CN101270158B - 一种靶向抗神经胶质瘤蛋白及制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种靶向抗神经胶质瘤蛋白及制备方法和应用，本发明分离了一种蛋白质，其序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。基因工程所涉及的引物，将蝎毒氯毒素的核苷酸序列插入表达载体中pGEX-6p-1，构成重组表达质粒；重组质粒转化大肠杆菌Rossetta(DE3)，然后细胞裂解经亲和层析、超虑脱盐和色谱纯化得到Acp-W2蛋白。Acp-W2蛋白对神经胶质瘤有特异靶向作用，且能有效抑制大鼠神经胶质瘤的增殖，具有靶向抗神经胶质瘤的作用。Acp-W2蛋白在制备治疗或预防神经胶质瘤药物中的应用。本发明方法简单易行，操作方便，产量高，生物活性好。

Description

一种靶向抗神经胶质瘤蛋白及制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，本发明涉及一种靶向抗神经胶质瘤蛋白(Acp-W2)，同时还涉及靶向抗神经胶质瘤蛋白(Acp-W2)的制备方法，还涉及基因工程蛋白Acp-W2的用途，基因工程生产的靶向抗神经胶质瘤蛋白在动物模型水平上能高效抑制神经胶质瘤的增殖和转移，具有开发成抗神经胶质瘤药物的应用价值。

背景技术

脑神经胶质瘤是中枢神经系统最常见的肿瘤，其发生率约占全部颅内肿瘤的40％，患者平均存活时间为一年。目前所有治疗措施(如：手术切除、化学治疗、放射治疗和免疫治疗等)的疗效和应用潜力都极为有限。针对这一严峻现状，迫切需要研究和开发一种有效的治疗神经胶质瘤的药物。

1995年，Ullrich发现人脑神经胶质瘤细胞表达一种独特的电压依赖的氯电流，而这种电流可以被来源于蝎毒液的氯毒素Chlorotoxin有效抑制，从而有效地降低瘤细胞增殖速度和肿瘤细胞的转移。随后，在动物模型上进一步证实Chlorotoxin可选择性抑制神经胶质瘤。因此，筛选神经胶质瘤细胞所特有的氯离子通道的抑制剂可发展成为抗神经胶质瘤的选择性靶向新药。

现代科学研究表明，蝎毒的成分具有多种生理、药理活性，对抗肿瘤、治疗风湿、抗癫痫以及心血管疾病有重要治疗作用。但是其成分相当复杂，而且成分的结构和物理化学性质相似，难以分离，许多成分所起的作用甚至相反，而且有效成分往往含量低，这些无疑都限制了蝎毒的研究和应用。特别是蝎毒氯毒素Chlorotoxin只有36氨基酸的小肽，东亚钳蝎蝎毒氯毒素BmKCT也是一个由35氨基酸组成的多肽。因此，氯毒素在蝎毒中的含量非常低，从蝎毒混合物分离和纯化氯毒素的产量低和成本昂贵，这严重限制了蝎毒氯毒素抗神经胶质瘤药物的研发工作。尽管采用基因工程技术可以生产大量的蛋白质，然而蝎毒氯毒素仅由几十个氨基酸(小余40aa)组成，是一个很小的蛋白质多肽，如果采用基因工程的办法生产重组蝎毒氯毒素，那么氯毒素在受体表达菌中易于被蛋白酶降解，而且这么小蛋白的表达量不高和后期纯化困难。因此，通过人工改造蝎毒氯毒素，使氯毒素与其它标签融合，形成一个较大有生物活性的融合蛋白成为了高效开发蝎毒氯毒素靶向抗神经胶质瘤药物研发的最佳途径。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种靶向抗神经胶质瘤Acp-W2蛋白。该蛋白稳定性好，易于保存。

本发明的另一个目的是在于提供了一种靶向抗神经胶质瘤Acp-W2蛋白的制备方法。该方法简单易行，操作方便，易于生产，制备的蛋白纯度高，产量高。

本发明的再一个目的是在于提供了一种基因工程靶向抗神经胶质瘤Acp-W2蛋白在制备治疗或预防神经胶质瘤的药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：

