CN1660892A

CN1660892A - 海洋生物抗氧化活性肽及其制备方法

Info

Publication number: CN1660892A
Application number: CN 200510000032
Authority: CN
Inventors: 王跃军; 孙谧; 邹建; 王海英
Original assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2005-01-05
Filing date: 2005-01-05
Publication date: 2005-08-31
Anticipated expiration: 2025-01-05
Also published as: CN1301264C

Abstract

本发明涉及新型海洋生物抗氧化活性肽及其制备方法，该海洋生物抗氧化活性肽，其特征为一小分子量多肽类物质，分子量为794Da1；由7种氨基酸组成，分别为天冬氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸和赖氨酸，其物质的量之比为1∶1∶1∶1∶2∶1∶1。含有8个氨基酸残基。其中酸性氨基酸的相对含量为9.22％，碱性氨基酸的相对含量为12.62％，极性氨基酸的相对含量为44.8％。本发明提供的海洋生物抗氧化活性肽具有如下明显的优点：抗氧化活性强、水溶性好及安全、无毒、无副作用等，适宜应用于食品、化妆品、医药等领域。

Description

海洋生物抗氧化活性肽及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物肽领域，特别是涉及从海洋动物贝类提取的海洋生物抗氧化活性肽及其制备方法。

背景技术

众所周知，海洋生物产品是人们日常生活中重要蛋白质来源，说明海洋产品中含有各种各样丰富的蛋白质。据报道，来自海洋产品贝类中具有抗氧化活性的蛋白为一类含有酸性杂多糖的蛋白质，耐热性强。海洋贝类内脏中也含有大量的糖元及其它多糖，以及丰富蛋白质，以往多采用盐析及丙酮沉淀等步骤将多糖成分从抽取物中分离出来。

酶促活性多肽作为蛋白质的后加工产物，多为一类小分子的多肽，具有与蛋白质分子相同的正常的氨基酸结构。这类多肽多数都是在生命活动过程中起着重要的功能调节作用，因此结构一旦阐明，借助于化学途径，可合成拮抗剂、活性中心片断等类似物。同时研究活性多肽在降解代谢过程中的酶切位点、维持其构象的必要条件以及它们与特异受体结合的主要部位和发动或传导信息的活性中心，从而可有意识地将整个分子改貌，制备出比天然肽效价更高和选择性更强的药物。

目前国内外有关多肽类蛋白质的分离、纯化已有广泛的研究，一般普遍采用HPLC进行肽类物质的纯化，其活性回收率可达到80％以上。国内马建农等人采用CM-52、Bio-Gel P-6、DEAE-52及R-HPLC各步层析，从猪胰脏的酸醇提取液中纯化得到了纯的胰岛素拮抗肽；董文玉等人采用高效液相色谱法对组合化学合成结构小分子多肽进行了分析，结果成功地将10种目标多肽与其它杂质分离，提供了一种常规的分析手段。但从海洋动物贝类中分离、纯化抗氧化活性肽而言，目前尚属空白。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术存在不足，经发明人长期从事海洋生物、微生物及其后续加工处理的开发研究中，提供一种从海洋贝类内脏团中制得的一种新的海洋生物抗氧化活性肽及其制备方法。

本发明提供的海洋生物抗氧化活性肽，其特征为一小分子量多肽类物质，分子量为794Dal；由7种氨基酸组成，分别为天冬氨酸(Asp)、甘氨酸(Gly)、苏氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、缬氨酸(Val)和赖氨酸(Lys)，其物质的量之比为Asp∶Gly∶Thr∶Ala∶Pro∶Val∶Lys＝1∶1∶1∶1∶2∶1∶1。含有8个氨基酸残基。其中酸性氨基酸的相对含量为9.22％，碱性氨基酸的相对含量为12.62％，极性氨基酸的相对含量为44.8％，各氨基酸相对含量如表1，

表1.

