CN103788192B - 中华大蟾蜍抗菌肽bg-cath6(29)及其编码基因和应用 - Google Patents

中华大蟾蜍抗菌肽bg-cath6(29)及其编码基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6(29)及其编码基因和应用，所述抗菌肽选自序列表SEQ ID No:3所示的氨基酸序列，中华大蟾蜍的抗菌肽BG-CATH6(29)具有显著的抗肿瘤作用，且具有结构简单、人工合成方便、抗菌谱系广的有益特点，它们可以应用于抗微生物感染和抗肿瘤的药物的制备，用于人和动物的治疗。

Description

中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6(29)及其编码基因和应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6(29)及其编码基因和应用。
背景技术
中华大蟾蜍为无尾两栖类蟾蜍属动物，广泛分布于我国大部分地区，是传统中药蟾酥和蟾皮的主要基源动物，有具有解毒散结、消积利水、杀虫消疳的功效。从中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor的干燥皮提取精制而成的水溶性制剂-华蟾素，目前广泛应用于多种中晚期肿瘤，如原发性肝癌、胃癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌等。
抗菌肽（Cathelicidin）是主要在哺乳动物体内发现的一类结构多变的抗微生物肽，因在表达的信号肽与成熟肽间含有一高度保守的cathelin肽段而自成一家族，成熟抗菌肽位于前体分子的C-末端，具有很高的变异性。Cathelicidin和防御素一样，也是宿主免疫防御系统的重要组成部分，具有广谱的抗微生物活性、结合内毒素、抗肿瘤、免疫调节、参与伤口的愈合和血管的发生等多种功能。
发明内容
本发明的目的是提供了一种中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6(29)及其编码基因和应用。中华大蟾蜍的cathelicidin抗菌肽BG-CATH6(29)具有显著的抑制肿瘤细胞的作用，且具有结构简单、人工合成方便、抗菌谱系广的有益特点。可以应用于抗肿瘤细胞制剂的制备，用于人和动物的治疗。
为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：
中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6(29)，其具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
所述抗菌肽BG-CATH6(29)含有一对二硫键，由Cys13与Cys19形成。
含有所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6(29)的蛋白前体，其具有SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列。
所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6(29)的蛋白前体的编码基因，其具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
使用T7启动子序列和SP6启动子序列筛选获得所述编码基因，
所述T7启动子序列为5’-TAATACGACTCTATAGGGA-3’；
所述SP6启动子序列5’-CATACGATTTAGGTGACACTATAG-3’。
本发明还提供了所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6(29)在制备用于抗肿瘤的药物中的应用。
所述抗菌肽BG-CATH6(29)在100μg/ml时，对肝癌肿瘤细胞的抑制效果显著。
所述抗菌肽BG-CATH6(29)在3.125μg/ml时，对乳腺癌细的抑制效果显著。
所述抗菌肽BG-CATH6(29)在3.125μg/ml时，对脑神经瘤细胞的抑制效果显著。
与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明在中华大蟾蜍毒液腺cDNA文库中获得了cathelicidin抗菌肽BG-CATH6(29)。其信号肽及cathelin肽段与其它cathelicidin家族的成员高度保守，而其成熟肽高度变异。中华大蟾蜍cathelicidin抗菌肽显示了广谱的抑制肿瘤细胞活性。将本发明的中华大蟾蜍的cathelicidin抗菌肽BG-CATH6(29)全序列氨基酸序列经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同cathelicidin家族成熟肽。
因此，爬行动物来源的中华大蟾蜍cathelicidin家族抗菌肽及其衍生物具有显著的抑制肿瘤细胞生长的作用，且应用范围广泛。该抗菌肽具有结构简单、人工合成方便、抗菌谱系广的有益特点，可以应用于抗微生物感染和抗肿瘤的药物的制备，用于人和动物的治疗。具有良好的市场应用前景。
附图说明
图1是本发明中华大蟾蜍cathelicidin家族抗菌肽BG-CATH6(29)的cDNA及其蛋白质序列，其中斜体加框序列为推导的中华大蟾蜍cathelicidin家族抗菌肽BG-CATH6(29)的成熟序列。
图2表明本发明抗菌肽BG-CATH6(29)对肝癌细胞HepG2作用。
图3表明本发明抗菌肽BG-CATH6(29)对乳腺癌细胞MCF-7作用。
图4表明本发明抗菌肽BG-CATH6(29)对脑神经瘤细胞Neuro-2a作用。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。
实施例1、中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6(29)的基因克隆
1、总RNA的提取
中华大蟾蜍放于玻璃烧杯中，加入几滴乙醚，收集毒液腺分泌物（也可以直接使用收集好的毒液腺分泌物），立即放入液氮中。称重后取20mg分泌物于液氮中研磨至粉末状。加入10ml总RNA提取缓冲液（Trizol溶液，美国GIBCO/BRL产品），于20ml玻璃匀浆器中匀浆30分钟。然后加入等体积的酚/氯仿溶液，剧烈混匀。室温放置10分钟后，4℃,12000rpm离心10分钟，弃沉淀，上清液加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟。4℃,12000rpm离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为总RNA。
2、mRNA的分离
采用美国Promega公司的mRNA分离纯化试剂盒。取中华大蟾蜍毒腺总RNA500μg溶于500μl经DEPC处理然后高压灭菌的水中，放入65℃水浴10分钟。加入3μl的Oligo（dT）探针和13μl20×SSC溶液，混匀，放置室温冷却，称为A液。磁珠（SA-PMP）的洗涤：将磁珠（随mRNA分离纯化试剂盒）轻轻混匀，至磁力架吸附30秒，弃上清，加0.5×SSC0.3ml，至磁力架吸附30秒，最后加0.1ml0.5×SSC悬浮，称为B液。将A液加入B液中，室温放置10分钟，至磁力架吸附30秒，弃上清，用0.1×SSC洗涤4次。然后弃上清，加0.1ml DEPC水悬浮，至磁力架吸附30秒，将上清移至新的试管中，加入0.15ml DEPC水重新悬浮,至磁力架吸附30秒，将上清移至上述试管,则上清中为纯化的mRNA。加入1/10体积的3M乙酸钠,pH5.2,等体积异戊醇,于-70℃放置30分钟,然后于4℃,12000rpm离心10分钟,弃上清，沉淀溶于10μl DEPC水中。
3、cDNA文库构建
采用美国GIBCO/BRL公司SuperScriptTM质粒cDNA文库构建试剂盒。
3.1、cDNA第一链合成（mRNA反转录）：于1.5ml试管中加入2.0μl NotI引物和7μl mRNA，3μl DEPC水，70℃保温10分钟，立即放入冰浴冷却，然后加入4μl5×第一链合成缓冲液，2μl0.1M DTT，1μl10mM dNTP混合物，再加入1μl SuperScript II反转录酶，于42℃保温1小时后放入冰浴。
3.2、cDNA第二链合成：在第一链合成试管中加入：95μl DEPC水，30μl5×第二链合成缓冲液，3μl10mM dNTP混合物，1μl大肠杆菌DNA连接酶，4μl大肠杆菌DNA多聚酶I，1μl大肠杆菌RNA酶，反应总体积150μl，混匀后于16℃保温2小时；加入2μl T4DNA多聚酶继续保温5分钟。
3.3、DNA的抽提和乙醇沉淀：加入等体积酚/氯仿/异戊醇（25/24/1）混合物抽提，12000rpm离心5分钟，取140μl上层溶液转移到干净的试管中，加入70μl7.5M乙酸铵，0.5ml无水乙醇，12000rpm离心20分钟，弃上清，沉淀用75%乙醇洗一次，晾干。
3.4、Sal I adapter的连接：上述沉淀溶于25μl DEPC水中，加入10μl5×T4DNA连接酶缓冲液，10μl SalI adapter，5μl T4DNA连接酶，反应总体积50μl，于16℃保温16小时。重复上述DNA的抽提和乙醇沉淀过程，沉淀溶解于41μl DEPC水中。
3.5、Not I酶水解：于cDNA溶液中加入5μl React3缓冲液，4μl NotI酶，反应体积50μl，于37℃保温2小时。重复上述DNA的抽提和乙醇沉淀过程，沉淀溶解于100μl TEN缓冲液中。
3.6、DNA分级分离：将cDNA样品过柱（试剂盒中含有）后，去除小于300bp核苷酸的cDNA，cDNA大于300bp的组分合并，体积为200μl，加入5μl酵母tRNA，100μl7.5M乙醇胺，0.6ml无水乙醇，12000rpm离心20分钟，弃上清，沉淀用75%乙醇洗一次，晾干，沉淀溶于20μl TEN缓冲液中。
3.7、合成的cDNA连接到pSPORT1质粒：取10μl溶解于TEN缓冲液中的cDNA，加入4μl5×T4DNA连接酶缓冲液，1μl pSPORT1质粒（Not I-SalI酶水解，50ng），4μl DEPC水，1μl T4DNA连接酶，反应体积20μl，室温3小时。
3.8、大肠杆菌HB101感受态细胞的制备：挑取单个HB101菌落，接种于3ml不含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1：100再接种于50ml LB培养液中，37℃振荡2小时，待菌液在540nm的OD值为0.4时，4℃，2000rpm离心8分钟，弃上清，沉淀用0.1M CaCl2重悬，再以2000rpm离心8分钟，弃上清，沉淀以适量0.1M CaCl2重悬，分装后置冰浴内备用。
3.9、连接产物的转化：取上述连接产物5μl加入100μl感受态细胞，冰浴60分钟，42℃热休克60秒，再置冰浴5分钟，加入无氨苄青霉素的SOC培养基0.9ml，37℃振荡培养1小时，取200μl涂布于含氨苄青霉素的LB平皿上（15cm直径）。37℃培养16小时，每个LB平皿用5ml LB液体培养基洗涤菌落，加10%的甘油于液氮保存的所构建中华大蟾蜍皮肤毒液腺cDNA文库大约含1.8×105个克隆。
4、中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6(29)的基因克隆。采用cDNA文库构建质粒pSPORT1的通用引物T7启动子序列5’-TAATACGACTCTATAGGGA-3’(SEQ ID No:4)以及SP6启动子序列5’-CATACGATTTAGGTGACACTATAG-3’(SEQ ID No:5)鉴定每个克隆的插入片段大小。通过对2000多个插入片段>400bp的克隆的测序，结合核酸及蛋白质的序列比较，得到了一个中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6(29)编码基因，其cDNA由642个核苷酸组成，自5’端至3‘端序列为(SEQ ID NO:1)：
M--R--S--W--W--L--S--
1    AGTGGAGTGCGGAGAGGACATTTCCTCTAAGACAGGCCAAGATGAGGAGCTGGTGGCTGTCT
     LLLVSAVTLHGCLSDTAEPE
63   CTGCTGCTCGTCTCTGCTGTCACATTACACGGCTGTCTCTCTGACACTGCAGAGCCTGAG
     VQDGRSVGDVIDLYNQREGV
123  GTCCAAGATGGAAGATCTGTAGGAGATGTCATCGACCTCTACAACCAGAGGGAGGGGGTC
     TYLYKSLDQLPPVPMEEDEN
183  ACATACTTATATAAATCCCTGGACCAGCTGCCCCCTGTTCCAATGGAGGAAGATGAAAAT
     PNRRGFIIKETVCLKSENPD
243  CCGAACAGAAGAGGCTTTATCATTAAAGAGACGGTGTGCCTCAAATCCGAGAATCCTGAT
     LTQCDFKPDGDVKICSLDLD
301  TTAACCCAGTGTGATTTCAAGCCCGACGGAGATGTGAAGATCTGTTCTCTGGATTTGGAT
     DEDPEDIMCTSLNKNVRIKR
361  GATGAGGATCCTGAGGACATAATGTGCACCAGTCTGAACAAGAATGTCCGTATCAAAAGG
     NGKKKRKKPEKLCMKPGACS
421  AACGGGAAAAAGAAACGTAAGAAGCCTGAAAAATTGTGTATGAAACCAGGAGCATGTAGT
     VIFDASVNE*
481  GTCATCTTTGATGCGTCCGTCAATGAGTGAAACCATCTGTCCTGTTTGTAGCAAAGTCAG
541  AGACGTAGCAGAGCTAGAGACGTAGAGCGCCCACATCATGTAAATTCTGTTTAAGTAATG
601  ATTCGGCCTGATATCCATAAATAAAATGCTCATATCAAAC
其编码的抗菌肽前体蛋白氨基酸序列为(SEQ ID NO:2)：
MRSWWLSLLLVSAVTLHGCLSDTAEPEVQDGRSVGDVIDLYNQREGVTYL      50
YKSLDQLPPVPMEEDENPNRRGFIIKETVCLKSENPDLTQCDFKPDGDVK      100
ICSLDLDDEDPEDIMCTSLNKNVRIKRNGKKKRKKPEKLCMKPGACSVIF      150
DASVNE
从上述前体蛋白的序列分析，根据目前对cathelicidin抗菌肽成熟肽加工位点的知识，即成熟的抗菌肽一般都是从碱性氨基酸富集区（NGKK）切割，结合对信号肽与成熟肽间高度保守的cathelin肽段的分析，可以推论在此前体蛋白中，有两种基本切割方式，其一为Asn127-Glu156为中华大蟾蜍cathelicidin抗菌肽的成熟序列(SEQ ID NO:3NGKKKRKKPEKLCMKPGACSVIFDASVNE)。BG-CATH6(29)理论pI9.70，分子量Mw3206.83Da。
实施例2、中华大蟾蜍皮肤抗菌肽的制备
1、根据编码中华大蟾蜍皮肤抗菌肽cathelicidin抗菌肽的核酸序列推导出成熟抗菌肽的氨基酸序列，衍生物的氨基酸序列以该成熟抗菌肽为模板，结合结构模拟进行决定。分别用全自动多肽合成仪合成它们对应的全序列。并且将Cys13与Cys19环化形成二硫键一对。通过HPLC反相C18柱层析脱盐、纯化。
2、分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardment massspectrometry,FAB-MS)，以甘油：间硝基苄醇：二甲亚砜(1:1:1,V:V:V，体积比)为底物，Cs+作为轰击粒子，电流为1μA，发射电压为25Kv。
3、纯化的中华大蟾蜍抗菌肽用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法，用全自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。
所合成中华大蟾蜍抗菌肽的名称以及氨基酸序列如下所示：
BG-CATH6(29)（SEQ ID NO:3）：NGKKKRKKPEKLCMKPGAC SVIFDASVNE(Asn Gly Lys Lys Lys Arg Lys Lys Pro Glu Lys Leu Cys Met Lys Pro Gly Ala CysSer Val Ile Phe Asp Ala Ser Val Asn Glu)
实施例3
肝癌细胞HepG2培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基。细胞生长至对数生长期时常规消化，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基悬浮，计数细胞密度，调细胞密度至3×104/ml将。细胞接种于96孔板（100μl/孔），贴壁过夜后，加入抗菌肽BG-CATH6(29)分别6.25μg/ml，12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml，并设置对照孔和调零孔。每个剂量设置5个复孔，培养48小时后加入20μl MTT（5g/L)。37度，4小时后，加150μl DMSO，酶标仪检测吸光度A490，并以A630作参考。
实验结果如图2所示，相对细胞存活率/%=实验组A490/对照组A490×100%。设置6个浓度：6.25μg/ml，12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml，对应HepG2细胞存活率/分别为76.35%，72.17%，70.09%，72.91%，65.26%，67.48%。因此，抗菌肽BG-CATH6(29)在100μg/ml时，对肝癌细胞HepG2抑制效果显著。
实施例4
乳腺癌细胞MCF-7培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基。细胞生长至对数生长期时常规消化，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基悬浮，计数细胞密度，调细胞密度至3×104/ml将。细胞接种于96孔板（100μl/孔），贴壁过夜后，加入抗菌肽BG-CATH6(29)分别3.125μg/ml，6.25μg/ml，12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，并设置对照孔和调零孔。每个剂量设置5个复孔，培养48小时后加入20μl MTT（5g/L)。37度，4小时后，加150μl DMSO，酶标仪检测吸光度A490，并以A630作参考。
实验结果如图3所示，相对细胞存活率/%=实验组A490/对照组A490×100%。设置6个浓度：3.125μg/ml，6.25μg/ml，12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，对应MCF-7相对细胞存活率分别为36.15%，41.16%，44.27%，53.58%，64.10%，82.82%。因此可知，抗菌肽BG-CATH6(29)在3.125μg/ml时，对乳腺癌细胞MCF-7抑制效果显著，IC50=14.96μg/ml。
实施例5
脑神经瘤细胞Neuro-2a培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基。细胞生长至对数生长期时常规消化，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基悬浮，计数细胞密度，调细胞密度至3×104/ml将。细胞接种于96孔板（100μl/孔），贴壁过夜后，加入抗菌肽BG-CATH6(29)分别3.125μg/ml，6.25μg/ml，12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，并设置对照孔和调零孔。每个剂量设置5个复孔，培养48小时后加入20μl MTT（5g/L)。37度，4小时后，加150μlDMSO，酶标仪检测吸光度A490，并以A630作参考。
实验结果如图4所示，相对细胞存活率/%=实验组A490/对照组A490×100%。设置6个浓度：3.125μg/ml，6.25μg/ml，12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，对应Neuro-2a相对细胞存活率分别为59.48%，77.22%，77.71%，84.08%，79.76%，73.40%。因此可知，抗菌肽BG-CATH6(29)在3.125μg/ml时，对脑神经瘤细胞Neuro-2a抑制效果显著。
综上所述，本发明通过系列实验获得了中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6(29)，并通过抗肿瘤实验证明其对肿瘤细胞有显著抑制作用，而且应用范围广泛，可以应用于肝癌细胞、乳腺癌细胞和脑神经瘤细胞等，效果显著，可以应用于抗肿瘤药物的制备。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
 
<110>  潍坊医学院
 
<120>  中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6(29)及其编码基因和应用
 
<130> 
 
<160>  5    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  642
<212>  DNA
<213>  中华大蟾蜍
 
<400>  1
agtggagtgc ggagaggaca tttcctctaa gacaggccaa gatgaggagc tggtggctgt     60
 
ctctgctgct cgtctctgct gtcacattac acggctgtct ctctgacact gcagagcctg    120
 
aggtccaaga tggaagatct gtaggagatg tcatcgacct ctacaaccag agggaggggg    180
 
tcacatactt atataaatcc ctggaccagc tgccccctgt tccaatggag gaagatgaaa    240
 
atccgaacag aagaggcttt atcattaaag agacggtgtg cctcaaatcc gagaatcctg    300
 
atttaaccca gtgtgatttc aagcccgacg gagatgtgaa gatctgttct ctggatttgg    360
 
atgatgagga tcctgaggac ataatgtgca ccagtctgaa caagaatgtc cgtatcaaaa    420
 
ggaacgggaa aaagaaacgt aagaagcctg aaaaattgtg tatgaaacca ggagcatgta    480
 
gtgtcatctt tgatgcgtcc gtcaatgagt gaaaccatct gtcctgtttg tagcaaagtc    540
 
agagacgtag cagagctaga gacgtagagc gcccacatca tgtaaattct gtttaagtaa    600
 
tgattcggcc tgatatccat aaataaaatg ctcatatcaa ac                       642
 
 
<210>  2
<211>  156
<212>  PRT
<213>  中华大蟾蜍
 
<400>  2
 
Met Arg Ser Trp Trp Leu Ser Leu Leu Leu Val Ser Ala Val Thr Leu
1                    5                        10                       15     
 
 
His Gly Cys Leu Ser Asp Thr Ala Glu Pro Glu Val Gln Asp Gly Arg
         20                       25                       30         
 
 
Ser Val Gly Asp Val Ile Asp Leu Tyr Asn Gln Arg Glu Gly Val Thr
          35                       40                        45             
 
 
Tyr Leu Tyr Lys Ser Leu Asp Gln Leu Pro Pro Val Pro Met Glu Glu
     50                        55                       60                 
 
 
Asp Glu Asn Pro Asn Arg Arg Gly Phe Ile Ile Lys Glu Thr Val Cys
65                        70                       75                       80 
 
 
Leu Lys Ser Glu Asn Pro Asp Leu Thr Gln Cys Asp Phe Lys Pro Asp
                     85                        90                        95     
 
 
Gly Asp Val Lys Ile Cys Ser Leu Asp Leu Asp Asp Glu Asp Pro Glu
                100                     105                       110        
 
 
Asp Ile Met Cys Thr Ser Leu Asn Lys Asn Val Arg Ile Lys Arg Asn
          115                      120                      125            
 
 
Gly Lys Lys Lys Arg Lys Lys Pro Glu Lys Leu Cys Met Lys Pro Gly
     130                      135                      140                
 
 
Ala Cys Ser Val Ile Phe Asp Ala Ser Val Asn Glu
145                     150                      155    
 
 
<210>  3
<211>  29
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<400>  3
 
Asn Gly Lys Lys Lys Arg Lys Lys Pro Glu Lys Leu Cys Met Lys Pro
1                    5                        10                         15     
 
 
Gly Ala Cys Ser Val Ile Phe Asp Ala Ser Val Asn Glu
                20                       25                 
 
 
<210>  4
<211>  19
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  4
taatacgact ctataggga                                                  19
 
 
<210>  5
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  5
catacgattt aggtgacact atag                                            24
 
 

Claims (8)

1.中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6(29)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
2.根据权利要求1所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6(29)，其特征在于所述抗菌肽BG-CATH6(29)含有一对二硫键，由Cys13与Cys19形成。
3.含有权利要求1所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6(29)的蛋白前体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
4.权利要求3所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6(29)的蛋白前体的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
5.权利要求1所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6(29)在制备用于抗肝癌肿瘤细胞、乳腺癌细胞和脑神经瘤细胞的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6(29) 在制备用于抗肝癌肿瘤细胞、乳腺癌细胞和脑神经瘤细胞的药物中的应用，其特征在于：所述抗菌肽BG-CATH6(29)在100μg/ml时，对肝癌肿瘤细胞的抑制效果显著。
7.根据权利要求5所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6(29) 在制备用于抗肝癌肿瘤细胞、乳腺癌细胞和脑神经瘤细胞的药物中的应用，其特征在于：所述抗菌肽BG-CATH6(29)在3.125μg/ml时，对乳腺癌细胞的抑制效果显著。
8.根据权利要求5所述的中华大蟾蜍抗菌肽BG-CATH6(29) 在制备用于抗肝癌肿瘤细胞、乳腺癌细胞和脑神经瘤细胞的药物中的应用，其特征在于：所述抗菌肽BG-CATH6(29)在3.125μg/ml时，对脑神经瘤细胞的抑制效果显著。
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