CN104119434B - 黑眶蟾蜍抗菌肽及其基因和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黑眶蟾蜍抗菌肽及其基因，该黑眶蟾蜍抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，编码黑眶蟾蜍抗菌肽的基因核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，通过固相多肽合成手段获得的黑眶蟾蜍抗菌肽对多种微生物包括临床分离的多药物耐受病原体具有强大的抗菌活性，并且抗菌作用迅速，无明显溶血活性。黑眶蟾蜍抗菌肽具有体外生产方便、抗菌作用强大、迅速和安全等特点，可做为新型抗菌药物进行应用。
Description
技术领域
本发明提供一种黑眶蟾蜍抗菌肽基因获取、合成及应用，属于生物医学技术领域。
背景技术
黑眶蟾蜍，无尾目，蟾蜍科，蟾蜍属，是传统蟾蜍类中药材（蟾酥、干蟾、蟾皮和蟾衣）的主要来源之一。近年，大量的研究表明蟾酥药理活性谱极广，具有抗肿瘤、强心、升压、兴奋呼吸、镇咳平喘、利尿、兴奋平滑肌、抗血小板聚集、抗炎、增强免疫力及局麻药等作用。20 世纪80 年代蟾酥应用于临床，用于治疗恶性肿瘤、各种感染性疾病、慢性肝炎、骨髓炎、周围性面神经麻痹、止痛麻醉等。目前对蟾蜍类药物活性成分的研究主要集中在小分子化合物上，主要发现的有蟾蜍甾烯、环氧蟾蜍内酯类、蟾毒色胺类（bufotenines）和甾醇类等。
有实验表明蟾酥对金黄色葡萄球菌和甲型溶血性链球菌感染的家兔，具有明显的治疗效果；且抑菌效果迅速，对一些抗生素不敏感或耐受的化脓性感染病原体亦有抑制效果，但其物质基础不甚清晰。2010年，研究人员对黑眶蟾蜍皮肤分泌物进行了初步的分离纯化，得到一种耐热、pH稳定和抗菌谱广的抗菌物质。该抗菌物质经胰蛋白酶水解后，抑菌活性完全丧失，说明该抑菌活性成分为蛋白多肽类物质。但该蛋白多肽成分的序列以及具体功能现今未明。发明人通过基因工程手段获得了黑眶蟾蜍抗菌肽的基因序列，并对其进行了多肽合成与性质研究。
发明人将本发明所述的黑眶蟾蜍抗菌肽氨基酸全序列及其编码基因分别对蛋白质数据库和基因数据库进行了比对搜索，均未发现有任何相同序列信息。
发明内容
本发明的目的在于提供一种黑眶蟾蜍抗菌肽，该黑眶蟾蜍抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其是一种单链多肽，分子量4161.268道尔顿，等电点11.11。
本发明另一目的是提供一种编码所述黑眶蟾蜍抗菌肽的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
黑眶蟾蜍抗菌肽基因的克隆方法如下:
黑眶蟾蜍皮肤总RNA提取、反转录及设计引物并利用PCR方法筛选黑眶蟾蜍抗菌肽基因，其中正向扩增引物长度为24个核苷酸，其序列如SEQ ID NO：3所示，反向扩增引物长度为23个核苷酸，其序列如SEQ ID NO：4所示；所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定，基因测序结果表明编码黑眶蟾蜍抗菌肽的基因由495个核苷酸组成，自5’端至3’端序列为：
atgaggagct ggaggctgtc tctgctgctg gtctctgcag tcacattaca cggctgtctc 60
tctgaccctg cagagcctga ggtccaagat ggaagatcta tagaagatgt catcgacctc 120
tacaaccaga gggagggggt cacatactta tataaatccc tggaccagct gccccctgtt 180
ccaatggagg aggatgagaa tccgaacaga agaggcttta tcatgaaaga gaccgtgtgc 240
ctcaaatccg agaatcctga tttaacccag tgtgatttca agcctgacgg agatgtgaag 300
atctgttctc tggatttggg ggatgaggat cctgaggata tcatgtgctt cagtctgaac 360
aaggaggtcc gtatgaagcg gtccagcaga aggaaaccat gcaaggggtg gctctgcaag 420
ctgaagctaa gaggaggtta tactcttatc ggcagtgcta caaacctaaa tagacctacc 480
tacgtgaggg cataa 495
编码黑眶蟾蜍成熟抗菌肽为第382–492位核苷酸，其氨基酸序列为：
Ser Ser Arg Arg Lys Pro Cys Lys Gly Trp Leu Cys Lys Leu Lys Leu
1 5 10 15
Arg Gly Gly Tyr Thr Leu Ile Gly Ser Ala Thr Asn Leu Asn Arg Pro
20 25 30
Thr Tyr Val Arg Ala
35
黑眶蟾蜍抗菌肽的制备方法为多肽固相合成法，通过HPLC反相C18柱纯化。该抗菌肽具有强大的抗菌活性。
本发明另一目的是将黑眶蟾蜍抗菌肽应用在制备新型抗菌药物中。
本发明中所用黑眶蟾蜍来源于云南省西双版纳州，从农贸市场购得。
本发明的有益效果在于:
由黑眶蟾蜍抗菌肽编码基因推导其氨基酸结构，合成的黑眶蟾蜍抗菌肽具有广谱抗菌活性，尤其对临床多药物耐受病原体仍具有良好的生物活性，且无溶血作用。该黑眶蟾蜍抗菌肽具有结构简单、人工合成方便、抗菌活性强、抗菌谱广和无明显副作用的特点。
本发明提供的黑眶蟾蜍抗菌肽在6 μM-12 μM浓度时可有效抑制多种病原体（包括临床分离的多药物耐受病原体），与微生物接触后15分钟内即可杀灭98%的细菌。
附图说明
图1是本发明中黑眶蟾蜍抗菌肽的杀菌动力学结果示意图，图中Wholehkcath代表黑眶蟾蜍抗菌肽，Control为未加入抗菌肽的阴性对照。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的内容并不局限于此，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂或按常规方法配置的试剂。
实施例1：黑眶蟾蜍抗菌肽基因的克隆
一、黑眶蟾蜍皮肤总RNA提取：
A、活体黑眶蟾蜍用水清洗干净，放入液氮中速冻4小时，取皮肤组织，称重，取300mg皮肤组织，加入10 ml总RNA提取缓冲液 (Trizol溶液，美国Invitrogen公司产品)，于20ml玻璃匀浆器中匀浆10分钟；
B、加入等体积酚/氯仿溶液，振荡混匀，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，吸取上层水相液体；
C、上清加入1/2体积的异丙醇，室温放置10分钟，4℃下7500g离心10分钟，沉淀用75%乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为黑眶蟾蜍皮肤总RNA 。
二、黑眶蟾蜍皮肤cDNA文库合成
采用CLONTECH公司 CreatorTM SMARTTM cDNA Library Construction Kit cDNA文库构建试剂盒，参照试剂盒说明书方法操作如下：
A、cDNA第一链合成 ( mRNA 反转录 )：
1、在0.5 ml 无菌的离心管加入1 μl 黑眶蟾蜍皮肤总RNA、1 μl SMART IV 寡聚核苷酸、1 μl CDS III/3’ PCR引物与2 μl 去离子水；
2、混匀离心管中的试剂并短暂离心，72℃ 保温 2 分钟；
3、将离心管在冰上孵育2分钟；
4、在离心管中加入2.0 μl 5×第一链缓冲液、1.0 μl 20 mM二硫苏糖醇、1.0μl10 mM dNTP 混合物、1.0μl PowerScript 反转录酶，混匀；
5、短暂离心，在42℃ 保温 1 小时；
6、将离心管置于冰上中止第一链的合成；
7、移取2 μl所合成的cDNA第一链备用；
B、采用长末端聚合酶链式反应 (LD- PCR )方法扩增第二链
1、95℃预热PCR仪；
2、将2 μl cDNA第一链产物、80 μl 去离子水、10 μl 10×Advantage 2 PCR 缓冲、2 μl 50×dNTP 混合物、2 μl 5’PCR引物、2 μl CDS III/3’ PCR引物以及2 μl DNA聚合酶混合后，进行PCR扩增反应；
3、在PCR仪中按以下程序扩增：
(1) 预变性
95℃ 20秒钟
(2) 22个循环：
95℃ 5 秒钟
68℃ 6 分钟
4、循环结束后，将离心管中合成的 cDNA 双链进行后续过程。
三、黑眶蟾蜍抗菌肽编码基因的扩增
1、95℃预热PCR仪；
2、将2 μl cDNA双链（上述产物）、75.5 μl 去离子水、10 μl PCR 缓冲液、8 μldNTP混合物（各2.5 μM）、2 μl 正向扩增引物、2 μl 反向扩增引物以及0.5 μl DNA聚合酶于离心管中进行反应。正向扩增引物长度为24个核苷酸，其序列为5’–atgaggagctggaggctgtctctg-3’，反向扩增引物长度为23个核苷酸，序列为5’-ttatgccctcacgtaggtaggtc -3’。
3、在PCR仪中按以下程序扩增：
(1) 预变性
95℃ 5分钟
(2) 25个循环：
95℃ 30 秒钟
56℃ 40秒钟
72℃ 30秒钟
(3) 后扩增
72℃ 5分钟
4、 循环结束后，将PCR 产物用TIANGEN 公司的DNA产物纯化试剂盒进行抽提回收，步骤如下：
(1) 将PCR产物与等体积的膜结合缓冲颠倒混匀，然后将其转入离心纯化柱，室温静置5分钟，使DNA充分与硅胶膜结合。12000 rpm 离心1分钟，倒掉收集管中的废液；
(2) 加入700 µl的漂洗液（含乙醇）于离心纯化柱中，12000 rpm 离心1分钟，倒掉收集管中的废液；
(3) 重复步骤2；
(4) 12000 rpm 离心3分钟；
(5) 将离心纯化柱置于新的离心管中；
(6) 加入30 µl洗脱缓冲液，在室温下静置5分钟；
(7) 12000 rpm离心1分钟，管底溶液即为纯化过的黑眶蟾蜍抗菌肽编码基因PCR产物。
四、大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备
1、挑取单个DH5α菌落，接种于3 m1不含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1:100再接种于50 m1 LB培养基中，37℃振荡约2小时。当OD600值达到0.35时，收获细菌培养物；
2、将细菌转移到一个50 m1预冷的无菌聚丙烯管中，冰上放置10 min，使培养物冷却；
3、于4℃下8000 g离心10 min，吸出培养液；
4、每50 ml初始培养液用30 ml预冷的0.1 M CaCl2-MgCl2溶液(80 mM MgCl2，20mM CaCl2)重悬细胞沉淀；
5、于4℃下8000 g离心10 min，吸出上清液，并将管倒置l min以使残留的液体流尽；
6、每50 m1初始培养物用2 m1预冷的0.1 M CaCl2溶液重悬细胞沉淀，分装后备用。
五、连接及连接产物的转化
1、在微量离心管中加入1 μl Takara pMD19-T simple载体、4 μl黑眶蟾蜍抗菌肽编码基因PCR产物及5 μl的连接酶缓冲混合物；
2、16℃反应3 小时；
3、全量（10 μl）加入至100 μl DH5α感受态细胞中，冰中放置30分钟；
4、42℃加热90秒钟后，再在冰中放置1分钟；
5、加入37℃温浴过的LB培养基890 μl，37℃缓慢振荡培养60分钟；
6、取200 μl涂布于含有X-Gal、IPTG、氨苄青霉素的LB培养基上，37℃培养16小时以形成单菌落。
六、黑眶蟾蜍抗菌肽编码基因克隆筛选及鉴定
挑取上述单菌落于含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃缓慢振荡培养4小时，进行PCR扩增。扩增引物及扩增条件同前述黑眶蟾蜍抗菌肽编码基因的扩增；将经PCR确证的阳性克隆进行质粒提取后，以美国Applied Biosystems3730A全自动核苷酸序列测定仪进行核苷酸序列的测定；测序引物为BcaBESTTM Sequencing Primer M13-47（5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC -3’），基因测序结果自5’端至3’端序列如SEQ ID NO：1所示。
黑眶蟾蜍抗菌肽基因核苷酸序列长度为495个碱基，序列类型：核酸，链数：单链，拓扑学：直链状，序列种类：cDNA，来源：黑眶蟾蜍皮肤。
编码黑眶蟾蜍成熟抗菌肽为第382–492位，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。其中包含两个半胱氨酸残基，形成一对二硫键。
实施例2：黑眶蟾蜍抗菌肽的应用
一、黑眶蟾蜍抗菌肽的制备方法
根据编码黑眶蟾蜍抗菌肽的基因推导出黑眶蟾蜍抗菌肽的氨基酸序列，用自动多肽合成仪合成其全序列，通过HPLC反相C18柱层析脱盐、纯化。
二、黑眶蟾蜍抗菌肽的质量评价与分子量测定
纯化的黑眶蟾蜍抗菌肽用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，并采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）测定其精确分子量，最后用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构以进行确证。
三、黑眶蟾蜍抗菌肽药理活性检测
1、 抗菌活性检测
采用二倍稀释法进行最小抑制浓度（minimal inhibitory concentration, MIC）的检测，受试菌株为溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、大肠埃希菌（Escherichia coli）、甲型副伤寒沙门氏菌（Salmonella Paratyphi A）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、弗劳地枸橼酸杆菌（Citrobacter freundii）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。
以上菌株接种于LB固体培养基上，37℃培养箱中倒置培养。待菌落长出后，用接种环挑取单菌落转接到LB液体培养基中，37℃培养箱震荡培养至对数生长期。在紫外分光光度计上检测菌液OD600，根据1 OD600=1×109 CFU/ml将菌液用液体LB培养基稀释至2×105CFU/ml。在无菌96孔板各孔中预先加入100 μl LB液体培养基，然后在第一孔中加入100 μl稀释到一定浓度的经0.22 µm微孔滤膜过滤除菌的黑眶蟾蜍抗菌肽样品，混匀后取100 μl加入第2孔，依次倍比稀释，从第10孔吸出100 μl弃去，至此二倍浓度梯度样品即制备好，各孔的浓度分别为48 μM、24 μM、12 μM、6 μM和3 μM，同时设立阴性对照和阳性对照。
以肉眼观察未见微生物生长浓度为最小抑制浓度。
结果如表1所示，黑眶蟾蜍抗菌肽对多种受试菌株均具有良好的抗菌活性，最小抑菌浓度不超过12 μM。值得注意的是，敏感菌株中，大肠埃希菌13A10022、大肠埃希菌13U1780和肺炎克雷伯菌13A13361为临床分离的多药物耐受病原体。
表1 黑眶蟾蜍抗菌肽的最小抑菌浓度
2、杀菌动力学测定
为评估黑眶蟾蜍抗菌肽抗菌功能的效率，进行了杀菌动力学检测。根据黑眶蟾蜍抗菌肽的最小抑菌浓度选取大肠埃希菌13A10022菌为指示菌株，将过夜培养的菌稀释到约为1×105 cfu/mL，取适当抗菌肽溶液（终浓度为2×MIC），加入190 μl菌液，对照组加入菌液与等量的MH培养基，立即置于37℃，100 rpm恒温摇床上培养，分别在0、15、120、240 min取培养液稀释涂板检测，37℃恒温培养箱中培养24小时后进行菌落计数。研究过程中，每个时间点三个重复取平均值。
结果如图1所示，黑眶蟾蜍抗菌肽杀菌作用发挥迅速稳定，15分钟内即可杀灭98%的细菌，且随着时间的推移未出现菌落的明显增加。
3、溶血活性检测
人静脉采血，将人静脉血与阿氏液按1:1比例混合置于离心管中，1000 rpm离心5min，生理盐水洗涤至上清液不再呈红色为止。将已进行洗涤的红细胞加生理盐水稀释成107-108个/ml浓度的悬浮液；上述稀释好的红细胞悬浮液与溶解于生理盐水的不同浓度的样品37℃保温30 min，再于1000 rpm离心5 min，上清液于540 nm测吸收值。阴性对照使用生理盐水，阳性对照使用Triton X-100；各孔的黑眶蟾蜍抗菌肽终浓度分别为192 μM、96 μM、48 μM、24 μM、12 μM、6 μM和3 μM；根据测得的吸光度值计算样品的溶血率。
结果显示，在192 μM浓度下（有效浓度的16-32倍），黑眶蟾蜍抗菌肽也未表现出明显的溶血活性（<5%）。
总之，黑眶蟾蜍抗菌肽具有很强的抗菌作用，同时其安全性高，可做为新型抗菌药物进行应用。
SEQUENCE LISTING
<110> 昆明理工大学
<120> 黑眶蟾蜍抗菌肽及其基因和应用
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 495
<212> DNA
<213> Bufo maculatus
<400> 1
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<213> Bufo maculatus
<400> 2
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1 5 10 15
Arg Gly Gly Tyr Thr Leu Ile Gly Ser Ala Thr Asn Leu Asn Arg Pro
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35
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
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<212> DNA
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<400> 4
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<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cgccagggtt ttcccagtca cgac 24
Claims (3)
1.一种黑眶蟾蜍抗菌肽，其特征在于：所述黑眶蟾蜍抗菌肽的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。
2.编码权利要求1所述黑眶蟾蜍抗菌肽的基因，其特征在于：核苷酸序列为SEQ ID NO：1第382-492位核苷酸。
3.权利要求1所述的黑眶蟾蜍抗菌肽在制备抗菌药物中的应用。
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|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |