CN102898504B - 抗氧化活性合成肽及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗氧化活性合成肽及其用途。本发明提供的多肽，为如下1）-3）中任一一种：1）由序列表中序列1所示的多肽；2）由序列表中序列2所示的多肽；3）由序列表中序列3所示的多肽。本发明的实验证明，本发明合成3条多肽，其具有抗氧化活性，由于该抗氧化肽具有分子量小，活性高，易于人工合成，成本低等特点，可以广泛的用于食品、化妆品、医药等行业的大规模生产；具体可作为抗氧化剂用于化妆品、食品保健品、动物饲料添加剂、医药等方面。

Description

抗氧化活性合成肽及其用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种抗氧化活性合成肽及其用途。

背景技术

现代自由基学说指出自由基是机体在氧化反应中产生的有害化合物，会导致脂质、蛋白质和DNA氧化性退变等氧化损害，引发糖尿病、动脉硬化、癌症等一系列慢性疾病。在食品中，一些营养成分会氧化产生氢过氧化物，降低食品品质，甚至会导致摄入者的身体发生疾病。因此，寻找抗氧化剂以抑制氢过氧化物的产生一直是人们关注的焦点之一。目前，BHA、BHT、PG等化学合成抗氧化剂已广泛的应用于食品行业以防止食品劣性氧化，但是因其潜在危害限制了其应用范围；一些抗氧化肽因其具有清除自由基、淬灭单线态氧、分解过氧化物及抑制脂质过氧化等功效，且具有分子量小、易吸收等特点，也已经用于化妆品行业，以抑制皮肤老化及化妆品自身氧化。

抗氧化肽作为抗氧化剂的一个重要组成，近几年其相关研究也越来越多。抗氧化肽大多是蛋白质酶解、分离纯化后获得，但是方法成本高、分离时间长、品质难以控制、抗氧化活性各有高低，从而限制了抗氧化肽的大规模生产及应用。而利用定量构效关系（QSAR）模型可以揭示抗氧化肽的构效关系，并预测高活性抗氧化肽的结构。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种抗氧化活性合成肽。

本发明提供的多肽，为如下1）-3）中任意一种：

1）序列表中序列1所示的多肽；

2）序列表中序列2所示的多肽；

3）序列表中序列3所示的多肽。

上述三条多肽均为本发明保护的范围，且这几条多肽具有相同的氨基酸残基，均自N末端起第一位氨基酸残基和第二位氨基酸残基分别为酪氨酸和脯氨酸，且均具有较高的抗氧化活性，一般在多肽筛选和多肽合成中作为一组。

上述多肽为具有抗氧化活性的多肽；上述抗氧化活性具体通过ABTS清除活性、ORAC活性和/或抑制脂质过氧化活性体现。

本发明的另一个目的是提供一种多肽溶液。

本发明提供的多肽溶液，为将上述多肽溶于醇溶液或酸性溶液中得到的溶液；所述醇溶液具体可为浓度50%（体积百分含量）及其以上的乙醇水溶液；所述酸性溶液具体可为浓度为2-20mM的盐酸水溶液。

上述多肽或多肽溶液在如下1）-3）中任一所述中的应用也是本发明保护的范围：1）制备抗氧化活性产品；2）制备清除自由基产品；3）制备抑制脂质过氧化产品。

在上述应用中，清除自由基在本发明的实施例中具体通过清除ABTS自由基和/或淬灭AAPH自由基体现。

上述多肽或多肽溶液在作为抗氧化剂中的应用也是本发明保护的范围。

上述多肽或多肽溶液在制备化妆品中的应用也是本发明保护的范围。

上述多肽或多肽溶液在作为动物营养补充剂中的应用也是本发明保护的范围。

上述多肽或多肽溶液在作为食品营养补充剂中的应用也是本发明保护的范围。

上述多肽通过多肽合成仪进行化学合成的，合成肽通过质谱鉴定；具有较高的ABTS清除活性、ORAC活性以及抑制脂质过氧化活性。

本发明即是在研究抗氧化肽定量构效关系模型的基础上，预测出高活性抗氧化肽的序列，经化学合成后进行活性验证，得出的一组结构相似、功能活性相同的序列。这些序列经过与蛋白质资源库的比对，存在于天然蛋白质序列中。与酶解法制备并分离纯化的抗氧化肽相比，本发明具有高自由基清除率、高抗氧化活性等特征。采用化学合成的方法制备这些抗氧化肽，功能活性高且稳定、成本较低。

本发明的实验证明，本发明合成3条多肽，其具有抗氧化活性，由于该抗氧化肽具有分子量小，活性高，易于人工合成，成本低等特点，可以广泛的用于食品、化妆品、医药等行业的大规模生产；具体可作为抗氧化剂用于化妆品、食品保健品、动物饲料添加剂、医药等方面。总之，本发明的优点在于：（1）发明了未见报道的具有高抗氧化活性（ABTS清除活性、ORAC活性和抑制脂质过氧化活性）的肽序列；（2）发明的多肽是4肽，分子量小，易吸收。（3）发明的抗氧化肽结构简单，人工合成方便，易于工业化生产，在食品、医药、饲料和化妆品领域中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为抗氧化肽Tyr-Pro-Tyr-Trp的质谱图

图2为抗氧化肽Tyr-Pro-Tyr-Trp的高效液相色谱

图3为抗氧化肽Tyr-Pro-Trp-Tyr的质谱图

图4为抗氧化肽Tyr-Pro-Trp-Tyr的高效液相色谱

图5为抗氧化肽Tyr-Pro-Phe-Trp的质谱图

图6为抗氧化肽Tyr-Pro-Phe-Trp的高效液相色谱

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、抗氧化活性合成肽的获得

多肽的合成由北京中科亚光生物技术有限公司提供。多肽的制备采用Apex 396型号的多肽合成仪，通过Fmoc固相合成法合成。分别按照三个不同肽序列Tyr-Pro-Tyr-Trp，Tyr-Pro-Trp-Tyr，Tyr-Pro-Phe-Trp的特征，由C端到N端逐步依次将氨基酸连接上。开始，将第一个氨基酸通过一段对酸敏感的连接物连接在不溶性的支撑物树脂上。用六氢吡啶将Fmoc保护基去掉后，第二个Fmoc保护的氨基酸被连接上了上去，连接方法有预活化或“一锅煮”等。目标序列连接后，用TFA将肽链从树脂上洗脱得到粗品。所合成的多肽经高效液相色谱仪纯化，纯度达到90%以上，并经过质谱仪鉴定结构。

本发明根据QSAR模型提供一组具有高抗氧化活性的合成多肽，具体如下：

多肽1：Tyr-Pro-Tyr-Trp（序列1）；

多肽2：Tyr-Pro-Trp-Tyr（序列2）；

多肽3：Tyr-Pro-Phe-Trp（序列3）；

上述3条多肽均为4肽；且每条多肽的N1位置均为酪氨酸、N2位置均为脯氨酸。

上述多肽可以人工合成，其质谱图和高效液相色谱检测结果如图1-6所示：

图1为抗氧化肽Tyr-Pro-Tyr-Trp的质谱图，质谱图是通过Voyager-DE PRO型号的质谱仪测定得到的，质谱参数：正极模式，手工集控；加速电压为20000V；采集质量范围为300-2000Da,激光投射的数量为50/频谱，激光强度为2753，激光频率为3.0HZ。图2为抗氧化肽Tyr-Pro-Tyr-Trp的高效液相色谱,色谱条件：分析柱为Agela(250×4.6mm I.D.)C18；检测波长为220nm；梯度为30-45%，时间15min；流动相A为0.05%TFA+2%CH₃CN,流动相B为0.05%TFA+90%CH₃CN。；

图3为抗氧化肽Tyr-Pro-Trp-Tyr的质谱图，质谱图是通过Voyager-DE PRO型号的质谱仪测定得到的，质谱参数：正极模式，手工集控；加速电压为20000V；采集质量范围为300-2000Da,激光投射的数量为50/频谱，激光强度为2753，激光频率为3.0HZ；图4为抗氧化肽Tyr-Pro-Trp-Tyr的高效液相色谱，色谱条件：分析柱为Agela(250×4.6mm I.D.)C18；检测波长为220nm；梯度为28-43%，时间15min；流动相A为0.05%TFA+2%CH₃CN,流动相B为0.05%TFA+90%CH₃CN。

图5为抗氧化肽Tyr-Pro-Phe-Trp的质谱图，质谱图是通过Voyager-DE PRO型号的质谱仪测定得到的，质谱参数：正极模式，手工集控；加速电压为20000V；采集质量范围300-2000Da,激光投射的数量为50/频谱，激光强度为2753，激光频率为3.0HZ。图6为抗氧化肽Tyr-Pro-Phe-Trp的高效液相色谱，色谱条件：分析柱为Agela(250×4.6mm I.D.)C18；检测波长为220nm；梯度为28-48%，时间20min；流动相A为0.05%TFA+2%CH₃CN,流动相B为0.05%TFA+90%CH₃CN；图6的具体结果如下表1：

表1为抗氧化肽Tyr-Pro-Phe-Trp的高效液相色谱结果

实施例2、抗氧化活性合成肽的活性检测

将上述多肽1、2、3分别溶于50%的乙醇水溶液中，得到多肽1溶液、多肽2溶液、多肽3溶液，母液浓度为10mM，然后用去离子水稀释至下面所需浓度。

1、用TEAC法测定抗氧化肽的ABTS清除活性

将7mmol/L ABTS(水溶液)与终浓度为2.45mmol/L的过硫酸钾混合反应产生ABTS⁺·，混合液在黑暗室温（25℃）下放置16h，得到ABTS⁺·溶液。ABTS⁺·溶液用无水乙醇稀释，至在734nm下的吸光值为0.7±0.02。取该溶液4ml与40μl0.5mM的待测多肽溶液混合，30℃下在734nm下测定吸光度，用蒸馏水代替样品作为空白对照，实验平行3次。采用系列Trolox（中文名：水溶性维生素E）溶液代替待测多肽溶液，测定后绘制标准曲线。结果表示为待测多肽溶液相当的抗氧化能力所需要的Trolox的浓度。ABTS⁺·清除率的计算公式如下：

式中：A₀为空白样在734nm波长处的吸光度；A为待测样在734nm波长处的吸光度。结果表示为与每微摩尔浓度的待测样品相当的抗氧化能力所需要的Trolox的微摩尔浓度。

结果如下：多肽Tyr-Pro-Tyr-Trp、Tyr-Pro-Trp-Tyr和Tyr-Pro-Phe-Trp的ABTS清除率分别为79.80%、79.88%和64.95%，活性值分别为4.09、4.09和3.33（μmol/μmol）；高于同等条件下的阳性对照维生素C（VC）和谷胱甘肽（GSH）水平（清除率分别为14.55%和30.03%；活性值为0.76和1.55）。

说明上述多肽均具有较高的抗氧化活性。

2、用ORAC法测定抗氧化肽的抗氧化活性值

基于ORAC反应在75mM磷酸钾缓冲液(pH=7.4)环境中进行，荧光剂FL以该缓冲液配制成高浓度储备液，小体积分装后4℃保存，可以储存4周。实验时取出必要量以同样75mM磷酸钾缓冲液稀释至反应体系中的终浓度为70nM。AAPH以75mM磷酸钾缓冲液配制至反应体系终浓度为12mM使用。标准抗氧化物质Trolox以及待测样品也均用缓冲液溶解和稀释。AAPH和Trolox现用现配。

具体测定操作为,在96孔板各微孔中分别加入5μM待测多肽溶液20μL后添加FL120μL在37℃下预置12min后,用多道移液器迅速在各孔中加入AAPH 60μL启动反应，并将微孔板置于荧光分析仪中在37℃下以激发波长485nm，发射波长520nm,进行连续测定，每1min测定一次各孔荧光强度，测定时间为2h。

ORAC实验需要设定两种对照，即没有添加自由基的FL荧光自然衰减对照(-AAPH)和没有抗氧化剂存在时的自由基作用对照(+AAPH)。样品的抗氧化能力与自由基作用下荧光衰退曲线的延缓部分面积(NetAUC)直接相关。

抗氧化剂作用下的荧光衰退曲线下面积与无抗氧化剂存在时自由基作用的荧光衰退曲线下面积之差，即荧光熄灭曲线的延迟部分面积Net AUC为抗氧化剂的保护面积。

AUC=1+(f₁/f₀+f₂/f₀+f₃/f₀+……+f_n/f₀)

其中f₀指开始时荧光值读数；f_n指在n min时的荧光值读数。

Net AUC=AUC_抗氧化剂-AUC_对照

最终结果表示成每微摩尔浓度的待测多肽溶液相当的抗氧化能力所需要的Trolox的微摩尔浓度。

结果为抗氧化多肽Tyr-Pro-Tyr-Trp、Tyr-Pro-Trp-Tyr和Tyr-Pro-Phe-Trp的ORAC活性值分别为5.61、4.90和3.63（μmol Trolox/μmol），高于同等条件下的阳性对照VC和GSH（ORAC活性值分别为0.63和1.11）。

说明上述多肽均具有较高的抗氧化活性。

3、硫氰酸铁法（FTC）测定抗氧化肽的抑制脂质过氧化活性

在5mL具塞试管中加入0.5mL蒸馏水，2.5mL 20mM的亚油酸乳化液(将0.2804g亚油酸与0.2804g吐温20混合，再加入50mL0.1MpH7.0磷酸缓冲液)，2mL0.1mol/L的磷酸缓冲液(pH7.0)，加入0.5mL5mM待测多肽溶液于玻璃试管中,总反应体积5.5mL。混合均匀后于50℃避光放置。用乙醇代替待测多肽溶液作为阴性对照，以BHT和VE（溶于99.5%乙醇）为阳性对照。

每隔一段时间(0h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、30h、36h、48h)从上述具塞试管中吸取100μL混合液加入到4.7mL75%的乙醇溶液中,再加入100μL 30%(g/g)的硫氰酸铵溶液,100μL 20mmol/L的氯化亚铁盐酸(3.5%)溶液。反应3min,然后在500nm下测定吸光值。吸光值达到0.3的天数作为诱导期。相对抗氧化活性表示为样品的诱导期除以阳性对照的诱导期。

结果为抗氧化多肽Tyr-Pro-Tyr-Trp、Tyr-Pro-Trp-Tyr和Tyr-Pro-Phe-Trp的脂质过氧化抑制率分别为66.34%、68.11%和63.21%，其相对抗氧化活性为4.55、5.42和3.69。高于同等条件下的维生素E（VE）（抑制率为61.18%）。

说明上述多肽均具有较高的抗氧化活性。

实施例3、抗氧化肽的应用

1、抗氧化肽作为抗氧化成分加入化妆品特效营养霜中

特效营养霜（质量分数%）

上述抗氧化肽可以为由实施例1得到的3条抗氧化肽中的任意一种。

结果抗氧化肽因分子量小，可以快速被皮肤吸收，可以延缓皮肤衰老。

2、抗氧化肽作为抗氧化成分加入到面膜中

洁肤面膜配方（质量分数%）：

其余为水

上述抗氧化肽可以为由实施例1得到的3条抗氧化肽中的任意一种。

结果抗氧化肽有清除自由基、防止色斑的作用。

3、抗氧化肽作为动物用营养补充剂加入到猫粮中

猫粮配方如下：主要配料有鸡肉，猪肉，鱼肉（重量50%）；大米，玉米，蔬菜纤维，加碘盐，植物油以及动物脂肪、营养补充剂等。成分表：粗蛋白质（至少）31%，粗脂肪（至少）9%，纤维（至多）130毫克/千克，水份（至多）10%，灰份（至多）8%，食盐（至多）0.5％，抗氧化肽2%。

上述抗氧化肽可以为由实施例1得到的3条抗氧化肽中的任意一种。

结果抗氧化肽既能补充氨基酸又能补充抗氧化剂，可以在体内起到清除自由基和延缓衰老的作用。

4、抗氧化肽作为食品营养强化剂加入到酱油配料中。

生酱油6%

焦糖色素0.06%

氯化钠2%

味精0.7%

乳酸0.06%

防腐剂0.02%

抗氧化肽0.05%

上述抗氧化肽可以为由实施例1得到的3条抗氧化肽中的任意一种。

结果抗氧化肽既能补充氨基酸又能补充抗氧化剂，可以在体内起到清除自由基和延缓衰老的作用。

Claims (7)

1.一种多肽，为序列表中序列2所示的多肽。

2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：所述多肽为具有抗氧化活性的多肽。

3.一种多肽溶液，为将权利要求1或2所述多肽溶于醇溶液或酸性溶液中得到的溶液。

4.权利要求1或2所述多肽或权利要求3所述的多肽溶液在如下1)-3)中任一所述中的应用：

1)制备抗氧化活性产品；

2)制备清除自由基产品；

3)制备抑制脂质过氧化产品。

5.权利要求1或2所述多肽或权利要求3所述的多肽溶液在制备动物营养补充剂中的应用。

6.权利要求1或2所述多肽或权利要求3所述的多肽溶液在制备食品营养补充剂中的应用。

7.权利要求1或2所述多肽或权利要求3所述的多肽溶液在制备化妆品中的应用。