CN113558145B - 抗菌短肽lbd-q在制备抗菌产品中的应用及其药物、饲料添加剂和饲料 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗菌短肽LBD‑Q在制备抗菌产品中的应用及其药物、饲料添加剂和饲料，涉及生物技术领域。本发明提供了一种抗菌短肽LBD‑Q在制备抗菌产品中的应用，其氨基酸序列为：CTYKVKPKLQRFKLYFLGTVTC，经发明人研究发现，该抗菌短肽LBD‑Q抗菌活性高，对于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有较强的抑制作用，能够清除动物体内的病菌，并保护动物机体，相较于改造前的抗菌短肽LBD‑ALF，本发明提供的抗菌短肽LBD‑Q对于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抑制作用明显增强，能够用于制备抗菌的产品中。

Description

抗菌短肽LBD-Q在制备抗菌产品中的应用及其药物、饲料添加 剂和饲料

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种抗菌短肽LBD-Q在制备抗菌产品中的应用及其药物、饲料添加剂和饲料。

背景技术

无脊椎动物主要或全部依赖于自身先天性免疫系统进行对病原生物的感染或入侵的抵御，其中抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)在其中扮演着极其重要的角色，诸多研究发现对虾类AMPs具有较强抗菌、抗病毒等活性，因其在水产养殖业中的潜在应用前景及杀灭细菌或病毒的功能而备受关注。甲壳类抗菌肽主要分为甲壳素(Crustins)、对虾素(Penaeidins)以及抗脂多糖因子(ALFs)，具有一定的抗菌或抗病毒活性。ALFs是对虾抗菌肽中的重要组成部分之一，是宿主对细菌、真菌和病毒的防御的重要和关键的组成部分。

抗菌肽因其选择性、作用速度和不易细菌产生耐药性而成为十分具有吸引力的候选药物和饲料添加剂。

天然和人工合成的抗菌肽是克服耐药性的主要选择之一。由于抗生素的耐药性不断增强，急需新的感染治疗方法。抗菌肽为此提供了机会，近年来，抗菌肽的鉴定和优化改造引起了科研学者的极大兴趣。迄今为止，已有越来越多来源于不同物种的抗菌肽被鉴定，并上传于抗菌肽的数据库ADB中。而总体来说，目前的抗菌肽的基本结构可分为以下几种基本结构类型，分别是α螺旋，β折叠，环形结构以及伸展结构。以这四种结构作为基础，构成相对多种多样的抗菌肽，对结构的理解有助于更好的解释抗菌肽的活性。

目前鉴定和分离的众多天然抗菌肽活性不是很理想，或对真核细胞存在一定的毒性，因此对抗菌肽进行设计和改造成为克服此类缺点的首选方法，有助于未来开发具有吸引力的新型抗菌肽。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种抗菌短肽LBD-Q在制备抗菌产品中的应用，以解决上述问题中的至少一种。

本发明的第二目的在于提供一种药物，该药物包括抗菌短肽LBD-Q。

本发明的第三目的在于提供一种饲料添加剂，该饲料添加剂包括抗菌短肽LBD-Q。

本发明的第四目的在于提供一种饲料，该饲料包括上述饲料添加剂。

第一方面，本发明提供了一种抗菌短肽LBD-Q在制备抗菌产品中的应用，所述抗菌短肽LBD-Q的氨基酸序列为：CTYKVKPKLQRFKLYFLGTVTC。

作为进一步技术方案，所述抗菌短肽LBD-Q的氨基端的半胱氨酸和羧基端的半胱氨酸之间具有二硫键结构。

作为进一步技术方案，所述抗菌短肽LBD-Q的氨基端和羧基端各自独立的进行了修饰。

作为进一步技术方案，所述抗菌短肽LBD-Q的氨基端进行了乙酰化修饰。

作为进一步技术方案，所述抗菌短肽LBD-Q的羧基端进行了酰胺化修饰。

作为进一步技术方案，所述菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。

作为进一步技术方案，所述革兰氏阳性菌包括枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、谷氨酸棒状杆菌、溶壁微球菌或藤黄微球菌中的至少一种；

所述革兰氏阴性菌包括大肠杆菌、荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、美人鱼发光杆菌、弗氏志贺氏菌、嗜水气单胞菌或溶藻弧菌中的至少一种。

第二方面，本发明提供了一种抗菌的药物，包括抗菌短肽LBD-Q。

第三方面，本发明提供了一种饲料添加剂，包括抗菌短肽LBD-Q。

第四方面，本发明提供了一种饲料，包括以上的饲料添加剂。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供了一种抗菌短肽LBD-Q在制备抗菌产品中的应用，其氨基酸序列为：CTYKVKPKLQRFKLYFLGTVTC，经发明人研究发现，该抗菌短肽LBD-Q抗菌活性高，对于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有较强的抑制作用，能够清除动物体内的病菌，并保护动物机体，相较于改造前的抗菌短肽LBD-ALF，本发明提供的抗菌短肽LBD-Q对于枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、谷氨酸棒状杆菌、溶壁微球菌、大肠杆菌、荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、弗氏志贺氏菌、嗜水气单胞菌和溶藻弧菌的抑制作用明显增强，能够用于制备抗菌的产品中。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为抗菌短肽LBD-Q的反相高效液相色谱图；

图2为抗菌短肽LBD-Q的质谱分析报告；

图3为抗菌短肽LBD-Q对待测菌的杀菌动力学分析，A代表金黄色葡萄球菌，B代表大肠杆菌；

图4为SEM观察LBD-Q与金黄色葡萄球菌孵育后的超显微整体变化，A代表用无菌水代替LBD-Q的空白对照组，B代表用pGFP代替LBD-Q的阴性对照组；C-F依次代表与LBD-Q共同孵育15min、30min、1h、2h后的金黄色葡萄球菌；

图5为SEM深度观察LBD-Q与金黄色葡萄球菌孵育后的超显微整体变化，a-d依次代表与LBD-Q共同孵育0min、30min、1h、2h后的金黄色葡萄球菌；

图6为SEM观察LBD-Q与大肠杆菌孵育后的超显微整体变化，A代表用无菌水代替LBD-Q的空白对照组，B代表用pGFP代替LBD-Q的阴性对照组；C-F依次代表与LBD-Q共同孵育15min、30min、1h、2h后的大肠杆菌；

图7为SEM深度观察LBD-Q与大肠杆菌孵育后的超显微整体变化，a-d依次代表与LBD-Q共同孵育0min、30min、1h、2h后的大肠杆菌；

图8为SEM深度观察LBD-Q与溶藻弧菌孵育后的超显微整体变化，A代表用无菌水代替LBD-Q的空白对照组，B代表用pGFP代替LBD-Q的阴性对照组；C-F依次代表与LBD-Q共同孵育15min、30min、1h、2h后的溶藻弧菌；

图9为TEM观察LBD-Q与金黄色葡萄球菌共同孵育后变化，A代表用无菌水代替LBD-Q的空白对照组，B代表用pGFP代替LBD-Q的阴性对照组，C和D分别代表与LBD-Q共同孵育1h和2h后的金黄色葡萄球菌；

图10为TEM观察LBD-Q与大肠杆菌共同孵育后变化，A代表用无菌水代替LBD-Q的空白对照组，B代表用pGFP代替LBD-Q的阴性对照组，C和D分别代表与LBD-Q共同孵育1h和2h后的大肠杆菌；

图11为TEM观察LBD-Q与溶藻弧菌共同孵育后变化，A代表用无菌水代替LBD-Q的空白对照组，B代表用pGFP代替LBD-Q的阴性对照组，C和D分别代表与LBD-Q共同孵育1h和2h后的溶藻弧菌；

图12为抗菌短肽LBD-Q与金黄色葡萄球菌基因组DNA的结合活性，M：核酸分子量标准；1：与无菌水共孵后的DNA；2：与40μM pGFP共孵后的DNA；3-8：依次为与1.25、2.5、5、10、20和40μM的LBD-Q共孵后的DNA；

图13为抗菌短肽LBD-Q与溶藻弧菌基因组DNA的结合活性，M：核酸分子量标准；1：与无菌水共孵后的DNA；2：与40μM pGFP共孵后的DNA；3-8：依次为与1.25、2.5、5、10、20和40μM的LBD-Q共孵后的DNA；

图14为抗菌短肽LBD-Q与溶藻弧菌共孵处理后的日本囊对虾累积死亡率，每组对虾个数在统计死亡率时为30尾，p<0.05的显著性差异由柱上的*表示；

图15为抗菌短肽LBD-Q与金黄色葡萄球菌共孵处理后的日本囊对虾累积死亡率，每组对虾个数在统计死亡率时为30尾，p<0.05的显著性差异由柱上的*表示。

具体实施方式

下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

第一方面，本发明提供了一种抗菌短肽LBD-Q在制备抗菌产品中的应用，所述抗菌短肽LBD-Q的氨基酸序列为：CTYKVKPKLQRFKLYFLGTVTC。

经发明人研究发现，该抗菌短肽LBD-Q抗菌活性高，对于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有较强的抑制作用，能够清除动物体内的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，并保护动物机体，相较于改造前的抗菌短肽LBD-ALF，本发明提供的抗菌短肽LBD-Q对于枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、谷氨酸棒状杆菌、溶壁微球菌、大肠杆菌、荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、弗氏志贺氏菌、嗜水气单胞菌和溶藻弧菌的抑制作用明显增强，能够用于制备抗菌的产品中。

在一些优选的实施方式中，所述抗菌短肽LBD-Q的氨基端的半胱氨酸和羧基端的半胱氨酸之间具有二硫键结构。

本发明提供的抗菌短肽LBD-Q的氨基端为半胱氨酸，羧基端为半胱氨酸，两个半胱氨酸之间能够形成二硫键，提高抗菌短肽LBD-Q的稳定性。

在一些优选的实施方式中，所述抗菌短肽LBD-Q的氨基端和羧基端各自独立的进行了修饰。对抗菌短肽LBD-Q的氨基端和羧基端进行化学修饰，形成末端封闭以起到增强短肽的稳定性的作用。本发明中对于抗菌短肽LBD-Q的氨基端和羧基端修饰的方式不做具体限制，能够提高短肽的稳定性，不妨碍其功能的行使即可。

在一些优选的实施方式中，所述抗菌短肽LBD-Q的氨基端进行了乙酰化修饰；

在一些优选的实施方式中，所述抗菌短肽LBD-Q的羧基端进行了酰胺化修饰。

在本发明中，通过对抗菌短肽LBD-Q的氨基端进行了乙酰化修饰，羧基端进行了酰胺化修饰以提高抗菌短肽LBD-Q的稳定性。

在一些优选的实施方式中，所述菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。

在一些优选的实施方式中，所述革兰氏阳性菌包括枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、谷氨酸棒状杆菌、溶壁微球菌或藤黄微球菌中的至少一种；

所述革兰氏阴性菌包括大肠杆菌、荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、美人鱼发光杆菌、弗氏志贺氏菌、嗜水气单胞菌或溶藻弧菌中的至少一种。

在一些优选的实施方式中，所述产品可以为药物、制剂、饲料添加剂或者包括抗菌短肽LBD-Q的饲料等。

第二方面，本发明提供了一种抗菌的药物，包括抗菌短肽LBD-Q。

在本发明中，抗菌的药物包括但不限于替考拉宁，将抗菌短肽LBD-Q和替考拉宁共同使用能够进一步提高药物的抗菌效果。

第三方面，本发明提供了一种饲料添加剂，包括抗菌短肽LBD-Q。

经发明人研究发现，本发明提供的抗菌短肽LBD-Q抗菌活性高，对于病菌具有较强的抑制作用，能够清除动物体内的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，并保护动物机体，因此，包括该抗菌短肽LBD-Q的药物或者饲料添加剂也具有抗菌短肽LBD-Q的所有功效，能够用于对革兰氏阳性菌的防治。

第四方面，本发明提供了一种饲料，包括上述饲料添加剂。

包括以上饲料添加剂的饲料也具有抗菌功效，能够用于虾等无脊椎动物的养殖领域中。

下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

实施例1基于MjALF-D进行抗菌肽LBD短肽的改造

根据对MjALF-D的LBD短肽的理化性质以及结构信息进行分析，分析软件使用Expert Protein Analysis Software(ExPASy)网站中的ProtParam在线分析软件(http://www.expasy.org/tools/protparam)以及The Antimicrobial Peptide Database(APD，http://aps.unmc.edu/AP/main.php)在线分析软件，得到多肽的相关参数。短肽的亲水疏水氨基酸的排布分析以及螺旋轮投影均使用在线分析软件Heliquest analysis(http://heliquest.ipmc.cnrs.fr/cgi-bin/ComputParams.py)(Gautier et al.,2008)进行。对MjALF-D的LBD短肽(LBD-ALF)在APD抗菌肽系统中进行序列比对，根据比对结果以及得到的所有相关参数，进行氨基酸的替换，从而改善短肽活性并改造设计新的LBD短肽，设计得到的新的短肽LBD-Q的理化性质如表1所示。

LBD-ALF和LBD-Q的氨基酸序列如下：

LBD-ALF：CTYNVKPDLQRFELYFLGTVTC(SEQ ID NO.1)；

LBD-Q：CTYKVKPKLQRFKLYFLGTVTC(SEQ ID NO.2)。

表1 LBD-Q短肽的理化性质分析

实施例2抗菌短肽LBD-Q短肽的人工合成

对已改造设计完成的抗菌LBD短肽进行合成。合成方法是按照固相化学合成，合成方向为从LBD-Q短肽的C端至N端，且在N端进行乙酰化修饰，在C端进行酰胺化修饰，形成末端封闭以起到增强合成多肽的稳定性的作用。两个半胱氨酸之间形成了一个二硫键，合成的LBD-Q短肽经反相高效液相色谱法进行纯化并检测其纯度，使用质谱法对LBD-Q短肽进行质谱鉴定，结果分别如图1和图2所示，根据图1的计算得到本实施例提供的LBD-Q短肽的纯度为98％，有图2所示的质谱图检测结果可以看出，本实施例提供的LBD-Q短肽的分子质量为2886.52。

实施例3抗菌短肽LBD-Q的MIC及MBC测定

蛋白最小抑菌浓度(MIC)及最小杀菌浓度(MBC)的检测分析采用液体生长抑制测定法进行，具体测定方法参照如下文献：

[1]Ying P,Libing Z,Mao Y,et al.The antibacterial activity andmechanism analysis of piscidin 5like from Larimichthys crocea[J].2019,92:43-49.

结果如表2所示。

表2 LBD-ALF及LBD-Q短肽的MIC及MBC(单位：μM)

注：NT：未检测。

实施例4杀菌动力学测定

将浓度为1×10⁸CFU/mL的待测菌(待测菌分别为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌)分别与等体积浓度为2×MBC(20μM)和4×MBC的抗菌短肽LBD-Q混合，于灭菌的一次性96孔板中进行测孵育。以无菌水取代LBD-Q与待测菌进行孵育作为空白对照。

分别在0、15、30、60、120、180、240、300和360min时间点吸取5μL的混合培养物，取磷酸缓冲液100μL对混合培养物进行稀释，之后均匀涂布在MHA固体培养基上，于28℃或37℃条件下在恒温培养箱中培养12-15h，对长成的菌落个数进行计数，并分别计算其CFU值，计算公式为CFU(％)＝实验组CFU/对照组(0min)CFU*100％。每组各设置2个平行，重复3次。通过SPSS 17.0对数据进行单因素方差比较各组间的差异。结果如图3所示。

在2×MBC及4×MBC两种不同浓度的LBD-Q处理下，金黄色葡萄球菌在15min时，并未有明显差异；在处理30min时，随着共孵时间的延长，4×MBC的LBD-Q对金黄色葡萄球菌的杀伤指数增大；在处理3h后，随着时间的推移杀伤能力逐渐降低，曲线趋于平缓，如图3中的A所示。

LBD-Q对大肠杆菌杀伤力较金黄色葡萄球菌更为迅速(图3中的B)，在孵育2h时，大肠杆菌在2×MBC及4×MBC浓度的LBD-Q作用下几乎全部死亡。因此，通过杀菌动力学曲线结果可以得知，LBD-Q对细菌的杀灭活性具有剂量及时间依赖性。

实施例5LBD-Q与细菌孵育的扫描电镜(SEM)观察

将80μM LBD-Q分别与等体积的浓度为1×10⁸CFU/mL的待测菌(待测菌分别为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、溶藻弧菌)菌液进行共孵，将灭菌后的无酶水分别和等体积的浓度为1×10⁸CFU/mL的待测菌菌液共同孵育视为空白对照组，将80μM pGFP分别与等体积的浓度为1×10⁸CFU/mL的待测菌菌液孵育组作为阴性对照组，置于37℃恒温培养箱进行培养，分别于15min、30min、1h以及2h取样，进行扫描电镜(SEM)观察。结果如图4-8所示

其中，以绿色荧光蛋白的氨基酸序列为基础，合成一个含有24个氨基酸的多肽(pGFP)(登录号：AAN41637)作为后续功能验证所用的阴性对照，pGFP的氨基酸序列如下：

pGFP：TTGKLPVPWPTLVTTFSYGVQCFS(SEQ ID NO.3)。

从图4中可以看出，空白对照组(图4中的A)以及阴性对照组(图4中的B)的金黄色葡萄球菌不黏连，细菌胞体较为独立且形态完整，呈现光滑的球形。在经过LBD-Q处理后15min(图4中的C)，菌体开始轻微聚集，并且细胞间开始出现丝状物黏连；处理30min后(图4中的D)，菌体细胞成团，且出现粘稠物质包裹菌体；处理1h后(图4中的E)，大量菌体聚集，粘稠物质逐渐增多，直至处理2h后(图4中的F)，菌体在粘稠物包裹下失去原本完整的形状，类似解体死亡。

通过50000×放大进行扫描电镜深度观察，可以更加清晰地看到在被LBD-Q处理30min后(图5中的B)的金黄色葡萄球菌已失去对照组金黄色葡萄球菌完整且表面光滑的状态，胞体出现皱缩凹陷；随着处理时间的推移，至处理1h后(图5中的C)，菌体皱缩更加严重，并出现黏性物质包裹菌体，处理2h后(图5中的D)，大量菌体聚集至菌体失去完整形状。

从图6中可以看出，对照组大肠杆菌细胞膜完整而且光滑，个体较为独立(图6中的A和B)；在与LBD-Q共孵15min后，视野中大肠杆菌开始增多，且出现丝状物在菌体之间；在共孵30min后，菌体间聚集现象更加明显，而且菌体之间开始出现黏连现象；至共孵1h后，细菌开始被不明黏状物裹覆，菌体皱缩；直至共孵时间达到2h，菌体被黏状物质包裹成片覆盖整个视野。

通过放大至50000倍的扫描电镜下观察，图7所示，对照组大肠杆菌形状完整，在与LBD-Q处理30min后，胞体之间出现明显的丝状物，并且菌体开始聚集，随着时间的推移，逐渐被大片黏性物质包裹至溃烂失去完整形状。

空白对照组以及阴性对照组的溶藻弧菌细胞独立，且胞体形状完整、成长杆状(图8中的A和B)；通过LBD-Q处理后的溶藻弧菌开始出现形态上的变化，处理15min后，如图8中的C所示，细菌表面开始变粗糙并有颗粒状现象；在处理30min后，细菌胞体表面颗粒状变得更加明显，菌体开始聚集(图8中的D)；在处理1h后，菌体聚集现象更加明显，细菌表面均出现了不同程度的凹陷或者破损现象(图8中的E)；直至LBD-Q处理溶藻弧菌2h后，如图8中的F所示，可以看到菌体最终破裂，失去完整形状，视野中出现部分碎片。

实施例6透射电镜(TEM)观察LBD-Q对细菌的超微结构的影响

将80μM LBD-Q分别与等体积的浓度为1×10⁸CFU/mL的待测菌(待测菌分别为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、溶藻弧菌)菌液进行共孵，将灭菌后的无酶水和等体积的浓度为1×10⁸CFU/mL的待测菌菌液共同孵育视为空白对照组，将80μM pGFP与等体积的浓度为1×10⁸CFU/mL的待测菌菌液孵育组作为阴性对照组，置于37℃恒温培养箱进行培养，于1h和2h分别取样进行透射电镜(TEM)观察。结果如图9-11所示。

用透射电镜观察了暴露于GAP的金黄色葡萄球菌细胞内微观变化，观察到对照组的金黄色葡萄球菌细胞壁及细胞膜外观完整、清晰(图9中的A、图9中的B)。经过LBD-Q处理1h后，从图9中的C可以看到菌体胞内颜色开始变浅，细胞质呈现内陷现象，当处理2h后，菌体细胞壁及细胞膜均破裂，内容物外泄(图9中的D)。

从图10中的A和B中可以观察到空白对照组及阴性对照组的大肠杆菌细菌壁及细胞膜均完整、光滑；在LBD处理细菌1h后，菌体内呈现空泡化现象，细菌细胞质发生聚集，细胞壁与细胞膜分离，细胞内容物向内皱缩(图10中的C)；在处理2h后，细菌细胞形态变化更为明显，菌体出现裂解现象，胞质流出，视野中可见细胞碎片(图10中的D)。

通过透射电镜观察对照组及实验组中溶藻弧菌的超显微结构变化，结果如图11所示。对照组溶藻弧菌细胞形状完整(图11中的A、B)。与LBD-Q共孵1h后，图11中的C显示部分细胞细胞壁边界模糊，细胞胞质不均且出现内陷现象，视野中可见部分细胞碎片及流出的细胞质。在处理2h后，细菌质外流，细胞结构丧失(图11中的D)。说明LBD-Q可以破坏细菌的细胞壁和细胞膜，导致内容物外流至细菌死亡失。

实施例7 LBD-Q与细菌基因组DNA结合

提取待测菌(待测菌分别为金黄色葡萄球菌、溶藻弧菌)DNA，将200ng待测菌与不同浓度梯度的LBD-Q进行共同孵育，分别以无菌水和pGFP代替LBD短肽在同样条件下分别与同样质量的待测菌DNA共同孵育作为空白对照和阴性对照。孵育结束之后，以0.8％的Agarose进行电泳检测分析，结果如图12-图13所示。

结果表明，当LBD-Q短肽的浓度达到10μM时，出现微弱结合现象，样品开始呈现拖尾现象，条带变浅；当浓度达到20及40μM时，出现凝胶阻滞现象，LBD-Q与金黄色葡萄球菌以及溶藻弧菌的DNA分子相互结合进而导致分子量增大，样品滞留在点样孔中而无法跑出，因而DNA的条带消失。因此，随着LBD-Q浓度的增加，与两种细菌的基因组DNA的相互作用能力均有所增强。结果表明，LBD-Q对细菌基因组DNA具有一定的结合能力且具有一定的浓度依赖。

实施例8 LBD-Q对日本囊对虾体内抗感染保护实验

为了检测在活体水平上LBD-Q对日本囊对虾的抗感染免疫保护能力，研究LBD-Q在体内对细菌的抑制、清除及保护机体的能力。在对日本囊对虾注射LBD-Q与免疫刺激物的注射混合液后，与对照组进行比较，统计日本囊对虾的累计死亡率。

1注射液的制备

选择待测菌(待测菌分别为金黄色葡萄球菌、溶藻弧菌)作为LBD-Q短肽对日本囊对虾抗细菌感染保护的免疫刺激源。

(1)取已活化的待测菌菌液以1:50接种至LB液体培养基中，过夜培养菌至对数生长期；

(2)4℃条件下，5000rpm离心10min，并使用灭菌生理盐水清洗菌体3次，去掉培养基上清后，将菌体沉淀用灭菌生理盐水进行重悬，并调整细菌浓度为5×10⁷CFU/mL；

(3)分别溶解LBD-Q短肽和pGFP短肽至浓度为80μM；

(4)取1.5mL的菌液分别与等体积的LBD-Q短肽、pGFP短肽和生理盐水进行混匀，使得LBD-Q短肽或pGFP短肽的终浓度为40μM；在摇床上室温共同孵育30min，即得到待注射的混合液并及时进行后续注射实验。

2注射实验

将160尾日本囊对虾平均随机分为4组，每组40尾，分组设置如下方所示：

空白对照组：生理盐水；

阳性对照组：生理盐水+金黄色葡萄球菌；生理盐水+溶藻弧菌；

阴性对照组：pGFP+金黄色葡萄球菌；pGFP+溶藻弧菌；

实验组：LBD-Q+金黄色葡萄球菌；LBD-Q+溶藻弧菌。

注射时，向各组对虾的第二腹节注射50μL的已制备好的待注射混合液，最终阳性对照、阴性对照以及实验组的每尾虾体内分别含1.25×10⁶CFU待测菌。

结果如图14-15所示，注射细菌与LBD-Q孵育后的混合液的实验组的累计死亡率均显著低于注射细菌与生理盐水或pGFP孵育后的对照组的累计死亡率。在注射溶藻弧菌中的阳性对照及阴性对照组结果中可以发现溶藻弧菌对于对虾有着较强的致死作用，而实验组注射LBD-Q与溶藻弧菌共孵混合液的对机体很好的保护作用，对溶藻弧菌有较强的抑制作用(图14)。

而金黄色葡萄球菌对虾的死亡曲线较溶藻弧菌组稍微推迟一些，从图15可以看出，说明金黄色葡萄球菌对于对虾也具有较强的致死作用，但与溶藻弧菌相比稍弱一些；LBD-Q同样可以对金黄色葡萄球菌有一定的抑制作用。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京师范大学珠海校区

<120> 抗菌短肽LBD-Q在制备抗菌产品中的应用及其药物、饲料添加剂和饲料

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Cys Thr Tyr Asn Val Lys Pro Asp Leu Gln Arg Phe Glu Leu Tyr Phe

1 5 10 15

Leu Gly Thr Val Thr Cys

20

<210> 2

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Cys Thr Tyr Lys Val Lys Pro Lys Leu Gln Arg Phe Lys Leu Tyr Phe

1 5 10 15

Leu Gly Thr Val Thr Cys

20

<210> 3

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe

1 5 10 15

Ser Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser

20

Claims (8)

1.抗菌短肽LBD-Q在制备抗菌产品中的应用，所述抗菌短肽LBD-Q的氨基酸序列为：CTYKVKPKLQRFKLYFLGTVTC。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗菌短肽LBD-Q的氨基端的半胱氨酸和羧基端的半胱氨酸之间具有二硫键结构。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗菌短肽LBD-Q的氨基端和羧基端各自独立的进行了修饰；

所述抗菌短肽LBD-Q的氨基端进行了乙酰化修饰；

所述抗菌短肽LBD-Q的羧基端进行了酰胺化修饰。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述革兰氏阳性菌包括枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、谷氨酸棒状杆菌、溶壁微球菌或藤黄微球菌中的至少一种；

所述革兰氏阴性菌包括大肠杆菌、荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、美人鱼发光杆菌、弗氏志贺氏菌、嗜水气单胞菌或溶藻弧菌中的至少一种。

6.一种抗菌的药物，其特征在于，包括权利要求1-5任一项所述应用中的抗菌短肽LBD-Q。

7.一种饲料添加剂，其特征在于，包括权利要求1-5任一项所述应用中的抗菌短肽LBD-Q。

8.一种饲料，其特征在于，包括权利要求7所述的饲料添加剂。

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