一种基因工程靶向抗神经胶质瘤Acp-W2蛋白。通过分子生物学方法，申请人分子设计了靶向抗神经胶质瘤Acp-W2蛋白。一种分离的蛋白Acp-W2，其序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。申请人发现Acp-W2蛋白以液态形式在-20℃下保存6个月以上和以干粉形式在4℃下保存12个月以上，其生物活性不变。Acp-W2蛋白稳定性好，易于保存。本发明涉及一种基因工程靶向抗神经胶质瘤蛋白以及生产靶向抗神经胶质瘤蛋白的方法。该基因工程靶向抗神经胶质瘤蛋白的生产方法简单，后期纯化得率高，生物活性好。

Acp-W2：MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLEVLFQGPLGSDDDDKCGPCFTTDANMARKCRECCGGIGKCFGPQCLCR(SEQ ID NO：1)。

一种基因工程靶向抗神经胶质瘤Acp-W2蛋白的制备方法。它包括下列步骤：

A、设计引物：设计4条PCR扩增引物进行2轮PCR扩增获取W2基因，正向引物为P1：5’GCGGATCCGTGCGGTCCGTGCTTCACCACC 3’，引物P2：5′GCAGCATTCACGGCATTTACGAGCCATGTTAGCGTCGGTGGTGAAGCA′；反向引物为P3：5’TGCCGTGAATGCTGCGGTGGTATCGGTAAATGCTTCGGTCCGCAGTGC3’，引物P4：5’CCCAAGCTTCAACGGCACAGGCACTGCGGACC 3’。

B、两轮PCR扩增W2基因：第一轮PCR扩增用引物P2和引物P3，第二轮PCR扩增用引物P1和引物P4。第一轮PCR反应的试剂如下：将5微升的10x聚合酶缓冲液、4微升的脱氧核糖核苷酸(dNTP)混合物、1微升的引物P2、1微升的引物P3、0.25微升的耐热DNA聚合酶(TaqDNA)和37.75微升的无菌水混合。PCR反应条件：94℃预变性300秒、94℃变性45秒、55℃复性45秒、72℃延伸45秒、72℃最后延伸200秒，循环32次。第二轮PCR中使用引物P1和引物P4，加入第一轮PCR扩增产物稀释50倍的模板1微升，其它反应条件不变，获得特异性的扩增带(图1)。

C、将PCR扩增W2基因融合到谷胱苷肽转移酶(GST)的下游，表达和纯化Acp-W2蛋白：PCR扩增产物凝胶电泳回收后用BamHI和HindIII双酶切，酶切后的片段插入经BamHI和HindIII双酶切的表达载体pGEX-6p-1(购自Pharmacia公司)，构建重组表达质粒，转化Rossetta(DE3)(购自Promega)。对转化的大肠杆菌异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，购自华美生物工程公司)诱导培养后，收集菌体，悬浮于缓冲液中(50mM Tris-Cl，1.0mM EDTA，pH8.0)，超声波破菌并离心，所得上清通过GST亲和层析胶后可收集洗脱得到的融合蛋白。收集得到的融合蛋白溶液再经超虑脱盐和色谱分离，获得基因工程Acp-W2蛋白(图2)，纯度达到95％(图3)。

基因工程Acp-W2蛋白作为药物在治疗神经胶质瘤中的用途。它包括下列步骤：

A、建立大鼠神经胶质瘤C6细胞皮下移植瘤动物模型：收获C6(购自上海细胞所)培养细胞并配成1.5×10⁶个/ml浓度的悬液，按0.2-0.3ml的体积注射于每只实验大鼠(150g±10g)右前腋皮下，接种7至10天，即可在右前肢腋下随手触摸到肿瘤颗粒。正常培养7天后，挑选成瘤较好、肿瘤大小适宜的个体作为实验的模型动物(图4)。

B、Acp-W2靶向大鼠神经胶质瘤：采用氯胺T法将放射性元素¹³¹I标记GST蛋白和Acp-W2蛋白。取已通过碘饱和甲状腺的模型大鼠15只，随机均分为3组，试验组注射¹³¹I-Acp-W2蛋白，另两组注射游离的Na¹³¹I(由中国原子能科学研究院同位素)和¹³¹I-GST蛋白做对照组。注射方式为尾静脉注射，剂量20μl。分别于5min、10min、30min、60min、120min和180min时，采用断颈法处死实验动物，分别取血液以及心脏、肺、肝、肾、胰、胃、大脑、肌肉和肿瘤组织块作为样品，以FT-613(购自北京核仪器厂)自动计算放免测量仪记录样品的脉冲数，记录时间30秒，换算出单位重量样品的放射强度(脉冲数)以及样本单位放射量权重(〔某样品单位重量脉冲数/样本单位重量脉冲数总和〕×100％)。统计分析发现，在180分钟内，荷瘤大鼠肿瘤组织内¹³¹I-Acp-W2的含量随时间的延长而不断增加(富集)，而其它非肿瘤组织则不具有这种现象(图5)，表明重组Acp-W2蛋白对由C6细胞所诱发的肿瘤组织有明显的特异靶向作用。

C、体内抑制大鼠神经胶质瘤增殖：大鼠腋下接种C6细胞7天后，挑选已成瘤的个体12只随机分为3组，分别对3组动物腹腔注射Acp-W2蛋白、GST蛋白和生理盐水。蛋白溶液浓度2μg/μl，注射剂量3组均为100μl/只大鼠，频率为每2天注射一次，共注射7次。最后一次注射后再将动物饲养5天，观察肿瘤生长情况，解剖摘取肿瘤前采用断颈法处死动物，剥离皮下肿瘤组织并称量各自瘤重，比较分析两组间的差异。结果表明，两组动物皮下肿瘤平均重量分别为：生理盐水组0.3259±0.1114g；GST蛋白组0.3399±0.1965g；Acp-W2蛋白组0.0493±0.0428g。Acp-W2蛋白实际抑瘤率为84.87％。统计学分析也显示两组间肿瘤均重差异极显著，显示Acp-W2蛋白具有很强的抑瘤效果(图6)。

D、体内抑制大鼠神经胶质瘤转移：大鼠腋下接种C6细胞14天后，挑选已成瘤的个体15只随机分为3组，分别对3组动物腹腔注射Acp-W2蛋白、GST蛋白和生理盐水。蛋白溶液浓度2μg/μl，注射剂量3组均为100μl/只大鼠，频率为每2天注射一次，共注射7次。最后一次注射后再将动物饲养7天，观察肿瘤生长情况，解剖摘取肿瘤前采用断颈法处死动物，观察各组动物肺部肿瘤转移情况，比较分析两组间的差异。结果表明，Acp-W2蛋白试验组动物的肺基本上是正常的，而GST蛋白和生理盐水的试验动物的肺出现了肿瘤(图7)。统计学分析也显示两组间肿瘤转移差异极显著，显示Acp-W2蛋白具有很强的抑制肿瘤转移的效果(图7)。

可见，本发明具有如下特点：(1)基因工程生产Acp-W2蛋白产量高。实验室小试生产98％纯度以上的Acp-W2蛋白产量达到30mg/L培养物，中试发酵水平达到400mg/L培养物；(2)Acp-W2稳定性高。Acp-W2是一个由269氨基酸组成的31.5KDa大小的蛋白，具有很高的稳定性，不易变质；(3)易于生产。使用亲和层析、超虑脱盐和高效液相色谱3个纯化操作步骤，就可以得到95％以上色谱纯的Acp-W2蛋白；(4)Acp-W2药物效果显著。动物实验表明，重组Acp-W2蛋白不仅对神经胶质瘤组织具有特异靶向性，而且能有效抑制神经胶质瘤恶性增殖和转移。

附图说明

图1重叠PCR方法扩增W2基因示意图

M：DNA Mark Ladder2000；1：引物P2和P3的扩增带；2：引物P1和P4的扩增带。

图2工程菌BL21(pGEX/Acp-W2)的诱导表达示意图

1：未经诱导转化pGEX-Acp-W2的全细胞蛋白提取物；2：经IPTG诱导转化pGEX-pGEX-Acp-W2的全细胞蛋白提取物；3：纯化的基因工程Acp-W2蛋白；4：中分子量蛋白质Mark。

图3基因工程Acp-W2蛋白的HPLC分析

图4建立大鼠神经胶质瘤C6细胞皮下移植瘤动物模型

(A)：大鼠神经胶质瘤C6细胞皮下移植瘤动物外形照片(接种21天)；(B)：对应A图大鼠神经胶质瘤C6细胞皮下移植瘤动物解剖照片。

图5 Acp-W2蛋白靶向大鼠神经胶质瘤

(A)：生理盐水对照组¹³¹I在大鼠不同组织中的增长速率；(B)：¹³¹I-GST蛋白在大鼠不同组织中的增长速率；(C)：¹³¹I-Acp-W2蛋白在大鼠不同组织中的增长速率。

图6 Acp-W2蛋白体内抑制大鼠神经胶质瘤增殖

(A)：生理盐水、GST蛋白和Acp-W2蛋白处理组大鼠神经胶质瘤解剖结果；(B)：生理盐水、GST蛋白和Acp-W2蛋白处理组大鼠神经胶质瘤重量及其抑瘤率；(C)：生理盐水、GST蛋白和Acp-W2蛋白处理组大鼠神经胶质瘤重量的柱形图。

图7 Acp-W2蛋白体内抑制大鼠神经胶质瘤转移

(A)：生理盐水和Acp-W2蛋白处理组大鼠肺的肿瘤转移情况统计；(B)：典型的生理盐水和Acp-W2蛋白处理组大鼠肺解剖照片(a：一只具有+++肿瘤严重程度的生理盐水对照组大鼠肺；b：一只没有发生病变的Acp-W2蛋白组大鼠肺)。

具体实施方式

实施例1：分子设计W2基因

基于已报道的蝎毒氯毒素BmKCT(AF135821)的氨基酸序列，利用常规方法推断编码蛋白质的核苷酸序列，同时考虑大肠杆菌密码子偏好性。在此基础上，分别设计引物进行PCR扩增获取目的基因W2。正向引物为P1：5’GCGGATCCGTGCGGTCCGTGCTTCACCACC 3’，引物P2：5′GCAGCATTCACGGCATTTACGAGCCATGTTAGCGTCGGTGGTGAAGCA′；反向引物为P3：5’TGCCGTGAATGCTGCGGTGGTATCGGTAAATGCTTCGGTCCGCAGTGC 3’，引物P4：5’CCCAAGCTTCAACGGCACAGGCACTGCGGACC 3’。第一轮PCR扩增用引物P2和引物P3，第二轮PCR扩增用引物P1和引物P4。第一轮PCR反应的试剂如下：将5微升的10xTaq聚合酶缓冲液、4微升的dNTP混合物、1微升的引物P2、1微升的引物P3、0.25微升的TaqDNA聚合酶和37.75微升的无菌水混合。PCR反应条件：94℃预变性300秒、94℃变性45秒、55℃复性45秒、72℃延伸45秒、72℃最后延伸200秒，循环32次。第二轮PCR中使用引物P1和引物P4，加入第一轮PCR扩增产物稀释50倍的模板1微升，其它反应条件不变。

实施例2：Acp-W2蛋白重组表达载体的构建

A：W2和pGEX-6p-1的双酶切与连接

将实施例1中所得PCR产物经过酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，无水乙醇(2.5倍体积)沉淀后用50μl灭菌水溶解沉淀。用限制性内切酶BamHI和HindIII(Takara公司产品)对回收的PCR产物和表达载体pGEX-6p-1质粒进行酶切。酶切反应：BamHI(14U/μl)和HindIII(20U/μl)各1μl，10倍缓冲液2.5μl，，PCR产物或pGEX-6p-1质粒50-100ng，加无菌水至总体积为25μl。37℃水浴5小时，酶切产物经酚∶氯仿∶异戊醇抽提，无水乙醇(2.5倍体积)沉淀后用T₄DNA连接酶(Takara公司产品)将PCR产物与表达载体pGEX-6p-1连接。连接反应：T₄DNA连接酶(1U/μl)1μl，PCR产物与表达载体pGEX-6p-1的摩尔比为3∶1，并且DNA总量为0.1μg，5倍连接酶反应缓冲液4μl，加无菌水至总体积为20μl，16℃放置24小时。

B：大肠杆菌DH5a和Rossetta(DE3)感受态细胞的制备

DH5α(购自中国典型培养物保藏中心，DH5α为普通菌株)感受态细胞的制备：在划线平板上挑取DH5α单菌落，接种于5ml LB培养液，37℃，250rpm摇床中培养过夜；以1％量转接于5ml LB培养基中，生长至OD₆₀₀到0.4～0.6，取菌液1ml于预冷的1.5ml Eppendorf管中，冰浴5～10分钟，4℃ 12,000rpm离心20～30秒，收集菌体，倒置1分钟，再冰浴10分钟；沉淀重悬于1ml预冷的0.1M CaCl₂中，冰浴20～40分钟，4℃ 12,000rpm离心20～30秒，收集菌体，将菌体重悬于150μl预冷的CaCl₂中，冰浴2～7小时，4℃冰箱保存，如放置在-70℃则可保存6个月。

Rossetta(DE3)感受态细胞的制备同于DH5α感受态细胞的制备。

C：连接产物的转化和阳性克隆的鉴定

将实施例2A步骤中的20μl连接反应液加到100μl的DH5α感受态细胞，混匀，冰浴30分钟，42℃水浴90秒(不能摇动)，再冰浴2分钟；加等体积2×LB培养液，37℃摇床(120rpm)温育1小时；摇匀菌液，取200μl涂布于LB/AP⁺琼脂平板上，待菌液吸干后倒置于37℃培养12～16小时，观察结果。

加氨苄青霉素琼脂平板(LB/AP⁺)上挑取单菌落10个，于500μl含氨苄的LB液体培养基中37℃振摇4小时，取2μl菌液作为模板，以实施例1中的正反向引物P1、P2、P3、P4进行PCR。PCR筛选的阳性克隆子进一步使用限制性酶切反应鉴定。两者都为阳性结果的克隆子送上海三博公司进行测序分析。测序引物是针对pGEX-6p-1质粒的通用测序引物pGEX5’primer。

实施例3：重组Acp-W2基因工程菌的制备

将实施例2C步骤中测序正确的阳性克隆子按照碱裂解法提取重组表达质粒pGEX-Acp-W2(方法见《分子克隆》第二版)。按照实施例2C步骤中的转化方法将提取的pGEX-Acp-W2质粒转入实施例2B步骤制备的大肠杆菌感受态Rossetta(DE3)细胞中。平板为LB/AP⁺琼脂平板。挑取单克隆子获得基因工程菌Rossetta(DE3)(pGEX-Acp-W2)。

实施例4：重组Acp-W2蛋白的表达和纯化

在含氨苄青霉素的LB液体培养基中以1∶100的比例接种克隆子(重组大肠杆菌Rossetta(DE3)/pGEX-Acp-W2)，37℃培养至OD₆₀₀＝0.8时加入IPTG(终浓度为0.1mM)对培养物进行诱导，然后将培养物在28℃培养4小时以进行目的基因的表达。浓缩诱导后的培养物50倍，超声波破细胞(80HZ，30秒/次，至培养物变清亮为止)，12000rpm离心15分钟，所得上清加入到GST亲和层析胶中充分混合后26℃作用1小时使Acp-W2蛋白与GST亲和层析胶充分结合。用含50mM的EDTA(乙二胺四乙酸)的Tris-Cl(三羟甲基氨基甲烷盐酸)缓冲溶液(1.0mM，pH8.0)反复冲洗GST亲和层析胶去除杂蛋白。然后用10mM的GSH(还原型谷胱甘肽)溶液按照50ml/L培养物洗脱Acp-W2蛋白。洗脱的Acp-W2蛋白通过50ml的10KDa超虑管(Millipore，Centricon，USA)离心浓缩脱盐，离心速度为3500rpm/min，温度为4℃。然后浓缩脱盐的Acp-W2蛋白进行HPLC(美国安吉伦公司产品)纯化。HPLC(高效液相色谱)的参数设置为：分离柱子C18(EliteHPLC，China，10×250mm，5μm)，流速5ml/min，液相为含有0.1％的三氟乙酸TFA的乙腈(CH3CN：10％ to 80％)洗脱液，紫外检测设置在280nm处。手工收集Acp-W1蛋白峰，并且冷冻干燥(-40℃)。通过Tris-Tricine缓冲液的十二烷基磺酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)检测收集液中的重组Acp-W2蛋白，并用Bradford方法测定含量。高效液相色谱鉴定蛋白纯度达到95％。

实施例5：大鼠神经胶质瘤C6细胞皮下移植瘤动物模型的建立

收获C6培养细胞并配成1.5×10⁶个/ml浓度的悬液，按0.2-0.3ml的体积注射于每只实验SD大鼠(150g±10g，购自湖北省试验动物中心)右前腋皮下，接种7至10天，即可在右前肢腋下随手触摸到肿瘤颗粒。正常培养7天后，挑选成瘤较好、肿瘤大小适宜的个体作为实验的模型动物。

实施例6：Acp-W2靶向大鼠C6细胞皮下移植瘤

采用氯胺T法将放射性元素¹³¹I标记GST蛋白和Acp-W2蛋白。取已通过碘饱和甲状腺的模型大鼠15只，随机均分为3组，试验组注射¹³¹I-Acp-W2蛋白，另两组注射游离的Na¹³¹I和¹³¹I-GST蛋白做对照组。注射方式为尾静脉注射，剂量20μl。分别于5min、10min、30min、60min、120min和180min时，采用断颈法处死实验动物，分别取血液以及心脏、肺、肝、肾、胰、胃、大脑、肌肉和肿瘤组织块作为样品，以FT-613自动计算放免测量仪记录样品的脉冲数，记录时间30秒，换算出单位重量样品的放射强度(脉冲数)以及样本单位放射量权重(〔某样品单位重量脉冲数/样本单位重量脉冲数总和〕×100％)。统计分析发现，在180分钟内，荷瘤大鼠肿瘤组织内¹³¹I-Acp-W2的含量随时间的延长而不断增加(富集)，而其它非肿瘤组织则不具有这种现象，表明重组Acp-W2蛋白对由C6细胞所诱发的肿瘤组织有明显的特异靶向作用。

实施例7：Acp-W2蛋白体内抑制大鼠神经胶质瘤增殖

大鼠腋下接种C6细胞7天后，挑选已成瘤的个体12只随机分为3组，分别对3组动物腹腔注射Acp-W2蛋白、GST蛋白和生理盐水。蛋白溶液浓度2μg/μl，注射剂量3组均为100μl/只大鼠，频率为每2天注射一次，共注射7次。最后一次注射后再将动物饲养5天，观察肿瘤生长情况，解剖摘取肿瘤前采用断颈法处死动物，剥离皮下肿瘤组织并称量备自瘤重，比较分析两组间的差异。结果表明，两组动物皮下肿瘤平均重量分别为：生理盐水组0.3259±0.1114g；GST蛋白组0.3399±0.1965g；Acp-W2蛋白组0.0493±0.0428g。Acp-W2蛋白实际抑瘤率为84.87％。统计学分析也显示两组间肿瘤均重差异极显著，显示Acp-W2蛋白具有很强的抑瘤效果。

实施例8：Acp-W2蛋白体内抑制大鼠神经胶质瘤转移

大鼠腋下接种C6细胞14天后，挑选已成瘤的个体15只随机分为3组，分别对3组动物腹腔注射Acp-W2蛋白、GST蛋白和生理盐水。蛋白溶液浓度2μg/μl，注射剂量3组均为100μl/只大鼠，频率为每2天注射一次，共注射7次。最后一次注射后再将动物饲养7天，观察肿瘤生长情况，解剖摘取肿瘤前采用断颈法处死动物，观察各组动物肺部肿瘤转移情况，比较分析两组间的差异。结果表明，Acp-W2蛋白试验组动物的肺基本上是正常的，而GST蛋白和生理盐水的试验动物的肺出现了肿瘤，。统计学分析也显示两组间肿瘤转移差异极显著，显示Acp-W2蛋白具有很强的抑制肿瘤转移的效果。

SEQUENCE LISTING

<110>武汉大学

<120>一种靶向抗神经胶质瘤蛋白及制备方法和用途

<130>一种靶向抗神经胶质瘤蛋白及制备方法和用途

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>269

<212>PRT

<213>人工合成

<400>1

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro

1               5                   10                  15

Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu

            20                  25                  30

Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu

        35                  40                  45

Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys

    50                  55                  60

Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn

65                  70                  75                  80

Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu

                85                  90                  95

Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser

            100                 105                 110

Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu

        115                 120                 125

Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn

    130                 135                 140

Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp

145                 150                 155                 160

Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu

                165                 170                 175

Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr

            180                 185                 190

Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala

        195                 200                 205

Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Glu Val Leu

    210                 215                 220

Phe Gln Gly Pro Leu Gly Ser Asp Asp Asp Asp Lys Cys Gly Pro Cys

225                 230                 235                 240

Phe Thr Thr Asp Ala Asn Met Ala Arg Lys Cys Arg Glu Cys Cys Gly

                245                 250                 255

Gly Ile Gly Lys Cys Phe Gly Pro Gln Cys Leu Cys Arg

            260                 265

Claims (2)

1.一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

2.权利要求1所述的一种分离的蛋白质在制备治疗或预防神经胶质瘤的药物中的应用。

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