DE10020376A1 - Dynamische Marker - Google Patents

Dynamische Marker

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DE10020376A1
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Bernhard Wolf
Martin Koch
Ernst Stetter
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KOCH, MARTIN, VALBY, DK
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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von dynamischen Magnetfeldern (DM-Felder) oder DM-Felderzeugern zum Erkennen und/oder Sortieren von Zellen, Zellbestandteilen oder Pathogenen, die Verwendung dieser Felder oder Felderzeuger zur Reinigung von Flüssigkeiten von Pathogenen, Methoden oder Verfahren zur Behandlung von infizierten Zellen oder Tumorzellen, die Verwendung superparamagnetisch markierter Wirkstoffe zur Herstellung eines Präparates zur Anwendung in einem Verfahren zur Behandlung von infizierten Zellen oder Tumorzellen, das die Behandlung mit einem DM-Feld oder DM-Felderzeuger umfasst, sowie die Kombination von superparamagnetisch markierten Wirkstoffen oder superparamagnetischen Beads mit einem Erzeuger eines DM-Feldes. Fig. 3 zeigt als Beispiel ein Mikroskop (12), unter dem eine superparamagnetisch markierte Probe (15) dem durch den Felderzeuger (11) erzeugten DM-Wechselfeld ausgesetzt wird und so die bewegten markierten Objekte (z. B. Zellen) in Bewegung gesetzt und damit spezifisch erkennbar werden.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von dynamischen Magnetfeldern (DM-Felder) oder DM-Felderzeugern zum Erkennen und/oder Sortieren von Zellen, Zellbestandteilen oder Pathogenen, die Verwendung dieser Felder oder Felderzeuger zur Reinigung von Flüssigkeiten von Patho­ genen, Methoden oder Verfahren zur Behandlung von infizierten Zellen oder Tumorzellen, die Verwendung superparamagnetisch markierter Wirkstoffe zur Herstellung eines Präparates zur Anwendung in einem Verfahren zur Behandlung von infizierten Zellen oder Tumorzellen, das die Behandlung mit einem DM-Feld oder DM-Felderzeuger umfasst, sowie die Kombination von superparamagnetisch markierten Wirkstoffen oder superparamagnetischen Beads mit einem Erzeuger eines DM-Feldes.
Hintergrund der Erfindung
Systeme zum Isolieren von mit superparamagnetischen Beads oder an­ derweitig paramagnetisch markierten Zellen sind bekannt. Diese be­ nutzen entweder Zellsortierapparaturen (siehe z. B. US 5,837,200), die einen relativ niedrigen Durchsatz haben, oder sie basieren auf dem Anlegen von statischen magnetischen Gleichfeldern, um superpa­ ramagnetisch markierte Zellen mittels einer durch einen Magneten, der ein nichthomogenes magnetisches Gleichfeld erzeugt, umgebenen Säule zurückzuhalten und erst nach Auswaschen nicht markierter Zellen durch Entfernen des Magneten auch auswaschbar zu machen (MACS = Magnetically Activated Cell Sorter, kommerziell erhältlich von der Firma Miltenyi Biotec GmbH).
Bekannt geworden ist auch die Anwendung von Wechselfeldern zur Unter­ drückung der Kettenbildung von Häm-Molekülen in durch den Erreger der Malaria, einen Protozoen namens Plasmodium, infizierten Erythro­ zyten. Eine Form des Erregers hält sich normalerweise in Erythrozyten auf und bewirkt dort durch Aufnahme der Proteinkomponente aus Hämo­ globin die Freisetzung von Häm, das sich dann in langen Ketten zu­ sammenlagert. Durch Wechselfelder gelang es, diese Kettenbildung zu hemmen bzw. vorhandene Ketten zu zerstören. Dadurch konnte ein 33 bis 70%-igen Abfall der Anzahl an Parasiten erreicht werden. Die schwach oszillierenden Magnetfelder, die bei diesen Versuchen an der Universität Washington verwendet wurden, sind niederfrequente Magnetfelder. Sie sollen helfen, dem Erreger der Malaria die Lebens­ basis durch Zerstörung der gebildeten Hämstrukturen in den Erythro­ zyten zu entziehen. Das zweiwertige Eisenion im Hämmolekül ist nur im deoxygenierten Zustand magnetisch, so dass hier vor allem venöses Blut von Interesse ist.
Bekannt ist auch ein Verfahren einer dänischen Firma (MEDICO-CHEMICAL LAB, APS), bei dem eine magnetisierte Medizin direkt in die Blutbahn injiziert wird und an der Stelle, wo die Behandlung stattfinden soll, beispielsweise am Ort eines Tumors, durch ein starkes magneti­ sches Gleichfeld festgehalten und so angereichert wird. Problematisch hierbei war, ein Magnetfeld aufzubauen, das stark genug ist, den Wirkstoff am gewünschten Ort zu halten.
Schließlich ist auch bekannt, Eisenoxid enthaltende Nanopartikel in einen Tumor zu verabreichen (z. B. durch Injektion) und dann durch Anwendung von Wechselfeldern lokal derart in Schwingungen zu ver­ setzen, daß am Ort der Nanopartikel Temperaturen bis ca. 47°C ent­ stehen. Als Folge zerfällt das entartete Gewebe. In Mäuse verpflanzte Brusttumoren verschwanden so innerhalb einer halben Stunde. Diese an der Humbold-Universität entwickelte Methode verwendet hochfrequen­ te Felder (kHz, MHz). Die hier wirkenden elektromagnetischen Felder sind jedoch materialkonstanten-abhängig und u. U. inhomogen. Ihre Wirkung kann im Unterschied zu derjenigen der dynamischen Wechsel­ felder, die mit der ersten Maxwellschen Gleichung beschrieben werden können, mit der zweiten Maxwellschen Gleichung beschrieben werden (Induktionsgesetz).
  • 1. Maxwell'sche Gleichung: ∳ H . ds = ∫ (J + ∂D/∂t) . dA
  • 2. Maxwell'sche Gleichung: ∳ E . ds = - ∫∂B/∂t . dA
    A = Fläche
    H = Magnetisches Feld
    E = Elektrisches Feld
    J = Stromdichte
    s = Wegstrecke
    B = Magnetische Flussdichte
    t = Zeit
    ∂D/∂t = Verschiebungsstromdichte
Alle genannten Systeme verwenden entweder statische magnetische Gleichfelder oder einfache (oszillierende) Wechselfelder.
Insbesondere in der eingangs erwähnten MACS-Technik werden magne­ tische Felder angewendet, die von einem Permanentmagneten erzeugt werden. Diese inhomogenen, statischen magnetischen Gleichfelder sind Materialkonstanten-unabhängig (J. C. Maxwell, On Faraday's Lines of Force, Scientific Papers 1855, 1856, nachgedruckt Dower, New York 1952), können also Flüssigkeiten durchdringen und darin be­ findliche magnetische Partikel erreichen und auf diese einwirken. Das magnetische System ist jedoch nach dessen Installation in der Anlage unveränderlich festgelegt. Es steht ausser Zweifel, dass eine Vielzahl magnetisch markierter Objekte (z. B. Zellen) in Lösung von einem starken Permanentmagneten angezogen werden, wenn auch unterschiedlich stark.
Die Patentanmeldung WO 95/19217 (entspricht EP 0 740 578) beschreibt eine Vorrichtung, die es ermöglicht, regelrecht sich bewegende Magnetfelder zu erzeugen. Diese wird in der angegebenen Patentanmeldung zur Bewegung von Ionen in Mauerwerk mit dem Ziel, Salze aus Mauerwerk zu entfernen, angewendet.
Zur Therapie proliferativer Erkrankungen, wie Tumorerkrankungen oder Krebs, werden bislang vor allem Chemotherapie, Bestrahlung, chirurgische Behandlung, Cryothermie (Einfrieren), Hyperthermie (lokal oder im ganzen Körper abnorm erhöhte Temperatur) und Immun­ therapie, oder Kombinationen davon, verwendet, zur Behandlung von Infektionen beispielsweise Antibiotika oder andere Chemotherapeutika, z. B. antiparasitäre oder antivirale Wirkstoffe. Es besteht ein Be­ dürfnis, neue Vorrichtungen und Verfahren zur Therapie und Diagnose derartiger Erkrankungen zur Verfügung zu haben.
Anfang 2000 wurde in der Deutschen Ärztezeitung berichtet, dass Krebskulturen in Laborgefässen in ihrem Wachstum beeinträchtigt werden können, wenn sie durch Lautsprecher beschallt wurden. Dieses einfache Experiment zeigt, dass die Zellkulturen (Zellen eines Lun­ genkarzinoms) bei mechanischer Belastung langsamer wachsen als in einer unbeschallten Kontrollgruppe. Es wäre interessant, derartige mechanische Effekte auf andere Weise hervorzurufen.
Zusammenfassung der Vorteile der Erfindung
Die dynamische Markierungstechnik gemäss der Erfindung erlaubt, im Unterschied zum Stand der Technik jetzt mit magnetischen Bewe­ gungsfeldern (dynamische Magnetfelder, nachfolgend DM-Felder genannt) zu arbeiten. Diese können so kombiniert werden, dass auch in stehen­ den (ohne Hall-Effekt) oder bewegten Flüssigkeiten niedriger bis hoher (z. B. gelartiger) Viskosität dynamische Effekte auf ruhende oder bewegte markierte Objekte erzeugt werden können. Die Frequenz dieser magnetischen Felder kann so gewählt werden, dass sie auch als materialkonstantenunabhängig angesehen werden können (der fre­ quenzabhängige Summand der ersten Maxwell'schen Gleichung ist hier zu vernachlässigen, der erste Summand ist völlig materialkonstanten­ unabhängig). Dies bedeutet, dass Felder dieser Art nahezu verlustfrei entsprechende Flüssigkeiten durchwandern können, um dann auf alle magnetischen, z. B. mit magnetischen Beads markierten Objekte, etwa Zellen oder z. B. Liposomen oder superparamagnetisch markierte Wirk­ stoffe, magnetisch-dynamisch einwirken zu können (beispielsweise durch Drehungen, Transport oder Aufbau von (nach Eliminieren der Felder reversibel sich auflösenden) Strukturbarrieren). Durch eben diese dynamische Charakteristik der für die dynamische Markierung verwendbaren Felder (DM-Felder) können ferner auch elektrische Kräfte in Flüssigkeiten erzeugt werden, die magnetische wie auch unmagne­ tische Ionen- beeinflussen können (siehe unten Fig. 1).
