CN104356216B - 版纳绳蚋防御肽SibaDef及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种吸血昆虫版纳绳蚋防御肽及其基因和应用属于生物医学领域。该多肽分子量4795.23道尔顿，等电点8.94，全序列一级结构ATCDLLSISTPWGSVNHAACAAHCLALNRGFRGGYCSSKAVCTCRK，其第三位半胱氨酸和第三十六位半胱氨酸组成分子内二硫键，第二十位半胱氨酸和第四十二位半胱氨酸组成分子内二硫键，其第二十四位半胱氨酸和第四十四位半胱氨酸组成分子内二硫键。编码版纳绳蚋防御肽的基因由447个核苷酸组成，其中编码成熟版纳绳蚋防御肽为第178‑315位核苷酸。该版纳绳蚋防御肽具有显著的抑制细菌生长的作用，能够作为制备病原微生物感染疾病的治疗药物的应用。

Description

版纳绳蚋防御肽SibaDef及其基因和应用

技术领域：

本发明涉及一种吸血昆虫版纳绳蚋(Simulium bannaense)防御肽SibaDef及其基因和应用，属于生物医学领域。

背景技术：

在当前抗生素的耐药性日益严峻的情况下，多肽类抗微生物(抗菌肽)药物的潜在应用价值吸引了各国研究人员的密切关注。研究表明，抗菌肽能够在低浓度下快速杀灭各种革兰氏阳性和阴性细菌、真菌、寄生虫等病原微生物，而且也能杀死多种肿瘤细胞，抑制病毒的繁殖与扩散。此外，它们还无致畸变作用，无蓄积毒性，不容易产生抗药性。一些临床前期的数据表明，抗菌肽对于局部感染和全身感染都有效，有希望成为新一代抗微生物药物。

昆虫是世界上最大的生物种群，除海洋外，其余所有的生态环境都有昆虫的分布。昆虫并不具有高等动物那样高度专一的免疫系统，即在昆虫体内缺乏T和B淋巴细胞系统,也无免疫球蛋白及补体系统。然而昆虫能在几亿年的自然进化当中仍然占据优势，表明其先天免疫系统是非常强大的。研究表明，昆虫的先天免疫系统能够快速大量合成多种防御肽直接杀灭入侵的病菌，并阻止病菌的继续侵袭。此外，它们还通过参与、调节机体的免疫系统间接发挥各种防御功能。因此，从昆虫来源的抗菌肽中筛选潜在的抗生素替代物是当前学界的研究热点。吸血昆虫版纳绳蚋Simulium bannaense主要分布于云南省西双版纳，其体内的抗菌活性物质成分尚未见公开报道。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种新的具有广谱抗微生物(革兰氏阳性细菌)的版纳绳蚋防御肽及其基因和应用。

本发明的版纳绳蚋防御肽SibaDef是中国吸血昆虫版纳绳蚋防御肽基因编码的一种环状多肽，分子量4795.23道尔顿，等电点8.94，多肽全序列一级结构(氨基酸序列SEQ IDNO:1)为：

(ATCDLLSISTPWGSVNHAACAAHCLALNRGFRGGYCSSKAVCTCRK)，其第三位半胱氨酸和第三十六位半胱氨酸组成分子内二硫键，第二十位半胱氨酸和第四十二位半胱氨酸组成分子内二硫键，其第二十四位半胱氨酸和第四十四位半胱氨酸组成分子内二硫键。

编码版纳绳蚋防御肽前体的基因由447个核苷酸(SEQ ID NO:2)组成，其自5’端至3’端序列为:

其中第178–315位核苷酸为成熟蚋防御肽SibaDef的编码基因。

本发明的蚋防御肽在制备金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、蜡样芽孢杆菌和藤黄微球菌引起的感染疾病的治疗药物的应用。

本发明的有益效果在于：提供一种新的具有广谱抗微生物(革兰氏阳性细菌)的蚋防御肽，该蚋防御肽具有显著的抑制细菌生长的作用，能够在制备金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、蜡样芽孢杆菌和藤黄微球菌引起的感染疾病的治疗药物中应用。

附图说明：

图1(图1-a、图1-b)显示版纳绳蚋防御肽SibaDef的分离纯化。图中：A. 通过C₄反相高压液相色谱柱进行分离纯化，箭头所示为含有抗菌活性的组分；B.通过C₁₈反相高压液相色谱柱对含有抗菌活性的组分继续进行分离纯化，箭头所示为纯化的防御肽SibaDef。

具体实施方式：

下面结合附图对本发明作详细说明。

1、版纳绳蚋防御肽SibaDef的制备和氨基酸序列测定：

(1)、版纳绳蚋唾液腺匀浆：

解剖显微镜下剥离版纳绳蚋唾液腺组织，累积1g唾液腺组织样品，加入10ml 0.1MpH 6.0的磷酸盐缓冲溶液(PBS)，于20ml玻璃匀浆器中匀浆。匀浆液于4℃条件下12000rpm离心15分钟，上清于-80℃保存。

(2)、版纳绳蚋防御肽SibaDef的分离纯化：

以上述收集的上清液为原料，按照下述程序纯化防御肽SibaDef，分离纯化的每个组分都进行抗菌活性检测，具体方法如下：

A.采用美国Millipore公司的超滤管将上清液中分子量大于10kDa的物质去除。上清液加入超滤管(10kDa，15ml)中进行第一次离心(3000×g，40分钟)，收集滤液，再进行第二次离心(3000×g，10分钟)，收集滤液，再进行第三次离心(3000×g，5分钟)，收集剩余的滤液，于-20℃保存。

B.上述的滤液采用C₄反相高压液相色谱柱进行进一步纯化，该步骤在美国Waters公司的2795四元梯度高效液相色谱仪中进行，以0-60％乙腈线性梯度进行洗脱，流速为0.7ml/min,收集有抗菌活性的组分，如图1a箭头所示。

C.将收集的有抗菌活性的组分，通过C₁₈反相高压液相色谱柱进行进一步纯化，最后得到纯化的版纳绳蚋防御肽SibaDef，如图1b箭头所示。

(3)、版纳绳蚋防御肽SibaDef的氨基酸测定

纯化的版纳绳蚋防御肽SibaDef运用Edman降解法进行测序，该步骤在美国ABI公司的Proscise ^TM 491蛋白质测序仪中进行。氨基酸测序结果表明版纳绳蚋防御肽的全序列一级结构为：ATCDLLSISTPWGSVNHAACAAHCLALNRGFRGGYCSSKAVCTCRK。

2、版纳绳蚋防御肽SibaDef基因的克隆

(1)、版纳绳蚋唾液腺总RNA提取：

A.版纳绳蚋于解剖显微镜下取唾液腺组织，累积300mg样品，加入3ml Trizol溶液，于20ml玻璃匀浆器中匀浆30分钟。

B.加入等体积酚/氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃除沉淀。

C.上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，4℃，12000rpm，离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为版纳绳蚋唾液腺总RNA。

(2)、版纳绳蚋唾液腺mRNA的纯化：

版纳绳蚋唾液腺mRNA分离纯化采用美国PROMEGA公司的mRNAIsolation Systems试剂盒。

A.提取的版纳绳蚋唾液腺总RNA溶于500μl DEPC水中，放入65℃水浴10分钟，加人3μl的Oligo(dT)探针和13μl 20×SSC溶液，混匀，放置室温冷却，称为A液。

B.磁珠(SA-PMP)的洗涤：将磁珠轻弹混匀，至磁力架吸附30秒，弃上清，加0.5×SSC 0.3m1，至磁力架吸附30秒，最后加0.1ml 0.5×SSC悬浮，称之为B液。

C.将A液加入B液中，室温放置10分钟，至磁力架吸附30秒，弃上清，用0.1×SSC洗涤4次，最后弃上清，加0.L ml DEPC水悬浮，至磁力架上吸附30秒，将上清移至新的试管，再加入0.15m1DEPC水重新悬浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述试管，则上清中为纯化的版纳绳蚋唾液腺mRNA。

D.加入1/10体积3M乙酸钠，pH5.2，等体积异丙醇，于-70℃放置30分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀溶解于10μl DEPC水中。

(3)版纳绳蚋唾液腺cDNA文库构建：

采用CLONTECH公司Creator^TM SMART ^TM cDNA Library Construction Kit质粒cDNA文库构建试剂盒。

A.cDNA第一链合成(mRNA反转录)：

在0.5ml无菌的离心管加入1μl版纳绳蚋唾液腺mRNA、1μl SMART IV寡聚核苷酸、1μl CDS III/3’PCR引物，加2μl去离子水使总体积达到5μl。

混匀离心管中的试剂并以12000rpm离心15秒，72℃保温2分钟。将离心管在冰上孵育2分钟。在离心管中加入以下试剂2.0μl 5×第一链缓冲、1.0μl 20mM二硫苏糖醇、1.0μl10mM dNTP混合物、1.0μl PowerScript反转录酶。混合离心管中试剂并以12000rpm离心15秒，在42℃保温1小时。将离心管置于冰上中止第一链的合成。从离心管取2μl所合成的cDNA第一链备用。

B.采用长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法扩增第二链

95℃预热PCR仪，将2μl cDNA第一链(mRNA反转录)、80μl去离子水、10μl 10×Advantage 2PCR缓冲、2μl 50×dNTP混合物、2μl 5’PCR引物、2μl CDS III/3’PCR引物以及2μl大肠杆菌聚合酶离心管进行反应。在PCR仪中按以下程序扩增：95℃，20秒钟；22个循环(95℃，5秒钟；68℃，6分钟)。循环结束后，将离心管中合成的cDNA双链进行抽提。

C.PCR产物用PROMEGA公司的SV Gel and PCR Clean-Up System试剂盒进行抽提回收，步骤如下：

将通过PCR得到的cDNA双链加入等体积的膜结合缓冲颠倒混匀，然后将混和液转入离心纯化柱，室温静置5分钟，使DNA充分与硅胶膜结合。12000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。加入700μl的洗脱液(含乙醇)于离心纯化柱中，以12000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。重复步骤2。12000rpm离心5分钟，将离心纯化柱置于新的离心管中。加入30μl超纯水，在室温下静置5分钟。12000rpm离心30秒，管底溶液即为所纯化过的cDNA双链。

D.大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备：

挑取单个DH5α菌落，接种于3ml不含氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1:100再接种于50mlLB培养液中，37℃振荡2小时。当OD₆₀₀值达到0.35时，收获细菌培养 物。将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50m1聚丙烯管中，在冰上方置10分钟，使培养物冷却至0℃。于4℃以4100rpm离心10分钟，回收细胞。倒出培养液，将管倒置l min以使最后的痕量培养液流尽。每50ml初始培养液且30ml预冷的0.1mol/LCaCl₂-MgCl₂溶液(80mmol/L MgCl₂,20mmol/L CaCl₂)重悬每份细胞沉淀。

于4℃以4100rpm离心10分钟，回收细胞。倒出培养液，将管倒置l分钟以使最后的痕量培养液流尽。每50m1初始培养物用2m1用冰预冷的0.1mol/L CaCl₂重悬每份细胞沉淀，分装后备用。

E.酶切、连接以及连接产物的转化：

在微量离心管中加入1μl Takara pMD18-T载体、4μl版纳绳蚋cDNA双链溶液，全量为5μl。加入5μl(等量)的连接酶缓冲混合物。16℃反应2小时。全量(10μl)加入至100μl DH5α感受态细胞中，冰中放置30分钟。42℃加热90秒钟后，再在冰中放置1分钟。加入37℃温浴过的LB培养基890μl，37℃缓慢振荡培养60分钟。取200μl涂布于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB培养基上37℃培养16小时，形成单菌落。每个LB平皿用5ml LB液体培养基洗涤菌落，加30％甘油冻存。构建的cDNA大约含1×10⁶个单独克隆。

(4)、版纳绳蚋防御肽基因克隆筛选：

扩增引物序列为5’ATGCTGAAGT TTATTTCTCT AG 3’，PCR另一扩增引物为CLONTECH公司SMART ^TM cDNA Library Construction Kit中的3’PCR Primer引物，其序列为5’ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG 3’。

PCR反应在如下条件下进行：94℃，30秒钟；52℃，45秒钟；72℃，2分30秒钟，共35个循环。

首先滴定构建的细菌cDNA文库，然后用含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基稀释至适当的细菌浓度(大约5000个细菌/毫升，和30个细菌/毫升分别用于首轮筛选第二轮筛选)，在96孔培养板上按8×8矩阵铺板(共64孔，每孔100μl),37℃过夜培养。按行、列分别合并细菌培养液，有16个样品进行PCR鉴定，交叉阳性孔细菌样品进入第二轮筛选。

(5)、版纳绳蚋防御肽基因序列测定和结果：

提取质粒DNA用双脱氧法测定核苷酸序列，使用仪器为美国AppliedBiosystems373A全自动核苷酸序列测定仪，测序引物为BcaBEST^TMSequencing Primer RV-M和BcaBEST^TM Sequencing Primer M13-47，BcaBEST^TM Sequencing Primer RV-M序列：5`GAGCGGATAACAATTTCACACAGG 3’，BcaBEST^TM Sequencing Primer M13-47：5’CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3’。

基因测序结果表明编码版纳绳蚋防御肽SibaDef前体的基因由447个核苷酸(SEQID NO:2)组成(GenBank Accession No.KJ842485)，自5’端至3’端序列为:

其中第178–315位核苷酸为成熟蚋防御肽SibaDef的编码基因。

3、版纳绳蚋防御肽SibaDef抑制细菌生长的作用：

以Luria-Bertani(LB)液体培养基作为培养介质。供试菌株经LB固体培养基复苏后，用无菌水稀释菌落成每毫升含2×10⁵个细菌的菌液，备用。

测定最小抑菌浓度时，采用二倍稀释法进行抗菌检测。具体方法如下：在0.19ml培养基中加入0.01ml样品作为第一孔，混匀后取0.1ml加入第2孔(已加如0.1ml新鲜培养基)，依次倍比稀释，自第6孔吸出0.1ml弃去，四周各孔系对照，将各孔中加入已校正的菌液(2×10⁵cfu/ml)0.1ml，混匀后放置37℃培养18小时，于600nm波长处测定光吸收。最小抑菌浓度为看不见细菌生长的最低样品浓度。细菌菌株来源于昆明医科大学，此试验重复四次，取平均值，结果如表1。

表1，版纳绳蚋防御肽SibaDef抑制细菌生长的作用：

由表1可见，版纳绳蚋防御肽SibaDef具有显著的抑制革兰氏阳性细菌生长的作用。

SEQUENCE LISTING

<110> 昆明医科大学

<120> 版纳绳蚋防御肽SibaDef及其基因和应用

<130> 2016

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 46

<212> PRT

<213> Simulium bannaense

<400> 1

Ala Thr Cys Asp Leu Leu Ser Ile Ser Thr Pro Trp Gly Ser Val Asn

1 5 10 15

His Ala Ala Cys Ala Ala His Cys Leu Ala Leu Asn Arg Gly Phe Arg

20 25 30

Gly Gly Tyr Cys Ser Ser Lys Ala Val Cys Thr Cys Arg Lys

35 40 45

<210> 2

<211> 447

<212> DNA

<213> Simulium bannaense

<400> 2

atgctgaagt ttatttctct aggtcttctc attgtagcac tttgcttttt tggtggtatc 60

atgagttttc cggccgaatt tgaacaggct caaagtgaag aaaatttcga acctgctgat 120

gtgctgccgt tttcagaaaa cgaaccccaa gaaaacgaac atcaccgatt cagaagagca 180

acctgcgacc tgttgagcat ttccacacca tggggcagtg tgaaccatgc ggcctgtgca 240

gctcattgtt tggcattaaa tcgtggtttc cgaggtggct attgcagtag caaagctgtg 300

tgcacctgta ggaaataatt tctgtccata gtaaaatctt atttactttg aaccgattcg 360

ggcggtggat ctgactgatg tacgatttga ataaattgga caaattcaat ataaagcaga 420

aaatgaatta caacaaaaaa aaaaaaa 447

Claims (3)

1.一种版纳绳蚋防御肽SibaDef，其特征在于该防御肽是中国吸血昆虫版纳绳蚋防御肽基因编码的一种环状多肽，分子量4795.23道尔顿，等电点8.94，其氨基酸序列为SEQ IDNO:1所示。

2.编码版纳绳蚋防御肽SibaDef前体的基因，其特征在于该前体基因GenBankaccession No.KJ842485由447个核苷酸组成，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示；其中第178–315位核苷酸为成熟蚋防御肽SibaDef的编码基因。

3.权利要求1所述的版纳绳蚋防御肽在制备金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、蜡样芽孢杆菌和藤黄微球菌引起的感染疾病的治疗药物中的应用。