CN103882029B - 一种非洲帝王蝎抗菌肽基因、抗菌肽Pi_4、其结构同源抗菌肽、制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明具体涉及一种非洲帝王蝎抗菌肽基因、抗菌肽Pi_4、其结构同源抗菌肽、制备方法及应用。本发明筛选获得一种新的非洲帝王蝎抗菌肽基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，由该基因编码的非洲帝王蝎抗菌肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。本发明还提供了人工合成的非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4及其结构同源抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3~4所示，所述抗菌肽Pi_4及其结构同源抗菌肽对多重耐药性病原菌、革兰氏细菌和真菌具有较强的抗菌活性，其分子量小且具有广谱抗菌机制作用，和传统抗生素相比大大降低了耐药机率，且在低浓度下对人的正常细胞毒性小，是抗生素的最佳替代物。

Description

一种非洲帝王蝎抗菌肽基因、抗菌肽Pi_4、其结构同源抗菌 肽、制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术及医药领域，具体涉及一种非洲帝王蝎抗菌肽基因、抗菌肽Pi_4、其结构同源抗菌肽、制备方法和应用。

背景技术

自抗生素问世以来，各种细菌感染性疾病得到了有效的控制。但由于抗生素被滥用或乱用，加速了细菌的进化过程，导致出现了很多耐药性细菌。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus, MRSA) 和耐万古霉素肠球菌(Vancomycin-Resistant Enterococci, VRE)是两种临床上比较常见但又很难控制的耐药菌。在过去三、四十年间，MRSA和VRE已经从可控的耐药菌转变成了严重危害公共健康问题的超级细菌。

金黄色葡萄球菌(S. aureus)是一种比较突出的人类病原菌，它能引起一系列的疾病，小到普通的皮肤感染，大到严重危及生命的疾病，如心内膜炎、肺炎、败血症等。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA) 是指对β内酰胺类抗生素（如甲氧西林、苯唑西林和氟氯西林）耐药的金黄色葡萄球菌株。自1961 年，MRSA 在英国首次发现后，其分离率逐年增加，1985 年开始爆发流行，已成为医院感染的重要致病菌之一。MRSA 多重耐药现象日益严重，部分地区已经出现对万古霉素耐药、中介耐药以及异质性耐药MRSA细菌。研究表明，MRSA从最初的仅存在于医院逐渐蔓延到自然界各个角落，已经成了一个全球性健康问题。研究员已经从家畜（如马、牛、猪等）、宠物（狗）、动物园动物及野生动物（野兔）分离出该病原菌。据报道，全球约有超过16 亿人携带葡萄球菌，保守估计携带MRSA 的人群大约在200~ 8500万。2009年，中国CHINET 细菌耐药性监测中，得到金葡菌中甲氧西林耐药株MRSA 平均为52.17%。 在2004 年，美国ICU 病房，MRSA 的分离率达到了66.17%， 每年因感染MRSA而死亡的美国人多达18000。在1995 年至2003 年加拿大医院MRSA 的发生率增长了10 倍。欧洲最近的一项抗生素耐药检测指出，在2000~ 2008 年，马耳他MRSA 引起的菌血症，已经居欧洲之首，2006 年最高达到了66%。在地中海地区很多国家，MRSA 的感染也已经很严重。而目前市面上对MRSA有作用的抗生素仅万古霉素一种，因此开发新型抗生素类药物极其必要。

肠球菌（Enterococci）定植于我们的肠道和皮肤,通常不会引起疾病，一旦它们获得了对抗生素的抗性，就能导致肠道、尿道和伤口等处发生非常严重的感染（如败血症、心内膜炎等）。由于万古霉素的滥用/乱用，耐万古霉素肠球菌(Vancomycin resistantEnterococcus, VRE)的数量逐渐增多，且VRE 具有将万古霉素耐药性传递到金黄色葡萄球菌的危险。虽然目前临床上使用的抗生素有上百种，还没有一种能有效治疗VRE 的药物，临床上常用几种抗生素结合使用的方法来治疗VRE引起的感染，如用替考拉宁等糖肽类抗生素与青霉素类广谱β-内酰胺类抗生素结合使用。糖肽类抗生素的作用机制与β-内酰胺类抗生素相同，都是干扰细菌细胞壁肽聚糖的交联，从而使细菌细胞发生裂解。抗生素类药物由于需要与细胞上特异性受体结合，从而干扰或破坏细菌体内的某个生理过程来抑制细菌的生长，故容易引起微生物的抗药性，加速微生物进化，从而产生超级细菌。

抗菌肽普遍存在于各种生物体，是生物体先天免疫系统的重要组成部分。这类多肽由10-50个氨基酸组成，带有不同数量的正电荷。这些抗菌肽通过所带的正电荷与细菌细胞壁膜的磷脂的负电荷相吸引，在细胞膜上形成孔道，导致细胞质流出，细胞死亡。抗菌肽抗菌作用无特异性，具有很宽的抗菌谱，对革兰氏阳性、革兰氏阴性、真菌都有作用，且其代谢物是氨基酸，对宿主细胞的毒性小，是一类应用前景广阔的新型抗菌药。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种非洲帝王蝎抗菌肽基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

本发明的另一个目的在于提供一种由上述非洲帝王蝎抗菌肽基因编码的非洲帝王蝎抗菌肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

本发明的再一个目的在于提供一种人工合成的非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4，其特征在于，它是将上述非洲帝王蝎抗菌肽基因编码的非洲帝王蝎抗菌肽去除信号肽和前体肽后得到的，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示。

本发明的第四个目的在于提供上述人工合成的非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4的结构同源抗菌肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示。

本发明的第五个目的在于提供上述非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4及其结构同源抗菌肽的人工合成方法。

本发明的第六个目的在于提供所述非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4及其结构同源抗菌肽在制备治疗或预防多重耐药性病原菌和革兰氏细菌的药物中的应用，所述多重耐药性病原菌为MRSA和VRE。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：

一种非洲帝王蝎抗菌肽基因，其特征在于，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

按上述方案，所述非洲帝王蝎抗菌肽基因是首次从非洲帝王蝎（Pandinus imperator）毒腺中分离得到的，具体通过如下步骤获得：（1）首先提取非洲帝王蝎毒腺mRNA，通过反转录和PCR扩增得到大小不一的双链cDNA，再将双链cDNA与载体连接并转化后，构建得到cDNA文库；（2）采用PCR策略从上述cDNA文库中筛选PCR产物为300-600bp大小的克隆子，进行测序并进行NCBI数据库搜索，经过blast发现了一个cDNA序列和已有报道的AmAP2、Antimicrobial peptide 143、AP1、NDBP13和Putative antimicrobial peptideclone5等抗菌肽编码基因的同源性分别为43%、43%、39%、40% 和43%，这表明，该筛选得到的cDNA编码一个新抗菌肽基因。

一种由上述非洲帝王蝎抗菌肽基因编码的非洲帝王蝎抗菌肽，其特征在于，它的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示；所述非洲帝王蝎抗菌肽由80个氨基酸残基组成，包括三部分：22个氨基酸残基长的信号肽，18个氨基酸残基长的成熟肽，以及40个氨基酸残基长的前体肽（见图1）。

人工合成的非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4，其特征在于，它是将上述非洲帝王蝎抗菌肽基因编码的非洲帝王蝎抗菌肽去除信号肽和前体肽后得到的，其氨基酸序列如序列表SEQID NO：3所示。

按上述方案，对所述非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4通过Jpred server、NPSA server 和HeliQuest 软件结构预测，发现该非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4具有典型线性抗菌肽的结构特征：α-螺旋并有疏水和亲水面（结构特征示意图见图2）。

人工合成的非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4的结构同源抗菌肽，其特征在于，它是基于非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4的氨基酸序列进行点突变后得到的，其氨基酸序列如序列表SEQ IDNO：4所示。

按上述方案，所述的点突变需遵循以下原则：1、在保持现有非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4的α-螺旋结构的前提下，尽量使突变后的抗菌肽两亲性更加明显，即使得其疏水面更疏水、亲水面亲水性更强； 2、增强亲水面的静电荷数量，提高其对磷脂膜的静电吸引作用；3、 去掉对形成α-螺旋结构有破坏作用的氨基酸。将突变后得到的氨基酸序列如序列表SEQID NO：4所示的结构同源抗菌肽命名为抗菌肽Pi_4_Mu。

上述非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4及其结构同源抗菌肽的人工合成方法，其特征在于：分别根据序列表SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，采用固相化学法合成多肽序列，并对合成的多肽进行C端酰胺化，然后通过HPLC反相C18柱层析脱盐、纯化得到非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4及其结构同源抗菌肽。

上述非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4及其结构同源抗菌肽在制备治疗或预防多重耐药性病原菌和革兰氏细菌的药物中的应用，所述多重耐药性病原菌为MRSA和VRE。

按上述方案，所述非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4对革兰氏细菌和真菌的抗菌结果为：（1）对革兰氏阴性细菌：大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）、产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）和阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）的最小抑制菌生长浓度(minimalinhibitory concentration, MIC) 均大于32 μM；伤寒杆菌（Salmonella enterica）的MIC为32μM；（2） 对革兰氏阳性细菌：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、珊瑚诺卡氏菌（Nocardia corallina）、苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）和巨大芽孢杆菌（B. megaterium）的MIC 分别为8 μM、16 μM、16 μM、和16 μM；（3）对真菌：热带假丝酵母（Candida tropicalis）的MIC为16 μM。Pi_4的结构同源抗菌肽（抗菌肽Pi_4_Mu）对革兰氏细菌和真菌的抗菌效果更好，特别是对革兰氏阳性菌和真菌的MIC显著提高：对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌（S. aureus）、珊瑚诺卡氏菌（N. corallina）、苏云金芽胞杆菌（B.thuringiensis）和巨大芽孢杆菌（B. megaterium）的MIC 分别为4 μM、4 μM、8 μM、和4μM；对革兰氏阴性菌恶臭假单胞菌（P putida）、伤寒杆菌（S enterica）的MIC分别为32 μM和4 μM； 对真菌：热带假丝酵母（Candida tropicalis）的MIC为4 μΜ。上述抗菌结果表明所述非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4及其结构同源抗菌肽对革兰氏细菌有广谱抗菌活性，特别地可作用于革兰氏阳性菌和真菌，其中抗菌肽Pi_4_Mu对革兰氏阳性菌和真菌的抗菌效果更好，可以应用于制备治疗或预防革兰氏细菌及真菌引起的各种疾病的药物中。

所述非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4对多重耐药性病原菌的抗菌结果为：（1）对从北京朝阳医院分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA：菌株16558、16472、16713、16465、16478、 16679 的MIC 为8 μM，菌株16436的MIC为16μM、菌株16585和16760 的MIC 均为32 μM；（2）对万古霉素耐药肠球菌VRE：菌株S13、E128和E147的MIC 均为8 μM，菌株E1、E161、E11、E156的MIC 均为12 μM， 菌株E179的MIC大于12 μM。抗菌肽Pi_4_Mu对多重耐药性病原菌的抗菌结果为：（1）对从北京朝阳医院分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA：菌株16472和16478、MIC 为2 μM，菌株16558、16713、16436、16465、16585、16760、16679的MIC为8 μM；（2）对万古霉素耐药肠球菌VRE：菌株S13、E128、E156、E179 和E147的MIC 均为6 μM，菌株E1、E161和E11的MIC 均为8 μM。上述抗菌结果表明，所述非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4及其结构同源抗菌肽Pi_4_Mu在低浓度的条件下就能高效抑制MRSA 以及VRE 的生长，可以应用于制备治疗或预防因MRSA 、VRE引起的疾病的药物中，尤其是应用于制备治疗或预防因MRSA、VRE引起的呼吸相关性肺炎、败血症、脑膜炎、中耳炎、皮肤软组织感染、泌尿系统感染和中枢神经系统感染等严重感染性疾病的药物中。

本发明提供的非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4及其结构同源抗菌肽Pi_4_Mu对多重耐药性病原菌、革兰氏细菌和真菌具有较强的抗菌活性，其分子量小且具有多抗菌机制作用，和传统抗生素相比大大降低了耐药机率，并且对人的正常细胞毒性小，因此在面临抗药性和筛选新的抗生素极端困难的情况下，成为抗生素的最佳替代物。

附图说明

图1 为本发明提供的非洲帝王蝎抗菌肽基因及其编码的抗菌肽的氨基酸序列示意图。图中核苷酸序列下方为推断的对应氨基酸序列；5’UTR和3’UTR用小写字母表示，CDS用大写字母表示，信号肽氨基酸以单下划线标记，前体肽以双下划线标记，信号肽和前体肽中间序列为成熟肽序列；多聚腺苷酸化信号以斜体下划线标记。

图2 为非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4的结构特征图。

图3 为非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4的结构同源抗菌肽Pi_4_Mu的结构特征图。

图4 为非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4 及抗菌肽Pi_4_Mu的红细胞溶血试验结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护内容并不局限于以下实施例。

实施例1 非洲帝王蝎抗菌肽基因的获得

1、非洲帝王蝎毒腺总RNA 的提取（RNAiso Plus，购于Takara）

（1）取电击过好的蝎尾腺迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至将蝎尾腺研磨成粉末状（研磨越彻底，RNA 的收率和质量越高），向研钵中加入与样品匀浆量匹配的适量的RNAiso Plus，充分匀浆；

（2）将匀浆液转移至离心管中，室温（15~30℃）静置5 min；

（3）然后加入氯仿（氯仿体积为RNAiso Plus体积 的 1/5），盖紧离心管盖，混合至溶液乳化呈乳白色，室温静置5 min；

（4）12,000 g 4℃ 离心15 min，从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液（含RNA）、中间的白色蛋白层（大部分为DNA）及带有颜色的下层有机相，吸取上清液转移至另一新的离心管中（切勿吸出白色中间层）；

（5）向上清液中加入异丙醇（异丙醇体积为RNAiso Plus 体积的0.5~1倍），上下颠倒离心管充分混匀后，室温下静置10 min；12,000g 4℃ 离心10 min，得到RNA 沉淀；

（6）RNA 沉淀用75％乙醇洗涤（乙醇加入量与RNAiso Plus 体积相同），7,500×g4℃ 离心5 min后弃去上清；室温下将RNA沉淀干燥后，加入适量的RNase-free 水溶解RNA沉淀，得到蝎毒腺总RNA。整个过程参照RNAiso Plus（Total RNA 提取试剂）推荐方法进行，制备的蝎毒腺总RNA采用用琼脂糖凝胶电泳（1%琼脂糖+溴乙锭）分析检测其质量。

2、mRNA 的分离纯化

采用PolyA Tract mRNA 分离系统（Promega, USA）分离和纯化蝎毒腺总RNA，得到mRNA，其工作原理是基于Oligo(dT)与mRNA 3ˊ端poly（A）尾的互补配对特性，

用生物素标记oligo（dT），通过它与mRNA3ˊ端poly（A）的退火形成杂合体，然后用标有亲和素的磁珠和磁性分离架捕获并洗涤生物素Oligo（dT）/mRNA杂交体，最后用无RNA酶的ddH₂O 将之洗脱下来，达到从总RNA 中分离mRNA 的目的。具体操作步骤如下：

（1）样品的制备：将RNA 加入到含有32 μl β-巯基乙醇的800 μl 的GTC中。

（2）探针的退火：取250pM 浓度Oligo（dT）5 μl，加入蒸馏水至50 μl；加入1.6 ml预热的dilution buffer（dilution buffer 中已加入32 μl β-巯基乙醇），与RNA 混匀，70℃温浴5 min。

（3）磁珠的活化：取1.2ml 的磁珠SA-PMPS（购自Promega）于1.5 ml 的离心管中；用0.5×SSC 重悬SA-PMPS，以磁架吸附磁珠，原体积0.5×SSC 洗涤SA-PMPS 三次。

（4）mRNA 的获取：将70℃ 温育的RNA 与SA-PMPS 混合，室温放置5 min后放在磁架上吸附磁珠，弃上清液；取2ml的0.5×SSC 悬浮磁珠，洗涤重复2次，最后一次尽量去除SSC；加入无RNA酶的ddH₂O 至磁珠中，轻轻混匀，然后离心（12000g×3min）或磁架吸附磁珠；取上清，获得mRNA，通过电泳和紫外测定mRNA 的浓度和纯度。

（5）mRNA的沉淀：将上步骤获得的mRNA 中加入糖原和2.5 倍体积的无水乙醇，沉淀过夜，所得沉淀即为mRNA，mRNA 将用于cDNA 合成。

3、第一链cDNA合成

利用SMART cDNA synthesis Kit（购于Takara）构建cDNA文库。首先以3' SMART™CDS Primer II A（5’–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT₍₃₀₎N_-1N–3’）为引物，以mRNA为模板合成第一链cDNA。

（1）将1000 ng mRNA 和1μl 3′ SMARTer CDS Primer II A引物（5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT₍₃₀₎N-₁N–3'，12 μM）分别加入到0.5 ml PCR管中，用无RNase水补足溶液体积至4.5 μl，混匀，简短离心十几秒；

（2）放在PCR 仪中孵育，72℃孵育3 min，然后将温度降至42℃孵育2 min；

（3）按照以下顺序混合得到混合试剂，其中SMARTer A Oligonucleotide 引物序列为5'–AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACXXXXX–3'：

2.0 μl 5×First-Strand Buffer

0.25 μl DTT (100mM)

1.0 μl SMARTer A Oligonucleotide (12 μM )

0.25 μl RNase Inhibitor

1.0 μl SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U) *

5.5 μl Total Volume added per reaction

上述反转录酶需在使用混合试剂前加入，混合试剂应放在微量离心机上短暂离心混合；

（4）在0.5 ml PCR管加入5.5 μl 上述混合试剂，上下吹打混匀后短暂离心，在PCR仪上42℃ 孵育90 min。

（5）在70℃ 加热10 min后终止反应，向其中加入40 μl 的TE缓冲液 (pH8.0的10mM Tris，0.1 mM EDTA)，至此得到第一链cDNA合成产物，并用于第二链cDNA的合成。

4、第二链cDNA 合成

利用SMART cDNA synthesis Kit（购于Takara），以SMART II™ AOligonucleotide（5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACXXXXX–3'）为引物，以第一链为模板合成第二链。

（1）以30 μl 第一链cDNA 为模板，以6 μl 5’PCR引物SMART II™ AOligonucleotide (12 μM)合成第二链cDNA。其PCR反应体系如下：

30 μl 第一链cDNA

222 μl 超纯水

30 μl 10×Advantage 2 PCR 缓冲液

6 μl 50×dNTP 聚合物(10 mM)

6 μl 5’PCR引物SMART II™ A Oligonucleotide (12 μM)

6 μl 50×Advantage 2 酶聚合物

上述反应体系应放在微量离心机上短暂离心混合；

（2）PCR 反应条件为95℃ 预变性1 min；95℃ 变性15 s，65℃ 复性30 s，68℃ 延伸3 min，共30个循环（通过优化确定的PCR循环次数）；

（3）用1.2％ 琼脂糖凝胶、1×TAE 缓冲液，取5 μl PCR产物进行电泳，根据其结果来决定PCR产物质量及纯度；此时的PCR产物为双链cDNA。

5、cDNA文库的构建：

利用pMD19-T Vector试剂盒（购于Takara）双链cDNA 与pMD19-T 载体的连接和转化。

（1）在微量离心管中配制下列DNA 溶液，体系为5 μl；

pMD®19-T Simple Vector*1 1 μl

cDNA 1 μl

dH₂O 3 μl

（2）加入5 μl（等量）的Solution I；在16℃ 反应30 min；

（3）全量（10 μl）加入至100 μl DH5α 感受态细胞中，冰中放置30 min；

（4）42℃ 加热45s 后，再在冰中放置1 min；

（5）加入890 μl SOC 培养基，37℃ 振荡培养60 min；在含有X-Gal、IPTG、Amp 的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落，计数白色、蓝色菌落；

（6）挑选白色菌落，使用PCR 法确认载体中插入片段的长度大小。

6、用PCR 策略筛选cDNA 文库

使用pMD19-T载体的载体引物，正向引物：5'- GAGCGGATAACAATTTCACACAGG

-3' 反向引物：5'-CAGCACTGACCCTTTTGGGACCGC-3'，通过PCR 确认载体中插入片段的长度大小，将PCR 产物为300-600bp大小的克隆子进行测序；测序获得的序列经过生物软件ORF、SignalP4.0 和NCBI(美国国立生物技术信息中心) 数据库进行序列比对判断其基因结构和同源性。经过blast发现了一个cDNA序列和已有报道的AmAP2、Antimicrobialpeptide 143、AP1、NDBP13和Putative antimicrobial peptide clone5等抗菌肽编码基因的同源性分别为43%、43%、39%、40% 和43%，表明，该筛选得到的cDNA序列是一个新的非洲帝王蝎抗菌肽基因。

本实施例筛选得到的非洲帝王蝎抗菌肽基因编码的非洲帝王蝎抗菌肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。图1为非洲帝王蝎抗菌肽基因及其编码的抗菌肽的氨基酸序列示意图，从图1可以看出非洲帝王蝎抗菌肽基因编码的抗菌肽氨基酸由以下三部分组成：信号肽（22个残基），成熟肽（18个残基），以及前体肽（40个残基），其中成熟肽序列为FPFLLSLIPTAISAIKKL。

对上述非洲帝王蝎抗菌肽的成熟肽通过Jpred server、NPSA server 和HeliQuest 软件结构预测，发现该非洲帝王蝎抗菌肽的成熟肽具有典型线性抗菌肽的结构特征：α-螺旋并有疏水和亲水面。

实施例2非洲帝王蝎毒抗菌肽Pi_4的人工合成

根据实施例1获得的非洲帝王蝎抗菌肽基因序列推导出非洲帝王蝎抗菌肽的氨基酸序列（SEQ ID NO：2），去除其信号肽和前体肽，采用固相化学合成法，用自动多肽合成仪合成非洲帝王蝎抗菌肽的成熟肽序列，然后通过HPLC反相C18柱层析脱盐、纯化得到合成多肽。所述合成多肽用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，并采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测定其精确的分子量，并用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列以进行确证，最终得到与实施例1所述的非洲帝王蝎抗菌肽（氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示）的成熟肽的氨基酸序列一致且结构特征一致的合成多肽，命名为非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4（其氨基酸序列见SEQ ID NO：3，结构特征示意图见图2）。

实施例3非洲帝王蝎毒抗菌肽Pi_4的结构同源抗菌肽的设计及人工合成

非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4的结构同源抗菌肽的设计：根据非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4的氨基酸序列（SEQ ID NO：3）及其结构特征，遵循以下原则设计突变体：1、在保持现有非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4的α-螺旋结构的前提下，尽量使突变后的抗菌肽两亲性更加明显，即使得其疏水面更疏水、亲水面亲水性更强； 2、增强亲水面的静电荷数量，提高其对磷脂膜的静电吸引作用； 3、 去掉对形成α-螺旋结构有破坏作用的氨基酸。采用点突变将非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4氨基酸序列（SEQ ID NO：3）的第2位的脯氨酸突变成赖氨酸，第6的丝氨酸突变成赖氨酸，得到氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示的突变体，即非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4的结构同源抗菌肽。

本实施例中人工合成结构同源抗菌肽（突变体）的方法同实施例2，得到的合成多肽用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，并采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测定其精确的分子量，并用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列以进行确证，最终得到：氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，结构特征示意图如图3所示的合成多肽，命名为抗菌肽Pi_4_Mu。

实施例4非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4及其结构同源抗菌肽的抑菌试验

实验对象包括以下细菌：革兰氏阳性细菌，包括金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus（CCTCC:AB 94004），巨大芽孢杆菌Bacillus magaterium（CCTCC:AB90008），珊瑚诺卡氏菌Nocardia corallina（CCTCC:AA92100），苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis（CCTCC:AB93100）；革兰氏阴性细菌，包括大肠杆菌E.coli DH5α，荧光假单胞菌Pseudomonas fluorences （CCTCC:PF），恶臭假单胞菌Pseudomonas putida（CCTCC:PP），阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae（CCTCC:AB 2010162），伤寒杆菌Salmonella enterica (CCTCC:AB2010185)，产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca (CCTCC:AB2010143）；真菌：热带假丝酵母（Candida tropicalis）。以上革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌均购于中国典型培养物保藏中心。

多重耐药菌：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA 菌株（16436、16465、16558、16559、16585、16679、16731、16748 和16760）和万古霉素耐药肠球菌VRE 菌株（E1、E11、E128、E147、E156、E161、E179 和S13）；实验使用的MRSA 以及VRE 所有菌株均从北京朝阳医院分离的。

对以上细菌采用96 孔板培养法试验：（1）分别将革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌和多重耐药菌菌株培养到OD₆₀₀=0.4 时，用新鲜培养基稀释至OD₆₀₀=0.002 后取160μl加入到96 孔板中，然后分别向各孔加入40 μl 经等比稀释的抗菌肽Pi_4或抗菌肽Pi_4_Mu，负对照只加菌，空白对照只有培养基；（2）37℃培养12 小时后，用酶标仪测96 孔板中各孔的在600nm 波长处的吸光值；（3）确定非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4及抗菌肽Pi_4_Mu的10 倍稀释的最低抑制浓度之后将最低抑制浓度进行2 倍等比稀释，重复本实验实例实验的前两个步骤，最终确定非洲帝王蝎毒抗菌肽Pi_4及抗菌肽Pi_4_Mu 对细菌的最低抑制浓度。

试验结果见表1和表2。非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4对革兰氏细菌和真菌的抗菌结果为：（1）对革兰氏阴性细菌：大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）、产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）、阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）的最小抑制菌生长浓度(minimal inhibitory concentration, MIC) 均大于32 μM；伤寒杆菌（Salmonella enterica）的MIC为32μM；（2） 对革兰氏阳性细菌：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、珊瑚诺卡氏菌（Nocardia corallina）、苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）、巨大芽孢杆菌（B. megaterium）的MIC 分别为8 μM、16 μM、16 μM、和16 μM；（3）对真菌：热带假丝酵母（Candida tropicalis）的MIC为16 μM。抗菌肽Pi_4_Mu对革兰氏细菌和真菌的抗菌效果更好，特别是对革兰氏阳性菌和真菌的MIC显著提高：对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌（S. aureus）、珊瑚诺卡氏菌（N. corallina）、苏云金芽胞杆菌（B. thuringiensis）、巨大芽孢杆菌（B. megaterium）的MIC 分别为4 μM、4 μM、8 μM、和4 μM；对革兰氏阴性菌恶臭假单胞菌（P putida）、伤寒杆菌（S enterica）的MIC分别为32 μM和4μM；对真菌：热带假丝酵母（Candida tropicalis）的MIC为4 μΜ。表1的抗菌结果表明所述非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4和抗菌肽Pi_4_Mu对革兰氏细菌有广谱抗菌活性，特别地可作用于革兰氏阳性菌和真菌，其中抗菌肽Pi_4_Mu对革兰氏阳性菌和真菌的抗菌效果更好，因此非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4和抗菌肽Pi_4_Mu可以用于制备治疗或预防革兰氏细菌及真菌引起的各种疾病的药物中。

表1 非洲帝王蝎毒抗菌肽Pi_4和抗菌肽Pi_4_Mu对革兰氏细菌和真菌的抑制效果

非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4对多重耐药性病原菌的抗菌结果为：（1）对从北京朝阳医院分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA：菌株16558、16472、16713、16465、16478、16679 的MIC 为8 μM，菌株16436的MIC为16μM、菌株16585和16760 的MIC 均为32 μM；（2）对万古霉素耐药肠球菌VRE：菌株S13、E128和E147的MIC 均为8 μM，菌株E1、E161、E11、E156的MIC均为12 μM， 菌株E179的MIC大于12 μM。抗菌肽Pi_4_Mu对多重耐药性病原菌的抗菌结果为：（1）对从北京朝阳医院分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA：菌株16472和16478、MIC为2 μM，菌株16558、16713、16436、16465、16585、16760、16679的MIC为8 μM；（2）对万古霉素耐药肠球菌VRE：菌株S13、E128、E156、E179 和E147的MIC 均为6 μM，菌株E1、E161和E11的MIC 均为8 μM。表2的抗菌结果表明，所述非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4和抗菌肽Pi_4_Mu在低浓度的条件下就能高效抑制MRSA 以及VRE 的生长，可以应用于制备治疗或预防因MRSA 、VRE引起的疾病的药物中，尤其是制备治疗或预防因MRSA、VRE引起的呼吸相关性肺炎、败血症、脑膜炎、中耳炎、皮肤软组织感染、泌尿系统感染和中枢神经系统感染等严重感染性疾病的药物中。

表2 非洲帝王蝎毒抗菌肽Pi_4和抗菌肽Pi_4_Mu抑制MRSA 和VRE的效果

实施例5 非洲帝王蝎毒抗菌肽Pi_4 和抗菌肽Pi_4_Mu的人红细胞溶血性试验

1、用无菌的生理盐水（0.85% NaCl）重悬人的红细胞，1,000×g 离心10 min，重复以上操作直到红细胞悬浮液的OD值等于0.85% NaCl 溶液的OD 值。

2、用生理盐水稀释红细胞悬浮液直到浓度为1×10⁷~10⁸cells/mL。

3、实验组A_treatment 是含有不同浓度梯度的非洲帝王蝎毒抗菌肽Pi_4或抗菌肽Pi_4_Mu的红细胞悬浮液，空白组A_blank 只有红细胞悬浮液，100% 裂解组A_triton 是加入1%Triton X-100 的红细胞悬浮液，全部样品放在37℃条件下温育30min。

4、所有样品10,000×g 离心2 min，取上清，并测上清的OD_570nm 值。

5、测试非洲帝王蝎毒抗菌肽Pi_4 和抗菌肽Pi_4_Mu对红细胞的裂解率，其中裂解率按以下公式计算： hemolysis% = ( A_treatment-A_blank)/(A_Triton -A_blank )×100%

实验结果见图4，图4的结果显示：在低于8 µM的浓度下，抗菌肽Pi_4和抗菌肽Pi_4_Mu不能裂解红细胞，在8 µM、16µM、32 µM和64 µM浓度下，抗菌肽Pi_4对红细胞的裂解性分别是6.58%、22.85%、91.67%和95.75%，抗菌肽Pi_4_Mu对红细胞的裂解性是分别为3.82%、6.98%、10.03%和62.94%。上述红细胞溶血性实验表明，在有效MIC范围内，抗菌肽Pi_4和抗菌肽Pi_4_Mu对人红细胞的溶血较弱，其中抗菌肽Pi_4_Mu在32 µM（远高于其MIC值）浓度下，对人红细胞的溶血性很低，特别适合应用于抗菌肽药物的开发制备。

序列表

<110> 中国地质大学（武汉）

<120> 一种非洲帝王蝎抗菌肽基因、抗菌肽Pi_4、其结构同源抗菌肽、制备方法和应用

<160> 4

<210> 1

<211> 487

<212> DNA

<213> 非洲帝王蝎

<400> 1

gaatcgctag atttttcgtt cctgcataga tcttgatcct cacccgcaac aatgaagctg 60

atcagtttgg tgccaatgtt ctttcttgtg cttttagctg ttgactactg ccattctttt 120

ccatttctat tgagtctaat accaacggct atctccgcta tcaaaaagct tggtaaacgc 180

aacgttgatt caccaaatta cctggatttc cggaagcgag acctggattc agatctagat 240

gatcttgact tggatgatct gcaagaactc cttgacaaac tatcggatta ctaagaagac 300

acaaaacaga agatgactct atgtaaaatg caatacacct gtagtatata aattatatta 360

tagcaaagaa agtctgccaa acttatttaa aggcaagcat aaaacacaga aagataattg 420

tgtttactta gaggaataaa aattaatttt tgacgtaaga aaaaagaaaa aaaaaaaaaa 480

aaaaaaa 487

<210> 2

<211> 80

<212> PRT

<213> 非洲帝王蝎

<400> 2

Met Lys Leu Ile Ser Leu Val Pro Met Phe Phe Leu Val Leu Leu

1 5 10 15

Ala Val Asp Tyr Cys His Ser Phe Pro Phe Leu Leu Ser Leu Ile

20 25 30

Pro Thr Ala Ile Ser Ala Ile Lys Lys Leu Gly Lys Arg Asn Val

35 40 45

Asp Ser Pro Asn Tyr Leu Asp Phe Arg Lys Arg Asp Leu Asp Ser

50 55 60

Asp Leu Asp Asp Leu Asp Leu Asp Asp Leu Gln Glu Leu Leu Asp

65 70 75

Lys Leu Ser Asp Tyr

80

<210> 3

<211> 18

<212> PRT

<213> 非洲帝王蝎

<400> 3

Phe Pro Phe Leu Leu Ser Leu Ile Pro Thr Ala Ile Ser Ala Ile

1 5 10 15

Lys Lys Leu

<210> 4

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Phe Lys Phe Leu Leu Lys Leu Ile Pro Thr Ala Ile Ser Ala Ile

1 5 10 15

Lys Lys Leu

Claims (6)

1.一种非洲帝王蝎抗菌肽基因，其特征在于，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述的非洲帝王蝎抗菌肽基因编码的非洲帝王蝎抗菌肽，其特征在于，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

3.人工合成的非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4，其特征在于，它的氨基酸序列如序列表SEQ IDNO：3所示。

4.权利要求3所述的人工合成的非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4的结构同源抗菌肽，其特征在于，氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：4所示。

5.非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4及其结构同源抗菌肽的人工合成方法，其特征在于：分别根据序列表SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，采用固相化学法合成多肽序列，并对合成的多肽进行C端酰胺化，然后通过HPLC反相C18柱层析脱盐、纯化得到非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4及其结构同源抗菌肽。

6.非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4及其结构同源抗菌肽在制备治疗或预防多重耐药性病原菌和革兰氏细菌的药物中的应用，所述非洲帝王蝎抗菌肽Pi_4及其结构同源抗菌肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示，所述多重耐药性病原菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和万古霉素耐药肠球菌。