Die schwach oszillierenden Felder, die in den eingangs erwähnten Versuchen an der Universität Washington gegen Malaria verwendet wurden, können ebenfalls mittels eines in der vorliegenden Erfindung verwendeten DM-Felderzeugers hervorgerufen werden, wenn man den sonst langgestreckten DM-Felderzeuger rund ausführt, dem Stator einer Drehstrommaschine vergleichbar, und beispielsweise als eine Art Manschette um einen Arm, ein Bein oder den ganzen Körper legt. Bevorzugt finden jedoch nicht ringförmige DM-Felderzeuger Verwendung.
Es ist auch möglich, mittels der DM-Felder eine mechanische Belastung von infiziertem Gewebe oder Tumorgewebe hervorzurufen, z. B., indem man superparamagnetische Beads in der Nähe eines Tumors oder eines infizierten Organs (z. B. Leber, Gehirn) appliziert (beispielsweise durch Injektion am Tumorort oder durch Transport mittels eines DM- Feld selbst, oder insbesondere durch Administration von mit gegen den Tumor oder infizierte Zellen gerichteten Antikörpern, die super­ paramagnetisch markiert sind, so dass sie sich wegen der Bindung an Tumorzellen nach beispielsweise Injektion oder Infusion an Tumor­ zellen anreichern) und dann magnetisch mittels DM-Feldern "rüttelt" oder rotiert. Der DM-Felderzeuger kann hier den entsprechenden Er­ fordernissen in Form, Leistung und Frequenz angepasst werden.
Bei Anwendung von Ferritmaterialien anstelle von geschichteten, gegeneinander isolierten Blechen oder massiven Komponenten (bei­ spielsweise geeignet für Frequenzen unter 15 Hz) als Bestandteil des Magnetfelderzeugers können auch höhere Frequenzen(beispielsweise im kHz-Bereich) durch ein DM-Gerät erzeugt werden.
Die schon beschriebenen Hyperthermieeffekte durch in Tumoren inji­ zierte Eisenoxidpartikel und von aussen angelegte Wechselfelder sollen nach Berichten der Berliner Forscher der Charité/Humbolduni­ versität bei Mäusen Tumoren zerstört haben. Elektromagnetische Wechselfelder, die über grössere Distanzen (Körper des Menschen) magnetisierte Tumoren wegheizen sollen, sind aufgrund der langen Wege mit unterschiedlichen Materialkonstanten (Gewebe, Wasser etc.) problematisch. Ein zusätzliches Problem ist wohl auch hierbei die "Magnetisierung" des Tumors. Einfaches Einspritzen von super­ paramagnetischen Beads gewährleistet nicht immer eine gleichmässige, optimale Verteilung. Dies kann jedoch mit der DM-Technik in Kombi­ nation mit Beads, an die Antikörper gegen Tumorzellen oder infizierte Zellen konjugiert sind, und erforderlichenfalls forciertes dynami­ sches Anpressen über die blutversorgten Teile des erkrankten Gewebes gelingen.
Die Anwendungsmöglichkeiten von DM-Feldern sind somit ausserordent­ lich vielfältig.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung betrifft die Verwendung von dynamischen Magnetfeldern (DM-Felder) oder von DM-Felderzeugern zum Erkennen und/oder Sortieren von Zellen, Zellbestandteilen oder Pathogenen, insbesondere solchen Zellen, Zellbestandteilen oder Pathogene, an die superparamagnetische Beads gebunden sind.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von DM-Feldern oder von DM-Felderzeugern zur Reinigung von Flüssigkeiten von Pathogenen, insbesondere solchen, an die superparamagnetische Beads gebunden sind.
Die Erfindung betrifft auch Methoden oder Verfahren zur Diagnose (Erkennen von kranken, z. B. infizierten oder Tumorzellen) und insbesondere Behandlung von infizierten Zellen oder Tumorzellen, welche die Nutzung von DM-Feldern oder DM-Felderzeugern und ins­ besondere zusätzlich superparamagnetischen Beads umfassen, die am Ort der infizierten Zellen oder Tumorzellen (insbesondere nach entsprechend lokalisierter Administration, z. B. Injektion, oder, insbesondere, wenn die superparamagnetischen Beads an für die genannten Zellen spezifische Antikörper (direkt, über einen Spacer oder über Liposomen) gebunden sind, systemischer Administration) vorliegen oder an diese gebunden sind.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von superparamagnetisch markierten Wirkstoffen zur Herstellung eines Präparates zur Anwendung in einem Verfahren zur Behandlung von infizierten Zellen oder Tumor­ zellen, das die Behandlung mit einem DM-Feld oder mit einem DM- Felderzeuger sowie von superparamagnetischen Beads umfasst, die (a) am Ort der Zellen verabreicht (z. B. injiziert), (b) mit einem DM-Feld oder DM-Felderzeuger dorthin manövriert (vor allem durch Körperhöhlen) und/oder (c) an die genannten Zellen, z. B. über an die Beads gebundene, für Antigene auf den zu behandelnden Zellen spezifische Antikörper (die insbesondere direkt oder über Spacer oder Liposomen an die Beads gebunden sind), spezifisch gebunden werden oder sind und gewünschtenfalls einen gegen Infektion oder Tumoren wirksamen Wirkstoff (direkt oder über einen Spacer kovalent an die Beads gebunden oder in Liposomen, die an die Beads gebunden sind) tragen; sowie die Kombination von superparamagetisch markierten Wirkstoffen oder superparamagnetischen Beads mit einem Erzeuger eines DM-Feldes (DM-Felderzeuger).
Die vor- und nachstehend genannten Ausdrücke haben vorzugsweise im Rahmen der vorliegenden Offenlegung die folgenden Bedeutungen, soweit nichts anderes angegeben ist - einzelne oder mehrere der entsprechenden spezifischeren Definitionen können anstelle der obigen allgemeineren Definitionen verwendet werden und betreffen dann je­ weils bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung:
Verwenden von DM-Feldern oder DM-Felderzeugern und superparamagne­ tischen Beads bedeutet insbesondere, dass DM-Felder oder DM-Felder­ zeuger angewendet werden, um die superparamagnetischen Beads, insbe­ sondere die an Zellen, Zellbestandteile und/oder Pathogene gebunde­ nen, in Bewegung zu versetzen, beispielsweise in longitudinale Bewe­ gung oder Rotation, oder (durch Erzeugen statischer Wechselfelder mittels eines DM-Felderzeugers) aus ihnen Strukturen, wie Barrieren oder stäbchenförmige Strukturen, zu formen.
DM-Felder (magnetische Bewegungsfelder) sind dadurch gekennzeichnet, daß sie der ersten Maxwellschen Gleichung gehorchen und somit magne­ tische Effekte betreffen, die bei Wahl ausreichend niedriger Frequen­ zen, da dann der zweite Summand der 1. Maxwell'schen Gleichung ver­ nachlässigbar ist, materialkonstantenunabhängige Durchdringung zeigen (im Unterschied hierzu beruhen z. B. die an der Charité genutzten Felder auf der zweiten Maxwellschen Gleichung und basieren auf dem Prinzip der Induktion).
DM-Felderzeuger sind in WO 95/19217 beschrieben, sie können in den Abmessungen an die Bedürfnisse angepasst werden (z. B. durch Dimen­ sionierung, etwa so, dass sie auf einem Mikroskopiertisch verwendet werden können, bis hin zu sich über einen ganzen Körper erstreckenden Spulensystemen. Im Prinzip entsprechen sie "Linearmotoren".
Erkennen von Zellen, Zellbestandteilen oder Pathogenen bedeutet, dass diese nach Markierung mit superparamagnetischen Beads durch Anlegen von magnetischen Bewegungsfeldern in Rotation versetzt oder gerichtet bewegt werden können und so beobachtet und in Gegenwart nichtmarkierter Zellen erkannt (identifiziert) werden können, vor­ zugsweise mikroskopisch. Dies bedeutet, dass auch eine Methode zur Diagnose(beispielsweise Erkennen von kranken Zellen aus Gewebezellen oder Blut) Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist.
Sortieren von Zellen, Zellbestandteilen oder Pathogenen bedeutet, dass entsprechend superparamagnetisch markierte Zellen, Zellbestand­ teile oder Pathogene aus Lösungen durch Anlegen beispielsweise von magnetischen Bewegungsfeldern oder durch Erzeugen von Strukturen (Fig. 4, (18)) aus Gemischen mit unmarkierten Gegenstücken heraus­ sortiert oder angereichert werden können, beispielsweise aus flies­ senden Lösungen, indem sie an eine Seite gelenkt und nur dort abge­ zweigt werden, oder aus stehenden Lösungen, insbesondere Blutkon­ serven, Blutserumkonserven oder Blutplasmakonserven oder Nährmedien, beispielsweise für die Organtransplantation oder Zellkulturen, die frei von Pathogenen sein müssen), indem sie ebenfalls an eine Stelle, z. B. eine Seite, konzentriert und dort (beispielsweise durch Absau­ gen) entfernt werden. Vorteil ist, dass beispielsweise Nährmedien für die Zellkultur oder aus Blut gewonnene Konserven so gereinigt werden können. Durch sequentielle Anwendung unterschiedlicher Anti­ körper können so auch mehrere Komponenten aus einer Probe gewonnen werden.
Zellbestandteile sind beispielsweise Organellen, wie Lysosomen, Endoplasmatisches Retikulum, Vesikel der Zellmembran (z. B. Mikro­ somen, kanalikuläre Membranvesikel aus Gallenkanälchen) und der­ gleichen. Pathogene sind auch Krebszellen, z. B. (beispielsweise zur Metastasenbildung geeignete) Tumorzellen oder Blutkrebszellen oder abnorm prolieferierende Zellen aus Knochenmark.
Pathogene sind beispielsweise Bakterien einschliesslich Mycoplasmen, Viren (z. B. HIV, Hepatitis-Viren, wie HCV), Pilze (wie Hefen) oder Parasiten (wie Protozoen, z. B. Trypanosomen oder Plasmodien, Würmer oder dergleichen).
