氨基酚、甲基对甲氨基酚、磺基对甲氨基酚；氨基罗丹明、羧基罗丹明、氯代罗丹明、甲基罗丹明、磺基罗丹明以及硫代罗丹明、花青、吲哚碳花青、氧杂碳花青、硫杂碳花青、部花青、噁二唑衍生物、吡啶基噁唑、硝基苯并噁二唑、苯并噁二唑、芘衍生物、瀑布蓝、噁嗪衍生物、尼罗红、尼罗蓝、甲酚紫、噁嗪170、吖啶衍生物、原黄素、吖啶橙、吖啶黄、芳基甲川衍生物、金胺、结晶紫、孔雀绿、四吡咯衍生物、卟啉、酞菁以及胆红素。在一些实施方案中，可检测标记可包括近红外染料，诸如但不限于Cy5.5、吲哚菁绿(ICG)、DyLight 750或IRdye 800。在一些实施方案中，近红外染料可包括花青染料(例如花青2、花青3、花青3.5、花青5、花青5.5、花青7)。在某些实施方案中，可检测标记可包括呫吨染料或磺化呫吨染料，诸如Alexa Fluor(例如Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor647、Alexa Fluor 700)。此外，如果可鉴别染料的抗体，那么缀合染料可用作示踪、检测或显现标记以及作为检索柄。
可使用对肽的其它修饰。举例来说，D-氨基酸氯毒素和/或D-氨基酸氯毒素变体可包括翻译后修饰(例如甲基化和/或酰胺化)，其可影响例如血清半衰期。在一些实施方案中，D-氨基酸氯毒素和/或D-氨基酸氯毒素变体可缀合至例如可修饰肽或实现对肽的性质的改变的其它部分。缀合部分可例如是通过可逆结合于血清白蛋白来延长肽的半衰期的亲脂性部分。在一些实施方案中，简单碳链(例如通过豆蔻酰化)可缀合至肽。在一些实施方案中，亲脂性部分可以是胆甾醇或胆甾醇衍生物，包括胆甾烯、胆甾烷、胆甾二烯以及氧化甾醇。在一些实施方案中，肽可缀合至肉豆蔻酸(十四酸)或其衍生物。
缀合D-氨基酸氯毒素和/或D-氨基酸氯毒素变体还可以缀合至其它部分，其可起到其它作用，诸如提供用于从组织或流体中检索肽的亲和力柄(例如生物素)。举例来说，本发明的文库中的肽还可以缀合至生物素。除了延长半衰期，生物素还可以充当用于从组织或其它位置检索肽的亲和力柄。在一些实施方案中，可使用可充当可检测标记与亲和力柄两者的荧光生物素缀合物。可商购获得的荧光生物素缀合物的非限制性实例包括Atto425-生物素、Atto 488-生物素、Atto 520-生物素、Atto-550生物素、Atto 565-生物素、Atto 590-生物素、Atto 610-生物素、Atto 620-生物素、Atto 655-生物素、Atto 680-生物素、Atto 700-生物素、Atto 725-生物素、Atto 740-生物素、荧光素生物素、生物素-4-荧光素、生物素-(5-荧光素)缀合物以及生物素-B-藻红蛋白、Alexa fluor 488生物胞素、Alexa flour 546、Alexa Fluor549、荧光黄尸胺生物素-X、荧光黄生物胞素、俄勒冈绿488生物胞素、生物素-罗丹明以及四甲基罗丹明生物胞素。在一些其它实例中，缀合物可包括化学发光化合物、胶态金属、发光化合物、酶、放射性同位素以及顺磁性标记。
在一些实施方案中，本发明提供检测D-氨基酸氯毒素肽和/或D-氨基酸氯毒素肽变体的方法。在一方面，本发明包括一种检测受试者中的肽的方法。所述方法可包括向受试者施用有效量的包括D-氨基酸氯毒素肽和/或D-氨基酸氯毒素肽变体的组合物。肽可包括可检测标记，并且所述方法可进一步包括检测来自可检测标记的信号。在一些实施方案中，在施用之后，肽可结合于表达氯毒素靶标的组织(例如细胞)，并且所述方法可包括检测来自结合于受试者中的组织的肽的信号，以确定肽结合于组织的水平。在某些实施方案中，检测与正常组织相比增加水平的肽与组织的结合可指示所述组织包括表达氯毒素靶标的肿瘤组织。除检测肽与组织的结合之外，检测方法可包括例如通过检测受试者的血液和/或组织中的肽来示踪患者中的肽。
本发明进一步包括检测受试者中的组织(例如癌组织)和/或使其显像的方法。D-氨基酸氯毒素肽和/或D-氨基酸氯毒素肽变体可结合于多种氯毒素靶标。举例来说，在一些实施方案中，氯毒素靶标可包括膜联蛋白A2和依钙蛋白。在存在针对氯毒素靶标的结合亲和力的情况下，可向受试者施用包括D-氨基酸氯毒素肽和/或D-氨基酸氯毒素肽变体的组合物，并且然后所述肽可特异性结合于氯毒素靶标。检测与氯毒素靶标的结合和/或使其显像可用于例如鉴别具有诸如膜联蛋白A2和依钙蛋白等氯毒素靶标的组织。
结合的检测和/或显像还可以用于例如确定受试者是否具有与具有(例如表达)氯毒素靶标的细胞相关的疾病、疾患和/或病症。在一些实施方案中，所述方法可包括通过检测来自可检测标记的信号来获得受试者中的一个区域的图像。举例来说，所述区域可包括癌组织并且肽可结合于癌组织，从而提供癌组织的检测和/或显像。缀合染料可用于例如使用可特异性结合于肿瘤(例如脑肿瘤)的D-氨基酸氯毒素和D-氨基酸氯毒素变体进行肿瘤显像。在一些实施方案中，所述区域可包括肿瘤并且所述肽可结合于肿瘤，从而提供肿瘤的显像。在一些实施方案中，所述区域可包括脑肿瘤并且肽结合于脑肿瘤，从而提供脑肿瘤的显像。在某些实施方案中，本发明可包括检测与以下相关的癌组织和/或使其显像：神经胶质瘤、星形细胞瘤成神经管细胞瘤、脉络丛癌瘤、室管膜瘤、其它脑肿瘤、成神经细胞瘤、头颈癌、肺癌、乳房癌、肠癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、肉瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤(Ewing’s sarcoma)、癌、黑素瘤(包括无黑色素性黑素瘤)、卵巢癌、子宫颈癌、淋巴瘤、甲状腺癌、肛门癌、结肠-直肠癌、子宫内膜癌、生殖细胞肿瘤、喉癌、多发性骨髓瘤、前列腺癌、成视网膜细胞瘤、胃癌、睾丸癌以及威耳姆氏肿瘤(Wilm’s tumor)。在一些实施方案中，癌组织可与以下有关：神经胶质瘤、皮肤癌、肺癌、淋巴瘤、成神经管细胞瘤、前列腺癌、胰腺癌或其组合。
在一些实施方案中，癌组织可与以下有关：乳房癌和乳腺癌、结肠癌、皮肤癌、肺癌、淋巴瘤、神经胶质瘤、成神经管细胞瘤、前列腺癌、胰腺癌、口腔鳞状细胞癌和/或血管外皮瘤。
在一方面，本发明进一步包括用于使受试者中的肿瘤显像的肽。肽可包括具有至少三个D-氨基酸的氨基酸序列和具有被配置成结合于肿瘤的二级结构的肽，其中肽进一步包括可检测标记。如本文所描述，举例来说，肽可具有结合于诸如膜联蛋白A2和依钙蛋白的氯毒素靶标的形状的二级结构。在一些实施方案中，肽包括打结肽，诸如本文所描述的D-氨基酸氯毒素和/或D-氨基酸氯毒素变体。在某些实施方案中，肽可包括与天然氯毒素的相同氨基酸序列的氨基酸序列。可检测标记可例如缀合至肽的N端和/或缀合至肽中的赖氨酸残基。
D-氨基酸氯毒素肽可用于多种其它应用，诸如治疗性和/或诊断性应用。在一些实施方案中，D-氨基酸氯毒素和D-氨基酸氯毒素变体可用于治疗疾病的方法中。在一些实施方案中，D-氨基酸氯毒素肽可用于经由氯毒素-药物缀合物将药物递送至例如受试者的脑中的肿瘤。
本发明还提供用于向受试者施用本文所描述的D-氨基酸氯毒素和/或D-氨基酸氯毒素变体或其缀合物的组合物，以促进诊断性和/或治疗性应用。在某些实施方案中，组合物可包含药学上可接受的赋形剂。用于本发明中的药物赋形剂包括但不限于粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、包衣剂、甜味剂、调味剂以及着色剂。本领域技术人员将认识到其它药物赋形剂也可用于本发明。如本文所用的术语“药物组合物”包括例如固体和/或液体剂型，诸如片剂、胶囊、丸剂等。
本发明的D-氨基酸氯毒素和/或D-氨基酸氯毒素变体或其缀合物可通过本领域中可用的任何适合的技术例如以组合物形式施用。本发明的D-氨基酸氯毒素和/或D-氨基酸氯毒素变体或其缀合物可根据需要频繁地施用，包括每小时、每天、每周或每月施用。本发明的方法中所用的D-氨基酸氯毒素和/或D-氨基酸氯毒素变体或其缀合物可以是例如按剂量施用，所述剂量可视所使用的方法的需要而变化。本文所描述的D-氨基酸氯毒素和/或D-氨基酸氯毒素变体或其缀合物可以包括以下的多种方式向受试者施用：胃肠外、皮下、静脉内、气管内、鼻内、皮内、肌肉内、经结肠、经直肠、经尿道或腹膜内。在一些实施方案中，药物组合物可胃肠外、静脉内、肌肉内或经口施用。在一些实施方案中，D-氨基酸氯毒素和/或D-氨基酸氯毒素变体或其缀合物可全身施用。在一些实施方案中，组合物可瘤内和/或节内施用，诸如递送至受试者的淋巴结。在某些实施方案中，施用可包括肠道施用，包括经口施用、直肠施用；以及通过胃喂食管或十二指肠喂食管施用。施用还可以包括静脉内注射、动脉内注射、肌肉内注射、脑内、脑室内或皮下(在皮肤下)施用。在一些实施方案中，施用可通过包括经皮(涂覆至皮肤)的局部手段和吸入来实现。
包含本文所描述的D-氨基酸氯毒素和/或D-氨基酸氯毒素变体或其缀合物的口服药剂可以任何适合的形式用于经口施用，诸如液体、片剂、胶囊等。口服制剂可进一步包衣或处理以防止或减少在胃中的溶解。本发明的组合物可使用本领域中已知的任何适合的方法向受试者施用。适用于本发明的制剂和递送方法的制剂是本领域中普遍熟知的。举例来说，本文所描述的D-氨基酸氯毒素和/或D-氨基酸氯毒素变体或其缀合物可与药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂一起被配制成药物组合物。所述组合物可按需要含有包括以下的药学上可接受的辅助物质以接近生理条件：pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂等，诸如例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、失水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。
如本文所用，“受试者”是人或非人动物。在一些实施方案中，受试者可包括但不限于小鼠、大鼠、兔、人或其它动物。在另一个实施方案中，受试者是人，诸如患有癌症或处于患有癌症的危险之中的人。在一些实施方案中，受试者或生物来源可被怀疑患有或处于患有包括恶性疾病、病症或疾患(例如癌症)的疾病、病症或疾患的危险之中。在某些实施方案中，受试者或生物来源可被怀疑患有或处于患有过度增殖性疾病(例如癌、肉瘤)的危险之中，并且在本公开的某些其它实施方案中，受试者或生物来源可已知不处于此类疾病、病症或疾患的危险或不存在此类疾病、病症或疾患。
“治疗”、“治疗中”或“改善”是指治疗性治疗/预防性治疗。如果接受治疗的个体的疾病(例如过度增殖性病症，诸如癌症)的至少一个症状改善，或者治疗可延迟个体的进行性疾病的恶化，或防止其它相关疾病(例如癌症的转移)的发生，那么治疗是治疗性的。
包括本文所描述的D-氨基酸氯毒素和/或D-氨基酸氯毒素变体的组合物的“治疗有效量(或剂量)”或“有效量(或剂量)”是指化合物足以以统计显著性方式使得疾病的一个或多个症状改善的量。当提到单独施用的单个活性成分时，治疗有效剂量是指单独的所述成分(例如本文所描述的D-氨基酸氯毒素和/或D-氨基酸氯毒素变体)。当提到组合时，治疗有效剂量是指活性成分产生治疗作用的组合量，无论是连续施用还是同时施用(在同一制剂中或在分开的制剂中)。
术语“药学上可接受的”是指当使用本领域中熟知的途径向受试者施用时分子实体和组合物不产生变应性或其它严重有害反应。
“有需要的患者”或“有需要的受试者”是指处于便于用本文所描述的D-氨基酸氯毒素和/或D-氨基酸氯毒素变体治疗或改善的疾病、病症或疾患(例如癌症)危险之中或罹患所述疾病、病症或疾患的患者或受试者。
在一方面，本发明包括治疗与表达氯毒素靶标的细胞相关的疾病的方法。所述方法可包括向有需要的受试者施用治疗有效量的包含D-氨基酸氯毒素和/或D-氨基酸氯毒素变体的药物组合物，从而治疗疾病。在一些实施方案中，氯毒素靶标可包括膜联蛋白A2、依钙蛋白或其组合。
在一些实施方案中，D-氨基酸氯毒素和/或D-氨基酸氯毒素变体可进一步包括其它药剂以促进治疗。举例来说，D-氨基酸氯毒素和/或D-氨基酸氯毒素变体可进一步包括细胞毒性剂(例如有丝分裂抑制剂)、毒素、反义核苷酸、癌症治疗药物(例如烷基化剂)、核苷酸药物、抗代谢产物、代谢调节剂、放射致敏剂、肽治疗剂、肽-药物缀合物、放射性核素或其组合。
细胞毒性剂可包括可用于例如通过抑制细胞增殖治疗癌症的药物。一些示例性细胞毒性剂可包括例如长春花生物碱、丝裂霉素(mitomycin)、博来霉素(bleomycin)、细胞毒性核苷、紫杉烷以及埃博霉素(epothilone)。那些类别的成员包括例如多柔比星(doxorubicin)、洋红霉素(carminomycin)、佐柔比星(daunorubicin)、氨基蝶呤、甲氨蝶呤、甲基叶酸、二氯甲氨蝶呤、丝裂霉素C、甲基丝裂霉素、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、吉西他滨(gemcitabine)、胞嘧啶阿糖胞苷、鬼臼毒素或鬼臼毒素衍生物，诸如依托泊苷(etoposide)、依托泊苷磷酸酯或替尼泊苷(teniposide)、美法仑(melphalan)、长春花碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、异长春碱(leurosidine)、长春地辛(vindesine)、环氧长春碱(leurosine)、帕西他赛(paclitaxel)以及其治疗有效性类似物和衍生物。其它有用的抗肿瘤剂包括雌莫司汀(estramustine)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、博来霉素、吉西他滨(gemcitibine)、异环磷酰胺(ifosamide)、美法仑、六甲密胺、硫替派(thiotepa)、阿糖胞苷、依达曲沙(idatrexate)、曲美沙特(trimetrexate)、达卡巴嗪(dacarbazine)、L-天冬酰胺酶、喜树碱、CPT-11、拓扑替康(topotecan)、ara-C、必卡他胺(bicalutamide)、氟他胺(flutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)、吡啶并苯并吲哚衍生物、干扰素以及白介素。
适合的代谢调节剂可包括但不限于氯尼达明(lonidamine)、二氯乙酸盐、α-生育酚丁二酸酯、茉莉酮酸甲酯、桦木酸以及白藜芦醇。
放射致敏剂已知增加癌细胞对电磁辐射(例如x射线)的毒性作用的敏感性。x射线活化的放射致敏剂的实例包括但不限于甲硝哒唑(metronidazole)、迷索硝唑(misonidazole)、去甲基迷索硝唑(desmethylmisonidazole)、哌莫硝唑(pimonidazole)、依他硝唑(etanidazole)、尼莫拉唑(nimorazole)、丝裂霉素C、RSU 1069、SR 4233、EO9、RB 6145、烟酰胺、5-溴脱氧尿苷(BUdR)、5-碘脱氧尿苷(IUdR)、溴脱氧胞苷、氟脱氧尿苷(FudR)、羟基脲、顺铂以及其治疗有效性类似物和衍生物。
在一些实施方案中，D-氨基酸氯毒素和/或D-氨基酸氯毒素变体可包括放射性核素和/或复合放射性核素。适合的放射性核素可包括但不限于Sc-47、Ga-67、Y-90、Ag-111、In-111、Sm-153、Tb-166、Lu-177、Bi-213、Ac-225、Cu-64、Cu-67、Pd-109、Ag-111、Re-186、Re-188、Pt-197、Bi-212、Bi-213、Pb-212或Ra-223。
在某些实施方案中，本发明可包括治疗诸如以下的疾病、病症和/或疾患：神经胶质瘤、星形细胞瘤成神经管细胞瘤、脉络丛癌、室管膜瘤、其它脑肿瘤、成神经细胞瘤、头颈癌、肺癌、乳房癌、肠癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、肉瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、癌、黑素瘤、卵巢癌、子宫颈癌、淋巴瘤、甲状腺癌、肛门癌、结肠-直肠癌、子宫内膜癌、生殖细胞肿瘤、喉癌、多发性骨髓瘤、前列腺癌、成视网膜细胞瘤、胃癌、睾丸癌以及威耳姆氏肿瘤。在一些实施方案中，所述方法可包括治疗包括以下的疾病、病症和/或疾患：神经胶质瘤、皮肤癌、肺癌、淋巴瘤、成神经管细胞瘤、前列腺癌、胰腺癌或其组合。在某些实施方案中，所述方法可用于治疗乳房癌和乳腺癌、结肠癌、皮肤癌、肺癌、淋巴瘤、神经胶质瘤、成神经管细胞瘤、前列腺癌、胰腺癌、口腔鳞状细胞癌和/或血管外皮瘤。
本发明进一步包括施用本文所描述的D-氨基酸氯毒素和/或D-氨基酸氯毒素变体的方法。举例来说，在一方面，本发明包括一种包括以下步骤的方法：向有肿瘤的受试者施用有效剂量的本文所描述的D-氨基酸氯毒素和/或D-氨基酸氯毒素变体或包含本文所描述的D-氨基酸氯毒素和/或D-氨基酸氯毒素变体的组合物，使得肽相对于正常组织选择性靶向肿瘤组织。
所述方法可进一步包括促进受试者中的癌组织(例如肿瘤)的手术移除。举例来说，本发明可包括一种包括以下步骤的方法：向具有癌组织(例如肿瘤)的受试者施用有效剂量的本文所描述的D-氨基酸氯毒素和/或D-氨基酸氯毒素变体或包含本文所描述的D-氨基酸氯毒素和/或D-氨基酸氯毒素变体的组合物，使得肽相对于正常组织选择性靶向癌组织(例如肿瘤组织)。所述方法可包括通过例如检测显示肽的结合增加的组织来使癌组织显像，从而指示癌组织的位置。位置的鉴别可提供从受试者手术移除癌组织的步骤。手术移除可包括例如如通过本文所描述的D-氨基酸氯毒素和/或D-氨基酸氯毒素变体的结合所鉴别的癌组织的术中可视化。
本发明还提供用于向受试者施用本文所描述的D-氨基酸氯毒素和D-氨基酸氯毒素变体以促进诊断性和/或治疗性应用的组合物。在某些实施方案中，组合物可包括药学上可接受的赋形剂。用于本发明中的药物赋形剂包括但不限于粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、包衣剂、甜味剂、调味剂以及着色剂。本领域技术人员将认识到其它药物赋形剂也可用于本发明。如本文所用的术语“药物组合物”包括例如固体和/或液体剂型，诸如片剂、胶囊、丸剂等。
本发明的D-氨基酸氯毒素和D-氨基酸氯毒素变体可根据需要频繁地施用，包括每小时、每天、每周或每月施用。本发明的方法中所用的D-氨基酸氯毒素和D-氨基酸氯毒素变体可例如按剂量施用，所述剂量可视所使用的方法的需要而变化。本文所描述的D-氨基酸氯毒素和/或D-氨基酸氯毒素变体可以包括以下的多种方式向受试者施用：胃肠外、皮下、静脉内、气管内、鼻内、皮内、肌肉内、经结肠、经直肠、经尿道或腹膜内。在一些实施方案中，药物组合物可胃肠外、静脉内、肌肉内或经口施用。在一些实施方案中，组合物可瘤内和/或节内施用，诸如递送至受试者的淋巴结。在某些实施方案中，施用可包括肠道施用，包括经口施用、直肠施用；以及通过胃喂食管或十二指肠喂食管施用。施用还可以包括静脉内注射、动脉内注射、肌肉内注射、脑内、脑室内或皮下(在皮肤下)施用。
包含本文所描述的药物候选物(例如肽)的口服药剂可以任何适合的形式来经口施用，诸如液体、片剂、胶囊等。口服制剂可进一步涂覆包衣或处理以防止或减少在胃中的溶解。本发明的组合物可使用本领域中已知的任何适合的方法向受试者施用。适用于本发明的制剂和递送方法的制剂是本领域中普遍熟知的。举例来说，本文所描述的药物候选物(例如肽)可与药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂一起配制成药物组合物。组合物可按需要含有包括以下的药学上可接受的辅助物质以接近生理条件：pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂等，诸如例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、失水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。
本发明进一步包括D-氨基酸氯毒素和/或D-氨基酸氯毒素变体的功能测定。D-氨基酸氯毒素和/或D-氨基酸氯毒素变体以及其缀合物结合于肿瘤或癌组织的能力可通过体外结合、离体显像、动物模型以及本领域中已知并且如先前所描述的其它测定来测定。参见例如美国专利公布号US20080279780和WO 2011/142858，这两个专利关于用于检测和测量对肿瘤细胞和肿瘤组织的结合的功能测定的描述以引用的方式并入本文中。
本领域技术人员将有了解关于可用于测量D-氨基酸氯毒素和/或D-氨基酸氯毒素变体以及其缀合物的体内活性的动物模型的知识。举例来说，美国国家癌症研究所(National Cancer Institute)维持了特定癌症模型的数据库。参见美国国家癌症研究所网站的“癌症模型数据库(Cancer ModelsDatabase)”。所有动物均严格按照美国国家卫生研究所关于实验室动物的护理和使用的指导(National Institutes of Health Guide for the Care and Use ofLaboratory Animals)进行处理。先前已描述了ND2：SmoA1成神经管细胞瘤小鼠、TRAMP前列腺癌小鼠以及Apc1638N肠道腺瘤和腺癌瘤小鼠。参见Fodde，R.等人，A targeted chain-termination mutation in the mouse Apc generesults in multiple intestinal tumors.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1994.91(19)：第8969-73页；Greenberg，N.M.等人，Prostate cancer in a transgenicmouse.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1995.92(8)：第3439-43页；Kaplan-Lefko，P.J.等人，Pathobiology of autochthonous prostate cancer in apre-clinical transgenic mouse model.Prostate，2003.55(3)：第219-37页；Hallahan，A.R.等人，The SmoA1 mouse model reveals that notch signaling iscritical for the growth and survival of sonic hedgehog-inducedmedulloblastomas.Cancer Res.，2004.64(21)：第7794-800页；各自明确地以全文引用的方式并入本文中。
癌症小鼠模型的一个实例是成神经管细胞瘤土生小鼠模型ND2：SmoA1。参见A.R.Hallahan等人，“The SmoA1 Mouse Model RevealsThat Notch Signaling is Critical for the Growth and Survival of SonicHedgehog-Induced Medulloblastomas，”Cancer Research(54：7794-7800，2004)，以及B.A.Hatton等人“The Smo/Smo Model：Hedgehog-InducedMedulloblastoma With 90％ Incidence and Leptomeningeal Spread，”CancerResearch(58：1768-1776，2008)。使用了C57M/6背景，并且施用D-氨基酸氯毒素和/或D-氨基酸氯毒素变体以及其缀合物以评估一种或多种肽缀合物相对于正常组织对癌组织的结合优先。选择具有症状性成神经管细胞瘤的半合或纯合(称为ND2：SmoA1)小鼠招募到这些研究中。使用旷场笼评估(open field cage evaluation)检测症状。症状可包括头部倾斜、弓背姿势、运动失调、颅骨突出以及重量减轻。此测定中的阳性结果将包括通过施用D-氨基酸氯毒素和/或D-氨基酸氯毒素变体以及其缀合物减轻、消除、减少或抑制这些症状。
此类分析可用于显示D-氨基酸氯毒素和/或D-氨基酸氯毒素变体以及其缀合物在包括例如与以下相关的癌组织的多种癌症中的作用：神经胶质瘤、星形细胞瘤成神经管细胞瘤、脉络丛癌瘤、室管膜瘤、其它脑肿瘤、成神经细胞瘤、头颈癌、肺癌、乳房癌、肠癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、肉瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤、癌、黑素瘤(包括无黑色素性黑素瘤)、卵巢癌、子宫颈癌、淋巴瘤、甲状腺癌、肛门癌、结肠-直肠癌、子宫内膜癌、生殖细胞肿瘤、喉癌、多发性骨髓瘤、前列腺癌、成视网膜细胞瘤、胃癌、睾丸癌以及威耳姆氏肿瘤。在一些实施方案中，癌组织可与以下有关：神经胶质瘤、皮肤癌、肺癌、淋巴瘤、成神经管细胞瘤、前列腺癌、胰腺癌或其组合。在一些实施方案中，癌组织可与以下有关：乳房癌和乳腺癌、结肠癌、皮肤癌、肺癌、淋巴瘤、神经胶质瘤、成神经管细胞瘤、前列腺癌、胰腺癌、口腔鳞状细胞癌和/或血管外皮瘤。
D-氨基酸氯毒素和/或D-氨基酸氯毒素变体以及其缀合物相对于正常组织靶向癌组织或肿瘤组织的可检测标记的能力可通过体外结合、离体显像、动物模型以及本领域中已知并且如上文所描述的其它分析来测定。举例来说，如本文所描述D-氨基酸氯毒素和/或D-氨基酸氯毒素变体可缀合至可检测标记，以产生D-氨基酸氯毒素缀合物或D-氨基酸氯毒素变体缀合物。可将适当量的D-氨基酸氯毒素缀合物或D-氨基酸氯毒素变体缀合物注入显示与晚期肿瘤一致的临床迹象的小鼠的尾部静脉。三天后可将小鼠处死并且可使用诸如Caliper/Xenogen光谱或Odyssey近红外显像系统等生物光子显像系统使其脑显像。阳性结果将显示与正常组织相比肽缀合物优先阐明或鉴别癌症组织。在一个实施方案中，相对于正常组织D-氨基酸氯毒素缀合物或D-氨基酸氯毒素变体缀合物对癌组织的优先结合与天然氯毒素缀合物大体上相同。在另一个实施方案中，相对于正常组织D-氨基酸氯毒素缀合物或D-氨基酸氯毒素变体缀合物对癌组织的优先结合小于天然氯毒素缀合物，但大于正常组织。
本领域技术人员将了解有关于可用于测量包括本文所描述的D-氨基酸氯毒素和/或D-氨基酸氯毒素变体以及其缀合物的D-氨基酸肽的活性的离体模型的知识。举例来说，为检测成神经管细胞瘤，通过尾部静脉向展现成神经管细胞瘤症状的ND2：SmoA1动物注射D-氨基酸氯毒素和/或D-氨基酸氯毒素变体或缀合物。注射之后使用CO2吸入三天使小鼠安乐死，并且使用Xenogen光谱显像系统(Caliper)获得其脑的离体生物光子图像。然后将脑冷冻于Tissue-Tek最佳切割温度(OCT)化合物(Sakura)中，切成12μm切片并且根据标准程序进行苏木精和曙红(H&E)染色。阳性结果将显示与正常组织相比D-氨基酸氯毒素和/或D-氨基酸氯毒素变体或其缀合物优先阐明或鉴别癌症组织。在一个实施方案中，相对于正常组织D-氨基酸氯毒素和/或D-氨基酸氯毒素变体或其缀合物对癌组织的优先结合与天然氯毒素或天然氯毒素缀合物大体上相同。在另一个实施方案中，相对于正常组织D-氨基酸氯毒素和/或D-氨基酸氯毒素变体或其缀合物对癌组织的优先结合小于天然氯毒素或天然氯毒素缀合物，但大于正常组织。
另一个实例涉及使前列腺组织显像。根据人受试者IRB批准方案收集并且处理正常和癌人前列腺组织样品。将切片与一定量的D-氨基酸氯毒素缀合物和/或D-氨基酸氯毒素变体缀合物在5％正常山羊血清缓冲液中孵育45分钟。通过在PBS缓冲液中持续5分钟洗涤载玻片3次来减少未结合的缀合物。通过荧光显微术检测信号并且与用苏木精和曙红(H&E)染色的相邻切片相关联。阳性结果将显示与正常组织相比D-氨基酸氯毒素缀合物或D-氨基酸氯毒素变体缀合物优先阐明或鉴别癌症组织。在一个实施方案中，相对于正常组织D-氨基酸氯毒素缀合物或D-氨基酸氯毒素变体缀合物对癌组织的优先结合与天然氯毒素缀合物大体上相同。在另一个实施方案中，相对于正常组织D-氨基酸氯毒素缀合物或D-氨基酸氯毒素变体缀合物对癌组织的优先结合小于天然氯毒素缀合物，但大于正常组织。
本领域技术人员将了解有关于可用于测量本文所描述的D-氨基酸氯毒素和/或D-氨基酸氯毒素变体以及其缀合物的活性的体外模型的知识。举例来说，将9L/lacZ胶质肉瘤细胞(ATCC，VA)和原代人包皮纤维母细胞(HFF)分别维持在DMEM和RPMI培养基中，两种培养基均补充有1％丙酮酸钠、1％链霉素/青霉素以及10％ FBS(Hyclone，UT)。将2x105个细胞接种于无菌盖玻片上36小时，然后进行标记和共焦显微镜分析。将细胞在维持在5％ CO2下的37℃湿润孵育器中与1ml CTX：CY5.5缀合物(1uM)一起培养2小时。将盖玻片在细胞培养基中洗涤2次并且在PBS缓冲液中洗涤2次。在此步骤之后，将细胞膜用FM 1-43FX(Molecular Probes，OR)的1uM溶液在黑暗中在室温下染色20分钟，在PBS中洗涤2次并且固定于4％低聚甲醛中。将细胞核用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，SigmaAldrich，MO)染色。使用装有DAPI、TRITC以及Cy5过滤器的DeltaVisionSA3.1广视野反卷积显微镜(Applied Precision，WA)获取共焦图像。使用SoftWoRX(Applied Precision，WA)进行图像处理。阳性结果将显示与正常组织相比D-氨基酸氯毒素或D-氨基酸氯毒素变体或其缀合物优先阐明或鉴别癌症组织。在一个实施方案中，相对于正常组织D-氨基酸氯毒素或D-氨基酸氯毒素变体或其缀合物对癌组织的优先结合与天然氯毒素或天然氯毒素缀合物大体上相同。在另一个实施方案中，相对于正常组织D-氨基酸氯毒素或D-氨基酸氯毒素变体或其缀合物对癌组织的优先结合小于天然氯毒素或天然氯毒素缀合物，但大于正常组织。
另一种模型包括使用在nu/nu(裸)小鼠中使用9L(一种大鼠胶质肉瘤细胞系(ATCC))和RH30(一种横纹肌肉瘤细胞系)建立的皮下异种移植物。异种移植物使用以1∶1比率悬浮于不含血清的培养基和基质胶中的1百万个9L或RH30细胞来建立。颅内异种移植物是通过将悬浮于10ul PBS中的1百万个9L细胞立体定位注射至脑前囟的外侧后方3mm来建立。
制备文库的方法
在另一个方面，本发明包括用于制备潜在药物候选物的方法。举例来说，本领域中普遍熟知的方法可用于制备小分子文库和更大的生物制品(例如抗体)文库。
在一些实施方案中，本发明包括制备所产生的肽文库的肽的方法。多种方法适用于制备肽文库。如本文进一步描述，本发明包括可用作产生肽文库的起始点的骨架。这些骨架以及多种多样的骨架变体可使用若干不同方法来制备。在一些方面，肽文库可使用本领域中普遍熟知的肽合成技术来产生。还可以使用常规寡核苷酸合成技术(例如基于芯片的寡核苷酸合成)。在一些情况下，合成方法可与多种表达系统组合。在一个示例性实施方案中，可使用简并密码子靶向骨架中的特定残基位置以引起随机诱变，从而产生可使用例如基于芯片的寡核苷酸合成来制备并且可编码骨架变体的大文库的一组不同的DNA。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括产生包含具有所述药理学性质的肽中的至少一些的肽文库。在某些实施方案中，所述方法进一步包括筛选肽中的至少一些，以鉴别哪些肽展现抑制蛋白质：蛋白质相互作用、抑制受体的拮抗作用、抑制激动剂与受体的结合、调控离子通道、抑制信号传导通路、活化信号传导通路和/或抑制蛋白质：小分子相互作用的活性。在一些实施方案中，蛋白质：蛋白质相互作用与选自由以下组成的组的疾病或病症有关：癌症、传染疾病、炎性疾病、免疫疾病、代谢疾病、心脏疾病、年龄相关疾病以及神经疾病。在某些实施方案中，蛋白质：蛋白质相互作用与癌症有关。在一些实施方案中，所述方法进一步包括从受试者获得多个样品，各样品在施用多种肽之后在不同时间点获得。在某些实施方案中，多种肽中的至少一种肽包含用于示踪受试者中的至少一种肽的可检测标记。在某些实施方案中，可检测标记包含近红外染料。
在一些实施方案中，编码骨架和骨架变体的分子可在各种表达系统中表达，并且在一些实施方案中，可组合为融合系统的一部分。例如，编码骨架和骨架变体的DNA分子可与可在若干不同细胞类型(例如293HEK或大肠杆菌(E.coli))中表达的融合系统组合。例如，293HEK细胞的融合可包括但不限于IgK前导序列和/或分泌的融合蛋白，诸如噬铁蛋白、脂质运载蛋白2以及人血清白蛋白。
在一些实施方案中，本文所描述的肽(例如打结肽)可以与脂质运载蛋白一起的融合体的形式表达。在一方面，本发明包括一种用于产生肽的方法，其可包括在细胞中表达包括肽(例如打结肽)和脂质运载蛋白的融合蛋白。所述方法可进一步包括将肽与脂质运载蛋白分离，从而产生肽(例如打结肽)。本发明进一步包括包括脂质运载蛋白和肽(例如打结肽)的融合蛋白的组合物。此融合系统相对于传统融合系统提供关于产生肽(例如打结肽)的多个优点。作为背景，而不是以任何方式限制，脂质运载蛋白是一类可具有以具有侧翼α螺旋的八链β桶状结构为特征的保守折叠的蛋白质。如Lcn2、NGAL以及噬铁蛋白等脂质运载蛋白在哺乳动物细胞中的表达水平等同于或胜过包括Fc融合的许多其它融合系统。
本文所描述的肽(例如打结肽)可使用多种脂质运载蛋白表达。在一些实施方案中，噬铁蛋白是用作分泌配偶体。噬铁蛋白可用作融合配偶体更大蛋白质，因为例如噬铁蛋白相对于更大蛋白质尺寸小(成熟蛋白是178个氨基酸并且分子量是20547Da)。另外，噬铁蛋白中的C87S突变可防止二聚作用并且产生纯单体融合蛋白。存在于噬铁蛋白中的单一分子内二硫键增加其稳定性。另外，噬铁蛋白仅具有单一N-连接糖基化位点，其在分泌之前参与在ER中的正确加工。在一些实施方案中，肽还可以与鼠Lcn2(也称为24p3)一起的融合肽形式表达，所述鼠Lcn2也非常好地充当分泌配偶体。还可以使用其它同系物。此外，本文所提供的肽(例如打结肽)还可以与包括以下的脂质运载蛋白家族的其它成员的融合系统的形式表达：Lcn1、Lcn6、Lcn8、Lcn9、Lcn10、Lcn12、Lcn15。
在一些实施方案中，可利用肽(例如打结肽)与Lcn2呈融合体形式的表达，加上自裂解Lcn2，其就在CIDG之后具有RARYKR；以及外源裂解的Lcn2，其在所述位置处具有ENLYFQ。前者可在蛋白质输出期间由哺乳动物细胞(例如由弗林蛋白酶(furin))裂解，并且游离Lcn2和打结肽可分泌至周围介质中。ENLYFQ是烟草蚀斑蛋白酶位点，其不内源性地存在于哺乳动物细胞中。此系统中的构建体可以融合体形式分泌，从而使随后通过添加外源性TEV蛋白酶将打结肽裂解掉。这可用于恢复打结素。在一些实施方案中，可将诸如聚组氨酸或聚精氨酸等纯化“柄”添加至Lcn2中并且随后通过蛋白水解移除。除打结肽之外，这些融合系统还可以用于医学关注的难于表达的蛋白质，诸如趋化因子、白介素以及肽激素。
脂质运载蛋白融合(例如与打结肽融合的噬铁蛋白和/或Lcn2)可以若干方式不同的方式使用。它可用于增加靶蛋白(例如潜在治疗剂)的尺寸以增加其半衰期。它可用于分泌靶蛋白，其中靶蛋白天然表达于细胞质中。Lcn2还具有独特的配体特异性并且紧密结合儿茶酚含铁细胞(细菌铁螯合剂)。这打开了加载Lcn2与诸如以下的特定配体的融合体的可能性：化学治疗剂或放射性试剂或具有有益性质的一些类型或者一种化合物。Lcn2在用含铁细胞和铁加载时具有深红色，其可辅助色谱法或其它纯化步骤。
除若干其它优点之外，脂质运载蛋白融合系统可用于历时相对短的时间范围制备大量蛋白质。在一些实施方案中，所获得的肽的量可小于约10mg/L、小于约20mg/L、小于约40mg/L、小于约50mg/L、小于约100mg/L、小于约150mg/L、小于约180mg/L或小于约200mg/L。在一些实施方案中，所获得的肽的量可在约10mg/L与200mg/L之间、约50mg/L与200mg/L之间，约100mg/L与200mg/L之间以及约150mg/L与200mg/L之间。
在其它实施方案中，本文所描述的肽中的一些可以文献中已知的多种方式表达。举例来说，肽在包括以下的细菌系统中表达：大肠杆菌、棒状杆菌(corynebacterium)以及荧光素假单胞菌(pseudomonas fluorescein)。大肠杆菌的表达平台可包括周质表达或胞浆表达。关于周质表达，融合可包括peIB、dsbA以及ExFABP融合。胞浆融合可包括小泛素样修饰剂(SUMO)融合。肽还可以在包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)的酵母系统中表达。肽还可以在昆虫细胞系统和包括植物和哺乳动物系统的真核系统中表达。
在一些方面，本文所公开的肽可通过转染合成，转染是一种涉及将外来DNA引入真核细胞的核中的技术。在一些方面，肽可通过瞬时转染(DNA不与真核细胞的基因组整合，但基因被表达24-96小时)合成。可使用各种方法将外来DNA引入宿主细胞，并且转染可通过基于化学品的手段来实现，包括通过磷酸钙、通过树状聚合物、通过脂质体以及通过使用阳离子型聚合物。非化学转染方法包括电穿孔、声穿孔、光学转染、原生质体融合、穿刺转染(impalefection)以及水动力递送。在一些实施方案中，转染可通过基于粒子的方法实现，所述基于粒子的方法包括基因枪，其中DNA偶联至惰性固体的纳米粒子，然后将其直接“射”入靶细胞的核中。其它基于粒子的转染方法包括磁体辅助转染和穿刺转染。
还可以使用病毒作为载体(病毒转导)使用逆转录病毒或慢病毒将DNA引入细胞。在一些实施方案中，本发明的肽可使用代达罗斯表达系统(Daedalus expression system)制备。Ashok D.Bandaranayake等人，NucleicAcids Res.2011 November；39(21)：e143，其以引用的方式整体并入本文中。此技术还可以与不含血清哺乳动物培养系统组合。并且，也可能表达无标签蛋白质，其可以单个尺寸排阻步骤以高水平直接从培养基中纯化。
在一方面，本发明提供一种以高水平制造数百至数千或更多种肽变体的方法。制备打结肽的常规方法可能是受限的，因为打结肽的活性可取决于肽的适当折叠。在制备在制造期间适当折叠的打结肽方面已存在有限的成功。本发明克服了本领域中已知的其它技术的这些问题。图4示出一种用于制造本发明的肽文库的示例性方法。如所示，可如下产生病毒：通过包装特定寡核苷酸序列，将序列转移至病毒，并且表达肽。可进行肽的回收和按比例放大，并且然后可纯化并测定样品。所述方法可有效(例如在三周内)进行并且可产生大量肽(例如200mg/升)。在一些情况下，由于根据本文所描述的方法制造的纯度，可不需要通过色谱纯化。
在一个示例性实施方案中，本发明包括经由可裂解接头融合至噬铁蛋白的打结肽的融合蛋白。图5示出可用于制备打结肽文库的示例性融合系统。如所示，融合系统包括一个序列，其包括IgK SP、sFLAG、HIS、噬铁蛋白、TEV以及目标打结肽序列。在一些实施方案中，这些融合可与代达罗斯表达系统组合。Ashok D.Bandaranayake等人，Nucleic Acids Res.2011 November；39(21)：e143，其以全文引用的方式并入本文中。可使用慢病毒来获得在HEK293细胞(人肾细胞系)中的快速、稳定表达。噬铁蛋白可在此系统中高度表达并且例如同时用以帮助打结肽表达。可裂解接头的性质允许融合体在蛋白质表达时或随后由外源添加的蛋白酶裂解。噬铁蛋白融合配偶体可例如是可推广用于任何难于表达的蛋白质的表达增强系统，可用作标签以增加更小肽的尺寸，并且/或者改善肽的血清半衰期(例如通过使最终融合蛋白的尺寸增大超过肾小球过滤限制。
虽然HEK293细胞是强健的并且用于一般蛋白质表达，但慢病毒可感染多种细胞。将此与允许蛋白质在其表达时裂解的系统组合使一组有力的测定成为可能，所述一组有力的测定依赖于所分泌的肽以自泌或旁泌方式起作用(即它们作用于分泌它们的细胞或附近的细胞)。此情况的一个实例将是用表达肽文库的慢病毒感染癌症靶细胞并且然后通过流式细胞术筛选那些显示凋亡迹象(例如膜联蛋白V表达)的细胞。可将显示凋亡应激迹象的细胞挑选出来并且进行病毒测序，从而基本上寻找表达以自泌方式诱导凋亡的肽的细胞。一组相关筛选可在扩散限制基质(例如软琼脂)中进行，其中表达肽的细胞与靶细胞混合并且琼脂限制肽的扩散。靶细胞死亡的区域将是活性分泌肽的指示。以此方式进行的筛选可使用非常大的文库，因为去卷积将与对产生肽的基因进行测序一样简单。
在一些实施方案中，本发明可包括用于产生打结素的方法，使得打结素蛋白可保持拴系至哺乳动物细胞的表面用于常规结合筛选(例如靶分子拴系至柱或珠粒并且通过对靶标的亲和力鉴别药物候选物的那些筛选)。与其它已知方法(例如噬菌体或酵母展示)相反，本文所描述的方法使用融合系统(例如本发明的噬铁蛋白系统)来表达肽文库，所述肽文库已根据上文所描述的“规则”(例如肽中酸性氨基酸/碱性氨基酸的比率)设计，并且可通过体内药物发现过程建立，并且/或者已经针对特定生物物理学和药理学性质进行了预筛选。在这些方法中，例如，所有DNA序列和蛋白质产品均已经是已知的并且已经验证(例如肽全部适当折叠并且具有改善的血清半衰期)。本发明的方法与所展示的蛋白质未知并且先前未验证的其它已知展示技术形成直接对比，并且替代地使它们的序列随机化(使用诱变寡核苷酸和简并NNN密码子)从而产生巨大尺寸(通常大于107)的文库，其中蛋白质中有许多由于有害突变而未适当折叠。
在一些实施方案中，本发明涉及产生质量定义型药物候选物文库的方法，其中所述方法包括产生多种药物候选物，药物候选物中的至少一些各具有独特质量标签或消化片段质量标签，以及使用质谱法分析多种药物候选物以测量药物候选物中的至少一些的独特质量标签或消化片段质量标签。在某些实施方案中，所述方法包括产生包含多种药物候选物中的至少一些的质量定义型药物候选物文库，药物候选物文库是基于药理学性质而产生，其中质量定义型药物候选物文库中的药物候选物的身份可以药物候选物中的每一种的独特质量标签或消化片段质量标签来确定。
本发明进一步提供产生质量定义型药物候选物文库的方法，其中所述方法包括产生多种药物候选物，药物候选物中的至少一些各具有独特质量标签或消化片段质量标签；使用质谱法分析多种药物候选物以测量药物候选物中的至少一些的独特质量标签或消化片段质量标签；以及产生包含多种药物候选物中的至少一些的质量定义型药物候选物文库，药物候选物文库是基于药理学性质产生，其中质量定义型药物候选物文库中的药物候选物的身份可以药物候选物各自的独特质量标签或消化片段质量标签来确定。
在一些实施方案中，多种药物候选物中的至少一种包含预定数目的重同位素原子，以改变至少一种药物候选物的独特质量标签或消化片段质量标签。在某些实施方案中，重同位素原子包括13C或氘。在一些实施方案中，多种打结肽中的至少一种的独特质量标签或消化片段质量标签由缀合至至少一种打结肽的部分限定。在某些实施方案中，所述部分缀合至至少一种打结肽的N端。在一些实施方案中，所述部分包含预定数目的重同位素原子以改变至少一种打结肽的独特质量标签或消化片段质量标签。在某些实施方案中，重同位素原子包括13C或氘。在一些实施方案中，多种打结肽包括大于100种肽、大于1000种肽或大于10000种肽。
在一些实施方案中，多种药物候选物包括打结肽。在某些实施方案中，打结肽的独特质量标签或消化片段质量标签由打结肽的天然氨基酸序列限定。在某些实施方案中，多种药物候选物中的至少一种包含预定数目的重同位素原子以改变至少一种药物候选物的独特质量标签或消化片段质量标签。在某些实施方案中，重同位素原子包括13C或氘。
在一些实施方案中，多种打结肽中的至少一种的独特质量标签或消化片段质量标签由缀合至至少一种打结肽的部分限定。在某些实施方案中，所述部分缀合至至少一种打结肽的N端。在某些实施方案中，所述部分包含预定数目的重同位素原子以改变至少一种打结肽的独特质量标签或消化片段质量标签。在某些实施方案中，重同位素原子包括13C或氘。在某些实施方案中，多种打结肽包括大于100种肽。在某些实施方案中，多种打结肽包括大于1000种肽。在某些实施方案中，多种打结肽包括大于10000种肽。
本发明进一步提供确定通过不同施用途径向受试者施用的打结肽的分布曲线的方法，其中所述方法包括向受试者施用轻打结肽，轻打结肽是通过第一递送途径施用并且与具有与轻打结肽相同的序列的重打结肽相比具有更低分子量；向受试者施用重打结肽，重打结肽通过不同于第一递送途径的第二递送途径施用；以及比较获自受试者的组织或流体样品的轻打结肽的量与重打结肽的量，从而确定受试者中分别基于第一和第二递送途径的轻打结肽和重打结肽的分布曲线。
在一些实施方案中，轻打结肽与轻打结肽相比包含更少更重的同位素。在一些实施方案中，重打结肽比轻打结肽包含至少多一个13C原子或氘原子。在某些实施方案中，第一打结肽缀合至第一部分而重打结肽缀合至第二部分。在其它实施方案中，第一部分、第二部分或两者分别缀合至轻打结肽和重打结肽的N端。在某些实施方案中，第一部分、第二部分或两者包含疏水部分。
在一些实施方案中，轻打结肽与轻打结肽相比包含更少更重的同位素。在其它实施方案中，重打结肽比轻打结肽包含至少多一个13C原子或氘原子。在某些实施方案中，第一打结肽缀合至第一部分而重打结肽缀合至第二部分。在某些实施方案中，第一部分、第二部分或两者分别缀合至轻打结肽和重打结肽的N端。在一些实施方案中，第一部分、第二部分或两者包含疏水部分。在一些实施方案中，至少一个13C原子存在于第一部分、第二部分或两者中。在一些实施方案中，轻打结肽、重打结肽或两者在通过质谱法分析时具有独特质量标签或消化质量标签。
在一些实施方案中，至少一个13C原子存在于第一部分、第二部分或两者中。在其它实施方案中，其中轻打结肽、重打结肽或两者在通过质谱法分析时具有独特质量标签或消化质量标签。
在一些实施方案中，多种肽中的至少一种肽包含缀合至至少一种肽的N端的疏水部分，其中至少一种肽展现与缺乏疏水部分的至少一种肽相比增加的半衰期。在某些实施方案中，疏水部分包含疏水性荧光染料或者饱和或不饱和烷基。
在一些实施方案中，多种肽中的至少一种肽包含用于示踪受试者中的至少一种肽的可检测标记。在某些实施方案中，可检测标记包括近红外染料。
分析文库的方法
由本发明提供的所产生的文库可使用多种方法分析并且用于确定关于应用的范围的信息。本文所提供的方法进一步包括分析多个样品中的至少一些样品，以确定多个样品中的各样品中的具有所述药理学性质的肽中的至少一些的身份。在一些实施方案中，肽中的至少一些的身份使用质谱法确定，其中肽中的每一种包含通过质谱仪检测的独特质量标签或消化片段质量标签。在其它实施方案中，多种药物候选物包括大于5种药物候选物、大于10种药物候选物、大于100种药物候选物、大于1000种药物候选物或大于10000种药物候选物。在某些实施方案中，多种肽中的至少一种肽包含用于示踪受试者中的至少一种肽的可检测标记。在某些实施方案中，可检测标记包括近红外染料。
在一方面，所述方法包括产生肽文库，其中文库中的肽中的一些或全部具有独特质量标签或消化片段标签(例如由胰蛋白酶消化)。在某些方面，所产生的肽文库的肽使用诸如胰蛋白酶等酶消化成更小、更可管理的片段。通过这样做，肽样品可更容易通过质谱法分析。
如图6中所示，所产生的肽文库可使用质谱法分析以单个地鉴别文库中的所有肽。肽中的每一种可具有例如独特的胰蛋白酶片段。可以若干电荷态获得肽的可视化，并且MS/MS使得身份明确，从而向过程中固有地添加质量控制。
在一些实施方案中，肽的汇集的质量定义型文库可用于各种应用。使用本文所公开的方法(例如基于芯片的寡核苷酸)，可完全限定数千种肽的文库并且用于产生其中每个成员均具有独特质量标签或消化片段质量标签的文库。在一些情况下，各种肽的身份可由其质量编码，从而允许进行例如使用以庞大标识符妨碍肽的展示方法不能实现的测定。举例来说，使用展示方法来发现穿过血脑屏障或因缺乏细胞穿透而与细胞内靶标相互作用的肽是不可行的，因为展示肽的元件(噬菌体、酵母、RNA)的庞大尺寸比组合动作占优势。由于肽几乎不含或不含附加物(除了可能存在的生物素、染料、标签或其它微小的修饰)，它们的特性是肽本身的品质的真正度量。此特征是可用于同时测试数千种肽的口服生物利用率、血清半衰期、血脑屏障穿透率以及向特定器官或肿瘤归巢的体内系统中的特定优点。
在一方面，本发明可包括产生质量定义型药物候选物文库的方法。所述方法可包括例如产生多种药物候选物，药物候选物中的至少一些各具有独特质量标签或消化片段质量标签。所述方法还可以包括使用质谱法分析多种药物候选物，以测量药物候选物中的至少一些的独特质量标签或消化片段质量标签。所述方法可进一步包括产生包含多种药物候选物中的至少一些的质量定义型药物候选物文库，药物候选物文库是基于药理学性质而产生，其中质量定义型药物候选物文库中的药物候选物的身份可以药物候选物中的每一种的独特质量标签或消化片段质量标签来确定。药理学性质可包括例如口服生物利用率、穿过血脑屏障的能力、血脑屏障排阻、血清半衰期、穿透细胞的能力、进入亚细胞器或其它细胞结构域的能力或其组合。
在一些方面，通过质谱对大肽文库的分析可包括分析大量可能具有类似分子量的肽和/或肽片段，从而产生相对拥挤的质谱图，这可防碍肽的明确鉴别。在一些实施方案中，正在分析的文库可被划分为具有不同质量的药物候选物(例如肽)的子文库，使得质谱图更不拥挤并且允许独特质量标签的更有效鉴别。
在一些实施方案中，具有独特质量标签的肽的文库还可以通过用原子量或质量数不同于自然界中通常所发现的原子量或质量数的同位素置换骨架中的一个或多个原子来产生。在一些实施方案中，文库中的肽的质量可通过添加本文进一步描述的同位素标记缀合物或标签来改变。可掺入本发明肽文库中的同位素的实例包括氮、氧、氢、碳、氟和氯、溴、硫以及硅的同位素。举例来说，本文中产生的文库中的肽因至少一个15N原子、至少一个17O原子、至少一个18O原子、至少一个2H原子、至少一个3H原子、至少一个13C、14C、18F、37Cl、至少一个76Br、至少一个33S原子、34S原子、36S原子、至少一个29Si原子或至少一个30Si原子而彼此不同。
