CN101381404B - 靶向肿瘤蛋白kct-w2及制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种工程靶向肿瘤KCT-W2蛋白及制备方法和用途，本发明分离了一种蛋白质，其序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。基因工程所涉及的引物，将W2的核苷酸序列插入表达载体中pGEX-6p-1，构成重组表达质粒；重组质粒转化大肠杆菌Rossetta(DE3)，然后细胞裂解经GST亲和层析和色谱纯化得到重组KCT-W2蛋白。用Cy5.5NHS easter标记KCT-W2蛋白，获得了稳定KCT-W2蛋白荧光复合物。该KCT-W2蛋白荧光复合物对大鼠腋下移植的神经胶质瘤具有特异的靶向作用，而且KCT-W2蛋白荧光复合物可以对肿瘤进行准确的示踪和定位，一种KCT-W2蛋白荧光复合物在制备治疗或预防早期肿瘤药物中的应用。本发明方法简单易行，操作方便，高效灵敏。

Description

靶向肿瘤蛋白KCT-W2及制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，本发明涉及一种靶向肿瘤的蛋白KCT-W2序列，同时涉及靶向肿瘤蛋白的基因工程制备方法，也涉及高效灵敏肿瘤检测KCT-W2蛋白荧光复合物的制备，还涉及KCT-W2蛋白荧光复合物在制备治疗或预防早期肿瘤药物中的用途。

背景技术

肿瘤是一种严重威胁人类生命和健康的疾病。2002年，世界卫生组织发表的一份研究报告表明，全球癌症状况将日益严重，今后20年新患者人数将由目前的每年1000万增加到1500万，因癌症而死亡的人数也将由每年600万增至1000万。我国流行病学调查表明，2003年我国城市居民恶性肿瘤致死率为94.71/10万。农村居民恶性肿瘤患者病死率更高，为104.01/10万。癌症在我国已成为第一位致死疾病。近年来我国每年新增肿瘤患者160-170万人。这些数字强烈地表明肿瘤是威胁人们生命的最大疾病。鉴于目前恶性肿瘤的严重危害性和治疗手段与药物的局限性，因此，有效的癌症预防、早期筛查、早期诊断和早期治疗具有异常重要的作用。世界卫生组织认为，通过有效的预防措施，癌症的发生可减少三分之一；通过有效的早期诊断治疗，三分之一癌症可以治愈；通过有效的治疗，其余三分之一的患者可以减少痛苦，提高生活质量。然而，常用的肿瘤筛查方法均不理想。例如，超声诊断和乳房摄影等检测最小极限为1cm直径的肿瘤，肿瘤细胞数目已达到10⁹个。即使目前较先进的磁共振成像(MRI)也只能检出癌细胞数超过100万个的肿瘤病灶，而无法对肿瘤进行早期筛查和诊断。无疑，如果能够有效地检测到早期分裂的肿瘤细胞和数目不多癌细胞团，将能为肿瘤患者争取宝贵的治疗时间，有效地治疗肿瘤并挽救或延长患者生命。

中国学者李文鑫等构建了高质量的东亚钳蝎(Buthus martensii Karsch)毒腺细胞cDNA文库，从库中筛选出一种氯离子通道调节剂的基因(GenBank登录号为AF135821)(Xian-Chun Zeng，Wen-Xin Li，Shun-Yi Zhu，Fang Peng，Zhi-Hui Zhu，Kai-Lang Wu，Fu-Hua Yang.Cloning and characterization of a cDNA sequence encoding theprecursor of a Chlorotoxin-like peptide from the Chinese scorpion Buthusmartensii Karsch.Toxicon38:1009-1014.2000)，命名为东亚钳蝎氯毒素BmKCT基因。我们构建了该基因的基因工程菌并进行高效表达和纯化，研究表明，重组BmKCT蛋白可以有效抑制星型胶质瘤细胞U251细胞膜上的氯电流(杨锐，彭方，刘辉，曹志贱，李文鑫，毛歆，蒋达和，东亚钳蝎氯毒素BmKCT的表达和功能鉴定，《中国生物化学与分子生物学报》2005年21卷1期：19-23)，而且有明显的抗神经胶质瘤的活性。利用氯毒素多肽与肿瘤细胞膜上MMP-2和氯通道大分子复合物特异相互作用，可开发出其蛋白荧光复合物对肿瘤进行早期筛查和诊断。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种靶向肿瘤蛋白KCT-W2。在体外具有很强的稳定性，易于长期保存。

本发明的另一个目的是在于提供了一种靶向肿瘤蛋白KCT-W2的制备方法。该方法简单易行，操作方便，易于生产和制备高纯度KCT-W2蛋白。

本发明的再一个目的是在于提供了一种肿瘤检测KCT-W2蛋白荧光复合物的制备方法。该方法简单和高效。

本发明还涉及KCT-W2蛋白荧光复合物在制备治疗或预防早期肿瘤药物中的用途。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：

本发明涉及一种靶向肿瘤蛋白KCT-W2的序列及其靶向功能，同时涉及靶向肿瘤蛋白的基因工程制备方法，也涉及高效灵敏肿瘤检测KCT-W2蛋白荧光复合物的制备，还涉及KCT-W2蛋白荧光复合物的靶向肿瘤可视化及其在早期肿瘤诊断中的用途。

基于已报道的蝎毒氯毒素BmKCT(AF135821)的氨基酸序列，通过生物信息学方法，分子设计了基因工程肿瘤靶向蝎毒多肽序列。通过蛋白质结构预测(http://swissmodel.expasy.org//SWISS-MODEL.html)SWISS-MODEL程序和蛋白质结构分析(http://swissmodel.expasy.org/spdbv/)Swiss-PdbViewer程序，基于我们对蝎毒多肽与通道相互作用多样性及机制的深刻认识，在此基础上，申请人分子设计了肿瘤靶向蛋白KCT-W2，其序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列：MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLEVLFQGPLGSDDDDKCGPCFTTDANMARKCREPCCGIGKCFGPQCLCNRI(SEQ ID NO.1)。申请人发现KCT-W2蛋白以液态形式在-20℃下保存6个月以上和以干粉形式在4℃下保存12个月以上，其生物活性不变。KCT-W2蛋白稳定性好，易于保存。

一种制备基因工程靶向肿瘤蛋白KCT-W2的方法，它包括下列步骤：

A、设计W2基因4条PCR扩增引物进行2轮PCR扩增获取目的基因，正向引物P1：5’GCCGGATCCCCGATGACGTGTGGGCCTTGCTTTACAACGGA3’，正向引物P2：5′AATGTGTCTGTAACACCCGGTTTCGTAAAAGGTTATGGTGTCGTGGGAAG3′；反向引物P3：5′AAATGTTGCCTACGATTATACCGTTCCTTTACATCCCTTCCCACGACACCA3′，反向引物P4：5’GCCCTCGAGTCATATACGGTTACACAGACATTGTGGGCCA3′。

B、第一轮PCR扩增用正向引物P2和反向引物P3，第二轮PCR扩增用引物P1和引物P4。PCR反应条件：94℃预变性300秒、94℃变性45秒、55℃复性45秒、72℃延伸45秒、72℃最后延伸200秒，循环32次。第二轮PCR中使用正向引物P1和反向引物P4，加入第一轮PCR扩增产物稀释50倍的模板1微升，其它反应条件不变。

C、将最终PCR扩增产物凝胶电泳回收后用BamHI和XhoI双酶切，将酶切后的片段插入经BamHI和XhoI双酶切的表达载体pGEX-6p-1(购自Pharmacia公司)，构建重组表达质粒，转化大肠杆菌DE3(中国典型培养物保藏中心)。对转化的大肠杆菌IPTG(购置华美生物工程公司)诱导培养后，收集菌体，悬浮于缓冲液中(50mM Tris-Cl，1.0mM EDTA，pH8.0)，超声波破菌并离心，所得上清通过GST亲和层析胶后可收集洗脱得到的融合蛋白KCT-W2。收集得到的融合蛋白溶液再经分离纯化、色谱分离。将纯化蛋白经SDS-PAGE电泳检测，获得KCT-W2蛋白。

对KCT-W2蛋白进行制备，并获得一种肿瘤检测KCT-W2蛋白荧光复合物药物。一种高效灵敏肿瘤检测KCT-W2蛋白荧光复合物的制备方法。菁染料Cy5.5NHS easter含有N-羟基琥珀酰亚胺活性酯(NHS ester)基团，该基团可与蛋白质、多肽、DNA或其他生物分子中的羟基、氨基或巯基以化学键的方式键合，表征生物分子的特性，形成具有生物功能的标记衍生物。KCT-W2蛋白含有多个精氨酸，可以被菁染料Cy5.5NHSeaster有效标记。将1mg菁染料Cy5.5NHS easter溶解在400微升的二甲基亚砜中，并加入到10mg的基因工程KCT-W2蛋白蛋白溶液中。然后添加15微升三乙胺至上述混合物中，并在黑暗处摇动过夜。高效液相色谱分离纯化标记的KCT-W2蛋白，并冻干。获得KCT-W2蛋白荧光复合物。该方法标记简单，反应活性高，标记产物水溶性好。

KCT-W2蛋白荧光复合物在制备治疗或预防神经胶质瘤药物中的应用，KCT-W2蛋白荧光复合物的靶向肿瘤可视化及其在早期肿瘤诊断中的用途包括神经胶质瘤C6细胞腋下移植瘤大鼠模型的制备和KCT-W2蛋白荧光复合物在肿瘤模型鼠上的标记示踪试验两个步骤。首先制备神经胶质瘤C6细胞腋下移植瘤大鼠模型：每只大鼠腋下注射神经胶质瘤C6细胞0.2ml(细胞浓度5-10*10⁶/ml)，室温(20-25℃，以下相同)饲养7-10天，大鼠腋下出现肿瘤。KCT-W2蛋白荧光复合物在肿瘤模型鼠上的标记示踪试验：选用成功的神经胶质瘤C6细胞腋下移植瘤大鼠，尾静脉注射1mg的KCT-W2蛋白荧光复合物，同时设置菁染料对照组。每12小时分别红外光和可见光给试验大鼠拍照，时间持续7天，采集和分析全过程的数据和图片。图片结果分析表明，KCT-W2蛋白荧光复合物对大鼠腋下移植的神经胶质瘤具有特异的靶向作用，而且KCT-W2蛋白荧光复合物可以对肿瘤进行准确的失踪和定位，在肿瘤的早期诊断中价值巨大。

可见，本发明专利具有如下特点：(1)稳定性高。与GST标签融合，形成一个较大有生物活性的融合蛋白使KCT-W2蛋白具有很高的稳定性，不易变质；(2)易于生产。使用目前常用的蛋白质基因工程生产方法可生产KCT-W2蛋白。菁染料标记KCT-W2蛋白操作简单；(3)靶向可视化示踪。本专利研制的KCT-W2蛋白荧光复合物只识别肿瘤细胞和肿瘤组织，可有效地定位、跟踪肿瘤的大小和去向。因此，KCT-W2蛋白荧光复合物在肿瘤早期的诊断中价值巨大。

附图说明

图1重叠PCR方法扩增W2基因示意图

M：DNA Marker；1：引物P2和P3的扩增带；2：引物P1和P4的扩增带。

图2工程菌BL21(pGEX/KCT-W2)的诱导表达示意图

1：未经诱导转化pGEX-KCT-W2的全细胞蛋白提取物；2：经IPTG诱导转化pGEX-KCT-W2的全细胞蛋白提取物；3：纯化的基因工程KCT-W2蛋白；4：中分子量蛋白质Marker。

图3基因工程KCT-W2蛋白的HPLC分析

图4神经胶质瘤C6细胞的培养

图5建立大鼠神经胶质瘤C6细胞皮下移植瘤动物模型

(A)：大鼠神经胶质瘤C6细胞皮下移植瘤动物外形照片；(B)：对应A图大鼠神经胶质瘤C6细胞皮下移植瘤动物解剖照片。

图6KCT-W2蛋白荧光复合物在大鼠体内活体成像图

1、染料组；2、染料标记KCT-W2蛋白质组

图7动物解剖组织分布

1、肿瘤；2、肝；3、肺；4、小肠；5、肾；6、脾

具体实施方式

实施例1：W2多肽序列的分子设计

通过蛋白质结构预测(http://swissmodel.expasy.org//SWISS-MODEL.html)SWISS-MODEL程序和蛋白质结构分析(http://swissmodel.expasy.org/spdbv/)Swiss-PdbViewer程序，基于对蝎毒多肽与通道相互作用多样性及机制的深刻认识，分子设计了特异性作用于氯通道的W2多肽序列：CGPCFTTDANMARKCREPCCGIGKCFGPQCLCNRI(KCT-W2)。

实施例2：设计引物及PCR扩增W2基因

根据W2多肽序列，分别设计引物进行PCR扩增获取W2基因。合成W2多肽基因的4条引物如下：正向引物P1(5’GCCGGATCCCCGATGACGTGTGGGCCTTGCTTTACAACGGA3’)，正向引物P2(5′AATGTGTCTGTAACACCCGGTTTCGTAAAAGGTTATGGTGTCGTGGGAAG3′)，反向引物P3(5′AAATGTTGCCTACGATTATACCGTTCCTTTACATCCCTTCCCACGACACCA3′)和引物P4(5’GCCCTCGAGTCATATACGGTTACACAGACATTGTGGGCCA3′)。第一轮PCR扩增用正向引物P2和反向引物P3，第二轮PCR扩增用正向引物P1和反向引物P4。第一轮PCR反应的试剂和条件如下：1μl Taq聚合酶(1单位)、0.5μl四种(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶)脱氧单核苷酸等比混合液(10mmol/L)、17.5μl无菌双蒸水、2.5μl10倍PCR缓冲液、1.5μl氯化镁(25mmol/L)、P2(10μmol/L)和P3(10μmol/L)引物各1μl，总体积为25μl。PCR反应过程：94℃预变性300秒、94℃变性60秒、55℃复性60秒、72℃延伸60秒、循环35次、72℃最后延伸300秒。第二轮PCR中使用引物P1和引物P4，加入第一轮PCR扩增产物稀释50倍的模板1微升，其它反应条件不变。(见图1)

实施例3：W2基因和pGEX-6p-1的双酶切与连接

将实施例2中所得PCR产物经过酚:氯仿:异戊醇(25：24：1)(体积比)抽提，无水乙醇(2.5倍体积)沉淀后用50μl灭菌水溶解沉淀。用限制性内切酶BamHI和XhoI(Takara公司产品)对回收的PCR产物和表达载体pGEX-6p-1质粒进行酶切。酶切反应：BamHI(14U/μl)和XhoI(20U/μl)各1μl，10倍缓冲液2.5μl，，PCR产物或pGEX-6p-1质粒50-100ng，加无菌水至总体积为25μl。37℃水浴5小时，酶切产物经酚：氯仿:异戊醇抽提，无水乙醇(2.5倍体积)沉淀后用T₄DNA连接酶将PCR产物与表达载体pGEX-6p-1连接。连接反应：T₄DNA连接酶(1U/μl)1μl，PCR产物与表达载体pGEX-6p-1的摩尔比为3：1，并且DNA总量为0.1μg，5倍连接酶反应缓冲液4μl，加无菌水至总体积为20μl，16℃放置24小时。

实施例4：大肠杆菌DH5a和ROSSETTA(DE3)感受态细胞的制备

DH5α感受态细胞的制备：在划线平板上挑取DH5α单菌落，接种于5ml LB培养液，37℃，250rpm摇床中培养过夜；以1％量转接于5ml LB培养基中，生长至OD₆₀₀到0.4～0.6，取菌液1ml于预冷的1.5ml Eppendorf管中，冰浴5～10分钟，4℃12,000rpm离心20～30秒，收集菌体，倒置1分钟，再冰浴10分钟；沉淀重悬于1ml预冷的0.1MCaCl₂中，冰浴20～40分钟，4℃12,000rpm离心20～30秒，收集菌体，将菌体重悬于150μl预冷的CaCl₂(氯化钙)中，冰浴2～7小时，4℃冰箱保存，如放置在-70℃则可保存6个月。

Rossetta(DE3)感受态细胞的制备同于DH5α感受态细胞的制备。

实施例5：连接产物的转化和阳性克隆的鉴定

将实施例2中的20μl连接反应液加到100μl的DH5α感受态细胞，混匀，冰浴30分钟，42℃水浴90秒(不能摇动)，再冰浴2分钟；加等体积2×LB培养液，37℃摇床(120rpm)温育1小时；摇匀菌液，取200μl涂布于LB/AP⁺琼脂平板上，待菌液吸干后倒置于37℃培养12～16小时，观察结果。

加氨苄青霉素琼脂平板(LB/AP⁺)上挑取单菌落10个，于500μl含氨苄的LB液体培养基中37℃振摇4小时，取2μl菌液作为模板，以实施例1中的正反向引物进行PCR。PCR筛选的阳性克隆子进一步使用限制性酶切反应鉴定。两者都为阳性结果的克隆子送上海三博公司进行测序分析。测序引物是针对pGEX-6p-1质粒的通用测序引物pGEX5’primer。

实施例6：重组表达质粒KCT-W2/pGEX-6p-1提取和基因工程菌Rossetta(DE3)(KCT-W2/pGEX-6p-1)的制备

将实施例5中测序确证的阳性克隆子按照碱裂解法提取重组表达质粒KCT-W2/pGEX-6p-1(方法见《分子克隆》第二版)。按照实施例5中的转化方法将提取的KCT-W2/pGEX-6p-1质粒转入实施例4制备的大肠杆菌感受态Rossetta(DE3)细胞中。平板为LB/AP⁺琼脂平板。挑取单克隆子获得基因工程菌Rossetta(DE3)(KCT-W2/pGEX-6p-1)。

实施例7：重组KCT-W2蛋白的表达和纯化

在含氨苄青霉素的LB液体培养基中以1:100的比例接种克隆子(重组大肠杆菌Rossetta(DE3)/pGEX-KCT-W2)，37℃培养至OD₆₀₀＝0.8时加入IPTG(终浓度为0.1mM)对培养物进行诱导，然后将培养物在28℃培养4小时以进行目的基因的表达。浓缩诱导后的培养物50倍，超声波破细胞(80HZ，30秒/次，至培养物变清亮为止)，12000rpm离心15分钟，所得上清加入到GST亲和层析胶中充分混合后26℃作用1小时使KCT-W2蛋白与GST亲和层析胶充分结合。用含50mM的EDTA的Tris-Cl缓冲溶液(1.0mM，pH8.0)反复冲洗GST亲和层析胶去除杂蛋白。然后用10mM的GSH溶液按照50ml/L培养物洗脱KCT-W2蛋白。洗脱的KCT-W2蛋白通过50ml的10KDa超虑管(Millipore，Centricon，USA)离心浓缩脱盐，离心速度为3500rpm/min，温度为4℃。然后浓缩脱盐的KCT-W2蛋白进行HPLC(美国安吉伦公司产品)纯化。HPLC的参数设置为：分离柱子C18(EliteHPLC，China，10×250mm，5μm)，流速5ml/min，液相为含有0.1％的三氟乙酸(TFA)的乙腈(CH₃CN：从10％到80％)洗脱液，紫外检测设置在280nm处。手工收集KCT-W2蛋白峰，并且冷冻干燥(—40℃)。通过Tris-Tricine缓冲液的十二烷基磺酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)检测收集液中的重组KCT-W2蛋白(见图2)，并用Bradford方法测定含量。高效液相色谱鉴定蛋白纯度达到95％(见图3)。

实施例8：KCT-W2蛋白荧光复合物的制备

将1mg菁染料Cy5.5NHS easter溶解在400微升的二甲基亚砜中，并加入到10mg的基因工程KCT-W2蛋白蛋白溶液中。然后添加15微升三乙胺至上述混合物中，并在黑暗处摇动过夜。高效液相色谱分离纯化标记的KCT-W2蛋白，并冻干和定量，获得KCT-W2蛋白荧光复合物。另外，用1mg菁染料Cy5.5NHS easter失活，做阴性对照。实施例9：KCT-W2蛋白荧光复合物在制备治疗或预防神经胶质瘤药物中的应用(大鼠神经胶质瘤C6细胞皮下移植瘤动物模型的建立)：使用DMEM培养基传代培养C6细胞(见图4)。通常，C6细胞贴壁培养过程中，一周传代两次。收获细胞时，吸除培养瓶内培养液，加D-hanks液数毫升，轻轻摇晃，冲洗掉残余培养液及表面脱落的细胞。吸除D-hanks液后，向瓶内加入适量Trypsin溶液，进行消化。加入适量培养液，用吸管反复轻轻吹打细胞，使之脱离瓶壁并分散成单个细胞。收集细胞悬液，显微计数，配成浓度为5-10×10⁶个/ml细胞悬浮液待用，实验过程中须时常轻轻震动悬液以防细胞贴壁或沉降。按0.2ml的体积注射于每只实验鼠(100g±2g)右前腋皮下，接种一周至10天，即可在右前肢腋下随手触摸到肿瘤颗粒。正常培养两至三周后，挑选成瘤较好、肿瘤大小适宜的个体作为实验的模型动物(见图5)。

KCT-W2蛋白荧光复合物的靶向肿瘤可视化和肿瘤示踪研究：挑选12个移植瘤大鼠，且随机分组，6只/组。一组注射100微升的染料(30微克)，一组注射100微升的染料标记KCT-W2蛋白质(1000微克)。在暗处饲养1-7天，每天进行每组大鼠的表象观察。每天麻醉大鼠后，678nm红外处和可见光拍摄大鼠全身照片(图6)。时间持续7天，7天后进行动物解剖，取其肿瘤、肝、肺、小肠、肾和脾进行表象观察并于678nm红外处和可见光拍照(图7)，采集和分析全过程的数据和图片。图片结果分析表明，KCT-W2蛋白荧光复合物对大鼠腋下移植的神经胶质瘤具有特异的靶向作用，而且KCT-W2蛋白荧光复合物可以对肿瘤进行准确的示踪和定位，该药物在肿瘤的早期诊断中价值巨大。

SEQUENCE LISTING

<110>武汉莫尔元药科技有限公司

<120>靶向肿瘤蛋白KCT-W2及制备方法和用途

<130>靶向肿瘤蛋白KCT-W2及制备方法和用途

<160>5

<170>PatentIn version3.1

<210>1

<211>271

<212>PRT

<213>人工合成

<400>1

<210>2

<211>41

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

<210>3

<211>50

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

<210>4

<211>51

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

<210>5

<211>40

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

Claims (3)

1.一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

2.一种制备权利要求1所述的一种基因工程靶向肿瘤蛋白的方法，其步骤是：

A、设计引物：设计4条PCR扩增引物进行2轮PCR扩增获取目的基因，正向引物P1：5’GCCGGATCCCCGATGACGTGTGGGCCTTGCTTTACAACGGA3’，正向引物P2：5′AATGTGTCTGTAACACCCGGTTTCGTAAAAGGTTATGGTGTCGTGGGAAG3′；反向引物P35′AAATGTTGCCTACGATTATACCGTTCCTTTACATCCCTTCCCACGACACCA3′，反向引物P4：5’GCCCTCGAGTCATATACGGTTACACAGACATTGTGGGCCA3′；

B、进行两轮PCR扩增反应，第一轮PCR反应的试剂和条件如下：1μl Taq聚合酶、0.5μl四种脱氧单核苷酸混合液10mmol/L、17.5μl无菌双蒸水、2.5μl 10倍PCR缓冲液、1.5μl氯化镁25mmol/L、引物P2 10μmol/L和引物P3 10μmol/L各1μl，总体积为25μl，PCR反应过程：94℃预变性300秒、94℃变性60秒、55℃复性60秒、72℃延伸60秒、循环35次、72℃最后延伸300秒，第二轮PCR中使用引物P1和引物P4，加入第一轮PCR扩增产物稀释50倍的模板1μl，其它反应条件不变；

C、将PCR扩增产物凝胶电泳回收后用BamHI和XhoI双酶切，将酶切后的片段插入经BamHI和XhoI双酶切的表达载体pGEX-6p-1，构建重组表达质粒，转化大肠杆菌DE3，对转化的大肠杆菌IPTG诱导培养后，收集菌体，悬浮于缓冲液中，50mM Tris-Cl，1.0mM EDTA，pH8.0，超声波破菌并离心，得上清通过GST亲和层析胶后可收集洗脱得到的融合蛋KCT-W2，收集得到的融合蛋白溶液再经分离纯化、色谱分离，将纯化蛋白经SDS-PAGE电泳检测，得KCT-W2蛋白。

3.一种利用权利要求2所述的KCT-W2蛋白制备KCT-W2蛋白荧光复合物的方法，其步骤是：

A、将1mg菁染料Cy5.5NHS easter溶解在400μl的二甲基亚砜中，并加入到10mg的基因工程KCT-W2蛋白蛋白溶液中；

B、添加15微升三乙胺至上述混合物中，并在黑暗处摇动过夜；

C、高效液相色谱分离纯化标记的KCT-W2蛋白，并冻干和定量，获得KCT-W2蛋白荧光复合物Cy5.5-KCT-W2。

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