Die superparamagnetische Markierung gelingt vorzugsweise durch superparamagnetisch markierte Antikörper oder durch superpara­ magnetisch markierte Liposomen, die auch Antikörper, welche für die entsprechenden Zellen oder Pathogene, d. h. spezifisch oder verstärkt dort exprimierte Antigene, spezifisch sind und diese binden. Diese Antikörper sind beispielsweise gegen (z. B. auf der Zelloberfläche exprimierte) Tumorantigene, auf der Zelloberfläche (beispielsweise durch antigenpräsentierende Proteine wie solche des Major Histocompatibility Complex oder dergleichen) präsentierte Peptide (beispielsweise aus Pathogenen, wie Viren oder Mycoplasmen) oder direkt auf den Pathogenen selbst vorliegende Antigene gerichtet und durch Standardverfahren erhältlich.
Das Sortieren von Zellen, Zellbestandteilen oder Pathogenen gelingt ebenfalls mittels entsprechend superparamagnetisch markierten Antikörpern oder Liposomen, wobei ebenfalls aus fliessenden oder stehenden Flüssigkeiten die markierten Komponenten an bestimmten Stellen angereichert und dann selektiv abgeleitet oder abgesaugt werden können. Das Reinigen von Flüssigkeiten von Zellen, Zellbe­ standteilen oder Pathogenen gelingt ebenfalls auf analoge Weise.
Die Behandlung von infizierten Zellen oder Tumorzellen kann bei­ spielsweise extrakorporal erfolgen (beispielsweise in Zell- oder Gewebskulturen, etwa zum Züchten von Leberzellen aus einer virus­ infizierten Leber, oder aus isoliertem Knochenmark eines Tumorpatien­ ten, um jeweils infizierte bzw. Tumorzellen zu entfernen und so die Reimplantation zu ermöglichen). Auf diese Weise können (durch Heraussortieren markierter infizierter oder tumoraler Zellen, durch deren mechanische Zerstörung, durch kräftige Bewegung und/oder durch Administration mit Wirkstoffen beladener superparamagnetischer, antikörpergebundener Beads, deren Wirkstoffe im DM-Feld durch die stärkere mechanische Belastung der gebundenen Zellen und die selek­ tive Aufkonzentrierung an den Zellen dort verstärkt wirken) die unerwünschten Zellen beseitigt und so rein "gesunde" Zell- oder Gewebskulturen oder Zellen oder Gewebeteile gewonnen werden, die beispielsweise zur heterologen oder vorzugsweise autologen Trans­ plantation verwendet werden können.
Die Behandlung kann aber auch im Körper erfolgen, vorzugsweise bei einem Warmblüter, wie einem Menschen, insbesondere, wenn dieser einer entsprechenden Behandlung bedarf. So können antikörper- und superparamagnetisch markierte Beads, vorzugsweise mit einem oder mehreren Wirkstoffen beladen, einem Warmblüter administriert und mittels DM-Feldern nach "Andocken" am erkrankten Gewebe in Bewegung versetzt werden, was einerseits die erkrankten Zellen mechanisch belastet, andererseits dem Wirkstoff verstärkt aussetzt (beispiels­ weise, da dieser durch das DM-Feld ins Zellinnere gelangt).
Auch nicht-markierte Beads können (insbesondere in Körperhöhlen, wie Lunge, Magen-Darm-Trakt, Bauchhöhle, Pleuraspalt, Gehirncavernen, Rückenmarkskanal, Hohlräume im Bereich von Muskelfaszien etc.) Ver­ wendung finden. Diese können erst mittels DM-Feldern an die gewünsch­ te Stelle (z. B. Tumor, infiziertes Organ, z. B. Leber) manövriert und dann vor Ort in Bewegung versetzt werden und so die erkrankten Stellen durch mechanische Belastung für die Abwehrkräfte des Körpers zugänglich machen.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von superparamagnetisch markierten Wirkstoffen zur Herstellung eines Präparates zur Anwendung in einem Verfahren zur Behandlung von infizierten Zellen oder Tumor­ zellen, das die Behandlung mit einem DM-Feld umfasst, sowie die Kombination von superparamagetisch markierten Wirkstoffen oder su­ perparamagnetischen Beads mit einem Erzeuger eines DM-Feldes, ins­ besondere, wie in WO 95/19217 beschrieben.
Superparamagnetische Kügelchen (Beads) sind bekannt, nach an sich bekannten Verfahren herstellbar oder kommerziell erhältlich. Der Ausdruck "Kügelchen" bedeutet nicht zwangsläufig Kugelform, sondern ist im Sinne von "Partikelchen" verwendet.
Beispielsweise beschreibt die Internationale Patentanmeldung WO 85/02772 Partikelchen, die in einer Kohlenhydrat-, Polyaminosäure- oder Kunststoffmatrix basieren. Beispiele für entsprechende Kohlen­ hydratmatrices finden sich in PCT/SE82/00381, PCT/SE83/00106 und PCT/SE83/00268, für entsprechende Polyaminosäure-Matrices in US 4,247,406; Kunststoffmatrices, beispielsweise basierend auf Polymeren aus Acrylaten, Polystyrol, etc., sind ebenfalls bekannt. In die Matrix sind beispielsweise Eisenoxidpartikel eingebettet. Das Patent US 4,219,411 beschreibt Polystyrol - und insbesondere auf Polymerisa­ ten von Acrylsäure und ihren Derivaten (wie Acrylamid, Methacrylamid, Acrylsäure, Methacrylsäure, Dimethylaminomethacrylat, Hydroxy-nieder­ alkyl- oder Amino-niederalkylacrylate, wie 2-Hydroxyethyl-, 3-Hydro­ xypropyl- oder 2-Aminoethyl-methacrylsäure) basierende Matrices mit freien Hydroxygruppen, die mit Cyanogenbromid aktivierbar sind, oder mit freien Carboxygruppen, oder mit freien Aminogruppen, die alle die kovalente Bindung an Moleküle, wie Antikörper, Avidin oder Streptavidin, erlauben. Weitere Patente, die geeignete Partikelmatri­ ces beschreiben, sind US 3,957,741 und US 4,035,316.
Die superparamagnetischen Eigenschaften werden durch die Einbettung von Metalloxiden, insbesondere Eisenoxid (Fe3O4), oder von anderen geeigneten Metallen oder Legierungen erzielt. Die Metallpartikel sind vorzugsweise fein und von relativ gleichmässiger Grösse, so daß der resultierende Partikeldurchmesser vorzugsweise die unten genannten Grössen hat. Die Metalle sind insbesondere Eisen, Nickel oder Kobalt, oder Legierungen, die beispielsweise noch Gadolinium, Dysprosium oder Erbium, ferner Vanadium, oder andere Übergangsmetalle enthalten können. Eisenoxid (insbesondere Magnetit) ist bevorzugt. Einige Ferrite, wie Lithiumferrite, kommen ebenfalls in Frage.
Bevorzugte Beads haben einen mittleren Durchmesser von 2 µm oder weniger, insbesondere 1 µm oder weniger (um beispielsweise nicht im Kapillarsystem stecken zu bleiben), vorzugsweise von 30 bis 1000 nm, insbesondere von 30 bis bis 300 nm. Besonders bevorzugt sind Beads mit biologisch abbaubarer Matrix, z. B. aus Kohlenhydraten (insbesondere Polysacchariden) oder Polyaminosäuren. Alle diese Beads, wie auch Analoge davon, sind im Rahmen der vorliegenden Erfin­ dung geeignet. Die Beads können auch zusätzlich mit gamma-Strahlern (wie Technetium-99 m) in geringer Aktivität markiert sein, um die Bewegung von ggf. mit Wirkstoffen beladenen Kügelchen mittels einer gamma-Kamera, beispielsweise im Körper, zu verfolgen.
Insbesondere bietet beispielsweise die Firma Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Deutschland, unter der Bezeichnung "MicroBeads" freie oder mit Antikörpern konjugierte Beads mit durchschnittlicher Grösse von rund 50 nm an, die Eisenoxid in einer Polysaccharidmatrix enthalten - diese haben den grossen Vorteil, auch bioabbaubar zu sein, und sind deshalb und aufgrund ihrer geringen Grösse sehr be­ vorzugt. Von der Firma Polysciences, Inc., werden unter der Bezeich­ nung "BioMag®" Beads von ca. 1 µm Grösse angeboten, die aus einem Eisenoxidkern mit einer Silanhülle bestehen und mit Amino- oder Carboxygruppen funktionalisiert sind, welche die kovalente Bindung an Proteine (wie Antikörper, Avidin, Streptavidin), Glykoproteine, Polysaccharide, Lektine und andere Liganden erlaubt. Sigma-Aldrich bietet ebenfalls superparamagnetische Beads von ca. 1 µm Durchmesser auf Eisenoxidbasis an, die an der Oberfläche als funktionelle Gruppen entweder Carboxy- oder Aminogruppen tragen. Weitere superparamagne­ tische Beads werden von der Deutschen Dynal GmbH, Hamburg, Deutschland angeboten, und von einer Reihe weitere Firmen.
Beispiele für Wirkstoffe, die gemäss der Erfindung angewendet werden können, sind insbesondere antitumorwirksame Chemotherapeutika, die (alleine oder als Kombination von zwei oder mehr der genannten Sub­ stanzen) erfindungsgemäss als Wirkstoffe Einsatz finden können, insbesondere die in folgender Aufstellung enthaltenen:
  • A) Alkylierende Agentien, wie Dacarbazine (DTIC-Dome); Senfgasde­ rivate, wie Mechlorethamine (Mustargen); Ethyleneiminderivate, e. g. Triethylenethiophosphoramid (thio-tepa); Procarbazine (Matulane); Alkylsulfonate wie Busulfan (Myeleran); Cyclophosphamid; 4-Hydroxy­ peroxycyclophosphamid (4-HC); Mafosfamid; Ifosfamid; Melphalan (Al- keran); Chlorambucil (Leukeran); Nitrosoharnstoffe wie Cyclohexyl­ nitrosoharnstoff (meCCNU; Carmustin, BCNU, BiCNU) oder Lomustin (CCNU, CeeNU), cis-Platin(II)-diamindichlorid (Platinol oder Cispla­ tin); Carboplatin (Paraplatin); vorzugsweise quervernetzende Chemo­ therapeutika, insbesondere bis-alkylierende Agentien, besonders Senfgasderivate wie Mechlorethamin (Mustargen); Alkylsulfonate wie Busulfan; Cyclophosphamid; Melphalan; Chlorambucil; Cisplatin(II) - diamindichlorid oder Carboplatin; oder Verbindungen, die Vernetzungen (cross-links) über ionische Bindungen bewirken, wie etwa Ethylenimin- Derivate, z. B. Triethylen-thiophosporamid (Thio-tepa);
  • B) Antitumorantibiotica, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, welche Bleomycin(Blenoxane); Anthracycline, wie Daunomycin, Dactino­ mycin (Cosmegen), Daunorubicin (Cerubidin), Doxorubicin (Adriamycin, Rubex), Epirubicin, Esorubicin, Idarubicin (Idamycin), Plicamycin (Mithracin, früher als Mithramycin bezeichnet) und insbesondere quervernetzende (bis-alkylierende) Antitumorantibiotica, wie Mitomy­ cin C (Mitomycin, Mutamycin) umfasst;
  • C) Antimetabolite, z. B. Folsäureanaloga wie Methotrexate (Folex, Mexate) oder Trimetrexat; Purinnucleosidanaloge wie Cladribin (Leu­ statin; 2-Chloro-2'-deoxy-(3-D-adenosin), 6-Mercaptopurin (Mercapto­ purin, Purinethol, 6-MP), Pentostatin (Nipent) oder 6-Thioguanin (6-TG, Tabloid); Pyrimidinanaloge wie 5-Fluoruracil (Fluoruracil, 5-FU), 5-Fluordeoxyuridin (Floxuridine, FUDR), Cytosinarabinosid (Ara-C, Cytarabin, Cytosar-U oder Tarabin PFS), Fludarabinphosphat (Fludara) oder 5-Azacytidin; Hydroxyharnstoff (Hydrea); oder Poly­ aminbiosyntheseinhibitoren, vor allem Ornithindecarboxylas- oder S-Adenosylmethionindecarboxylaseinhibitoren, z. B. die in EP 0 456 133 genannten, insbesondere 4-Amidino-1-indanon-2'-amidinohydrazon;
  • D) Pflanzenalkaloide, inbesondere Vincaalkaloide, wie Vinblastin (Velban), Vincristin (Oncovin) oder Vindesin; Epipodophyllotoxine, wie Etoposid (VP-16, VePesid) oder Teniposid (VM-26, Vumon);
  • E) hormonal wirksame Agentien und Antagonisten, insbesondere Adrenocorticoide, wie Prednison (Deltason) oder Dexamethason (Deca­ dron); Progestine wie Hydroxyprogesteron(Prodox), Megestrolacetate (Megace) oder Medroxyprogesteron (Provera, Depo-Provera); Androgene wie Testosteron oder Fluoxymesteron (Halotestin); Östrogene wie Diethylstilbestrol (DES), Estradiol oder Chlorotriansien (Tace); synthetische Analoge von LHRH, wie Goserelin (Zoladex); Synthetische Analoge von LH-releasing hormone, wie Leuprolid (Lupron, Lupron Depot); Anti-androgene wie Flutamid (Eulexin); Anti-östrogene wie Tamoxifen; Aromataseinhibitoren wie Aminogluthetimid (Cytadren), Lentaron (Formestane, 4-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion) (siehe EP 0 162 510), Fadrozol (5-(p-Cyanophenyl)-5,6,7,8-tetrahydroimidazo- [1,5-a] pyridin, siehe EP 0 437 415 und EP 0 165 904), Letrozol (4,4'- (1H-1,2,4-Triazol-1-yl-methylen)-bis-benzonitril, siehe US 4,976,672), Arimidex, 4-(α-(4-Cyanophenyl)-α-fluoro-1-(1,2,4-tri­ azolyl)methyl)-benzonitril (siehe EP 0 490 816) oder 4-(α-(4-cya­ nophenyl)-(2-tetrazolyl)methyl)-benzonitril (siehe EP 0 408 509); Adrenalcyctoxische Agentien, wie Mitotan (Lysodren); Somatostatin­ analoge, wie Octreotid (Sandostatin); oder 5α-Reductaseinhibitoren, wie N-(1-Cyano-1-methyl-ethyl)-4-aza-3-oxo-5α-androst-1-en-17β- carboxamid (siehe EP 0 538 192);
  • F) Modifikatoren für biologische Vorgänge (biological response agents), insbesondere Lymphokine, wie Aldesleukin (humanesrekombi­ nantes IL-2, Proleukin); oder Interferone, wie Interferon-α (Intron- A, Roferon) oder Interferon "B1B2B3D4" (siehe EP 0 205 404);
  • G) Inhibitoren von Protein-Tyrosinkinasen und/oder Serin/Threo­ ninkinasen, wie N-{5-[4-Methyl-piperazino-methyl)-benzoylamido]-2- methyl-phenyl}-4-(3-pyridyl)-2-pyrimidin(siehe EP 0 546 409),N-(3- Chlorphenyl)-4-(2-(3-hydroxy)-propyl-amino-4-pyridyl)-2-pyrimidinamin (siehe EP 0 606 046), N-Benzoyl-staurosporin (siehe EP 0 296 110), 4,5-bis(Anilino)-phthalimid (siehe EP 0 516 588), N-(5-N-Benzoyl­ amido-2-methyl-phenyl)-4-(3-pyridyl)-2-pyridinamin (siehe EP 0 564 409) oder 4-(m-Chloranilino)-5,6-dimethyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin (siehe EP 0 682 027);
  • H) Antisense-Oligonucleotide oder Oligonucleotidderivative, beispielsweise auf raf (siehe WO 95/32987) oder PKC zielend, auf SAMDC (PCT-Anmeldung WO 96/05298); oder
  • I) gemischt wirkende Agentien oder Agentien mit anderen oder unbekannten Wirkmechanismen, beispielsweise S-Triazinderivative, z. B. Altrematin (Hexalen); Enzyme, wie Asparaginase (Elspar); Methylhydrazinderivative, wie Dacarbazin und Procarbazin; Matrirne­ talloproteinaseinhibitoren, Hexamethylmelamin, Pentamethylmelamin; Anthrachinone wie Mitoxantrone (Novantrone); Mitotische Spindelgifte wie Paclitaxel (Taxol), Epothilon A, Epothilon B, Epothilonderivate oder Discodermolid; Streptozocin(Zanosar); Estracyt (Estramustin); Amsacrin; Agentien mit Zelldifferenzierungswirkung, wie All-transre­ tinsäure (TRA); Immunomodulatoren, wie Levamisol (Ergamisol); Vakzi­ ne, z. B. Anti-melanomvakzine (siehe EP 0 674 097); oder Antikörper, die gegen Tumoren wirksam sind, z. B. gegen Melanom-Antigene gerich­ tete Antikörper (siehe EP 0 640 131), Antikörper zur aktiven Immun­ therapie von Melanomen (siehe EP 0 428 485), Antikörper gegen Dick­ darmkrebs (Panorex®), Antikörper gegen Non-Hodkin-Lymphom (Rituxi­ mab), Antikörper gegen Brustkrebs (Trastuzumab), Antiidiotyp-Anti­ körper wie TriaAb© oder CeaVac® (Titan Pharmaceuticals, Inc.) und mit dem aus elf Aminosäuren bestehenden Abschnitt des TAT-Proteins des AIDS-Virus, der das Durchdringen von Zellmebranen bewirkt, kon­ jugierte (beispielsweise rekombinante) Proteine, wie die Zellregula­ tion beeinflussende Proteine oder entsprechend modifizierte Antikör­ per, die innerhalb der Krebszelle entartete Proteine, wie entartete Tyrosin- oder Serin/Threoninkinasen, binden und so inaktivieren können).
Als gegen Infektionen wirksame Verbindungen können insbesondere Antibiotika, antivirale Wirkstoffe, wie z. B. Hemmstoffe der Reversen Transkriptase oder retroviraler Proteasen, wie der HIV-Protease, oder gegen Virus-Hepatitis (wie HCV) wirksame Wirkstoffe, wie Inter­ feron (insbesondere Interferon-alfa-2) und/oder Ribavirin, oder Antikörper Verwendung finden.
Die genannten Verbindungen können auch als Salze, insbesondere phar­ mazeutisch verwendbare Salze, vorliegen, wenn sie geeignete salzbil­ dende Gruppen haben. Salze von Wirkstoffen mit basischen Gruppen können beispielsweise Säureadditionssalze sein, wie Halogenide, Methansulfonate oder Sulfate, Wirkstoffe mit sauren Gruppen können Salze mit Basen, wie Metallen oder Ammoniumsalze von Ammoniak oder substitueriten Aminen sein. Die Wirkstoffe können entweder direkt (vorzugsweise überspacer)kovalentan superparamagnetische Kügelchen gekoppelt (konjugiert) sein, oder in Liposomen eingearbeitet sein, welche mit superparamagnetischen Beads markiert sind oder werden können, die nicht-kovalent (beispielsweise durch mit Lipiden konju­ gierte Antigene, die auf der Liposomenoberfläche präsentiert werden und das Andocken von durch superparamagnetische Kügelchen markierten Antikörpern ermöglichen, oder unter Ausnutzung der Biotin/Avidin-bzw. Biotin/Streptavidin-Wechselwirkung) gebunden sind, oder durch direkte Bindung oder Bindung über Spacer kovalent an die Liposomen gebunden sind (gebunden z. B. an Bestandteile der Liposomenhülle, wie Amino­ gruppen von Lecithinen, oder Amino-, Hydroxy- oder Carboxygruppen an Acylresten, die zu den liposomenbildenden Phospholipiden gehören, oder dergleichen). Alternativ kann superparamagnetisches Material, beispielsweise direkt entsprechende Eisenoxidpartikelchen, direkt in die Liposomen eingebaut vorliegen. Auch lediglich durch Antikörper (die gleichzeitig auch als therapeutische Wirkstoffe fungieren kön­ nen) markierte superparamagnetische Beads können verwendet werden, da diese ebenfalls entsprechende erkrankte Zellen erkennen und der Behandlung mit DM-Feldern zugänglich machen.
Beispiele für Liposomenformulierungen sind bekannt; so umfasst eine im Rahmen der Erfindung verwendbare Liposomendispersion (phospholi­ pid-stabilisierte Dispersion)
  • a) ein Phospholipid oder mehrere Phospholipide der Formel A,
    worin RA C10-20-Acyl, RB Wasserstoff oder C10-20-Acyl, Ra, Rb und Rc Wasserstoff oder C1-4-Alkyl und n eine ganze Zahl von zwei bis vier darstellen, gewünschtenfalls
  • b) ein weiteres Phospholipid oder mehrere weitere Phospholipide;
  • c) den oder die Wirkstoffe und
  • d) eine pharmazeutisch annehmbare Trägerflüssigkeit und gewünsch­ tenfalls weitere Hilfsstoffe und/oder Konservierungsmittel.
Das Herstellungsverfahren für diese Dispersionen ist dadurch gekenn­ zeichnet, dass man eine Lösung oder Suspension der Komponenten a) und c) oder a), b) und c), vorzugsweise von a) und b) in einem Gewichtsverhältnis von 20 : 1 bis 1 : 5, insbesondere von 5 : 1 bis 1 : 1, durch Verdünnung mit Wasser in eine Dispersion umwandelt, anschliessend das organische Lösungsmittel entfernt, beispielsweise durch Zentrifugation, Gelfiltration, Ultrafiltration oder insbeson­ dere durch Dialyse, z. B. tangentiale Dialyse, vorzugsweise gegen Wasser, die erhaltene Dispersion, vorzugsweise nach Zugabe von Hilfsstoffen oder Konservierungsmitteln, erforderlichenfalls unter Einstellung eines annehmbaren pH-Wertesdurch Zugabe von pharmazeu­ tisch annehmbaren Puffern, wie Phosphatsalzen oder organischen Säuren (rein oder gelöst in Wasser), wie Essigssäure oder Zitronen­ säure, vorzugsweise zwischen pH 3 und 6, z. B. pH 4-5, falls sie nicht bereits die richtige Wirkstoffkonzentration hat, kon­ zentriert, vorzugsweise auf eine Wirkstoffkonzentration von 0,2 bis 30 mg/ml, insbesondere von 1 bis 20 mg/ml, wobei die Konzen­ trierung vorzugsweise nach den zuletzt genannten Methoden zur Entfernung eines organischen Lösungsmittels erfolgt, insbesondere durch Ultrafiltration, z. B. unter Verwendung einer Apparatur zur Durchführung tangentialer Dialyse und Ultrafiltration.
Die nach diesem Verfahren herstellbare, durch Phospholipide stabili­ sierte Dispersion ist bei Zimmertemperatur mindestens mehrere Stun­ den stabil, reproduzierbar bezüglich des Mengenanteils der Komponen­ ten und toxikologisch unbedenklich und daher insbesondere für die orale oder intravenöse Verabreichung am Warmblüter, insbesondere Menschen, geeignet.
Die Grössenordnung der erhaltenen Partikel in der Dispersion ist variabel und liegt vorzugsweise zwischen ca. 1,0 × 10-8 bis ca. 1,0 × 10-5 m, insbesondere zwischen etwa 10-7 und etwa 2 × 10-6 m.
Die Nomenklatur der Phospholipide der Formel A und die Bezifferung der C-Atome erfolgt anhand der in Eur. J. of Biochem. 79, 11-21 (1977) "Nomenclature of Lipids" von der IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature (CBN) gegebenen Empfehlungen (sn-Nomen­ klatur, stereospecific numbering).
In einem Phospholipid der Formel A sind RA und RB mit den Bedeutungen C10-20-Acyl vorzugsweise geradkettiges C10-20-Alkanoyl mit einer geraden Anzahl an C-Atomen (unsubstituiert oder substituiert, insbesondere durch funktionelle Gruppen, die ein Ankoppeln an Antikörper, Beads oder dergleichen erlauben, z. B. Hydroxy, Amino oder Carboxy) und geradkettiges C10-20-Alkenoyl mit einer Doppelbindung und einer ge­ raden Anzahl an C-Atomen (unsubstituiert oder substituiert, insbe­ sondere durch funktionelle Gruppen, die ein Ankoppeln an Antikörper, Beads oder dergleichen erlauben, z. B. Hydroxy, Amino oder Carboxy, wobei Amino oder Hydroxy aus Stabilitätsgründen nicht an C-Atome gebunden sein sollten, von denen die Doppelbindung ausgeht).
Geradkettiges C10-20-Alkanoyl RA und RB mit einer geraden Anzahl an C-Atomen sind beispielsweise n-Dodecanoyl, n-Tetradecanoyl, n-Hexa­ decanoyl oder n-Octadecanoyl. Geradkettiges C10-20-Alkenoyl RA und RB mit einer Doppelbindung und einer geraden Anzahl an C-Atomen sind beispielsweise 6-cis-, 6-trans-, 9-cis- oder 9-trans-dodeceno­ yl, -tetradecenoyl, -hexadecenoyl, -octadecenoyl oder -icosenoyl, insbesondere 9-cis-octadecenoyl (Oleoyl).
In einem Phospholipid der Formel A ist n eine ganze Zahl von zwei bis vier, vorzugsweise zwei. Die Gruppe der Formel -(CnH2n)- stellt unverzweigtes oder verzweigtes Alkylen dar, z. B. 1,1-Ethylen, 1,1-, 1,2- oder 1,3-Propylen oder 1,2-, 1,3- oder 1,4-Butylen. Bevorzugt ist 1,2-Ethylen (n = 2).
Phospholipide der Formel A sind beispielsweise natürlich vorkommende Kephaline, worin Ra, Rb und Rc Wasserstoff bedeuten oder natürlich vorkommende Lecithine, worin Ra, Rb und Rc Methyl bedeuten, z. B. Kephalin oder Lecithin aus Sojabohnen, Rinderhirn, Rinderleber oder Hühnerei mit verschiedenen oder identischen Acyl gruppen RA und RB oder Mischungen davon. Der Begriff "natürlich vorkommende" Phospholipide der Formel A" definiert Phospholipide, welche bezüg­ lich RA und RB keine einheitliche Zusammensetzung haben. Solche natürlichen Phospholipide sind ebenfalls Lecithine und Kephaline, deren Acylgruppen RA und RB strukturell undefinierbar und von natür­ lich vorkommenden Fettsäuregemischen abgeleitet sind.
Bevorzugt sind synthetische, im wesentlichen reine Phospholipide der Formel A mit verschiedenen oder identischen Acylgruppen RA und RB. Der Begriff "synthetisches" Phospholipid der Formel A definiert Phospholipide, welche bezüglich RA und RB eine einheitliche Zusam­ mensetzung haben. Solche synthetischen Phospholipide sind vorzugs­ weise die unten definierten Lecithine und Kephaline, deren Acylgrup­ pen RA und RB eine definierte Struktur haben und von einer definier­ ten Fettsäure mit einem Reinheitsgrad höher als ca. 95% abgeleitet sind. RA und RB können gleich oder verschieden und ungesättigt oder gesättigt sein. Bevorzugt ist RA gesättigt, z. B. n-Hexadecanoyl, und RB ungesättigt, z. B. 9-cis-Octadecenoyl (= Oleoyl).
Der Begriff "im wesentlichen reines" Phospholipid definiert einen Reinheitsgrad von mehr als 70% (Gew.) des Phospholipids der Formel A, welcher anhand geeigneter Bestimmungsmethoden, z. B. papierchro­ matographisch, nachweisbar ist.
Besonders bevorzugt sind synthetische, im wesentlichen reine Phospholipide der Formel A, worin RA die Bedeutung geradkettiges C10-20- Alkanoyl mit einer geraden Anzahl an C-Atomen und RB die Bedeutung geradkettiges C10-20-Alkenoyl mit einer Doppelbindung und einer ge­ raden Anzahl an C-Atomen haben. Ra, Rb und Rc sind Methyl und n = 2.
In einem besonders bevorzugten Phospholipid der Formel A bedeuten RA n-Do decanoyl, n-Tetradecanoyl, n-Hexadecanoyl oder n-Octadecanoyl und RB 9-cis- Dodecenoyl, 9-cis-Tetradecenoyl, 9-cis-Hexadecenoyl, 9-cis-Octadecenoyl oder 9-cis-Icosenoyl. Ra, Rb und Rc sind Methyl und n ist 2. Ein ganz besonders bevorzugtes Phospholipid der Formel A ist synthetisches 1-n-Hexadecanoyl-2-(9-cis-octadecenoyl)-3-sn­ phosphatidylcholin mit einer Reinheit von mehr als 95%. Bevorzugte natürliche, im wesentlichen reine Phospholipide der Formel A sind insbesondere Lecithin (L-α-Phosphatidylcholin) aus Sojabohnen oder Hühnerei.
Für die Acylreste in den Phospholipiden der Formel A sind auch die in Klammern angegebenen Bezeichnungen gebräuchlich: 9-cis-Do­ decenoyl (Lauroleoyl), 9-cis-Tetradecenoyl (Myristoleoyl), 9-cis- Hexa decenoyl (Palmitoleoyl), 6-cis-Octadecenoyl (Petroseloyl), 6-trans-Octadecenoyl (Petroselaidoyl), 9-cis-Octadecenoyl (Oleoyl), 9-trans-Octadecenoyl (Elaidoyl), 11-cis-Octadecenoyl (Vaccenoyl), 9-cis-Icosenoyl (Gadoleoyl), n-Dodecanoyl (Lauroyl), n-Tetradecanoyl (Myristoyl), n-Hexadecanoyl (Palmitoyl), n-Octadecanoyl (Stearoyl), n-Icosanoyl (Arachidoyl). Weitere Phospholipide sind vorzugsweise Ester von Phosphatidsäure (3-sn-Phos phatidsäure) mit den genannten Aclyresten, wie Phosphatidylserin und Phosphatidylethanolamin.
In der Trägerflüssigkeit d) sind die Komponenten a), b) und c) oder a) und c) als Liposomen so enthalten, dass sich mehrere Tage bis Wochen keine Feststoffe oder feste Aggregate wie Mizellen zu­ rückbilden und die Flüssigkeit mit den genannten Komponenten, gege­ benenfalls nach Filtration, vorzugsweise oral oder intravenös, applizierbar ist.
In der Trägerflüssigkeit d) können pharmazeutisch annehmbare, nicht toxische Hilfsstoffe enthalten sein, z. B. wasserlösliche Hilfsstoffe welche zur Herstellung von isotonischen Bedingungen geeignet sind, z. B. ionische Zusätze wie Kochsalz oder nichtionische Zusätze (Ge­ rüstbildner) wie Sorbit, Mannit oder Glucose oder wasser lösliche Stabilisatoren für die Liposomendispersion wie Lactose, Fructose oder Saccharose. Zusätzlich zu den wasserlöslichen Hilfsstoffen können in der Trägerflüssigkeit für flüssige pharmazeutische Formu­ lierungen verwendbare Emulgatoren, Netzmittel oder Tenside vorhanden sein, insbesondere Emulgatoren wie Ölsäure, nichtionische Tenside vom Typ Fettsäure-Polyhydroxyalkoholester wie Sorbitanmonolaurat, -oleat, -stearat oder -palmitat, Sorbitantristearat oder -trioleat, Polyoxyethylen-Addukte von Fettsäure-Polyhydroxyalkoholestern wie Polyoxyethylen-sorbitanmonolaurat, -oleat, -stearat, -palmitat, -tristearat oder -trioleat, Polyethylenglycol-Fettsäureester wie Polyoxyethylstearat, Polyethylenglycol-400-stearat, Polyethylengly­ col-2000-stearat, insbesondere Ethylenoxid-Propylenoxid Blockpoly­ mere vom Typ Pluronic® (Wyandotte Chem. Corp.) oder Synperonic® (ICI).
Von freiem Wirkstoff können die Liposomen beispielsweise durch Gelfiltration getrennt werden, so daß in der verbleibenden Disper­ sion nur kein oder sehr wenig Wirkstoff außerhalb der Liposomen vorliegt.
Superparamagnetische Kügelchen können entweder anschliessend kova­ lent gebunden werden (beispielsweise durch Zugabe bifunktionaler Cross-Linker), oder es können beispielsweise im Gemisch der Kompo­ nenten (a) bis (d) antigene Komponenten, die sich in der Membran einbauen (z. B. rekombinante Membranproteine, wie CD4 oder CD8, oder niedermolekulare Haptene, wie Dinitrophenol, die beispielsweise an Stelle von den Resten Ra, Rb oder Rc) vorliegen, an die dann mit den entsprechenden Antikörpern konjugierte superparamagnetische Kügelchen gebunden werden können, oder man stellt durch Bindung von Biotin über einen Spacer, beispielsweise anstelle eines der Reste Ra, Rb und/oder Rc, und Bindung von mit Avidin oder Strept­ avidin konjugierten superparamagnetischen Kügelchen die superpara­ magnetisch markierten Liposomen her; der oder die Liposomen selbst werden mit paramagnetischen Materialien, wie kleinsten Eisenoxidteilchen, die direkt bei der Herstellung der Liposomen zugegeben werden, neben dem Wirkstoff auch mit diesen Teilchen beladen und sind so selbst eine Art superparamagnetische Kügelchen. Bevorzugte Konservierungsmittel sind z. B. Antioxidantien, wie Ascorbinsäure, oder Microbizide, wie Sorbinsäure oder Benzoesäure.
Besonders bevorzugt sind mit (insbesondere gegen infizierte Zellen, wie HIV-infizierte Lymphozyten oder Virus (z. B. HCV)-infizierte Leberzellen, oder Tumorzellen gerichtete) Antikörpern konjugierte superparamagnetische Beads, oder mit superparamagnetischen Beads und entsprechenden Antikörpern gekoppelte wirkstoffhaltige Liposo­ men, die sich jeweils nach Injektion am Ort des Tumors anreichern und die direkt mittels der DM-Felder in Bewegung versetzt werden und so durch mechanischen Stress oder im Falle der Liposomen zu­ sätzlich Wirkstofffreisetzung unter dem Einfluss des DM-Feldes direkt am Ort der infizierten Zellen oder Tumorort Antitumorwirkung ermöglichen. Analog ist die Verwendung gegen Parasiten gerichteter Antikörper möglich.
Die Administrationswege umfassen, unter anderem, die enterale, wie nasale, orale oder rektale; oder die parenterale, wie intrader­ male, subkutane, intramuskuläre, jedoch insbesondere die intravas­ kuläre (insbesondere intravenöse), intralumbale, intracraniale oder intracavitäre (z. B. in die Bauchhöhle oder andere Körperhöhlen, in Muskelfascien oder dergleichen) Injektion bzw. intravaskuläre Infusion.
Die enterale (z. B. orale) Administration ist insbesondere geeignet zur Behandlung von Erkrankungen, die vom Darm-, Lungen-, Rachen-, Mund- und/oder Nasenlumen aus zugänglich sind. Innerhalb der ent­ sprechenden Räume können durch DM-Felder die superparamagnetischen Beads, beispielsweise gekoppelt mit Wirkstoffen oder wirkstofftra­ genden Liposomen, gewünschtenfalls an die gewünschten Stellen im Körper manövriert werden.
Die parenterale Verabreichung ist besonders geeignet zur Behandlung von Erkrankungen, die über die Blutbahn erreicht werden können (insbesondere Infusion, intravaskuläre Injektion), hinter der Blut- Hirnchung) vor dem Zugang der Wirksubstanz geschützt sind oder von Körperhöhlen (z. B. Bauchhöhle, Interpleuralspalt, Interfasziku­ lärraum oder dergleichen) aus zugänglich sind, wobei im Falle der Körperhöhlen wiederum die Möglichkeit besteht, mittels DM-Feldern superparamagnetisch markierten Wirkstoff oder entsprechend markierte wirkstoffhaltige Liposomen an die gewünschten Stellen zu manövrie­ ren. Die Administration kann lokal (am Ort der zu behandelnden Erkrankung, z. B. durch Injektion) oder systemisch (z. B. durch intravaskuläre Injektion oder Infusion) erfolgen.
Die an Warmblüter, z. B. Menschen von etwa 70 kg Körpergewicht, zu verabreichenden Dosismengen, als Menge an Wirksubstanz ausge­ drückt, variieren je nach Spezies, Alter, individuellem Zustand, Applikationsweise und dem jeweiligen Krankheitsbild und liegen für nichtpolymere Wirkstoffe (andere als z. B. Proteine oder Anti­ körper) insbesondere zwischen etwa 0,1 mg und etwa 10 g, vorzugs­ weise zwischen etwa 0,4 mg und etwa 4 g, z. B. bei ungefähr 1 mg bis 1,5 g pro Person und Tag, verteilt auf vorzugsweise 1 bis 3 Einzeldosen, die z. B. gleich gross sein können. Im Falle polymerer Wirkstoffe liegt die Dosis, als Menge des Wirkstoffes ausgedrückt, vorzugsweise zwischen 0,05 und 50 mg, vorzugsweise zwischen 0,1 und 10 mg pro Person und Tag. Ueblicherweise erhalten Kinder die halbe Dosis von Erwachsenen. Bei Bedarf kann man die Behandlung solange durchführen, wie es zur Tumorbehandlung und/oder zur Verhin­ derung der Bildung von Metastasen erforderlich ist.
Zum Koppeln von Wirkstoffen oder Liposomen (mit oder ohne Antikör­ permarkierung, mit Wirkstoff beladen) (nachfolgend beide als Reak­ tionspartner A bezeichnet) an superparamagnetische Beads (nachfol­ gend als Reaktionspartner B bezeichnet), oder von (insbesondere Infektions-, Parasiten- oder tumorspezifischen) Antikörpern (Reak­ tionspartner A) an Liposomen oder superparamagnetische Beads (je­ weils Reaktionspartner B), die mit Wirkstoff beladen sind, finden gängige Verfahren Verwendung, z. B. die Cyanogenbromid-Aktivierung etwa der Beads-Oberfläche bei Vorliegen von OH-Gruppen, oder die schonendere Behandlung mit heterobifunktionalen Kopplungsreagentien, die zunächst mit auf dem zu koppelnden Molekül oder der Beadsober­ fläche oder Liposom vorliegenden funktionellen Gruppen, insbesondere Hydroxy-, Amino-, Carboxy-, Epoxid-, Thiol- oder Diengruppen ent­ haltenden Gruppen oder reaktiven Formen davon reagieren können und dann anschließend oder im gleichen Ansatz zur im wesentlichen selben Zeit mit Gruppen auf den zu bindenden Molekülen oder Anti­ körpern. Nichtkovalente Bindung ist möglich, indem an Reaktions­ partner A z. B. Avidin oder Streptavidin gekoppelt wird, an den zu bindenden Reaktionspartner B Biotin, oder umgekehrt.
Die kovalente Kopplung kann beispielsweise an epoxy- oder als akti­ vierte Ester funktionalisierten Carboxygruppen (reaktive Form) erfolgen. Die reaktiven Carboxygruppen können auch in situ herge­ stellt werden (z. B. unter Verwendung von in der Peptidchemie übli­ chen Reagentien, z. B. zur Herstellung von 1-Hydroxybenzotriazol-, Succinimid- oder N-Hydroxysuccinimid-estern, oder in-situ-Deriva­ tisierung z. B. mit Carbodiimiden, wie Dicyclohexylcarbodiimid, mit Carbonylimidazol, mit N-[(Dimethylamino)-1H-1,2,3-triazolo[4,5- b]pyridin-1-ylmethylene]-N-methylmethanaminiumhexafluorophosphat-N- oxid(HATU); mit 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroni­ umtetrafluoroborat (HBTU), mit 2-(Pyridon-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyl­ uroniumtetrafluoroborat (TPTU); oder Benzotriazol-1-yl-oxy-tris(di­ methylamino)-phosphoniumhexafluorophosphat (BOP), oder ähnlichen Reagentien). Die Umsetzung findet dann vor allem mit Amino-, aber auch Hydroxy- oder Mercaptogruppen am zu koppelnden Gegenpartner statt. Auch (i) Azid- oder (ii) Dien-modifizierte Reaktionspartner A oder B können mit ihren jeweiligen komplementären Reaktionspart­ nern umgesetzt werden, die im Falle (i) Diengruppen, im Falle (ii) Azidgruppen enthalten, die gemeinsam für eine Diels-Alder-Kopplung geeignet sind.
Als heterobifunktionale Reagentien können beispielsweise solche verwendet werden, die eine Gruppe umfassen, die mit Amino-, Hydroxy- oder Mercaptogruppen reagieren, und eine weitere Gruppe enthalten, di ein Disulfid ist und nachfolgend unter Freisetzung einer Mercap­ togruppe (z. B. mit Dithiothreitol oder ähnlichen Reduktionsmitteln) umgesetzt werden kann. Andere mögliche heterobifunktionale Reagentien tragen z. B. eine aminoreaktive Gruppe und eine photoaktivier­ bare Gruppe, z. B. N-Hydroxysuccinimidoyl-4-azido-salicylsäure. Wieder andere heterobifunktionale Reagentien umfassen z. B. eine Amino- und eine Mercapto-reaktive Gruppe, oder zwei unterschiedliche Amino-reaktive Gruppen, z. B. Succinimidoyl-maleinimidderivate, wie Succinimidoyl-butylphenyl-maleinimid, N-ε-Maleimidocapronsäure oder N-(ε-Maleimidocapronsäure), oder dergleichen. Ein Beispiel für ein Hydtoxy- und Sulfhydryl-reaktives heterobifunktionales Reagens ist N-(ρ-Maleimidophenyl)isocyanat.
Superparamagnetische Beads oder andere Reaktionspartner B können wie erwähnt, durch Cyanogenbromid aktiviert sein, aber auch durch Epoxy-, Nitrophenylchloroformat-, N-Hydroxysuccinimid- oder Chlo­ roformatgruppen aktiviert sein, durch Polyacrylazidoreste (photo­ aktivierbar), Epoxidgruppen, Bromoacetylgruppen, Epichlorohydrin­ aktivierung, Tresyl-chlorid-Aktivierung, Vinylsulfon-Aktivierung, oder dergleichen.
Neue Kombinationsprodukte (z. B. von Antikörpern mit superparamag­ netischen Beads, oder von Wirkstoffen mit Liposomen und/oder mit Wirkstoffen) sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Die Erfindung betrifft insbesondere die in den Beispielen genannten Ausführungsformen der Erfindung.
Abbildungen
Fig. 1 Die Lorentzkraft wird von Antoon Lorentz selbst als eine elektrische Kraft bezeichnet und ähnelt formell in der Tat auch der elektrischen Fernwirkungskraft (Coulombkraft). Die Lorentzkraft wirkt auf elektrische Ladungen in einem magnetischen Feld. Im Demonstrationsversuch der Fig. 1 wird die Wirkung der Lorentzkraft auf Ionen demonstriert. Hierzu wird ein dynamisches, homogenes magnetisches Feld erzeugt (siehe WO 95/19217), welches einen mit einem Gemisch aus Kochsalz, Wasser und Sand (1) gefüllten transpa­ renten Plastikbehälter (3) durchdringt, der hermetisch von der Umgebung abgeschlossen ist. Das dynamische Feld wird verlustarm durch geschichtete Bleche (auch Feldrückwegbleche (2)) geführt.
Geschichtete Blechpakete sind bei sehr niedrigen Frequenzen der dynamischen Felder (z. B. 15 Hz oder nieriger) nicht notwendig. (4) ist eine symbolische geschlossene Feldlinie, (5) zeigt exem­ plarisch eine Nutsektion mit Windungsteil (5) des DM-Felderzeugers (6). Weitere Details siehe Beispiel 3. Eine elektrische Kraft, die Lorentzkraft, ist also im Stande, sowohl positive als auch negative Ionen - die magnetisch oder unmagnetisch sein können - in die gleiche Richtung zu transportieren. Dies ist mit der Cou­ lombkraft nicht zu erreichen.
Fig. 2 Diese Abbildung zeigt diesmal nur die magnetischen Aspekte. Über einem DM-Felderzeuger (6) befindet sich ein transparenter Plastikbehälter (8), der mit Wasser gefüllt ist. Eine Magnetitkugel (7) kann durch die Flüssigkeit z. B. in und gegen die Pfeilrichtung longitudinal bewegt werden. Mit einem Stück Aluminium anstelle der Magnetitkugel (7) ist dies nicht möglich. (9) symbolisiert eine geschlossene Feldlinie, (10) eine Nutsektion mit Windungsteil. Es ist nicht möglich, ein quantenmechanisches Mehrpartikelproblem matematisch exakt zu beschreiben, doch kann der rein magnetische Charakter der Wirkung des DM-Feldes demonstriert werden.
Fig. 3 Die Abbildung zeigt eine der möglichen Anwendungen der Erfindung. In der unter dem Mikroskop (12) vor dessen Objektiv (13) auf dem Mikroskopiertisch (14) liegenden Probe (15) befinden sich z. B. Zellen, Zellbestandteile oder Pathogene und eine relativ sehr geringe Zahl (im Extremfall nur 1) mit superparamagnetischen Beads (über entsprechende Antikörper gebunden) markierter Zellen, Zellbestandteile oder Pathogene. Beidseitig neben der Probe liegend erkennt man in den Mikroskopiertisch integrierte DM-Felderzeuger (11) zur Erzeugung der Feldstrukturen. Es kann sich dabei um 2 aktive DM-Felderzeuger, einen DM-Felderzeuger und einen magnetischen Rückweg oder auch nur um einen DM-Felderzeuger ohne Rückweg handeln. Die Probe wird von einem z. B. in Amplitude, Frequenz und Richtung variablen dynamischen Magnetfeld durchdrungen. Der Bobachter kann nun selbständig z. B. die Frequenz, Amplitude oder Richtung des dynamischen, die Probe durchsetzenden Magnetfeldes ändern. Dies wird erreicht, indem elektronische Schaltkreise, klassischen Frequenzumformern gleich, durch Regeleinrichtungen, z. B. Fusspedal, Schalter oder dergleichen, angesteuert werden oder angesteuert und umgeschaltet werden. Hierdurch werden die markierten Objekte elektromagnetisch entsprechend beeinflusst. Es können z. B. konstan­ te/nichtkonstante Drehungen der markierten Objekte(Drehimpulserhal­ tung) im mathematisch positiven oder negativen Sinne erreicht wer­ den. Hierdurch können noch wenige, gar einzelne markierte Objekte, unter einer Vielzahl nicht arkierter erkannt werden. Es kann jedoch auch, durch Beobachterschaltung der Regelkreise, das dynamische Magnetfeld in mehrere unabhängige statische Magnetwechselfelder aufgeteilt werden, was ein magnetisches "Erstarren" der beobachteten Objekte zur Folge hat. All dies ermöglicht die Beobachtung einzelner markierter Objekte zwischen einer Vielzahl von anderen unmarkierten Objekten mit einer hohen Selektivität.
Fig. 4 Diese Abbildung zeigt unter (16) ungeordnete markierte Objekte (z. B. Zellen). Diese werden in (17) in Rotationsbewegungen versetzt (siehe Beschreibung hierzu unter Fig. 3). Es können auch entgegengesetzte Rorationsbewegungen erzielt werden, oder permanente Wechsel in der Rotationsbewegung. Unter (18) wird eine Strukturer­ zeugung (stabförmig) der markierten Objekte gezeigt (Beschreibung hierzu siehe unter Fig. 3). Es können gezielte Wanderbewegungen der markierten Objekte erreicht werden, durch die andere, auch nicht-markierte Objekte markiert und transportiert werden können.
Die nachfolgenden Beispiele dienen der Illustration der Erfindung, ohne ihren Umfang einschränken zu sollen.
Beispiel 1 Markierung von Lymnhocyten
Gewinnung von Lymphocyten aus Blut: 20 IE Heparin pro ml Blut werden in einer 20-ml-Injektionsspritze vorgelegt und darin Venenblut aufgezogen. Diesem Heparinblut werden ca. 4 ml Macrodex 6 % (Fa. Knoll, Ludwigshafen, Deutschland) zugesetzt und die Spritze bei Raumtemperatur ca. 1 Stunde lang in einen Ständer gestellt. Nach dieser Zeit wird der nahezu erythrocytenfreie Überstand in einer zweiten Spritze mit Kanüle aufgenommen. Das Blut wird 1 : 1 mit phos­ phatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (150 mM Natriumchlorid, 150 mM Natriumphosphat, pH 7,2) versetzt. Zur vollständigen Isolierung der Lymphozyten werden 3 ml Lymphocytentrennmedium (Ficoll-Lösung der Dichte 1,077 g/ml) in einem Zentrifugenröhrchen vorgelegt und 4 ml der Blut/PBS-Lösung vorsichtig auf das Trennmedium geschichtet (vorsichtig pipettieren, um Phasenvermischung zu vermeiden). Nach Verschliessen mit einem Silikonstopfen wird der Gradient bei 400 g (bezogen auf die Röhrchenmitte) 30 min bei Raumtemperatur zentri­ fugiert (bei der Zentrifugation ist darauf zu achten, dass die elektrische Bremse der Zentrifuge während des Laufs ausgeschaltet bleibt); dabei entstehen 4 Phasen: oberste Schicht Plasma, darunter eine opaque weißliche Bande (Periphere monocytische Blutzellen), dann das Lymphocytentrennmedium und als Pellet die restlichen Ery­ throzyten mit den Granulocyten. Das Plasma wird mittels einer Pas­ teurpipette abgesaugt.
Gewünschtenfalls kann man vorhandene Monocyten entfernen, indem man die Schicht mit den Peripheren monocytischen Blutzellen in eine Petrischale überführt. Die B- und T-Lymphozyten bleiben hier im Überstand, während andere Zelltypen sich an die Oberfläche der Petrischale adsorbieren.
Die Zellen im Überstand oder (wenn die Monocyten nicht weiter ent­ fernt werden) das abgesaugte Plasma werden sodann in einer Puffer­ lösung - PBS (möglichst frei von Calzium- und Magnesiumionen, um die Aggregation der Zellen untereinander oder an Oberflächen zu verhindern) mit 2 mM EDTA und 0,5 % Rinderserumalbumin (BSA), nach­ folgend als PBS* bezeichnet - aufgenommen und durch ein Nylon-Netz oder einen Nylonfilter (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Deutschland) passiert, um Klumpen zu entfernen. Die Zellen werden gezählt und in der zuletzt genannten Pufferlösung durch Zentrifuga­ tion gewaschen. Das Pellet mit den Zellen wird anschließend mit MACS MultiSort Microbeads (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Deutschland), die mit CD4- (oder CD-8-)Antikörper markiert sind (es handelt sich um mit anti-CD4-Antikörper (oder mit anti-CD8- Antikörper) konjugierte Kügelchen mit Eisenoxid in einer Polysac­ charidmatrix, Durchmesser ca. 50 nm), inkubiert: Die Zellen (107 Zellen) werden in 80 µl PBS* aufgenommen. Nach Zusetzen von 20 µl MACS CD4 (oder alternativ CD8) Microbeads-Suspension (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Deutschland) inkubiert man für 10 min bei 4°C. Nach der Inkubation werden die Zellen in der 10- bis 20-fachen Menge an PBS* aufgenommen, bei 300 × g für 10 min zentrifugiert und nach vollständigem Entfernen des Überstands das Zellpellet in 500 µl Puffer je 108 markierte Zellen aufgenommen.
Anschließend erfolgt die magnetische Anreicherung mittels Säulen, die mit Kügelchen aus kunststoffüberzogenem ferromagnetischem Ma­ terial befüllt sind, in Gegenwart eines Magnetfeldes: Eine MS+-Säule (Miltenyi) wird im Magnetfeld eines Permanentmagneten (Separator der Firma Miltenyi) plaziert. Die Säule wird vorbereitet durch Waschen mit 500 Pl PBS*; anschliessend wird die oben hergestellte Zellsuspension aufgetragen. Die nicht markeirten Zellen werden mit PBS* (3 × 500 µl) ausgewaschen. Die Säule wir anschliessend aus dem Separator entfernt, über einem geeigneten Sammelröhrchen plaziert und mit 1 ml PBS* ausgewaschen. Man erhält die CD4 (oder CD8)-Zellen mit magnetisch markierten Zellen.
Beispiel 2 Erkennen magnetisch markierter Zellen unter dem Mikroskop
Die in Beispiel 1 hergestellten magnetisch markierten Zellen werden anschliessend mikroskopisch mittels eines erfindungsgemässen DM- Feldes in Bewegung (Rotation oder Wanderung) versetzt (Fig. 3), als Vorrichtung zur Erzeugung der magnetischen Feldstrukturen DM- Felderzeuger (11), wobei 2 aktive Felderzeuger verwendet werden, oder alternativ 1 aktiver DM-Felderzeuger und ein magnetischer Rückweg, oder sogar nur ein DM-Felderzeuger ohne magnetischen Rück­ weg. Es ist möglich, die markierten Zellen auf diese Weise zu be­ wegen. Dies zeigt, daß das Prinzip der Erfindung tatsächlich an­ wendbar ist.
In der unter dem Mikroskop liegenden Probe befindet sich eine grosse Anzahl nichtmarkierter Zellen und eine geringere (je nach Probe auch sehr geringe) Anzahl markierter Zellen, mar­ kiert mit dem entsprechenden Antikörper und den daran konju­ gierten Magnetitpartikeln. Beispielsweise durch Hervorrufen konstanter/nicht konstanter Drehungen der markierten Objekte im mathematisch positiven oder negativen Sinne werden kon­ stante/nichtkonstante Drehungen der markierten Zellen er­ reicht. Auch wenige oder gar einzelne markierte Objekte können so unter einer Vielzahl von anderen erkannt werden. Durch Be­ obachterbeschaltung der Regelkreise wird das dynamische Ma­ gnetfeld in mehrere unabhängige statische Magnetfelder aufge­ teilt. Auf diese Weise kann ein Erstarren der markierten Zel­ len erreicht werden. Auch so können einzelne markierte Zellen zwischen unmarkierten, beweglich bleibenden erkannt werden.
Beispiel 3 Modell für Transport von Salzen innerhalb eines Körpers
In einem mit einem Gemisch aus Salz, Wasser und Sand (I) ge­ füllten Plastikbehälter (Fig. 1, (3)) (als Modell für einen Körper) wird gezeigt, dass mit einem DM-Felderzeuger (6) durch Erzeugen von Wanderfeldern Ionen bewegt werden können. Durch Einwirkung der Lorenzkraft wird erreicht, dass, wenn ein dyna­ misches, homogenes magnetisches Feld gemäss WO 95/19217 er­ zeugt wird, das den Plastikbehälter (3) durchdringt und ver­ lustarm durch geschichtete Bleche (Feldrückwegbleche (2)) ge­ führt wird, sich nach Abschluss des Experimentes mehr von den nichtmagnetischen Natrium- und Chloridionen auf der einen Sei­ te als auf der anderen Seite des Kastens befinden. Mit anderen Worten, das Experiment zeigt auch, dass es möglich ist, Kon­ zentrationsgradienten von Salzen zu produzieren und so bei­ spielsweise auch die Wirkung solcher Gradienten auf Zellen (beispielsweise Makrophagen, Protozoen) in entsprechenden Ver­ suchsanordnungen zu untersuchen.
Beispiel 4 Modell für den Transport magnetischer Partikel in einem Körper oder in Lösungen, insbesondere zum Sortieren von superparamagnetisch markierten Zellen und deren Trennung von nicht markierten Zellen
Fig. 2 zeigt eine weitere Anordnung, mit der die Bewegung eines magnetischen Partikels (hier eine paramagnetische Kugel (7) - vorliegend als eine Magnetitkugel - als Modell) gezeigt wird. Dieser Versuch wird in einer deutschen Universität als Doppel-Blind-Versuch durchgeführt. Über einem Felderzeuger (6) befindet sich ein transparenter Plastikbehälter (8), der mit Wasser gefüllt ist. Durch Bewegungsfelder wird die Kugel bei­ spielsweise in Pfeilrichtung longitudinal bewegt. Mit einem nicht magnetischen Stück Aluminium gelingt diese Bewegung unter den gleichen Verhältnissen nicht.
Beispiel 5 Bewegung von markierten superparamagnetischen Beads
Fig. 4 zeigt ungeordnete superparamagnetische Beads (Milte­ nyi). Durch einen (nicht gezeigten) DM-Felderzeuger werden die ungeordneten Beads (16) entweder durch magnetische Bewegungs­ felder in Bewegung versetzt (z. B. Rotation (17) oder gezielte Bewegung (19)) oder es werden mit ihnen durch statische Wech­ selfelder kompakte, hier linear ausgedehnte Strukturen ausge­ bildet (dies würde in einem Körper beispielsweise das Ver­ schliessen von Blutgefässen mittels superparamagnetischer Beads ermöglichen, ums so die Blutzufuhr zu einem Tumor oder infizierten Gewebeteilen zu unterbinden und so diese abzutö­ ten). Auch gezielte Wanderbewegung, alternierend mit Drehung, von mit superparamagnetischen Beads markierten Zellen ist möglich (19). Dies zeigt die Anwendbarkeit beispielsweise zum Erkennen spezifischer Zellen (etwa Erkennung von Tumorzellen durch entsprechend mit superparamagnetischen Beads markierte Antikörper) oder insbesondere zur Zellsortierung (Herausziehen der markierten Zellen aus einem Gemisch mit nicht markierten Zellen).

Claims (14)

1. Verwendung von dynamischen Magnetfeldern (DM-Felder) zum Erkennen und/oder Sortieren von Zellen, Zellbestandteilen oder Pathogenen, an die superparamagnetische Beads gebunden sind.
2. Verwendung gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Erkennen zur Diagnose von Erkrankungen von Zellen verwen­ det wird.
3. Verwendung gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass Tumorzellen oder infizierte Zellen erkannt werden, an die superparamagnetische Beads über für diese Zellen spezifische Antikörper gebunden sind.
4. Verwendung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es extrakorporal angewewndet wird.
5. Verwendung eines dynamischen Magnetfeldes zur Reinigung von Flüssigkeiten von Pathogenen, an die superparamagnetische Beads gebunden sind.
6. Verwendung gemäss Anspruch 4, worin die zu reinigende Flüs­ sigkeit eine Blutkonserve, Plasmakonserve oder ein Zellkultur­ medium ist.
7. Verfahren zur Diagnose, insbesondere zum Erkennen von kran­ ken, vor allem infizierten Zellen oder Tumorzellen, welches die Verwendung von dynamischen Magnetfeldern und an die ge­ nannten Zellen bindenden superparamagnetisch markierten Beads umfasst.
8. Verfahren gemäss Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass es extrakorporal angewendet wird.
9. Verfahren zur Behandlung erkrankter Zellen, insbesondere von infizierten Zellen oder Tumorzellen, welches die Nutzung von dynamischen Magnetfeldern und superparamagnetischen Beads umfasst, die am Ort der infizierten Zellen oder Tumorzellen vorliegen oder an diese gebunden sind.
10. Verfahren gemäss Anspruch 9, worin die erkrankten Zellen durch superparamagnetische Beads, welche über Antikörper an die erkrankten Zellen gebunden sind, selektiv markiert und durch das Anlegen eines dynamischen Magnetfeldes Stress durch Bewegung ausgesetzt werden.
11. Verfahren gemäss Anspruch 9, worin die erkrankten Zellen durch superparamagnetische Beads, welche direkt an einen Wirk­ stoff gekoppelt sind oder an Liposomen, die einen derartigen Wirkstoff tragen, markiert sind und durch das Anlegen eines dynamischen Feldes an den Ort der Wirkung transportiert werden und/oder nach Markierung der erkrankten Zellen so angeregt werden, dass die Zellen dem Wirkstoff verstärkt ausgesetzt werden.
12. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es extrakorporal angewendet wird.
13. Verwendung von superparamagnetisch markierten Wirkstoffen zur Herstellung eines Präparates zur Anwendung in einem Ver­ fahren zur Behandlung von infizierten Zellen oder Tumorzellen, das die Behandlung mit einem dynamischen Magnetfeld umfasst, die (a) am Ort der genannten Zellen verabreicht, (b) mit einem DM-Feld oder DM-Felderzeuger dorthin manövriert und/oder (c) an die genannten Zellen, insbesondere über an die Beads gebun­ dene, für Antigene auf den zu behandelnden Zellen spezifische Antikörper, gebunden werden oder sind.
14. Kombination von superparamagetisch markierten Wirkstoffen oder superparamagnetischen Beads mit einem Erzeuger eines dynamischen Magnetfeldes, geeignet zur Behandlung infizierter Zellen oder Tumorzellen.
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