在一些实施方案中，所产生的文库的肽和/或肽缀合物可因至少1个原子、至少2个原子、至少3个原子、至少4个原子、至少5个原子、至少6个原子、至少7个原子、至少8个原子、至少9个原子或至少10个原子的同位素取代而彼此不同。在一些实施方案中，大于约10个、大于约15个、大于约20个、大于约25个、大于约30个、大于约35个、大于约40个、大于约45个、大于约50个原子可由同位素原子取代。在一些实施方案中，肽和/或肽缀合物可因全部1H、12C、14N、16O或32S或其任何组合的同位素取代而不同。
本发明的肽文库可包括肽中的一些或全部具有独特质量标签的肽。本发明的肽文库可通过MS或串联质谱(MS/MS)分析来分析。在本发明的用于鉴别和/或定量肽的方法中可使用多种质谱法。不同电离方法，特别是像电喷雾电离(ESI)、基质辅助激光解吸/电离(MALDI)、硅上的解吸/电离(DIOS)、平原子轰击(FAB)以及液体次级离子质谱法(LSIMS)等软电离技术可用于检验所产生的肽文库。电离技术可以各种方式与包括以下的不同质谱分析仪组合：四极质谱分析仪、飞行时间(TOF)分析仪、四极离子阱、混合四极-TOF和傅里叶变换离子回旋共振(FTICR)MS。在一些实施方案中，肽文库可使用液相色谱(例如通过整合的液相色谱质谱仪系统(LC-MS)或LC-MS/MS)和/或其它分离技术来分析。
使用本发明的方法，可产生具有广泛多样性(例如数千)的骨架变体文库。此外，肽中的每一种均可设计成具有独特质量标签或消化片段质量标签，其可用于筛选并且单个地鉴别具有以下药理学性质中的至少一种的文库中的肽：口服生物利用率、穿过血脑屏障的能力、血清半衰期、穿透细胞的能力或进入亚细胞器或其它细胞结构域的能力。同样，可使用缀合物对肽文库进行基于质量的分析。在一些实施方案中，可使用缀合物来标记具有可通过质谱法来区别的两个相同疏水部分的文库。举例来说，可使用具有不同同位素的缀合物来产生具有不同质量但具有例如相同或不同氨基酸序列的肽。
在本公开的一些方面，肽文库中的肽是缀合的。缀合可在肽内的任何适合的位置发生，例如，肽可在组成肽的任何氨基酸残基处或在其N端或C端缀合。在各个方面，本公开的肽在其N端缀合。在本公开的一些方面，肽文库可包括缀合肽。
缀合可通过本领域中已知的多种方式进行。在一些实例中，缀合物添加至肽文库的N端。N-缀合可通过肽文库与包括琥珀酰亚胺酯的胺反应性酯的反应来实现。在一些方面，缀合可通过使用pH值来进行以选择性缀合至N端，而不会碰撞肽中的内部赖氨酸残基。在一些实施方案中，肽可设计成使得它们不含可缀合赖氨酸残基。在一些方面，肽与N端丝氨酸或苏氨酸残基的缀合可经由氧化偶联实现。在一些实施方案中，缀合可通过将一个部分缀合至肽文库中的肽中的赖氨酸来实现。
在本公开的一些方面，可通过结合缀合物将缀合肽从肽文库中的典型地被消化的肽片段的汇集物中分离。举例来说，可通过选择性结合缀合物将缀合肽固定至表面上。在某些方面，使肽的N端与生物素或棕榈酸缀合以便在用胰蛋白酶蛋白水解后进行回收。任何适合的缀合-粘合剂组合均可用于分离本公开的肽。
在本公开的各个方面，缀合肽片段相对于文库中的其它缀合肽片段具有独特质谱标签。在另外方面，缀合肽的质谱标签不同于相应非缀合肽的质谱标签。在各个方面，缺乏N端缀合的肽的质谱标签不同于具有N端缀合的相应肽的质谱标签。
在各个方面，肽的缀合可在单一氨基酸处进行。在一些方面，所述氨基酸可以是半胱氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯基丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、鸟氨酸、脯氨酸、硒代半胱氨酸、丝氨酸或酪氨酸。在一种示例性情况下，氨基酸可以是半胱氨酸。在另外方面，缀合可在超过一个氨基酸处进行。在一些方面，所述超过一个氨基酸可以是半胱氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯基丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、鸟氨酸、脯氨酸、硒代半胱氨酸、丝氨酸或酪氨酸。
在本公开的一些方面，肽可以是缀合的以防止氧化。举例来说，半胱氨酸残基可在还原后缀合以防止半胱氨酸残基再氧化。任何适合的硫醇-烷基化剂均可用于防止半胱氨酸残基在还原之后再氧化。在某些方面，半胱氨酸残基与碘乙酰胺、N-乙基马来酰亚胺或碘乙酸缀合以防止半胱氨酸残基在还原之后再氧化。在各个方面，半胱氨酸残基与碘乙酰胺缀合。在某些方面，肽可与“重”碘乙酰胺缀合，从而使其能够用作缀合至标准(即“轻”)碘乙酰胺的材料的参考标准。此策略特别用于打结素肽文库，这归因于所述肽中的大量半胱氨酸残基。
在本公开的各个方面，缀合物原子可以是“重”的或“轻”的，这取决于原子的相对原子质量。举例来说，13C原子是“重”原子而12C原子是“轻”原子。在一些方面，举例来说，含有至少一个13C原子的缀合物相对于仅含有12C原子的缀合物是重的。举例来说，在一些方面，含有超过两个13C原子的缀合物相对于仅含有一个13C原子的缀合物是重的。在一些方面，除碳之外的原子可用于重缀合物和轻缀合物。
在一些实施方案中，可添加具有至少一个13C原子的缀合物。这些更重的缀合物可以其它方式与仅具有12C原子的缀合物相同，从而产生例如通过质谱法可检测的差异。举例来说，可向受试者施用两个相同的文库；一个文库可用棕榈酸(轻肽)进行N-末端标记，并且另一个可用含有五个13C原子的棕榈酸(重肽)进行N-末端标记。
具有13C原子的文库将更重约五个原子质量单位，但由于它化学上相同，它在质谱法中可具有相同电离性质(峰高)。从组织样品回收的材料可掺杂一些重文库并且使用5+位移峰来定量各未位移的峰的相对量。这是重要的，因为通常质谱法中的峰高不是定量的，而是反映肽的电离度。
在本公开的各个方面，可将重文库加标至含有未知量的轻文库成员的样品中。质谱分析期间观测到的重文库峰可然后用于帮助定量同一样品中出现的轻文库峰。
重文库还用于在特定程序之后监测文库中的候选物的相对量。举例来说，可将少量重文库混合至标准文库中以确定相对峰高的基线。因为重文库化学上相同但质量不同，所以通过LC/MS/MS可见在此混合物中标准文库的每个成员具有与其相邻的重峰。这些重峰的高度将形成一种规格，通过所述规格可判断标准文库的成员的量。所以可例如将标准文库在血清中孵育以测试对血清蛋白酶的敏感性。在血清中孵育之后，可将材料加热以将血清蛋白酶失活，并且掺入重文库作为标准。然后，可将重材料的LC/MS/MS峰高与标准文库的峰高相比较以确定哪些文库成员经受蛋白水解。这里的中心点是可将重文库掺杂至标准文库中以提供参考峰。不同肽将仅仅基于其固有品质而差异“飞行”，从而独立于浓度影响其峰高，但它们将与其重对应物一样地飞行，除了重肽将因其质量而位移。所以重肽的峰高可用于校准标准肽的峰高以由峰高提供浓度。
在某些方面，本发明可利用通过多种方式轻肽和重肽的分析。举例来说，本发明包括确定通过不同施用途径向受试者施用的打结肽的分布曲线的方法。所述方法可包括例如向受试者施用轻打结肽，轻打结肽是通过第一递送途径施用并且具有与具有与轻打结肽相同的序列的重打结肽相比更低的分子量。所述方法还可以包括向受试者施用重打结肽，重打结肽是通过不同于第一递送途径的第二递送途径施用。所述方法可进一步包括比较获自受试者的组织或流体样品的轻打结肽的量和重打结肽的量，从而确定在受试者中分别基于第一和第二递送途径的轻打结肽和重打结肽的分布曲线。
在一些实施方案中，用于分析肽文库的缀合物可因至少一个15N原子、至少一个17O原子、至少一个18O原子、至少一个2H原子、至少一个3H原子、至少一个13C、14C、18F、37Cl、至少一个76Br、至少一个33S原子、34S原子、36S原子、至少一个29Si原子或至少一个30Si原子而彼此不同。在各个实施方案中，附接于所产生的文库中的肽的缀合物可因至少1个原子、至少2个原子、至少3个原子、至少4个原子、至少5个原子、至少6个原子、至少7个原子、至少8个原子、至少9个原子或至少10个原子的同位素取代而彼此不同。在一些实施方案中，本发明可包括可提供对经受住实验测试(例如BBB穿透率、口服生物利用率)的肽的定量评估的方法。对于这些方法，可使用同位素掺杂策略。各种肽的相对质量可通过多种方式改变。举例来说，本发明包括使用含有若干不同同位素偏差的部分以比较超过两个样品中的肽的相对丰度。还可使用不同于碳的同位素(例如氢/氘)。在一个实例中，肽的文库可分成两个部分：一些肽可缀合至具有正常同位素分布(例如大部分或全部是12C原子)的部分，而其它肽可缀合至相同但同位素更重的部分(例如含有已知数目的13C原子)。这两个轻肽和重肽的汇集物从化学观点来看可几乎相同(例如相同色谱洗脱时间)，但含13C的肽汇集物的质量将移至更重质量。质谱法中的峰高可不仅是肽丰度的函数而且还是肽电离度的函数。因此，各种肽的重形式可具有与其正常、更轻对应物相同的电离度。通过恰好在LC/MS之前将在实验中(例如来自动物的血液)回收的正常(例如大部分或全部是12C原子)肽样品与重文库的一部分进行掺杂，质量位移的重文库将形成与所回收的样品比较的一组参考峰。这些参考峰将出现在相同MS曲线中但将根据缀合物中的13C原子的数目向更重的方向移。因为重肽和正常(轻)肽化学上类似，所以它们将同时从LC(液相色谱)柱上洗脱并且具有相同电离度。然后，重样品和正常样品的相对峰高将准确反映两个样品中的肽的相对丰度。在一些实施方案中，肽可进一步包括用于促进从受试者的组织或流体纯化的部分。举例来说，可将生物素缀合至肽以帮助回收，或者可使用缀合物的抗体来回收荧光或“弹头(warhead)”缀合物。在某些实施方案中，肽还可以包括治疗性分子，诸如细胞毒性剂和/或毒素。在一些实施方案中，肽还可以包括药物候选物和/或候选接头。
使用文库的方法
由所述本文所描述的方法和系统产生和制备的文库可用于一系列应用。举例来说，潜在药物候选物文库可用于治疗性和/或诊断性目的。一些示例性用途包括但不限于将肽缀合至放射性标记和/或荧光分子用于生物显像，将肽连接至细胞毒性剂，使用用于体外诊断的肽来进行生物化学测定，以及例如用于兽医学用途、杀虫剂、抗生素、除草剂、防冻剂组合物以及抗蛇毒素。
如本领域普通技术人员将了解，本文所描述的所产生的肽文库可针对广泛范围的靶标(例如治疗靶标)进行定制。在一些实施方案中，靶标与多种疾病或病症有关。举例来说，一些靶标可包括但不限于磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2(GPC2)、原钙粘蛋白(1α(PCDHA1)、Cav2.2、Kv1.3、Nav1.2、NaV1.1、NaV1.7、NaV1.8、CIC-3、nAChR、NMDA-R、NPRA、GLP-1R、α1B-AR、NT-R-1、ACE、NET mTor、cMet、VEGF/VEGFR、c-Kit、PDGF/PDGFR、PI3K、HER2、EGFR、Orai1、CD47、Raf、NFκB、溴结构域蛋白、HATS、HDAC、LDH、IDH2、CD22、MIC、c-Myc、n-Myc、PHF5A、BUB1B、Bcl-2、k-Ras、Notch1、p53、α5β3、NKG2D、CTLA4/CD28和/或Mcl-1。
本发明还提供用于向受试者施用本文所描述的药物候选物以促进诊断性和/或治疗性应用的组合物。在某些实施方案中，组合物可包含药学上可接受的赋形剂。用于本发明中的药物赋形剂包括但不限于粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、包衣剂、甜味剂、调味剂以及着色剂。本领域技术人员将认识到其它药物赋形剂可用于本发明。如本文所用的术语“药物组合物”包括例如固体和/或液体剂型，诸如片剂、胶囊、丸剂等。
在一些实施方案中，药物候选物选自由小化学分子、生物制品以及肽组成的组。在某些实施方案中，多种药物候选物包括多种肽。
本发明的药物候选物(例如肽)可根据需要频繁地施用，包括每小时、每天、每周或每月施用。本发明的方法中所用的药物候选物(例如肽)可例如按剂量施用，所述剂量可视所使用的方法的需要而变化。本文所描述的药物候选物(例如肽)可以包括以下的多种方式向受试者施用：胃肠外、皮下、静脉内、气管内、鼻内、皮内、肌肉内、经结肠、经直肠、经尿道或腹膜内。在一些实施方案中，药物组合物可胃肠外、静脉内、肌肉内或经口施用。在一些实施方案中，药物候选物可全身施用。在一些实施方案中，组合物可瘤内和/或节内施用，诸如递送至受试者的淋巴结。在某些实施方案中，施用可包括肠道施用，包括经口施用、经直肠施用；以及通过胃喂食管或十二指肠喂食管施用。施用还可以包括静脉注射、动脉注射、肌肉注射、脑内、脑室内或皮下(在皮肤下)施用。在一些实施方案中，施用可通过包括经皮(涂覆至皮肤)的局部手段和吸入来实现。
包含本文所描述的药物候选物(例如肽)的口服药剂可以任何适合的形式来经口施用，诸如液体、片剂、胶囊等。口服制剂可进一步包衣或处理以防止或减少在胃中的溶解。本发明的组合物可使用本领域中已知的任何适合的方法向受试者施用。适用于本发明的制剂和递送方法是本领域中普遍熟知的。举例来说，本文所描述的药物候选物(例如肽)可与药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂一起被配制成药物组合物。组合物可按需要含有包括以下的药学上可接受的辅助物质以接近生理条件：pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂等，诸如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、失水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。
本发明的方法中所用的药物候选物可通过本领域中可用的任何适合的技术来施用。在一些实施方案中，可向单个受试者施用药物候选物的整个文库或子文库。此类施用可提供例如对大量药物候选物的药理学性质的快速分析。在向受试者施用之后，可获得样品并且例如通过诸如与串联质谱偶联的液相色谱等任何适合的分析方法进行分析。
施用本发明的文库和子文库可包括经由多种途径施用。在一些实例中，获自本发明的方法的候选物的文库或子文库可通过超过一种途径来施用，例如药物候选物(例如打结肽)的子文库可经口和静脉内施用。相同药物的不同施用途径可例如具有不同效果，包括不同药物吸收速率、不同的作用起始时间和持续时间。在一些实施方案中，本发明的文库可通过超过一种途径施用并且可针对包括以下的所需性质比较结果：作用部位的最大药物浓度、其它地方的最小药物浓度以及延长的药物吸附和避免快速穿过代谢。在某些实施方案中，可经口与静脉内向受试者施用文库，并且然后可分析(例如通过质谱法)脑组织以确定引起改善的穿过血脑屏障的候选物浓度的施用途径。
本发明进一步涉及用于鉴别具有药理学性质的药物候选物的文库的方法，其中所述方法包括分析在向受试者施用多种药物候选物之后从受试者分离的样品。在某些实施方案中，药物候选物的文库来自本文所提供的质量定义型药物候选物文库。在某些实施方案中，所述方法包括在分离的样品中鉴别具有所述药理学性质的至少一种药物候选物。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括使用药物候选物所共有的药理学性质来产生具有所述药理学性质的其它药物候选物。
在一些实施方案中，药理学性质包括口服生物利用率、穿过血脑屏障的能力、血脑屏障排阻、血清半衰期、穿透细胞的能力、进入亚细胞器或其它细胞结构域的能力或其组合。在某些实施方案中，药理学性质包括口服生物利用率。
在一些实施方案中，本公开涉及用于鉴别具有药理学性质的文库药物候选物的方法，其中所述方法包括向受试者施用多种文库药物候选物，其中文库药物候选物来自本文所提供的质量定义型药物候选物文库，从受试者获得包含多种文库药物候选物中的至少一些的样品；以及分析样品以确定具有所述药理学性质的多种文库药物候选物中的至少一些的身份。
在一些实施方案中，本公开提供用于鉴别具有药理学性质的药物候选物的方法，所述方法包括：向受试者施用包含多种药物候选物的组合物；从受试者获得包含多种药物候选物中的至少一些的样品；以及分析样品以确定具有所述药理学性质的药物候选物中的至少一些的身份。
在一些实施方案中，药理学性质包括口服生物利用率、穿过血脑屏障的能力、血脑屏障排阻、血清半衰期、穿透细胞的能力、进入亚细胞器或其它细胞结构域的能力、靶向器官或组织的能力、靶向癌组织的能力或其组合。在某些实施方案中，所述方法进一步包括产生包含具有所述药理学性质的肽中的至少一些的肽文库。
在一些实施方案中，第一递送途径和第二递送途径独立地选自口服途径、局部途径、经粘膜途径、静脉内途径、肌肉内途径以及吸入途径。在某些实施方案中，第一递送途径或第二递送途径包括口服途径。
用于本发明的文库或子文库的分析的样品包括获自受试者的任何样品。这些样品包括体内或体外获得的生物组织或流体来源的样品。此类样品的非限制性实例包括分离自受试者的体液(例如血液、血浆、血清、粘液、脊髓液或尿液)、器官、组织、级分以及细胞。样品还包括生物样品的切片，例如器官或组织的截面部分。来自受试者的组织样品可包括活检和/或尸检组织。组织样品还可以包括来自脑、肺、肾脏、肌肉、肝脏、心脏、胃、胰腺或任何其它器官的组织。样品还可以包括生物样品的提取物，例如来自生物流体(例如血液或尿液)的抗原。在一些实例中，本公开的文库可经由3种、4种或5种施用途径施用。在一些实施方案中，生物样品是哺乳动物的(例如大鼠、小鼠或人)。在某些实施方案中，生物样品来源于人。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括使用药物候选物所共有的药理学性质来产生具有所述药理学性质的其它药物候选物。在一些实施方案中，受试者是动物。在某些实施方案中，受试者是人。
在一些实施方案中，样品包括组织样品或流体样品。在某些实施方案中，流体样品包括血液、尿液、粘液或脊髓液。在某些实施方案中，样品包括血液。在一些实施方案中，组织样品包括活检或尸检组织。在某些实施方案中，组织包括来自脑、肺、肾脏、肌肉、肝脏、心脏、胃、胰腺或器官的组织。在一些实施方案中，受试者是动物。在一些实施方案中，受试者是人。
在一些实施方案中，样品包括组织样品或流体样品。在一些实施方案中，流体样品包括血液、尿液、粘液或脊髓液。在某些实施方案中，样品包括血液。在一些实施方案中，组织样品包括活检或尸检组织。在其它实施方案中，组织包括来自脑、肺、肾脏、肌肉、肝脏、心脏、胃、胰腺或器官的组织。
在本公开的一些方面，所述方法进一步包括建立药物候选物的结构与药理学性质之间的关系，并且在另外方面，建立基于所述关系的药物候选物的子集。
在本公开的一些方面，所述方法进一步包括在施用之后的所选持续时间内以所选时间间隔获得多个样品。在某些方面，时间间隔是5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟或60分钟。在另外方面，所选持续时间是1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、15小时、30小时、45小时、60小时、75小时、90小时、105小时或120小时。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括从受试者获得多个样品，各样品在施用多种肽之后在不同时间点获得。在一些实施方案中，所述方法进一步包括分析多个样品中的至少一些样品，以确定多个样品中的各样品中的具有所述药理学性质的肽中的至少一些的身份。在某些实施方案中，肽中的至少一些的身份使用质谱法确定，其中肽中的每一种包含通过质谱仪检测的独特质量标签或消化片段质量标签。在某些实施方案中，多种药物候选物包括大于五种药物候选物。在其它实施方案中，多种药物候选物包括大于10种药物候选物。在其它实施方案中，多种药物候选物包括大于100种药物候选物。在其它实施方案中，多种药物候选物包括大于1000种药物候选物。在其它实施方案中，多种药物候选物包括大于10000种药物候选物。在其它实施方案中，多种打结肽包括大于100种肽。在其它实施方案中，多种打结肽包括大于1000种肽。在其它实施方案中，多种打结肽包括大于10000种肽。
在一些实施方案中，多种药物候选物包括大于五种药物候选物、大于10种药物候选物、大于100种药物候选物、大于1000种药物候选物或大于10000种药物候选物。在一些实施方案中，多种药物候选物包括打结肽。在某些实施方案中，打结肽的独特质量标签或消化片段质量标签由打结肽的天然氨基酸序列限定。
一种用于鉴别具有药理学性质的药物候选物的方法，所述方法包括分析在向受试者施用多种药物候选物之后从受试者分离的样品；以及在所分离的样品中鉴别具有所述药理学性质的至少一种药物候选物。在一些实施方案中，药物候选物选自由小化学分子、生物制品以及肽组成的组。在某些实施方案中，多种药物候选物包括多种肽。在其它实施方案中，药理学性质包括口服生物利用率、穿过血脑屏障的能力、血脑屏障排阻、血清半衰期、穿透细胞的能力、进入亚细胞器或其它细胞结构域的能力、靶向器官或组织的能力、靶向癌组织的能力或其组合。
一种用于鉴别具有药理学性质的药物候选物的方法，所述方法包括向受试者施用包含多种药物候选物的组合物；从受试者获得包含多种药物候选物中的至少一些的样品；以及分析样品以确定具有所述药理学性质的药物候选物中的至少一些的身份。在一些实施方案中，药物候选物选自由小化学分子、生物制品以及肽组成的组。在某些实施方案中，多种药物候选物包括多种肽。在其它实施方案中，药理学性质包括口服生物利用率、穿过血脑屏障的能力、血脑屏障排阻、血清半衰期、穿透细胞的能力、进入亚细胞器或其它细胞结构域的能力、靶向器官或组织的能力、靶向癌组织的能力或其组合。在一些实施方案中，所述方法进一步包括从受试者获得多个样品，各样品在施用多种肽之后在不同时间点获得。在某些实施方案中，多种肽中的至少一种肽包含用于示踪受试者中的至少一种肽的可检测标记。在某些实施方案中，可检测标记包含近红外染料。
在一些实施方案中，第一递送途径和第二递送途径独立地选自口服途径、局部途径、经粘膜途径、静脉内途径、肌肉内途径以及吸入途径。在某些实施方案中，第一递送途径或第二递送途径包括口服途径。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括筛选肽中的至少一些，以鉴别哪些肽展现抑制蛋白质：蛋白质相互作用、抑制受体的拮抗作用、抑制激动剂与受体的结合、调控离子通道、抑制信号传导通路、活化信号传导通路和/或抑制蛋白质：小分子相互作用的活性。在其它实施方案中，蛋白质：蛋白质相互作用与选自由以下组成的组的疾病或病症有关：癌症、传染疾病、炎性疾病、免疫疾病、代谢疾病、心脏疾病、年龄相关疾病以及神经疾病。在某些实施方案中，蛋白质：蛋白质相互作用与癌症有关。
示例性方面
实施例1
表达肽构建体以产生打结素
此实施例描述一种用于在培养物中表达肽构建体并且极大地促进其特别是作为药物的开发的方法。
如图7中所示，可例如以基于慢病毒表达的方法表达各种打结素，所述基于慢病毒表达的方法可包括包装、转移并且然后表达，随后分离和/或纯化所表达的打结素肽。可使用若干编码构建体。在此实施例中，打结素肽的编码包括包括IgK SP-sFLAG-HIS-噬铁蛋白-TEV-打结素的多核苷酸构建体。一些示例性构建体的特定序列公开于以下序列章节中。图8示出了根据图7中所描述的方法制成的许多示例性打结素的凝胶数据。如所示，氯毒素(CTX)、糜蛋白酶抑制剂(CTI)、表皮调节素(EPI)、禾富毒素(HTX)、起泡蛋白(BUB)、马铃薯羧肽酶抑制剂(PCI)是适当折叠的。
图9示出了描述的制备打结素的汇集文库的示意图。在此实施例中，数千种打结素的序列可在寡核苷酸汇集物中编码(1)并且使用独特引物对进行选择性扩增(2)。DNA子文库可克隆至表达载体中，其产生打结素变体，所述打结素变体可例如具有可使用诸如质谱学的当前技术可解析的独特亲本质量标签和独特胰蛋白酶片段质量标签。
图10包括示例性打结素变体，其描述来自克隆打结素文库的代表性测序。序列示出了单轮文库克隆的原始测序数据。以灰色突出显示的序列部分是全长氯毒素变体，并且寡核苷酸合成的错误可解释截短和延长的肽序列。
使用此实施例中描述的方法，产生若干打结素骨架的变体并且进行分析。图11示出了关于例如禾富毒素、氯毒素以及糜蛋白酶抑制剂对3000成员打结素文库的SDS-PAGE分析。各SDS-PAGE凝胶柱显示在天然和还原条件下运行的3000个打结素蛋白质变体的汇集物的纯化样品。成对条带之间的迁移率变动指示二硫化物形成。
选择四个骨架来产生经定义的文库：禾富毒素、CTI、氯毒素以及表皮调节素。经由电脑模拟产生一系列目标氨基酸序列，使得各个文库的每个成员将具有拥有独特质量的胰蛋白酶片段；突变被选择成在结构上相邻的以产生结合表位。半胱氨酸未突变，并且尤其避免了赖氨酸以使得N端缀合是明确的。产生了各骨架的3000个变体，并且各骨架侧翼一组独特的PCR引物位点，使得四个子文库中的每一种均可独立地扩增。所有构建体均具有N端BamHI位点和C端NotI位点，并且在来自12000个寡核苷酸的汇集物的各子文库PCR扩增之后，使用标准技术将各子文库限制消化并且克隆至切割的亲本载体(弗林蛋白酶裂解与TEV裂解形式)中作为Lcn2融合蛋白。将HEK293细胞用此质粒文库以及为代达罗斯表达所需的辅助质粒转染并且在3-4天后收获培养基中的病毒。使用标准程序将病毒通过离心浓缩并且用于感染HEK293细胞以便产生蛋白质。我们已经发现TEV可裂解的构建体在产生文库时在技术上更容易处理，因为它允许通过镍树脂上的IMAC容易地回收融合物。在IMAC之后，将融合蛋白透析至PBS中并且将其用6xHis标记的TEV蛋白酶裂解过夜，并且随后通过使材料再次运行穿过镍树脂将Lcn2和蛋白酶移除。将含有裂解肽文库的流过物进一步纯化并且通过尺寸排阻色谱法(SEC)将缓冲液更换成10mM甲酸铵，并且将含有肽的级分汇集并且冻干。
采取两种方法进行克隆，无缝克隆(Invitrogen)和基于限制/连接的方法。无缝克隆用于典型地使用来自IDT的合成的“gBlock”制备单构建体。遵循制造商的说明书。限制/连接法是标准的并且用于如下的克隆文库：对来自CustomArray的汇集的寡核苷酸进行PCR以扩增相关子文库。将扩增的汇集物琼脂糖凝胶纯化并且使用Qiagen柱清除掉琼脂糖。将纯化片段用FaastDigest(Fermentas)BamHI和NotI消化并且连接至已用相同的两种限制性核酸内切酶切割的亲本载体中。对单例克隆(Singleton clone)进行序列验证，并且对各个文库的48个成员测序以验证文库质量。
将克隆的打结素或文库共转染至HEK293细胞中并且如所描述收集培养基(Daedalus：a robust，turnkey platform for rapid production of decigramquantities of active recombinant proteins in human cell lines using novellentiviral vectors.Bandaranayake AD，Correnti C，Ryu BY，Brault M，StrongRK，Rawlings DJ.Nucleic Acids Res.2011年11月；39(21)：e143.doi：10.1093/nar/gkr706.2011年9月12日电子出版)。使用镍IMAC分离融合蛋白并且用重组TEV蛋白酶裂解。将过量噬铁蛋白经由尺寸排阻色谱法移除，所述尺寸排阻色谱法是一种还允许缓冲液换成10mM甲酸铵的方法。然后，将含有打结素的级分冻干。经由SEC色谱法、反相HPLC、质谱法以及在SDS-PAGE中还原对比非还原样品的凝胶迁移来证实适当的折叠和肽均匀性。
使用3-10倍过量的可商购获得的活化酯缀合物在PBS中进行与棕榈酸、ICG或耐生物素化物酶生物素的缀合。当存在溶解性问题时添加乙腈。对单例进行RP-HPLC来纯化最终材料，并且通过透析将过量缀合物从文库中移除。
实施例2
产生质量索引肽文库和肽以用于药物开发
此实施例描述一种用于产生含有用于产生打结素的质量索引肽的肽文库的方法。此实施例还描述了对样品中的质量索引肽的分析。
经由电脑模拟产生肽佛手瓜胰蛋白酶抑制剂的3,000种变体的质量索引文库。肽中的所有赖氨酸残基均变成精氨酸残基。所得序列是：CPRILMRCRLDTDCFPTCTCRPSGFCG。将此序列的G1和S2添加至分子的N端。人工分析骨架的分子结构以鉴别序列的位置可改变而不会破坏骨架结构的部分。所鉴别的氨基酸残基包括M8、R9、L12、D13、T14、F17、P18、T19、T21、R23、P24、S25、G26。所鉴别的氨基酸是R23、P24、S25以及G26，并且分别位于β转角的位置1至4。
使用Python软件来产生五百万个序列的汇集物，使得各序列是独特的变体。通过改变汇集物中的各成员的氨基酸来产生序列，使得各成员含有长度在7-30个氨基酸范围内的完全胰蛋白酶肽。当进行还原和用碘乙酰胺烷基化时，完全胰蛋白酶肽在800-3500Da的质量范围内。
各变体相对于起始氨基酸序列的氨基酸改变的数目选自4与8之间的分布范围。分布是如下加以加权：4：15％，5：50％，6：20％，7：10％，8：5％。改变的位置从可能可变的位置的列项中随机选择。对于各氨基酸改变，要取代的氨基酸选自一组氨基酸。该组氨基酸适合于给定位置中的骨架的结构并且适当地加以加权以有利于更可能有利于适当折叠的氨基酸。不同结构分类中各氨基酸的权数如下：
β转角位置1：D：15，G：11，H：13，N：10，Q：15，S：13，T：10，Y：10
β转角位置2：D：12，E：14，G：10，N：10，Q：10，S：12，P：35
β转角位置3：D：18，G：21，H：12，N：10，Q：21，S：10
β转角位置4：G：16，N：10，Q：10，S：10，T：12，Y：10
所有其它位置：A：4，D：8，E：4，F：7，G：8，H：8，I：8，L：2，M：4，N：4，Q：4，R：8，S：7，T：4，V：4，W：6，Y：10
没有具有超过3个色氨酸残基的变体保留于汇集物中。选择汇集物的各成员的逆翻译来进行DNA合成。在DNA合成期间，n端GS部分的编码变成GGATCC。另外，向汇集物的各成员中添加5’序列AACTGCCATGTGCAACTCGTAAG和3’序列TAATGCGGCCGCGTTCTTAGTCACCTTGCATGGAC。选择逆翻译以使得不含BamHI(GGATCC)或NotI(GCGGCCGC)限制性位点，除非针对汇集物的特定成员来选择。
从可能的变体的汇集物，随机选择质量索引文库的成员。将成员一次一个添加至文库中，直至达到成员的所需数目为止。仅在添加成员保留文库的以下标准的情况下添加成员：
●各成员在0.15道尔顿(Dalton)内具有至多2个邻居，并且在90分钟梯度内预测的液相色谱(LC)保留时间是2.75分钟；
●每个成员具有在2.1汤普森(Thompson)内也具有至多2个邻居的7-25个氨基酸的至少一个胰蛋白酶的肽，并且预测的LC保留时间是2.75分钟，其在文库内的序列中是独特的。
随后，针对文库成员对3,000个有义链寡核苷酸以及3,000个完全反义互补寡核苷酸进行排序。
对文库的成员进行关于蛋白质表达的筛选。将文库的成员的样品制备为蛋白质混合物。将蛋白质混合物的样品用20mM DTT还原并且用25mM碘乙酰胺阻断。将蛋白质用胰蛋白酶按1/50的胰蛋白酶与蛋白质比率消化过夜(或约16-18小时)并且使用C18脱盐柱纯化。将1μg纯化肽样品注入与纳米流HPLC耦合的Orbitrap Elite杂交质谱仪(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)中。液相色谱/质谱设备和方法由以下组成：由用MagicC18AQ树脂(5μm，粒子；Michrom Bioresources，Auburn CA)填充的IntegraFrit(New Objective，Woburn，MA)制成的捕集柱(100μm×1.5cm)，随后是由用Magic C18AQ树脂(5μm，粒子；Michrom Bioresources)填充的PicoFrit(New Objective)制成的分析柱(75μm×27cm)。将柱子以通气柱配置串联连接至Eksigent 2D纳米-HPLC(Eksigent Technologies，Dublin，CA)上，以允许3uL/min的快速样品加载。
将肽样品使用90分钟非线性梯度通过LC-MS/MS如下进行分析：以5％乙腈加上0.1％甲酸(相对于水加上0.1％甲酸)开始，历时2分钟变成7％，然后历时90分钟变成35％，然后历时1分钟变成50％，在50％下保持9分钟，历时1分钟变成95％，在95％下保持5分钟，历时1分钟降至5％并且在5％下重新调控。用于肽分离的流速是300nL/min。
向纳米喷雾器尖端施加2.25kV的喷雾电压。质谱实验由以下组成：在Orbitrap(AGC目标值1e6，分辨率60K，及一个显微扫描、FT预览扫描开启)中的完全MS扫瞄，随后在线性离子阱中的多达5次MS/MS光谱采集。使用碰撞-诱导的解离，选择来自Orbitrap扫描的五个最强离子进行MS/MS(分离宽度2m/z，目标值1e4，碰撞能量35％，最大注射时间100ms)。使用动态排除询问较低丰度肽离子(重复计数1，重复持续时间30秒，排除列表尺寸100，排除时间45秒，排除质量宽度-0.55m/z低至1.55m/z高)。使用电荷态筛选，从而允许具有可鉴别的电荷态+2、+3和+4以及更高的任何离子的MS/MS。
对于含有目标肽的样品，使用以下数据分析方法。构建用于数据库检索的FASTA数据库，其含有整个UniProt人蛋白质组(2012/12/19)、来自佛手瓜胰蛋白酶抑制剂文库的预期3,000个蛋白质以及一组通常观察的污染蛋白质。将来自所有MS试验的原始机器输出文件转化成mzXML文件并且针对此FASTA数据库，配置有k得分评分算法的X！Tandem(版本2011.12.01.1)进行检索。检索参数如下：酶，胰蛋白酶；最大漏切位点，2；固定修饰，半胱氨酸上的甲酰胺基甲基化；潜在修饰，甲硫氨酸上的氧化；母体单同位素质量误差(monositopic mass error)，-1.5Da至2.5Da。
通过PeptideProphet(Trans-Proteomic Pipeline版本4.6)为肽鉴别分配概率，并且将所分配的概率＜0.95的所有鉴别弃去。基于那些变体所独有的胰蛋白酶肽的肽鉴别推断存在于样品中的变体。对于小鼠血浆和组织样品，遵循以上方法，除整个UniProt小鼠蛋白质组(2012/12/19)之外使用含有上文所描述的序列的FASTA数据库。
实施例3
使用缀合肽产生质量索引肽文库
此实施例描述一种用于产生含有可用于产生打结素的缀合的质量索引肽的肽文库的方法。此实施例进一步描述了对样品中的质量索引缀合肽的分析。
将肽缀合至生物素并且在用胰蛋白酶蛋白水解后重新从肽文库中获得。使得1000个佛手瓜胰蛋白酶抑制剂变体的文库按10mg/ml与3倍摩尔过量的生物素的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯在磷酸盐缓冲盐水中反应。缀合是严格地在肽的N端进行，因为文库被工程化为不含赖氨酸残基。
通过超滤移除过量生物素和NHS，并且将所得文库经由尾部静脉注射以100mg/kg向具有异种移植的人肿瘤的小鼠施用。在5、10、30以及60分钟时将小鼠处死，并且收集肿瘤、脑、血液以及肾脏并且机械均质化。通过离心将细胞和凝结材料移除并且将所得上清液与固定于珠粒上的亲和素一起在室温下在震荡下孵育30分钟。然后，用PBS将珠粒彻底洗涤并且煮沸以释放生物素化肽。然后使这些肽经受还原、(半胱氨酸残基的)烷基化、胰蛋白酶化以及LC/MS/MS分析以确定各种组织中的肽的身份。
在此方法的变化形式中，胰蛋白酶在机械均质化之前添加以打破在样品胰蛋白酶化期间可能已形成的与打结素肽的蛋白质-蛋白质相互作用。肽的回收同样使用亲和素珠粒，除了仅回收肽的N端。
除与生物素缀合之外，通过同位素标记产生其它肽文库。两种类型的文库均经由质谱法定量。将10mg/ml的具有1000个佛手瓜胰蛋白酶抑制剂变体的文库分成两半份。一半与3倍摩尔过量的同位素正常棕榈酸的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯在磷酸盐缓冲盐水中反应。另一半以相同方式处理，其中棕榈酸含有四个C13(同位素重)碳。添加足以使棕榈酸保持在溶液中的DMSO或DMF。在过夜(12-18小时)孵育之后通过用乙酸乙酯萃取移除过量棕榈酸。
同位素重文库在化学上与同位素正常文库相同，但按质量来区分。重文库通过静脉内给药以100mg/kg向动物施用，而同位素正常文库通过口腔灌洗施用于相同动物中。在文库施用之后20分钟将动物处死。收集血液并且使其凝结。通过离心移除细胞和凝结材料，并且将所得血浆用5mMTCEP还原，用碘乙酰胺烷基化，并且施加到C18固相萃取柱中。然后，用于0.5％ TFA中的增加百分比的乙腈冲洗柱子。N-末端棕榈基化肽在80％或更高浓度的乙腈下洗脱。然后，使此洗脱材料经受胰蛋白酶化和LC/MS/MS分析，并且直接比较同位素正常峰和重峰。观察到正常峰并且其对应于具有口服生物利用率的肽。
在此方案的变化形式中，将血浆在碘乙酰胺处理之后并且在将其施加至C18柱之前用胰蛋白酶处理。使用此方法，仅回收了各文库成员的N端胰蛋白酶肽并且可基于独特的性质来区别。
筛选由28种打结素肽组成的文库中以高亲和力结合于人源横纹肌肉瘤(例如癌症)细胞系A-204的那些。在暴露之前二十四小时，将细胞涂铺于涂有聚L-赖氨酸的6孔板(Corning)上并且使其在补充有10％ FBS(Hyclone)的RPMI-1640培养基(Life Technology)中生长至达到约85％汇合。将粘附细胞用3ml D-PBS(Life Technology)洗涤3次，并且与于D-PBS中的打结素文库(30μg/ml)一起在37C下孵育1h。将未结合的肽吸出，并且用D-PBS洗涤细胞3次，其中回收最后一次洗涤物用于分析。为洗脱结合的打结素，将细胞在37C下依次在1ml于D-PBS中的280mM NaCl以及560mM和1.12M NaCl中孵育5分钟。在最终洗脱之后，将细胞收集于HyPure Molecular Biology Grade Water(Hyclone)中。用三个冻融循环将细胞溶解，并且在浴槽式超声波仪中保持5分钟。裂解物的蛋白质浓度是基于使用Nanodrop 1000在280nm下的吸光度来定量，并且将样品稀释至在水中100μg/ml总蛋白。使用Strata-X脱盐柱(Phenomenex)将裂解物和洗脱样品脱盐。然后，将回收的肽还原，烷基化并且胰蛋白酶化，然后提交用于LC/MS-MS分析。单个打结素是通过其独特的胰蛋白酶肽标签从各样品中鉴别的。
实施例4
鉴别打结素的血清稳定性、半衰期以及组织归巢能力
此实例描述一种用于鉴别含有用于产生打结素的质量索引肽的打结素肽的方法。此实施例进一步描述了对样品中的质量索引肽的分析。
经由尾部静脉注射向六只小鼠给予质量索引打结素的文库。三只小鼠在5分钟时处死，三只在30分钟时处死。通过心脏穿刺收集血液并且将器官(脑、肝脏、肾脏)解剖用于分析。将组织在液氮中快速冷冻。随后将组织解冻、均质化并且通过质谱法进行分析以确定组织分布和半衰期估值。
实施例5
糜蛋白酶抑制剂突变耐受性的平行评估
此实施例描述了根据本公开的一个方面对糜蛋白酶抑制剂(CTI)的突变耐受性的评估。
进行基于芯片的寡核苷酸合成，以产生CTI的3000个突变体的集合。将突变体通过PCR扩增并且通过限制性消化并且连接至慢病毒系统中进行克隆。
图12描绘了通过反向蛋白质组学对CTI的突变耐受性的评估，产生了具有4-8个突变的CTI的3000个突变体，其各自具有独特的MS标签。这些病毒用于使HEK293细胞变成(inflect)汇集物，并且将所得肽分离，用胰蛋白酶消化，用碘乙酰胺处理，并且施加到LC/MS/MS Orbitrap Elite系统中，并且观察1595种蛋白质。示出了相较于全套有序蛋白质，在表达和观测的蛋白质中，在各位置处氨基酸的过度表现或表现不足。底部的线以下的氨基酸在所产生和观察的蛋白质的集合中根本未观察到。总地来说，与在有序蛋白质的集合中相比，精氨酸和色氨酸氨基酸很少会存在于所产生和观察的蛋白质中，而谷氨酸更可能存在。
虽然本文已显示和描述了本发明的优选实施方案，但对本领域技术人员来说将明显的是此类实施方案仅通过举例来提供。本领域技术人员现将想起许多变化、改变以及取代而不会背离本发明。应了解，在实践本发明时可使用本文所描述的本发明实施方案的各个替代方案。
以下权利要求书旨在限定本发明的范围，并且从而涵盖在这些权利要求书和其等效物的范围内的方法和结构。
序列
以下是目标基因的DNA和/或氨基酸序列以及本文鉴别的构建体。
用于无缝克隆的亲本构建体的构建：
SEQ ID NO：1-从pUC57 Xho/Bam切割并且连接至pCVL中的IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GG-亲本序列
GACTGAGTCGCCCGCTCGAGACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACTACAAGGACGAGCATCACCATCATCACCATGGTGGAAGCCAGGACTCCACCTCAGACCTGATCCCAGCCCCACCTCTGAGCAAGGTCCCTCTGCAGCAGAACTTCCAGGACAACCAATTCCAGGGGAAGTGGTATGTGGTAGGCCTGGCAGGGAATGCAATTCTCAGAGAAGACAAAGACCCGCAAAAGATGTATGCCACCATCTATGAGCTGAAAGAAGACAAGAGCTACAATGTCACCTCCGTCCTGTTTAGGAAAAAGAAGTGTGACTACTGGATCAGGACTTTTGTTCCAGGTTGCCAGCCCGGCGAGTTCACGCTGGGCAACATTAAGAGTTACCCTGGATTAACGAGTTACCTCGTCCGAGTGGTGAGCACCAACTACAACCAGCATGCTATGGTGTTCTTCAAGAAAGTTTCTCAAAACAGGGAGTACTTCAAGATCACCCTCTACGGGAGAACCAAGGAGCTGACTTCGGAACTAAAGGAGAACTTCATCCGCTTCTCCAAATCTCTGGGCCTCCCTGAAAACCACATCGTCTTCCCTGTCCCAATCGACCAGTGTATCGACGGCGGAGGTAGCGAAAACCTGTATTTTCAGGGAGGCGGCCGCTAAGGATCCCGGACCGCCTCTCC
NotI切割的是AACCTGTATTTTCAGGGAGGC-GCTAAGGATCCCGGACCGCCTCTCC
融合蛋白序列-由10个组成的原始集合-通过无缝克隆克隆至以上NotI切割的亲本中：
SEQ ID NO：2-IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GG-起泡蛋白
GACTGAGTCGCCCGCTCGAGACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACTACAAGGACGAGCATCACCATCATCACCATGGTGGAAGCCAGGACTCCACCTCAGACCTGATCCCAGCCCCACCTCTGAGCAAGGTCCCTCTGCAGCAGAACTTCCAGGACAACCAATTCCAGGGGAAGTGGTATGTGGTAGGCCTGGCAGGGAATGCAATTCTCAGAGAAGACAAAGACCCGCAAAAGATGTATGCCACCATCTATGAGCTGAAAGAAGACAAGAGCTACAATGTCACCTCCGTCCTGTTTAGGAAAAAGAAGTGTGACTACTGGATCAGGACTTTTGTTCCAGGTTGCCAGCCCGGCGAGTTCACGCTGGGCAACATTAAGAGTTACCCTGGATTAACGAGTTACCTCGTCCGAGTGGTGAGCACCAACTACAACCAGCATGCTATGGTGTTCTTCAAGAAAGTTTCTCAAAACAGGGAGTACTTCAAGATCACCCTCTACGGGAGAACCAAGGAGCTGACTTCGGAACTAAAGGAGAACTTCATCCGCTTCTCCAAATCTCTGGGCCTCCCTGAAAACCACATCGTCTTCCCTGTCCCAATCGACCAGTGTATCGACGGCGGAGGTAGCGAAAACCTGTATTTTCAGGGAGGCGATACCTGCGGCAGCGGCTATAATGTGGATCAGCGTCGTACCA ATAGCGGCTGCAAAGCGGGCAATGGCGATCGTCATTTTTGCGGCTGCGATCGT ACCGGCGTGGTGGAATGCAAAGGCGGCAAATGGACCGAAGTGCAGGATTGCG GCAGCAGCAGCTGCAAAGGCACCAGCAATGGCGGCGCGACCTGCTAATGCTAAGGATCCCGGA
SEQ ID NO：3-
SEQ ID NO：4-IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GG-吸引素
GACTGAGTCGCCCGCTCGAGACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACTACAAGGACGAGCATCACCATCATCACCATGGTGGAAGCCAGGACTCCACCTCAGACCTGATCCCAGCCCCACCTCTGAGCAAGGTCCCTCTGCAGCAGAACTTCCAGGACAACCAATTCCAGGGGAAGTGGTATGTGGTAGGCCTGGCAGGGAATGCAATTCTCAGAGAAGACAAAGACCCGCAAAAGATGTATGCCACCATCTATGAGCTGAAAGAAGACAAGAGCTACAATGTCACCTCCGTCCTGTTTAGGAAAAAGAAGTGTGACTACTGGATCAGGACTTTTGTTCCAGGTTGCCAGCCCGGCGAGTTCACGCTGGGCAACATTAAGAGTTACCCTGGATTAACGAGTTACCTCGTCCGAGTGGTGAGCACCAACTACAACCAGCATGCTATGGTGTTCTTCAAGAAAGTTTCTCAAAACAGGGAGTACTTCAAGATCACCCTCTACGGGAGAACCAAGGAGCTGACTTCGGAACTAAAGGAGAACTTCATCCGCTTCTCCAAATCTCTGGGCCTCCCTGAAAACCACATCGTCTTCCCTGTCCCAATCGACCAGTGTATCGACGGCGGAGGTAGCGAAAACCTGTATTTTCAGGGAGGCGATCAGAATTGCGATATTGGCAATATTACCAGCCAGTGCCAGA TGCAGCATAAAAATTGCGAAGATGCGAATGGCTGCGATACCATTATTGAAGAAT GCAAAACCAGCATGGTGGAACGTTGCCAGAATCAGGAATTTGAAAGCGCGGCG GGCAGCACCACCCTGGGCCCGCAGTAATGCTAAGGATCCCGGA
SEQ ID NO 5-
SEQ ID NO：6-IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GG-禾富毒素
GACTGAGTCGCCCGCTCGAGACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACTACAAGGACGAGCATCACCATCATCACCATGGTGGAAGCCAGGACTCCACCTCAGACCTGATCCCAGCCCCACCTCTGAGCAAGGTCCCTCTGCAGCAGAACTTCCAGGACAACCAATTCCAGGGGAAGTGGTATGTGGTAGGCCTGGCAGGGAATGCAATTCTCAGAGAAGACAAAGACCCGCAAAAGATGTATGCCACCATCTATGAGCTGAAAGAAGACAAGAGCTACAATGTCACCTCCGTCCTGTTTAGGAAAAAGAAGTGTGACTACTGGATCAGGACTTTTGTTCCAGGTTGCCAGCCCGGCGAGTTCACGCTGGGCAACATTAAGAGTTACCCTGGATTAACGAGTTACCTCGTCCGAGTGGTGAGCACCAACTACAACCAGCATGCTATGGTGTTCTTCAAGAAAGTTTCTCAAAACAGGGAGTACTTCAAGATCACCCTCTACGGGAGAACCAAGGAGCTGACTTCGGAACTAAAGGAGAACTTCATCCGCTTCTCCAAATCTCTGGGCCTCCCTGAAAACCACATCGTCTTCCCTGTCCCAATCGACCAGTGTATCGACGGCGGAGGTAGCGAAAACCTGTATTTTCAGGGAGGCGGCCATGCGTGCTATCGTAATTGCTGGCGTGAAGGCAATGATG AAGAAACCTGCAAAGAACGTTGCTAATGCTAAGGATCCCGGACCGCC
SEQ ID NO：7-
SEQ ID NO：8-IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GG-哈那毒素
GACTGAGTCGCCCGCTCGAGACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACTACAAGGACGAGCATCACCATCATCACCATGGTGGAAGCCAGGACTCCACCTCAGACCTGATCCCAGCCCCACCTCTGAGCAAGGTCCCTCTGCAGCAGAACTTCCAGGACAACCAATTCCAGGGGAAGTGGTATGTGGTAGGCCTGGCAGGGAATGCAATTCTCAGAGAAGACAAAGACCCGCAAAAGATGTATGCCACCATCTATGAGCTGAAAGAAGACAAGAGCTACAATGTCACCTCCGTCCTGTTTAGGAAAAAGAAGTGTGACTACTGGATCAGGACTTTTGTTCCAGGTTGCCAGCCCGGCGAGTTCACGCTGGGCAACATTAAGAGTTACCCTGGATTAACGAGTTACCTCGTCCGAGTGGTGAGCACCAACTACAACCAGCATGCTATGGTGTTCTTCAAGAAAGTTTCTCAAAACAGGGAGTACTTCAAGATCACCCTCTACGGGAGAACCAAGGAGCTGACTTCGGAACTAAAGGAGAACTTCATCCGCTTCTCCAAATCTCTGGGCCTCCCTGAAAACCACATCGTCTTCCCTGTCCCAATCGACCAGTGTATCGACGGCGGAGGTAGCGAAAACCTGTATTTTCAGGGAGGCGAATGCCGTTATCTGTTTGGCGGCTGCAAAACCACCAGCGATT GCTGCAAACATCTGGGCTGCAAATTTCGTGATAAATATTGCGCGTGGGATTTTA CCTTTAGCTAATGCTAAGGATCCCGGA
SEQ ID NO：9-
SEQ ID NO：10-IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GG-糜蛋白酶抑制剂
GACTGAGTCGCCCGCTCGAGACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACTACAAGGACGAGCATCACCATCATCACCATGGTGGAAGCCAGGACTCCACCTCAGACCTGATCCCAGCCCCACCTCTGAGCAAGGTCCCTCTGCAGCAGAACTTCCAGGACAACCAATTCCAGGGGAAGTGGTATGTGGTAGGCCTGGCAGGGAATGCAATTCTCAGAGAAGACAAAGACCCGCAAAAGATGTATGCCACCATCTATGAGCTGAAAGAAGACAAGAGCTACAATGTCACCTCCGTCCTGTTTAGGAAAAAGAAGTGTGACTACTGGATCAGGACTTTTGTTCCAGGTTGCCAGCCCGGCGAGTTCACGCTGGGCAACATTAAGAGTTACCCTGGATTAACGAGTTACCTCGTCCGAGTGGTGAGCACCAACTACAACCAGCATGCTATGGTGTTCTTCAAGAAAGTTTCTCAAAACAGGGAGTACTTCAAGATCACCCTCTACGGGAGAACCAAGGAGCTGACTTCGGAACTAAAGGAGAACTTCATCCGCTTCTCCAAATCTCTGGGCCTCCCTGAAAACCACATCGTCTTCCCTGTCCCAATCGACCAGTGTATCGACGGCGGAGGTAGCGAAAACCTGTATTTTCAGGGAGGCGAAATTAGCTGCGAACCGGGCAAAACCTTTAAAGATAAATGCA ATACCTGCCGTTGCGGCGCGGATGGCAAAAGCGCGGCGTGCACCCTGAAAGCG TGCCCGAATCAGTAATGCTAAGGATCCCGGA
SEQ ID NO：11-
SEQ ID NO：12-IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GG-毒素K
GACTGAGTCGCCCGCTCGAGACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACTACAAGGACGAGCATCACCATCATCACCATGGTGGAAGCCAGGACTCCACCTCAGACCTGATCCCAGCCCCACCTCTGAGCAAGGTCCCTCTGCAGCAGAACTTCCAGGACAACCAATTCCAGGGGAAGTGGTATGTGGTAGGCCTGGCAGGGAATGCAATTCTCAGAGAAGACAAAGACCCGCAAAAGATGTATGCCACCATCTATGAGCTGAAAGAAGACAAGAGCTACAATGTCACCTCCGTCCTGTTTAGGAAAAAGAAGTGTGACTACTGGATCAGGACTTTTGTTCCAGGTTGCCAGCCCGGCGAGTTCACGCTGGGCAACATTAAGAGTTACCCTGGATTAACGAGTTACCTCGTCCGAGTGGTGAGCACCAACTACAACCAGCATGCTATGGTGTTCTTCAAGAAAGTTTCTCAAAACAGGGAGTACTTCAAGATCACCCTCTACGGGAGAACCAAGGAGCTGACTTCGGAACTAAAGGAGAACTTCATCCGCTTCTCCAAATCTCTGGGCCTCCCTGAAAACCACATCGTCTTCCCTGTCCCAATCGACCAGTGTATCGACGGCGGAGGTAGCGAAAACCTGTATTTTCAGGGAGGCGTGTGCCGTGATTGGTTTAAAGAAACCGCGTGCCGTCATGCGA AAAGCCTGGGCAATTGCCGTACCAGCCAGAAATATCGTGCGAATTGCGCGAAA ACCTGCGAACTGTGCTAATGCTAAGGATCCCGGA
SEQ ID NO：13-
SEQ ID NO：14-IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GG-EGF表皮调节素核心
GACTGAGTCGCCCGCTCGAGACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACTACAAGGACGAGCATCACCATCATCACCATGGTGGAAGCCAGGACTCCACCTCAGACCTGATCCCAGCCCCACCTCTGAGCAAGGTCCCTCTGCAGCAGAACTTCCAGGACAACCAATTCCAGGGGAAGTGGTATGTGGTAGGCCTGGCAGGGAATGCAATTCTCAGAGAAGACAAAGACCCGCAAAAGATGTATGCCACCATCTATGAGCTGAAAGAAGACAAGAGCTACAATGTCACCTCCGTCCTGTTTAGGAAAAAGAAGTGTGACTACTGGATCAGGACTTTTGTTCCAGGTTGCCAGCCCGGCGAGTTCACGCTGGGCAACATTAAGAGTTACCCTGGATTAACGAGTTACCTCGTCCGAGTGGTGAGCACCAACTACAACCAGCATGCTATGGTGTTCTTCAAGAAAGTTTCTCAAAACAGGGAGTACTTCAAGATCACCCTCTACGGGAGAACCAAGGAGCTGACTTCGGAACTAAAGGAGAACTTCATCCGCTTCTCCAAATCTCTGGGCCTCCCTGAAAACCACATCGTCTTCCCTGTCCCAATCGACCAGTGTATCGACGGCGGAGGTAGCGAAAACCTGTATTTTCAGGGAGGCGTGAGCATTACCAAATGCAGCAGCGATATGAATGGCTATTGCC TGCATGGCCAGTGCATTTATCTGGTGGATATGAGCCAGAATTATTGCCGTTGCG AAGTGGGCTATACCGGCGTGCGTTGCGAACATTTTTTTCTGTAATGCTAAGGATCCCGGA
SEQ ID NO：15-
SEQ ID NO：16-IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GG-环杆菌素
GACTGAGTCGCCCGCTCGAGACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACTACAAGGACGAGCATCACCATCATCACCATGGTGGAAGCCAGGACTCCACCTCAGACCTGATCCCAGCCCCACCTCTGAGCAAGGTCCCTCTGCAGCAGAACTTCCAGGACAACCAATTCCAGGGGAAGTGGTATGTGGTAGGCCTGGCAGGGAATGCAATTCTCAGAGAAGACAAAGACCCGCAAAAGATGTATGCCACCATCTATGAGCTGAAAGAAGACAAGAGCTACAATGTCACCTCCGTCCTGTTTAGGAAAAAGAAGTGTGACTACTGGATCAGGACTTTTGTTCCAGGTTGCCAGCCCGGCGAGTTCACGCTGGGCAACATTAAGAGTTACCCTGGATTAACGAGTTACCTCGTCCGAGTGGTGAGCACCAACTACAACCAGCATGCTATGGTGTTCTTCAAGAAAGTTTCTCAAAACAGGGAGTACTTCAAGATCACCCTCTACGGGAGAACCAAGGAGCTGACTTCGGAACTAAAGGAGAACTTCATCCGCTTCTCCAAATCTCTGGGCCTCCCTGAAAACCACATCGTCTTCCCTGTCCCAATCGACCAGTGTATCGACGGCGGAGGTAGCGAAAACCTGTATTTTCAGGGAGGCGGCATTCCGTGCGGCGAAAGCTGCGTGTGGATTCCGTGCATTA GCGCGGCGCTGGGCTGCAGCTGCAAAAATAAAGTGTGCTATCGTAATTAATGCTAAGGATCCCGGA
SEQ ID NO：17-
SEQ ID NO：18-IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GG-布拉齐因
GACTGAGTCGCCCGCTCGAGACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACTACAAGGACGAGCATCACCATCATCACCATGGTGGAAGCCAGGACTCCACCTCAGACCTGATCCCAGCCCCACCTCTGAGCAAGGTCCCTCTGCAGCAGAACTTCCAGGACAACCAATTCCAGGGGAAGTGGTATGTGGTAGGCCTGGCAGGGAATGCAATTCTCAGAGAAGACAAAGACCCGCAAAAGATGTATGCCACCATCTATGAGCTGAAAGAAGACAAGAGCTACAATGTCACCTCCGTCCTGTTTAGGAAAAAGAAGTGTGACTACTGGATCAGGACTTTTGTTCCAGGTTGCCAGCCCGGCGAGTTCACGCTGGGCAACATTAAGAGTTACCCTGGATTAACGAGTTACCTCGTCCGAGTGGTGAGCACCAACTACAACCAGCATGCTATGGTGTTCTTCAAGAAAGTTTCTCAAAACAGGGAGTACTTCAAGATCACCCTCTACGGGAGAACCAAGGAGCTGACTTCGGAACTAAAGGAGAACTTCATCCGCTTCTCCAAATCTCTGGGCCTCCCTGAAAACCACATCGTCTTCCCTGTCCCAATCGACCAGTGTATCGACGGCGGAGGTAGCGAAAACCTGTATTTTCAGGGAGGCCAGGATAAATGCAAAAAAGTGTATGAAAATTATCCGGTGAGCA AATGCCAGCTGGCGAATCAGTGCAATTATGATTGCAAACTGGATAAACATGCGC GTAGCGGCGAATGCTTTTATGATGAAAAACGTAATCTGCAGTGCATTTGCGATT ATTGCGAATATTAATGCTAAGGATCCCGGA
SEQ ID NO：19-
SEQ ID NO：20-IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GG-氯毒素
GACTGAGTCGCCCGCTCGAGACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACTACAAGGACGAGCATCACCATCATCACCATGGTGGAAGCCAGGACTCCACCTCAGACCTGATCCCAGCCCCACCTCTGAGCAAGGTCCCTCTGCAGCAGAACTTCCAGGACAACCAATTCCAGGGGAAGTGGTATGTGGTAGGCCTGGCAGGGAATGCAATTCTCAGAGAAGACAAAGACCCGCAAAAGATGTATGCCACCATCTATGAGCTGAAAGAAGACAAGAGCTACAATGTCACCTCCGTCCTGTTTAGGAAAAAGAAGTGTGACTACTGGATCAGGACTTTTGTTCCAGGTTGCCAGCCCGGCGAGTTCACGCTGGGCAACATTAAGAGTTACCCTGGATTAACGAGTTACCTCGTCCGAGTGGTGAGCACCAACTACAACCAGCATGCTATGGTGTTCTTCAAGAAAGTTTCTCAAAACAGGGAGTACTTCAAGATCACCCTCTACGGGAGAACCAAGGAGCTGACTTCGGAACTAAAGGAGAACTTCATCCGCTTCTCCAAATCTCTGGGCCTCCCTGAAAACCACATCGTCTTCCCTGTCCCAATCGACCAGTGTATCGACGGCGGAGGTAGCGAAAACCTGTATTTTCAGGGAGGCATGTGCATGCCGTGCTTTACCACCGATCATCAGATGGCGCGTA AATGCGATGATTGCTGCGGCGGCAAAGGCCGTGGCAAATGCTATGGCCCGCAG TGCCTGTGCCGTTAATGCTAAGGATCCCGGA
SEQ ID NO：21-
用于BamH1/NotI克隆的亲本构建体的构建：
SEQ ID NO：22-IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GS-亲本序列
GACTGAGTCGCCCGCTCGAGACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACTACAAGGACGAGCATCACCATCATCACCATGGTGGAAGCCAGGACTCCACCTCAGACCTGATCCCAGCCCCACCTCTGAGCAAGGTCCCTCTGCAGCAGAACTTCCAGGACAACCAATTCCAGGGGAAGTGGTATGTGGTAGGCCTGGCAGGGAATGCAATTCTCAGAGAAGACAAAGACCCGCAAAAGATGTATGCCACCATCTATGAGCTGAAAGAAGACAAGAGCTACAATGTCACCTCCGTCCTGTTTAGGAAAAAGAAGTGTGACTACTGGATCAGGACTTTTGTTCCAGGTTGCCAGCCCGGCGAGTTCACGCTGGGCAACATTAAGAGTTACCCTGGATTAACGAGTTACCTCGTCCGAGTGGTGAGCACCAACTACAACCAGCATGCTATGGTGTTCTTCAAGAAAGTTTCTCAAAACAGGGAGTACTTCAAGATCACCCTCTACGGGAGAACCAAGGAGCTGACTTCGGAACTAAAGGAGAACTTCATCCGCTTCTCCAAATCTCTGGGCCTCCCTGAAAACCACATCGTCTTCCCTGTCCCAATCGACCAGTGTATCGACGGCGGAGGTAGCGAAAACCTGTATTTTCAGGGATCCTAATGTTGGCCATGATGTTAGGCGGCCGCTAAGGATCCCGGA
BamHI位点：GGATCC
NotI位点：GCGGCCGC
BamHI位点在打结素之前添加“GS”。此构建体可用于克隆文库。
在弗林蛋白酶裂解、BamHI/NotI克隆中亲本构建体的构建可包括理想化弗林蛋白酶，切割位点是RARYKRS-对于Bam HI位点可使用RARYKRGS。
SEQ ID NO：23-IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-弗林蛋白酶-GS-亲本序列
GACTGAGTCGCCCGCTCGAGACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACTACAAGGACGAGCATCACCATCATCACCATGGTGGAAGCCAGGACTCCACCTCAGACCTGATCCCAGCCCCACCTCTGAGCAAGGTCCCTCTGCAGCAGAACTTCCAGGACAACCAATTCCAGGGGAAGTGGTATGTGGTAGGCCTGGCAGGGAATGCAATTCTCAGAGAAGACAAAGACCCGCAAAAGATGTATGCCACCATCTATGAGCTGAAAGAAGACAAGAGCTACAATGTCACCTCCGTCCTGTTTAGGAAAAAGAAGTGTGACTACTGGATCAGGACTTTTGTTCCAGGTTGCCAGCCCGGCGAGTTCACGCTGGGCAACATTAAGAGTTACCCTGGATTAACGAGTTACCTCGTCCGAGTGGTGAGCACCAACTACAACCAGCATGCTATGGTGTTCTTCAAGAAAGTTTCTCAAAACAGGGAGTACTTCAAGATCACCCTCTACGGGAGAACCAAGGAGCTGACTTCGGAACTAAAGGAGAACTTCATCCGCTTCTCCAAATCTCTGGGCCTCCCTGAAAACCACATCGTCTTCCCTGTCCCAATCGACCAGTGTATCGACGGCGGAGGTAGCcgcgcgcgctataaacgcGGATCCTAATGTTGGCCATGATGTTAGGCGGCCGCTAAGGATCCCGGA
SEQ ID NO：24-IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GS-中期因子
GACTGAGTCGCCCGCTCGAGACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACTACAAGGACGAGCATCACCATCATCACCATGGTGGAAGCCAGGACTCCACCTCAGACCTGATCCCAGCCCCACCTCTGAGCAAGGTCCCTCTGCAGCAGAACTTCCAGGACAACCAATTCCAGGGGAAGTGGTATGTGGTAGGCCTGGCAGGGAATGCAATTCTCAGAGAAGACAAAGACCCGCAAAAGATGTATGCCACCATCTATGAGCTGAAAGAAGACAAGAGCTACAATGTCACCTCCGTCCTGTTTAGGAAAAAGAAGTGTGACTACTGGATCAGGACTTTTGTTCCAGGTTGCCAGCCCGGCGAGTTCACGCTGGGCAACATTAAGAGTTACCCTGGATTAACGAGTTACCTCGTCCGAGTGGTGAGCACCAACTACAACCAGCATGCTATGGTGTTCTTCAAGAAAGTTTCTCAAAACAGGGAGTACTTCAAGATCACCCTCTACGGGAGAACCAAGGAGCTGACTTCGGAACTAAAGGAGAACTTCATCCGCTTCTCCAAATCTCTGGGCCTCCCTGAAAACCACATCGTCTTCCCTGTCCCAATCGACCAGTGTATCGACGGCGGAGGTAGCGAAAACCTGTATTTTCAGAGCGATTGCAAATATAAATTTGAAAACTGGGGCGCGTGCGATGGCGGCACCGGCACCAAAGTGCGCCAGGGCACCCTGAAAAAAGCGCGCTATAACGCGCAGTGCCAGGAAACCATTCGCGTGACCAAACCGTGCTAATGCTGGATCCCGGACCGCCTCTCC
SEQ ID NO：25-
SEQ ID NO：26-IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GG-紫菌素A
GACTGAGTCGCCCGCTCGAGACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACTACAAGGACGAGCATCACCATCATCACCATGGTGGAAGCCAGGACTCCACCTCAGACCTGATCCCAGCCCCACCTCTGAGCAAGGTCCCTCTGCAGCAGAACTTCCAGGACAACCAATTCCAGGGGAAGTGGTATGTGGTAGGCCTGGCAGGGAATGCAATTCTCAGAGAAGACAAAGACCCGCAAAAGATGTATGCCACCATCTATGAGCTGAAAGAAGACAAGAGCTACAATGTCACCTCCGTCCTGTTTAGGAAAAAGAAGTGTGACTACTGGATCAGGACTTTTGTTCCAGGTTGCCAGCCCGGCGAGTTCACGCTGGGCAACATTAAGAGTTACCCTGGATTAACGAGTTACCTCGTCCGAGTGGTGAGCACCAACTACAACCAGCATGCTATGGTGTTCTTCAAGAAAGTTTCTCAAAACAGGGAGTACTTCAAGATCACCCTCTACGGGAGAACCAAGGAGCTGACTTCGGAACTAAAGGAGAACTTCATCCGCTTCTCCAAATCTCTGGGCCTCCCTGAAAACCACATCGTCTTCCCTGTCCCAATCGACCAGTGTATCGACGGCGGAGGTAGCGAAAACCTGTATTTTCAGGGAGGCAGCGCCATCAGCTGCGGCGAGACCTGCTTCAAGTTCAAGTGCTACACCCCCAGATGCAGCTGCAGCTACCCCGTGTGCAAGTAAGCTAAGGATCCCGGACCGCC
SEQ ID NO：27-
SEQ ID NO：28-IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GG-λ毒素
GACTGAGTCGCCCGCTCGAGACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACTACAAGGACGAGCATCACCATCATCACCATGGTGGAAGCCAGGACTCCACCTCAGACCTGATCCCAGCCCCACCTCTGAGCAAGGTCCCTCTGCAGCAGAACTTCCAGGACAACCAATTCCAGGGGAAGTGGTATGTGGTAGGCCTGGCAGGGAATGCAATTCTCAGAGAAGACAAAGACCCGCAAAAGATGTATGCCACCATCTATGAGCTGAAAGAAGACAAGAGCTACAATGTCACCTCCGTCCTGTTTAGGAAAAAGAAGTGTGACTACTGGATCAGGACTTTTGTTCCAGGTTGCCAGCCCGGCGAGTTCACGCTGGGCAACATTAAGAGTTACCCTGGATTAACGAGTTACCTCGTCCGAGTGGTGAGCACCAACTACAACCAGCATGCTATGGTGTTCTTCAAGAAAGTTTCTCAAAACAGGGAGTACTTCAAGATCACCCTCTACGGGAGAACCAAGGAGCTGACTTCGGAACTAAAGGAGAACTTCATCCGCTTCTCCAAATCTCTGGGCCTCCCTGAAAACCACATCGTCTTCCCTGTCCCAATCGACCAGTGTATCGACGGCGGAGGTAGCGAAAACCTGTATTTTCAGGGAGGCGTGTGCTGCGGCTACAAGCTGTGCCACCCCTGCTAAGCTAAGGATCCCGGACC
SEQ ID NO：29-
SEQ ID NO：30-IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GG-λ毒素NG
GACTGAGTCGCCCGCTCGAGACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACTACAAGGACGAGCATCACCATCATCACCATGGTGGAAGCCAGGACTCCACCTCAGACCTGATCCCAGCCCCACCTCTGAGCAAGGTCCCTCTGCAGCAGAACTTCCAGGACAACCAATTCCAGGGGAAGTGGTATGTGGTAGGCCTGGCAGGGAATGCAATTCTCAGAGAAGACAAAGACCCGCAAAAGATGTATGCCACCATCTATGAGCTGAAAGAAGACAAGAGCTACAATGTCACCTCCGTCCTGTTTAGGAAAAAGAAGTGTGACTACTGGATCAGGACTTTTGTTCCAGGTTGCCAGCCCGGCGAGTTCACGCTGGGCAACATTAAGAGTTACCCTGGATTAACGAGTTACCTCGTCCGAGTGGTGAGCACCAACTACAACCAGCATGCTATGGTGTTCTTCAAGAAAGTTTCTCAAAACAGGGAGTACTTCAAGATCACCCTCTACGGGAGAACCAAGGAGCTGACTTCGGAACTAAAGGAGAACTTCATCCGCTTCTCCAAATCTCTGGGCCTCCCTGAAAACCACATCGTCTTCCCTGTCCCAATCGACCAGTGTATCGACGGCGGAGGTAGCGAAAACCTGTATTTTCAGGGAGGCAACGGCGTGTGCTGCGGCTACAAGCTGTGCCACCCCTGCTAAGCTAAGGATCCCGGACC
SEQ ID NO：31-
SEQ ID NO：32-IgK-SF-H6-GGS-lcn2C-GGS-ENLYFQ-GG-马铃薯羧肽酶抑制剂
GACTGAGTCGCCCGCTCGAGACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACTACAAGGACGAGCATCACCATCATCACCATGGTGGAAGCCAGGACTCCACCTCAGACCTGATCCCAGCCCCACCTCTGAGCAAGGTCCCTCTGCAGCAGAACTTCCAGGACAACCAATTCCAGGGGAAGTGGTATGTGGTAGGCCTGGCAGGGAATGCAATTCTCAGAGAAGACAAAGACCCGCAAAAGATGTATGCCACCATCTATGAGCTGAAAGAAGACAAGAGCTACAATGTCACCTCCGTCCTGTTTAGGAAAAAGAAGTGTGACTACTGGATCAGGACTTTTGTTCCAGGTTGCCAGCCCGGCGAGTTCACGCTGGGCAACATTAAGAGTTACCCTGGATTAACGAGTTACCTCGTCCGAGTGGTGAGCACCAACTACAACCAGCATGCTATGGTGTTCTTCAAGAAAGTTTCTCAAAACAGGGAGTACTTCAAGATCACCCTCTACGGGAGAACCAAGGAGCTGACTTCGGAACTAAAGGAGAACTTCATCCGCTTCTCCAAATCTCTGGGCCTCCCTGAAAACCACATCGTCTTCCCTGTCCCAATCGACCAGTGTATCGACGGCGGAGGTAGCGAAAACCTGTATTTTCAGGGAGGCcagcagcatgcggatccgatttgcaacaaaccgtgcaaaacccatgatgattgcagcggcgcgtggttttgcc aggcgtgctggaacagcgcgcgcacctgcggcccgtatgtgggcTAATGCTAAGGATCCCGGACCG
SEQ ID NO：33-

Claims (147)

1.一种用于鉴别具有药理学性质的药物候选物的方法，所述方法包括：
分析在向受试者施用多种药物候选物之后从所述受试者分离的样品；以及
在所述分离的样品中鉴别具有所述药理学性质的至少一种药物候选物。
2.一种用于鉴别具有一种药理学性质的药物候选物的方法，所述方法包括：
向受试者施用包含多种药物候选物的组合物；
从所述受试者获得包含所述多种药物候选物中的至少一些的样品；以及
分析所述样品，以确定具有所述药理学性质的所述药物候选物中的所述至少一些的身份。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述药物候选物选自由小化学分子、生物制品以及肽组成的组。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述多种药物候选物包括多种肽。
5.如权利要求1或2所述的方法，其中所述多种药物候选物包括多种小化学分子。
6.如权利要求1或2所述的方法，其中所述多种药物候选物包括多种生物制品。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述药理学性质包括口服生物利用率、穿过血脑屏障的能力、血脑屏障排阻、血清半衰期、穿透细胞的能力、进入亚细胞器或其它细胞结构域的能力、靶向器官或组织的能力、靶向癌组织的能力或其组合。
8.如权利要求6所述的方法，其进一步包括产生包含具有所述药理学性质的肽中的至少一些的肽文库。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括筛选所述肽中的所述至少一些，以鉴别哪些肽展现抑制蛋白质：蛋白质相互作用、抑制受体的拮抗作用、抑制激动剂与受体的结合、调控离子通路、抑制信号传导通路、活化信号传导通路和/或抑制蛋白质：小分子相互作用的活性。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述蛋白质：蛋白质相互作用与选自由以下组成的组的疾病或病症有关：癌症、传染疾病、炎性疾病、免疫疾病、代谢疾病、心脏疾病、年龄相关疾病以及神经疾病。
11.如权利要求9或10所述的方法，其中所述蛋白质：蛋白质相互作用与癌症有关。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括从所述受试者获得多个样品，各样品在施用所述多种肽之后在不同时间点获得。
13.如权利要求12所述的方法，其进一步包括分析所述多个样品中的至少一些样品，以确定所述多个样品中的各样品中的具有所述药理学性质的所述肽中的至少一些的身份。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述肽中的至少一些的身份是使用质谱法确定的，其中所述肽中的每一种包含通过质谱仪检测到的独特的质量标签或消化片段质量标签。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多种药物候选物包括大于5种药物候选物、大于10种药物候选物、大于100种药物候选物、大于1000种药物候选物或大于10000种药物候选物。
16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多种肽中的至少一种肽包含用于示踪所述受试者中的至少一种肽的可检测的标记。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述可检测标记包括近红外染料。
18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多种肽中的至少一种肽包含缀合至所述至少一种肽的N端的疏水部分，其中所述至少一种肽展现与缺乏所述疏水部分的所述至少一种肽相比增加的半衰期。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述疏水部分包含疏水性荧光染料或者饱和或不饱和烷基。
20.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品包括组织样品或流体样品。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述流体样品包括血液、尿液、粘液或脊髓液。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述样品包括血液。
23.如权利要求20所述的方法，其中所述组织样品包括活检或尸检组织。
24.如权利要求20或23所述的方法，其中所述组织包括来自脑、肺、肾脏、肌肉、肝脏、心脏、胃、胰腺或器官的组织。
25.如前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括使用为所述药物候选物所共有的所述药理学性质来产生具有所述药理学性质的其它药物候选物。
26.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者是动物。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述受试者是人。
28.如前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括建立所述药物候选物的结构与药理学性质之间的关系。
29.如权利要求28所述的方法，其进一步包括基于所述关系选择药物候选物的子集。
30.如前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括在施用之后的所选持续时间内以所选时间间隔获得多个样品。
31.如权利要求30所述的方法，其中所选时间间隔是5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟或60分钟。
32.如权利要求30所述的方法，其中所选持续时间是1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、15小时、30小时、45小时、60小时、75小时、90小时、105小时或120小时。
33.一种产生质量定义型药物候选物文库的方法，所述方法包括：
产生多种药物候选物，所述药物候选物中的至少一些各具有独特质量标签或消化片段质量标签；
使用质谱法分析所述多种药物候选物，以测量药物候选物中的所述至少一些的独特质量标签或消化片段质量标签；以及
产生包含所述多种药物候选物中的所述至少一些的质量定义型药物候选物文库，所述药物候选物文库是基于药理学性质而产生，其中所述质量定义型药物候选物文库中的药物候选物的身份可以用所述药物候选物中的每一种的独特质量标签或消化片段质量标签来确定。
34.一种用于鉴别具有药理学性质的文库药物候选物的方法，所述方法包括：
分析在向受试者施用多种药物候选物之后从所述受试者分离的样品，其中所述文库药物候选物来自如权利要求33所述的质量定义型药物候选物文库；
在所述分离的样品中鉴别具有所述药理学性质的至少一种药物候选物。
35.一种用于鉴别具有药理学性质的文库药物候选物的方法，所述方法包括：
向受试者施用多种文库药物候选物，其中所述文库药物候选物来自如权利要求26所述的质量定义型药物候选物文库；
从所述受试者获得包含所述多种文库药物候选物中的至少一些的样品；以及
分析所述样品，以确定具有所述药理学性质的所述多种文库药物候选物中的至少一些的身份。
36.如权利要求33至35中任一项所述的方法，其中所述药理学性质包括口服生物利用率、穿过血脑屏障的能力、血脑屏障排阻、血清半衰期、穿透细胞的能力、进入亚细胞器或其它细胞结构域的能力或其组合。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述药理学性质包括口服生物利用率。
38.如权利要求33至37中任一项所述的方法，其中所述多种药物候选物包括大于五种药物候选物、大于10种药物候选物、大于100种药物候选物、大于1000种药物候选物或大于10000种药物候选物。
39.如权利要求33至35中任一项所述的方法，其中所述多种药物候选物包括打结肽。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述打结肽的独特质量标签或消化片段质量标签由所述打结肽的天然氨基酸序列限定。
41.如权利要求33至35中任一项所述的方法，其中所述多种药物候选物中的至少一种包含预定数目的重同位素原子，以改变所述至少一种药物候选物的独特质量标签或消化片段质量标签。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述重同位素原子包括13C或氘。
43.如权利要求39或40所述的方法，其中所述多种打结肽中的至少一种的独特质量标签或消化片段质量标签由缀合至所述至少一种打结肽的部分限定。
44.如权利要求40所述的方法，其中所述部分缀合至所述至少一种打结肽的N端。
45.如权利要求43或44所述的方法，其中所述部分包含预定数目的重同位素原子，以改变所述至少一种打结肽的独特质量标签或消化片段质量标签。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述重同位素原子包括13C或氘。
47.如权利要求39所述的方法，其中所述多种打结肽包括大于100种肽、大于1000种肽或大于10000种肽。
48.如权利要求33至47所述的方法，其进一步包括建立所述药物候选物的结构与药理学性质之间的关系。
49.如权利要求48所述的方法，其进一步包括基于所述关系选择药物候选物的子集。
50.如权利要求33至49中任一项所述的方法，其进一步包括在施用之后的所选持续时间内以所选时间间隔获得多个样品。
51.如权利要求50所述的方法，其中所选时间间隔是5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟或60分钟。
52.如权利要求50所述的方法，其中所选持续时间是1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、15小时、30小时、45小时、60小时、75小时、90小时、105小时或120小时。
53.一种确定通过不同施用途径向受试者施用的打结肽的分布曲线的方法，所述方法包括：
向所述受试者施用轻打结肽，所述轻打结肽是通过第一递送途径施用并且与具有与所述轻打结肽相同的序列的重打结肽相比具有更低分子量；
向所述受试者施用所述重打结肽，所述重打结肽通过不同于所述第一递送途径的第二递送途径施用；以及
比较获自所述受试者的组织或流体样品的所述轻打结肽的量与所述重打结肽的量，从而确定在所述受试者中分别基于所述第一和第二递送途径的所述轻打结肽和重打结肽的分布曲线。
54.一种确定通过不同施用途径向受试者施用的打结肽的分布曲线的方法，所述方法包括：
分析在向受试者施用包含轻打结肽的组合物之后从所述受试者分离的样品，所述轻打结肽是通过第一递送途径施用并且与具有与所述轻打结肽相同的序列的重打结肽相比具有更低分子量；
分析在向受试者施用包含所述重打结肽的组合物之后从所述受试者分离的样品，所述重打结肽通过不同于所述第一递送途径的第二递送途径施用；以及
比较获自所述受试者的组织或流体样品的所述轻打结肽的量与所述重打结肽的量，从而确定在所述受试者中分别基于所述第一和第二递送途径的所述轻打结肽和重打结肽的分布曲线。
55.如权利要求53或54所述的方法，其中所述轻打结肽与所述轻打结肽相比包含更少更重的同位素。
56.如权利要求53至55中任一项所述的方法，其中所述重打结肽比所述轻打结肽包含至少多一个13C原子或氘原子。
57.如权利要求53至56中任一项所述的方法，其中所述第一打结肽缀合至第一部分并且所述重打结肽缀合至第二部分。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述第一部分、第二部分或两者分别缀合至所述轻打结肽和重打结肽的N端。
59.如权利要求57所述的方法，其中所述第一部分、第二部分或两者包含疏水部分。
60.如权利要求53至59中任一项所述的方法，其中所述第一递送途径和第二递送途径独立地选自口服途径、局部途径、经粘膜途径、静脉内途径、肌肉内途径以及吸入途径。
61.如权利要求53至60中任一项所述的方法，其中所述第一递送途径或所述第递送二途径包括口服途径。
62.如权利要求57所述的方法，其中至少一个13C原子存在于所述第一部分、所述第二部分或两者中。
63.如权利要求53至62中任一项所述的方法，其中所述轻打结肽、所述重打结肽或两者在通过质谱法分析时具有独特质量标签或消化质量标签。
64.如权利要求53至63所述的方法，其进一步包括建立所述药物候选物的结构与药理学性质之间的关系。
65.如权利要求64所述的方法，其进一步包括基于所述关系选择药物候选物的子集。
66.如权利要求53至65中任一项所述的方法，其进一步包括在施用之后的所选持续时间内以所选时间间隔获得多个样品。
67.如权利要求66所述的方法，其中所选时间间隔是5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟或60分钟。
68.如权利要求66所述的方法，其中所选持续时间是1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、15小时、30小时、45小时、60小时、75小时、90小时、105小时或120小时。
69.一种用于鉴别具有药理学性质的药物候选物的方法，所述方法包括：
向受试者施用包含多种药物候选物的组合物；
从所述受试者获得包含所述多种药物候选物中的至少一些的样品；以及
分析所述样品，以确定具有所述药理学性质的所述药物候选物中的所述至少一些的身份。
70.如权利要求69所述的方法，其中所述药物候选物选自由小化学分子、生物制品以及肽组成的组。
71.如权利要求69所述的方法，其中所述多种药物候选物包括多种肽。
72.如权利要求69所述的方法，其中所述药理学性质包括口服生物利用率、穿过血脑屏障的能力、血脑屏障排阻、血清半衰期、穿透细胞的能力、进入亚细胞器或其它细胞结构域的能力、靶向器官或组织的能力、靶向癌组织的能力或其组合。
73.如权利要求71所述的方法，其进一步包括产生包括具有所述药理学性质的所述肽中的至少一些的肽文库。
74.如权利要求71所述的方法，其进一步包括筛选所述肽中的至少一些，以鉴别哪些肽展现抑制蛋白质：蛋白质相互作用、抑制受体的拮抗作用、抑制激动剂与受体的结合、调控离子通路、抑制信号传导通路、活化信号传导通路和/或抑制蛋白质：小分子相互作用的活性。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述蛋白质：蛋白质相互作用与选自由以下组成的组的疾病或病症有关：癌症、传染疾病、炎性疾病、免疫疾病、代谢疾病、心脏疾病、年龄相关疾病以及神经疾病。
76.如权利要求75所述的方法，其中所述蛋白质：蛋白质相互作用与癌症有关。
77.如权利要求71所述的方法，其进一步包括从所述受试者获得多个样品，各样品在施用所述多种肽之后在不同时间点获得。
78.如权利要求77所述的方法，分析所述多个样品中的至少一些样品，以确定所述多个样品中的各样品中的具有所述药理学性质的所述肽中的至少一些的身份。
79.如权利要求71所述的方法，其中所述肽中的至少一些的身份使用质谱法确定，其中所述肽中的每一种包含通过质谱仪检测到的独特质量标签或消化片段质量标签。
80.如权利要求69所述的方法，其中所述多种药物候选物包括大于五种药物候选物。
81.如权利要求69所述的方法，其中所述多种药物候选物包括大于10种药物候选物。
82.如权利要求69所述的方法，其中所述多种药物候选物包括大于100种药物候选物。
83.如权利要求69所述的方法，其中所述多种药物候选物包括大于1000种药物候选物。
84.如权利要求69所述的方法，其中所述多种药物候选物包括大于10000种药物候选物。
85.如权利要求71所述的方法，其中所述多种肽包括大于100种肽。
86.如权利要求71所述的方法，其中所述多种肽包括大于1000种肽。
87.如权利要求71所述的方法，其中所述多种肽包括大于10000种肽。
88.如权利要求71所述的方法，其中所述多种肽中的至少一种肽包含用于示踪所述受试者中的至少一种肽的可检测标记。
89.如权利要求88所述的方法，其中所述可检测标记包括近红外染料。
90.如权利要求71所述的方法，其中所述多种肽中的至少一种肽包含缀合至所述至少一种肽的N端的疏水部分，其中所述至少一种肽展现与缺乏所述疏水部分的所述至少一种肽相比增加的半衰期。
91.如权利要求90所述的方法，其中所述疏水部分包含疏水性荧光染料或者饱和或不饱和烷基。
92.如权利要求69所述的方法，其中所述样品包括组织样品或流体样品。
93.如权利要求92所述的方法，其中所述流体样品包括血液、尿液、粘液或脊髓液。
94.如权利要求69所述的方法，其中所述样品包括血液。
95.如权利要求92所述的方法，其中所述组织样品包括活检或尸检组织。
96.如权利要求92所述的方法，其中所述组织包括来自脑、肺、肾脏、肌肉、肝脏、心脏、胃、胰腺或器官的组织。
97.如权利要求69所述的方法，其进一步包括使用为所述药物候选物所共有的所述药理学性质来产生具有所述药理学性质的其它药物候选物。
98.如权利要求69所述的方法，其中所述受试者是动物。
99.如权利要求69所述的方法，其中所述受试者是人。
100.一种产生质量定义型药物候选物文库的方法，所述方法包括：
产生多种药物候选物，所述药物候选物中的至少一些各具有独特质量标签或消化片段质量标签；
使用质谱法分析所述多种药物候选物，以测量药物候选物中的所述至少一些的独特质量标签或消化片段质量标签；以及
产生包含所述多种药物候选物中的至少一些的质量定义型药物候选物文库，所述药物候选物文库是基于药理学性质而产生，其中所述质量定义型药物候选物文库中的药物候选物的身份可以所述药物候选物中的每一种的独特质量标签或消化片段质量标签来确定。
101.如权利要求100所述的方法，其中所述药理学性质包括口服生物利用率、穿过血脑屏障的能力、血脑屏障排阻、血清半衰期、穿透细胞的能力、进入亚细胞器或其它细胞结构域的能力或其组合。
102.如权利要求100所述的方法，其中所述药理学性质包括口服生物利用率。
103.如权利要求100所述的方法，其中所述药物候选物选自由小化学分子、生物制品以及肽组成的组。
104.如权利要求100所述的方法，其中所述多种药物候选物包括大于五种药物候选物。
105.如权利要求100所述的方法，其中所述多种药物候选物包括大于10种药物候选物。
106.如权利要求100所述的方法，其中所述多种药物候选物包括大于100种药物候选物。
107.如权利要求100所述的方法，其中所述多种药物候选物包括大于1000种药物候选物。
108.如权利要求100所述的方法，其中所述多种药物候选物包括大于10000种药物候选物。
109.如权利要求100所述的方法，其中所述多种药物候选物包括打结肽。
110.如权利要求109所述的方法，其中所述打结肽的独特质量标签或消化片段质量标签由所述打结肽的天然氨基酸序列限定。
111.如权利要求100所述的方法，其中所述多种药物候选物中的至少一种包含预定数目的重同位素原子，以改变所述至少一种药物候选物的独特质量标签或消化片段质量标签。
112.如权利要求101所述的方法，其中所述重同位素原子包括13C或氘。
113.如权利要求109所述的方法，其中所述多种打结肽中的至少一种的独特质量标签或消化片段质量标签由缀合至所述至少一种打结肽的部分限定。
114.如权利要求113所述的方法，其中所述部分缀合至所述至少一种打结肽的N端。
115.如权利要求113所述的方法，其中所述部分包含预定数目的重同位素原子，以改变所述至少一种打结肽的独特质量标签或消化片段质量标签。
116.如权利要求115所述的方法，其中所述重同位素原子包括13C或氘。
117.如权利要求109所述的方法，其中所述多种打结肽包括大于100种肽。
118.如权利要求109所述的方法，其中所述多种打结肽包括大于1000种肽。
119.如权利要求109所述的方法，其中所述多种打结肽包括大于10000种肽。
120.一种确定通过不同施用途径向受试者施用的打结肽的分布曲线的方法，所述方法包括：
向所述受试者施用轻打结肽，所述轻打结肽通过第一递送途径施用并且与具有与所述轻打结肽相同的序列的重打结肽相比具有更低分子量；
向所述受试者施用所述重打结肽，所述重打结肽通过不同于所述第一递送途径的第二递送途径施用；以及
比较获自所述受试者的组织或流体样品的所述轻打结肽的量与所述重打结肽的量，从而确定在所述受试者中分别基于所述第一和第二递送途径的所述轻打结肽和重打结肽的分布曲线。
121.如权利要求120所述的方法，其中所述轻打结肽与所述轻打结肽相比包含更少更重的同位素。
122.如权利要求120所述的方法，其中所述重打结肽比所述轻打结肽包含至少多一个13C原子或氘原子。
123.如权利要求120所述的方法，其中所述第一打结肽缀合至第一部分而所述重打结肽缀合至第二部分。
124.如权利要求123所述的方法，其中所述第一部分、第二部分或两者分别缀合至所述轻打结肽和重打结肽的N端。
125.如权利要求123所述的方法，其中所述第一部分、第二部分或两者包含疏水部分。
126.如权利要求120所述的方法，其中所述第一递送途径和第二递送途径独立地选自口服途径、局部途径、经粘膜途径、静脉内途径、肌肉内途径以及吸入途径。
127.如权利要求120所述的方法，其中所述第一递送途径或所述第二递送途径包括口服途径。
128.如权利要求120所述的方法，其中至少一个13C原子存在于所述第一部分、所述第二部分或两者中。
129.如权利要求120所述的方法，其中所述轻打结肽、所述重打结肽或两者在通过质谱法分析时具有独特质量标签或消化质量标签。
130.一种用于使受试者中的肿瘤显像的肽，所述肽包含含有具有至少三个D-氨基酸的氨基酸序列的氯毒素，并且所述肽具有被配置成结合于所述肿瘤的二级结构，其中所述肽进一步包含可检测标记。
131.如权利要求130所述的肽，其中所述肽中的氨基酸中的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％是D-氨基酸。
132.如权利要求130或131所述的肽，其具有与以下序列至少80％、83％、86％、89％、90％或92％相同的氨基酸序列：MCMPCFTTDHQMARXCDDCCGGXGRGXCYGPQCLCR，其中X选自K、A以及R。
133.一种包含与以下序列至少80％相同的氨基酸序列的肽：MCMPCFTTDHQMARXCDDCCGGXGRGXCYGPQCLCR，其中所述氨基酸序列中的氨基酸中的至少三个是D-氨基酸，其中X选自K、A以及R。
134.如权利要求133所述的肽，其中所述肽中的氨基酸中的至少50％、至少60％或至少70％是D-氨基酸。
135.如权利要求133-134中任一项所述的肽，其进一步包含可检测标记。
136.如权利要求130-135中任一项所述的肽，其中所述肽中的氨基酸全部是D-氨基酸。
137.如权利要求130-132或135-137中任一项所述的肽，其中所述可检测标记缀合至所述肽的N端或缀合至所述肽中的赖氨酸残基。
138.如权利要求137所述的肽，其中所述可检测标记包括近红外染料。
139.如权利要求137所述的肽，其中所述可检测标记包括花青染料。
140.一种组合物，其包含如权利要求130-139中任一项所述的肽或其组合。
141.一种检测受试者中的肽的方法，所述方法包括：
向所述受试者施用有效量的根据权利要求130-132中任一项所述的肽或根据权利要求135-139中任一项所述的肽或根据权利要求126所述的组合物，并且检测可检测标记。
142.如权利要求141所述的方法，其中所述检测包括通过检测所述可检测标记获得所述受试者中的一个区域的图像。
143.如权利要求142所述的方法，其中所述检测包括癌组织的术中可视化。
144.如权利要求142所述的方法，其中所述可检测标记的可视化指导所述受试者的肿瘤的手术移除。
145.一种治疗与表达氯毒素靶标的细胞相关的疾病的方法，所述方法包括：
向有需要的受试者施用治疗有效量的包含根据权利要求130-139所述的肽的药物组合物或如权利要求140所述的组合物，从而治疗所述疾病。
146.如权利要求145所述的方法，其中所述组合物的肽进一步包含细胞毒性剂、毒素、反义核苷酸、癌症药物、核苷酸药物、代谢调节剂、放射致敏剂、肽治疗剂、肽-药物缀合物或其组合。
147.如权利要求145或权利要求146所述的方法，其中所述疾病包括与以下相关的癌组织：神经胶质瘤、皮肤癌、肺癌、淋巴瘤、成神经管细胞瘤、前列腺癌、胰腺癌、乳房癌、乳腺癌、结肠癌、肉瘤、口腔鳞状细胞癌、血管外皮瘤或其组合。
CN201380072527.9A 2012-12-10 2013-12-10 用于筛选的方法 Pending CN105008393A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261735516P 2012-12-10 2012-12-10
US61/735,516 2012-12-10
US201361794685P 2013-03-15 2013-03-15
US61/794,685 2013-03-15
PCT/US2013/074218 WO2014093406A1 (en) 2012-12-10 2013-12-10 Methods for screening

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105008393A true CN105008393A (zh) 2015-10-28

Family

ID=49883268

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380072523.0A Pending CN105189540A (zh) 2012-12-10 2013-12-10 含脂质运载蛋白融合伴侣
CN201380072527.9A Pending CN105008393A (zh) 2012-12-10 2013-12-10 用于筛选的方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380072523.0A Pending CN105189540A (zh) 2012-12-10 2013-12-10 含脂质运载蛋白融合伴侣

Country Status (11)

Country Link
US (4) US10156559B2 (zh)
EP (2) EP2928914A1 (zh)
JP (2) JP2016505826A (zh)
CN (2) CN105189540A (zh)
AU (2) AU2013359429A1 (zh)
BR (2) BR112015013525A2 (zh)
CA (2) CA2913127A1 (zh)
IL (2) IL239262A0 (zh)
RU (2) RU2015126651A (zh)
SG (2) SG11201504602VA (zh)
WO (2) WO2014093406A1 (zh)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2569330B1 (en) 2010-05-11 2016-09-28 Fred Hutchinson Cancer Research Center Chlorotoxin variants, conjugates, and methods for their use
AU2013263349B2 (en) 2012-05-17 2016-09-08 Extend Biosciences, Inc Carriers for improved drug delivery
AU2013359429A1 (en) 2012-12-10 2015-07-09 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods for screening
US11559580B1 (en) 2013-09-17 2023-01-24 Blaze Bioscience, Inc. Tissue-homing peptide conjugates and methods of use thereof
KR101576904B1 (ko) * 2014-07-31 2015-12-14 (주)케어젠 파골세포 분화 및 활성 억제능을 갖는 펩타이드 및 이의 용도
US9789197B2 (en) 2014-10-22 2017-10-17 Extend Biosciences, Inc. RNAi vitamin D conjugates
CA2964463C (en) 2014-10-22 2024-02-13 Extend Biosciences, Inc. Therapeutic vitamin d conjugates
WO2016065052A1 (en) 2014-10-22 2016-04-28 Extend Biosciences, Inc. Insulin vitamin d conjugates
ES2938525T3 (es) * 2015-05-18 2023-04-12 Pieris Pharmaceuticals Gmbh Polipéptido de fusión anticanceroso
BR112017027985A2 (pt) * 2015-06-26 2018-08-28 Hutchinson Fred Cancer Res peptídeos terapêuticos e métodos de uso dos mesmos
CN107847554A (zh) * 2015-06-26 2018-03-27 弗莱德哈钦森癌症研究中心 治疗性肽及其使用方法
CN108135970B (zh) * 2015-09-09 2023-09-01 弗莱德哈钦森癌症中心 软骨归巢肽
WO2017083545A1 (en) * 2015-11-10 2017-05-18 Fred Hutchinson Cancer Research Center Nkg2d decoys
CN105348392B (zh) * 2015-11-18 2019-08-02 北京华金瑞清生物医药技术有限公司 一种Nav1.7抑制剂及其改造方法
US20190282661A1 (en) 2016-04-15 2019-09-19 Blaze Bioscience, Inc. Methods of treating breast cancer
EP3442555A4 (en) * 2016-04-15 2020-04-01 Blaze Bioscience, Inc. METHODS OF TREATING BREAST CANCER
US20190292243A1 (en) * 2016-08-22 2019-09-26 Fred Hutchinson Cancer Research Center Peptides and methods of use thereof
EP3503930A4 (en) 2016-08-29 2020-08-05 Fred Hutchinson Cancer Research Center CHELATING PLATFORM FOR DELIVERY OF RADIONUCLIDES
CN106699866A (zh) * 2016-12-13 2017-05-24 山西农业大学 一种鸡细胞外脂肪酸结合蛋白、原核表达及其纯化方法
EP3571215A4 (en) 2017-01-18 2020-12-30 Fred Hutchinson Cancer Research Center PEPTIDE COMPOSITIONS AND METHOD OF USE THEREOF TO INTERRUPT TEAD INTERACTIONS
AU2018236465A1 (en) * 2017-03-16 2019-08-22 Blaze Bioscience, Inc. Cartilage-homing peptide conjugates and methods of use thereof
EP3638290A4 (en) 2017-06-15 2021-04-07 Blaze Bioscience, Inc. KIDNEY HOMING PEPTIDE CONJUGATES AND METHOD OF USING THEREOF
CN107739410B (zh) * 2017-10-18 2021-07-30 南京鼓楼医院 CD3单链抗体-iRGD融合蛋白、制备及其作为抗肿瘤药物的应用
AU2018388583A1 (en) 2017-12-19 2020-06-11 Blaze Bioscience, Inc. Tumor homing and cell penetrating peptide-immuno-oncology agent complexes and methods of use thereof
AU2019233914A1 (en) * 2018-03-16 2020-09-24 Blaze Bioscience, Inc. Truncated cartilage-homing peptides and peptide complexes and methods of use thereof
WO2021126341A1 (en) * 2019-12-19 2021-06-24 Blaze Bioscience, Inc. Methods of treating vascular lesions and malformations

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997043301A2 (en) * 1996-05-10 1997-11-20 Novartis Ag Identification of members of combinatorial libraries by mass spectrometry
CN1791671A (zh) * 2003-03-21 2006-06-21 先灵公司 靶配体的筛选方法
CN101189257A (zh) * 2005-03-08 2008-05-28 阿雷斯贸易股份有限公司 脂质运载蛋白

Family Cites Families (115)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4444744A (en) 1980-03-03 1984-04-24 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibodies to cell surface antigens
DE3407582A1 (de) 1984-03-01 1985-09-05 Dornier System Gmbh, 7990 Friedrichshafen Schaltungsanordnung fuer einen regelkreis
WO1988002117A1 (en) 1986-09-19 1988-03-24 Scripps Clinic And Research Foundation Monoclonal paratopic molecule directed to human ganglioside gd2
US5591829A (en) 1987-05-29 1997-01-07 Matsushita; Shuzo Antibodies modified with toxic substance
US5051364A (en) 1989-02-16 1991-09-24 The Salk Institute For Biological Studies Anti-lipocortin-I and anti-lipocortin-II monoclonal antibodies
DE3909799A1 (de) 1989-03-24 1990-09-27 Behringwerke Ag Monoklonale antikoerper (mak) gegen tumorassoziierte antigene, ihre herstellung und verwendung
CA2066428C (en) 1989-09-08 2000-11-28 Bert Vogelstein Structural alterations of the egf receptor gene in human gliomas
US5223253A (en) 1989-09-28 1993-06-29 American Home Products Corporation Bovine vaccine compositions and method for preventing trichomonas infections using same
US5650489A (en) * 1990-07-02 1997-07-22 The Arizona Board Of Regents Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof
GB2250993B (en) 1990-11-21 1995-02-15 Inst Nat Sante Rech Med Stromelysin-3 and its application in the diagnosis and treatment of malignant breast cancer
US5750376A (en) 1991-07-08 1998-05-12 Neurospheres Holdings Ltd. In vitro growth and proliferation of genetically modified multipotent neural stem cells and their progeny
EP1243652A3 (en) 1991-09-20 2003-03-26 Amgen Inc., Glial derived neurotrophic factor
US5314992A (en) 1991-11-25 1994-05-24 Trustees Of Dartmouth College Lipocortin-1 receptor protein and its uses
EP0642353A1 (en) 1992-05-14 1995-03-15 Oncologix, Inc. Treatment of vascular leakage syndrome and collagenase induced disease by administration of matrix metalloproteinase inhibitors
MY116474A (en) 1993-01-14 2004-02-28 Cancer Res Campaign Tech Potentiation of temozolomide in human tumour cells
US5626862A (en) 1994-08-02 1997-05-06 Massachusetts Institute Of Technology Controlled local delivery of chemotherapeutic agents for treating solid tumors
US5688773A (en) 1994-08-17 1997-11-18 The General Hospital Corporation Method of selectively destroying neoplastic cells
US5985822A (en) 1994-12-09 1999-11-16 The Scripps Research Institute Inhibition of glial cell proliferation with N-CAM homophilic peptides
US5756340A (en) 1995-05-08 1998-05-26 The Regents Of The University Of California Insect control with multiple toxins
JP3809502B2 (ja) 1995-05-30 2006-08-16 二郎 有川 ハンタウィルス抗原蛋白質およびモノクローナル抗体
JPH0971599A (ja) 1995-09-06 1997-03-18 Nippon Seibutsu Kagaku Kenkyusho 鶏貧血ウイルス（ｃａｖ）感染鶏血清と高い反応性を示すポリペプチド及びこのポリペプチドに対する抗体、鶏貧血ウイルス感染の診断法及びワクチン
US5905027A (en) 1995-12-27 1999-05-18 Uab Research Foundation Method of diagnosing and treating gliomas
US6667156B2 (en) 1995-12-27 2003-12-23 Uab Research Foundation Diagnosis and treatment of neuroectodermal tumors
US6130101A (en) 1997-09-23 2000-10-10 Molecular Probes, Inc. Sulfonated xanthene derivatives
KR100581508B1 (ko) 1997-12-05 2006-05-22 가부시키가이샤 그린 펩티드 종양항원 펩티드 유도체
GB9809776D0 (en) 1998-05-07 1998-07-08 Nycomed Imaging As Method
DE69921151T2 (de) 1998-08-12 2005-06-02 Daiichi Pure Chemicals Co. Ltd. Fluorszierende marker
US6703381B1 (en) 1998-08-14 2004-03-09 Nobex Corporation Methods for delivery therapeutic compounds across the blood-brain barrier
DE69912444T3 (de) 1998-08-25 2010-05-06 University Of Washington, Seattle Schnelle quantitative analyse von proteinen oder proteinfunktionen in komplexen gemischen
US6214986B1 (en) 1998-10-07 2001-04-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of bcl-x expression
US6629040B1 (en) * 1999-03-19 2003-09-30 University Of Washington Isotope distribution encoded tags for protein identification
SE9901387D0 (sv) 1999-04-19 1999-04-19 Astra Ab New pharmaceutical foromaulations
US6849714B1 (en) 1999-05-17 2005-02-01 Conjuchem, Inc. Protection of endogenous therapeutic peptides from peptidase activity through conjugation to blood components
EP1216060A2 (de) 1999-09-14 2002-06-26 Biomedical Apherese Systeme GmbH Magnetische nanoteilchen mit biochemischer wirksamkeit und verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung
AUPQ339899A0 (en) * 1999-10-13 1999-11-04 University Of Queensland, The Novel molecules
WO2001037721A2 (en) 1999-11-22 2001-05-31 The Research Foundation Of State University Of New York Magnetic nanoparticles for selective therapy
DE10020376A1 (de) 2000-04-26 2001-11-08 Inst Zelltechnologie E V Dynamische Marker
WO2002036142A2 (en) 2000-11-03 2002-05-10 University Of Vermont And State Agricultural College Compositions for inhibiting grb7
US20020077921A1 (en) 2000-12-15 2002-06-20 Paul-David Morrison Method and apparatus for an interactive catalog
AU2002252160A1 (en) 2001-03-01 2002-09-19 Northwest Biotherapeutics, Inc. Connexin enhances chemotherapy-induced apoptosis in human cancer cells inhibiting tumor cell proliferation
WO2003008583A2 (en) 2001-03-02 2003-01-30 Sagres Discovery Novel compositions and methods for cancer
WO2003000203A2 (en) 2001-06-26 2003-01-03 Uab Research Foundation Chlorotoxin inhibition of cell invasion, cancer metastasis, angiogenesis and tissue remodeling
