JP2016505826A - スクリーニングの方法 - Google Patents

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Abstract

薬物候補を発見するための方法及びシステムが、開示される。方法及びシステムは、選択された薬理学的性質を有する潜在的薬物候補のサブライブラリー（例えば、ペプチドのサブライブラリー）を同定するためにスクリーニングされ得る潜在的薬物候補のライブラリー（例えば、ペプチドのライブラリー）を作製することを含むことができる。ペプチドライブラリーを作製及び使用する方法も、提供される。Ｄ−アミノ酸クロロトキシン及びＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体も、提供される。【選択図】 図４

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年１２月1０日出願の米国特許仮出願第６１／７３５，５１６号及び２０１３年３月１５日出願の同第６１／７９４，６８５号の利益を主張するものであり、それらの出願は両者とも全体が参照により本明細書に取り込まれる。
連邦政府による後援の研究の表明
本発明は、米国国立衛生研究所による契約番号Ｒ０１ＣＡ１３５４９１、ＮＩＨ ＲＯＩ ＡＩ０５９５４３、ＡＩ０９４４１９、及びＡＩ０９７７８６の下、米国政府による後援を受けてなされた。
創薬に向けた研究では、新しく有用な薬物を同定及び開発するために、多大な技術的及び金融的資源を利用し続ける。残念なことに、新薬の発見は、依然として困難な状態が続いている。例えば、患者の苦痛を緩和して処置の成功率を改善するためには、例えばダメージが少なく、より精密に標的を捉える癌治療を開発することが必須である。しかし数十年にわたる研究の後でさえ、科学者らは依然として、医薬の特性と癌の標的特性とを正しく組み合わせた治療化合物を同定することに苦闘している。
非常に様々なタイプの化合物が、異なる治療目的で研究及び追跡されてきた。例えば低分子化学分子及び高分子生物製剤（例えば、抗体）が、多様な治療用途で用いられ、様々な成功を収めてきた。一部の低分子ペプチドもまた、例えばその自然な効能により、薬物として有用であることが示されてきた。
数多くの薬物例が発見されたにもかかわらず、新しい創薬プラットフォーム、例えば改善された薬理学的性質を有する、有用な薬物の更なる同定、並びに潜在的薬物候補を作製及び分析するための改善された方法が、依然として求められている。
本発明は、創薬のプラットフォーム及び方法に関する。幾つかの態様において、本発明は、選択された薬理学的性質を有する潜在的薬物候補のサブライブラリー（例えば、ペプチドのサブライブラリー）を同定するためにスクリーニングされ得る潜在的薬物候補のライブラリー（例えば、ペプチドのライブラリー）を作製する方法に関する。ある特定の態様において、本発明は、同定された候補の薬理学的性質の追加的改変により更なる薬物開発のためのリード化合物になり得る薬物候補（例えば、ペプチド）を同定する方法に関する。本発明は、潜在的薬物候補のライブラリー（例えば、ペプチドのライブラリー）を作製する方法も包含する。様々な態様において、本開示は、薬理学的性質を有する薬物候補を同定する方法であって、複数の薬物候補を対象に投与した後、該対象から単離された試料を分析すること；及び該単離された試料中で、該薬理学的性質を有する少なくとも１つの薬物候補を同定すること、を含む、方法に関する。
幾つかの態様において、本開示は、薬理学的性質を有する薬物候補を同定する方法であって、複数の薬物候補を含む組成物を対象に投与すること；複数の薬物候補のうちの少なくとも幾つかを含む試料を該対象から得ること；及び該試料を分析して、該薬理学的性質を有する薬物候補の少なくとも幾つかの同一性を決定すること、を含む、方法に関する。
幾つかの態様において、本開示は、質量で定義された（mass-defined）薬物候補ライブラリーを作製する方法であって、複数の薬物候補を生成し、該薬物候補の少なくとも幾つかがそれぞれ特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャを有すること、及び質量分析を利用して該複数の薬物候補を分析して、該薬物候補の少なくとも幾つかに関して特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャを測定すること、を含む、方法に関する。ある特定の実施形態において、該方法は、薬理学的性質に基づいて作製された、該複数の薬物候補の少なくとも幾つかを含む質量で定義された薬物候補ライブラリーを作製することを含み、質量で定義された薬物候補ライブラリー内の薬物候補の同一性が、薬物候補それぞれの特有の質量シグネチャを又は消化フラグメント質量シグネチャにより決定され得る。
幾つかの態様において、本開示は、薬理学的性質を有する薬物候補のライブラリーを同定する方法であって、複数の薬物候補を対象に投与した後、該対象から単離された試料を分析することを含む、方法に関する。ある特定の実施形態において、薬物候補のライブラリーは、本明細書に示された質量で定義された薬物候補ライブラリーのものである。ある特定の実施形態において、該方法は、該単離された試料中で、該薬理学的性質を有する少なくとも１つの薬物候補を同定することを含む。
幾つかの態様において、本開示は、薬理学的性質を有するライブラリー薬物候補を同定する方法であって、本明細書に示された質量で定義された薬物候補ライブラリーのものである、複数のライブラリー薬物候補を対象に投与すること、該対象から、該複数のライブラリー薬物候補のうちの少なくとも幾つかを含む試料を得ること、及び該試料を分析して、該薬理学的性質を有する該複数のライブラリー薬物候補のうちの少なくとも幾つかの同一性を決定すること、を含む、方法に関する。
幾つかの態様において、本開示は、異なる投与経路により対象に投与されるノットのあるペプチド（knotted-peptides）の分布プロファイルを決定する方法であって、軽い結び目のあるペプチドを該対象に投与し、該軽い結び目のあるペプチドが、第一の送達経路により投与され、該軽い結び目のあるペプチドと同じ配列を有する重い結び目のあるペプチドよりも低い分子量を有すること；重い結び目のあるペプチドを該対象に投与し、該重い結び目のあるペプチドが、第一の送達経路とは異なる第二の送達経路により投与されること；並びに対象の組織又は体液試料から得られた軽い結び目のあるペプチドの量を重い結び目のあるペプチドの量と比較し、それによりそれぞれ第一の送達経路及び第二の送達経路に基づき、該対象における軽い結び目のあるペプチド及び重い結び目のあるペプチドの分布プロファイルを決定すること、を含む、方法を提供する。
幾つかの態様において、本開示は、対象の腫瘍を画像化するためのペプチドであって、少なくとも３つのＤ−アミノ酸を有するアミノ酸配列を含むクロロトキシンを含み、該腫瘍に結合するように構成された二次構造を有し、検出可能な標識をさらに含む、ペプチドを提供する。
本開示の幾つかの態様において、クロロトキシンターゲットを発現する細胞に関連する疾患を処置する方法であって、本開示によるペプチドを含む医薬組成物、又は本開示のペプチドを含む組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与し、それにより該疾患を処置することを含む、方法が提供される。
参照による取り込み
本明細書で言及された全ての発行物、特許、及び特許出願は、各発行物、特許、又は特許出願が具体的かつ個別に参照により取り込まれるのと同程度に、参照により本明細書に取り込まれる。
本発明の新規な特色は、詳細には添付の特許請求の範囲に示されている。本発明の特色及び利点のより良い理解は、本発明の原理を利用した例示的実施形態を示した以下の詳細な記載、及び添付の図面を参照することにより得られる。
本発明の実施形態による、様々なスカフォールドを示すゲル画像を提供する。 ＰＣＲアセンブリからタンパク質回収までの初期ライブラリー創出の図解を示す。表面残基（ＤＨＱループ）の１つの潜在的パッチを示して、初期ペプチドライブラリーのためのランダムな突然変異誘発アプローチを例示している。残基Ｋ１５及びＫ２３は、アラニンに対して化学的コンジュゲーションを容易にするように変異している。 本発明の一実施形態による、ペプチドライブラリーを作製する例示的方法を示している。 本発明の一実施形態による、ペプチドライブラリーを生成する例示的方法を示している。 本発明の一実施形態による、ノッチン（例えば、バブルプロテイン（bubble protein））を作製するのに用いられ得る例示的融合系を示している。 本発明の一実施形態による、質量分析を利用した大きなライブラリーの分析を示している。 本発明の一実施形態による、ノッチン変異体を発現するためにシデロカリン融合物を利用する例示的方法を示している。 本発明の一実施形態による、発現するノッチンスカフォールドのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している。 本発明の一実施形態による、プールされたライブラリーの生成の図解を提供する。図９Ｂは、９Ａの拡大図である。 本発明の一実施形態による、プールされたライブラリーの生成の図解を提供する。図９Ｂは、９Ａの拡大図である。 本発明の一実施形態による、クローン化されたノッチンライブラリーからの代表的シークエンシングデータを記載している。 本発明の複数の実施形態による、３０００の要素からなるノッチンライブラリーのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している。 本発明の一実施形態による、リバースプロテオミクスによる突然変異耐性の評価を示している。
本開示は、創薬のシステム及び方法に関する。ある特定の実施形態において、本開示は、所望の薬理学的性質を有する薬物候補を同定する方法に関する。さらなる態様において、本開示は、質量で定義された薬物候補ライブラリーを作製する方法に関する。他の態様において、本開示は、異なる投与経路により対象に投与された結び目のあるペプチドの分布プロファイルを決定する方法に関する。
選択されたライブラリーの作製
一態様において、本発明は、選択された薬理学的性質を有する潜在的薬物候補のサブライブラリー（例えば、低分子化学分子、生物製剤、ペプチド、及びそれらの任意の誘導体又はフラグメントのサブライブラリー）を同定するためにスクリーニングされ得る潜在的薬物候補のライブラリー（例えば、低分子化学分子、生物製剤、ペプチド、及びそれらの任意の誘導体又はフラグメントのライブラリー）を作製するための方法及びシステムに関する。１回に１つの潜在的薬物候補をスクリーニングする従来の薬物スクリーニング方法とは異なり、本発明は、最初、潜在的薬物候補（例えば、１００を超える候補）のライブラリーをスクリーニングして、ライブラリー内の候補の一部又は全てについてある特定の薬様の性質を探索する。ライブラリーのスクリーニングは、ライブラリー内の潜在的薬物候補の一部又は全てを対象に投与すること、及びどの薬物候補が該当する薬理学的性質を有するかを決定すること、を含むことができる。例えば潜在的薬物候補の大きなライブラリーを、非限定的に経口生物学的利用度、薬物動態、分布、ターゲティング能力、血清中半減期、組織透過性、腫瘍透過性、及び／又は血液脳関門透過性をはじめとするある特定の薬理学的性質についてスクリーニングすることができる。ライブラリーの初期スクリーニングを利用して、少なくとも１つの薬理学的性質を共有する潜在的薬物候補のサブライブラリーを同定し、それにより次のターゲットに基づくスクリーニング又は表現型のスクリーニングに最適な薬物候補のパネルを作製することができる。幾つかの実施形態において、ライブラリーのスクリーニングを利用して、１つを超える薬理学的性質を共有する潜在的薬物候補を同定することができる。幾つかの実施形態において、複数のペプチドのうちの少なくとも１つのペプチドは、該少なくとも１つのペプチドのＮ末端にコンジュゲートされた疎水性部分を含み、該少なくとも１つのペプチドは、該疎水性部分を欠く少なくとも１つのペプチドに比較して、半減期の増加を示す。特定の実施形態において、疎水性部分は、疎水性蛍光色素、又は飽和若しくは不飽和アルキル基を含む。
本開示の幾つかの態様において、該複数の薬物候補は、複数のペプチドを含む。
本開示の幾つかの態様において、該複数の薬物候補は、複数の低分子化学分子を含む。
本開示の幾つかの態様において、該複数の薬物候補は、複数の生物製剤を含む。
幾つかの実施形態において、薬理学的性質は、経口生物学的利用度、血液脳関門を通過する能力、血液脳関門による排除、血清中半減期、細胞を透過する能力、細胞内オルガネラ若しくは他の細胞内ドメインに侵入する能力、又はそれらの組み合わせを含む。ある特定の実施形態において、薬理学的性質は、経口生物学的利用度を含む。
本明細書で用いられる用語「薬物候補」は、ターゲット又は対象への影響を潜在的に誘起し得る任意の薬剤を意味する。幾つかの態様において、薬物候補は、治療効果を有し得る。模範的薬物候補としては、低分子化学分子、生物製剤、ペプチド、及びそれらの任意の誘導体又はフラグメントを挙げることができるが、これらに限定されない。
本明細書で用いられる「薬理学的性質」は、ターゲット又は対象への影響を誘起する薬物候補の潜在能力を特徴づけるために用いられ得る薬物候補の性質である。模範的な薬理学的性質としては、経口生物学的利用度、血液脳関門を通過する能力、血液脳関門による排除、血清中半減期、細胞を透過する能力、細胞内オルガネラ又は他の細胞内ドメインに侵入する能力などを挙げることができるが、これらに限定されない。
幾つかの実施形態において、ライブラリーのスクリーニングは、２つの薬理学的性質、３つの薬理学的性質、４つの薬理学的性質、５つの薬理学的性質、６つの薬理学的性質、７つの薬理学的性、８つの薬理学的性質、９つの薬理学的性質、又は１０の薬理学的性質を共有する候補を同定するために用いることができる。幾つかの実施形態において、ライブラリーのスクリーニングは、１０を超える薬理学的性を共有する潜在的薬物候補を同定するために用いることができる。
多数の薬物候補を対象に投与して、例えばどの薬物候補が該当する薬理学的性質を有するか、を決定するためにスクリーニングすることができる。例えば該方法は、５を超える薬物候補、１０を超える薬物候補、５０を超える薬物候補、１００を超える薬物候補、５００を超える薬物候補、１０００を超える薬物候補、１５００を超える薬物候補、２０００を超える薬物候補、３０００を超える薬物候補、５０００を超える薬物候補、８０００を超える薬物候補、又は１００００を超える薬物候補を投与することを含み得る。
幾つかにおいて、ライブラリースクリーニングの実施形態は、血液脳関門を越える能力を備えた候補を同定するために用いることができる。ある特定の実施形態において、該スクリーニングを利用して、血清中半減期、経口生物学的利用度、タンパク質分解、毒性、クリアランス、細胞を透過する能力、又は細胞内オルガネラに侵入する能力に基づいて候補を同定することができる。幾つかの例において、該スクリーニングを利用して、１つを超える所望の薬理学的性質を備えたライブラリーの要素を同定することができる。例えば該スクリーニングを利用して、血液脳関門を越える能力、血液脳関門による排除、最適な血清中半減期、経口生物学的利用度、タンパク質分解の低下、細胞を透過する能力若しくは細胞内オルガネラに侵入する能力、臓器若しくは組織をターゲットとする能力、及び／又は癌組織をターゲットとする能力などの性質の２つ以上を示す候補を同定することができる。幾つかの実施形態において、ペプチドのスクリーニングは、どのペプチドが、タンパク質：タンパク質相互作用を阻害する活性、リセプターの拮抗を阻害する活性、リセプターへのアゴニスト結合を阻害する活性、イオンチャネルを調節する活性、シグナル伝達経路を阻害する活性、シグナル伝達経路を活性化する活性、及び／又はタンパク質：低分子相互作用を阻害する活性を示すか、を同定するために実施することができる。該ペプチドの活性（例えば、タンパク質：タンパク質相互作用）を、例えば癌、感染性疾患、炎症性疾患、免疫疾患、代謝疾患、心臓疾患、加齢に関連する疾患、及び神経疾患などの疾患又は障害に関連づけることができる。
本明細書で用いられる用語「タンパク質：タンパク質相互作用」は、1つのタンパク質と別のタンパク質の間の、一過性又は永久になり得る物理的接触を意味する。第一のタンパク質と第二のタンパク質との相互作用により、第一のタンパク質又は第二のタンパク質のいずれかへの影響が誘発されて、その影響が第一若しくは第二、又はそれらの両方のタンパク質を検出可能な手法で変化させることができる。
幾つかの態様において、本発明のライブラリーを作製する方法は、先に記載されたような１つ以上の薬様特性を有する薬物候補（例えば、低分子化学分子、生物製剤、ペプチド、及びそれらの任意の誘導体又はフラグメント）のサブライブラリーを漸進的に増大させる反復工程を含み得る。例えば第一のスクリーニングにおいて、数千もの候補（例えば、低分子化学分子、生物製剤、ペプチド、及びそれらの任意の誘導体又はフラグメント）を、１つ以上の薬理学的性質、例えば細胞透過性、経口生物学的利用度、血清中半減期、血液脳関門の透過性、血液脳関門による排除、臓器若しくは組織をターゲットとする能力、及び／又は癌組織をターゲットとする能力についてテストすることができる。その後、ある特定の性質を有する同定された薬物候補を、再度スクリーニングして、他の薬理学的性質を有する候補の次のライブラリーを作製することができる。次のスクリーニングは、第一のスクリーニングで同定された薬物候補を任意の所望の数、含むことができる。候補の別のサブライブラリーを、第一のスクリーニング及び第二のスクリーニングの反復後に作製することができる。任意の数の反復を、利用することができる。幾つかの実施形態において、本発明のスクリーニング方法は、１回の反復、２回の反復、３回の反復、４、５回の反復、６回の反復、７回の反復、８回の反復、９回の反復、１０回の反復、１１回の反復、１２回の反復、１３回の反復、１４回の反復、１５回の反復、１６回の反復、１７回の反復、１８回の反復、１９回の反復、又は２０回の反復を含む。様々な反復でテストされる薬様特性は、各反復で同一であっても、又は異なっていてもよい。例えば１回目に、候補（例えば、ペプチド）のライブラリーを、脳血液関門を越える能力についてテストすることができる。２回目の反復では、ライブラリーを、血清中半減期を含む１つ以上の薬理学的性質についてテストすることができる。
さらに、例えば反復モデリング及び構造分析を通して、リード化合物同定のためにより良好な薬物選択を可能にする規則を、同定することができる。例えばペプチドは、ペプチドライブラリーにより、ペプチドにある特定の薬様特性を持たせる様々な共通特性を有することができる。どのペプチドが薬様特性を有する可能性が高いかの定義を支援する規則を、同定することができる。例えば規則としては、酸性／塩基性アミノ酸比、疎水性／親水性比若しくは絶対パーセンテージ、隣接するアミノ酸の置換、及び／又はペプチド内の構造ループの長さを挙げることができる。
幾つかの態様において、薬物候補は、低分子化学分子である。例えば低分子化学物質は、低分子化学分子のライブラリーにより、低分子化学分子に特定の薬様特性を持たせる様々な共通特性を有することができる。どの低分子化学分子が薬様特性を有する可能性が高いか、の定義を支援する規則を、同定することができる。様々な態様において、規則としては、潜在的薬物としての有用性を示す吸収、分布、代謝、及び排泄のパラメータを挙げることができる。例えば、規則としては、水素結合、親油性、分子量、ｐＫａ、極性表面積、形状、反応性、溶解度、浸透性、化学的安定性、代謝（第一及び二相）、タンパク質及び組織結合、輸送（例えば、取り込み、排出）、クリアランス、半減期、生物学的利用度、薬物−薬物相互作用、ＬＤ５０などを挙げることができる。
幾つかの実施形態において、規則としては、融合タンパク質の切断を容易にするためにライブラリーの要素の最初の残基をグリシンにすることを挙げることができる。規則として、プロリン及びシステイン残基が変異されないこと、又はαへリックスのグリシン突然変異が回避されることも挙げることができる。規則として、アミノ酸残基の全てを高疎水性アミノ酸に変換する突然変異スキームを回避することも挙げることができる。疎水性の酸の例としては、フェニルアラニン、トリプトファン、イソロイシン、ロイシン、バリン、及びメチオニンが挙げられる。他の例において、規則により、一般的なタンパク質−タンパク質ホットスポット残基の突然変異への偏向を示すことができる。そのような残基としては、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、イソロイシン、ヒスチジン、アスパラギン酸、及びアルギニン部分を挙げることができる。幾つかの実施形態において、規則が、構造的に隣接する残基の突然変異に有利になり得る。例えばαへリックス内の突然変異が高度のαへリックス形成傾向を有するアミノ酸に偏向することで突然変異が回避されるよう、規則により要求することができる。そのようなアミノ酸の例としては、メチオニン、アラニン、ロイシン、グルタミン酸、リジン、アラニン、及びイソロイシンが挙げられる。規則により、αへリックス内のグリシン及びプロリンへの突然変異を回避することもできる。規則として、構造的に隣接する残基での突然変異を挙げることができる。規則として、ペプチド内に存在し得る任意のシステインノットを保存するために、変異されていない、そして／又は移動していないシステイン残基を保持することも挙げることができる。
幾つかの実施形態において、規則として、１つのペプチド構築物あたりの突然変異数を同定することも挙げることができる。幾つかの態様において、規則が、１つのペプチド構築物あたりに４〜８アミノ酸突然変異の範囲内の突然変異数を含んでいてもよい。幾つかの態様において、規則として、１つのペプチド構築物あたりに約４アミノ酸突然変異、約５アミノ酸突然変異、約６アミノ酸突然変異、約７アミノ酸突然変異、又は約８アミノ酸突然変異を挙げることができる。幾つかの態様において、規則として、Ｎ末端のペプチドライブラリーのコンジュゲーションを容易にするために、リジンがペプチド配列内に存在しないことを挙げることができる。規則を、ペプチドライブラリーのより容易な同定及び分析を促すように設計することもできる。例えば規則が、各ペプチドを特有の質量シグネチャ又は特有のフラグメント質量シグネチャにより順序どおり同定可能にすること、又はＭＳによる同定を支援することを含むことができる。
本明細書で用いられる用語「フラグメント」は、フラグメントが由来するペプチド又はタンパク質の切断により作製されるペプチド又はタンパク質の一部を指す。
本明細書で用いられる用語「質量シグネチャ」は、少なくとも１つのタンパク質又は少なくとも１つのペプチドのフラグメントの分析を実施することにより質量分析で出力されるピークのパターンを指す。質量シグネチャは、各フラグメントに特有であってもよく、又は質量シグネチャは、幾つかのフラグメントで同一であってもよい。
本発明は、選択されたライブラリーを作製することに加えて、ノッチン（又は結び目のあるペプチド）に基づく創薬にさらなる進展をもたらす。例えば本発明は、より長い血清中半減期（例えば、コンジュげーションによる）を有する結び目のあるペプチド、より良好な溶解度を有する結び目のあるペプチド、１０〜数百又は数千又はそれを超えるペプチドの範囲内の変異体のライブラリー多様性を生じるための時間及びコストに効率的な方法、適正にフォールディングされた結び目のあるペプチドを作製する方法、及び結び目のあるペプチドを高収率（例えば、ｍｇ量）で生成する方法を提供することができる。
幾つかの態様において、ライブラリーを作製する方法は、更なる薬物開発のためのリード化合物であることをより高い確率で立証し得る潜在的薬物候補のより効率的で集中的な選択をもたらす。例えば従来の創薬では、典型的には最初にターゲットを絞り、インビトロで能力を有する医薬リードを開発する。残念なことに、インビトロで同定された医薬リードは、例えばインビボで投与されると薬理学的性質又は投与などでの問題を有する可能性がある。例えば従来のアプローチでは、特定の薬物候補の生物学的機能を同定し、その後、血液脳関門透過性、血清中半減期などの課題は、後に決着させる。ほとんどの場合、活性分子を固定する試みはいずれも、活性を破壊する。本発明のアプローチは、ある意味で、例えば生物学的に関連する特性について選択された「事前選択された」ライブラリーをインビボでスクリーニングすること、所望の薬様特性及び薬理学的性質の改変／発展を指揮すること、並びに該当するリード化合物をより効率的かつ選択的に同定するために更にテスト及びスクリーニングされ得る何千もの変異体の効率的で迅速な合成を可能にすることによって、創薬をくつがえすものである。例えば最後の分子により求められる薬様の品質を既に有する分子のさらなるスクリーニングを限定することで、従来のアプローチでは後期まで同定され得ない、必須の薬理学的性質を欠く薬物候補の選択が回避されるよう支援することができる。
本発明のライブラリーを作製する方法は、潜在的薬物候補の任意のタイプに適用可能である。潜在的薬物候補の例としては、例えば対象の局所又は全身に作用する任意の生物学的、生理学的、又は薬理学的活性物質を挙げることができる。例えば、低分子化学分子、ペプチド、及び／又は高分子生物製剤（例えば、抗体）のライブラリーを、スクリーニングすることができる（例えば、インビトロ又はインビボで）。例えば、低分子薬の既存のライブラリーを選択して対象に投与し、該当する薬理学的性質を有する低分子薬のサブライブラリーを同定するために選択することができる。同様に、生物製剤（例えば、抗体）の既存のライブラリーを選択して対象に投与し、ある特定の薬理学的性質を有する低分子薬のサブライブラリーを同定することができる。本明細書にさらに記載される通り、本発明は、低分子化学分子及び／又は高分子生物製剤（例えば、抗体）に比較して特有の特性を提供し得るペプチドのスクリーニングをさらに含む。１つの例において、薬様特性をターゲットのものと適合させるように既に事前選択されたライブラリー（例えば、ペプチドライブラリー）に対して、該当する特定のターゲットをスクリーニングすることができる。例えばターゲットが、中枢神経系（ＣＮＳ）に存在すれば、血液脳関門を通過する薬物候補のライブラリーを、ＣＮＳターゲットに関してスクリーニングすることができる。あるいは、骨関節炎に関する薬物スクリーニングでは、軟骨をターゲットとするように設計されたライブラリーを利用することができる。リードが同定されたら、潜在的リード化合物の数を絞り込むために、変異体（例えば、何千もの変異体）を同じ方法で合成及びスクリーニングすることができる。
幾つかの実施形態において、本発明の方法は、潜在的薬物候補の低分子ライブラリーを作製するために用いることができる。例えば薬物候補は、Merck Index、The Physicians Desk Reference、及びThe Pharmacological Basis of Therapeuticsなどの周知の参考文献に記載されるもののような公知の薬物を挙げることができ、それには、生理学的環境に配置された後に生物活性になる又はより活性になる、薬剤；ビタミン；ミネラル補助食品；疾患若しくは疾病の処置、予防、診断、治癒若しくは鎮静に用いられる物質；身体の構造若しくは機能に影響を及ぼす物質；又はプロドラッグがあるが、それらに限定されない。候補としては、例えば低分子、抗生物質、抗ウイルス薬、抗真菌薬、エンジイン、重金属錯体、ホルモンアンタゴニスト、非特異性（非抗体）タンパク質、糖オリゴマー、アプタマー、オリゴヌクレオチド（例えば、ターゲットの核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ配列）に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド）、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、放射性核種、及び転写に基づく医薬品を挙げることもできる。幾つかの実施形態において、潜在的薬物候補として、核酸、ペプチド、低分子化学分子（例えば、医薬化合物）、及びペプチドミメティクスを挙げることができる。
ある特定の態様において、薬物候補は、合成又は天然の化合物（例えば、医薬低分子化合物及び／又はペプチド）の大きなライブラリーから提供することができる。一例が、ＦＤＡに認可された、ヒトに使用され得る化合物のライブラリーである。加えて、合成化合物のライブラリーは、メイブリッジケミカル社（英国コーンウォール州トレビレット）、コムジェネックス（ニュージャージー州プリンストン）、ブランドン・アソシエイツ（ニューハンプシャー州メリマック）、及びマイクロソース（コネチカット州ニューミルフォード）をはじめとする複数の会社から市販されており、希少化合物のライブラリーは、アルドリッチ（ウィスコンシン州ミルウォーキー）から入手できる。コンビナトリアルライブラリーは、入手すること、及び調製することができる。あるいは、細菌、真菌、植物及び動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーも、例えばパン・ラボラトリーズ若しくはマイコサーチなど、入手することができ、又は当該技術分野で周知の方法により容易に調製することができる。動物、細菌、真菌、葉及び樹皮をはじめとする植物源などの天然供給源から単離された化合物、並びに海洋試料を、潜在的に有用な医薬剤の存在に関する候補としてアッセイしてもよい。複数の商業的ライブラリーを、スクリーニングに直ちに使用することができる。そのようなライブラリーは、天然由来又は合成低分子の類似体を含むことができる。天然由来の低分子の非限定的例としては、アルカロイド、グリコシド、脂質、フェナジン、フェノール、ポリケチド、テルペン、テトラピロール、又は非リボソームペプチドが挙げられる。
潜在的薬物候補としてスクリーニングされる低分子は、２００〜１０００Ｄａであれば、その範囲内の分子量を有し得る。幾つかの実施形態において、潜在的薬物候補は、約２００〜９００Ｄａ、約２００〜８００Ｄａ、約２００〜７００Ｄａ、約２００〜６００Ｄａ、約２００〜５００Ｄａ約２００〜４００Ｄａ、約２００〜３００Ｄａ、約３００〜１０００Ｄａ、約３００〜９００Ｄａ約３００〜８００Ｄａ、約３００〜７００Ｄａ、約３００〜６００Ｄａ、約３００〜５００Ｄａ、約３００〜４００Ｄａ、約４００〜１０００Ｄａ、約４００〜９００Ｄａ、約４００〜８００Ｄａ、約４００〜７００Ｄａ、約４００〜６００Ｄａ、約４００〜５００Ｄａ、約５００〜１０００Ｄａ、約５００〜９００Ｄａ、約５００〜８００Ｄａ、約５００〜７００Ｄａ、約５００〜６００Ｄａ、約６００〜１０００Ｄａ、約６００〜９００Ｄａ、約６００〜８００Ｄａ、約６００〜７００Ｄａ、約７００〜１０００Ｄａ、約７００〜９００Ｄａ、約７００〜８００Ｄａ、約８００〜１０００Ｄａ、約８００〜９００Ｄａ、約９００〜１０００Ｄａ、約１０００〜１５００Ｄａ、約１５００〜２０００Ｄａ、約２０００〜２５００Ｄａ、約２５００〜３０００Ｄａ、約３０００〜３５００Ｄａ、約３５００〜４０００Ｄａ、約４０００〜４５００Ｄａ、又は約４５００〜５０００Ｄａの範囲内の分子量を有することができる。
幾つかの態様において、本発明は、結び目のあるペプチドを（「ノッチン」とも称される）の大きなライブラリーを作製するための方法及びシステムを含む。これらの種のペプチドは、多くの場合、有毒動物の毒液中に見出され、顕著な血清安定性を有するよう、そして特異的ターゲットに結合するように、何百万年にもわたって進化してきた。１つの例示的実施形態において、本発明は、潜在的薬物スカフォールドとしての、１５〜４０の、又は幾つかの実施形態において１１〜５７のアミノ酸からなる毒素様のジスルフィド結合ペプチドを含み得る結び目のあるペプチドに関する。これらの結び目のあるペプチドのライブラリーは、作製され、その後、薬物動態、分布、経口利用度、特異的組織分布又は標的化能力（例えば、腫瘍）などの適切な「薬様特性」を有するそれらのペプチド候補のライブラリーからのインビボ選択によりさらに分類することができる。作製されたペプチドライブラリー及び／又は個々の薬物ペプチドの幾つかの選択された特性としては、１）ＧＩ安定性／経口生物学的利用度、２）制御可能／プログラム可能な薬物動態、３）タンパク質／タンパク質相互作用を破壊する能力、４）血液脳関門を越える能力、５）細胞を透過する能力、特異的オルガネラ及び／又は細胞コンパートメントを透過する能力、６）選択可能な組織／臓器標的化のための潜在能力、７）造影剤又は造影薬に特異的にコンジュゲートされる能力、８）「プログラム可能な多様性」（例えば、ＤＮＡが固定され得る、変異し得る、又は選択的に変異し得る特異的位置をコードする）、９）容易な遺伝子操作（ペプチドがＤＮＡコード配列により「プログラムする」ことが可能であるため）、並びに１０）プログラム可能な細胞内標的化の潜在能力（例えば、核移行配列の組み込み）、を挙げることができる。
本発明は、例えばペプチドライブラリーを作製するための出発点として用いられ得る、ペプチドスカフォールドをさらに含む。幾つかの実施形態においてこれらのスカフォールドは、様々な結び目のあるペプチド（又はノッチン）から得ることができる。本明細書で参照される「結び目のあるペプチド」又は「ノッチン」は、例えば、ジスルフィドノット内のジスルフィドを特徴とする低分子ジスルフィドリッチタンパク質を含む。この結び目は、例えば１つのジスルフィド架橋が、２つの他のジスルフィドと、相互に連結されたバックボーンと、により形成された大環状分子に架かっている場合に得ることができる。幾つかの態様において、結び目のあるペプチドは、例えば増殖因子のシステインノット又は阻害剤のシステインノットを包含することができる。他の可能なペプチド構造としては、βシートを有さない２つのジスルフィド架橋により結合された２つの平行なへリックスを有するペプチド（例えば、ヘフトキシン）が挙げられる。スカフォールド用の幾つかの適切なペプチドとしては、クロロトキシン、ブラゼイン、サーキュリン（circulin）、ステクリスプ、ハナトキシン、ミドカイン、ヘフトキシン、ジャガイモカルボキシペプチダーゼ阻害剤、バブルプロテイン、アトラクチン、α−ＧＩ、α−ＧＩＤ、μ−ＰＩＩＩＡ、ω−ＭＶＩＩＡ、ω−ＣＶＩＤ、χ−ＭｒＩＡ、ρ−ＴＩＡ、コナントキンＧ、コンツラキンＧ、ＧｓＭＴｘ４、マルガトキシン、ｓｈＫ、トキシンＫ、キモトリプシン阻害剤（ＣＴＩ）、及びＥＧＦエピレグリンコアを挙げることができるが、それらに限定されない。図１に示す通り、これらのスカフォールドの幾つか、例えばエピレグリン、ヘフトキシン、バブル、クロロトキシン及びＣＴＩは、本発明の方法を用いて生成して、ゲルで同定することができる。
特定のスカフォールドに基づいて、スカフォールド変異体のより大きなライブラリーを作製することができる（例えば、数十、数百、数千、数万、数十万、又はそれを超える異なるスカフォールド変異体の多様性を有する）。ランダムな、又は所定の突然変異誘発を利用して、例えばスカフォールド変異体のライブラリーを設計することができる。幾つかの例において、該方法は、ペプチドスカフォールド内の保存されたアミノ酸残基、及び三次構造の形成に関与する残基を同定し、その後、必要なアミノ酸を保存し、他の位置を変異させるように設計されたヌクレオチドで該ペプチドをコードすることにより、制御された変異性を有するペプチドの生合成を含むことができる。例えばスカフォールドのループ領域を通るアミノ酸のスキャンを系統的に実施して、３つの残基パッチに突然変異誘発を加えて、その成果をタンデム質量分析により判定することができる。突然変異耐性領域が画定されたら、この情報を利用して、より多くの残基の突然変異を通してより大きなライブラリーを作製することができる。
幾つかの実施形態において、本明細書に記載された方法は、１０を超えるペプチド変異体、２０のペプチド変異体、３０のペプチド変異体、４０のペプチド変異体、５０のペプチド変異体、６０のペプチド変異体、７０のペプチド変異体、８０のペプチド変異体、９０のペプチド変異体、１００のペプチド変異体、１１０のペプチド変異体、１２０のペプチド変異体、１３０のペプチド変異体、１４０のペプチド変異体、１５０のペプチド変異体、１６０のペプチド変異体、１７０のペプチド変異体、１８０のペプチド変異体、１９０のペプチド変異体、２００のペプチド変異体、２１０のペプチド変異体、２２０のペプチド変異体、２３０のペプチド変異体、２４０のペプチド変異体、２５０のペプチド変異体、２６０のペプチド変異体、２７０のペプチド変異体、２８０のペプチド変異体、２９０のペプチド変異体、３００のペプチド変異体、３５０のペプチド変異体、４００のペプチド変異体、４５０のペプチド変異体、５００のペプチド変異体、５５０のペプチド変異体、６００のペプチド変異体、６５０のペプチド変異体、７００のペプチド変異体、７５０のペプチド変異体、８００のペプチド変異体、８５０のペプチド変異体、９００のペプチド変異体、９５０のペプチド変異体、１０００のペプチド変異体、１１００のペプチド変異体、１２００のペプチド変異体、１３００のペプチド変異体、１４００のペプチド変異体、１５００のペプチド変異体、１６００のペプチド変異体、１７００のペプチド変異体、１８００のペプチド変異体、１９００のペプチド変異体、２０００のペプチド変異体、２５００のペプチド変異体、３０００のペプチド変異体、３５００のペプチド変異体、４０００のペプチド変異体、４５００のペプチド変異体、５０００のペプチド変異体、６０００のペプチド変異体、７０００のペプチド変異体、８０００のペプチド変異体、９０００のペプチド変異体、１０，０００のペプチド変異体、１１，０００のペプチド変異体、１２，０００のペプチド変異体、１３，０００のペプチド変異体、１４，０００のペプチド変異体、１５，０００のペプチド変異体、１６，０００のペプチド変異体、１７，０００のペプチド変異体、１８，０００のペプチド変異体、１９，０００のペプチド変異体、２０，０００のペプチド変異体、２１，０００のペプチド変異体、２２，０００のペプチド変異体、２３，０００のペプチド変異体、２４，０００のペプチド変異体、２５，０００のペプチド変異体、２６，０００のペプチド変異体、２７，０００のペプチド変異体、２８，０００のペプチド変異体、２９，０００のペプチド変異体、３０，０００のペプチド変異体、３４，０００のペプチド変異体、３５，０００のペプチド変異体、３６，０００のペプチド変異体、３７，０００のペプチド変異体、３８，０００のペプチド変異体、３９，０００のペプチド変異体、４０，０００のペプチド変異体、４１，０００のペプチド変異体、４２，０００のペプチド変異体、４３，０００のペプチド変異体、４４，０００のペプチド変異体、４５，０００のペプチド変異体、４６，０００のペプチド変異体、４７，０００のペプチド変異体、４８，０００のペプチド変異体、４９，０００のペプチド変異体、５０，０００のペプチド変異体、５，５０００のペプチド変異体、６０，０００のペプチド変異体、６５，０００のペプチド変異体、７０，０００のペプチド変異体、７５，０００のペプチド変異体、８０，０００のペプチド変異体、８５，０００のペプチド変異体、９０，０００のペプチド変異体、９５，０００のペプチド変異体、１００，０００のペプチド変異体、１１０，０００のペプチド変異体、１２０，０００のペプチド変異体、１３０，０００のペプチド変異体、１４０，０００のペプチド変異体、１５０，０００のペプチド変異体、１６０，０００のペプチド変異体、１７０，０００のペプチド変異体、１８０，０００のペプチド変異体、１９０，０００のペプチド変異体、２００，０００のペプチド変異体、２１０，０００のペプチド変異体、２２０，０００のペプチド変異体、２３０，０００のペプチド変異体、２４０，０００のペプチド変異体、２５０，０００のペプチド変異体、２６０，０００のペプチド変異体、２７０，０００のペプチド変異体、２８０，０００のペプチド変異体、２９０，０００のペプチド変異体、又は３００，０００のペプチド変異体を使用することができる。幾つかの実施形態において、約３００，０００を超えるペプチド変異体を、本発明の方法により生成及び／又は使用することが得できる。
幾つかの実施形態において、約１００〜１５，０００のペプチド変異体、１００〜１４，０００のペプチド変異体、１００〜１３，０００のペプチド変異体、１００〜１２，０００のペプチド変異体、１００〜１１，０００のペプチド変異体、１００〜１０，０００のペプチド変異体、１００〜９０００のペプチド変異体、１００〜８０００のペプチド変異体、１００〜７０００のペプチド変異体、１００〜６０００のペプチド変異体、１００〜５０００のペプチド変異体、１００〜４０００のペプチド変異体、１００〜３０００のペプチド変異体、１００〜２０００のペプチド変異体、１００〜１０００のペプチド変異体、１００〜９００のペプチド変異体、１００〜８００のペプチド変異体、１００〜７００のペプチド変異体、１００〜６００のペプチド変異体、１００〜５００のペプチド変異体、１００〜４００のペプチド変異体、１００〜３００のペプチド変異体、１００〜２００のペプチド変異体を、生成及び／又は使用することができる。
幾つかの実施形態において、１００未満のペプチド変異体を、用いることができる。幾つかの実施形態において、約１０〜１００のペプチド変異体、約１０〜９０のペプチド変異体、約１０〜８０のペプチド変異体、約１０〜７０のペプチド変異体、約１０〜６０のペプチド変異体、約１０〜５０のペプチド変異体、約１０〜５０のペプチド変異体、約１０〜４０のペプチド変異体、約１０〜３０のペプチド変異体、約１０〜２０のペプチド変異体、約２０〜１００のペプチド変異体、約２０〜９０のペプチド変異体、約２０〜８０のペプチド変異体、約２０〜７０のペプチド変異体、約２０〜６０のペプチド変異体、約２０〜５０のペプチド変異体、約２０〜４０のペプチド変異体、約２０〜３０のペプチド変異体、約３０〜１００のペプチド変異体、約３０〜９０のペプチド変異体、約３０〜８０のペプチド変異体、約３０〜７０のペプチド変異体、約３０〜６０のペプチド変異体、約３０〜５０のペプチド変異体、約３０〜４０のペプチド変異体、約４０〜１００のペプチド変異体、約４０〜９０のペプチド変異体、約４０〜８０のペプチド変異体、約４０〜７０のペプチド変異体、約４０〜６０のペプチド変異体、約４０〜５０のペプチド変異体、約５０〜１００のペプチド変異体、約５０〜９０のペプチド変異体、約５０〜８０のペプチド変異体、約５０〜７０のペプチド変異体、約５０〜６０のペプチド変異体、約６０〜１００のペプチド変異体、約６０〜９０のペプチド変異体、約６０〜８０のペプチド変異体、約６０〜７０のペプチド変異体、約７０〜１００のペプチド変異体、約７０〜９０のペプチド変異体、約７０〜８０のペプチド変異体、約８０〜１００のペプチド変異体、約８０〜９０のペプチド変異体、又は約９０〜１００のペプチド変異体を、本発明の方法で用いることができる。幾つかの実施形態において、約９０未満のペプチド変異体、約８０のペプチド変異体、約７０のペプチド変異体、約６０のペプチド変異体、約５０のペプチド変異体、約４０のペプチド変異体、約３０のペプチド変異体、約２０のペプチド変異体、又は約１０のペプチド変異体を、本発明の方法で用いることができる。
幾つかの実施形態において、本発明の方法で用いられるペプチドは、約２〜１００のアミノ酸を含むことができる。幾つかの実施形態において、本発明のペプチドは、約１０〜１００のアミノ酸、約１０〜９０のアミノ酸、約１０〜８０のアミノ酸、約１０〜７０のアミノ酸、約１０〜６０のアミノ酸、約１０〜５０のアミノ酸、約１０〜４０のアミノ酸、約１０〜３０のアミノ酸、約１０〜２０のアミノ酸、約２０〜３０のアミノ酸、約２０〜４０のアミノ酸、約２０〜５０のアミノ酸、約２０〜６０のアミノ酸、約２０〜７０のアミノ酸、約２０〜８０のアミノ酸、約２０〜９０のアミノ酸、約２０〜１００のアミノ酸、約３０〜４０のアミノ酸、約３０〜５０のアミノ酸、約３０〜６０のアミノ酸、約３０〜７０のアミノ酸、約３０〜８０のアミノ酸、約３０〜９０のアミノ酸、約３０〜１００のアミノ酸、約４０〜５０のアミノ酸、約４０〜６０のアミノ酸、約４０〜７０のアミノ酸、約４０〜８０のアミノ酸、約４０〜９０のアミノ酸、約４０〜１００のアミノ酸、約５０〜６０のアミノ酸、約５０〜７０のアミノ酸、約５０〜８０のアミノ酸、約５０〜９０のアミノ酸、約５０〜１００のアミノ酸、約５０〜１００のアミノ酸、又は約６０〜７０のアミノ酸、約６０〜８０のアミノ酸、約６０〜９０のアミノ酸、約６０〜１００のアミノ酸、約７０〜８０のアミノ酸、約７０〜９０のアミノ酸、約７０〜１００のアミノ酸、約８０〜９０のアミノ酸、約８０〜１００のアミノ酸、又は約９０〜１００のアミノ酸を含むことができる。幾つかの実施形態において、本発明のペプチドは、約１０のアミノ酸、約１１のアミノ酸、約１２のアミノ酸、約１３のアミノ酸、約１４のアミノ酸、約１５のアミノ酸、約１６のアミノ酸、約１７のアミノ酸、約１８のアミノ酸、約１９のアミノ酸、約２０のアミノ酸、約２１のアミノ酸、約２２のアミノ酸、約２３のアミノ酸、約２４のアミノ酸、約２５のアミノ酸、約２６のアミノ酸、約２７のアミノ酸、約２８のアミノ酸、約２９のアミノ酸、約３０のアミノ酸、約３１のアミノ酸、約３２のアミノ酸、約３３のアミノ酸、約３４のアミノ酸、約３５のアミノ酸、約３６のアミノ酸、約３７のアミノ酸、約３８のアミノ酸、約３９のアミノ酸、約４０のアミノ酸、約４１のアミノ酸、約４２のアミノ酸、約４３のアミノ酸、約４４のアミノ酸、約４５のアミノ酸、約４６のアミノ酸、約４７のアミノ酸、約４８のアミノ酸、約４９のアミノ酸又は約５０のアミノ酸を含むことができる。
幾つかの実施形態において、本発明の方法を用いて、結び目のあるペプチドのライブラリーを作製する。ある特定の実施形態において、本発明の結び目のあるペプチドは、約１０〜６０のアミノ酸（例えば、１１〜５７のアミノ酸）を含むことができる。幾つかの実施形態において、本発明の結び目のあるペプチドは、約１０〜４５のアミノ酸、約１０〜４０のアミノ酸、約１０〜３５のアミノ酸、約１０〜３０のアミノ酸、約１０〜３５のアミノ酸、約１０〜２０のアミノ酸、約１０〜２５のアミノ酸、約１５〜５０のアミノ酸、約１５〜４５のアミノ酸、約１５〜４０のアミノ酸、約１５〜３５のアミノ酸、約１５〜３０のアミノ酸、約１５〜２５のアミノ酸、約１５〜２０のアミノ酸、約２０〜５０のアミノ酸、約２０〜４５のアミノ酸、約２０〜４０のアミノ酸、約２０〜３５のアミノ酸、約２０〜３０のアミノ酸、約２０〜２５のアミノ酸、約２５〜５０のアミノ酸、約２５〜４５のアミノ酸、約２５〜４０のアミノ酸、約２５〜３５のアミノ酸、約２５〜３０のアミノ酸、約３０〜５０のアミノ酸、約３０〜４５のアミノ酸、約３０〜４０のアミノ酸、約３０〜３５のアミノ酸、約３５〜５０のアミノ酸、約３５〜４５のアミノ酸、約３５〜４０のアミノ酸、約４０〜５０のアミノ酸、約４０〜４５のアミノ酸、約４５〜５０アミノ酸、又は約５０〜６０のアミノ酸を含むことができる。幾つかの実施形態において、本発明の結び目のあるペプチドは、約１０のアミノ酸、約１１のアミノ酸、約１２のアミノ酸、約１３のアミノ酸、約１４のアミノ酸、約１５のアミノ酸、約１６のアミノ酸、約１７のアミノ酸、約１８のアミノ酸、約１９のアミノ酸、約２０のアミノ酸、約２１のアミノ酸、約２２のアミノ酸、約２３のアミノ酸、約２４のアミノ酸、約２５のアミノ酸、約２６のアミノ酸、約２７のアミノ酸、約２８のアミノ酸、約２９のアミノ酸、約３０のアミノ酸、約３１のアミノ酸、約３２のアミノ酸、約３３のアミノ酸、約３４のアミノ酸、約３５のアミノ酸、約３６のアミノ酸、約３７のアミノ酸、約３８のアミノ酸、約３９のアミノ酸、約４０のアミノ酸、約４１のアミノ酸、約４２のアミノ酸、約４３のアミノ酸、約４４のアミノ酸、約４５のアミノ酸、約４６のアミノ酸、約４７のアミノ酸、約４８のアミノ酸、約４９のアミノ酸、約５０のアミノ酸、約５１のアミノ酸、約５２のアミノ酸、約５３のアミノ酸、約５４のアミノ酸、約５５のアミノ酸、約５６のアミノ酸、又は約５７のアミノ酸で構成される。
幾つかの実施形態において、本発明のペプチドは、ジスルフィド結合を含むことができる。本明細書で提供されるペプチドは、１〜１０のジスルフィド結合を含むことができる。幾つかの実施形態において、本明細書で提供されるペプチドは、１〜９のジスルフィド結合、１〜８のジスルフィド結合、１〜７のジスルフィド結合、１〜６のジスルフィド結合、１〜５のジスルフィド結合、１〜４のジスルフィド結合、１〜３のジスルフィド結合、１〜２のジスルフィド結合、２〜３のジスルフィド結合、２〜４のジスルフィド結合、２〜５のジスルフィド結合、２〜６のジスルフィド結合、２〜７のジスルフィド結合、２〜８のジスルフィド結合、２〜９のジスルフィド結合、２〜１０のジスルフィド結合、３〜４のジスルフィド結合、３〜５のジスルフィド結合、３〜６のジスルフィド結合、３〜７のジスルフィド結合、３〜８のジスルフィド結合、３〜９のジスルフィド結合、３〜１０のジスルフィド結合、４〜５のジスルフィド結合、４〜６のジスルフィド結合、４〜７のジスルフィド結合、４〜８のジスルフィド結合、４〜９のジスルフィド結合、５〜６のジスルフィド結合、５〜７のジスルフィド結合、５〜８のジスルフィド結合、５〜９のジスルフィド結合、５〜１０のジスルフィド結合、６〜７のジスルフィド結合、６〜８のジスルフィド結合、６〜９のジスルフィド結合、６〜１０のジスルフィド結合、７〜８のジスルフィド結合、７〜９のジスルフィド結合、７〜１０のジスルフィド結合、８〜９のジスルフィド結合、８〜１０のジスルフィド結合、又は９〜１０のジスルフィド結合を有することができる。本発明の幾つかの実施形態において、結び目のあるペプチドは、１つのジスルフィド結合、２つのジスルフィド結合、３つのジスルフィド結合、４つのジスルフィド結合、５、６つのジスルフィド結合、７つのジスルフィド結合、８のジスルフィド結合、９つのジスルフィド結合又は１０のジスルフィド結合を有する。
幾つかの実施形態において、該ペプチド（例えば、結び目のあるペプチド）の分子量は、約０．５ｋＤａ〜約２０ｋＤａの範囲内であってもよい。幾つかの実施形態において、本明細書に記載されたペプチド（例えば、結び目のあるペプチド）の分子量は、約０．５〜１５ｋＤａ、約０．５〜１０ｋＤａ、約０．５〜５ｋＤａ、約１〜２０ｋＤａ、約１〜１５ｋＤａ、約１〜１０ｋＤａ、約１〜５Ｋａ、約５〜２０ｋＤａ、約５〜１５ｋＤａ、約５〜１０ｋＤａ、約１０〜２０ｋＤａ、約１０〜１５ｋＤａ、又は約１５〜２０ｋＤａの範囲内の分子量を有することができる。幾つかの実施形態において、本明細書に記載されたペプチド（例えば、結び目のあるペプチド）は、約０．５〜１０ｋＤａ、約０．５〜９ｋＤａ、約０．５〜８、約０．５〜７ｋＤａ、約０．５〜６ｋＤａ、約０．５〜５ｋＤａ、約０．５〜４ｋＤａ、約０．５〜３ｋＤａ、約０．５〜２ｋＤａ、約０．５〜１ｋＤａ、約１〜２ｋＤａ、約１〜３ｋＤａ、約１〜４ｋＤａ、約１〜５ｋＤａ、約１〜６ｋＤａ、約１〜７ｋＤａ、約１〜８ｋＤａ、約１〜９ｋＤａ、約１〜１０ｋＤａ、約２〜３ｋＤａ、約２〜４ｋＤａ、約２〜５ｋＤａ、約２〜６ｋＤａ、約２〜７ｋＤａ、約２〜８ｋＤａ、約２〜９ｋＤａ、約２〜１０ｋＤａ、約３〜４ｋＤａ、約３〜５ｋＤａ、約３〜６ｋＤａ、約３〜７ｋＤａ、約３〜８ｋＤａ、約３〜９ｋＤａ、約３〜１０ｋＤａ、約４〜５ｋＤａ、約４〜６ｋＤａ、約４〜７ｋＤａ、約４〜８ｋＤａ、約４〜９ｋＤａ、約４〜１０ｋＤａ、約５〜６ｋＤａ、約５〜７ｋＤａ、約５〜８ｋＤａ、約５〜９ｋＤａ、約５〜１０ｋＤａ、約６〜７ｋＤａ、約６〜８ｋＤａ、約６〜９ｋＤａ、約６〜１０ｋＤａ、約７〜１０ｋＤａ、約７〜８ｋＤａ、約７〜９ｋＤａ、約７〜１０ｋＤａ、約８〜９ｋＤａ、約８〜１０ｋＤａ、又は約９〜１０ｋＤａの範囲内の分子量を有することができる。
ペプチド（例えば、結び目のあるペプチド）の変異体は、ランダムにすること（縮重コドン又はエラープローンＰＣＲなどの技術による）又は完全に定義することができる。チップによるオリゴヌクレオチド合成の進展により、ＤＮＡライブラリーの作製が安価かつルーチンになり、ＤＮＡから作製されたペプチドライブラリーの組成の完全な定義を可能にした。それぞれが特有の質量フラグメント又はトリプシン分解フラグメントを有するようにペプチドを設計することにより、質量分析を、ペプチドそれぞれの存在について同時にスクリーニングするために用いることができる。幾つかの態様において、本開示は、対象の腫瘍を画像化するためのペプチドであって、少なくとも３つのＤ−アミノ酸を有するアミノ酸配列を含むクロロトキシンを含み、腫瘍に結合するように構成された二次構造を有し、検出可能な標識をさらに含む、ペプチドを提供する。本開示の更なる態様において、該ペプチド内のアミノ酸の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％が、Ｄ−アミノ酸である。幾つかの態様において、本発明のペプチドは、以下の配列：
ＭＣＭＰＣＦＴＴＤＨＱＭＡＲＸＣＤＤＣＣＧＧＸＧＲＧＸＣＹＧＰＱＣＬＣＲ（ここで、Ｘは、Ｋ、Ａ及びＲから選択される）と少なくとも８０％、８３％、８６％、８９％、９０％又は９２％同一のアミノ酸配列を有し得る。幾つかの態様において、本発明のペプチドは、以下の配列：
ＭＣＭＰＣＦＴＴＤＨＱＭＡＲＸＣＤＤＣＣＧＧＸＧＲＧＸＣＹＧＰＱＣＬＣＲ（ここで、アミノ酸配列内のアミノ酸の少なくとも３つは、Ｄ−アミノ酸であり、Ｘは、Ｋ、Ａ及びＲから選択される）と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、本開示のペプチドは、該ペプチド内のアミノ酸の少なくとも５０％、少なくとも６０％、又は少なくとも７０％が、Ｄ−アミノ酸である。幾つかの態様において、本開示のペプチドは、検出可能な標識をさらに含む。本開示の幾つかの態様において、所定のペプチド内のアミノ酸全てが、Ｄ−アミノ酸である。本開示の幾つかの態様において、検出可能な標識は、該ペプチドのＮ末端にコンジュゲートされているか、又は該ペプチド内のリジン残基にコンジュゲートされている。本開示の他の態様において、検出可能な標識は、近赤外色素を含む。本開示の他の態様において、検出可能な標識は、シアニン色素を含む。本開示の様々な態様において、本明細書に記載されたペプチドのいずれか、又はそれらの組み合わせを含む組成物を、生成することができる。本発明の幾つかの態様において、対象におけるペプチドを検出する方法であって、対象に、本開示のペプチド又はその組成物の有効量を投与すること、及びそれに含まれる検出可能な標識を検出すること、を含む、方法が提供される。さらなる態様において、本開示は、検出可能な標識を検出することにより対象における領域の画像を得ることをさらに含む。さらなる態様において、該検出することは、癌組織の手術中の視覚化を含む。さらなる態様において、検出可能な標識の視覚化は、対象の腫瘍の外科的除去を誘導する。本開示の幾つかの態様において、クロロトキシンターゲットを発現する細胞に関連する疾患を処置する方法であって、それを必要とする対象に、本開示によるペプチドを含む医薬組成物、又は本開示のペプチドを含む組成物の治療有効量を投与し、それにより該疾患を処置すること、を含む、方法が提供される。さらなる態様において、該ペプチド組成物は、細胞毒性剤、毒素、アンチセンスヌクレオチド、癌用薬物、ヌクレオチド薬、代謝モジュレータ、放射線増感剤、ペプチド治療薬、ペプチド−薬物コンジュゲート、又はそれらの組み合わせをさらに含む。さらなる態様において、該疾患は、神経膠腫、皮膚癌、肺癌、リンパ腫、髄芽細胞腫、前立腺癌、膵臓癌、乳癌、乳腺癌（mammary cancer）、結腸癌、肉腫、口腔扁平上皮癌、血液外皮腫、又はそれらの組み合わせに関連する癌組織を含む。
幾つかの態様において、ペプチド変異体は、広範囲の技術を用いて作製することができる。ある特定の実施形態において、例えば必要なアミノ酸を保存し、他の位置を変異させるように設計されたヌクレオチドでペプチドをコードすることにより、制御された変異性を有するペプチドライブラリーを調製することができる。変異体内に保持するアミノ酸は、例えばアラニンを各アミノ酸位置に系統的に置換することが可能なアラニンスキャニング技術により、同定することができる。この方策により、活性ペプチドをもたらすネイティブ配列内のアミノ酸が同定される。必須アミノ酸の置換は、ペプチド活性の低下をもたらす可能性があり、活性低下の度合いは、例えば置換されるアミノ酸の重要性の相対的指標として利用することができる。
保持されたアミノ酸を同定して、大きなペプチドライブラリーを保持されたアミノ酸残基の周囲で開発することができる。例えばペプチドライブラリーを、保持されたアミノ酸周辺の隣接残基の系統的トランケーションにより作製することができる。ライブラリーが、ショットガンアプローチにおいて、元のペプチド上の選択された位置を、他の全ての天然アミノ酸とランダムかつ同時に置換することにより作製されたランダムライブラリーであってもよい。幾つかの実施形態において、作製されたライブラリーは、ペプチド配列内の選択された１つの位置又は複数の位置が、それぞれ異なるアミノ酸で系統的に交換された位置的なペプチドライブラリーであってもよい。このアプローチは、特定の位置のアミノ酸置換の影響を示すことができる。ペプチドライブラリーは、元のペプチドの配列上で並べ替えを実施することによりスクランブルライブラリーとして構築することもできる。そのようなライブラリーは、全ての可能な代替物を与える能力を有し、ペプチドライブラリーに関して最高度の変異性を与える。
様々なスクリーニング技術を用いて、薬物候補の様々なライブラリーを同定することができる。例えば、インビトロ及び／又はインビボアッセイを、本明細書に記載された様々な薬理学的性質を有する薬物候補を同定するために別個に、又は組み合わせて用いることができる。１つの例示的実施形態において、経口生物学的利用度を、ライブラリーについて分析することができる。例えば何百又は何千ものペプチドからなるプチドライブラリーを、対象（例えば、動物、ラット、マウス、ヒト又はブタ）に供給することができる（例えば、約１ｇ／ｍＬ又は１００ｍｇ／ｍＬ未満）。例えばペプチドのライブラリーが胃の中で処理され、可能ならば血中を通過した後のある時点で、例えば対象の血液を分析することができる。この例において、血中に見出されるライブラリーのペプチドを、胃の酸性環境に化学的に抵抗し得ること、及び対象の血流に入り得ることで同定することができる（例えば、質量分析による）。そのような分析の後、大きなライブラリーのサブライブラリーを、その後に経口生物学的利用性を有する薬物を同定するのに用いることができる。
他の薬理学的性質を、別の薬理学的性質を有する薬物のより大きなライブラリー及び／又はサブライブラリーについて同定することができる。例えば血清中半減期を分析して、所望の血清中半減期を有する薬物候補（例えば、結び目のあるペプチド）のサブライブラリーを決定することもできる。幾つかの実施形態において、薬物候補（例えば、ペプチド）のサブライブラリーは、約１５分〜約７２時間の範囲内の血清中半減期を有することができる。より短い半減期及びより長い半減期も、同様に同定することができる。１つの例示的実施形態において、薬物候補（例えば、結び目のあるペプチド）のライブラリーを、対象の血流に注入し（例えば、約１ｇ／ｍＬ又は１００ｍｇ／ｍＬ未満）、その後、所定の時点の後で（例えば、１５分ごと、１時間ごと、４時間ごと、又は他のスケジュールで）、対象から試料（例えば、血液、尿、粘液、脳脊髄液、又は組織）を採取して分析し（例えば、質量分析を利用して）、注入後に依然として存在する薬物候補を測定することができる。対象からの組織試料としては、生検及び／又は剖検組織を挙げることができる。組織試料には、脳、肺、腎臓、筋肉、肝臓、心臓、胃、膵臓、又は任意の他の臓器からの組織を挙げることもできる。その時点に応じて、血清中半減期を決定することができ、特定の血清中半減期を有する薬物候補（例えば、結び目のあるペプチド）のサブライブラリーを同定することができる。
幾つかの実施形態において、ある特定の薬理学的性質を有する薬物候補の同定は、連続で、又は並行して実施することができる。例えば１つのサブライブラリーを、特定の血中半減期を有すると同定することができる。そのサブライブラリーを、その後、先に記載された通り経口生物学的利用度についてスクリーニングすることができる。あるいはライブラリーを対象に消化させることができ、その後、サブライブラリーが経口生物学的利用性があるか、そしてサブライブラリー内の薬物候補が所望の血清中半減期を有するか、を決定するために、後に分析することができる。
スクリーニング工程は、薬物候補のサブライブラリーについて同定され得る薬様特性のタイプにも限定されない。他の例示的スクリーニングを利用して、例えば血液脳関門を越えること、ある特定の細胞型を透過すること、及び／又は細胞内オルガネラ若しくは細胞コンパートメントを透過することが可能な薬物候補（例えば、結び目のあるペプチド）のサブライブラリーを同定することができる。例えばライブラリーを対象に投与し、その後、脳組織を分析して（例えば、質量分析により）血液脳関門を越えることが可能な薬物候補（例えば、結び目のあるペプチド）のサブライブラリーを決定することができる。幾つかの実施形態において、他の特性を示す候補を有するサブライブラリーを作製することができる。例えば、薬物候補（例えば、ペプチド）が、重要な臓器を有害作用を持って標的化することで障害を生じれば、それらの候補をライブラリーから排除し、それによりライブラリーを創出してもよい。あるいは薬物候補は、それらが血清アルブミン及び／又はＩｇＧ及び／又はＦｃＲｎに結合するかどうか（例えば、ｐＨ感受性結合により）に応じて選択又は除外してもよい。
幾つかの実施形態において、例えばノッチンペプチド薬物候補のライブラリーを特定の動物モデルで発現させて、所望の影響についてスクリーニングするか、又は該動物を治療的に処置することができる。例えば発現は、ウイルス形質導入システム（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、又はアデノ随伴ウイルス）を利用して、ウイルス材料を取り込んでノッチンペプチド（複数可）を発現する特定の臓器又は身体エリアに該ペプチドライブラリーを送達するよう遂行することができる。幾つかの態様において、これらの方法は、実験動物系内の治療上有用なペプチドの決定に利用することができる。例えば、ノッチンのライブラリーを、神経変性疾患（例えば、ハンチントン病）又は筋肉疾患（例えば、サルコペニア）を発症するように遺伝子操作されたマウスの脳細胞内で発現させることができる。ニューロンが健常のまま維持された領域を、変性した比較エリアにおいて同定し、その後、この領域に局所的に分泌されるペプチドを、同定することができる（例えば、健常な領域から抽出された組織の質量分析による）。
先に述べられた通り、本発明は、ある特定の薬理学的性質を有する薬物候補のサブライブラリーを決定するための様々な方法を含む。本発明の幾つかの態様において、選択された薬理学的性質を有し、インビトロ及び／又はインビボスクリーニングを利用して同定された薬物候補のサブライブラリーを、その後、該当するターゲット（例えば、治療ターゲット）への結合に有用な薬物を最終的に設計するために、ある特定の性質を潜在的に改善するよう後に修飾され得る１つ以上のリード薬物候補を同定するためにスクリーニングすることができる。
例示的実施形態において、特定の表面残基の位置を、縮重コドンを利用したランダム突然変異誘発のターゲットとするオリゴヌクレオチド構成アプローチ（本明細書にさらに記載される）を利用して、ペプチドライブラリーを創出することができる（図２）。一態様において、該方法は、１０の特有の、又は重複する３つのアミノ酸サブドメインを変異させることにより、スカフォールドを通して解析することを含むことができる。本発明者らは、どの部位が突然変異に耐容するかを決定したら、より大きなランダム化ライブラリーを構築するであろう。これらのライブラリーは、その後、個別に、又はプール形式でスクリーニングすることができる。例えばＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ部位を含むプライマーを用いて、アセンブリの反応を増幅させることができ、精製されたＰＣＲ産物を、ベクター（例えば、ダイダロスベクター：ｐＣＶＬ−ｓＵＣＯＥ−ＳＦＦＶ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ）にクローニングすることができる。得られたレンチウイルスライブラリーを利用して、細胞（例えば、ＨＥＫ２９３フリースタイル細胞）に形質導入して、変異体を分泌する細胞のポリクローナル集団を創出することができる。分泌された構築物を、Ｎ末端分泌シグナル及びＣ末端タグ（例えば、ＳＴＲＥＰＩＩタグ（ＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ））で操作することができる。分泌されたペプチドを、例えばサイズ排除又はアフィニティークロマトグラフィーを利用して、培養上清から回収することができる。多様性が限定された、又は多様性が広範囲である複数のライブラリーを、このアプローチを利用して作製することができる。分泌されたタンパク質ライブラリーの多様性を計測して、下流のスクリーニング用途での検出限界を確立するために、精製されたペプチドプールをタンデム質量分析を利用して分析することができる。
