CN101284867A - 源自蜂王浆的抗氧化肽 - Google Patents

Abstract

本发明提供具有以下(1)～(3)的任意一种氨基酸序列的抗氧化肽：(1)Tyr－Tyr－Ser－Pro－Leu；(2)Asn－Tyr－Pro－Phe－Asp－Val－Asp－Gln；(3)Ser－Leu－Pro－Ile－Leu－His－Glu－Trp。

Description

源自蜂王浆的抗氧化肽

本申请是申请日为2005年2月16日、申请号为200510009423.0的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及具有抗氧化作用的肽，具体而言涉及通过将蜂王浆中含有的蛋白质水解所获得的抗氧化肽。

背景技术

现在，蜂王浆广泛地应用于保健食品、医药品、化妆品等领域，报告显示其具有扩张血管、降低血压、抗菌等各种药理作用及营养生理作用。

蜂王浆是由蜜蜂的唾液腺合成、由位于头部的大颚腺分泌的乳状物质，是工蜂为了培育蜂王而喂食蜂王幼虫巢中的幼蜂的物质。蜂王浆均衡地富含蛋白质、维生素、矿物质，一生都食用蜂王浆的蜂王的寿命是工蜂的40倍，并且具有一天产卵2000个的能力。对蜂王浆的有效成分的研究，一直以10-羟基-2-癸烯酸(デセン酸)为代表的脂肪酸、氨基酸、维生素等低分子化合物为中心而进行。

另一方面，虽然蜂王浆一般含有10％以上的蛋白质，但是对与该蛋白质分子结构、生理作用相关的研究一直比较落后。并且，制造含有蜂王浆的化妆品、保健药水(ドリンク剤)等时，进行醇提取，蛋白质作为沉淀物被分离，但现阶段没有实现对该蛋白质的有效利用。

关于蜂王浆蛋白质的蛋白酶处理物，为人所知的是其具有钙吸收促进作用(仲佐輝子、食品と開発、34，5(1999))、降低血糖值作用(上田修一郎、Food Style、21，6，5(2002))，并且也有关于其抗氧化作用的报道((社)日本全国蜂王浆公平贸易理事会(全国ロ一ャルゼリ一公正取引協議会)「ロ一ャルゼリ一(Royal Jelly)に関する研究」平成13年度研究報告書)，但其效果不如维生素E。

本发明的目的在于提供具有强抗氧化作用的天然物质。

发明内容

针对上述课题，经过反复的研究，结果本发明人发现通过将蜂王浆用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶进行酶处理，可以获得具有和维生素E同等程度的强抗氧化能力的抗氧化肽。

即，本发明涉及如下所示的发明：

1.具有以下(1)～(3)的任意一种氨基酸序列的抗氧化肽：

(1)Tyr-Tyr-Ser-Pro-Leu；

(2)Asn-Tyr-Pro-Phe-Asp-Val-Asp-Gln；

(3)Ser-Leu-Pro-Ile-Leu-His-Glu-Trp。

2.以上述1所述的抗氧化肽作为有效成分的抗氧化剂。

3.含有上述1所述的抗氧化肽的食品。

4.具有以下(1)～(3)的任意一种氨基酸序列的抗氧化肽的制造方法：

(1)Tyr-Tyr-Ser-Pro-Leu；

(2)Asn-Tyr-Pro-Phe-Asp-Val-Asp-Gln；

(3)Ser-Leu-Pro-Ile-Leu-His-Glu-Trp，

其特征在于，用蛋白酶将源自蜂王浆的蛋白质水解。

5.含有上述1所述的抗氧化肽的化妆品。

附图说明

图1：表示通过硫氰酸铁法进行的抗氧化作用的测定结果。图1中，“none”表示没有蛋白质的对照，“Chymom”表示用胃蛋白酶、胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶处理所获得的分解物(Chymo级分)，“S.I”表示表示用胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶及小肠酶处理所获得的分解物(S.I级分)，“V.E”表示维生素E。

图2：表示阳离子交换色谱分析法的色谱图、及各级分的抗氧化试验的结果。

具体实施方式

本发明的抗氧化肽具有如下的氨基酸序列。

Tyr-Tyr-Ser-Pro-Leu(以下简称为“肽1”)

Asn-Tyr-Pro-Phe-Asp-Val-Asp-Gln(以下简称为“肽2”)

Ser-Leu-Pro-Ile-Leu-His-Glu-Trp(以下简称为“肽3”)

肽1～肽3是新的肽，其抗氧化作用通过本发明首次得到明确。

本发明的抗氧化肽也可以通过基因重组或化学合成获得，并且，也可以通过使胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、源自猪的小肠酶作用于蜂王浆本身(生蜂王浆、干蜂王浆等)或者源自蜂王浆的蛋白质级分来获得。并且，只要可以获得肽1～肽3，也可以使用由胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、源自猪的小肠酶等水解酶将蜂王浆以外的蛋白质原料水解而得到的物质。

作为用于通过蛋白质的酶分解制造本发明的抗氧化肽的酶可以举出胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、小肠酶等，这些酶是可以将源自微生物、包括哺乳动物在内的动物、植物、酵母、真菌等任意的生物的肽键水解的酶的例子，优选胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、源自猪的小肠酶。例如，通过将源自蜂王浆的蛋白质在37℃左右的温度下和源自各种生物的胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、小肠酶同时进行约1～约48小时的处理，可以获得本发明的任意一种抗氧化肽。

本发明的肽可以从源自蜂王浆的蛋白质的酶分解物中进行分离、提纯后使用，也可以将包括本发明的抗氧化肽和其他多种肽的蛋白分解物组合物(根据需要去除盐类、糖类或者高分子蛋白质等的物质)作为抗氧化肽用于食品、化妆品等各种用途。

例如，含有蜂王浆的保健药水是通过将向蜂王浆添加约70～约95％(v/v)的醇、优选乙醇后沉淀的蛋白质除去而制造的，该含水醇中不溶性的源自蜂王浆的蛋白质可以作为酶处理的原料蛋白质使用。作为化学合成法，可以通过肽合成器进行合成，也可以通过固相合成或者液相合成，阶段性地通过肽键将氨基酸延长来制造。

本发明的抗氧化肽基于其抗氧化作用，可以适合添加到由活性氧引起的各种疾病的预防及治疗用的食品中。本发明的抗氧化肽具有和维生素E同等程度的抗氧化能力，通过作为食品每天摄取约1μg～约1000mg，可以预防或者治疗由活性氧引起的各种疾病。作为食品，可以添加到饮料、保健药水等液状食品、胶状食品(包括营养辅助食品、下咽困难者用的食品)，也可以作为辅助物、功能性食品等以药片、颗粒等固形食品的形式摄取。并且，也可以用于准医药品(口中清凉剂、护齿、护肤、毛发用剂、洗浴用剂、爽身粉类(てんか粉類)、保健药水、健胃清凉剂等)、动物用食品(宠物食品等)、动物用饲料、植物用肥料等。

本发明的抗氧化肽通过添加到对氧化不稳定的食品中，可以作为稳定剂使用。

并且，本发明的抗氧化肽也可以添加到化妆品中。作为化妆品，例如适用于洗剂、化妆水、乳状液、口红、霜剂、凝胶、面膜(パツク)、粉底霜等主要用于皮肤或粘膜等的物质。

以下对本发明通过实施例进行详细说明。

实施例1

(1)抗氧化肽级分的调制

将醇变性蜂王浆蛋白质冻干之后，溶解到5倍量的蒸馏水中。通过进行透析去除低分子的糖、杂质，获得纯度更高的醇变性蜂王浆蛋白质。将该蛋白质溶液用1N HCl调整到pH2.8，在最初用1/500重量比的胃蛋白酶进行处理。将其分解物依次用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶(シグマ公司制造)、源自猪的小肠酶进行处理。对于胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶，添加后在37℃下进行24小时温育，对于小肠酶，添加后在37℃下进行1小时温育。在反应停止时，如果是胃蛋白酶，用1NNaOH调整到pH8.0以使酶失活，如果是胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、小肠酶时，添加4倍量的99.7％乙醇，以3,000×g进行20分的离心分离，去除未反应的蛋白质及酶。将通过小肠酶处理所获得的上清液用蒸发器进行浓缩干燥固化后，溶解到蒸馏水中，作为醇变性蜂王浆蛋白质的蛋白酶分解物。将这样所获得的胃蛋白酶/胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶分解物(Chymo级分)、胃蛋白酶/胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶分解物/小肠酶分解物(S.I级分)作为样本使用。肽的浓度测定通过Lowry法进行。标准蛋白质使用牛血清白蛋白。

此外，作为“醇变性蜂王浆蛋白质”使用通过将蜂王浆用醇(本实施例中为70％v/v含水乙醇)沉淀处理，将所获得的蜂王浆蛋白质冻干而得到的物质。

(2)抗氧化作用的测定

(2-1)氧化模型体系

氧化模型体系是将Chen等的方法(14)加以改良后进行的。向管形瓶中加入5mg亚麻酸、1ml的0.2M磷酸钾缓冲液(K-phosphatebuffer)(pH7.0；1％TritonX-100)，作为氧化促进剂添加0.05mM氯化铁(II)和蒸馏水，在40℃下进行4分钟的超音波处理，做成乳化液。加入样本(0.2％)和蒸馏水使最终容量为1ml，在40℃的恒温槽中加热60分钟，并振动。对于加热前及加热后的反应液的过氧化脂质的量尽快地通过硫氰化铁法进行测定。对于抗氧化作用的评价，通过对加热前后的过氧化脂质的增加量的比较来进行。

(2-2)硫氰酸铁法

根据大泽等的方法(23)进行。向0.05ml的反应液中加入99.5％的乙醇2.25ml、30％硫氰酸铵水溶液0.05ml、0.1ml的1N HCl以及0.1ml的0.02MFeCl₂/3.5％HCl，进行充分搅拌后，测定500nm下的吸光度。测定时使用Jasco、V-530UV分光光度计。S.I级分、Chymo级分、维生素E(VE)及无蛋白质对照(none)的比较结果如图1所示。另外，各肽以0.2％的浓度添加。这是因为一般情况下食品添加物的使用浓度是0.1％左右，所以使用与该浓度相近的值。可以看出，S.I样本显示出和α-生育酚(维生素E)同等的抗氧化作用。

(3)抗氧化肽的分离、鉴定

(3-1)阳离子交换色谱分析法

S.I级分溶解到0.05M的乙酸铵缓冲液(pH6.0)中，并使其吸附到用该缓冲液平衡化的AG50WX2(H+型，50-100目，BioRad)柱上。将非吸附物质用同样的缓冲液清洗后，将吸附的级分用0.2M的NH₄OH洗脱。将洗脱的吸附级分冻干，获得碱性肽级分。阳离子交换色谱分析法的色谱图、以及各级分的抗氧化试验结果如图2所示。图2中具有最高抗氧化活性的级分V进一步用HPLC提纯。

(3-2)HPLC

为了分离级分V中存在的抗氧化肽，进行使用反相柱的高效液体色谱分析法(HPLC)。其中柱使用ODS柱(Pegasil-3000DS，SenshuScientific Co.)，洗脱时使用从0.1％TFA水溶液到含有0.085％TFA的60％乙腈溶液的60分钟的浓度梯度法(1％/min)。肽的洗脱位置用220nm下的吸光度进行了确认。并且，再次进行HPLC时，使用从含有0.1％TFA的20％乙腈溶液到含有0.085％TFA的40％乙腈溶液的40分钟的浓度梯度法(0.5％/min)。对于通过用反相柱的HPLC分离的抗氧化肽的氨基酸序列，使用蛋白质定序仪(プロティンシ一クェンサ一)G-1005A(ヒュ一レツト·パツカ一ド社)进行分析。其结果是获得了肽1(序列号1)、肽2(序列号2)、肽3(序列号3)。这些肽的质谱分析的结果如下表1所示。

表1

表1的质谱分析的结果和蛋白质定序仪的结果一致，因而鉴定了本发明的肽的序列。

制剂例1：化妆水

配合以下各成份，按照通常的方法调制成化妆水。

乙醇                                            5重量％

甘油                                            4重量％

BG(1，3-丁二醇)                                 4重量％

实施例1所获得的蜂王浆蛋白质酶分解物             0.5重量％

柠檬酸                                          适量

柠檬酸钠                                        适量

净化水                                          残余

制剂例2：保健药水

配合以下各成份，按照通常的方法调制成保健药水。

水                                              88重量％

葡萄糖                                          10重量％

抗坏血酸钠                                      4重量％

实施例1所获得的蜂王浆蛋白质酶分解物        1重量％

柠檬酸                                     适量

EDTA2Na                                    0.5重量％

制剂例3：健康食品(片剂)

配合以下各成份，按照通常的方法调制成片剂。

淀粉                                       15重量％

乳糖                                       25重量％

羟丙基纤维素                               4重量％

硬脂酸镁                                   1重量％

虫胶(シェラック)                           5重量％

砂糖                                       45重量％

实施例1所获得的蜂王浆蛋白质酶分解物        5重量％

根据本发明，可以获得源自天然物质的、安全性高的抗氧化肽，并可广泛地应用于食品、化妆品等领域。

Claims (5)

1.具有以下氨基酸序列的抗氧化肽：

Asn-Tyr-Pro-Phe-Asp-Val-Asp-Gln。

2.以权利要求1所述的抗氧化肽作为有效成分的抗氧化剂。

3.含有权利要求1所述的抗氧化肽的食品。

4.具有以下氨基酸序列的抗氧化肽的制造方法：

Asn-Tyr-Pro-Phe-Asp-Val-Asp-Gln，

其特征在于，用蛋白酶将源自蜂王浆的蛋白质水解。

5.含有权利要求1所述的抗氧化肽的化妆品。

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