氨基酸相对含量(mol％)

Asp 9.2

Gly 10.3

Thr 12.6

Ala 14.9

Pro 27.6

Val 12.6

Lys 12.6

该多肽酸性氨基酸和碱性氨基酸含量相对平衡，所以酸碱性不强，极性氨基酸和非极性氨基酸相对含量也较平衡，所以不显示出较强或者是较弱的疏水作用。

茚三酮反应呈阳性，表明该肽N端未被封闭且为链状多肽。

吸收光谱扫描结果表明，该肽的最大吸收为280nm，与典型蛋白质吸收峰相同。

纯度鉴定纯度大于96.42％，达到高效液相纯。

抗氧化生物活性

采用亚铁离子催化过氧化氢产生羟自由基(Fenton反应)，该反应产生的羟自由基可使番红花红褪色。

取0.025M，pH7.4的磷酸缓冲液1ml，40ug/ml的番红花红1ml，供试药品0.5ml，3％过氧化氢1ml(新鲜配制)，0.945mM EDTA-Fe(II)1ml(新鲜配制)，混合后在37℃水浴中反应30min后在520nm处测定吸收度。空白组以0.5ml蒸馏水代替供试样品，对照组以1.5ml蒸馏水代替EDTA-Fe(II)和供试样品。并按下式计算清除率：

在Fenton反应中亚铁离子与过氧化氢反应产生羟自由基，羟自由基可使番红花红褪色。在加入扇贝抗氧化活性肽后，通过消除羟自由基，从而抑制番红花红褪色。根据对褪色的抑制程度计算清除羟自由基能力的强弱。

结果表明，海洋生物抗氧化活性肽在试验浓度(0.1～1.0mg/mL)范围内对羟自由基有极强的清除作用，并且随着浓度的增加，清除率持续增大。并且在低浓度时，抗氧化活性增加迅速，浓度增高时，活性增加速度降低不明显。根据所得曲线进行对数回归，经计算得到IC₅₀为0.39mg/mL。

通过一系列抗氧化活性的特异性化学实验方法发现该肽对番红花红褪色反应有抑制作用而对其它抗氧化反应无明显的作用，但此多肽是否真正具有抗羟自由基活性还无法确定。因为有以下几种可能是该多肽对褪色反应有抑制作用：1.多肽能够捕获羟自由基，从而抑制了番红花红的褪色；2.多肽与H₂O₂或EDTA-Fe(II)结合，破坏了Fenton羟自由基反应的发生，导致番红花红无法褪色；3.多肽在513nm处有强烈的吸收，在反应时抵消了番红花红褪色的程度；4.多肽与番红花红结合成化学性质稳定的物质，从而屏蔽了羟自由基与番红花红的反应。鉴于以上四种可能，我们有针对性的作了一些实验，结果见下表2：

表2番红花红褪色机理测定结果

加样量 A_513nm A_513nm平均值

1ml EDTA-Fe(II) 1mlH₂O 0.1ml肽 0.709； 0.710； 0.711 0.710

1mll EDTA-Fe(II) 1mlH₂O 0.1mlH₂O 0.700； 0.704； 0.697 0.700

1mlH₂O 1mlH₂O₂ 0.1ml肽 0.680； 0.683； 0.684 0.682

1mlH₂O 1mlH₂O₂ 0.1ml H₂O 0.620； 0.624； 0.626 0.623

从上表2数据可以发现：1.番红花红的褪色确实是由于Fenton反应产生的羟自由基引起的，因为EDTA-Fe(II)或H₂O₂在单独作用时都无法使番红花红褪色；多肽的加入基本上不会引起反应体吸光度的较大增加。因此，通过Fenton反应引起的番红花红褪色反应完全可以用来检测抗羟自由基多肽的活性。

同时，采用ESR自旋捕集技术和化学发光法对扇贝抗氧化多肽的抗氧化活性进行了研究。结果发现该小肽对Fenton反应产生的羟自由基清除能力非常强，进一步证实该多肽对羟自由基的捕获作用。

本发明提供的海洋生物抗氧化活性肽的制备方法包括：

(1)氧化活性蛋白的制备：

①将贝类如新鲜扇贝类内脏团绞碎，然后按湿重1∶1(w/w)加入1.0％的NaCl溶液(内含0.2％Triton-100；0.1mmol/L EDTA)置组织匀浆器中制成匀浆；

②调pH为5.6，70℃水浴加热5min，迅速冷却。冷却液经如15000rpm离心10min，收集上清液，调pH至6.7后收取60～90％饱和度的(NH₄)₂SO₄沉淀，沉淀用5mmol/L的三羟甲基氨基甲烷(Tris)-HCl(pH7.5)缓冲液溶解、透析。

③将离心透析液取上清液，加入1.5倍预冷丙酮。将丙酮沉淀物再溶解于5mmol/L的Tris-HCl(pH7.5)缓冲液中并充分透析得粗蛋白液；

④粗蛋白液经聚乙二醇20000浓缩、离心除不溶物，取上清液上DEAE-Sephadex A-50柱(20×400mm)。先用5mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)充分平衡，再用含0～0.2M氯化钠的上述缓冲液梯度洗脱，流速20ml/h。收集在280nm有吸收的馏份，合并具SOD活性的馏份，浓缩并用双蒸水充分透析、冻干保存(以上试验温度条件除特别注明外均为4℃)。

(2)抗氧化活性多肽制备

①根据正交实验选取酶解贝类如扇贝内脏团制得抗氧化肽的最佳条件为：向抗氧化蛋白，加入0.016g低温碱性蛋白酶，蛋白质与酶重量比为33∶1.6调pH为9.0，于30℃恒温水浴中酶解24小时；将酶解液置于沸水浴中加热如10分钟使酶失活，冷却。离心除去变性的大分子蛋白，取上清冷冻干燥。

②酶解后粗品用去离子水溶解，经Sephadex G-25凝胶柱层析进一步去除大分子蛋白：用Tris-HCl缓冲液(pH7.2)平衡后装柱(18×1000mm)，上样后用平衡缓冲液洗脱，流速为3ml/min，280nm处检测。

(3)提纯

①CM Sepharose阳离子交换柱层析：

阳离子交换剂CM Sepharose Fast Flow，经预处理后用2mM磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH3.0)平衡后装柱(30×160mm)，上样后用缓冲液洗脱到出现基线，再用含0～0.5M氯化钠的上述缓冲液梯度洗脱。收集活性峰。

②反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析：

Waters 2690高效液相色谱系统，Symmetry C₁₈分析型色谱柱(5um，3.9×150mm)，上样溶液为过膜去离子水，洗脱液为30％乙腈-水溶液。0％～100％洗脱液洗脱15ml。样品收集后真空冷冻干燥，得纯海洋生物抗氧化活性肽。

根据本发明提供的海洋生物抗氧化活性肽及其制备方法中，所述贝类内脏团包括各种贝类内脏团，例如蛤蜊、球母、刀蚌、文蛤、扇贝等，特别是扇贝如栉孔扇贝，通常剥离扇贝柱后剩余的全部内脏团，以利于经济实用，优选采用新鲜贝类如新鲜扇贝剥离扇贝柱后剩余的全部内脏团。另外也可采用各种渔类加工后剩余的下脚料。

所述本发明提供的海洋生物抗氧化活性肽(PCF)的动物生理活性：

①抗氧化物活性采用地塞米松(DEX)与脾脏和胸腺淋巴细胞共同培养，建立了淋巴细胞免疫抑制试验模型。实验结果，DEX能显著降低脾脏和胸腺淋巴细胞的活性，而PCF不仅能显著地减轻其对免疫细胞的抑制作用，同时还可以促进免疫细胞的活性，表明PCF对DEX引起的淋巴细胞抑制具有保护作用。

②采用噻唑盐比色法探讨了在⁶⁰Co辐射损伤条件下贝类如扇贝多肽对胸腺细胞的保护作用，和对⁶⁰Co辐射损伤的胸腺细胞修复能力的影响。结果提示：提示扇贝多肽具有抵抗⁶⁰Co辐射对胸腺细胞的损伤作用，并且呈剂量依赖性；而且在一定的时间范围内对受到辐射损伤后的胸腺细胞具有促进其修复的作用。

③探究了扇贝多肽对大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型(MCAO)损伤后神经元的保护作用，结论：扇贝多肽对大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤后的神经元具有保护作用，其机制与扇贝多肽能提高抗氧化酶含量，抑制脂质过氧化有关。

④所述海洋肽能明显增加衰老皮肤的的表皮平均厚度和成纤维细胞数目。提高真皮内弹性纤维含量，具有显著的抗皮肤老化作用。并且皮肤毒理学实验表明，该海洋肽未引起皮肤急性毒性反应，无刺激性，为轻度致敏物。

⑤扇贝多肽具有抗紫外线UVA对无毛小鼠皮肤氧化损伤的作用。其机制与扇贝多肽上调Bcl-2蛋白表达，下调NOS蛋白的表达，提高抗氧化酶含量，抑制脂质过氧化有关。

通过生物及动物生理活性测定确定所得到的多肽为抗氧化活性多肽。

在抗氧化活性蛋白制备中，匀浆通常采用市售匀浆机如组织匀浆机(如海鸥YQ-3型匀浆机，江阴市新北五金皮塑厂销售)。

收集具有抗氧化活性的扇贝蛋白为酶解目标，制备抗氧化多肽，这样提高了以后的各步操作的目标性和可行性。

本实验采用较长时间加热的步骤，使不需要的杂蛋白变性、沉淀，进而提高了产物的纯度，有利于后续操作步骤(图1)。

海产贝类内脏中含有大量的糖元及其它多糖，多糖的存在使成分的吸湿性、粘性增大，不易冻干保存，采用盐析及丙酮沉淀等步骤将多糖成分从抽提物中分离出来。

海洋碱性低温蛋白酶因其来自海洋低温环境，所以与陆地蛋白酶相比，在酶的性质方面具有特殊性。酶解制备多肽类活性物质时，各种酶的反应条件各异，影响底物蛋白构象的变化，并且各种酶专一性促使产物多肽的N-末端、C-末端氨基酸组成及排列各异。选取海洋低温碱性蛋白酶对扇贝进行酶解，目标性较强。

酶解得到的抗氧化肽粗品经Sephadex G-25分析，记录显示有两个峰(图2)。

根据分子筛的作用原理，物质出峰时间与分子量大小呈负相关。与未经酶解的抗氧化蛋白比较表明：图中蛋白吸收曲线的第一个峰与肽吸收曲线的第一个峰为同一物质，而肽吸收曲线第二个峰为比第一个峰具有更小分子量的物质。因此图中蛋白吸收曲线的第二个峰为扇贝抗氧化蛋白经碱性蛋白酶酶解后的产物，系小肽类物质。将多肽峰收集冻干保存。

该步实验主要是为了使酶解后的杂蛋白和多肽分离，并且蛋白和酶解后的多肽分子量差别较大，所以在进行分子筛纯化时，选取了较大的流速，使蛋白较快的流出。经过该步纯化，实现了快速的蛋白与多肽分离。将目标成分进行了浓缩，便于进一步的操作。

将海洋肽上CM Sepharose FF阳离子交换层析柱后的结果见图3。

较低pH值可确保大部分多肽分子与阳离子交换树脂产生较好的吸附作用，但考虑到树脂的耐受pH值范围及为避免多肽被水解，因此，确定上样缓冲液的pH值为3.0，作为洗脱液，应为高盐浓度的缓冲液，以确保将被吸附的多肽分子全部洗脱下来。

阳离子交换得到的第二峰经RP-HPLC分析，结果如图4，保留时间为20.919min的峰为活性峰。因该峰与杂峰临近并有部分交叉，所以只收集峰尖部分并冻干保存。

反相高效液相方法是目前用于分离小分子肽类物质最常用的方法之一。

海洋抗氧化肽粗制品经CM Sepharose阳离子柱层析、RP-HPLC柱层析等步骤，该活性肽被提纯了35.88倍，结果见表3。

表3纯化结果

步骤	总蛋白含量(mg)	EC₅₀(mg/mL)	纯化倍数
步骤	总蛋白含量(mg)	EC₅₀(mg/mL)	纯化倍数	酶解液CM Sepharose阳离子柱层析RP-HPLC	1.7020.7360.016	13.991.7940.39	1.007.835.88

本发明提供海洋生物抗氧化活性肽及其制备方法是一种快速、方便可靠的方法，得到具有对Fenton反应产生的羟自由基清除能力非常强其清除的EC₅₀＝0.39Mg/ml左右具有显著的抗氧化作用。氧自由基诱导的脂质过氧化反应与许多疾病的发生有密切的联系。其中羟自由基是已知的最强的氧化剂，它几乎可以和所有的细胞成分发生反应，对机体危害极大。因此，海洋抗氧化肽可能被作为天然的食品抗氧化剂用于抑制脂质自氧化。羟自由基能使透明质酸解聚，涵水力下降导致皮肤干燥出现皱纹，海洋抗氧化肽还可认为是一种有效的抗皮肤老化的海洋活性物质。另外，研究表明具有较强抗氧化作用的肽分子量一般较小，因此它们易被肠道吸收而直接在机体起作用，又安全、无毒、无副作用。目前，自由基学说及其有关指标测定已成为阐述抗衰老物质作用机制的通用方法。另外，海洋蛋白资源酶解后普遍呈现出溶解性好，乳化性强，流动性增加等优点。因此，该抗氧化肽作为天然抗氧化剂在药物、日用化工、食品等方面均具有广阔的开发利用前景。

附图说明

图1为抗氧化蛋白的DEAE-Sephadex A-50柱层析曲线。

图2为扇贝抗氧化蛋白与肽的凝胶层析曲线。

图3为抗氧化肽CM Sepharose阳离子柱层析曲线。

图4为抗氧化肽RP-HPLC分析结果。

具体实施方式

本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于实施例。

实施例1

抗氧化活性蛋白的制备

(1)将600克新鲜扇贝内脏团绞碎，然后按湿重1∶1(w/w)加入1.0％的NaCl溶液(内含0.2％Triton-100；0.1mmol/L EDTA)置组织匀浆器中制成匀浆。调pH为5.6，70℃水浴加热5min，迅速冷却。冷却液经15000rpm离心10min，收集上清液，调pH至6.7后收取60～90％饱和度的(NH₄)₂SO₄沉淀，沉淀用5mmol/L的Tris-HCl(pH7.5)缓冲液溶解、透析。将离心透析液取上清液，缓缓加入1.5倍预冷丙酮。将丙酮沉淀物再溶解于5mmol/L的Tris-HCl(pH7.5)缓冲液中并充分透析得粗蛋白液，冻干保存(样品I)。

(2)粗蛋白液经聚乙二醇20000浓缩、离心除不溶物，取上清液上DEAE-Sephadex A-50柱(20×400mm)。先用5mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH7.5)充分平衡，再用含0～0.2M氯化钠的上述缓冲液梯度洗脱，流速20ml/h。收集在280nm有吸收的馏份，合并具SOD活性的馏份，浓缩并用双蒸水充分透析、冻干保存(样品II)。

酶解

取样品II 90ml(含蛋白质为0.33g)，加入0.016g海洋低温碱性蛋白酶(黄海水产研究所产品)，调节pH＝9.0，30℃恒温水浴中酶解24小时。酶解结束，将酶解液置于沸水浴中加热10分钟使酶失活。冷却，离心除去变性的大分子蛋白。取上清冷冻干燥、真空封装(样品III)。

分离

酶解后粗品用去离子水溶解，经Sephadex G-25凝胶柱层析进一步去除大分子蛋白：用Tris-HCl缓冲液(pH7.2)平衡后装柱(18×1000mm)，上样后用平衡缓冲液洗脱，收集多肽峰，冻干保存(样品IV)。

提纯

(1)阳离子交换剂CM Sepharose Fast Flow，经预处理后用2mM磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH3.0)平衡后装柱(30×160mm)，上样后用缓冲液洗脱到出现基线，再用含0～0.5M氯化钠的上述缓冲液梯度洗脱。收集活性峰(样品V)。

(2)Waters 2690高效液相色谱系统，Symmetry C₁₈分析型色谱柱(5um，3.9×150mm)，上样溶液为过膜去离子水，洗脱液为30％乙腈-水溶液。0％～100％洗脱液洗脱15ml。样品收集后真空冷冻干燥(样品VI)，得纯海洋生物抗氧化活性肽。

Claims

1、一种海洋生物抗氧化活性肽，其特征在于为一小分子量多肽类物质，分子量为794Dal；由天冬氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸和赖氨酸组成，其相对mol％含量分别为天冬氨酸9.2、甘氨酸10.3、苏氨酸12.6、丙氨酸14.9、脯氨酸27.6、缬氨酸12.6、赖氨酸12.6，其物质的量之比为天冬氨酸∶甘氨酸∶苏氨酸∶丙氨酸∶脯氨酸∶缬氨酸∶赖氨酸＝1∶1∶1∶1∶2∶1∶1，含有8个氨基酸残基，其中酸性氨基酸的相对含量为9.22％，碱性氨基酸的相对含量为12.62％，极性氨基酸的相对含量为44.8％；

该多肽酸性氨基酸和碱性氨基酸含量相对平衡，所以酸碱性不强，极性氨基酸和非极性氨基酸相对含量也较平衡，所以不显示出较强或者是较弱的疏水作用；

茚三酮反应：呈阳性，表明该物质N端未被封闭且为链状多肽；

吸收光谱：扫描结果表明，该物质的最大吸收为280nm，与典型蛋白质吸收峰相同；

纯度鉴定：纯度大于96.42％，达到高效液相纯；

抗氧化生物活性：该抗氧化活性肽对Fenton反应产生的羟自由基清除能力极强，其清除的EC₅₀＝0.39mg/mL。

2、一种海洋生物抗氧化活性肽的制备方法，包括

(1)抗氧化活性蛋白的制备：

①将贝类内脏团绞碎，然后按湿重1∶1(w/w)加入含0.2％Triton-100；0.1mmol/L EDTA的1.0％的NaCl溶液置组织匀浆器中制成匀浆；

②调pH为5.6，70℃水浴加热5min，迅速冷却。冷却液经离心10min，收集上清液，调pH至6.7后收取60～90％饱和度的(NH₄)₂SO₄沉淀，沉淀用5mmol/L pH7.5的三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液溶解、透析；

③将离心透析液取上清液，加入1.5倍预冷丙酮。将丙酮沉淀物再溶解于5mmol/L pH7.5的三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液中并充分透析得粗蛋白液；

④粗蛋白液经聚乙二醇20000浓缩、离心除不溶物，取上清液上DEAE-Sephadex A-50 20×400mm柱，先用5mmol/L pH7.5的三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液充分平衡，再用含0～0.2M氯化钠的上述缓冲液梯度洗脱，流速20ml/h，收集在280nm有吸收的馏份，合并具SOD活性的馏份，浓缩并用双蒸水充分透析、冻干保存；

(2)抗氧化活性多肽制备

①向抗氧化蛋白加入海洋低温碱性蛋白酶，蛋白质与酶重量比为33∶1.6，调pH为9.0，于30℃恒温水浴中酶解24小时，酶解结束后，将酶解液置于沸水浴中加热使酶失活，冷却，离心除去变性的大分子蛋白，取上清液冷冻干燥；

②酶解后粗品用去离子水溶解，经Sephadex G-25凝胶柱层析进一步去除大分子蛋白：用pH7.2三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液平衡后装18×1000mm柱，上样后用平衡缓冲液洗脱，流速为3ml/min，280nm处检测；

(3)提纯

①CM Sepharose阳离子交换柱层析：

阳离子交换剂CM Sepharose Fast Flow，经预处理后用pH3.0的2mM磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液平衡后装30×160mm柱，上样后用缓冲液洗脱到出现基线，再用含0～0.5M氯化钠的上述缓冲液梯度洗脱，收集活性峰；

②反相高效液相色谱(RP-HPLC)

Waters 2690高效液相色谱系统，Symmetry C₁₈分析型色谱5um，3.9×150mm柱，上样溶液为过膜去离子水，洗脱液为30％乙腈—水溶液，0％～100％洗脱液洗脱15ml，样品收集后真空冷冻干燥，得纯海洋生物抗氧化活性肽。