CN104031135A - 树蛙防御肽PopuDef及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种树蛙防御肽及其基因和应用，属于生物医学领域。该多肽分子量4636.12道尔顿，等电点4.75，全序列一级结构为：GASPALWGCDSFLGYCRIACFAHEASVGQKDCAEGMICC LPNVF，其第九位半胱氨酸和第三十八位半胱氨酸组成分子内二硫键，第十六位半胱氨酸和第三十二位半胱氨酸组成分子内二硫键，其第二十位半胱氨酸和第三十九位半胱氨酸组成分子内二硫键。编码树蛙防御肽的基因由401个核苷酸组成，其中编码成熟树蛙防御肽为第67-198位核苷酸。该树蛙防御肽具有显著的抑制细菌生长的作用，能够作为制备病原微生物感染疾病的治疗药物的应用。

Description

树蛙防御肽PopuDef及其基因和应用

技术领域：

本发明涉及一种树蛙(Polypedates puerensis)防御肽PopuDef及其基因和应用，属于生物医学领域。

背景技术：

抗生素广泛用于治疗敏感微生物(常为细菌或真菌)所致的感染。但是，由于人们对这些“传统抗生素”的不合理使用、甚至滥用，导致许多细菌对它们产生了耐药性。于是人们开始寻找新的抗微生物替代药物。近年来的研究发现,多肽类抗生素不但具有广谱的抗微生物活性,同时具有“传统抗生素”无法比拟的优越性：在很低的浓度时，就可以快速地杀死各种细菌(含临床耐药性菌株)；对真菌和病毒也有抑制作用；微生物不易产生耐药性；对于局部感染和全身感染都有效，有希望成为新一代抗微生物药物。目前，对多肽类抗微生物药物的研制受到了日益广泛的重视。

许多两栖动物被广泛应用在传统中药和民族药物中，如中华蟾蜍Bufogargarizans和滇蛙Rana pleuraden等。近年来的研究表明，这些两栖类动物的皮肤分泌物具有广泛的药理活性，如抗微生物、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、创伤修复、镇痛作用等。目前，从两栖动物皮肤中筛选一些药理活性单体化合物是新药发明的热点。据国内外文献报道，已从各种生物来源分离得到不同的活性多肽，而且有些已进入临床阶段。虽然我国对两栖动物应用有着悠久的历史，但是都是整体入药，对其活性成分和药理性质的研究比较薄弱。树蛙Polypedates puerensis主要分布于四川、云南省，是我国特色资源动物之一,其皮肤分泌物中的活性物质成分尚未见报道。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种新的具有广谱抗微生物(包括革兰氏阴、阳性细菌)的树蛙防御肽及其基因和应用。

本发明的树蛙防御肽PopuDef是中国两栖类树蛙防御肽基因编码的一种环状多肽，分子量4636.12道尔顿，等电点4.75，多肽全序列一级结构(氨基酸序列SEQ ID NO:1)为：

Gly Ala Ser Pro Ala Leu Trp Gly Cys Asp Ser Phe Leu Gly Tyr Cys Arg Ile AlaCys Phe Ala His Glu Ala Ser Val Gly Gln Lys Asp Cys Ala Glu Gly Met Ile Cys CysLeu Pro Asn Val Phe(GASPALWGCDSFLGYCRIACFAHEASVGQKDCAEGMICC LPNVF)，其第九位半胱氨酸和第三十八位半胱氨酸组成分子内二硫键，第十六位半胱氨酸和第三十二位半胱氨酸组成分子内二硫键，其第二十位半胱氨酸和第三十九位半胱氨酸组成分子内二硫键。

编码树蛙防御肽的基因由401个核苷酸(SEQ ID NO:2)组成，其自5’端至3’端序列为:

编码树蛙防御肽的基因，其成熟树蛙防御肽为SEQ ID NO:2的第67-198位核苷酸，其氨基酸序列(SEQ ID NO:3)为：

本发明的树蛙防御肽作为制备病原微生物感染疾病的治疗药物的应用。

本发明的有益效果在于：提供一种新的具有广谱抗微生物(包括革兰氏阴、阳性细菌)的树蛙防御肽，该树蛙防御肽具有显著的抑制细菌生长的作用，能够作为制备病原微生物感染疾病的治疗药物的应用。

附图说明：

附图显示树蛙防御肽PopuDef的分离纯化。箭头所示为纯化的防御肽PopuDef。

具体实施方式：

下面结合附图对本发明作详细说明。

1、树蛙防御肽PopuDef的制备和氨基酸序列测定：

(1)、树蛙皮肤匀浆：

活体树蛙用水清洗干净，剥离皮肤组织，称重，取2g皮肤组织，加入10ml0.1M pH6.0的磷酸盐缓冲溶液(PBS)，于20ml玻璃匀浆器中匀浆。匀浆液于4℃条件下12000rpm离心15分钟，上清于-80℃保存。

(2)、树蛙防御肽PopuDef的分离纯化：

以上述收集的上清液为原料，按照下述程序纯化防御肽PopuDef，分离纯化的每个组分都进行抗菌活性检测，具体方法如下：

A.采用美国Millipore公司的超滤管将上清液中分子量大于10kDa的物质去除。上清液加入超滤管(10kDa，15ml)中进行第一次离心(3000×g，40分钟)，收集滤液，再进行第二次离心(3000×g，10分钟)，收集滤液，再进行第三次离心(3000×g，5分钟)，收集剩余的滤液，于-20℃保存。

B.上述的滤液采用C₁₈反相高压液相色谱柱进行进一步纯化，该步骤在美国Waters公司的2795四元梯度高效液相色谱仪中进行，以0-60％乙腈线性梯度进行洗脱，流速为0.7ml/min,如图1所示，得到纯化的树蛙防御肽PopuDef。

(3)、树蛙防御肽PopuDef的氨基酸测定

纯化的树蛙防御肽PopuDef运用Edman降解法进行测序，该步骤在美国ABI公司的Proscise^TM491蛋白质测序仪中进行。氨基酸测序结果表明树蛙防御肽的全序列一级结构为：GASPALWGCDSFLGYCRIACFAHEASVGQKDCAEGMICC LPNVF。

2、树蛙防御肽PopuDef基因的克隆

(1)、树蛙皮肤总RNA提取：

A.活体树蛙用水清洗干净，放入液氮中速冻10小时，取皮肤组织，称重，取300mg皮肤组织，加入3ml Trizol溶液，于20ml玻璃匀浆器中匀浆30分钟。

B.加入等体积酚/氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃除沉淀。

C.上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，4℃，12000rpm，离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为树蛙皮肤总RNA。

(2)、树蛙皮肤mRNA的纯化：

树蛙皮肤mRNA分离纯化采用美国PROMEGA公司的mRNAIsolation Systems试剂盒。

A.提取的树蛙皮肤总RNA溶于500μl DEPC水中，放入65℃水浴10分钟，加人3μl的Oligo(dT)探针和13μl20×SSC溶液，混匀，放置室温冷却，称为A液。

B.磁珠(SA-PMP)的洗涤：将磁珠轻弹混匀，至磁力架吸附30秒，弃上清，加0.5×SSC0.3m1，至磁力架吸附30秒，最后加0.1ml0.5×SSC悬浮，称之为B液。

C.将A液加入B液中，室温放置10分钟，至磁力架吸附30秒，弃上清，用0.1×SSC洗涤4次，最后弃上清，加0.L ml DEPC水悬浮，至磁力架上吸附30秒，将上清移至新的试管，再加入0.15m1DEPC水重新悬浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述试管，则上清中为纯化的树蛙皮肤mRNA。

D.加入1/10体积3M乙酸钠，pH5.2，等体积异丙醇，于-70℃放置30分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀溶解于10μl DEPC水中。

(3)树蛙皮肤cDNA文库构建：

采用CLONTECH公司Creator^TM SMART ^TM cDNA Library Construction Kit质粒cDNA文库构建试剂盒。

A.cDNA第一链合成(mRNA反转录)：

在0.5ml无菌的离心管加入1μl树蛙皮肤mRNA、1μl SMART IV寡聚核苷酸、1μl CDS III/3’PCR引物，加2μl去离子水使总体积达到5μl。混匀离心管中的试剂并以12000rpm离心15秒，72℃保温2分钟。将离心管在冰上孵育2分钟。在离心管中加入以下试剂2.0μl5×第一链缓冲、1.0μl20mM二硫苏糖醇、1.0μl10mM dNTP混合物、1.0μl PowerScript反转录酶。混合离心管中试剂并以12000rpm离心15秒，在42℃保温1小时。将离心管置于冰上中止第一链的合成。从离心管取2μl所合成的cDNA第一链备用。

B.采用长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法扩增第二链

95℃预热PCR仪，将2μl cDNA第一链(mRNA反转录)、80μl去离子水、10μl10×Advantage2PCR缓冲、2μl50×dNTP混合物、2μl5’PCR引物、2μl CDS III/3’PCR引物以及2μl大肠杆菌聚合酶离心管进行反应。在PCR仪中按以下程序扩增：95℃，20秒钟；22个循环(95℃，5秒钟；68℃，6分钟)。循环结束后，将离心管中合成的cDNA双链进行抽提。

C.PCR产物用PROMEGA公司的SV Gel and PCR Clean-UpSystem试剂盒进行抽提回收，步骤如下：

将通过PCR得到的cDNA双链加入等体积的膜结合缓冲颠倒混匀，然后将混和液转入离心纯化柱，室温静置5分钟，使DNA充分与硅胶膜结合。12000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。加入700μl的洗脱液(含乙醇)于离心纯化柱中，以12000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。重复步骤2。12000rpm离心5分钟，将离心纯化柱置于新的离心管中。加入30μl超纯水，在室温下静置5分钟。12000rpm离心30秒，管底溶液即为所纯化过的cDNA双链。

D.大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备：

挑取单个DH5α菌落，接种于3ml不含氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1:100再接种于50mlLB培养液中，37℃振荡2小时。当OD₆₀₀值达到0.35时，收获细菌培养物。将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50m1聚丙烯管中，在冰上方置10分钟，使培养物冷却至0℃。于4℃以4100rpm离心10分钟，回收细胞。倒出培养液，将管倒置l min以使最后的痕量培养液流尽。每50ml初始培养液且30ml预冷的0.1mol/LCaCl₂-MgCl₂溶液(80mmol/L MgCl₂,20mmol/L CaCl₂)重悬每份细胞沉淀。

于4℃以4100rpm离心10分钟，回收细胞。倒出培养液，将管倒置1分钟以使最后的痕量培养液流尽。每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl₂重悬每份细胞沉淀，分装后备用。

E.酶切、连接以及连接产物的转化：

在微量离心管中加入1μl Takara pMD18-T载体、4μl树蛙cDNA双链溶液，全量为5μl。加入5μl(等量)的连接酶缓冲混合物。16℃反应2小时。全量(10μl)加入至100μl DH5α感受态细胞中，冰中放置30分钟。42℃加热90秒钟后，再在冰中放置1分钟。加入37℃温浴过的LB培养基890μl，37℃缓慢振荡培养60分钟。取200μl涂布于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB培养基上37℃培养16小时，形成单菌落。每个LB平皿用5ml LB液体培养基洗涤菌落，加30％甘油冻存。构建的cDNA大约含1×10⁶个单独克隆。

(4)、树蛙防御肽基因克隆筛选：

扩增引物序列为5’ATGAAACTGTTCATCATGCTAC3’，PCR另一扩增引物为CLONTECH公司SMART ^TM cDNA Library Construction Kit中的3’PCRPrimer引物，其序列为5’ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG3’。