幾つかの実施形態において、ライブラリーを作製する方法は、反復式及び並行式であってもよい。図３に示す通り、例えば細胞透過性、経口生物学的利用度、血清中半減期、血液脳関門透過性及び組織ホーミングについて何千ものペプチドをテストするために、１つの実験を並行して実施することができる。好適な特性を有するそれらのペプチドで、同じ配列とわずかに変化した配列とを有する次のペプチドライブラリーを作製するための基礎材料を形成することができる。このセットには、何千ものサイズがあってもよく、これらの好適な（薬様の）性質全てについて並行してテストすることができる。そしてこの群の最良のもので、そのセットの基礎材料を形成することになる。これらの工程を利用して、更なる薬様ペプチドの作製のために一般原理と予測値を構築することができる。
ペプチドコンジュゲート
幾つかの態様において、本発明は、ペプチドコンジュゲートのライブラリーを含む。例えばペプチドライブラリーの幾つか又は全てを、ペプチドの特性を改変するように選択された部分にコンジュゲートさせることができる。
ある特定の態様において、本発明は、Ｎ末端で疎水性（例えば、親油性）部分にコンジュゲートされたノッチン又は結び目のあるペプチドのライブラリーを含む。ノッチンの全て又は幾つかが、例えば内部リジンの位置でのコンジュゲートを回避することでペプチドのアミノ末端にコンジュゲートさせるように、内部リジンを欠如させることができる。幾つかの実施形態において、Ｎ末端への疎水性部分の結合を利用して、結び目のあるペプチドの半減期を延長させることができる。幾つかの実施形態において、簡単な炭素鎖（例えば、ミリストイル化及び／又はパルミチル化により）をペプチドにコンジュゲートさせることができる。親油性部分により、血清アルブミンへの可逆的結合を介して半減期を延長することができる。ある特定の実施形態において、ペプチドのＮ末端への近赤外色素の結合も実施して、コンジュゲートされたペプチドの追跡を可能にしてもよい。ある特定の実施形態において、ペプチドのリジンへの近赤外色素の結合も実施して、コンジュゲートされたペプチドの追跡を可能にしてもよい。色素への抗体により、色素が追跡マーカ及び検索ハンドルという二重の役割を満たすことがさらに可能になる。コンジュゲートされたペプチドを、組織又は体液からペプチドを検索するためのアフィニティーハンドル（例えば、ビオチン）の提供など他の役割を果たし得る他の部分にコンジュゲートさせることもできる。
他の修飾を利用することができる。例えば、結び目のあるペプチドが、翻訳後修飾（例えば、メチル化及び／又はアミド化）を含むことができ、又は結び目のあるペプチドを、例えば血清中半減期、に影響を及ぼし得るＤ−アミノ酸の幾つか又は全てで構成させることもできる。幾つかの実施形態において、ライブラリー内のペプチドを、例えばペプチドの特性を改変し得る、又は特性変化を実行し得る、他の部分にコンジュゲートさせることができる。コンジュゲートされた部分は、例えば血清アルブミンへの可逆的結合を介してペプチドの半減期を延長する親油性部分であってもよい。幾つかの実施形態において、親油性部分は、コレステン、コレスタン、コレスタジエン、及びオキシステロールをはじめとするコレステロール、又はコレステロール誘導体であってもよい。幾つかの実施形態において、該ペプチドは、ミリスチン酸（テトラデカン酸）又はその誘導体にコンジュゲートさせることができる。
幾つかの実施形態において、該ペプチドを、コンジュゲートされたペプチドの生体分布の追跡、検出又は視覚化を可能にする検出可能な標識にコンジュゲートさせることができる。検出可能な標識は、蛍光標識（例えば、蛍光色素）であってもよい。ある特定の実施形態において、蛍光標識は、特定の適用に望ましい発光特性を有することができる。例えば蛍光標識は、５００ｎｍ〜１１００ｎｍの範囲内、６００ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲内、６００〜８００ｎｍの範囲内、６５０ｎｍ〜８５０ｎｍの範囲内、７００ｎｍ〜８００ｎｍの範囲内、７２０〜７８０ｎｍの範囲内、又は７２０〜７５０ｎｍの範囲内に最大発光波長を有する蛍光色素であってもよい。例えば、ある特定の条件下で、シアニン５．５は、６９５ｎｍ前後に最大発光を有することができ、ＩＲｄｙｅ８００は、８００ｎｍ前後に最大発光を有することができ、インドシアニングリーンは、８２０ｎｍ前後に最大発光を有することができる。当業者は、検出可能な標識として使用され得て先の発光特性を有する様々な色素を認識するであろう。
本明細書で用いられる用語「検出可能な標識」は、低分子化学分子、ペプチド、タンパク質、又はそれらのフラグメント若しくは部分に結合し得て、それにより低分子化学分子、ペプチド、タンパク質、又はそれらのフラグメントが、タグ又は修飾の検出を可能にするデバイス、装置又は方法を利用して認識可能になるようなタグ又は修飾を意味する。
幾つかの態様において、検出可能な標識は、蛍光色素である。本開示のコンジュゲート分子として使用され得る蛍光色素の非限定的例としては、ローダミン、ロドール、フルオレセイン、チオフルオレセイン、アミノフルオレセイン、カルボキシフルオレセイン、クロロフルオレセイン、メチルフルオレセイン、スルホフルオレセイン、アミノロドール、カルボキシロドール、クロロロドール、メチルロドール、スルホロドール；アミノローダミン、カルボキシローダミン、クロロローダミン、メチルローダミン、スルホローダミン、及びチオローダミン、シアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニン、メロシアニン、シアニン色素（例えば、シアニン２、シアニン３、シアニン３．５、シアニン５、シアニン５．５、シアニン７）、オキサジアゾール誘導体、ピリジルオキサゾール、ニトロベンゾオキサジアゾール、ベンゾオキサジアゾール、ピレン誘導体、カスケードブルー、オキサジン誘導体、ナイルレッド、ナイルブルー、クレシルバイオレット、オキサジン１７０、アクリジン誘導体、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリジンイエロー、アリールメチン誘導体（arylmethine derivatives）、キサンテン色素、スルホン化キサンテン色素、アレクサフルオル（例えば、アレクサフルオル５９４、アレクサフルオル６３３、アレクサフルオル６４７、アレクサフルオル７００）、オーラミン、クリスタルバイオレット、マラカイトグリーン、テトラピロール誘導体、ポルフィリン、フタロシアニン、及びビリルビンが挙げられる。幾つかの実施形態において、色素は、Ｃｙ５．５、ＩＲｄｙｅ８００、ＤｙＬｉｇｈｔ７５０又はインドシアニングリーン（ＩＣＧ）をはじめとする近赤外色素であってもよい。幾つかの態様において、近赤外色素としては、シアニン色素（例えば、シアニン２、シアニン３、シアニン３．５、シアニン５、シアニン５．５、シアニン７）を挙げることができる。ある特定の実施形態において、検出可能な標識としては、キサンテン色素、又はスルホン化キサンテン色素、例えばアレクサフルオル（例えば、アレクサフルオル５９４、アレクサフルオル６３３、アレクサフルオル６４７、アレクサフルオル７００）を挙げることができる。色素への抗体が、見出され得る場合、コンジュゲートされた色素を、追跡、検出又は視覚化マーカとして、そして検索ハンドルとして利用することができる。
本発明のライブラリー内のペプチドは、ビオチンにコンジュゲートさせることもできる。ビオチンは、半減期の延長に加えて、組織又は他の位置のペプチドを検索するためのアフィニティーハンドルとして作用することもできる。一実施形態において、該ペプチドは、例えばＰＥＧリンカーによりビオチニダーゼ耐性ビオチン（例えば、ＮＨＳ−ｄＰＥＧ４−ビオチニダーゼ耐性ビオチン）に、コンジュゲートさせることができる。幾つかの実施形態において、検出可能な標識及びアフィニティーハンドルとして作用し得る蛍光ビオチンコンジュゲートを、使用することができる。市販の蛍光ビオチンコンジュゲートの非限定的例としては、Ａｔｔｏ４２５−ビオチン、Ａｔｔｏ４８８−ビオチン、Ａｔｔｏ５２０−ビオチン、Ａｔｔｏ−５５０ビオチン、Ａｔｔｏ５６５−ビオチン、Ａｔｔｏ５９０−ビオチン、Ａｔｔｏ６１０−ビオチン、Ａｔｔｏ６２０−ビオチン、Ａｔｔｏ６５５−ビオチン、Ａｔｔｏ６８０−ビオチン、Ａｔｔｏ７００−ビオチン、Ａｔｔｏ７２５−ビオチン、Ａｔｔｏ７４０−ビオチン、フルオレセインビオチン、ビオチン−４−フルオレセイン、ビオチン−（５−フルオレセイン）コンジュゲート、ビオチン−Ｂ−フィコエリトリン、アレクサフルオル４８８ビオシチン、アレクサフルオル５４６、アレクサフルオル５４９、ルシファーイエローカダベリンビオチン−Ｘ、ルシファーイエロービオシチン、オレゴングリーン４８８ビオシチン、ビオチン−ローダミン及びテトラメチルローダミンビオシチンが挙げられる。幾つかの他の例において、該コンジュゲートとしては、化学発光化合物、コロイド金属、発光化合物、酵素、放射性同位体、及び常磁性標識を挙げることができる。
本発明のライブラリー内のペプチドは、典型的には食品中に見出され、胃、小腸、又は結腸から血流に吸収されるビタミン又は他の分子にコンジュゲートさせることができる。例としては、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫが挙げられるが、それらに限定されない。これらのコンジュゲーションの目的は、胃腸系からのペプチドの経口生物学的利用度又は吸収を改善することである。
幾つかの例において、ある特定のペプチドが胃腸管、血液脳関門、細胞膜、核膜などの生体バリアを越えるのを支援すると思われる選択された一連のアミノ酸を同定して、新しいペプチドが同じ生体バリアを越えるのを支援する目的で、他のペプチドに遺伝子的又は物理的に移植することができる。他の例において、同じアプローチを利用して、新しいペプチドがある特定の生体バリアを越えるのを防ぐ配列をペプチドに移植してもよい。例えば薬物をこの手法で修飾して、ＢＢＢ透過を防ぎ、それにより中枢神経系の副作用の確率を低下させることができる。
ペプチドライブラリーの鏡像異性体
本発明は、ペプチドライブラリーの鏡像異性体をさらに含む。例えば、該ペプチドは、天然由来のＬ−アミノ酸の全てを含むことができる。ある特定の実施形態において、該ペプチド内のアミノ酸の幾つか又は全てが、Ｄ−アミノ酸であってもよい。
幾つかの態様において、本発明は、Ｄ−アミノ酸を有し、クロロトキシンスカフォールドを基にしたペプチド、例えばＤ−アミノ酸クロロトキシン及び／又はＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体を包含する。クロロトキシンを基にしたペプチドは、様々な量のＤ−アミノ酸を含むことができる。クロロトキシンの天然のペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：ＭＣＭＰＣＦＴＴＤＨＱＭＡＲＫＣＤＤＣＣＧＧＫＧＲＧＫＣＹＧＰＱＣＬＣＲ。該ペプチドは、配列内に存在するシステイン残基の間に形成された４つのジスルフィド結合によりさらに架橋させることができる。天然のペプチドは、Ｌ−アミノ酸の全てを含む。化学的には、インビボで存在するものなどのキラル環境以外では、クロロトキシンの全Ｄ−アミノ酸形態が、クロロトキシンの全Ｌ−アミノ酸形態と識別不能の可能性がある。Ｄ−アミノ酸は、本質的には極めてまれであるため、Ｄ−アミノ酸を含むペプチドは、タンパク質分解に対して抵抗性であり得る。したがってＤ−アミノ酸のクロロトキシンは、例えば対象への投与後の生体液中で、切断に抵抗し得る。こうしてＤ−アミノ酸のペプチドは、例えば経口投与することができ、より低い免疫反応を有していてもよい。Ｄ−アミノ酸は、抗原プロセシング及び提示の予防を支援し、それにより抗原性を低下させることもできる。本発明において使用されるＤ−アミノ酸としては、例えばｄＡｒｇ、ｄＨｉｓ、ｄＬｙｓ、ｄＡｓｐ、ｄＧｌｕ、ｄＳｅｒ、ｄＴｈｒ、ｄＡｓｎ、ｄＧｌｎ、ｄＣｙｓ、ｄＧｌｙ、ｄＰｒｏ、ｄＡｌａ、ｄＶａｌ、ｄＩｌｅ、ｄＬｅｕ、ｄＭｅｔ、ｄＰｈｅ、ｄＴｙｒ、及びｄＴｒｐを挙げることができる。
幾つかの実施形態において、該ペプチドは、天然クロロトキシン配列と同じ配列を有し、配列内のアミノ酸の少なくとも３つが天然アミノ酸の代わりにＤ−アミノ酸を含む、ペプチドを包含し得る。幾つかの態様において、該ペプチドは、配列内のアミノ酸の少なくとも３つが天然アミノ酸の代わりにＤ−アミノ酸を含む、クロロトキシン変異体、例えば変異されたクロロトキシンペプチドを含むことができる。幾つかの実施形態において、配列内のアミノ酸の少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、又は少なくとも３５が、天然アミノ酸の代わりにＤ−アミノ酸を含むことができる。ある特定の実施形態において、クロロトキシンスカフォールドを基にしたペプチド内のアミノ酸の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％が、Ｄ−アミノ酸であってもよい。一態様において、本発明は、ペプチド内のアミノ酸の全てがＤ−アミノ酸である、クロロトキシンスカフォールドを基にしたペプチドを含む。
例えば本発明のペプチドを作製する方法によれば、非常に様々なクロロトキシン変異体を、作製することができる。例えば、従来の突然変異誘発及び合成に基づくシステムを利用して、何千ものクロロトキシンＤ−アミノ酸変異体を、クロロトキシンの天然由来アミノ酸配列を基にして調製することができる。幾つかの実施形態において、本発明のペプチドは、以下の配列：ＭＣＭＰＣＦＴＴＤＨＱＭＡＲＫＣＤＤＣＣＧＧＫＧＲＧＫＣＹＧＰＱＣＬＣＲと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８３％、８５％、８６％、８９％、９０％、９２％又は９５％同一であり、アミノ酸の全て又は幾つかがＤ−アミノ酸である、アミノ酸配列を含むことができる。幾つかの実施形態において、クロロトキシン変異体は、天然アミノ酸の代わりにＤ−アミノ酸である、少なくとも３つの配列内アミノ酸を有することができる。幾つかの実施形態において、クロロトキシン変異体の配列内のアミノ酸の少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、又は少なくとも３５が、天然アミノ酸の代わりにＤ−アミノ酸を含むことができる。ある特定の実施形態において、クロロトキシン変異体の配列内のアミノ酸の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％が、天然アミノ酸の代わりにＤ−アミノ酸を含むことができる。
一実施形態において、Ｄ−アミノ酸ペプチドの全てが、以下の式を有することができる：Ｈ−ｄＭｅｔ−ｄＣｙｓ−ｄＭｅｔ−ｄＰｒｏ−ｄＣｙｓ−ｄＰｈｅ−ｄＴｈｒ−ｄＴｈｒ−ｄＡｓｐ−ｄＨｉｓ−ｄＧｌｎ−ｄＭｅｔ−ｄＡｌａ−ｄＡｒｇ−ｄＸａａ−ｄＣｙｓ−ｄＡｓｐ−ｄＡｓｐ−ｄＣｙｓ−ｄＣｙｓ−ｄＧｌｙ−ｄＧｌｙ−ｄＸａａ−ｄＧｌｙ−ｄＡｒｇ−ｄＧｌｙ−ｄＸａａ−ｄＣｙｓ−ｄＴｙｒ−ｄＧｌｙ−ｄＰｒｏ−ｄＧｌｎ−ｄＣｙｓ−ｄＬｅｕ−ｄＣｙｓ−ｄＡｒｇ−ＯＨ酢酸塩（ジスルフィド結合、空気酸化）（式中、ｄＸａａは、ｄＡｒｇ、ｄＡｌａ、又はｄＬｙｓである）。
別の実施形態において、Ｄ−アミノ酸ペプチドの全てが、以下の式を有することができる：Ｈ−ｄＭｅｔ−ｄＣｙｓ−ｄＭｅｔ−ｄＰｒｏ−ｄＣｙｓ−ｄＰｈｅ−ｄＴｈｒ−ｄＴｈｒ−ｄＡｓｐ−ｄＨｉｓ−ｄＧｌｎ−ｄＭｅｔ−ｄＡｌａ−ｄＡｒｇ−ｄＸａａ−ｄＣｙｓ−ｄＡｓｐ−ｄＡｓｐ−ｄＣｙｓ−ｄＣｙｓ−ｄＧｌｙ−ｄＧｌｙ−ｄＸａａ−ｄＧｌｙ−ｄＡｒｇ−ｄＧｌｙ−ｄＬｙｓ−ｄＣｙｓ−ｄＴｙｒ−ｄＧｌｙ−ｄＰｒｏ−ｄＧｌｎ−ｄＣｙｓ−ｄＬｅｕ−ｄＣｙｓ−ｄＡｒｇ−ＯＨ酢酸塩（ジスルフィド結合、空気酸化）（式中、ｄＸａａは、ｄＡｒｇ、ｄＡｌａ、又はｄＬｙｓである）。
別の実施形態において、Ｄ−アミノ酸ペプチドの全てが、以下の式を有することができる：Ｈ−ｄＭｅｔ−ｄＣｙｓ−ｄＭｅｔ−ｄＰｒｏ−ｄＣｙｓ−ｄＰｈｅ−ｄＴｈｒ−ｄＴｈｒ−ｄＡｓｐ−ｄＨｉｓ−ｄＧｌｎ−ｄＭｅｔ−ｄＡｌａ−ｄＡｒｇ−ｄＡｒｇ−ｄＣｙｓ−ｄＡｓｐ−ｄＡｓｐ−ｄＣｙｓ−ｄＣｙｓ−ｄＧｌｙ−ｄＧｌｙ−ｄＡｒｇ−ｄＧｌｙ−ｄＡｒｇ−ｄＧｌｙ−ｄＬｙｓ−ｄＣｙｓ−ｄＴｙｒ−ｄＧｌｙ−ｄＰｒｏ−ｄＧｌｎ−ｄＣｙｓ−ｄＬｅｕ−ｄＣｙｓ−ｄＡｒｇ−ＯＨ酢酸塩（ジスルフィド結合、空気酸化）；分子量：４０６５．６Ｄａ。
別の実施形態において、Ｄ−アミノ酸ペプチドの全てが、以下の式を有することができる：Ｈ−ｄＭｅｔ−ｄＣｙｓ−ｄＭｅｔ−ｄＰｒｏ−ｄＣｙｓ−ｄＰｈｅ−ｄＴｈｒ−ｄＴｈｒ−ｄＡｓｐ−ｄＨｉｓ−ｄＧｌｎ−ｄＭｅｔ−ｄＡｌａ−ｄＡｒｇ−ｄＡｒｇ−ｄＣｙｓ−ｄＡｓｐ−ｄＡｓｐ−ｄＣｙｓ−ｄＣｙｓ−ｄＧｌｙ−ｄＧｌｙ−ｄＡｌａ−ｄＧｌｙ−ｄＡｒｇ−ｄＧｌｙ−ｄＬｙｓ−ｄＣｙｓ−ｄＴｙｒ−ｄＧｌｙ−ｄＰｒｏ−ｄＧｌｎ−ｄＣｙｓ−ｄＬｅｕ−ｄＣｙｓ−ｄＡｒｇ−ＯＨ酢酸塩（ジスルフィド結合、空気酸化）。
別の実施形態において、Ｄ−アミノ酸ペプチドの全てが、以下の式を有することができる：Ｈ−ｄＭｅｔ−ｄＣｙｓ−ｄＭｅｔ−ｄＰｒｏ−ｄＣｙｓ−ｄＰｈｅ−ｄＴｈｒ−ｄＴｈｒ−ｄＡｓｐ−ｄＨｉｓ−ｄＧｌｎ−ｄＭｅｔ−ｄＡｌａ−ｄＡｒｇ−ｄＡｌａ−ｄＣｙｓ−ｄＡｓｐ−ｄＡｓｐ−ｄＣｙｓ−ｄＣｙｓ−ｄＧｌｙ−ｄＧｌｙ−ｄＡｌａ−ｄＧｌｙ−ｄＡｒｇ−ｄＧｌｙ−ｄＬｙｓ−ｄＣｙｓ−ｄＴｙｒ−ｄＧｌｙ−ｄＰｒｏ−ｄＧｌｎ−ｄＣｙｓ−ｄＬｅｕ−ｄＣｙｓ−ｄＡｒｇ−ＯＨ酢酸塩（ジスルフィド結合、空気酸化）。
別の実施形態において、Ｄ−アミノ酸ペプチドの全てが、以下の式を有することができる：Ｈ−ｄＭｅｔ−ｄＣｙｓ−ｄＭｅｔ−ｄＰｒｏ−ｄＣｙｓ−ｄＰｈｅ−ｄＴｈｒ−ｄＴｈｒ−ｄＡｓｐ−ｄＨｉｓ−ｄＧｌｎ−ｄＭｅｔ−ｄＡｌａ−ｄＡｒｇ−ｄＡｌａ−ｄＣｙｓ−ｄＡｓｐ−ｄＡｓｐ−ｄＣｙｓ−ｄＣｙｓ−ｄＧｌｙ−ｄＧｌｙ−ｄＡｒｇ−ｄＧｌｙ−ｄＡｒｇ−ｄＧｌｙ−ｄＬｙｓ−ｄＣｙｓ−ｄＴｙｒ−ｄＧｌｙ−ｄＰｒｏ−ｄＧｌｎ−ｄＣｙｓ−ｄＬｅｕ−ｄＣｙｓ−ｄＡｒｇ−ＯＨ酢酸塩（ジスルフィド結合、空気酸化）。
別の実施形態において、Ｄ−アミノ酸ペプチドの全てが、以下の式を有することができる：Ｈ−ｄＭｅｔ−ｄＣｙｓ−ｄＭｅｔ−ｄＰｒｏ−ｄＣｙｓ−ｄＰｈｅ−ｄＴｈｒ−ｄＴｈｒ−ｄＡｓｐ−ｄＨｉｓ−ｄＧｌｎ−ｄＭｅｔ−ｄＡｌａ−ｄＡｒｇ−ｄＸａａ−ｄＣｙｓ−ｄＡｓｐ−ｄＡｓｐ−ｄＣｙｓ−ｄＣｙｓ−ｄＧｌｙ−ｄＧｌｙ−ｄＸａａ−ｄＧｌｙ−ｄＡｒｇ−ｄＧｌｙ−ｄＬｙｓ（６−ＩＣＧヘキサノイル）−ｄＣｙｓ−ｄＴｙｒ−ｄＧｌｙ−ｄＰｒｏ−ｄＧｌｎ−ｄＣｙｓ−ｄＬｅｕ−ｄＣｙｓ−ｄＡｒｇ−ＯＨ酢酸塩（ジスルフィド結合、空気酸化）（式中、ｄＸａａは、ｄＡｒｇ、ｄＡｌａ、又はｄＬｙｓである）。
別の実施形態において、Ｄ−アミノ酸ペプチドの全てが、以下の式を有することができる：Ｈ−ｄＭｅｔ−ｄＣｙｓ−ｄＭｅｔ−ｄＰｒｏ−ｄＣｙｓ−ｄＰｈｅ−ｄＴｈｒ−ｄＴｈｒ−ｄＡｓｐ−ｄＨｉｓ−ｄＧｌｎ−ｄＭｅｔ−ｄＡｌａ−ｄＡｒｇ−ｄＡｒｇ−ｄＣｙｓ−ｄＡｓｐ−ｄＡｓｐ−ｄＣｙｓ−ｄＣｙｓ−ｄＧｌｙ−ｄＧｌｙ−ｄＡｒｇ−ｄＧｌｙ−ｄＡｒｇ−ｄＧｌｙ−ｄＬｙｓ（６−ＩＣＧヘキサノイル）−ｄＣｙｓ−ｄＴｙｒ−ｄＧｌｙ−ｄＰｒｏ−ｄＧｌｎ−ｄＣｙｓ−ｄＬｅｕ−ｄＣｙｓ−ｄＡｒｇ−ＯＨ酢酸塩（ジスルフィド結合、空気酸化）；分子量：４７６５Ｄａ。
別の実施形態において、Ｄ−アミノ酸ペプチドの全てが、以下の式を有することができる：Ｈ−ｄＭｅｔ−ｄＣｙｓ−ｄＭｅｔ−ｄＰｒｏ−ｄＣｙｓ−ｄＰｈｅ−ｄＴｈｒ−ｄＴｈｒ−ｄＡｓｐ−ｄＨｉｓ−ｄＧｌｎ−ｄＭｅｔ−ｄＡｌａ−ｄＡｒｇ−ｄＡｒｇ−ｄＣｙｓ−ｄＡｓｐ−ｄＡｓｐ−ｄＣｙｓ−ｄＣｙｓ−ｄＧｌｙ−ｄＧｌｙ−ｄＡｌａ−ｄＧｌｙ−ｄＡｒｇ−ｄＧｌｙ−ｄＬｙｓ（６−ＩＣＧヘキサノイル）−ｄＣｙｓ−ｄＴｙｒ−ｄＧｌｙ−ｄＰｒｏ−ｄＧｌｎ−ｄＣｙｓ−ｄＬｅｕ−ｄＣｙｓ−ｄＡｒｇ−ＯＨ酢酸塩（ジスルフィド結合、空気酸化）。
別の実施形態において、Ｄ−アミノ酸ペプチドの全てが、以下の式を有することができる：Ｈ−ｄＭｅｔ−ｄＣｙｓ−ｄＭｅｔ−ｄＰｒｏ−ｄＣｙｓ−ｄＰｈｅ−ｄＴｈｒ−ｄＴｈｒ−ｄＡｓｐ−ｄＨｉｓ−ｄＧｌｎ−ｄＭｅｔ−ｄＡｌａ−ｄＡｒｇ−ｄＡｌａ−ｄＣｙｓ−ｄＡｓｐ−ｄＡｓｐ−ｄＣｙｓ−ｄＣｙｓ−ｄＧｌｙ−ｄＧｌｙ−ｄＡｌａ−ｄＧｌｙ−ｄＡｒｇ−ｄＧｌｙ−ｄＬｙｓ（６−ＩＣＧヘキサノイル）−ｄＣｙｓ−ｄＴｙｒ−ｄＧｌｙ−ｄＰｒｏ−ｄＧｌｎ−ｄＣｙｓ−ｄＬｅｕ−ｄＣｙｓ−ｄＡｒｇ−ＯＨ酢酸塩（ジスルフィド結合、空気酸化）。
別の実施形態において、Ｄ−アミノ酸ペプチドの全てが、以下の式を有することができる：Ｈ−ｄＭｅｔ−ｄＣｙｓ−ｄＭｅｔ−ｄＰｒｏ−ｄＣｙｓ−ｄＰｈｅ−ｄＴｈｒ−ｄＴｈｒ−ｄＡｓｐ−ｄＨｉｓ−ｄＧｌｎ−ｄＭｅｔ−ｄＡｌａ−ｄＡｒｇ−ｄＡｌａ−ｄＣｙｓ−ｄＡｓｐ−ｄＡｓｐ−ｄＣｙｓ−ｄＣｙｓ−ｄＧｌｙ−ｄＧｌｙ−ｄＡｒｇ−ｄＧｌｙ−ｄＡｒｇ−ｄＧｌｙ−ｄＬｙｓ（６−ＩＣＧヘキサノイル）−ｄＣｙｓ−ｄＴｙｒ−ｄＧｌｙ−ｄＰｒｏ−ｄＧｌｎ−ｄＣｙｓ−ｄＬｅｕ−ｄＣｙｓ−ｄＡｒｇ−ＯＨ酢酸塩（ジスルフィド結合、空気酸化）。
本発明は、本明細書に記載されたＤ−アミノ酸クロロトキシン及びＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体のコンジュゲートをさらに含む。例えばＤ−アミノ酸クロロトキシン及びＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体は、例えばペプチドの薬理学的性質を修飾し得る、様々な部分とコンジュゲートさせることができる。幾つかの実施形態において、ペプチドのアミノ酸配列内のリジンの幾つか又は全てを、アラニン又はアルギニンと交換して、Ｎ末端コンジュゲーションを容易にすることができる（例えば、リジンのアミノ末端から競合を低減することによる）。
例えば、本発明は、以下の配列：ＭＣＭＰＣＦＴＴＤＨＱＭＡＲＸＣＤＤＣＣＧＧＸＧＲＧＸＣＹＧＰＱＣＬＣＲ（ここで、アミノ酸の幾つか又は全ては、Ｄ−アミノ酸であり、Ｘは、Ｋ、Ａ又はＲを含み得る）と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８３％、８５％、８６％、８９％、９０％、９２％又は９５％同一のアミノ酸配列を有する、Ｄ−アミノ酸クロロトキシン及びＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体を含むことができる。幾つかの実施形態において、クロロトキシン変異体は、天然アミノ酸の代わりにＤ−アミノ酸である、少なくとも３つの配列内アミノ酸を有することができる。幾つかの実施形態において、クロロトキシン変異体の配列内のアミノ酸の少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、又は少なくとも３５が、天然アミノ酸の代わりにＤ−アミノ酸を含むことができる。ある特定の実施形態において、クロロトキシン変異体の配列内のアミノ酸の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％が、天然アミノ酸の代わりにＤ−アミノ酸を含むことができる。
Ｄ−アミノ酸クロロトキシン及びＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体のコンジュゲートは、ペプチドの様々な位置にコンジュゲートされた部分を含むことができる。例えばその部分を、クロロトキシン配列（例えば、Ｌｙｓ−１５、Ｌｙｓ−２３、及び／又はＬｙｓ−２７）内のリジン残基（例えば、Ｌ−又はＤ−アミノ酸形態）の任意の１つにコンジュゲートさせることができる。あるいは、該ペプチドを、リジン残基が存在しないように変異させてもよい。幾つかの実施形態において、該部分を、Ｄ−アミノ酸クロロトキシンペプチド及びＤ−アミノ酸クロロトキシンペプチド変異体のＮ末端にコンジュゲートさせることができる。幾つかの実施形態において、該部分を、該ペプチド内のアミノ酸の少なくとも１つにコンジュゲートさせることができる。
ある特定の実施形態において、Ｄ−アミノ酸クロロトキシン及びＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体を、対象において検出（例えば、視覚化）され得る検出可能な標識（例えば、色素）などの部分にコンジュゲートさせることができる。幾つかの実施形態において、Ｄ−アミノ酸クロロトキシン及び／又はＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体を、検出可能な標識にコンジュゲートさせて、コンジュゲートされたペプチドの生体分布の追跡を可能にすることができる。検出可能な標識としては、蛍光標識（例えば、蛍光色素）を挙げることができる。
ある特定の実施形態において、蛍光標識は、特定の適用に望ましい発光特性を有することができる。例えば蛍光標識は、５００ｎｍ〜１１００ｎｍの範囲内、６００ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲内、６００〜８００ｎｍの範囲内、６５０ｎｍ〜８５０ｎｍの範囲内、７００ｎｍ〜８００ｎｍの範囲内、７２０〜７８０ｎｍの範囲内、又は７２０〜７５０ｎｍの範囲内に最大発光波長を有する蛍光色素であってもよい。当業者は、検出可能な標識として使用され得て先の発光特性を有する様々な色素を認識するであろう。例えばある特定の条件下で、シアニン５．５は、６９５ｎｍ前後に最大発光を有することができ、ＩＲｄｙｅ８００は、８００ｎｍ前後に最大発光を有することができ、インドシアニンは、８２０ｎｍ前後に最大発光を有することができる。
本開示のコンジュゲート分子として使用され得る蛍光色素の非限定的例としては、ローダミン、ロドール、フルオレセイン、チオフルオレセイン、アミノフルオレセイン、カルボキシフルオレセイン、クロロフルオレセイン、メチルフルオレセイン、スルホフルオレセイン、アミノロドール、カルボキシロドール、クロロロドール、メチルロドール、スルホロドール；アミノローダミン、カルボキシローダミン、クロロローダミン、メチルローダミン、スルホローダミン、及びチオローダミン、シアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニン、メロシアニン、オキサジアゾール誘導体、ピリジルオキサゾール、ニトロベンゾオキサジアゾール、ベンゾオキサジアゾール、ピレン誘導体、カスケードブルー、オキサジン誘導体、ナイルレッド、ナイルブルー、クレシルバイオレット、オキサジン１７０、アクリジン誘導体、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリジンイエロー、アリールメチン誘導体、オーラミン、クリスタルバイオレット、マラカイトグリーン、テトラピロール誘導体、ポルフィリン、フタロシアニン、及びビリルビンが挙げられる。幾つかの実施形態において、検出可能な標識としては、Ｃｙ５．５、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、ＤｙＬｉｇｈｔ７５０、又はＩＲｄｙｅ８００などの近赤外色素を挙げることができるが、それらに限定されない。幾つかの実施形態において、近赤外色素としては、シアニン色素（例えば、シアニン２、シアニン３、シアニン３．５、シアニン５、シアニン５．５、シアニン７）を挙げることができる。ある特定の実施形態において、検出可能な標識としては、キサンテン色素、又はスルホン化キサンテン色素、例えばアレクサフルオル（例えば、アレクサフルオル５９４、アレクサフルオル６３３、アレクサフルオル６４７、アレクサフルオル７００）を挙げることができる。加えて、色素への抗体が、同定され得る場合、コンジュゲートされた色素を、追跡、検出又は視覚化マーカとして、そして検索ハンドルとして利用することができる。
ペプチドへの他の修飾を、利用することができる。例えばＤ−アミノ酸クロロトキシン及び／又はＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体が、例えば血清中半減期に影響を及ぼし得る、翻訳後修飾（例えば、メチル化及び／又はアミド化）を含むことができる。幾つかの実施形態において、Ｄ−アミノ酸クロロトキシン及び／又はＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体を、例えばペプチドの特性を改変し得る、又は特性変化を実行し得る、他の部分にコンジュゲートさせることができる。コンジュゲートされた部分は、例えば血清アルブミンへの可逆的結合を介してペプチドの半減期を延長する親油性部分であってもよい。幾つかの実施形態において、簡単な炭素鎖（例えば、ミリストイル化）を、ペプチドにコンジュゲートさせることができる。幾つかの実施形態において、親油性部分は、コレステン、コレスタン、コレスタジエン、及びオキシステロールをはじめとするコレステロール、又はコレステロール誘導体であってもよい。幾つかの実施形態において、該ペプチドは、ミリスチン酸（テトラデカン酸）又はその誘導体にコンジュゲートさせることができる。
コンジュゲートされたＤ−アミノ酸クロロトキシン及び／又はＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体は、組織又は体液からペプチドを検索するためのアフィニティーハンドル（例えば、ビオチン）の提供など他の役割を果たし得る他の部分にコンジュゲートさせることもできる。例えば、本発明のライブラリー内のペプチドを、ビオチンにコンジュゲートさせることもできる。ビオチンは、半減期の延長に加えて、組織又は他の位置のペプチドを検索するためのアフィニティーハンドルとして作用することもできる。幾つかの実施形態において、検出可能な標識及びアフィニティーハンドルとして作用し得る蛍光ビオチンコンジュゲートを、使用することができる。市販の蛍光ビオチンコンジュゲートの非限定的例としては、Ａｔｔｏ４２５−ビオチン、Ａｔｔｏ４８８−ビオチン、Ａｔｔｏ５２０−ビオチン、Ａｔｔｏ−５５０ビオチン、Ａｔｔｏ５６５−ビオチン、Ａｔｔｏ５９０−ビオチン、Ａｔｔｏ６１０−ビオチン、Ａｔｔｏ６２０−ビオチン、Ａｔｔｏ６５５−ビオチン、Ａｔｔｏ６８０−ビオチン、Ａｔｔｏ７００−ビオチン、Ａｔｔｏ７２５−ビオチン、Ａｔｔｏ７４０−ビオチン、フルオレセインビオチン、ビオチン−４−フルオレセイン、ビオチン−（５−フルオレセイン）コンジュゲート、ビオチン−Ｂ−フィコエリトリン、アレクサフルオル４８８ビオシチン、アレクサフルオル５４６、アレクサフルオル５４９、ルシファーイエローカダベリンビオチン−Ｘ、ルシファーイエロービオシチン、オレゴングリーン４８８ビオシチン、ビオチン−ローダミン及びテトラメチルローダミンビオシチンが挙げられる。幾つかの他の例において、該コンジュゲートとしては、化学発光化合物、コロイド金属、発光化合物、酵素、放射性同位体、及び常磁性標識を挙げることができる。
幾つかの実施形態において、本発明は、Ｄ−アミノ酸クロロトキシンペプチド及び／又はＤ−アミノ酸クロロトキシンペプチド変異体を検出する方法を提供する。一態様において、本発明は、対象においてペプチドを検出する方法を含む。該方法は、Ｄ−アミノ酸クロロトキシンペプチド及び／又はＤ−アミノ酸クロロトキシンペプチド変異体を含む組成物の有効量を、対象に投与することを含むことができる。該ペプチドは、検出可能な標識を含むことができ、該方法は、検出可能な標識からのシグナルを検出することをさらに含むことができる。幾つかの実施形態において、該ペプチドは、投与後に、クロロトキシンターゲットを発現する組織（例えば、細胞）に結合することができ、該方法は、対象の組織に結合されたペプチドからシグナルを検出して、組織へのペプチドの結合レベルを決定することを含むことができる。ある特定の実施形態において、正常な組織と比較した、組織へのペプチドの結合レベル上昇を検出することで、該組織がクロロトキシンターゲットを発現する腫瘍組織を含むことが示され得る。検出の方法は、組織へのペプチド結合を検出することに加えて、例えば対象の血中及び／又は組織中のペプチドを検出することにより、患者の体内のペプチドを追跡することを含むことができる。
本発明は、対象における組織（例えば、癌組織）を検出及び／又は画像化する方法をさらに含む。Ｄ−アミノ酸クロロトキシンペプチド及び／又はＤ−アミノ酸クロロトキシンペプチド変異体は、様々なクロロトキシンターゲットに結合することができる。例えば、幾つかの実施形態において、クロロトキシンターゲットとしては、アネキシンＡ２及びカルパクチンを挙げることができる。Ｄ−アミノ酸クロロトキシンペプチド及び／又はＤ−アミノ酸クロロトキシンペプチド変異体を含む組成物は、クロロトキシンターゲットへの結合親和性により、対象に投与することができ、その後、該ペプチドがクロロトキシンターゲットに特異的に結合することができる。クロロトキシンターゲットへの結合の検出及び／又は画像化を利用して、例えばアネキシンＡ２及びカルパクチンなどのクロロトキシンターゲットを有する組織を同定することができる。
結合の検出及び／又は画像化は、例えば対象がクロロトキシンターゲットを有する（例えば、発現する）細胞に関連する疾患、状態及び／又は障害を有するかどうかを決定するために、利用することもできる。幾つかの実施形態において、該方法は、検出可能な標識からシグナルを検出することにより、対象における領域の画像を得ることを含むことができる。例えば該領域としては、癌組織が挙げられ、該ペプチドは、癌組織に結合し、それにより癌組織の検出及び／又は画像化を提供することができる。コンジュゲートされた色素を、例えば腫瘍（例えば、脳腫瘍）に特異的に結合し得るＤ−アミノ酸クロロトキシン及びＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体を利用した腫瘍の画像化において、用いることができる。幾つかの実施形態において、該領域としては、腫瘍が挙げられ、該ペプチドは、腫瘍に結合し、それにより腫瘍の画像化を提供することができる。幾つかの実施形態において、該領域としては、脳腫瘍が挙げられ、該ペプチドは、脳腫瘍に結合し、それにより脳腫瘍の画像化を提供することができる。ある特定の実施形態において、本発明は、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、脈絡叢癌、上衣腫、他の脳腫瘍、神経芽細胞腫、頭頸部癌、肺癌、乳癌、腸癌、膵臓癌、肝臓癌、腎臓癌、肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、癌腫、黒色腫（メラニン欠乏性黒色腫を含む）、卵巣癌、子宮頸癌、リンパ腫、甲状腺癌、肛門癌、大腸癌、子宮内膜癌、胚細胞腫瘍、喉頭癌、多発性骨髄腫、前立腺癌、網膜芽細胞腫、胃癌、精巣癌、及びウィルムス腫瘍に関連する癌組織の検出及び／又は画像化を含むことができる。幾つかの実施形態において、該癌組織は、神経膠腫、皮膚癌、肺癌、リンパ腫、髄芽細胞腫、前立腺癌、膵臓癌、又はそれらの組み合わせに関連し得る。
幾つかの実施形態において、該癌組織は、乳癌及び乳腺癌（breast and mammary cancers）、結腸癌、皮膚癌、肺癌、リンパ腫、神経膠腫、髄芽細胞腫、前立腺癌、膵臓癌、口腔扁平上皮癌、及び／又は血管外皮細胞腫に関連し得る。
一態様において、本発明は、対象の腫瘍を画像化するためのペプチドをさらに含む。該ペプチドは、少なくとも３つのＤ−アミノ酸を有するアミノ酸配列を含むことができ、該ペプチドは、腫瘍に結合するように構成された二次構造を有し、検出可能な標識をさらに含む。本明細書に記載されたペプチドは、例えば、アネキシンＡ２及びカルパクチンなどのクロロトキシンターゲットに結合する形状を有する二次構造を有することができる。幾つかの実施形態において、該ペプチドは、本明細書に記載されたＤ−アミノ酸クロロトキシン及び／又はＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体などの結び目のあるペプチドを含む。ある特定の実施形態において、該ペプチドは、天然クロロトキシンのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含むことができる。検出可能な標識は、例えば該ペプチドのＮ末端及び／又は該ペプチドのリジン残基にコンジュゲートすることができる。
Ｄ−アミノ酸クロロトキシンペプチドを、治療及び／又は診断適用などの様々な他の適用に用いることができる。幾つかの実施形態において、Ｄ−アミノ酸クロロトキシン及びＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体を、疾患を処置する方法に用いることができる。幾つかの実施形態において、Ｄ−アミノ酸クロロトキシンペプチドを用い、薬物を、クロロトキシン−薬物コンジュゲートを介して、例えば対象の脳の腫瘍に、送達することができる。
本発明は、本明細書に記載されたＤ−アミノ酸クロロトキシン及び／若しくはＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体、又はそれらのコンジュゲートを、対象に投与して、診断及び／又は治療適用を容易にするための組成物も提供する。ある特定の実施形態において、該組成物は、医薬的に許容し得る賦形剤を含むことができる。本発明において有用な医薬賦形剤としては、結合剤、充填剤、崩壊剤、滑沢剤、コーティング、甘味剤、香味剤及び着色剤が挙げられるが、それらに限定されない。他の医薬的賦形剤が、本明細書において有用となることを、当業者は認識するであろう。本明細書で用いられる用語「医薬組成物」は、例えば錠剤、カプセル、丸薬などの固体及び／又は液体投与剤形を包含する。
本発明のＤ−アミノ酸クロロトキシン及び／若しくはＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体、又はそれらのコンジュゲートは、当該技術分野で利用可能な任意の適切な技術により、例えば組成物として、投与されてもよい。本発明のＤ−アミノ酸クロロトキシン及び／若しくはＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体、又はそれらのコンジュゲートを、１時間ごと、１日ごと、１週間ごと、又は１ヶ月ごとなど、必要に応じて頻繁に投与することができる。本発明の方法で用いられるＤ−アミノ酸クロロトキシン及び／若しくはＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体、又はそれらのコンジュゲートは、例えば用いられる方法の要件に応じて変動させ得る投与量で、投与することができる。本明細書に記載されたＤ−アミノ酸クロロトキシン及び／若しくはＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体、又はそれらのコンジュゲートは、非経口、皮下、静脈内、気管内、鼻腔内、皮内、筋肉内、結腸内、直腸内、尿道内又は腹腔内をはじめとする様々な方法で対象に投与することができる。幾つかの実施形態において、該医薬組成物は、非経口、静脈内、筋肉内又は経口投与することができる。幾つかの実施形態において、該Ｄ−アミノ酸クロロトキシン及び／若しくはＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体、又はそれらのコンジュゲートは、全身に投与することができる。幾つかの実施形態において、該組成物は、対象のリンパ節（複数可）への送達など、腫瘍内及び／又は結節内に投与することができる。ある特定の実施形態において、投与としては、経口投与、直腸投与、及び胃の栄養管又は十二指腸の栄養管による投与など、経腸投与を挙げることができる。投与としては、静脈注射、動脈注射、筋肉注射、脳内、脳室内又は皮下（皮膚の下への）投与を挙げることもできる。幾つかの実施形態において、投与は、皮膚上（皮膚への塗布）及び吸入をはじめとする局所手段により実行することができる。
本明細書に記載されたＤ−アミノ酸クロロトキシン及び／若しくはＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体、又はそれらのコンジュゲートを含む経口剤は、液体、錠剤、カプセルなどの経口投与用の任意の適切な形態であってもよい。経口配合剤を、さらにコーティング又は処置して、胃内での溶解を予防又は低減させることができる。本発明の組成物は、当該技術分野で公知の任意の適切な方法を利用して対象に投与することができる。本発明において使用される適切な配合剤及び送達方法は、当該技術分野で概ね周知である。例えば本明細書に記載された本発明のＤ−アミノ酸クロロトキシン及び／若しくはＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体、又はそれらのコンジュゲートを、医薬的に許容し得る希釈剤、担体又は賦形剤と共に医薬組成物として配合することができる。該組成物は、ｐＨ調整及び緩衝剤、等張化剤、湿潤剤など、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンなどをはじめとするおおよその生理学的条件に必要な医薬的に許容し得る補助物質を含有していてもよい。
本明細書で用いられる「対象」は、ヒト又は非ヒト動物である。幾つかの実施形態において、対象は、マウス、ラット、ウサギ、ヒト又は他の動物を挙げることができるが、それらに限定されない。別の実施形態において、対象は、ヒト、例えば癌を有するヒト、又は癌を有するリスクのあるヒトである。幾つかの実施形態において、対象又は生物学的供給源は、悪性疾患、障害又は状態（例えば、癌）などの疾患、障害又は状態を有すること、又は有するリスクのあることが疑われていてもよい。ある特定の実施形態において、対象又は生物学的供給源は、高増殖性疾患（例えば、癌腫、肉腫）を有すること、又は有するリスクがあることが疑われてもよく、本開示のある特定の他の実施形態において、対象又は生物学的供給源は、そのような疾患、障害又は状態のリスク又は存在がないことが知られていてもよい。
「処置」、「処置すること」又は「改善すること」は、治療的処置又は防御的／予防的処置のいずれかを指す。処置が、処置を受ける個体の疾患（例えば、癌などの高増殖性障害）の少なくとも１つの症状が改善すれば治療であり、又は処置は、個体の進行性疾患の悪化を遅延させても、若しくはさらなる関連疾患（例えば、癌の転移）の発病を予防してもよい。
本明細書に記載されたＤ−アミノ酸クロロトキシン及び／又はＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体を含む組成物の「治療有効量（又は用量）」又は「有効量（又は用量）」は、統計学的に有意な手法で疾患の１つ以上の症状の改善をもたらすのに十分な化合物量を指す。単独で投与された個々の有効成分を参照する場合、治療有効用量は、その単独での成分（例えば、本明細書に記載されたＤ−アミノ酸クロロトキシン及び／又はＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体）を指す。組み合わせを参照する場合、治療有効用量は、連続で投与されるか、又は同時に投与されるかにかかわらず（同じ配合又は別個の配合で）、治療効果をもたらす有効成分の混合量を指す。
用語「医薬的に許容し得る」は、当該技術分野で周知の経路を利用して対象に投与される場合に、アレルギー又は他の重篤な有害反応を生じない分子物質又は組成物を指す。
「必要とする患者」又は「必要とする対象」は、本明細書に記載されたＤ−アミノ酸クロロトキシン及び／又はＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体による処置又は改善を受け易い疾患、障害又は状態（例えば、癌）のリスクがある、又はそれに罹患した患者又は対象を指す。
一態様において、本発明は、クロロトキシンターゲットを発現する細胞に関連する疾患を処置する方法を含む。該方法は、それを必要とする対象に、Ｄ−アミノ酸クロロトキシン及び／又はＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体を含む医薬組成物の治療有効量を投与し、それにより該疾患を処置することを含むことができる。幾つかの実施形態において、クロロトキシンターゲットとしては、アネキシンＡ２、カルパクチン、又はそれらの組み合わせを挙げることができる。
幾つかの実施形態において、Ｄ−アミノ酸クロロトキシン及び／又はＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体は、処置を容易にする他の薬剤をさらに含むことができる。例えばＤ−アミノ酸クロロトキシン及び／又はＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体は、細胞毒性剤（例えば、有糸分裂阻害剤）、毒素、アンチセンスヌクレオチド、癌処置薬（例えば、アルキル化剤）、ヌクレオチド薬、抗代謝薬、代謝調整剤、放射線増感剤、ペプチド治療薬、ペプチド−薬物コンジュゲート、放射性核種、又はそれらの組み合わせをさらに含むことができる。
細胞毒性剤は、例えば細胞増殖を阻害することにより、癌を処置するのに用いられ得る薬物を含むことができる。幾つかの例示的細胞毒性剤としては、例えばビンカアルカロイド、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞毒性ヌクレオシド、タキサン及びエポチロンを挙げることができる。これらの分類の要素としては、例えばドキソルビシン、カルミノマイシン、ダウノルビシン、アミノプテリン、メトトレキサート、メトプテリン、ジクロロメトトレキサート、マイトマイシンＣ、ポルフィロマイシン、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド、ポドフィロトキシン又はポドフィロトキシン誘導体、例えばエトポシド、リン酸エトポシド又はテニポシド、メルファラン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ロイロシジン（leurosidine）、ビンデシン、ロイロシン、パクリタキセル、並びにそれらの治療上有効な類似体及び誘導体が挙げられる。他の有用な抗悪性腫瘍剤としては、エストラムスチン、シスプラチン、カルボプラチン、シクロフォスファミド、ブレオマイシン、ゲムシチビン、イフォスアミド（ifosamide）、メルファラン、ヘキサメチルメラミン、チオテパ、シタラビン、イダトレキサート、トリメトレキサート、ダカルバジン、Ｌ−アスパラギナーゼ、カンプトテシン、ＣＰＴ−１１、トポテカン、ａｒａ−Ｃ、ビカルタミド、フルタミド、リュープロリド、ピリドベンゾインドール誘導体、インターフェロン及びインターロイキンが挙げられる。
適切な代謝調整剤としては、ロニダミン、ジクロロアセタート、α−トコフェリルスクシナート、メチルジャスモナート、ベツリン酸、及びレスベラトロールを挙げることができるが、それらに限定されない。
放射線増感剤は、電磁放射線、例えばＸ線の毒性作用に対して癌細胞の感受性を上昇させることが公知である。Ｘ線により活性化する放射線増感剤の例としては、メトロニダゾール、ミソニダゾール、デスメチルミソニダゾール、ピモニダゾール、エタニダゾール、ニモラゾール、マイトマシインＣ、ＲＳＵ１０６９、ＳＲ４２３３、ＥＯ９、ＲＢ６１４５、ニコチンアミド、５−ブロモデオキシウリジン（ＢＵｄＲ）、５−ヨードデオキシウリジン（ＩＵｄＲ）、ブロモデオキシシチジン、フルオロデオキシウリジン（ＦｕｄＲ）、ヒドロキシ尿素、シスプラチン、並びにそれらの治療上有効な類似体及び誘導体が挙げられるが、それらに限定されない。
幾つかの実施形態において、Ｄ−アミノ酸クロロトキシン及び／又はＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体は、放射性核種及び／又は複合体化された放射性核種を含むことができる。適切な放射性核種としては、Ｓｃ−４７、Ｇａ−６７、Ｙ−９０、Ａｇ−１１１、Ｉｎ−１１１、Ｓｍ−１５３、Ｔｂ−１６６、Ｌｕ−１７７、Ｂｉ−２１３、Ａｃ−２２５、Ｃｕ−６４、Ｃｕ−６７、Ｐｄ−１０９、Ａｇ−１１１、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ｐｔ−１９７、Ｂｉ−２１２、Ｂｉ−２１３、Ｐｂ−２１２又はＲａ−２２３を挙げることができるが、それらに限定されない。
ある特定の実施形態において、本発明は、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、脈絡叢癌、上衣腫、他の脳腫瘍、神経芽細胞腫、頭頸部癌、肺癌、乳癌、腸癌、膵臓癌、肝臓癌、腎臓癌、肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、癌腫、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、リンパ腫、甲状腺癌、肛門癌、大腸癌、子宮内膜癌、胚細胞腫瘍、喉頭癌、多発性骨髄腫、前立腺癌、網膜芽細胞腫、胃癌、精巣癌、及びウィルムス腫瘍などの疾患、障害、及び／又は状態を処置することを含むことができる。幾つかの実施形態において、該方法は、神経膠腫、皮膚癌、肺癌、リンパ腫、髄芽細胞腫、前立腺癌、膵臓癌、又はそれらの組み合わせなどの疾患、障害、及び／又は状態を処置することを含むことができる。ある特定の実施形態において、該方法は、乳癌及び乳腺癌（breast and mammary cancers）、結腸癌、皮膚癌、肺癌、リンパ腫、神経膠腫、髄芽細胞腫、前立腺癌、膵臓癌、口腔扁平上皮癌、及び／又は血管外皮細胞腫を処置するために用いることができる。
本発明は、本明細書に記載されたＤ−アミノ酸クロロトキシン及び／又はＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体を投与する方法をさらに含む。例えば、一態様において、本発明は、該ペプチドが正常組織よりも腫瘍組織を選択的にターゲットとするように、本明細書に記載されたＤ−アミノ酸クロロトキシン及び／若しくはＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体、又は本明細書に記載されたＤ−アミノ酸クロロトキシン及び／若しくはＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体を含む組成物の有効用量を、腫瘍を有する対象に投与するステップを含む方法を含む。
該方法は、対象の癌組織（例えば、腫瘍）の外科的除去を容易にすることをさらに含むことができる。例えば本発明は、該ペプチドが正常組織よりも癌組織（例えば、腫瘍）を選択的にターゲットとするように、本明細書に記載されたＤ−アミノ酸クロロトキシン及び／若しくはＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体、又は本明細書に記載されたＤ−アミノ酸クロロトキシン及び／若しくはＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体を含む組成物の有効用量を、癌組織（例えば、腫瘍）を有する対象に投与することを含む方法を含むことができる。該方法は、例えば該ペプチドの結合増加を示す組織を検出することにより、癌組織を画像化し、それにより癌組織の位置を示すことを含むことができる。位置の同定は、対象から癌組織を外科的に除去するステップをもたらすことができる。外科的除去は、例えば本明細書に記載されたＤ−アミノ酸クロロトキシン及び／又はＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体の結合により同定される、癌組織の手術中の視覚化を含むことができる。
本発明は、本明細書に記載されたＤ−アミノ酸クロロトキシン及びＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体を対象に投与して、診断及び／又は治療適用を容易にするための組成物も提供する。ある特定の実施形態において、該組成物は、医薬的に許容し得る賦形剤を含むことができる。本発明において有用な医薬賦形剤としては、結合剤、充填剤、崩壊剤、滑沢剤、コーティング、甘味剤、香味剤及び着色剤が挙げられるが、それらに限定されない。他の医薬的賦形剤が、本明細書において有用となることを、当業者は認識するであろう。本明細書で用いられる用語「医薬組成物」は、例えば錠剤、カプセル、丸薬などの固体及び／又は液体投与剤形を包含する。
本発明のＤ−アミノ酸クロロトキシン及びＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体は、１時間ごと、１日ごと、１週間ごと、又は１ヶ月ごとなど、必要に応じて頻繁に投与することができる。本発明の方法で用いられるＤ−アミノ酸クロロトキシン及びＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体は、例えば用いられる方法の要件に応じて変動させ得る投与量で、投与することができる。本明細書に記載されたＤ−アミノ酸クロロトキシン及びＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体は、非経口、皮下、静脈内、気管内、鼻腔内、皮内、筋肉内、結腸内、直腸内、尿道内又は腹腔内をはじめとする様々な方法で対象に投与することができる。幾つかの実施形態において、該医薬組成物は、非経口、静脈内、筋肉内又は経口投与することができる。幾つかの実施形態において、該組成物は、対象のリンパ節（複数可）への送達など、腫瘍内及び／又は結節内に投与することができる。ある特定の実施形態において、投与は、経口投与、直腸投与、及び胃の栄養管又は十二指腸の栄養管による投与など、経腸投与を含むことができる。投与は、静脈注射、動脈注射、筋肉注射、脳内、脳室内又は皮下（皮膚の下への）投与を含むこともできる。
本明細書に記載された薬物候補（例えば、ペプチド）を含む経口剤は、液体、錠剤、カプセルなどの経口投与用の任意の適切な形態であってもよい。経口配合剤を、さらにコーティング又は処置して、胃内での溶解を予防又は低減させることができる。本発明の組成物は、当該技術分野で公知の任意の適切な方法を利用して対象に投与することができる。本発明において使用される適切な配合剤及び送達方法は、当該技術分野で概ね周知である。例えば本明細書に記載された薬物候補（例えば、ペプチド）を、医薬的に許容し得る希釈剤、担体又は賦形剤と共に医薬組成物として配合することができる。該組成物は、ｐＨ調整及び緩衝剤、等張化剤、湿潤剤など、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンなどをはじめとするおおよその生理学的条件に必要な医薬的に許容し得る補助物質を含有していてもよい。
本発明は、Ｄ−アミノ酸クロロトキシン及び／又はＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体の機能的アッセイをさらに含む。Ｄ−アミノ酸クロロトキシン及び／又はＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体、並びにそれらのコンジュゲートの、腫瘍又は癌組織に結合する能力を、インビトロ結合、エクスビボ画像化、動物モデル、及び当該技術分野で公知の他のアッセイにより、これまで記載された通りアッセイすることができる。腫瘍細胞及び腫瘍組織への結合を検出及び測定するための機能的アッセイの記載については、例えば、米国特許出願公開第２００８０２７９７８０号及び国際公開第２０１１／１４２８５８号を参照されたい（両者とも参照により本明細書に取り込まれる）。
当業者は、Ｄ−アミノ酸クロロトキシン及び／又はＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体、並びにそれらのコンジュゲートのインビボ活性を測定するのに有用な動物モデルについて熟知しているであろう。例えば、米国国立癌研究所は、特定の癌モデルのデータベースを保持している。米国国立癌研究所のウェブサイトにある「Cancer Models Database」を参照されたい。動物は全て、National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animalsに厳密に従って取り扱われる。ＮＤ２：ＳｍｏＡ１髄芽細胞腫マウス、ＴＲＡＭＰ前立腺癌マウス、並びにＡｐｃ１６３８Ｎ腸腺腫及び腺癌マウスは、これまで記載されている。Fodde, R., et al., A targeted chain-termination mutation in the mouse Apc gene results in multiple intestinal tumors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1994. 91(19): p. 8969-73；Greenberg, N. M., et al., Prostate cancer in a transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1995. 92(8): p. 3439-43；Kaplan-Lefko, P. J., et al., Pathobiology of autochthonous prostate cancer in a pre-clinical transgenic mouse model. Prostate, 2003. 55(3): p. 219-37；Hallahan, A. R., et al., The SmoA1 mouse model reveals that notch signaling is critical for the growth and survival of sonic hedgehog-induced medulloblastomas. Cancer Res., 2004. 64(21): p. 7794-800を参照されたい（それぞれの全体が参照により明確に本明細書に取り込まれる）。
癌のマウスモデルの一例が、髄芽細胞腫の自然発症マウスモデル、ＮＤ２：ＳｍｏＡ１である。A.R. Hallahan, et al., “The SmoAl Mouse Model Reveals That Notch Signaling is Critical for the Growth and Survival of Sonic Hedgehog-Induced Medulloblastomas,” Cancer Research (54:7794-7800, 2004)、 及びB.A. Hatton, et al. “The Smo/Smo Model: Hedgehog-Induced Medulloblastoma With 90% Incidence and Leptomeningeal Spread,” Cancer Research (58: 1768-1776, 2008)を参照されたい。ＡＣ５７Ｍ／６バックグランドを用い、Ｄ−アミノ酸クロロトキシン及び／又はＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体、並びにそれらのコンジュゲートを投与して、正常な組織を上回る癌組織へのペプチド又はペプチドコンジュゲートの優先的結合を評価する。症候性の髄芽細胞腫を有する半接合又はホモ接合（ＮＤ２：ＳｍｏＡ１とも称される）マウスを、これらの試験への登録のために選択する。オープンフィールドケージの評価を利用して、症状を検出する。症状としては、頭位傾斜、猫背、運動失調、頭蓋前突（protruding skull）、及び体重減少を挙げることができる。このアッセイでの陽性結果には、Ｄ−アミノ酸クロロトキシン及び／又はＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体、並びにそれらのコンジュゲートの投与によるこれらの症状の低下、減弱、縮小又は阻害が含まれる。
そのようなアッセイを利用して、例えば神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、脈絡叢癌、上衣腫、他の脳腫瘍、神経芽細胞腫、頭頸部癌、肺癌、乳癌、腸癌、膵臓癌、肝臓癌、腎臓癌、肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、癌腫、黒色腫（メラニン欠乏性黒色腫を含む）、卵巣癌、子宮頸癌、リンパ腫、甲状腺癌、肛門癌、大腸癌、子宮内膜癌、胚細胞腫瘍、喉頭癌、多発性骨髄腫、前立腺癌、網膜芽細胞腫、胃癌、精巣癌、及びウィルムス腫瘍に関連する癌組織をはじめとする様々な癌において、Ｄ−アミノ酸クロロトキシン及び／又はＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体、並びにそれらのコンジュゲートの影響を示すことができる。幾つかの実施形態において、該癌組織は、神経膠腫、皮膚癌、肺癌、リンパ腫、髄芽細胞腫、前立腺癌、膵臓癌、又はそれらの組み合わせに関連し得る。幾つかの実施形態において、該癌組織は、乳癌及び乳腺癌（breast and mammary cancers）、結腸癌、皮膚癌、肺癌、リンパ腫、神経膠腫、髄芽細胞腫、前立腺癌、膵臓癌、口腔扁平上皮癌、及び／又は血管外皮細胞腫に関連し得る。
検出可能な標識を、正常組織よりも癌組織又は腫瘍組織に優先的にターゲットにするためのＤ−アミノ酸クロロトキシン及び／又はＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体、並びにそれらのコンジュゲートの能力を、インビトロ結合、エクスビボ画像化、動物モデル、及び当該技術分野で公知の他のアッセイにより、先に記載された通りアッセイすることができる。例えばＤ−アミノ酸クロロトキシン及び／又はＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体を、本明細書に記載された通り検出可能な標識にコンジュゲートさせて、Ｄ−アミノ酸クロロトキシンコンジュゲート又はＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体コンジュゲートを生成させることができる。Ｄ−アミノ酸クロロトキシンコンジュゲート又はＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体コンジュゲートの適当な量を、進行した腫瘍と一致した臨床兆候を示すマウスの尾静脈に注射することができる。３日後に、マウスを殺処分することができ、その脳を、キャリパー／キセノゲン・スペクトル又はオデッセイ近赤外吸収画像システムなどのバイオフォトニックイメージングシステムを利用して画像化することができる。陽性結果により、該ペプチドコンジュゲートが、正常な組織に比較して癌組織を優先的に発光又は同定することが示される。一実施形態において、正常組織よりも癌組織への、Ｄ−アミノ酸クロロトキシンコンジュゲート又はＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体コンジュゲートの優先的な結合は、ネイティブのクロロトキシンコンジュゲートのそれと実質的に同様である。別の実施形態において、正常組織よりも癌組織への、Ｄ−アミノ酸クロロトキシンコンジュゲート又はＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体コンジュゲートの優先的な結合は、ネイティブなクロロトキシンコンジュゲートのそれよりも低いが正常な組織のそれよりも高い。
当業者は、本明細書に記載されたＤ−アミノ酸クロロトキシン及び／又はＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体、並びにそれらのコンジュゲートをはじめとするＤ−アミノ酸ペプチドの活性を測定するのに有用なエクスビボモデルについて熟知しているであろう。例えば、髄芽細胞腫の検出のために、髄芽細胞腫の症状を示すＮＤ２：ＳｍｏＡ１動物に、Ｄ−アミノ酸クロロトキシン及び／若しくはＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体、又はコンジュゲートを、尾静脈から注射する。注射の３日後に、ＣＯ２吸入を利用してマウスを安楽死させて、脳のエクスビボ・バイオフォトニック画像を、キセノゲン・スペクトル・イメージング・システム（キャリパー）を使用して得る。その後、脳をティッシュー・テック・最適切削温度（ＯＣＴ）コンパウンド（サクラ）中で凍結させて１２μｍ切片に切削し、標準手順に従ってヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色した。陽性の結果から、Ｄ−アミノ酸クロロトキシン及び／若しくはＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体、又はそれらのコンジュゲートが、正常な組織と比較して癌組織を優先的に発光又は同定することが示される。一実施形態において、正常組織よりも癌組織への、Ｄ−アミノ酸クロロトキシン及び／若しくはＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体、又はそれらのコンジュゲートの優先的な結合は、ネイティブのクロロトキシン又はネイティブのクロロトキシンコンジュゲートのそれと実質的に同様である。別の実施形態において、正常組織よりも癌組織への、Ｄ−アミノ酸クロロトキシン及び／若しくはＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体、又はそれらのコンジュゲートの優先的な結合は、ネイティブなクロロトキシン又はネイティブなクロロトキシンコンジュゲートのそれよりも低いが正常な組織のそれよりも高い。
別の例は、前立腺組織画像法に関する。正常及び癌のヒト前立腺組織試料を採取して、ヒト対象ＩＲＢ認可プロトコルにより取り扱う。切片を、５％正常ヤギ血清緩衝液中で、一定量のＤ−アミノ酸クロロトキシンコンジュゲート及び／又はＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体コンジュゲートと共に、４５分間インキュベートする。スライドにＰＢＳ緩衝液中で５分間の洗浄を３回行うことにより、非結合コンジュゲートを減少させる。蛍光顕微鏡測定によりシグナルを検出して、ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色した隣接切片と相関させる。陽性結果から、Ｄ−アミノ酸クロロトキシンコンジュゲート又はＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体コンジュゲートが、正常な組織と比較して癌組織を優先的に発光又は同定することが示される。一実施形態において、正常組織よりも癌組織への、Ｄ−アミノ酸クロロトキシンコンジュゲート又はＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体コンジュゲートの優先的結合が、ネイティブなクロロトキシンコンジュゲートのそれと実質的に同様である。別の実施形態において、正常組織よりも癌組織への、Ｄ−アミノ酸クロロトキシンコンジュゲート又はＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体コンジュゲートの優先的な結合は、ネイティブなクロロトキシンコンジュゲートのそれよりも低いが正常な組織のそれよりも高い。
当業者は、本明細書に記載されたＤ−アミノ酸クロロトキシン及び／又はＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体、並びにそれらのコンジュゲートの活性を測定するのに有用なインビトロモデルについて、熟知しているであろう。例えば、９Ｌ／ｌａｃＺ神経膠肉腫細胞（ＡＴＣＣ、バージニア州所在）及び初代ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）を、それぞれ１％ピルビン酸ナトリウム、１％ストレプトマイシン／ペニシリン及び１０％ＦＢＳ（ハイクローン、ユタ州所在）を補充されたＤＭＥＭ及びＲＰＭＩ培地で維持する。２×１０５細胞を滅菌カバースリップ上に播種し、その３６時間後に標識して共焦顕微鏡測定する。細胞を、５％ＣＯ２に維持された３７℃の加湿されたインキュベータ内で、ＣＴＸ：ＣＹ５．５コンジュゲート（１μＭ）１ｍｌと共に２時間培養した。カバースリップを細胞培養培地で２回、そしてＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した。このステップに続いて、細胞膜を１μＭのＦＭ １−４３ＦＸ（モレキュラー・プローブス、オレゴン州所在）溶液で、室温の暗所で２０分間染色し、ＰＢＳで２回洗浄して、４％パラホルムアルデヒドで固定する。細胞核を４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、シグマ・アルドリッチ、ミズーリ州所在）で染色する。ＤＡＰＩ、ＴＲＩＴＣ、及びＣｙ５フィルターを備えたデルタビジョンＳＡ３.1ワイドフィールド・デコンボリューション顕微鏡（アプライド・プレシジョン、ワシントン州所在）を用いて、共焦顕微鏡画像を得る。ＳｏｆｔＷｏＲＸ（アプライド・プレシジョン、ワシントン州所在）を使用して、画像処理を実施する。陽性結果から、Ｄ−アミノ酸クロロトキシン若しくはＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体、又はそれらのコンジュゲートが、正常な組織と比較して癌組織を優先的に発光又は同定することが示される。一実施形態において、正常な組織よりも癌組織への、Ｄ−アミノ酸クロロトキシン若しくはＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体、又はそれらのコンジュゲートの優先的な結合は、ネイティブなクロロトキシン又はネイティブなクロロトキシンコンジュゲートのそれと実質的に同様である。別の実施形態において、正常組織よりも癌組織への、Ｄ−アミノ酸クロロトキシン若しくはＤ−アミノ酸クロロトキシン変異体、又はそれらのコンジュゲートの優先的な結合は、ネイティブなクロロトキシン又はネイティブなクロロトキシンコンジュゲートのそれよりも低いが正常な組織のそれよりも高い。
別のモデルは、９Ｌラット神経膠肉腫細胞株（ＡＴＣＣ）及びＲＨ３０横紋筋肉腫細胞株を用いてｎｕ／ｎｕ（ヌード）マウスで作製された皮下異種移植片の使用を含む。異種移植片は、１：１比の無血清培地及びマトリゲル中で懸濁された１００万個の９Ｌ又はＲＨ３０細胞を用いて作製する。頭蓋内異種移植片は、ブレグマに対して３ｍｍ側方及び後方の脳に１０μｌのＰＢＳ中に懸濁された１００万個の９Ｌ細胞の定位的注射により作製する。
ライブラリーを作製する方法
さらに別の態様において、本発明は、潜在的な薬物候補を作製する方法を含む。例えば当該技術分野で概ね周知の方法を利用して、低分子ライブラリー及び高分子生物製剤（例えば、抗体）ライブラリーを作製することができる。
幾つかの実施形態において、本発明は、作製されたペプチドライブラリーのためのペプチドを作製する方法を含む。様々な方法が、ペプチドライブラリーを作製するのに適している。本明細書にさらに記載される通り、本発明は、ペプチドライブラリーを作製するための出発点として用いられ得るスカフォールドを含む。これらのスカフォールドと、非常に多様なスカフォールド変異体を、複数の異なるアプローチを利用して作製することができる。幾つかの態様において、該ペプチドライブラリーは、当該技術分野で概ね周知のペプチド合成技術を利用して生成することができる。従来のオリゴヌクレオチド合成技術（例えば、チップによるオリゴヌクレオチド合成）を、利用することもできる。幾つかの例において、該合成アプローチを、様々な発現系と組み合わせることができる。１つの例示的実施形態において、スカフォールド内の特定の残基の位置を、縮重コドンを用いたランダムな突然変異誘発のためのターゲットにして、例えばチップによるオリゴヌクレオチド合成を用いて生成され得るＤＮＡの多様な組み合わせを作製することができ、そしてスカフォールド変異体の大きなライブラリーをコードすることができる。幾つかの実施形態において、該方法は、薬理学的性質を有するペプチドの少なくとも幾つかを含むペプチドライブラリーを作製することをさらに含む。ある特定の実施形態において、該方法は、該ペプチドの少なくとも幾つかをスクリーニングして、どのペプチドが、タンパク質：タンパク質相互作用を阻害する活性、リセプターの拮抗を阻害する活性、リセプターへのアゴニスト結合を阻害する活性、イオンチャネルを調節する活性、シグナル伝達経路を阻害する活性、シグナル伝達経路を活性化する活性、及び／又はタンパク質：低分子相互作用を阻害する活性を示すか、を同定することをさらに含む。幾つかの実施形態において、タンパク質：タンパク質相互作用は、癌、感染性疾患、炎症性疾患、免疫疾患、代謝疾患、心臓疾患、加齢に関連する疾患、及び神経疾患からなる群から選択される疾患又は障害に関連づけられる。ある特定の実施形態において、タンパク質：タンパク質相互作用は、癌に関連づけられる。幾つかの実施形態において、該方法は、対象から複数の試料を得ることをさらに含み、各試料は、複数のペプチドを投与した後の異なる時点で得られる。ある特定の実施形態において、複数のペプチドのうちの少なくとも１つのペプチドは、少なくとも１つのペプチドを対象において追跡するために検出可能な標識を含む。ある特定の実施形態において、検出可能な標識は、近赤外色素を含む。
幾つかの実施形態において、スカフォールド及びスカフォールド変異体をコードする分子は、様々な発現系の中で発現することができ、幾つかの実施形態において、融合系の一部として組み合わせることができる。スカフォールド及びスカフォールド変異体をコードするＤＮＡ分子は、例えば２９３ＨＥＫ又は大腸菌（E.coli）など、複数の異なる細胞型で発現され得る融合系と組み合わせることができる。２９３ＨＥＫ細胞の融合物としては、例えばＩｇＫリーダー配列並びに／又は分泌された融合タンパク質、例えばシデロカリン、リポカリン２、及びヒト血清アルブミンを挙げることができるが、それらに限定されない。
幾つかの実施形態において、本明細書に記載されたペプチド（例えば、結び目のあるペプチド）は、リポカリンタンパク質との融合物として発現することができる。一態様において、本発明は、ペプチドを生成する方法であって、ペプチド（例えば、結び目のあるペプチド）及びリポカリンタンパク質を含む融合タンパク質を細胞内で発現することを含み得る、方法を含む。該方法は、該ペプチドをリポカリンタンパク質から分離し、それによりペプチド（例えば、結び目のあるペプチド）を生成することをさらに含むことができる。本発明は、リポカリンタンパク質及び該ペプチド（例えば、結び目のあるペプチド）を含む融合タンパク質の組成物をさらに含む。この融合系は、伝統的な融合系を超えるペプチド（例えば、結び目のあるペプチド）を生成するための様々な利点を提供する。限定するわけではなく背景情報として、リポカリンは、８本のβバレルと隣接するαへリックスを特徴とする１つの保存されたフォールドを有し得るタンパク質の一分類である。Ｌｃｎ２、ＮＧＡＬ及びシデロカリンと同様にリポカリンタンパク質の、哺乳動物細胞内での発現レベルは、Ｆｃ融合物をはじめとする多くの他の融合系と等しいか、又はそれらを上回っている。
本明細書に記載されたペプチド（例えば、結び目のあるペプチド）は、様々なリポカリンタンパク質を用いて発現することができる。幾つかの実施形態において、シデロカリンは、分泌パートナーとして用いられる。シデロカリンは、例えばより大きなタンパク質に対してシデロカリンのサイズが小さいことから（成熟タンパク質は、１７８アミノ酸であり、２０５４７Ｄａの分子量を有する）、融合パートナーのより大きなタンパク質として有用である。また、シデロカリン内のＣ８７Ｓの突然変異は、二量体化を防ぐことができ、純粋な単量体融合タンパク質を生成する。シデロカリン内に存在する単一の分子内ジスルフィド結合は、その安定性を上昇させる。同じくシデロカリンのみが、単一のＮ−結合グリコシル化部位を有し、分泌前にＥＲ内での正しいプロセシングを行う。幾つかの実施形態において、該ペプチドは、ネズミＬｃｎ２（２４ｐ３としても公知）との融合ペプチドとして発現することもでき、分泌パートナーとして非常に良好に作用する。他の相同体を用いることもできる。加えて、本明細書で提供されるペプチド（例えば、結び目のあるペプチド）は、Ｌｃｎ１、Ｌｃｎ６、Ｌｃｎ８、Ｌｃｎ９、Ｌｃｎ１０、Ｌｃｎ１２、Ｌｃｎ１５をはじめとするリポカリンファミリーの他の要素と共に融合系として発現することもできる。
幾つかの実施形態において、Ｌｃｎ２との融合物としてのペプチド（例えば、結び目のあるペプチド）の発現を、自己開裂するＬｃｎ２と共に、ＣＩＤＧの直後のＲＡＲＹＫＲと共に、そして外部開裂されたものをその位置のＥＮＬＹＦＱと共に、利用することができる。前者は、タンパク質輸送の間に哺乳動物細胞により開裂することができ（例えば、フリンによる）、遊離Ｌｃｎ２及び結び目のあるペプチドを、周囲の培地に分泌させることができる。ＥＮＬＹＦＱは、タバコエッチプロテアーゼ部位であり、哺乳動物細胞で内在的に見出されることはない。この系の構造体は、融合物として分泌することができ、外部ＴＥＶプロテアーゼの付加により結び目のあるペプチドを後に切断することができる。これは、ノッチンを回収するのに有用となり得る。幾つかの実施形態において、ポリヒスチジン又はポリアルギニンなどの精製「ハンドル」がＬｃｎ２に付加され得、続いてタンパク質分解により除去される。結び目のあるペプチドに加えて、これらの融合系を、ケモカイン、インターロイキン、及びペプチドホルモンなどの医療的関心のある発現困難なタンパク質にも用いることができる。
リポカリン融合物（例えば、結び目のあるペプチドと融合されたシデロカリン及び／又はＬｃｎ２）を、複数の異なる方法で用いることができる。半減期を増加させるために、標的タンパク質（例えば、潜在的治療薬）のサイズを増加させるのに、リポカリン融合物を用いることができる。標的タンパク質が自然に細胞質中で発現される場合には、リポカリン融合物を標的タンパク質を分泌させるのに用いることができる。Ｌｃｎ２は、特有のリガンド特異性も有し、カテコラートシデロフォア（細菌の鉄キレート物質）に強く結合する。これは、Ｌｃｎ２融合物に、化学療法若しくは放射線試薬などの特異的リガンド、又は有益な特性を有する幾つかのタイプ若しくは１つの化合物を充填するという可能性を開く。シデロフォア及び鉄が充填されたＬｃｎ２は、クロマトグラフィー又は他の精製ステップを支援し得る深紅色を有する。
リポカリン融合系は、複数の他の利点に加えて、比較的短時間の枠で多量のタンパク質を作製するのに用いることができる。幾つかの実施形態において、得られるタンパク質の量は、約１０ｍｇ／Ｌ未満、約２０ｍｇ／Ｌ未満、約４０ｍｇ／Ｌ未満、約５０ｍｇ／Ｌ未満、約１００ｍｇ／Ｌ未満、約１５０ｍｇ／Ｌ未満、約１８０ｍｇ／Ｌ未満、又は約２００ｍｇ／Ｌ未満であってもよい。幾つかの実施形態において、得られるタンパク質の量は、約１０ｍｇ／Ｌ〜２００ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ〜２００ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ〜２００ｍｇ／Ｌ、及び約１５０ｍｇ／Ｌ〜２００ｍｇ／Ｌであってもよい。
他の実施形態において、本明細書に記載されたペプチドの幾つかは、文献で知られる様々な方法で発現させることができる。例えば、該ペプチドは、大腸菌、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、及びシュードモナス・フルオレセンス（pseudomonas fluoresceins）をはじめとする細菌系内で発現される。大腸菌のための発現プラットフォームとしては、ペリプラズム発現又は細胞質発現を挙げることができる。ペリプラズム発現では、融合体としては、ｐｅＩＢ、ｄｓｂＡ、及びＥｘＦＡＢＰ融合体を挙げることができる。細胞質融合体としては、低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）融合体を挙げることができる。該ペプチドは、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）及びピキア・パストリス（Pichia pastoris）をはじめとする酵母系内で発現させることもできる。該ペプチドは、昆虫細胞系、並びに植物及び哺乳動物系をはじめとする真核生物系において発現させることもできる。
幾つかの態様において、本明細書に開示されたペプチドは、トランスフェクション、つまり外来性ＤＮＡを真核生物細胞の核に導入することを含む技術により合成することができる。幾つかの態様において、該ペプチドは、一過性トランスフェクションにより合成することができる（ＤＮＡは真核生物細胞のゲノムを組み込まず、遺伝子は２４〜９６時間、発現される）。様々な方法を、宿主細胞への外来性ＤＮＡ導入に用いることができ、トランスフェクションは、リン酸カルシウム、デンドリマー、リポソーム、及びカチオンポリマーの使用などの化学的手段により実現することができる。トランスフェクションの非化学的方法としては、電気穿孔、ソノポレーション、光学トランスフェクション、プロトプラスト融合、インペールフェクション（impalefection）、及び水力学的送達が挙げられる。幾つかの実施形態において、トランスフェクションは、ＤＮＡを不活性固体のナノ粒子に連結させ、その後それを標的細胞の核に直接「発射」する、遺伝子銃をはじめとする粒子系の方法により実現することができる。他の粒子系のトランスフェクション法には、磁気支援によるトランスフェクション及びインペールフェクションがある。
ＤＮＡは、担体としてウイルスを利用し、レトロウイルス又はレンチウイルスを利用して、細胞に導入することもできる（ウイルス形質導入）。幾つかの実施形態において、本発明のペプチドは、ダイダロス発現系を利用して調製することができる。全体が参照により本明細書に取り込まれる、Ashok D. Bandaranayake et al., Nucleic Acids Res. 2011 November; 39(21): e143。この技術は、無血清哺乳動物培養系と組み合わせてもよい。そして、タグのないタンパク質を発現させることも可能であり、それを単回のサイズ排除ステップで、培地から直接、高レベルで精製することができる。
一態様において、本発明は、何百から何千、又はそれを超えるペプチド変異体を高レベルで作製する方法を提供する。結び目のあるペプチドを作製するための従来の方法は、結び目のあるペプチドの活性が該ペプチドの適正なフォールディングに依存し得ることに限定される可能性がある。製造の間に適正にフォールティングする結び目のあるペプチドを作製する場合、成功が限られてきた。本発明は、当該技術分野で公知の他の技術により、これらの問題を克服している。図４に、本発明のペプチドライブラリーを作製する例示的方法を示している。図示された通り、ウイルスは、特定のオリゴヌクレオチド配列をパッケージングすること、該配列をウイルスに導入すること、及び該ペプチドを発現すること、により生成することができる。該ペプチドの回収及びスケールアップを実施することができ、その後、試料を精製及びアッセイすることができる。そのプロセスは、効率的に（例えば、３週間以内に）実施することができ、多量のペプチド（例えば、２００ｍｇ／リットル）を生成することができる。幾つかの例において、クロマトグラフィーによる精製は、本明細書に記載された方法による製造純度に起因して必要にならない可能性がある。
例示的実施形態において、本発明は、開裂可能なリンカーによりシデロカリンに融合された結び目のあるペプチドの融合タンパク質を含む。図５に、結び目のあるペプチドライブラリーを作製するのに用いられ得る例示的融合系を示している。図示された通り、該融合系は、ＩｇＫ ＳＰ、ｓＦＬＡＧ、ＨＩＳ、シデロカリン、ＴＥＶ、及び該当する結び目のあるペプチド配列をはじめとする配列を含む。幾つかの実施形態において、これらの融合物を、ダイダロス発現系と組み合わせることができる。全体が参照により本明細書に取り込まれる、Ashok D. Bandaranayake et al., Nucleic Acids Res. 2011 November; 39(21): e143。レンチウイルスを利用して、ヒト腎細胞株のＨＥＫ２９３細胞への迅速な安定発現を得ることができる。シデロカリンは、この系において高度に発現させることができ、例えば結び目のあるペプチドの発現も支援する働きがある。開裂可能なリンカーの性質により、該タンパク質が発現されている時、又は後に外来的に添加されたプロテアーゼにより、融合物を開裂させることができる。シデロカリン融合パートナーは、例えば任意の発現困難なタンパク質のための一般化可能な発現増大系になる可能性があり、より低分子のペプチドのサイズを増加させるため、そして／又はペプチドの血清中半減期を改善するための、タグとして用いることができる（例えば、最終的な融合タンパク質のサイズを糸球体濾過限界を超えて増大させることによる）。
ＨＥＫ２９３細胞は、ロバストであり、一般的なタンパク質発現に用いられるが、レンチウイルスは、様々な細胞に感染することができる。これを、タンパク質が発現される際に該タンパク質を開裂させる系と組み合わせることで、オートクリン又はパラクリンの手法で働く分泌ペプチド（即ち、それらは、ペプチドを分泌している細胞上で、又は細胞付近で作用する）に依存する強力なアッセイの組み合わせが可能になる。この例が、ペプチド発現するレンチウイルスのライブラリーにより癌標的細胞を感染させ、その後、アポトーシスの兆候（アネキシンＶ発現）を示す細胞についてフローサイトメトリーにより、それらの細胞をスクリーニングすることである。アポトーシスストレスの兆候を示す細胞を選別して、ウイルスのシークエンシングを行い、オートクリンの方式で、アポトーシスを誘導しているペプチドを発現する細胞を本質的に探索することができた。関連するスクリーニングのセットを、分散限定性のマトリックス（例えば、軟寒天）内で実施することができ、そこでペプチド発現細胞を標的細胞と混合し、寒天によりペプチドの拡散を限定させた。標的細胞の死滅したエリアは、活性分泌ペプチドの指標となる。この手法で実施されたスクリーニングは、デコンボリューションがペプチドを得た遺伝子のシークエンシングと同程度に簡単であるため、非常に大きなライブラリーを使用することができる。
幾つかの実施形態において、本発明は、ノッチンを生成する方法を包含することができ、それにより従来の結合スクリーニング（例えば、標的分子がカラム又はビーズにつなぎ留められていて、候補薬物が標的への親和性により同定されるスクリーニング）の中で使用するための哺乳動物細胞の表面に、ノッチンタンパク質をつなぎ留めた状態にしておくことができる。本明細書に記載された方法は、他の公知方法（例えば、ファージ又は酵母ディスプレイ）とは異なり、先に記載された「規則」（例えば、ペプチド内の酸性／塩基性アミノ酸の比）に従って設計されていて、インビボ創薬プロセスを通して樹立することができ、そして／又は既に特定の生物物理学的及び薬理学的性質について予めスクリーニングされている、ペプチドライブラリーを発現する、融合系（例えば、本発明のシデロカリン系）を使用する。これらの方法において、例えば全てのＤＮＡ配列およびタンパク質生成物は既に公知であり、既に検証されている（例えば、ペプチドの全てが適正にフォールティングしていて、血清中半減期が改善されている）。提示されたタンパク質が未知で過去に検証されておらず、代わりにランダムな配列を有し（突然変異誘発性オリゴヌクレオチド及び縮重ＮＮＮコドンを利用）、莫大なサイズ（一般には１０７を超える）のライブラリーを生成して、タンパク質の多くは有害突然変異により適正にフォールティングしない、他の公知のディスプレイ技術に対して、本発明の方法は正反対である。
幾つかの態様において、本発明は、質量で定義された薬物候補ライブラリーを作製する方法であって、複数の薬物候補を生成し、該薬物候補の少なくとも幾つかがそれぞれ特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャを有すること、及び質量分析を利用して該複数の薬物候補を分析して、該薬物候補の少なくとも幾つかに関して特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャを測定すること、を含む、方法に関する。ある特定の実施形態において、該方法は、質量で定義された薬物候補ライブラリー内の薬物候補の同一性が、薬物候補それぞれの特有の質量シグネチャを又は消化フラグメント質量シグネチャにより決定され得る、薬理学的性質に基づいて作製された、複数の薬物候補の少なくとも幾つかを含む質量で定義された薬物候補ライブラリーを作製することを含む。
本発明はさらに、質量で定義された薬物候補ライブラリーを作製する方法であって、複数の薬物候補を生成し、該薬物候補の少なくとも幾つかがそれぞれ特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャを有すること、質量分析を利用して該複数の薬物候補を分析して、該薬物候補の少なくとも幾つかに関して特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャを測定すること、及び薬理学的性質に基づいて作製された、複数の薬物候補の少なくとも幾つかを含む質量で定義された薬物候補ライブラリーを作製すること、を含み、質量で定義された薬物候補ライブラリー内の薬物候補の同一性が、薬物候補それぞれの特有の質量シグネチャを又は消化フラグメント質量シグネチャにより決定され得る、方法に関する。
幾つかの実施形態において、複数の薬物候補の少なくとも１つは、少なくとも１つの薬物候補の特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャを修飾するための重同位体原子を所定の数含む。ある特定の実施形態において、該重同位体原子は、１３Ｃ又はジュウテリウムを含む。幾つかの実施形態において、複数の結び目のあるペプチドの少なくとも１つの該特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャは、少なくとも１つの結び目のあるペプチドにコンジュゲートされた部分により定義される。ある特定の実施形態において、該部分は、少なくとも１つの結び目のあるペプチドのＮ末端にコンジュゲートされている。幾つかの実施形態において、該部分は、少なくとも１つの結び目のあるペプチドの特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャを修飾するために重同位体原子を所定の数含む。ある特定の実施形態において、重同位体原子は、１３Ｃ又はジュウテリウムを含む。幾つかの実施形態において、該複数の結び目のあるペプチドは、１００を超えるペプチド、１０００を超えるペプチド、又は１００００を超えるペプチドを含む。
幾つかの実施形態において、複数の薬物候補は、結び目のあるペプチドを含む。ある特定の実施形態において、結び目のあるペプチドの特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャは、結び目のあるペプチドの天然のアミノ酸配列により定義される。ある特定の実施形態において、複数の薬物候補の少なくとも１つは、少なくとも１つの薬物候補の特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャを修飾するために、重同位体原子を所定の数含む。ある特定の実施形態において、重同位体原子は、１３Ｃ又はジュウテリウムを含む。
幾つかの実施形態において、複数の結び目のあるペプチドの少なくとも１つの該特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャは、少なくとも１つの結び目のあるペプチドにコンジュゲートされた部分により定義される。ある特定の実施形態において、該部分は、少なくとも１つの結び目のあるペプチドのＮ末端にコンジュゲートされている。ある特定の実施形態において、該部分は、少なくとも１つの結び目のあるペプチドの特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャを修飾するために重同位体原子を所定の数含む。ある特定の実施形態において、重同位体原子は、１３Ｃ又はジュウテリウムを含む。ある特定の実施形態において、該複数の結び目のあるペプチドは、１００を超えるペプチドを含む。ある特定の実施形態において、該複数の結び目のあるペプチドは、１０００を超えるペプチドを含む。ある特定の実施形態において、該複数の結び目のあるペプチドは、１００００を超えるペプチドを含む。
本発明は、異なる投与経路により対象に投与される結び目のあるペプチドの分布プロファイルを決定する方法であって、軽い結び目のあるペプチドを対象に投与し、該軽い結び目のあるペプチドが、第一の送達経路により投与され、該軽い結び目のあるペプチドと同じ配列を有する重い結び目のあるペプチドよりも低い分子量を有すること；重い結び目のあるペプチドを対象に投与し、該重い結び目のあるペプチドが、第一の送達経路とは異なる第二の送達経路により投与されること；並びに対象の組織又は体液試料から得られた軽い結び目のあるペプチドの量を重い結び目のあるペプチドの量と比較し、それによりそれぞれ第一の送達経路及び第二の送達経路に基づき、対象における軽い結び目のあるペプチド及び重い結び目のあるペプチドの分布プロファイルを決定すること、を含む、方法をさらに提供する。
幾つかの実施形態において、軽い結び目のあるペプチドは、軽い結び目のあるペプチドよりも少なくかつ重い同位体を含む。幾つかの実施形態において、該重い結び目のあるペプチドは、軽い結び目のあるペプチドよりも少なくとも１つ多い１３Ｃ原子又はジュウテリウム原子を含む。ある特定の実施形態において、第一の結び目のあるペプチドは、第一の部分にコンジュゲートされていて、重い結び目のあるペプチドは、第二の部分にコンジュゲートされている。他の実施形態において、第一の部分、第二の部分又はそれらの両方は、それぞれ軽い結び目のあるペプチド及び重い結び目のあるペプチドのＮ末端にコンジュゲートされている。ある特定の実施形態において、第一の部分、第二の部分又はそれらの両方は、疎水性部分を含む。
幾つかの実施形態において、軽い結び目のあるペプチドは、軽い結び目のあるペプチドよりも少なくかつ重い同位体を含む。他の実施形態において、該重い結び目のあるペプチドは、軽い結び目のあるペプチドよりも少なくとも１つ多い１３Ｃ原子又はジュウテリウム原子を含む。ある特定の実施形態において、第一の結び目のあるペプチドは、第一の部分にコンジュゲートされていて、重い結び目のあるペプチドは、第二の部分にコンジュゲートされている。ある特定の実施形態において、第一の部分、第二の部分又はそれらの両方は、それぞれ軽い結び目のあるペプチド及び重い結び目のあるペプチドのＮ末端にコンジュゲートされている。幾つかの実施形態において、第一の部分、第二の部分又はそれらの両方は、疎水性部分を含む。幾つかの実施形態において、少なくとも１つの１３Ｃ原子が、第一の部分、第二の部分又はそれらの両方の中に存在する。幾つかの実施形態において、軽い結び目のあるペプチド、重い結び目のあるペプチド、及びそれらの両方は、質量分析により分析されると、特有の質量シグネチャ又は消化質量シグネチャを有する。
幾つかの実施形態において、少なくとも１つの１３Ｃ原子は、第一の部分、第二の部分又はそれらの両方の中に存在する。他の実施形態において、軽い結び目のあるペプチド、重い結び目のあるペプチド、及びそれらの両方は、質量分析により分析されると、特有の質量シグネチャ又は消化質量シグネチャを有する。
幾つかの実施形態において、複数のペプチドのうちの少なくとも１つのペプチドは、該少なくとも１つのペプチドのＮ末端にコンジュゲートされた疎水性部分を含み、該少なくとも１つのペプチドは、該疎水性部分を欠く少なくとも１つのペプチドに比較して、半減期の増加を示す。ある特定の実施形態において、疎水性部分は、疎水性蛍光色素、又は飽和若しくは不飽和アルキル基を含む。
幾つかの実施形態において、複数のペプチドのうちの少なくとも１つのペプチドは、少なくとも１つのペプチドを対象において追跡するために検出可能な標識を含む。ある特定の実施形態において、検出可能な標識は、近赤外色素を含む。
ライブラリーを分析する方法
本発明により提供される、作製されたライブラリーは、様々な方法を利用して分析することができ、様々な適用のための情報を決定するために用いることができる。本明細書に提供された方法は、複数の試料のうちの少なくとも幾つかの試料を分析して、該複数のうちの各試料において、薬理学的性質を有するペプチドの少なくとも幾つかの同一性を決定することをさらに含む。幾つかの実施形態において、該ペプチドの少なくとも幾つかの同一性は、質量分析を利用して決定され、そこで該ペプチドのそれぞれが、質量分析計により検出される特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャを含む。他の実施形態において、複数の薬物候補は、５を超える薬物候補、１０を超える薬物候補、１００を超える薬物候補、１０００を超える薬物候補、又は１００００を超える薬物候補を含む。ある特定の実施形態において、複数のペプチドのうちの少なくとも１つのペプチドは、対象において少なくとも１つのペプチドを追跡するために検出可能な標識を含む。ある特定の実施形態において、該検出可能な標識は、近赤外色素を含む。
一態様において、該方法は、ライブラリー内の該ペプチドの幾つか又は全てが特有の質量シグネチャ又は消化フラグメントシグネチャ（例えば、トリプシンによる）を有する、ペプチドライブラリーを作製することを含む。ある特定の態様において、作製されたペプチドライブラリーのペプチドは、トリプシンなどの酵素を用いてより小さくより管理可能なフラグメントに消化される。それを実行することにより、ペプチド試料は、より容易に、質量分析により分析することができる。
図６に示す通り、作製されたペプチドライブラリーを、質量分析を利用して分析して、ライブラリー内のペプチド全てを個別に同定することができる。ペプチドのそれぞれが、例えば特有のトリプシン分解フラグメントを有することができる。視覚化を、複数の電荷状態のペプチドについて得ることができ、ＭＳ／ＭＳにより、同一性が明確になり、それにより品質管理をプロセスに固有に加えることができる。
幾つかの実施形態において、質量で定義されたペプチドライブラリーのプールを、様々な適用に用いることができる。本明細書に開示された方法を利用して（例えば、チップによるオリゴヌクレオチド）、何千ものペプチドのライブラリーを完全に定義して、各要素が特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャを有するライブラリーを創出するために用いることができる。幾つかの例において、各ペプチドの同一性を、その質量によりコードして、例えば大量の識別子でペプチドをふさぐディスプレイ法では実現され得ないアッセイを実行することができる。例えば、ペプチドを提示する要素（ファージ、酵母、ＲＮＡ）のサイズそのものが組み合わせの挙動を左右するため、血液脳関門を越えるペプチド又は細胞透過を行わないために細胞内ターゲットと相互作用するペプチドを見出すためにディスプレイ法を使用することは、実行できそうにない。該ペプチドは、余分をほとんど、又は全く含まないため（おそらく、ビオチン、色素、タグ、又は他のわずかな修飾以外）、それらの挙動はペプチドそのものの品質の真の尺度である。この特色は、経口生物学的利用度、血中半減期、血液脳関門透過性、及び特定の臓器又は腫瘍へのホーミングについて、何千ものペプチドを同時にテストするために用いられ得るインビボ系において特に有利である。
一態様において、本発明は、質量で定義された薬物候補ライブラリーを作製する方法を含むことできる。該方法は、例えば薬物候補の少なくとも幾つかがそれぞれ特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャを有する薬物候補を複数生成することを含むことができる。該方法は、質量分析を利用して該複数の薬物候補を分析して、該薬物候補の少なくとも幾つかに関して特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャを測定すること、も含むことができる。該方法は、質量で定義された薬物候補ライブラリー内の薬物候補の同一性が、薬物候補それぞれの特有の質量シグネチャを又は消化フラグメント質量シグネチャにより決定され得る、薬理学的性質に基づいて作製された、複数の薬物候補の少なくとも幾つかを含む質量で定義された薬物候補ライブラリーを作製することをさらに含むことができる。薬理学的性質としては、例えば経口生物学的利用度、血液脳関門を通過する能力、血液脳関門による排除、血清中半減期、細胞を透過する能力、細胞内オルガネラ若しくは他の細胞内ドメインに侵入する能力、又はそれらの組み合わせを挙げることができる。
幾つかの態様において、質量分析による大きなペプチドライブラリーの分析は、類似の分子量を有し得る多数のペプチド及び／又はペプチドフラグメントを分析することを含むことができ、それによりペプチドの明確な同定を妨害し得る比較的込み合った質量スペクトルをもたらすことができる。幾つかの実施形態において、分析されるライブラリーを、質量が異なる薬物候補（例えば、ペプチド）を有するサブライブラリーに分別し、それにより質量スペクトルを疎らにして、特有の質量シグネチャのより効率的な同定を可能にする。
幾つかの実施形態において、スカフォールド内の１つ以上の原子を、自然に通常見出される原子質量又は質量数とは異なる原子質量又は質量数を有する同位体と交換することにより、特有の質量シグネチャを有するペプチドのライブラリを作製することもできる。幾つかの実施形態において、ライブラリー内のペプチドの質量を、本明細書でさらに記載された同位体標識されたコンジュゲート又はタグを添加することにより変更することができる。本発明のペプチドライブラリーに組み込まれ得る同位体の例としては、窒素、酸素、水素、炭素、フッ素及び塩素、臭素、硫黄及びケイ素の同位体が挙げられる。例えば本明細書で作製されたライブラリーのペプチドは、少なくとも１つの１５Ｎ原子、少なくとも１つの１７Ｏ原子、少なくとも１つの１８Ｏ原子、少なくとも１つの２Ｈ原子、少なくとも１つの３Ｈ原子、少なくとも１つの１３Ｃ、１４Ｃ、１８Ｆ、３７Ｃｌ、少なくとも１つの７６Ｂｒ、少なくとも１つの３３Ｓ原子、３４Ｓ原子、３６Ｓ原子、少なくとも１つの２９Ｓｉ原子、又は少なくとも１つの３０Ｓｉ原子が互いに異なっている。
幾つかの実施形態において、作製されたライブラリーのペプチド及び／又はペプチドコンジュゲートは、少なくとも１原子、少なくとも２原子、少なくとも３原子、少なくとも４原子、少なくとも５原子、少なくとも６原子、少なくとも７原子、少なくとも８原子、少なくとも９原子、又は少なくとも１０原子の同位体置換により互いに異なり得る。幾つかの実施形態において、約１０を超える原子、約１５を超える原子、約２０を超える原子、約２５を超える原子、約３０を超える原子、約３５を超える原子、約４０を超える原子、約４５を超える原子、約５０を超える原子を、同位体原子により置換させることができる。幾つかの実施形態において、ペプチド及び／又はペプチドコンジュゲートは、全ての１Ｈ、１２Ｃ、１４Ｎ、１６Ｏ若しくは３２Ｓ、又はそれらの任意の組み合わせの同位体置換により異なり得る。
本発明のペプチドライブラリーは、ペプチドの幾つか又は全てが特有の質量シグネチャを有するペプチドを含み得る。本発明のペプチドライブラリーは、ＭＳ又はタンデム質量スペクトル（ＭＳ／ＭＳ）分析により分析することができる。様々な質量分析法を、ペプチドを同定するため、そして／又は定量するために本発明の方法で用いることができる。異なるイオン化法、特にエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）と同様のソフトイオン化技術、マトリックス支援レーザ脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）、シリコン上脱離／イオン化（ＤＩＯＳ）、平坦な原子衝撃（flat atom bombardment）（ＦＡＢ）及び液体二次イオン質量分析（ＬＳＩＭＳ）を、作製されたペプチドライブラリーの検査に用いることができる。イオン化技術を、四極型質量分析計、飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析計、四極型イオントラップ、四極−ＴＯＦのハイブリッド、及びフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴＩＣＲ）ＭＳをはじめとする異なる質量分析計により様々な方法で組み合わせることができる。幾つかの実施形態において、該ペプチドライブラリーは、液体クロマトグラフィー（例えば、一体型液体クロマトグラフィー・質量分析システム（ＬＣ−ＭＳ）又はＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）及び／又は他の分離技術を用いて分析することができる。
本発明の方法を利用すれば、非常に多様な（例えば、何千もの）スカフォールド変異体ライブラリーを、生成することができる。さらに、ペプチドのそれぞれを、以下の薬理学的性質：経口生物学的利用度、血液脳関門を通過する能力、血液脳関門による排除、血清中半減期、細胞を透過する能力、又は細胞内オルガネラ若しくは他の細胞内ドメインに侵入する能力、のうちの少なくとも１つを有するライブラリー内のペプチドをスクリーニング及び個別に同定するのに用いられ得る特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャを有するように設計することができる。ペプチドライブラリーの質量に基づく分析についても、コンジュゲートを用いることができる。幾つかの実施形態において、コンジュゲートを用いて、質量分析により識別され得る２つの同一疎水性部分でライブラリーを標識することができる。例えば、異なる同位体を有するコンジュゲートを用いて、異なる質量を有するが、例えば同一又は異なるアミノ酸配列を有する、ペプチドを生成することができる。
本開示の幾つかの態様において、ペプチドライブラリー内のペプチドが、コンジュゲートされている。コンジュゲーションは、ペプチド内の任意の適切な位置で行うことができ、例えば該ペプチドを、ペプチドを構成する任意のアミノ酸残基で、又はそのＮ末端若しくはＣ末端のいずれかでコンジュゲートさせることができる。様々な態様において、本開示のペプチドは、それらのＮ末端でコンジュゲートされている。本発明の幾つかの態様において、ペプチドライブラリーは、コンジュゲートされたペプチドを含むことができる。
コンジュゲーションは、当該技術分野で公知の様々な方法により実施することができる。幾つかの例において、コンジュゲートを、ペプチドライブラリーのＮ末端に付加させる。ペプチドライブラリーと、スクシンイミジルエステルをはじめとするアミン反応性エステルとの反応により、Ｎ−コンジュゲーションを実現することができる。幾つかの態様において、ペプチド内の内部リジン残基にヒットせずにＮ末端に選択的にコンジュゲートするｐＨを利用することにより、コンジュゲーションを実施することができる。幾つかの実施形態において、ペプチドがコンジュゲート可能なリジン残基を含まないように、ペプチドを設計することができる。幾つかの態様において、ペプチドとＮ末端セリン又はトレオニン残基とのコンジュゲーションを、酸化的カップリングにより実現することができる。幾つかの実施形態において、該コンジュゲーションは、ペプチドライブラリー内のペプチド内のリジンに、ある部分をコンジュゲートすることにより完遂することができる。
本開示の幾つかの態様において、コンジュゲートされたペプチドは、コンジュゲートに結合することにより、ペプチドライブラリー内のトリプシン消化されたペプチドフラグメントのプールから単離することができる。例えばコンジュゲートされたペプチドは、コンジュゲートに選択的に結合することにより表面に固定することができる。ある特定の態様において、トリプシンでのタンパク質分解に続いて回収するために、ペプチドのＮ末端をビオチン又はパルミチン酸とコンジュゲートさせる。任意の適切なコンジュゲーション−結合剤の組み合わせを利用して、本開示のペプチドを単離することができる。
本開示の様々な態様において、コンジュゲートされたペプチドフラグメントは、ライブラリー内の他のコンジュゲートされたペプチドフラグメントと比べて特有の質量スペクトルシグネチャを有する。さらなる態様において、コンジュゲートされたペプチドの質量スペクトルシグネチャは、対応するコンジュゲートされていないペプチドの質量スペクトルシグネチャと異なっている。様々な態様において、Ｎ末端コンジュゲーションを欠くペプチドの質量スペクトルシグネチャは、Ｎ末端コンジュゲーションを有する対応するペプチドの質量スペクトルシグネチャと異なっている。
様々な態様において、ペプチドのコンジュゲーションは、１つのアミノ酸で実施することができる。幾つかの態様において、該アミノ酸は、システイン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、オルニチン、プロリン、セレノシステイン、セリン、又はチロシンであってもよい。模範的な例において、該アミノ酸は、システインであってもよい。他の態様において、コンジュゲーションは、１つを超えるアミノ酸で実施することができる。幾つかの態様において、１つを超えるアミノ酸は、システイン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、バリン、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、オルニチン、プロリン、セレノシステイン、セリン、又はチロシンであってもよい。
本開示の幾つかの態様において、ペプチドをコンジュゲートさせて、酸化を防ぐことができる。例えば、システイン残基の再酸化を防ぐために、システイン残基を還元に続いてコンジュゲートさせることができる。任意の適切なチオールアルキル化剤を使用して、還元後のシステイン残基の再酸化を防ぐことができる。ある特定の態様において、システイン残基を、ヨードアセトアミド、Ｎ−エチルマレイミド、又はヨード酢酸とコンジュゲートさせて、還元後のシステイン残基の再酸化を防ぐ。様々な態様において、システイン残基を、ヨードアセトアミドとコンジュゲートさせる。ある特定の態様において、ペプチドを「重い」ヨードアセトアミドとコンジュゲートさせることができ、それにより標準の（即ち、「軽い」）ヨードアセトアミドにコンジュゲートされた材料の参照標準としての使用が可能になる。この方策は、ノッチンペプチドライブラリーでは、これらのペプチド内のシステイン残基が多数であるため、特に有用である。
本開示の幾つかの態様において、コンジュゲート原子は、原子の相対的原子量に応じて、「重い」又は「軽い」のいずれかになり得る。例えば１３Ｃ原子は、「重い」原子であり、１２Ｃは、「軽い」原子である。幾つかの態様において、例えば、少なくとも１つの１３Ｃ原子を含むコンジュゲートは、１２Ｃ原子のみを含むコンジュゲートに比較して重い。例えば、幾つかの態様において、２つを超える１３Ｃ原子を含むコンジュゲートは、１つだけの１３Ｃ原子を含むコンジュゲートに比較して重い。幾つかの態様において、炭素以外の原子を、重いコンジュゲート及び軽いコンジュゲートに用いてもよい。
幾つかの実施形態において、少なくとも１つの１３Ｃ原子を有するコンジュゲートを、付加することができる。これらのより重いコンジュゲートは、１２Ｃ原子しか有さないコンジュゲートとそれ以外では同一であり、それにより例えば質量分析により、検出され得る差異を生じることができる。例えば、２つの同一ライブラリーを、対象に投与することができ、つまり１つのライブラリーをパルミチン酸でＮ末端標識することができ（軽いペプチド）、他方を５個の１３Ｃ原子を含むパルミチン酸でＮ末端標識することができる（重いペプチド）。
１３Ｃ原子を有するライブラリーは、約５原子質量単位だけ重いが、化学的には同一であるため、質量分析では同じイオン化特性（ピーク高）を有し得る。組織試料から回収された材料は、重いライブラリーの幾つかをドーピングすることができ、５＋シフトされたピークを、それぞれシフトされていないピークの相対量を定量するのに用いることができる。このことは、一般には質量分析のピーク高が定量的でなく代わりにペプチドのイオン化能力を反映するため、重要である。
本開示の様々な態様において、重いライブラリーを、未知量の軽いライブラリー要素を含む試料に添加することができる。質量スペクトル分析の間に観察される重いライブラリーピークを、その後、同じ試料中に見られる軽いライブラリーピークの定量を支援するために用いることができる。
重いライブラリーは、特別な手順に従ってライブラリー内の候補の相対量をモニタリングするのにも有用である。例えば、少量の重いライブラリーを、標準ライブラリーに混合して、相対的ピーク高のベースラインを決定することができる。重いライブラリーは、化学的に同一であるが質量が異なるため、この混合物中で標準ライブラリーの各要素は、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより、標準ライブラリーに隣接した重いピークを有するように観察される。これらの重いピークの高さは、標準ライブラリーの要素の量を判断し得る規格を形成することになる。そのため標準ライブラリーを、例えば血清中でインキュベートして、血清プロテアーゼへの感受性をテストすることができる。血清中でのインキュベートに続いて、材料を加熱して、血清プロテアーゼを不活化し、重いライブラリーを、標準と同様にドーピングすることができる。重い材料のＬＣ／ＭＳ／ＭＳのピーク高は、その後、標準ライブラリーのピーク高と比較して、どのライブラリーの要素がタンパク質分解を受けたか、を決定することができる。ここでの主要目的は、参照ピークをもたらすために重いライブラリーを標準ライブラリーにドーピングさせ得ること、である。異なるペプチドは、生来の品質に基づけば異なって「飛行（fly）」し、濃度とは独立してピーク高に影響を与えるが、重い同等物が質量によりシフトすることを除けば、それらは重い同等物と同じように飛行する。そのため重い物のピーク高を利用して、標準のピーク高を検量し、ピーク高から濃度を提供することができる。
ある特定の態様において、本発明は、様々な方法により軽いペプチド及び重いペプチドの分析を利用することができる。例えば本発明は、異なる投与経路により対象に投与される結び目のあるペプチドの分布プロファイルを決定する方法を含む。該方法は、例えば軽い結び目のあるペプチドを対象に投与することを含むことができ、該軽い結び目のあるペプチドは、第一の送達経路により投与され、該軽い結び目のあるペプチドと同じ配列を有する重い結び目のあるペプチドよりも低い分子量を有する。該方法は、重い結び目のあるペプチドを対象に投与することも含むことができ、該重い結び目のあるペプチドは、第一の送達経路とは異なる第二の送達経路により投与される。該方法は、対象の組織又は体液試料から得られた軽い結び目のペプチドの量を重い結び目のペプチドの量と比較し、それによりそれぞれ第一の送達経路及び第二の送達経路に基づき、対象における軽い結び目のペプチド及び重い結び目のペプチドの分布プロファイルを決定すること、をさらに含むことができる。
幾つかの実施形態において、該ペプチドライブラリーの分析に用いられるコンジュゲートは、少なくとも１つの１５Ｎ原子、少なくとも１つの１７Ｏ原子、少なくとも１つの１８Ｏ原子、少なくとも１つの２Ｈ原子、少なくとも１つの３Ｈ原子、少なくとも１つの１３Ｃ、１４Ｃ、１８Ｆ、３７Ｃｌ、少なくとも１つの７６Ｂｒ、少なくとも１つの３３Ｓ原子、３４Ｓ原子、３６Ｓ原子、少なくとも１つの２９Ｓｉ原子、又は少なくとも１つの３０Ｓｉ原子が互いに異なり得る。様々な実施形態において、作製されたライブラリーのペプチドに結合されたコンジュゲートは、少なくとも１原子、少なくとも２原子、少なくとも３原子、少なくとも４原子、少なくとも５原子、少なくとも６原子、少なくとも７原子、少なくとも８原子、少なくとも９原子、又は少なくとも１０原子の同位体置換により互いに異なり得る。幾つかの実施形態において、本発明は、実験テスト（例えば、ＢＢＢ透過性、経口生物学的利用度）に生き残ったペプチドの定量的評価を提供し得る方法を含むことができる。これらの方法では、同位体ドーピング方策を利用することができる。様々なペプチドの相対的質量を、様々な方法により変更することができる。例えば本発明は、２つを超える試料中でペプチドの相対的存在量を比較するために、複数の異なる同位体偏向を含む部分の使用を含む。炭素以外の同位体（例えば、水素／ジュウテリウム）を使用することも可能である。一例において、ペプチドのライブラリーは、２つの部分に分割することができ、つまり幾つかのペプチドは、通常（例えば、ほとんど又は全てが１２Ｃ原子）の同位体分布の部分にコンジュゲートすることができ、他のペプチドは、同位体として重いこと以外は同一の部分（例えば、既知の数の１３Ｃ原子を含む）にコンジュゲートすることができる。軽いペプチド及び重いペプチドのこれらの２つのプールは、化学的観点ではほぼ同一であり得るが（例えば、同一のクロマトグラフィー溶出時間）、ペプチドの１３Ｃ含有プールは、より重い質量に質量シフトするであろう。質量分析のピーク高は、ペプチド存在量のみならず、ペプチドのイオン化能力の関数でもあり得る。そのため各ペプチドの重い方は、それらの通常の軽い同等物と同じイオン化能力を有し得る。ＬＣ／ＭＳの直前に、（例えば動物の血液から）実験で回収された通常（例えば、ほとんど又は全てが１２Ｃ原子）のペプチド試料に重いライブラリーの一部をドーピングすることにより、質量シフトされた重いライブラリーが、回収された試料と比較される参照ピークの組を形成する。これらの参照ピークは、同じＭＳプロットに現れるが、コンジュゲート中の１３Ｃ原子数にしたがってより重い方にシフトされる。重いペプチド及び通常の（軽い）ペプチドは、化学的に類似しているため、ＬＣ（液体クロマトグラフィー）カラムから同時に溶出し、同じイオン化能力を有する。そのため、重い試料及び通常の試料の相対的ピーク高は、２つの試料中のペプチドの相対的存在量を正確に反映する。幾つかの実施形態において、該ペプチドは、対象の組織又は体液からの精製を容易にする部分をさらに含むことができる。例えばビオチンを該ペプチドにコンジュゲートして、回収を支援することができ、又は蛍光若しくは「弾頭」コンジュゲートを、コンジュゲートへの抗体で回収することができる。ある特定の実施形態において、該ペプチドは、細胞毒性剤及び／又は毒素などの治療分子を含むこともできる。幾つかの実施形態において、該ペプチドは、候補薬物及び／又は候補リンカーを含むこともできる。
ライブラリーを使用する方法
本明細書に記載された方法及びシステムにより作製及び生成されたライブラリーは、様々な適用のために用いることができる。例えば潜在的な薬物候補ライブラリーを、治療及び／又は診断目的で用いることができる。幾つかの例示的使用としては、バイオイメージングのために放射性標識及び／又は蛍光分子に該ペプチドをコンジュゲートすること、細胞毒性剤に該ペプチドを結合させること、生化学アッセイのためのインビトロ診断薬、並びに例えば獣医学的使用、殺虫剤、抗生物質、除草剤、不凍組成物、及び抗毒素に該ペプチドを用いること、が挙げられるが、それらに限定されない。
当業者に認識される通り、作製された、本明細書に記載のペプチドライブラリーは、広範囲のターゲット（例えば、治療ターゲット）に向けてカスタマイズすることができる。幾つかの実施形態において、該ターゲットは、様々な疾患又は障害に関連づけられる。例えば幾つかのターゲットとしては、グリピカン−２（ＧＰＣ２）、プロトカドヘリン（１α（ＰＣＤＨＡ１）、Ｃａｖ２．２、Ｋｖ１．３、Ｎａｖ１．２、ＮａＶ１．１、ＮａＶ１．７、ＮａＶ１．８、ＣＩＣ−３、ｎＡＣｈＲ、ＮＭＤＡ−Ｒ、ＮＰＲＡ、ＧＬＰ−１Ｒ、α１Ｂ−ＡＲ、ＮＴ−Ｒ−１、ＡＣＥ、ＮＥＴ ｍＴｏｒ、ｃＭｅｔ、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ、ｃ−Ｋｉｔ、ＰＤＧＦ／ＰＤＧＦＲ、ＰＩ３Ｋ、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、Ｏｒａｉ１、ＣＤ４７、Ｒａｆ、ＮＦκＢ、ブロモドメイン、ＨＡＴＳ、ＨＤＡＣ、ＬＤＨ、ＩＤＨ２、ＣＤ２２、ＭＩＣ、ｃ−Ｍｙｃ、ｎ−Ｍｙｃ、ＰＨＦ５Ａ、ＢＵＢ１Ｂ、Ｂｃｌ−２、ｋ−Ｒａｓ、Ｎｏｔｃｈ１、ｐ５３、α５β３、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＴＬＡ４／ＣＤ２８、及び／又はＭｃｌ−１を挙げることができるが、それらに限定されない。本発明は、本明細書に記載された薬物候補を対象に投与して、診断及び／又は治療適用を容易にするための組成物も提供する。ある特定の実施形態において、該組成物は、医薬的に許容し得る賦形剤を含むことができる。本発明において有用な医薬賦形剤としては、結合剤、充填剤、崩壊剤、滑沢剤、コーティング、甘味剤、香味剤及び着色剤が挙げられるが、それらに限定されない。他の医薬的賦形剤が、本明細書において有用となることを、当業者は認識するであろう。本明細書で用いられる用語「医薬組成物」は、例えば錠剤、カプセル、丸薬などの固体及び／又は液体投与剤形を包含する。
幾つかの実施形態において、該薬物候補は、低分子化学分子、生物製剤、及びペプチドからなる群から選択される。ある特定の実施形態において、該複数の薬物候補は、複数のペプチドを含む。
本発明の薬物候補（例えば、ペプチド）は、１時間ごと、１日ごと、１週間ごと、又は１ヶ月ごとなど、必要に応じて頻繁に投与することができる。本発明の方法で用いられる薬物候補（例えば、ペプチド）は、例えば用いられる方法の要件に応じて変動させ得る投与量で、投与することができる。本明細書に記載された薬物候補（例えば、ペプチド）は、非経口、皮下、静脈内、気管内、鼻腔内、皮内、筋肉内、結腸内、直腸内、尿道内又は腹腔内をはじめとする様々な方法で対象に投与することができる。幾つかの実施形態において、該医薬組成物は、非経口、静脈内、筋肉内又は経口投与することができる。幾つかの実施形態において、該薬物候補は、全身に投与することができる。幾つかの実施形態において、該組成物は、対象のリンパ節（複数可）への送達など、腫瘍内及び／又は結節内に投与することができる。ある特定の実施形態において、投与は、経口投与、直腸投与、及び胃の栄養管又は十二指腸の栄養管による投与など、経腸投与を含むことができる。投与は、静脈注射、動脈注射、筋肉注射、脳内、脳室内又は皮下（皮膚の下への）投与を含むこともできる。幾つかの実施形態において、投与は、皮膚上（皮膚への塗布）及び吸入をはじめとする局所手段により実行することができる。
本明細書に記載された薬物候補（例えば、ペプチド）を含む経口剤は、液体、錠剤、カプセルなどの経口投与用の任意の適切な形態であってもよい。経口配合剤を、さらにコーティング又は処置して、胃内での溶解を予防又は低減させることができる。本発明の組成物は、当該技術分野で公知の任意の適切な方法を利用して対象に投与することができる。本発明において使用される適切な配合剤及び送達方法は、当該技術分野で概ね周知である。例えば本明細書に記載された薬物候補（例えば、ペプチド）を、医薬的に許容し得る希釈剤、担体又は賦形剤と共に医薬組成物として配合することができる。該組成物は、ｐＨ調整及び緩衝剤、等張化剤、湿潤剤など、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンなどをはじめとするおおよその生理学的条件に必要な医薬的に許容し得る補助物質を含有していてもよい。
本発明の方法で用いられる薬物候補は、当該技術分野で利用できる任意の適切な技術により投与されてもよい。幾つかの実施形態において、薬物候補のライブラリー全体又はサブライブラリーを、一対象に投与することができる。そのような投与は、例えば多数の薬物候補の薬理学的性質の迅速な分析を提供することができる。対象への投与後に、試料を得て、例えば任意の適切なアッセイ方法、例えば液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法の組み合わせにより分析することができる。
本発明のライブラリー及びサブライブラリーの投与は、複数の経路を介した投与を含むことができる。幾つかの例において、本発明の方法から得られた候補のライブラリー又はサブライブラリーを、１つを超える経路により投与することができ、例えば薬物候補（例えば、結び目のあるペプチド）のサブライブラリーを経口投与及び経静脈投与の両方で投与することができる。同じ薬物の異なる投与経路は、例えば異なる薬物吸収速度、異なる作用開始時間及び作用持続時間など、異なる効果を有し得る。幾つかの実施形態において、本発明のライブラリーは、１つを超える経路で投与することができ、その結果を、作用部位での最大薬物濃度、他の部位での最小薬物濃度、及び急速通過代謝を回避するための長期薬物吸収など、所望の特性について比較することができる。ある特定の実施形態において、ライブラリーを、経口及び経静脈の両方で対象に投与し、その後、脳組織を分析して（例えば、質量分析による）、血液の関門を通過する候補の濃度改善を誘導する投与経路を決定することができる。
本発明はさらに、薬理学的性質を有する薬物候補のライブラリーを同定する方法であって、複数の薬物候補を対象に投与した後、該対象から単離された試料を分析すること、を含む、方法に関する。ある特定の実施形態において、該薬物候補のライブラリーは、本明細書で提供される質量で定義された薬物候補ライブラリーのものである。ある特定の実施形態において、該方法は、該単離された試料中で、該薬理学的性質を有する少なくとも１つの薬物候補を同定することを含む。
幾つかの実施形態において、該方法は、薬物候補に共通する薬理学的性質を利用して、薬理学的性質を有する更なる薬物候補を生成することをさらに含む。
幾つかの実施形態において、該薬理学的性質は、経口生物学的利用度、血液脳関門を通過する能力、血液脳関門による排除、血清中半減期、細胞を透過する能力、細胞内オルガネラ若しくは他の細胞内ドメインに侵入する能力、又はそれらの組み合わせを含む。ある特定の実施形態において、薬理学的性質は、経口生物学的利用度を含む。
幾つかの態様において、本開示は、薬理学的性質を有するライブラリー薬物候補を同定する方法であって、本明細書に示された質量で定義された薬物候補ライブラリーのものである、複数のライブラリー薬物候補を対象に投与すること、対象から、該複数のライブラリー薬物候補のうちの少なくとも幾つかを含む試料を得ること、及び該試料を分析して、薬理学的性質を有する該複数のライブラリー薬物候補のうちの少なくとも幾つかの同一性を決定すること、を含む、方法に関する。
幾つかの態様において、本開示は、薬理学的性質を有する薬物候補を同定する方法であって、複数の薬物候補を含む組成物を対象に投与すること、対象から、該複数の薬物候補のうちの少なくとも幾つかを含む試料を得ること、及び該試料を分析して、薬理学的性質を有する薬物候補のうちの少なくとも幾つかの同一性を決定すること、を含む、方法を提供する。
幾つかの実施形態において、該薬理学的性質は、経口生物学的利用度、血液脳関門を通過する能力、血液脳関門による排除、血清中半減期、細胞を透過する能力、細胞内オルガネラ若しくは他の細胞内ドメインに侵入する能力、臓器若しくは組織をターゲットとする能力、癌組織をターゲットとする能力、又はそれらの組み合わせを含む。ある特定の実施形態において、該方法は、該薬理学的性質を有するペプチドの少なくとも幾つかを含むペプチドライブラリーを作製することをさらに含む。
幾つかの実施形態において、第一及び第二の送達経路は、独立して、経口経路、局所経路、経粘膜経路、静脈内経路、筋肉内経路、及び吸入経路から選択される。ある特定の実施形態において、第一又は第二の送達経路のいずれかは、経口経路を含む。
本発明のライブラリー又はサブライブラリーの分析用の試料は、対象から得られた任意の試料を包含する。これらの試料は、インビボ又はインビトロで得られた生体組織又は生体液を起源とする試料を包含する。そのような試料の非限定的例としては、対象から単離された体液（例えば、血液、血漿、血清、粘液、脳脊髄液、又は尿）、臓器、組織、画分、及び細胞が挙げられる。試料としては、例えば臓器又は組織の断面部分のための生体試料の切片も挙げられる。対象からの組織試料としては、生検及び／又は剖検組織を挙げることができる。組織試料には、脳、肺、腎臓、筋肉、肝臓、心臓、胃、膵臓、又は任意の他の臓器からの組織を挙げることもできる。試料としては、生体試料からの抽出物、例えば生体液（例えば、血液又は尿）からの抗原も挙げることができる。幾つかの例において、本開示のライブラリーは、３つ、４つ、又は５つの投与経路を介して投与することができる。幾つかの実施形態において、生体試料は、哺乳動物（例えば、ラット、マウス又はヒト）である。ある特定の実施形態において、生体試料は、ヒトを起源とするものである。
幾つかの実施形態において、該方法は、薬物候補に共通する薬理学的性質を利用して、薬理学的性質を有する更なる薬物候補を生成することをさらに含む。幾つかの実施形態において、該対象は、動物である。ある特定の実施形態において、該対象は、ヒトである。
幾つかの実施形態において、該試料は、組織試料又は体液試料を含む。ある特定の実施形態において、該体液試料は、血液、尿、粘液、又は脳脊髄液を含む。ある特定の実施形態において、該試料は、血液を含む。幾つかの実施形態において、該組織試料は、生検又は剖検組織を含む。ある特定の実施形態において、組織は、脳、肺、腎臓、筋肉、肝臓、心臓、胃、膵臓、又は臓器からの組織を含む。幾つかの実施形態において、該対象は、動物である。幾つかの実施形態において、該対象は、ヒトである。
幾つかの実施形態において、該試料は、組織試料又は体液試料を含む。幾つかの実施形態において、該体液試料は、血液、尿、粘液、又は脳脊髄液を含む。ある特定の実施形態において、該試料は、血液を含む。幾つかの実施形態において、該組織試料は、生検又は剖検組織を含む。他の実施形態において、組織は、脳、肺、腎臓、筋肉、肝臓、心臓、胃、膵臓、又は臓器からの組織を含む。
本開示の幾つかの態様において、該方法は、薬物候補の構造と薬理学的性質との関連性、そして更なる態様において、その関連性に基づく薬物候補のサブセットを確立することをさらに含む。
本開示の幾つかの態様において、該方法は、投与後の選択された期間に選択された時間間隔で、複数の試料を得ることをさらに含む。ある特定の態様において、該時間間隔は、５分、１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、又は６０分である。さらなる態様において、選択された期間は、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１５時間、３０時間、４５時間、６０時間、７５時間、９０時間、１０５時間、又は１２０時間である。
幾つかの実施形態において、該方法は、複数の試料を対象から得ることをさらに含み、各試料は、複数のペプチドを投与した後の異なる時点に得られる。幾つかの実施形態において、該方法は、複数の試料のうち少なくとも幾つかの試料を分析して、複数の試料それぞれの薬理学的性質を有するペプチドの少なくとも幾つかの同一性を決定することをさらに含む。ある特定の実施形態において、該ペプチドの少なくとも幾つかの同一性は、質量分析を利用して決定され、そこで該ペプチドのそれぞれは、質量分析計により検出される特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャを含む。ある特定の実施形態において、該複数の薬物候補は、５を超える薬物候補を含む。他の実施形態において、該複数の薬物候補は、１０を超える薬物候補を含む。他の実施形態において、該複数の薬物候補は、１００を超える薬物候補を含む。他の実施形態において、該複数の薬物候補は、１０００を超える薬物候補を含む。他の実施形態において、該複数の薬物候補は、１００００を超える薬物候補を含む。他の実施形態において、該複数のペプチドは、１００を超えるペプチドを含む。他の実施形態において、該複数のペプチドは、１０００を超えるペプチドを含む。他の実施形態において、該複数のペプチドは、１００００を超えるペプチドを含む。
幾つかの実施形態において、該複数の薬物候補は、５を超える薬物候補、１０を超える薬物候補、１００を超える薬物候補、１０００を超える薬物候補、又は１００００を超える薬物候補を含む。幾つかの実施形態において、該複数の薬物候補は、結び目のあるペプチドを含む。ある特定の実施形態において、結び目のあるペプチドの特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャは、結び目のあるペプチドの天然のアミノ酸配列により定義される。
薬理学的性質を有する薬物候補を同定する方法であって、複数の薬物候補を対象に投与した後、該対象から単離された試料を分析すること；及び該単離された試料中で、該薬理学的性質を有する少なくとも１つの薬物候補を同定すること、を含む、方法。幾つかの実施形態において、該薬物候補は、低分子化学分子、生物製剤、及びペプチドからなる群から選択される。ある特定の実施形態において、該複数の薬物候補は、複数のペプチドを含む。他の実施形態において、該薬理学的性質は、経口生物学的利用度、血液脳関門を通過する能力、血液脳関門による排除、血清中半減期、細胞を透過する能力、細胞内オルガネラ若しくは他の細胞内ドメインに侵入する能力、臓器若しくは組織をターゲットとする能力、癌組織をターゲットとする能力、又はそれらの組み合わせを含む。
薬理学的性質を有する薬物候補を同定する方法であって、複数の薬物候補を含む組成物を対象に投与すること；複数の薬物候補のうちの少なくとも幾つかを含む試料を該対象から得ること；及び該試料を分析して、薬理学的性質を有する薬物候補の少なくとも幾つかの同一性を決定すること、を含む、方法。幾つかの実施形態において、該薬物候補は、低分子化学分子、生物製剤、及びペプチドからなる群から選択される。ある特定の実施形態において、該複数の薬物候補は、複数のペプチドを含む。他の実施形態において、該薬理学的性質は、経口生物学的利用度、血液脳関門を通過する能力、血液脳関門による排除、血清中半減期、細胞を透過する能力、細胞内オルガネラ若しくは他の細胞内ドメインに侵入する能力、臓器若しくは組織をターゲットとする能力、癌組織をターゲットとする能力、又はそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態において、該方法は、複数の試料を対象から得ることをさらに含み、各試料は、複数のペプチドを投与した後の異なる時点に得られる。ある特定の実施形態において、複数のペプチドのうちの少なくとも１つのペプチドは、少なくとも１つのペプチドを対象において追跡するために検出可能な標識を含む。ある特定の実施形態において、検出可能な標識は、近赤外色素を含む。
幾つかの実施形態において、第一及び第二の送達経路は、独立して、経口経路、局所経路、経粘膜経路、静脈内経路、筋肉内経路、及び吸入経路から選択される。特定の実施形態において、第一又は第二の送達経路のいずれかは、経口経路を含む。
幾つかの実施形態において、該方法は、ペプチドの少なくとも幾つかをスクリーニングして、どのペプチドが、タンパク質：タンパク質相互作用を阻害する活性、リセプターの拮抗を阻害する活性、リセプターへのアゴニスト結合を阻害する活性、イオンチャネルを調節する活性、シグナル伝達経路を阻害する活性、シグナル伝達経路を活性化する活性、及び／又はタンパク質：低分子相互作用を阻害する活性を示すか、を同定することをさらに含む。他の実施形態において、タンパク質：タンパク質相互作用は、癌、感染性疾患、炎症性疾患、免疫疾患、代謝疾患、心臓疾患、加齢に関連する疾患、及び神経疾患からなる群から選択される疾患又は障害に関連づけられる。ある特定の実施形態において、タンパク質：タンパク質相互作用は、癌に関連づけられる。
実施例１
ノッチン作製のためのペプチド構築物の発現
この実施例は、ペプチド構築物を培養で発現させて、特に薬物としてのその開発を大幅に促進する方法を記載している。
図７に示す通り、例えばパッケージング、導入、及びその後の発現に続き、発現されたノッチンペプチドの単離及び／又は精製を包含し得るレンチウイルス発現に基づく方法で、様々なノッチンを発現させることができる。複数のコードされた構築物を、使用することができる。この実施例において、ノッチンペプチドのコード化は、ＩｇＫ ＳＰ−ｓＦＬＡＧ−ＨＩＳ−シデロカリン−ＴＥＶ−ノッチンをはじめとするポリヌクレオチド構築物を含んだ。幾つかの例示的構築物の特異的配列を、以下の「配列」の節に開示する。図８は、図７に記載された方法により作製された複数の例示的ノッチンのゲルデータを示している。図示された通り、クロロトキシン（ＣＴＸ）、キモトリプシン阻害剤（ＣＴＩ）、エピレグリン（ＥＰＩ）、ヘフトキシン（ＨＴＸ）、バブルプロテイン（ＢＵＢ）、ジャガイモカルボキシペプチダーゼ阻害剤（ＰＣＩ）が、適正にフォールディングされた。
図９に、プールされたノッチンライブラリーの生成を記載した図解を示す。この実施例において、何千ものノッチンの配列を、オリゴヌクレオチドプールにコードすることができ（１）、特有のプライマー対を用いて選択的に増幅することができる（２）。ＤＮＡサブライブラリーを発現ベクターにクローニングして、例えば質量分析などの現行の技術を利用して解明可能である特有の親質量シグネチャ及び特有のトリプシン分解フラグメント質量シグネチャを有するノッチン変異体を得ることができる。
図１０は、クローニングされたノッチンライブラリーの代表的配列を記載する例示的ノッチン変異体を含む。その配列は、１回目のライブラリークローニングの生配列データを示している。灰色で強調された配列の一部は、全長のクロロトキシン変異体であり、オリゴヌクレオチド合成のエラーが、切り取られたペプチド配列及び延長されたペプチド配列を説明している。
この実施例に示された方法を利用して、複数のノッチンスカフォールドの変異体を作製し、分析した。図１１に、例えばヘフトキシン、クロロトキシン、及びキモトリプシン阻害剤についての３０００の要素からなるノッチンライブラリーのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの各縦列はネイティブ条件下及び還元的条件下で実施された３０００のノッチンタンパク質変異体のプールの精製試料を示している。各対のバンド間の泳動シフトは、ジスルフィド形成を示している。
４つのスカフォールド：ヘフトキシン、ＣＴＩ、クロロトキシン、及びエピレグリンを、定義されたライブラリーの作製のために選択した。ターゲットアミノ酸配列のリストを、インシリコで作製することで、それぞれのライブラリーの各要素が、特有の質量のトリプシン分解フラグメントを有するようにし、結合エピトープを作製するために、突然変異が構造的に隣接するように選択した。システインは、突然変異を受けず、リジンは、Ｎ末端コンジュゲーションを明確にするために特異的に回避させた。各スカフォールドの３０００の変異体を作製して、各スカフォールドをＰＣＲプライマー部位の特有の組み合わせにより隣接させ、それにより４つのサブライブラリーそれぞれを、独立に増幅させることができた。全ての構築物が、Ｎ末端ＢａｍＨＩ部位及びＣ末端ＮｏｔＩ部位を有し、１２０００のオリゴヌクレオチドのプールからの各サブライブラリーのＰＣＲ増幅に続いて、標準の技術を利用して、各サブラリーを制限消化して、切断された親ベクター（フリン切断物とＴＥＶ切断物の両方）にＬｃｎ２融合タンパク質としてクローニングした。ＨＫ２９３細胞をこのプラスミドライブラリーと、ダイダロス発現に必要となる補助的プラスミドをトランスフェクトし、培地中のウイルスを３〜４日後に回収した。ウイルスを遠心分離により濃縮して、標準手順を利用したタンパク質生成のためにＨＥＫ２９３細胞に感染させるために使用した。本発明者らは、ＴＥＶ切断可能な構築物が、ニッケル樹脂上のＩＭＡＣによる融合物の回収を容易にすることができるため、その構築物がライブラリー生成の際に技術的により容易に取り扱えることを見出した。ＩＭＡＣに続いて、融合タンパク質をＰＢＳで透析して、６×ＨＩＳタグＴＥＶプロテアーゼで一晩切断させ、次に再度ニッケル樹脂を用いて材料を処理することにより、Ｌｃｎ２及びプロテアーゼを除去した。切断されたペプチドライブラリーを含有するフロースルーを更に精製して、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により１０ｍＭギ酸アンモニウムにバッファー交換して、ペプチドを含む画分をプールし、凍結乾燥させた。
クローニングに到達させるのには２つのアプローチ、つまりシームレスクローニング（インビトロジェン）及び制限／ライゲーションに基づく方法があった。シームレスクローニングは、典型的にはＩＤＴから得られる合成された「ｇＢｌｏｃｋｓ」を使用し、１つの構築物を作製するのに用いた。製造業者の使用説明書に従った。制限／ライゲーション法は、標準的であり、以下の通りクローニングライブラリーに使用した：カスタムアレイ社のプールされたオリゴヌクレオチドを、関連のサブライブラリーを増幅させるためにＰＣＲに供した。増幅されたプールをアガロースゲルで精製し、キアゲンカラムを用いてアガロースを洗浄した。精製されたフラグメントをＦａａｓｔＤｉｇｅｓｔ（ファーメンタス） (Fermentas) ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩで消化して、同じ２つの制限エンドヌクレアーゼで切断された親ベクターにライゲートした。シングルトンのクローンを配列検証して、各ライブラリーの４８の要素を、ライブラリー品質の検証のためにシークエンシングした。
クローニングされたノッチン又はライブラリーをＨＥＫ２９３細胞にコトランスフェクトして、記載された通り培地を回収した（ダイダロス：新規なレンチウイルスベクターを用いてヒト細胞株中の活性組換えタンパク質のデシグラム量で急速に生成するためのロバストなターンキープラットフォーム。Bandaranayake AD, Correnti C, Ryu BY, Brault M, Strong RK, Rawlings DJ. Nucleic Acids Res. 2011 Nov;39(21):e143. doi: 10.1093/nar/gkr706. Epub 2011 Sep 12.）。融合タンパク質を、ニッケルＩＭＡＣを用いて単離し、組換えＴＥＶプロテアーゼで切断した。過剰のシデロカリンを、サイズ排除クロマトグラフィー（緩衝液を１０ｍＭギ酸アンモニウムに切り替えることも可能なプロセス）により除去した。ノッチン含有画分を、その後、凍結乾燥させた。適切なフォールディング及びペプチド均一性が、ＳＥＣクロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣ、質量分析、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥでの還元試料と非還元試料とのゲルシフトの対比により実証された。
パルミチン酸、ＩＣＧ、又はビオチニダーゼ耐性ビオチンへのコンジュゲートを、ＰＢＳ中の、市販された活性化エステルコンジュゲートの３〜１０倍過剰物を使用して実施した。溶解度の問題があれば、アセトニトリルを添加した。シングルトンでは、最終的な材料をＲＰ−ＨＰＬＣにより精製して、過剰のコンジュゲートを透析によりライブラリーから除去した。
実施例２
薬物開発のための質量を指標とする（mass-indexed）ペプチドライブラリー及びペプチドの作製
この実施例は、ノッチンの作製のために質量を指標とするペプチドを含むペプチドライブラリーを作製する方法を記載している。この実施例は、試料中の質量を指標とするペプチドの分析も記載している。
ペプチド：ハヤトウリ由来トリプシン阻害剤の３０００の変異体の質量を指標とするライブラリーを、インシリコで創出した。ペプチド内のリジン残基は全て、アルギニン残基に変化した。得られた配列は、ＣＰＲＩＬＭＲＣＲＬＤＴＤＣＦＰＴＣＴＣＲＰＳＧＦＣＧであった。この配列のＧ１及びＳ２を、分子のＮ末端に付加した。スカフォールドの分子構造を用手法で分析して、スカフォールド構造を破壊せずに変化させ得る配列部分を同定した。同定されたアミノ酸残基は、Ｍ８、Ｒ９、Ｌ１２、Ｄ１３、Ｔ１４、Ｆ１７、Ｐ１８、Ｔ１９、Ｔ２１、Ｒ２３、Ｐ２４、Ｓ２５、Ｇ２６を含んだ。同定されたアミノ酸は、Ｒ２３、Ｐ２４、Ｓ２５、及びＧ２６であり、それぞれβターンの１〜４の位置に配置されていた。
パイソン・ソフトウエアを用いて、５００００００の配列のプールを創出すると、各配列が特有の変異体になった。プール内の各要素のアミノ酸を改変させることにより配列を作製し、それにより各要素は、７〜３０アミノ酸長の範囲内の完全にトリプシン分解されたペプチドを含んだ。完全にトリプシン分解されたペプチドは、還元してヨードアセトアミドでアルキル化すると、質量範囲８００〜３５００Ｄａ内に収まった。
各変異体の出発アミノ酸配列からのアミノ酸改変の数は、４〜８の分布から選択された。分布は、以下の通り重み付けされた： ４：１５％、５：５０％、６：２０％、７：１０％、８：５％。改変された位置は、可能性のある改変可能な位置のリストから無作為に選択した。各アミノ酸改変については、置換されるアミノ酸を一組のアミノ酸から選択した。その組のアミノ酸は、所定の位置のスカフォールドの構造に適しており、適正なフォールディングになり易いアミノ酸に有利になるように適宜、重み付けした。異なる構造分類における各アミノ酸の重みは、以下の通りであった：
βターン位置１： Ｄ：１５、Ｇ：１１、Ｈ：１３、Ｎ：１０、Ｑ：１５、Ｓ：１３、Ｔ：１０、Ｙ：１０
βターン位置２: Ｄ：１２、Ｅ：１４、Ｇ：１０、Ｎ：１０、Ｑ：１０、Ｓ：１２、Ｐ：３５
βターン位置３: Ｄ：１８、Ｇ：２１、Ｈ：１２、Ｎ：１０、Ｑ：２１、Ｓ：１０
βターン位置４: Ｇ：１６、Ｎ：１０、Ｑ：１０、Ｓ：１０、Ｔ：１２、Ｙ：１０
他の全ての位置: Ａ：４、Ｄ：８、Ｅ：４、Ｆ：７、Ｇ：８、Ｈ：８、Ｉ：８、Ｌ：２、Ｍ：４、Ｎ：４、Ｑ：４、Ｒ：８、Ｓ：７、Ｔ：４、Ｖ：４、Ｗ：６、Ｙ：１０
プール内に３つを超えるトリプトファン残基が保持された変異体はなかった。プールの各要素の逆翻訳を、ＤＮＡ合成のために選択した。ＤＮＡ合成の間、Ｎ末端ＧＳ部分のコード化を、ＧＧＡＴＣＣに変更した。さらに５’配列：
ＡＡＣＴＧＣＣＡＴＧＴＧＣＡＡＣＴＣＧＴＡＡＧ及び３’配列：ＴＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＴＣＴＴＡＧＴＣＡＣＣＴＴＧＣＡＴＧＧＡＣを、プールの各要素に付加した。プールの特定の要素が選択されない限り、ＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）又はＮｏｔＩ（ＧＣＧＧＣＣＧＣ）制限部位を含まないように逆翻訳を選択した。
可能な変異体のプールから、質量を指標とするライブラリーの要素を、無作為に選択した。所望の数の要素に達するまで、要素を１回に１つ、ライブラリーに添加した。要素の付加でライブラリーに関する以下の基準が守られる場合のみ、要素を付加した：
・各要素が、９０分の勾配で、０．１５ダルトン及び予測された液体クロマトグラフィー（ＬＣ）保持時間２．７５分以内に最大２つの隣接要素を有すること；
・各要素が、配列が独特である２．１トムソン及び予測された液体クロマトグラフィー（ＬＣ）保持時間２．７５分以内に同じくライブラリー内に最大２つの隣接要素を有する７〜２５アミノ酸のトリプシン分解されたペプチドを少なくとも１つ有すること。
次に、３，０００のセンス鎖オリゴヌクレオチド及び３，０００の完全な逆相補配列のオリゴヌクレオチドを、ライブラリーの要素に向けて順序づけた。ライブラリーの要素を、タンパク質発現に向けてスクリーニングした。ライブラリー要素の試料を、タンパク質混合物として調製した。タンパク質混合物の試料を、２０ｍＭ ＤＤＴで還元して、２５ｍＭヨードアセトアミドでブロックした。該タンパク質をトリプシンタンパク質比１／５０で一晩（又はおよそ１６〜１８時間）トリプシンで消化して、Ｃ１８脱塩化ラムを使用して精製した。精製されたペプチド試料１μｇを、ナノフローＨＰＬＣと連結させたオービトラップ・エリート・ハイブリッド質量分析計（サーモフィッシャーサイエンティフィック、マサチューセッツ州ウォルサム所在）に注入した。液体クロマトグラフィー／質量分析の装置及び方法は、マジックＣ１８ＡＱ樹脂（５μｍ、２００Å粒子；ミクロムバイオリソーシス、カリフォルニア州オーバーン所在）を充填したインテグラフリット（ニューオブジェクティブ、マサチューセッツ州ウーバン所在）から作製されたトラップカラム（１００μｍ×１．５ｃｍ）と、それに続いてマジックＣ１８ＡＱ樹脂（５μｍ、１００Å粒子；ミクロムバイオリソーシス）を充填されたピコフリット（ニューオブジェクティブ）から作製された分析カラム（７５μｍ×２７ｃｍ）で構成させた。カラムをエクシジェント２ＤナノＨＰＬＣ（エクシジェント・テクノロジーズ、カリフォルニア州ダブリン所在）に通気式のカラム構成で直列に連結して、３μＬ／分での迅速な試料負荷を可能にした。
ペプチド試料を以下の通りの９０分間の非線形勾配を利用したＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した：０．１％ギ酸を含む５％アセトニトリルで出発し（０．１％ギ酸により防水）、２分間かけて７％に、その後、９０分間かけて３５％に、その後、１分間かけて５０％に変換して、５０％で９分間保持して、１分間かけて９５％に変換し、９５％で５分間保持し、１分間かけて５％に降下させて、５％で再調整。ペプチド分離の流速は、３００ｎＬ／分であった。
２．２５ｋＶのスプレー圧を、ナノスプレーチップに加えた。質量分析実験は、オービトラップでのフルＭＳスキャン（ＡＧＣターゲット値１ｅ６．分解能６０Ｋ、及び１μスキャン、ＦＴプレビュースキャンをオン）に続いて、リニアイオントラップで最大５のＭＳ／ＭＳスペクトル取得、という構成であった。オービトラップスキャンの最も強い５つのイオンを、衝突誘起解離（分離幅２ｍ／ｚ、目標値１ｅ４、衝突エネルギー３５％、最大注入時間１００ｍｓ）を利用してＭＳ／ＭＳについて選択した。存在率の低いペプチドイオンを、動的排除（リピート回数１、リピート時間３０秒、排除リストサイズ１００、排除時間４５秒、排除質量幅−０．５５ｍ／ｚ〜１．５５ｍ／ｚ）を利用してデータ取得した。電荷状態のスクリーニングを利用して、同定可能な電荷状態が＋２、＋３、及び＋４及びそれよりも高い値の任意のイオンのＭＳ／ＭＳを可能にした。
該当するペプチドを含む試料については、以下のデータ解析法を利用した。ＦＡＳＴＡデータベースを、ユニプロットヒトプロテオーム（２０１２／１２／１９）全体、ハヤトウリ由来トリプシン阻害剤ライブラリーから得た予測される３０００のタンパク質、及び一般に観察される一組の混入タンパク質を含ませて、データベース検索用に構築した。全てのＭＳ結果から機器が出力したファイルを、ｍｚＸＭＬファイルに変換して、このＦＡＳＴＡデータベースに対し、ｋ−スコア・スコアリングアルゴリズムで構成されたＸ！タンデム（２０１１．１２．０１．１版）で検索した。検索パラメータは、以下の通りであった：酵素、トリプシン；最大未切断数、２；確定的な修飾：システインでのカルボキシアミドメチル化；潜在的な修飾、メチオニンでの酸化；親モノアイソトピック質量誤差−１．５Ｄａ〜２．５Ｄａ。
ペプチド同定は、ペプチドプロフェット（トランス・プロテオーム・パイプライン、バージョン４．６）により確率を割り付け、確率０．９５未満に割り付けられた同定は全て、廃棄した。試料中に存在する変異体を、それらの変異体に特有のトリプシン分解ペプチドのペプチド同定に基づいて推論した。マウスの血漿及び組織試料については、ユニプロットマウスプロテオーム（２０１２／１２／１９）全体に加えて、先に記載された配列を含むＦＡＳＴＡデータベースを利用しながら、先の方法に従った。
実施例３
コンジュゲート化ペプチドを使用する質量を指標とするペプチドライブラリーの作製
この実施例は、ノッチンの作製のために用いられ得るコンジュゲートされた質量を指標とするペプチドを含むペプチドライブラリーを作製する方法を記載している。この例は、さらに、試料中の質量を指標とするコンジュゲート化ペプチドの分析を記載している。
ペプチドをビオチンにコンジュゲートして、トリプシンでのタンパク質分解後にペプチドライブラリーから回収した。１０００からなる１０ｍｇ／ｍｌハヤトウリ由来トリプシン阻害剤変異体のライブラリーを、リン酸緩衝生理食塩水中の３倍モル過剰のビオチンのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルと反応させた。そのライブラリーは、リジン残基を全く含まないように操作されているため、コンジュゲーションはペプチドの厳密にＮ末端で進行した。
過剰のビオチン及びＮＨＳを、限外ろ過により除去し、得られたライブラリーを異種移植されたヒト腫瘍を有するマウスに１００ｍｇ／ｋｇで尾静脈注射により投与した。マウスを５分後、１０分後、３０分後、及び６０分後に殺処分して、腫瘍、脳、血液、及び腎臓を採取し、機械的にホモジナイズした。細胞及び血液凝固材料を遠心分離により除去して、得られた上清をビーズに固定したアビジンと共に室温で３０分間振とうしながらインキュベートした。その後、ビーズをＰＢＳで十分に洗浄し、煮沸してビオチン化ペプチドを遊離させた。これらのペプチドを、その後、還元、アルキル化（システイン残基の）、トリプシン分解、及びＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析に供して、様々な組織中のペプチドの同一性を決定した。
この方法の変形として、トリプシンを機械的ホモジナイズの前に添加して、試料のトリプシン分解の間に形成された可能性のあるノッチンペプチドとのタンパク質−タンパク質相互作用を崩壊させた。ペプチドの回収は、ペプチドのＮ末端が回収されたことのみを除き、アビジンビーズを用いて同様に行った。
ビオチンとのコンジュゲートに加えて、さらなるペプチドライブラリーを、同位体標識により作製した。両方のタイプのライブラリーを、質量分析により定量した。１０００からなる１０ｍｇ／ｍｌハヤトウリ由来トリプシン阻害剤変異体のライブラリーを、半量ずつ二分割した。一方の半量を、リン酸緩衝生理食塩水中の３倍モル過剰の同位体的に通常のパルミチン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルと反応させた。もう一方の半量を、４つのＣ１３（同位体的に重い）炭素を含有するパルミチン酸を用いて同様の手法で処理した。ＤＭＳＯ又はＤＭＦを、溶液中のパルミチン酸を保持するのに十分、添加した。過剰のパルミチン酸を、一晩（１２〜１８時間）のインキュベーション後に酢酸エチルとの抽出により除去した。
同位体的に重いライブラリーは、同位体的に通常のライブラリーと化学的に同一であるが、質量により分類した。重いライブラリーはＩＶ投与により動物に１００ｍｇ／ｋｇで投与して、同位体的に通常のライブラリーは同じ動物に経口強制投与により投与した。ライブラリー投与の２０分後に、動物を殺処分した。血液を採取して、凝固させた。細胞及び血液凝固材料を遠心分離により除去して、得られた血漿を５ｍＭ ＴＣＥＰで還元し、ヨードアセトアミドでアルキル化して、Ｃ１８固相抽出カラムに適用した。その後、カラムを０．５％ＴＦＡ中のアセトニトリルで、その割合を増加させながらすすいだ。Ｎ末端パルミチル化ペプチドを、８０％以上のアセトニトリルで溶出させた。この溶出材料を、その後、トリプシン分解及びＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析に供し、同位体的に通常のピークと重いピークを直接比較した。通常のピークが観察され、経口生物学的利用度を有するペプチドに対応した。
このプロトコルの変形として、血漿を、ヨードアセトアミド処理後のＣ１８カラムへの適用前にトリプシンで処理した。この方法では、各ライブラリーの要素のＮ末端トリプシン分解ペプチドのみが回収され、特有の性質に基づいて識別可能であった。
２８のノッチンペプチドで構成されたライブラリーを、ヒト由来横紋筋肉腫（例えば、癌）細胞株Ａ−２０４への高い親和性で結合するものについてスクリーニングした。暴露の２４時間前に、細胞をポリ−Ｌ−リジンコーティングされた６ウェルプレート（コーニング）に播種して、１０％ＦＢＳ（ハイクローン）を補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地（ライフテクノロジー）中で発育させて、およそ８５％コンフルエントに到達させた。接着細胞を３ｍｌ Ｄ−ＰＢＳ（ライフテクノロジー）で３回洗浄し、Ｄ−ＰＢＳ中のノッチンライブラリー（３０μｇ／ｍｌ）と共に３７℃で１時間インキュベートした。非結合ペプチドを吸引して、細胞をＤ−ＰＢＳで３回洗浄し、最後の洗浄液を分析用に回収した。結合したノッチンを溶出するために、細胞をＤ−ＰＢＳ中の２８０ｍＭ ＮａＣｌ １ｍｌ中、３７℃で５分間、その後、５６０ｍＭ及び１．１２Ｍ ＮａＣｌ中でインキュベートした。最後の溶出に続いて、細胞をハイピュア社の分子生物学用水（ハイクローン）中に回収した。細胞を３回の凍結・解凍サイクルと、バスソニケータ中での５分間処理により溶解させた。溶解物のタンパク質濃度を、ナノドロップ１０００を利用した２８０ｎｍでの吸収に基づいて定量して、試料を水中１００μｇ／ｍｌの総タンパク質に希釈した。溶解物及び溶出試料をストラタＸ脱塩カラム（フェノメネックス）を利用して脱塩した。回収されたペプチドは、その後還元、アルキル化、及びトリプシン分解した後、ＬＣ／ＭＳ−ＭＳ分析に供した。個々のノッチンを各試料から、それらの特有のトリプシン分解ペプチドシグネチャにより、同定した。
実施例４
血清中安定性、半減期及び組織ホーミング能力によるノッチンの同定
この実施例は、ノッチンの作製のために質量を指標とするペプチドを含むノッチンペプチドを同定する方法を記載している。この実施例は、さらに、試料中の質量を指標とするペプチドの分析を記載している。
マウス６匹に、質量を指標とするノッチンのライブラリーを、尾静脈注射により与えた。マウス３匹を５分後に、そして３匹は３０分後に殺処分した。血液を心臓穿刺により採取して、臓器（脳、肝臓、腎臓）を分析用に切除した。組織を液体窒素中で急速凍結させた。続いて組織を解凍し、ホモジナイズして、質量分析による分析に供して、組織分布及び半減期推定値を測定した。
実施例５
キモトリプシン阻害剤突然変異耐性の並行評価
この実施例は、本開示の一態様によるキモトリプシン阻害剤（ＣＴＩ）の突然変異耐性の評価を記載している。
チップに基づくオリゴヌクレオチド合成を、ＣＴＩの３０００の突然変異体からなる組み合わせを作製するために実施した。突然変異体をＰＣＲにより増幅させて、レンチウイルス系への制限消化及びライゲーションによりクローニングした。
図１２は、それぞれが特有のＭＳシグネチャを有する、４〜８の突然変異を有する３０００のＣＴＩ変異体が作製された、リバースプロテオミクスによるＣＴＩの変異耐性の評価を示している。これらのウイルスを使用して、ＨＥＫ２９３細胞をプールとして感染させて、得られたペプチドを単離し、トリプシンで消化させて、ヨードアセトアミドで処理して、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳオービトラップエリートシステムに適用して、１５９５のタンパク質を観察した。順序づけられたタンパク質の全組み合わせに対し、発現及び観察されたタンパク質中で、各位置のアミノ酸の過大提示又は過小提示が示されている。下の方の線よりも低いアミノ酸は、生成及び観察されたタンパク質の組み合わせでは全く観察されなかった。全体的には、アルギニン及びトリプトファンアミノ酸が、順序づけられたタンパク質の組み合わせよりも生成及び観察されたタンパク質には存在する可能性が低く、グルタミン酸は、存在する可能性がより高くなった。
本発明の好ましい実施形態を本明細書に図示及び記載したが、そのような実施形態が例示として示されたにすぎないことは、当業者に自明であろう。数多くの変形、変更及び置換が、本発明を逸脱することなく当業者に予想されよう。本明細書に記載された発明の実施形態の様々な代替例が、本発明の実践において使用され得ることが、理解されなければならない。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義するものであり、これらの特許請求の範囲及びその均等物の中の方法及び構造は、特許請求の範囲に含まれるものとする。
配列
以下の記述は、本明細書で同定された該当する遺伝子及び構築物のＤＮＡ及び／又はアミノ酸配列である。
シームレスクローニングのための親構築物の構築：
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 シームレスクローニングにより先のＮｏｔＩ切断による親配列にクローニングされた融合タンパク質配列（本来の１０の組み合わせ）：
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 ＢａｍＨ１／ＮｏｔＩクローニングのための親構築物の構築：
Figure 2016505826
 ＢａｍＨＩ部位が、ノッチンの前に「ＧＳ」を付加する。この構築物は、ライブラリーをクローニングするために用いることができる。

フリン開裂のための親構築物の構築。ＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩクローニングは理想的なフリン切断部位：RARYKRS−RARYKRGSを含むことができ、それはＢａｍ ＨＩ部位に用いることができる。
Figure 2016505826
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Claims (147)

  1. 薬理学的性質を有する薬物候補を同定する方法であって、
    複数の薬物候補を対象に投与した後、前記対象から単離された試料を分析すること；及び
    前記単離された試料中で、前記薬理学的性質を有する少なくとも１つの薬物候補を同定すること、
    を含む、方法。
  2. 薬理学的性質を有する薬物候補を同定する方法であって、
    複数の薬物候補を含む組成物を対象に投与すること；
    前記複数の薬物候補のうちの少なくとも幾つかを含む試料を前記対象から得ること；及び
    前記試料を分析して、前記薬理学的性質を有する前記薬物候補の少なくとも幾つかの同一性を決定すること、
    を含む、方法。
  3. 前記薬物候補が、低分子化学分子、生物製剤、及びペプチドからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記複数の薬物候補が、複数のペプチドを含む、請求項１又は２に記載の方法。
  5. 前記複数の薬物候補が、複数の低分子化学分子を含む、請求項１又は２に記載の方法。
  6. 前記複数の薬物候補が、複数の生物製剤を含む、請求項１又は２に記載の方法。
  7. 前記薬理学的性質が、経口生物学的利用度、血液脳関門を通過する能力、血液脳関門による排除、血清中半減期、細胞を透過する能力、細胞内オルガネラ若しくは他の細胞内ドメインに侵入する能力、臓器若しくは組織をターゲットとする能力、癌組織をターゲットとする能力、又はそれらの組み合わせを含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記薬理学的性質を有する前記ペプチドの少なくとも幾つかを含むペプチドライブラリーを作製することをさらに含む、請求項６に記載の方法。
  9. 前記ペプチドの少なくとも幾つかをスクリーニングして、どのペプチドが、タンパク質：タンパク質相互作用を阻害する活性、リセプターの拮抗を阻害する活性、リセプターへのアゴニスト結合を阻害する活性、イオンチャネルを調節する活性、シグナル伝達経路を阻害する活性、シグナル伝達経路を活性化する活性、及び／又はタンパク質：低分子相互作用を阻害する活性を示すか、を同定することをさらに含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記タンパク質：タンパク質相互作用が、癌、感染性疾患、炎症性疾患、免疫疾患、代謝疾患、心臓疾患、加齢に関連する疾患、及び神経疾患からなる群から選択される疾患又は障害に関連づけられる、請求項９に記載の方法。
  11. 前記タンパク質：タンパク質相互作用が、癌に関連づけられる、請求項９又は１０に記載の方法。
  12. 前記対象から複数の試料を得ることをさらに含み、各試料が前記複数のペプチドを投与した後の異なる時点で得られる、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記複数の試料のうちの少なくとも幾つかの試料を分析して、前記複数のうちの各試料において、前記薬理学的性質を有する前記ペプチドの少なくとも幾つかの同一性を決定することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記ペプチドの少なくとも幾つかの同一性が、質量分析を利用して決定され、そこで前記ペプチドのそれぞれが、質量分析計により検出される特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャを含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記複数の薬物候補が、５を超える薬物候補、１０を超える薬物候補、１００を超える薬物候補、１０００を超える薬物候補、又は１００００を超える薬物候補を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記複数のペプチドのうちの少なくとも１つのペプチドが、前記対象において前記少なくとも１つのペプチドを追跡するために検出可能な標識を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記検出可能な標識が、近赤外色素を含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記複数のペプチドのうちの少なくとも１つのペプチドが、前記少なくとも１つのペプチドのＮ末端にコンジュゲートされた疎水性部分を含み、前記少なくとも１つのペプチドが、前記疎水性部分を欠く前記少なくとも１つのペプチドに比較して、半減期の増加を示す、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記疎水性部分が、疎水性蛍光色素、又は飽和若しくは不飽和アルキル基を含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記試料が、組織試料又は体液試料を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
  21. 前記体液試料が、血液、尿、粘液、又は脳脊髄液を含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記試料が、血液を含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記組織試料が、生検又は剖検組織を含む、請求項２０に記載の方法。
  24. 前記組織が、脳、肺、腎臓、筋肉、肝臓、心臓、胃、膵臓、又は臓器からの組織を含む、請求項２０又は２３に記載の方法。
  25. 前記薬物候補に共通する前記薬理学的性質を利用して、前記薬理学的性質を有する更なる薬物候補を生成することをさらに含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
  26. 前記対象が、動物である、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記対象が、ヒトである、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記薬物候補の構造と薬理学的性質との関連性を確立することをさらに含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記関連性に基づく薬物候補のサブセットを選択することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
  30. 投与後の選択された期間に選択された時間間隔で、複数の試料を得ることをさらに含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
  31. 選択された時間間隔が、５分、１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、又は６０分である、請求項３０に記載の方法。
  32. 選択された期間が、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１５時間、３０時間、４５時間、６０時間、７５時間、９０時間、１０５時間、又は１２０時間である、請求項３０に記載の方法。
  33. 質量で定義された（mass-defined）薬物候補ライブラリーを作製する方法であって、
    複数の薬物候補を生成し、前記薬物候補の少なくとも幾つかがそれぞれ特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャを有すること、
    質量分析を利用して前記複数の薬物候補を分析して、前記薬物候補の少なくとも幾つかに関して前記特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャを測定すること、及び
    薬理学的性質に基づいて作製された、前記複数の薬物候補の少なくとも幾つかを含む質量で定義された薬物候補ライブラリーを作製すること、
    を含み、前記質量で定義された薬物候補ライブラリー内の前記薬物候補の同一性が、前記薬物候補それぞれの前記特有の質量シグネチャを又は消化フラグメント質量シグネチャにより決定され得る、方法。
  34. 薬理学的性質を有するライブラリー薬物候補を同定する方法であって、
    複数の薬物候補を対象に投与した後、前記対象から単離された試料を分析し、前記ライブラリー薬物候補が、請求項３３に記載の質量で定義された薬物候補ライブラリーのものであること；及び
    前記単離された試料中で、前記薬理学的性質を有する少なくとも１つの薬物候補を同定すること、
    を含む、方法。
  35. 薬理学的性質を有するライブラリー薬物候補を同定する方法であって、
    請求項２６に記載の質量で定義された薬物候補ライブラリーのものである、複数のライブラリー薬物候補を対象に投与すること、
    前記対象から、前記複数のライブラリー薬物候補のうちの少なくとも幾つかを含む試料を得ること、及び
    前記試料を分析して、前記薬理学的性質を有する前記複数のライブラリー薬物候補のうちの少なくとも幾つかの同一性を決定すること、
    を含む、方法。
  36. 前記薬理学的性質が、経口生物学的利用度、血液脳関門を通過する能力、血液脳関門による排除、血清中半減期、細胞を透過する能力、細胞内オルガネラ若しくは他の細胞内ドメインに侵入する能力、又はそれらの組み合わせを含む、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. 前記薬理学的性質が、経口生物学的利用度を含む、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記複数の薬物候補が、５を超える薬物候補、１０を超える薬物候補、１００を超える薬物候補、１０００を超える薬物候補、又は１００００を超える薬物候補を含む、請求項３３〜３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. 前記複数の薬物候補が、ノットのあるペプチド（knotted-peptides）を含む、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の方法。
  40. 前記結び目のあるペプチドの特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャが、前記結び目のあるペプチドの天然のアミノ酸配列により定義される、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記複数の薬物候補の少なくとも１つが、前記少なくとも１つの薬物候補の前記特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャを修飾するための重同位体原子を所定の数含む、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の方法。
  42. 前記重同位体原子が、１３Ｃ又はジュウテリウムを含む、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記複数の結び目のあるペプチドの少なくとも１つの前記特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャが、前記少なくとも１つの結び目のあるペプチドにコンジュゲートされた部分により定義される、請求項３９又は４０に記載の方法。
  44. 前記部分が、前記少なくとも１つの結び目のあるペプチドのＮ末端にコンジュゲートされている、請求項４０に記載の方法。
  45. 前記部分が、前記少なくとも１つの結び目のあるペプチドの前記特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャを修飾するために重同位体原子を所定の数含む、請求項４３又は４４に記載の方法。
  46. 前記重同位体原子が、１３Ｃ又はジュウテリウムを含む、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記複数の結び目のあるペプチドが、１００を超えるペプチド、１０００を超えるペプチド、又は１００００を超えるペプチドを含む、請求項３９に記載の方法。
  48. 前記薬物候補の構造と薬理学的性質との関連性を確立することをさらに含む、請求項３３〜４７に記載の方法。
  49. 前記関連性に基づく薬物候補のサブセットを選択することをさらに含む、請求項４８に記載の方法。
  50. 投与後の選択された期間に選択された時間間隔で、複数の試料を得ることをさらに含む、請求項３３〜４９のいずれか１項に記載の方法。
  51. 選択された時間間隔が、５分、１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、又は６０分である、請求項５０に記載の方法。
  52. 選択された期間が、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１５時間、３０時間、４５時間、６０時間、７５時間、９０時間、１０５時間、又は１２０時間である、請求項５０に記載の方法。
  53. 異なる投与経路により対象に投与される結び目のあるペプチドの分布プロファイルを決定する方法であって、
    軽い結び目のあるペプチドを前記対象に投与し、前記軽い結び目のあるペプチドが、第一の送達経路により投与され、前記軽い結び目のあるペプチドと同じ配列を有する重い結び目のあるペプチドよりも低い分子量を有すること；
    前記重い結び目のあるペプチドを前記対象に投与し、前記重い結び目のあるペプチドが、前記第一の送達経路とは異なる第二の送達経路により投与されること；並びに
    前記対象の組織又は体液試料から得られた前記軽い結び目のあるペプチドの量を前記重い結び目のあるペプチドの量と比較し、それによりそれぞれ前記第一の送達経路及び前記第二の送達経路に基づき、前記対象における前記軽い結び目のあるペプチド及び前記重い結び目のあるペプチドの前記分布プロファイルを決定すること、
    を含む、方法。
  54. 異なる投与経路により対象に投与される結び目のあるペプチドの分布プロファイルを決定する方法であって、
    軽い結び目のあるペプチドを含む組成物を対象に投与した後、前記対象から単離された試料を分析し、前記軽い結び目のあるペプチドが、第一の送達経路により投与され、前記軽い結び目のあるペプチドと同じ配列を有する重い結び目のあるペプチドよりも低い分子量を有すること；
    前記重い結び目のあるペプチドを含む組成物を対象に投与した後、前記対象から単離された試料を分析し、前記重い結び目のあるペプチドが、前記第一の送達経路とは異なる第二の送達経路により投与されること；並びに
    前記対象の組織又は体液試料から得られた前記軽い結び目のあるペプチドの量を前記重い結び目のあるペプチドの量と比較し、それによりそれぞれ前記第一の送達経路及び前記第二の送達経路に基づき、前記対象における前記軽い結び目のあるペプチド及び前記重い結び目のあるペプチドの前記分布プロファイルを決定すること、
    を含む、方法。
  55. 前記軽い結び目のあるペプチドが、前記軽い結び目のあるペプチドよりも少なくかつ重い同位体を含む、請求項５３又は５４に記載の方法。
  56. 前記重い結び目のあるペプチドが、前記軽い結び目のあるペプチドよりも少なくとも１つ多い１３Ｃ原子又はジュウテリウム原子を含む、請求項５３〜５５のいずれか１項に記載の方法。
  57. 前記第一の結び目のあるペプチドが、第一の部分にコンジュゲートされていて、前記重い結び目のあるペプチドが、第二の部分にコンジュゲートされている、請求項５３〜５６のいずれか１項に記載の方法。
  58. 前記第一の部分、前記第二の部分又はそれらの両方が、それぞれ前記軽い結び目のあるペプチド及び前記重い結び目のあるペプチドのＮ末端にコンジュゲートされている、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記第一の部分、前記第二の部分又はそれらの両方が、疎水性部分を含む、請求項５７に記載の方法。
  60. 前記第一及び第二の送達経路が、独立して、経口経路、局所経路、経粘膜経路、静脈内経路、筋肉内経路、及び吸入経路から選択される、請求項５３〜５９のいずれか１項に記載の方法。
  61. 前記第一又は前記第二の送達経路のいずれかが、経口経路を含む、請求項５３〜６０のいずれか１項に記載の方法。
  62. 少なくとも１つの１３Ｃ原子が、前記第一の部分、前記第二の部分又はそれらの両方の中に存在する、請求項５７に記載の方法。
  63. 前記軽い結び目のあるペプチド、前記重い結び目のあるペプチド、及びそれらの両方が、質量分析により分析されると、特有の質量シグネチャ又は消化質量シグネチャを有する、請求項５３〜６２のいずれか１項に記載の方法。
  64. 前記薬物候補の構造と薬理学的性質との関連性を確立することをさらに含む、請求項５３〜６３に記載の方法。
  65. 前記関連性に基づく薬物候補のサブセットを選択することをさらに含む、請求項６４に記載の方法。
  66. 投与後の選択された期間に選択された時間間隔で、複数の試料を得ることをさらに含む、請求項５３〜６５のいずれか１項に記載の方法。
  67. 選択された時間間隔が、５分、１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、又は６０分である、請求項６６に記載の方法。
  68. 選択された期間が、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１５時間、３０時間、４５時間、６０時間、７５時間、９０時間、１０５時間、又は１２０時間である、請求項６６に記載の方法。
  69. 薬理学的性質を有する薬物候補を同定する方法であって、
    複数の薬物候補を含む組成物を対象に投与すること；
    前記複数の薬物候補のうちの少なくとも幾つかを含む試料を前記対象から得ること；及び
    前記試料を分析して、前記薬理学的性質を有する前記薬物候補の少なくとも幾つかの同一性を決定すること、
    を含む、方法。
  70. 前記薬物候補が、低分子化学分子、生物製剤、及びペプチドからなる群から選択される、請求項６９に記載の方法。
  71. 前記複数の薬物候補が、複数のペプチドを含む、請求項６９に記載の方法。
  72. 前記薬理学的性質が、経口生物学的利用度、血液脳関門を通過する能力、血液脳関門による排除、血清中半減期、細胞を透過する能力、細胞内オルガネラ若しくは他の細胞内ドメインに侵入する能力、臓器若しくは組織をターゲットとする能力、癌組織をターゲットとする能力、又はそれらの組み合わせを含む、請求項６９に記載の方法。
  73. 前記薬理学的性質を有する前記ペプチドの少なくとも幾つかを含むペプチドライブラリーを作製することをさらに含む、請求項７１に記載の方法。
  74. 前記ペプチドの少なくとも幾つかをスクリーニングして、どのペプチドが、タンパク質：タンパク質相互作用を阻害する活性、リセプターの拮抗を阻害する活性、リセプターへのアゴニスト結合を阻害する活性、イオンチャネルを調節する活性、シグナル伝達経路を阻害する活性、シグナル伝達経路を活性化する活性、及び／又はタンパク質：低分子相互作用を阻害する活性を示すか、を同定することをさらに含む、請求項７１に記載の方法。
  75. 前記タンパク質：タンパク質相互作用が、癌、感染性疾患、炎症性疾患、免疫疾患、代謝疾患、心臓疾患、加齢に関連する疾患、及び神経疾患からなる群から選択される疾患又は障害に関連づけられる、請求項７４に記載の方法。
  76. 前記タンパク質：タンパク質相互作用が、癌に関連づけられる、請求項７５に記載の方法。
  77. 前記対象から複数の試料を得ることをさらに含み、各試料が前記複数のペプチドを投与した後の異なる時点で得られる、請求項７１に記載の方法。
  78. 前記複数の試料のうちの少なくとも幾つかの試料を分析して、前記複数のうちの各試料において、前記薬理学的性質を有する前記ペプチドの少なくとも幾つかの同一性を決定する、請求項７７に記載の方法。
  79. 前記ペプチドの少なくとも幾つかの同一性が、質量分析を利用して決定され、そこで前記ペプチドのそれぞれが、質量分析計により検出される特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャを含む、請求項７１に記載の方法。
  80. 前記複数の薬物候補が、５を超える薬物候補を含む、請求項６９に記載の方法。
  81. 前記複数の薬物候補が、１０を超える薬物候補を含む、請求項６９に記載の方法。
  82. 前記複数の薬物候補が、１００を超える薬物候補を含む、請求項６９に記載の方法。
  83. 前記複数の薬物候補が、１０００を超える薬物候補を含む、請求項６９に記載の方法。
  84. 前記複数の薬物候補が、１００００を超える薬物候補を含む、請求項６９に記載の方法。
  85. 前記複数のペプチドが、１００を超えるペプチドを含む、請求項７１に記載の方法。
  86. 前記複数のペプチドが、１０００を超えるペプチドを含む、請求項７１に記載の方法。
  87. 前記複数のペプチドが、１００００を超えるペプチドを含む、請求項７１に記載の方法。
  88. 前記複数のペプチドのうちの少なくとも１つのペプチドが、前記対象において前記少なくとも１つのペプチドを追跡するために検出可能な標識を含む、請求項７１に記載の方法。
  89. 前記検出可能な標識が、近赤外色素を含む、請求項８８に記載の方法。
  90. 前記複数のペプチドのうちの少なくとも１つのペプチドが、前記少なくとも１つのペプチドのＮ末端にコンジュゲートされた疎水性部分を含み、前記少なくとも１つのペプチドが、前記疎水性部分を欠く少なくとも１つのペプチドに比較して、半減期の増加を示す、請求項７１に記載の方法。
  91. 前記疎水性部分が、疎水性蛍光色素、又は飽和若しくは不飽和アルキル基を含む、請求項９０に記載の方法。
  92. 前記試料が、組織試料又は体液試料を含む、請求項６９に記載の方法。
  93. 前記体液試料が、血液、尿、粘液、又は脳脊髄液を含む、請求項９２に記載の方法。
  94. 前記試料が、血液を含む、請求項６９に記載の方法。
  95. 前記組織試料が、生検又は剖検組織を含む、請求項９２に記載の方法。
  96. 前記組織が、脳、肺、腎臓、筋肉、肝臓、心臓、胃、膵臓、又は臓器からの組織を含む、請求項９２に記載の方法。
  97. 前記薬物候補に共通する前記薬理学的性質を利用して、前記薬理学的性質を有する更なる薬物候補を生成することをさらに含む、請求項６９に記載の方法。
  98. 前記対象が、動物である、請求項６９に記載の方法。
  99. 前記対象が、ヒトである、請求項６９に記載の方法。
  100. 質量で定義された薬物候補ライブラリーを作製する方法であって、
    複数の薬物候補を生成し、前記薬物候補の少なくとも幾つかがそれぞれ特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャを有すること、
    質量分析を利用して前記複数の薬物候補を分析して、前記薬物候補の少なくとも幾つかに関して前記特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャを測定すること、及び
    薬理学的性質に基づいて作製された、前記複数の薬物候補の少なくとも幾つかを含む質量で定義された薬物候補ライブラリーを作製すること、
    を含み、前記質量で定義された薬物候補ライブラリー内の前記薬物候補の同一性が、前記薬物候補それぞれの前記特有の質量シグネチャを又は消化フラグメント質量シグネチャにより決定され得る、方法。
  101. 前記薬理学的性質が、経口生物学的利用度、血液脳関門を通過する能力、血液脳関門による排除、血清中半減期、細胞を透過する能力、細胞内オルガネラ若しくは他の細胞内ドメインに侵入する能力、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１００に記載の方法。
  102. 前記薬理学的性質が、経口生物学的利用度を含む、請求項１００に記載の方法。
  103. 前記薬物候補が、低分子化学分子、生物製剤、及びペプチドからなる群から選択される、請求項１００に記載の方法。
  104. 前記複数の薬物候補が、５を超える薬物候補を含む、請求項１００に記載の方法。
  105. 前記複数の薬物候補が、１０を超える薬物候補を含む、請求項１００に記載の方法。
  106. 前記複数の薬物候補が、１００を超える薬物候補を含む、請求項１００に記載の方法。
  107. 前記複数の薬物候補が、１０００を超える薬物候補を含む、請求項１００に記載の方法。
  108. 前記複数の薬物候補が、１００００を超える薬物候補を含む、請求項１００に記載の方法。
  109. 前記複数の薬物候補が、結び目のあるペプチドを含む、請求項１００に記載の方法。
  110. 前記結び目のあるペプチドの特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャが、前記結び目のあるペプチドの天然のアミノ酸配列により定義される、請求項１０９に記載の方法。
  111. 前記複数の薬物候補の少なくとも１つが、前記少なくとも１つの薬物候補の前記特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャを修飾するための重同位体原子を所定の数含む、請求項１００に記載の方法。
  112. 前記重同位体原子が、１３Ｃ又はジュウテリウムを含む、請求項１０１に記載の方法。
  113. 前記複数の結び目のあるペプチドの少なくとも１つの前記特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャが、前記少なくとも１つの結び目のあるペプチドにコンジュゲートされた部分により定義される、請求項１０９に記載の方法。
  114. 前記部分が、前記少なくとも１つの結び目のあるペプチドのＮ末端にコンジュゲートされている、請求項１１３に記載の方法。
  115. 前記部分が、前記少なくとも１つの結び目のあるペプチドの前記特有の質量シグネチャ又は消化フラグメント質量シグネチャを修飾するために重同位体原子を所定の数含む、請求項１１３に記載の方法。
  116. 前記重同位体原子が、１３Ｃ又はジュウテリウムを含む、請求項１１５に記載の方法。
  117. 前記複数の結び目のあるペプチドが、１００を超えるペプチドを含む、請求項１０９に記載の方法。
  118. 前記複数の結び目のあるペプチドが、１０００を超えるペプチドを含む、請求項１０９に記載の方法。
  119. 前記複数の結び目のあるペプチドが、１００００を超えるペプチドを含む、請求項１０９に記載の方法。
  120. 異なる投与経路により対象に投与される結び目のあるペプチドの分布プロファイルを決定する方法であって、
    軽い結び目のあるペプチドを前記対象に投与し、前記軽い結び目のあるペプチドが、第一の送達経路により投与され、前記軽い結び目のあるペプチドと同じ配列を有する重い結び目のあるペプチドよりも低い分子量を有すること；
    前記重い結び目のあるペプチドを前記対象に投与し、前記重い結び目のあるペプチドが、前記第一の送達経路とは異なる第二の送達経路により投与されること；並びに
    前記対象の組織又は体液試料から得られた前記軽い結び目のあるペプチドの量を前記重い結び目のあるペプチドの量と比較し、それによりそれぞれ前記第一の送達経路及び前記第二の送達経路に基づき、前記対象における前記軽い結び目のあるペプチド及び前記重い結び目のあるペプチドの前記分布プロファイルを決定すること、
    を含む、方法。
  121. 前記軽い結び目のあるペプチドが、前記軽い結び目のあるペプチドよりも少なくかつ重い同位体を含む、請求項１２０に記載の方法。
  122. 前記重い結び目のあるペプチドが、前記軽い結び目のあるペプチドよりも少なくとも１つ多い１３Ｃ原子又はジュウテリウム原子を含む、請求項１２０に記載の方法。
  123. 前記第一の結び目のあるペプチドが、第一の部分にコンジュゲートされていて、前記重い結び目のあるペプチドが、第二の部分にコンジュゲートされている、請求項１２０に記載の方法。
  124. 前記第一の部分、前記第二の部分又はそれらの両方が、それぞれ前記軽い結び目のあるペプチド及び前記重い結び目のあるペプチドのＮ末端にコンジュゲートされている、請求項１２３に記載の方法。
  125. 前記第一の部分、前記第二の部分又はそれらの両方が、疎水性部分を含む、請求項１２３に記載の方法。
  126. 前記第一及び第二の送達経路が、独立して、経口経路、局所経路、経粘膜経路、静脈内経路、筋肉内経路、及び吸入経路から選択される、請求項１２０に記載の方法。
  127. 前記第一又は前記第二の送達経路のいずれかが、経口経路を含む、請求項１２０に記載の方法。
  128. 少なくとも１つの１３Ｃ原子が、前記第一の部分、前記第二の部分又はそれらの両方の中に存在する、請求項１２０に記載の方法。
  129. 前記軽い結び目のあるペプチド、前記重い結び目のあるペプチド、及びそれらの両方が、質量分析により分析されると、特有の質量シグネチャ又は消化質量シグネチャを有する、請求項１２０に記載の方法。
  130. 対象の腫瘍を画像化するためのペプチドであって、少なくとも３つのＤ−アミノ酸を有するアミノ酸配列を含むクロロトキシンを含み、前記腫瘍に結合するように構成された二次構造を有し、検出可能な標識をさらに含む、ペプチド。
  131. 前記ペプチド内の前記アミノ酸の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％が、Ｄ−アミノ酸である、請求項１３０に記載のペプチド。
  132. 以下の配列：
    ＭＣＭＰＣＦＴＴＤＨＱＭＡＲＸＣＤＤＣＣＧＧＸＧＲＧＸＣＹＧＰＱＣＬＣＲ（ここで、Ｘは、Ｋ、Ａ及びＲから選択される）と少なくとも８０％、８３％、８６％、８９％、９０％又は９２％同一のアミノ酸配列を有する、請求項１３０又は１３１に記載のペプチド。
  133. 以下の配列：
    ＭＣＭＰＣＦＴＴＤＨＱＭＡＲＸＣＤＤＣＣＧＧＸＧＲＧＸＣＹＧＰＱＣＬＣＲ（ここで、アミノ酸配列内のアミノ酸の少なくとも３つは、Ｄ−アミノ酸であり、Ｘは、Ｋ、Ａ及びＲから選択される）と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含むペプチド。
  134. 前記ペプチド内の前記アミノ酸の少なくとも５０％、少なくとも６０％、又は少なくとも７０％が、Ｄ−アミノ酸である、請求項１３３に記載のペプチド。
  135. 検出可能な標識をさらに含む、請求項１３３〜１３４のいずれかに記載のペプチド。
  136. 前記のペプチド内のアミノ酸全てが、Ｄ−アミノ酸である、請求項１３０〜１３５のいずれかに記載のペプチド。
  137. 前記検出可能な標識が、前記ペプチドのＮ末端にコンジュゲートされているか、又は前記ペプチド内のリジン残基にコンジュゲートされている、請求項１３０〜１３２又は１３５〜１３７のいずれかに記載のペプチド。
  138. 前記検出可能な標識が、近赤外色素を含む、請求項１３７に記載のペプチド。
  139. 前記検出可能な標識が、シアニン色素を含む、請求項１３７に記載のペプチド。
  140. 請求項１３０〜１３９のいずれか１項に記載のペプチド、又はそれらの組み合わせを含む組成物。
  141. 対象におけるペプチドを検出する方法であって、
    前記対象に、請求項１３０〜１３２のいずれかに記載のペプチド又は請求項１３５〜１３９のいずれかに記載のペプチド又は請求項１２６に記載の組成物の有効量を投与すること、及び検出可能な標識を検出すること、
    を含む、方法。
  142. 前記検出することが、前記検出可能な標識を検出することにより前記対象における領域の画像を得ることを含む、請求項１４１に記載の方法。
  143. 前記検出することが、癌組織の手術中の視覚化を含む、請求項１４２に記載の方法。
  144. 前記検出可能な標識の視覚化が、前記対象の腫瘍の外科的除去を誘導する、請求項１４２に記載の方法。
  145. クロロトキシンターゲットを発現する細胞に関連する疾患を処置する方法であって、
    それを必要とする対象に、請求項１３０〜１３９に記載のペプチドを含む医薬組成物又は請求項１４０に記載の組成物の治療有効量を投与し、それにより前記疾患を処置すること、
    を含む、方法。
  146. 前記組成物の前記ぺプチドが、細胞毒性剤、毒素、アンチセンスヌクレオチド、癌用薬物、ヌクレオチド薬、代謝モジュレータ、放射線増感剤、ペプチド治療薬、ペプチド−薬物コンジュゲート、又はそれらの組み合わせをさらに含む、請求項１４５に記載の方法。
  147. 前記疾患が、神経膠腫、皮膚癌、肺癌、リンパ腫、髄芽細胞腫、前立腺癌、膵臓癌、乳癌、乳腺癌（mammary cancer）、結腸癌、肉腫、口腔扁平上皮癌、血液外皮腫、又はそれらの組み合わせに関連する癌組織を含む、請求項１４５又は１４６に記載の方法。
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