GB0115581D0 (en) * 2001-06-26 2001-08-15 Glaxo Group Ltd Method of mass spectometry
WO2003029462A1 (en) * 2001-09-27 2003-04-10 Pieris Proteolab Ag Muteins of human neutrophil gelatinase-associated lipocalin and related proteins
US6972326B2 (en) 2001-12-03 2005-12-06 Molecular Probes, Inc. Labeling of immobilized proteins using dipyrrometheneboron difluoride dyes
AU2003207835A1 (en) 2002-02-04 2003-09-02 Auburn University Peptides for recognition and targeting of glial cell tumors
US20030232013A1 (en) 2002-02-22 2003-12-18 Gary Sieckman Therapeutic and diagnostic targeting of cancers cells with tumor homing peptides
US20060088899A1 (en) 2002-05-31 2006-04-27 Alvarez Vernon L Combination chemotherapy with chlorotoxin
AU2003240496B2 (en) 2002-05-31 2008-01-10 Eisai Inc. Combination chemotherapy with chlorotoxin
US7563600B2 (en) * 2002-09-12 2009-07-21 Combimatrix Corporation Microarray synthesis and assembly of gene-length polynucleotides
US7560160B2 (en) 2002-11-25 2009-07-14 Materials Modification, Inc. Multifunctional particulate material, fluid, and composition
US20040101822A1 (en) 2002-11-26 2004-05-27 Ulrich Wiesner Fluorescent silica-based nanoparticles
MXPA05010062A (es) * 2003-03-21 2006-03-08 Schering Corp Metodo de deteccion selectiva de ligandos objetivo.
CA2528669A1 (en) 2003-06-09 2005-01-20 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating and diagnosing cancer
DE10328251A1 (de) 2003-06-24 2005-01-13 Toximed Gmbh Pharmazeutischer Wirkstoff
US20070275902A1 (en) 2003-11-26 2007-11-29 Transmolecular, Inc. Treatment of Phosphatidylinositol Phospholipid Disorders
ATE428779T1 (de) * 2003-12-18 2009-05-15 Biomethodes Verfahren zur ortspezifischen massenmutagenese
US20080153746A1 (en) 2004-04-06 2008-06-26 Transmolecular, Inc. Diagnosis and Treatment of Myeloid and Lymphoid Cell Cancers
DE602005019728D1 (de) 2004-04-06 2010-04-15 Transmolecular Inc Diagnose und behandlung von myeloid- und lymphoidzellenkrebs mit chlorotoxin oder derivat
WO2005107793A2 (en) 2004-05-06 2005-11-17 The Trustees Of Columbia University Ngal for reduction and amelioration of ischemic and nephrotoxic injuries
CA2569381A1 (en) 2004-07-21 2006-08-31 Ambrx, Inc. Biosynthetic polypeptides utilizing non-naturally encoded amino acids
US20090209615A1 (en) * 2004-09-27 2009-08-20 Stuart Lipton Inhibitors of matrix metalloproteinases to treat neurological disorders
GB0422901D0 (en) 2004-10-14 2004-11-17 Ares Trading Sa Lipocalin protein
KR100681763B1 (ko) 2005-02-28 2007-02-15 재단법인 목암생명공학연구소 인간 리포칼린 2를 유효성분으로 포함하는 암 전이 억제용약학적 조성물, 이를 이용한 암 전이 억제 방법
US7462446B2 (en) 2005-03-18 2008-12-09 University Of Washington Magnetic nanoparticle compositions and methods
US20070037232A1 (en) 2005-03-31 2007-02-15 Barasch Jonathan M Detection of NGAL in chronic renal disease
JP2008535494A (ja) 2005-04-07 2008-09-04 サグレシュ ディスカバリー， インコーポレイテッド 癌関連遺伝子（ｐｒｌｒ）
WO2006110582A1 (en) 2005-04-08 2006-10-19 Xcyte Therapies, Inc. Compositions and methods for the treatment of burns and sepsis
ES2360519T3 (es) 2005-04-22 2011-06-06 University Of Washington Conjugado de cianina-clorotoxina y procedimiento para la visualización intraquirúrgica del cáncer.
US7833979B2 (en) 2005-04-22 2010-11-16 Amgen Inc. Toxin peptide therapeutic agents
AU2005335491B2 (en) 2005-08-18 2010-11-25 Ambrx, Inc. Compositions of tRNA and uses thereof
WO2007117467A2 (en) 2006-03-31 2007-10-18 Transmolecular, Inc. Use of tm-601 for the diagnosis and treatment of tumors
WO2007137163A2 (en) 2006-05-19 2007-11-29 Georgia Tech Research Corporation Abc transporter ligand
CN100564517C (zh) 2006-09-21 2009-12-02 武汉大学 一种蝎抗神经胶质瘤肽及其制备方法和应用
CN101003788A (zh) 2006-09-21 2007-07-25 武汉大学 一种蝎抗肿瘤转移肽及其制备方法和应用
US7825093B2 (en) 2006-10-25 2010-11-02 Amgen Inc. Methods of using OSK1 peptide analogs
EP2369005B1 (en) 2007-06-21 2013-04-03 Technische Universität München Biological active proteins having increased in vivo and/or in vitro stability
US20090004105A1 (en) 2007-06-27 2009-01-01 Zhen Cheng Molecular imaging of matrix metalloproteinase expression using labeled chlorotoxin
CA2696303A1 (en) 2007-08-07 2009-02-12 Transmolecular, Inc. Chlorotoxins as drug carriers
WO2009029760A1 (en) 2007-08-31 2009-03-05 Iosemantics, Llc Quality assurance tools for use with source code and a semantic model
US20100215575A1 (en) 2007-10-12 2010-08-26 Transmolecular, Inc. Systemic Administration of Chlorotoxin Agents for the Diagnosis and Treatment of Tumors
US20090123970A1 (en) 2007-10-19 2009-05-14 Abbott Laboratories Glycosylated mammalian ngal and use thereof
US20090269777A1 (en) 2007-10-19 2009-10-29 Abbott Laboratories Immunoassays and kits for the detection of ngal
US8846036B2 (en) 2007-10-19 2014-09-30 Abbott Laboratories Antibodies that bind to mammalian NGAL and uses thereof
US20090124022A1 (en) 2007-10-19 2009-05-14 Abbott Laboratories Antibodies that bind to mammalian ngal and uses thereof
US20090123946A1 (en) 2007-10-19 2009-05-14 Abbott Laboratories Immunoassays and kits for the detection of ngal
US20090176274A1 (en) 2007-10-19 2009-07-09 Abbott Laboratories Glycosylated mammalian ngal and use thereof
CA2702611A1 (en) 2007-10-19 2009-04-23 Abbott Laboratories Immunoassays and kits for the detection of ngal
WO2009062520A1 (en) 2007-11-15 2009-05-22 Bioporto Diagnostics A/S Diagnostic use of individual molecular forms of a biomarker
CA2749108C (en) 2008-01-18 2017-06-27 Visen Medical, Inc. Intramolecularly-quenched fluorescent imaging agents
WO2009108762A2 (en) 2008-02-26 2009-09-03 The Penn State Research Foundation Methods and compositions for treatment of retinoid-responsive conditions
US8093060B2 (en) 2008-02-28 2012-01-10 Canon Kabushiki Kaisha Multisite phosphorylated peptide (protein) recognizing compound and detection method, imaging method, alzheimer's disease diagnosing method and reagent kit using the same
US8685370B2 (en) 2008-03-14 2014-04-01 Visen Medical, Inc. Integrin targeting agents and in-vivo and in-vitro imaging methods using the same
US8470607B2 (en) 2008-03-20 2013-06-25 Morphotek, Inc. Inhibition of angiogenesis
GB0807831D0 (en) 2008-04-29 2008-06-04 Cambridge Entpr Ltd Agents for imaging cell death
CN101270158B (zh) 2008-04-30 2010-12-22 武汉大学 一种靶向抗神经胶质瘤蛋白及制备方法和用途
AU2009246142A1 (en) 2008-05-15 2009-11-19 Transmolecular, Inc. Treatment of metastatic tumors
JP2009300110A (ja) 2008-06-10 2009-12-24 Olympus Corp 移植細胞の光学的検出方法又はイメージング方法
AU2009264214B2 (en) * 2008-06-24 2013-06-06 Technische Universitaet Muenchen Muteins of hNGAL and related proteins with affinity for a given target
US20100098637A1 (en) 2008-09-23 2010-04-22 The Regents Of The University Of Michigan Dye-loaded nanoparticle
CN101381405B (zh) 2008-09-24 2011-07-27 武汉摩尔生物科技有限公司 基因工程肿瘤靶向kct-w1多肽及制备方法和用途
JP2010085108A (ja) 2008-09-29 2010-04-15 Nano Factory:Kk 生体光イメージング用プローブ
US20100105150A1 (en) 2008-10-24 2010-04-29 Abbott Laboratories Isolated human autoantibodies to neutrophil gelatinase-associated lipocalin (ngal) and methods and kits for the detection of human autoantibodies to ngal
US20100331650A1 (en) * 2009-06-25 2010-12-30 Roche Diagnostics Operations, Inc. Episodic blood glucose monitoring system with an interactive graphical user interface and methods thereof
EP3483610A1 (en) 2009-11-09 2019-05-15 University Of Washington Center For Commercialization Functionalized chromophoric polymer dots and bioconjugates thereof
CN101921769B (zh) 2010-01-11 2012-07-25 山西大学 一种重组腺病毒及其制备方法和应用
WO2011094671A2 (en) 2010-01-29 2011-08-04 The Uab Research Foundation N-terminally conjugated polypeptides for targeted therapy and diagnosis
LT2531206T (lt) 2010-02-04 2017-09-25 Morphotek, Inc. Chlorotoksino polipeptidai ir konjugatai ir jų naudojimas
CN101824084A (zh) 2010-04-08 2010-09-08 山西大学 靶向性抗胶质瘤蛋白质及其应用
EP2569330B1 (en) 2010-05-11 2016-09-28 Fred Hutchinson Cancer Research Center Chlorotoxin variants, conjugates, and methods for their use
AU2011290751B2 (en) * 2010-08-16 2015-08-13 Pieris Ag Binding proteins for Hepcidin
DK2638173T3 (da) * 2010-11-08 2019-09-30 Univ Leland Stanford Junior Fusionsproteiner omfattende et manipuleret knottin-peptid og anvendelser deraf
CN107064330B (zh) 2010-12-28 2022-02-25 探索诊断投资公司 通过质谱法定量胰岛素
EP2748357B1 (en) 2011-09-07 2018-04-04 X-Chem, Inc. Methods for tagging dna-encoded libraries
AU2013359429A1 (en) 2012-12-10 2015-07-09 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods for screening

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997043301A2 (en) * 1996-05-10 1997-11-20 Novartis Ag Identification of members of combinatorial libraries by mass spectrometry
CN1791671A (zh) * 2003-03-21 2006-06-21 先灵公司 靶配体的筛选方法
CN101189257A (zh) * 2005-03-08 2008-05-28 阿雷斯贸易股份有限公司 脂质运载蛋白

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JENNIFER A. GETZ等: "Protease-Resistant Peptide Ligands from a Knottin Scaffold Library", 《ACS CHEM BIOL.》 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2013359429A2 (en) 2015-11-12
AU2013359429A1 (en) 2015-07-09
RU2015126650A (ru) 2017-01-12
US10156559B2 (en) 2018-12-18
AU2013359426A2 (en) 2015-11-05
RU2015126651A (ru) 2017-01-16
US20150316536A1 (en) 2015-11-05
US20140179560A1 (en) 2014-06-26
BR112015013525A2 (pt) 2017-11-14
WO2014093406A1 (en) 2014-06-19
IL239261A0 (en) 2015-07-30
JP2016505251A (ja) 2016-02-25
JP2016505826A (ja) 2016-02-25
EP2928914A1 (en) 2015-10-14
CA2913127A1 (en) 2014-06-19
AU2013359426A1 (en) 2015-07-09
BR112015013515A2 (pt) 2017-11-14
WO2014093403A1 (en) 2014-06-19
CA2913029A1 (en) 2014-06-19
IL239262A0 (en) 2015-07-30
SG11201504600UA (en) 2015-07-30
SG11201504602VA (en) 2015-07-30
US20190101528A1 (en) 2019-04-04
EP2928913A1 (en) 2015-10-14
CN105189540A (zh) 2015-12-23
US20150322123A1 (en) 2015-11-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105008393A (zh) 用于筛选的方法
US20230151068A1 (en) Peptide compositions and methods of use thereof for disrupting tead interactions
KR101972173B1 (ko) 클로로톡신 변이체, 접합체, 및 이의 사용 방법
JP5861223B2 (ja) プロタンパク質およびその使用方法
CN106995495A (zh) 修饰抗体组合物及其制备和使用方法
JP7186940B2 (ja) 血液－脳関門を移行する抗体変種及びその使用
JP7291797B2 (ja) ヒト化抗体およびその使用方法
CN107936109A (zh) 衍生自sage1的肿瘤抗原短肽
CN106478797B (zh) 源自于sage1的肿瘤抗原短肽
CN108218977A (zh) 源自于肿瘤抗原sage1的短肽
US10287572B2 (en) Protein scaffolds and methods of use
CN108250289A (zh) 源自于mage b6的肿瘤抗原短肽
CN110862449B (zh) 衍生自ssx的肿瘤抗原短肽
Rajani Untitled Document
WO2023235522A1 (en) Compositions and methods for selective depletion of egfr target molecules
CN116897161A (zh) 氯毒素衍生物及其用途
CN108203459A (zh) 源自于prame的肿瘤抗原短肽
CN108218976A (zh) 衍生自lmp1的肿瘤抗原短肽
CN108250286A (zh) 源自于pasd1的肿瘤抗原短肽
CN107266552A (zh) 源自于prame的肿瘤抗原短肽
Moore Engineering Cystine-Knot Peptides for Molecular Imaging of Cancer

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20151028

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication