CN101824077A - 大绿蛙抗氧化肽antioxidin-RL及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种大绿蛙抗氧化肽antioxidin-RL及其基因和应用，属于生物医学技术领域。大绿蛙抗氧化肽antioxindin-RL是大绿蛙抗氧化肽基因编码的一种单链多肽，分子量1672.98道尔顿，等电点9.31，大绿蛙抗氧化肽antioxidin-RL全序列为：丙氨酸-甲硫氨酸-精氨酸-亮氨酸-苏氨酸-酪氨酸-天冬酰胺-精氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-异亮氨酸-酪氨酸-丙氨酸-苏氨酸。编码的基因由306个核苷酸组成，其中编码成熟肽部分的为第130-171位核苷酸。人工合成的大绿蛙抗氧化肽antioxidin-RL具有显著的抗氧化活性，能作为制备皮肤抗氧化保护和体内自由基清除药物的应用，并且还具有序列简单、合成方便的优点。

Description

大绿蛙抗氧化肽antioxidin-RL及其基因和应用

技术领域：

本发明提供一种大绿蛙(Rana livida)抗氧化肽antioxidin-RL及其基因和应用，属于生物医学技术领域。

背景技术：

在中国的传统中药和民族医药中，许多两栖类动物被作为药材广泛应用，如大蟾蜍(Bufo bufo)，西藏蟾蜍(Bufo tibetanus)，华西雨蛙(Hyla annectans)，棘腹蛙(Rana boulengeri)，斑腿泛树蛙(Polypedates leucomystax)，及花姬蛙(Microhyla pulchra)。其已报道的药理活性和临床疗效包括抗炎、抗肿瘤、局麻、镇痛、免疫调节和心血管调节作用等。由于常以全体入药，再加上其传统炮制方法的局限性，两栖类动物作为传统的中药材其有效成分往往不能很好地发挥作用，从这些传统药物中寻找特定活性的单体化合物是中药现代化的重要内容之一。国外从20世纪70年代就开始大规模从两栖类动物尤其是皮肤中寻找具有特定药理活性的单体化合物，这些单体化合物已经成为新药发明的亮点，如广胸蟾素在治疗Sojgren综合症和类似疾病方面能获得满意的结果；来源于非洲爪蟾的抗菌肽Magainin具有很强的抗菌活性且无溶血活性；蛙啡肽具有强大的镇痛和镇静作用，是吗啡的2000倍且无药物耐受性和成瘾性；分别来自蟾蜍和林蛙皮肤的bofokinin和ranakinin具有舒张血管和降压作用；分别来自北美豹蛙和阿伯蛙的亮精肽和酪精肽具有免疫调节和抗肿瘤作用。

自由基是生物体新陈代谢过程中产生的一类可以单独存在的具有高度氧化活性的带有一个或几个不配对电子的原子团或原子，在体内行使能量传递、免疫和信号传导等作用，为机体维持生命活动所必须，但过多的自由基就会具有破坏性，是引起衰老的重要原因之一，常导致生物体正常生物大分子、细胞和组织的损坏，从而引起多种疾病如心脏病、老年痴呆症、帕金森病和肿瘤等。机体的许多功能如吞噬、解毒、炎症等都会导致体内过多自由基的产生；此外，外界环境中的阳光辐射、空气污染、吸烟、农药等都会使人体产生更多自由基。及时清除体内过量的自由基是机体自我防护体系的重要组成部分。

机体具有强大的抗氧化系统。传统的抗氧化系统分为两类：第一类为基因编码的大分子抗氧化酶类如超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶等；第二类为一些非基因编码的小分子物质如胡萝卜素和维生素E等。近期从滇蛙皮肤中发现的基因编码并可分泌表达的小分子抗氧化多肽(antioxidant peptides)为一类新型的抗氧化系统。本发明涉及的大绿蛙抗氧化肽antioxidin-RL属于此类抗氧化物质，具有快速、强大的自由基清除能力，可以最大限度地保护皮肤，使其尽可能少地受到日照、紫外线等诱导的自由基损伤，对生物医学及化妆品研发具有重要意义。

发明人将本发明的大绿蛙抗氧化肽antioxidin-RL全序列氨基酸结构经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同多肽。发明人将本发明的大绿蛙抗氧化肽编码基因经基因数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同基因。

发明内容：

本发明的目的是基于上述理论研究和现有技术基础，提供一种新的具有强烈的抗氧化活性的大绿蛙抗氧化肽antioxidin-RL及其基因和应用。

为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：

大绿蛙抗氧化肽antioxindin-RL是大绿蛙抗氧化肽基因编码的一种单链多肽，分子量1672.98道尔顿，等电点9.31，大绿蛙抗氧化肽全序列为：丙氨酸-甲硫氨酸-精氨酸-亮氨酸-苏氨酸-酪氨酸-天冬酰胺-精氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-异亮氨酸-酪氨酸-丙氨酸-苏氨酸。

大绿蛙抗氧化肽antioxidin-RL基因的克隆包括：

大绿蛙皮肤总RNA提取，mRNA纯化，mRNA反转录及cDNA文库构建，设计引物，利用PCR方法筛选大绿蛙抗氧化肽基因。扩增引物长度为20个核苷酸，其序列为5’ATGTTCACCATGAAGAAATC 3’，PCR另一扩增引物为CLONTECH公司SMART^TM cDNA Library Construction Kit中的3’PCR Primer引物，其序列为5′ATTCTACAGGCCGAGGCGGCCGACATG 3′。所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定。基因测序结果表明编码大绿蛙抗氧化肽antioxidin-RL的基因由306个核苷酸组成，自5’端至3’端序列为：

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ctctgtgagc aagagagagg tgctgatgaa gaagatggag gggaagctaa actggaagac    120

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编码大绿蛙成熟抗氧化肽antioxidin-RL的为第130-171位核苷酸，其氨基酸序列为：

Ala Met Arg Leu Thr Tyr Asn Arg Pro Cys Ile Tyr Ala Thr

1               5                   10              14

大绿蛙抗氧化肽antioxidin-RL基因作为基因工程制备大绿蛙抗氧化肽的应用。

大绿蛙抗氧化肽antioxidin-RL的分离纯化方法：

冻干的大绿蛙皮肤分泌液首先过凝胶层析柱Sephadex-G50，收集具有抗氧化活性的峰，冻干，过反向高液相(RP-HPLC)C18柱，纯化得到大绿蛙抗氧化肽antioxidin-RL。

大绿蛙抗氧化肽antioxidin-RL的化学合成方法：

根据Edman降解法测得序列和编码大绿蛙antioxidin-RL抗氧化肽基因推断的氨基酸序列，用自动多肽合成仪(433A，Applied Biosystems)合成其全序列。通过HPLC反向柱层析脱盐纯化，并确定其纯度大于95％。用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)测定其分子量。合成的抗氧化肽溶于灭菌水，用于活性测定。

本发明的有益效果在于：

分离纯化得到大绿蛙抗氧化肽antioxidin-RL，并克隆得到其cDNA序列。该抗氧化肽有极显著的清除自由基作用。另外该抗氧化肽具有结构简单、人工合成方便、抗氧化活性强，抗炎活性强的特点。能作为制备皮肤抗氧化保护和清除体内自由基药物的应用。

附图说明：

图1显示不同浓度抗氧化肽作用下自由基清除率随时间变化。

具体实施方式：

下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。

大绿蛙抗氧化肽antioxidin-RL基因克隆：

I、大绿蛙皮肤总RNA提取：

A.活体大绿蛙用水清洗干净，放入液氮中速冻4小时，取皮肤组织，称重，

取300mg皮肤组织，加入10ml总RNA提取缓冲液(Trizol溶液，美国GIBCOBRL公司产品)，于20ml玻璃匀浆器中匀浆30分钟。

B.加入等体积酚/氯仿溶液，震荡混匀，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃除沉淀。

C.上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为大绿蛙皮肤总RNA。

II、大绿蛙皮肤mRNA的纯化：

大绿蛙皮肤mRNA分离纯化采用美国PROMEGA公司的PolyATtractmRNA Isolation Systems试剂盒。

A.取大绿蛙皮肤总RNA 500μg溶于500μl DEPC水中，放入65℃水浴10分钟，加人3μl的Oligo(dT)探针和13μl 20×SSC溶液，混匀，放置室温冷却，称为A液。

B.磁珠(SA-PMP)的洗涤：将磁珠轻弹混匀，至磁力架吸附30秒，弃上清，加0.5×SSC 0.3ml，至磁力架吸附30秒，最后加0.1ml 0.5×SSC悬浮，称之为B液。

C.将A液加入B液中，室温放置10分钟，至磁力架吸附30秒，弃上清，用0.1×SSC洗涤4次，最后弃上清，加0.1ml DEPC水悬浮，至磁力架上吸附30秒，将上清移至新的试管，再加入0.15ml DEPC水重新悬浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述试管，则上清中为纯化的大绿蛙皮肤mRNA。

D.加入1/10体积3M乙酸钠，pH5.2，等体积异丙醇，于-70℃放置30分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀溶解于10μl DEPC水中。

III、大绿蛙皮肤cDNA文库构建：采用CLONTECH公司Creator^TM SMART^TM cDNA Library Construction Kit质粒cDNA文库构建试剂盒。

A.cDNA第一链合成(mRNA反转录)：

1.在0.5ml无菌的离心管加入1μl大绿蛙皮肤mRNA、1μl SMART IV寡聚核苷酸、1μl CDS III/3’PCR引物，加2μl去离子水使总体积达到5μl。

2.混匀离心管中的试剂并离心，72℃保温2分钟。将离心管在冰上孵育2分钟。在离心管中加入以下试剂2.0μl 5×第一链缓冲、1.0μl20mM二硫苏糖醇、1.0μl 10mM dNTP混合物、1.0μl PowerScript反转录酶。

3.混合离心管中试剂并离心，在42℃保温1小时。

4.将离心管置于冰上中止第一链的合成。

5.从离心管取2μl所合成的cDNA第一链备用。

B.采用长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法扩增第二链

1.95℃预热PCR仪。

2.将2μl cDNA第一链(mRNA反转录)、80μl去离子水、10μl 10×Advantage 2 PCR缓冲、2μl 50×dNTP混合物、2μl 5’PCR引物、2μl CDS III/3’PCR引物以及2μl大肠杆菌聚合酶离心管进行反应。

3.在PCR仪中按以下程序扩增：

①95℃         20秒钟

②22个循环：

95℃           5秒钟

68℃           6分钟

4.循环结束后，将离心管中合成的cDNA双链进行抽提。

C.PCR产物用PROMEGA公司的Wizard

SV Gel and PCR Clean-Up

System试剂盒进行抽提回收，步骤如下：

1.将通过PCR得到的cDNA双链加入等体积的膜结合缓冲颠倒混匀，然后将混和液转入离心纯化柱，室温静置5分钟，使DNA充分与硅胶膜结合。16,000g离心1分钟，倒掉收集管中的废液。

2.加入700μl的洗脱液(含乙醇)于离心纯化柱中，16,000g离心1分钟，倒掉收集管中的废液。

3.重复步骤2。

4.16,000g离心5分钟。

5.将离心纯化柱置于新的离心管中。

6.加入30μl超纯水，在室温下静置5分钟。

7.16,000g离心1分钟，管底溶液即为所纯化过的cDNA双链。

D.大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备：

1.挑取单个DH5α菌落，接种于3ml不含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1∶100再接种于50ml LB培养液中，37℃振荡2小时。当OD₆₀₀值达到0.35时，收获细菌培养物。

2.将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上方置10min，使培养物冷却至0℃。

3.于4℃以4100r/min离心10min，以回收细胞。

4.倒出培养液，将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽。

5.每50ml初始培养液且30ml预冷的0.1mol/L CaCl₂-MgCl₂溶液(80mmol/L MgCl₂，20mmol/L CaCl₂)重悬每份细胞沉淀。

6.于4℃以4100r/min离心10min，以回收细胞。

7.倒出培养液，将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽。

8.每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl₂重悬每份细胞沉淀，分装后备用。

E.酶切、连接以及连接产物的转化：

1.在微量离心管中加入1μl Takara pMD18-T载体、4μl大绿蛙cDNA双链溶液，全量为5μl。

2.加入5μl(等量)的连接酶缓冲混合物。

3.16℃反应2小时。

4.全量(10μl)加入至100μl DH5α感受态细胞中，冰中放置30分钟。

5.42℃加热90秒钟后，再在冰中放置1分钟。

6.加入37℃温浴过的LB培养基890μl，37℃缓慢振荡培养60分钟。

7.取200μl涂布于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB培养基上37℃培养16小时，形成单菌落。

8.每个LB平皿用5ml LB液体培养基洗涤菌落，加30％甘油冻存。构建的cDNA大约含1×10⁶个单独克隆。

IV、大绿蛙抗氧化肽antioxidin-RL基因克隆筛选：

扩增引物长度为20个核苷酸，其序列为5’ATGTTCACCATGAAGAAATC3’，PCR另一扩增引物为CLONTECH公司SMART^TM cDNALibrary ConstructionKit中的3’PCR Primer引物，其序列为5′ATTCTACAGGCCGAGGCGGCCGACATG 3′。

PCR反应在如下条件下进行：94℃30秒钟，60℃30秒钟和72℃45秒钟，35个循环。

首先滴定构建的细菌cDNA文库，然后用含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基稀释至适当的细菌浓度(5000个细菌/毫升，和30个细菌/毫升分别用于首轮筛选第二轮筛选)，在96孔培养板上按8×8矩阵铺板(共64孔，每孔100μl)，37℃过夜培养。按行、列分别合并细菌培养液，有16个样品进行PCR鉴定，交叉阳性孔细菌样品进入第二轮筛选。

V、大绿蛙抗氧化肽antioxidin-RL基因序列测定和结果：

提取质粒DNA用双脱氧法测定核苷酸序列，使用仪器为美国AppliedBiosystems373A全自动核苷酸序列测定仪，测序引物为BcaBEST^TM SequencingPrimer RV-M和BcaBEST^TM Sequencing Primer M13-47，BcaBEST^TM SequencingPrimer RV-M序列：5`GAGCGGATAACAATTTCACACAGG 3’，BcaBEST^TMSequencing Primer M 13-47：5’CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3’。基因测序结果自5’端至3’端序列为：

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aaaaaa                                                               306

大绿蛙抗氧化肽antioxidin-RL基因核苷酸的序列表为：序列长度为306个碱基，序列类型：核酸，链数：单链，拓扑学：直链状，序列种类：cDNA，来源：大绿蛙皮肤。

编码大绿蛙成熟抗氧化肽antioxidin-RL的为第130-171位核苷酸，其氨基酸序列为：

Ala Met Arg Leu Thr Tyr Asn Arg Pro Cys Ile Tyr Ala Thr

1               5                   10              14

大绿蛙抗氧化肽antioxidin-RL基因作为基因工程制备大绿蛙抗氧化肽的应用。

大绿蛙抗氧化肽antioxidin-RL分离纯化：

I、Sephadex G-50凝胶过滤层析：

将3g冻干的大绿蛙皮肤分泌液溶于20ml 0.1M磷酸盐缓冲液(pH6.0)，12000rpm离心10分钟，取上清上样于已平衡好的Sephadex G-50凝胶过滤柱(26×100cm)，用同样缓冲液洗脱，并用自动部分收集器进行收集，流速为3ml/管/10min，于280nm紫外检测收集液中蛋白质或多肽的浓度，合并具有抗氧化活性的部分，冻干，-20℃保存备用。

II、反向高压液相层析(RP-HPLC)：

将Sephadex G-50凝胶过滤层析所得到的活性峰用2ml 0.1M磷酸盐缓冲液(pH6.0)重新溶解，4℃，12000rpm离心15分钟，取上清液，用0.45μm滤膜过滤，收集滤液上样于反相高压液相C18柱，以水(含0.1％三氟乙酸)∶乙腈(含0.1％三氟乙酸)构成的洗脱系统进行梯度洗脱，洗脱速度为0.7ml/min。收集具有抗氧化活性的峰，冻干，-20℃保存。Edman讲解法对其纯化所得的抗氧化肽纯品进行N-端测序(model 491，ABI，美国)。电喷雾电离质谱(ESI-MS)测定抗氧化肽分子量。

大绿蛙抗氧化肽antioxidin-RL的化学合成：

I、大绿蛙抗氧化肽antioxidin-RL的化学合成方法：根据编码大绿蛙抗氧化肽antioxidin-RL的蛋白测序结果和基因推断大绿蛙抗氧化肽的氨基酸序列，用自动多肽合成仪合成其全序列。通过HPLC反相C₁₈柱层析脱盐、纯化。

II、分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardment massspectrometry，FAB-MS)，以甘油∶间硝基苄醇∶二甲亚砜(1∶1∶1，V∶V∶V，体积比)为底物，Cs⁺作为轰击粒子，电流为1μA，发射电压为25Kv。

III、纯化的大绿蛙抗氧化肽用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。

大绿蛙抗氧化肽antioxindin-RL是大绿蛙抗氧化肽基因编码的一种单链多肽，分子量1672.98道尔顿，等电点9.31，大绿蛙抗氧化肽antioxidin-RL全序列为：丙氨酸-甲硫氨酸-精氨酸-亮氨酸-苏氨酸-酪氨酸-天冬酰胺-精氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-异亮氨酸-酪氨酸-丙氨酸-苏氨酸。

大绿蛙抗氧化肽antioxidin-RL的药理实验：

ABTS⁺清除法检测大绿蛙抗氧化肽antioxidin-RL的抗氧化作用：ABTS⁺·是相当稳定的蓝绿色自由基阳离子，在有供氢能力的抗氧化剂存在下，变成没有颜色的ABTS。抗氧化肽清除ABTS⁺·的能力通过734nm处吸光度的变化测定。样品的抗氧化能力与ABTS⁺·的清除率成正比，ABTS⁺·的清除率计算公式如下：

I＝[(A_B-A_A)/A_B]×100％

A_A是ABTS⁺·与样品避光孵育若干时间后的734nm光吸收值；A_B是ABTS⁺·在初始时的734nm光吸收值。

①.ABTS的PBS储存液的配制，浓度为2mM。②.K₂S₂O₈的PBS溶液配制，浓度为70mM。③.ABTS⁺·的制备：使用前将ABTS储存液和K₂S₂O₈溶液按照体积比为250∶1混合，室温避光15-16h。④.实验前用PBS稀释ABTS⁺·溶液，使其A₇₃₄在0.8±0.030之间。吸取稀释好的ABTS⁺·溶液48μl，加入2μl待测样品(终浓度为5-80μg/ml)，立即置于紫外分光光度计内，于734nm波长下测定其光吸收值。PBS调零。

以上试验均使用样品溶解液(超纯水)做对照。每组设3个平行。

结果如图1所示，80ug/ml的大绿蛙抗氧化肽antioxidin-RL能在几秒钟内快速清除ABTS⁺自由基，几分钟后清除率达99.7±0.3。这表明大绿蛙抗氧化肽antioxidin-RL具有很强的抗氧化作用，同时还具有序列简单、合成方便等优点，能作为制备皮肤抗氧化保护和清除体内自由基药物的应用。

SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院昆明动物研究所

<120>大绿蛙抗氧化肽antioxidin-RL及其基因和应用

<130>1

<160>2

<170>Patent In version 3.4

<210>1

<211>306

<212>DNA

<213>Rana livida

<400>1

atgttcacca tgaagaaatc cctgttactc ctttttgttc ttggaaccat caacttatct    60

ctctgtgagc aagagagagg tgctgatgaa gaagatggag gggaagctaa actggaagac    120

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cagatacagt atctagtaaa aaataaaaat ttcacatata taaaaaaaaa aaaaaaaaaa    300

aaaaaa                                                               306

<210>2

<211>14

<212>PRT

<213>Rana livida

<400>2

Ala Met Arg Leu Thr Tyr Asn Arg Pro Cys Ile Tyr Ala Thr

1               5                   10              14

Claims (4)

1.大绿蛙抗氧化肽antioxidin-RL，其特征在于大绿蛙抗氧化肽antioxindin-RL是大绿蛙抗氧化肽基因编码的一种单链多肽，分子量1672.98道尔顿，等电点9.31，大绿蛙抗氧化肽antioxidin-RL全序列为：丙氨酸-甲硫氨酸-精氨酸-亮氨酸-苏氨酸-酪氨酸-天冬酰胺-精氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-异亮氨酸-酪氨酸-丙氨酸-苏氨酸。

2.大绿蛙抗氧化肽antioxidin-RL基因核苷酸序列，其特征在于：cDNA由306个核苷酸组成，其自5’端至3’端序列为：

atgttcacca tgaagaaatc cctgttactc ctttttgttc ttggaaccat caacttatct  60

ctctgtgagc aagagagagg tgctgatgaa gaagatggag gggaagctaa actggaagac  120

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aaagaaatgt aatctactgg aaatcttctg atgtggaata tcatttagct aaatgcaaaa  240

cagatacagt atctagtaaa aaataaaaat ttcacatata taaaaaaaaa aaaaaaaaaa  300

aaaaaa                                                             306

3.权利要求2所述的大绿蛙抗氧化肽antioxidin-RL基因核苷酸序列，其特征在于，编码大绿蛙抗氧化肽antioxidin-RL成熟序列为第130-171位核苷酸，其氨基酸序列为：

Ala Met Arg Leu Thr Tyr Asn Arg Pro Cys Ile Tyr Ala Thr

1                5                  10              14

4.权利要求1所述的大绿蛙抗氧化肽antioxidin-RL，作为制备皮肤抗氧化保护和清除体内自由基药物的应用。