PCR反应在如下条件下进行：94℃，30秒钟；52℃，45秒钟；72℃，2分30秒钟，共35个循环。

首先滴定构建的细菌cDNA文库，然后用含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基稀释至适当的细菌浓度(大约5000个细菌/毫升，和30个细菌/毫升分别用于首轮筛选第二轮筛选)，在96孔培养板上按8×8矩阵铺板(共64孔，每孔100μl),37℃过夜培养。按行、列分别合并细菌培养液，有16个样品进行PCR鉴定，交叉阳性孔细菌样品进入第二轮筛选。

(5)、树蛙防御肽基因序列测定和结果：

提取质粒DNA用双脱氧法测定核苷酸序列，使用仪器为美国AppliedBiosystems373A全自动核苷酸序列测定仪，测序引物为BcaBEST^TMSequencing Primer RV-M和BcaBEST^TM Sequencing Primer M13-47，BcaBEST^TM Sequencing Primer RV-M序列：5`GAGCGGATAACAATTTCACACAGG3’，BcaBEST^TM Sequencing Primer M13-47：5’CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC3’。

基因测序结果表明编码树蛙防御肽PopuDef的基因由401个核苷酸(SEQ IDNO:2)组成(GenBank Accession No.KJ809087)，自5’端至3’端序列为:

编码树蛙成熟活性多肽为(SEQ ID NO:2)的第67-198位核苷酸，其氨基酸序列(SEQ ID NO:3)为:

3、树蛙防御肽PopuDef抑制细菌生长的作用：

以Luria-Bertani(LB)液体培养基作为培养介质。供试菌株经LB固体培养基复苏后，用无菌水稀释菌落成每毫升含2×10⁵个细菌的菌液，备用。

测定最小抑菌浓度时，采用二倍稀释法进行抗菌检测。具体方法如下：在0.19ml培养基中加入0.01ml样品作为第一孔，混匀后取0.1ml加入第2孔(已加如0.1ml新鲜培养基)，依次倍比稀释，自第6孔吸出0.1ml弃去，四周各孔系对照，将各孔中加入已校正的菌液(2×10⁵cfu/ml)0.1ml，混匀后放置37℃培养18小时，于600nm波长处测定光吸收。最小抑菌浓度为看不见细菌生长的最低样品浓度。细菌菌株来源于昆明医科大学，此试验重复四次，取平均值，结果如表1。

表1，树蛙防御肽PopuDef抑制细菌生长的作用：

由表1可见，合成的树蛙防御肽PopuDef具有显著的抑制细菌生长的作用。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  昆明医科大学

 

<120>  树蛙防御肽PopuDef及其基因和应用

<130>  1

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  401

<212>  DNA

<213>  Polypedates  puerensis

<400>  1

atgaaactgt tcatcatgct actggtattc ttgggacttg tggccatcac ctggggaaca  60

agtgatggcg cctctcccgc tttgtggggc tgtgacagtt tcctcggtta ttgccgtatt 120

gcctgctttg ctcacgaggc ttcggtaggg cagaaggact gtgctgaggg aatgatttgc 180

tgcctgccca atgttttctg atgcactttg gcatttattg accttggatt ctgtggactt 240

ccttccatga cttaactgtg tgtccatctt gcaatcgaag ataatgatta caagggtgca 300

gaaaccttcg tttgtgcttg cttctggtgg tactaacatt ggaaaaatgg gaataaaact 360

ctgacatgat tatacacaca catgttaaaa aaaaaaaaaa a                     401

 

 

<210>  2

<211>  66

<212>  PRT

<213>  Polypedates  puerensis

 

<400>  2

 

MKLFIMLLVF LGLVAITWGT SDGASPALWG CDSFLGYCRI ACFAHEASVG QKDCAEGMIC 60

 

CLPNVF                                                            66

Claims (4)

1.树蛙防御肽，其特征在于该防御肽是中国两栖类树蛙防御肽基因编码的一种环状多肽，分子量4636.12道尔顿，等电点4.75，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示。

2.编码树蛙防御肽的基因，其特征在于由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列组成。

3.编码树蛙防御肽的基因，其成熟树蛙防御肽为SEQ ID NO:2的第67-198位核苷酸，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3。

4.权利要求1所述的树蛙防御肽，作为制备病原微生物感染疾病的治疗药物的应用。