CN109415412B - 与抗生素对革兰氏阴性多药耐药菌具有增效性抗菌效果的抗菌肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过谷氨酸替代提升抗菌效果的抗菌肽，更详细而言，涉及将所述抗菌肽用作抗菌用药物组合物、食品添加剂、饲料添加剂、防腐组合物以及抗菌非处方药组合物的有效成分的用途。本发明的抗菌肽不仅对革兰氏阴性菌表现出有意义的抗菌活性，将本发明的抗菌肽与仅对革兰氏阳性菌表现出强抗菌活性而对革兰氏阴性菌不具有抗菌活性或具有低抗菌活性的抗生素混合处理时，表现出有意义的协同效应，对革兰氏阳性菌以及革兰氏阴性菌中的大肠杆菌和鲍氏不动杆菌及其抗生素耐药菌能够表现出优异的抗菌效果。

Description

与抗生素对革兰氏阴性多药耐药菌具有增效性抗菌效果的抗 菌肽及其用途
技术领域
本申请主张2016年06月23日申请的韩国专利申请第10-2016-0078630号；2016年09月20日申请的韩国专利申请第10-2016-0120307号；2017年05月10日申请的韩国专利申请第10-2017-0058124号；2017年05月10日申请的韩国专利申请第10-2017-0058131号；以及2017年05月10日申请的韩国专利申请第10-2017-0058137号为优先权，所述说明书整体为本申请的参考文献。
本发明涉及对革兰氏阴性多药耐药菌具有抗菌活性的抗菌肽，提供一种通过氨基酸残基的替代抗菌效果提升的抗菌肽。更详细而言，涉及一种将所述抗菌肽用作抗菌用药物组合物、食品添加剂、饲料添加剂、防腐组合物以及抗菌非处方药组合物的有效成分的用途。
背景技术
细菌的感染是人类疾病中最普遍且致命的原因之一。在青霉素(penic illin)之后开发出种类繁多的抗生素，用于根除由外部侵入生物体的细菌。但是，最近出现对这些抗生素具有耐药性的菌株，被认为是重大问题。有可能对生命造成威胁的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)以及绿脓假单胞菌(Pseudomonas aer uginosa)等菌种，对于迄今为止已知的所有抗生素产生了抵抗力(Stuart B.Levy,Scientific American,(1988):46-53)。
对抗生素的耐药性(tolerance)是与对抗生素的抗性(resistance)有所区别的现象，1970年代最初在肺炎球菌(Pneumococcus sp.)发现，为青霉素的作用机理提供了重要线索(Tomasz et al.,Nature,227,(1970):138-140)。诸如青霉素、头孢菌素(Cephalosporin)等的现有的化学抗生素通过阻碍微生物细胞壁或蛋白质的合成来表现抗菌作用。但是，表现出耐药性的菌种，在通常浓度的抗生素存在条件下停止生长，但最终不会死亡。在抗生素抑制细胞壁合成酶时，不会产生诸如自溶素(autolysin)等的细菌的自溶(autolytic)酶的活性，因此产生耐药性，基于该事实，青霉素通过激活内生水解酶(endogenous hydrolytic enzyme)来杀灭细菌，而细菌又抑制它们的活性，从而出现在抗生素治疗时也能生存的结果。因此，开发具有能够根除耐药菌株的新的作用机制的抗生素迫在眉睫，表现出与现有的化学抗生素不同的抗菌机理的抗菌肽作为新概念的下一代抗生素备受瞩目(Zasloff M.Curr Opin Immunol 4(1992):3-7；Boman,H.G.,Ce ll,65.205(1991)；Boman,H.G.J Intern Med.254.3(2003):197-215；Hanco ck,R.E.,&Scott,M.G.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97(2000):8856-8861,Zasloff,M.,Nature 415(2002):389-395)。
最近，多药耐药性菌中作为革兰氏阴性菌的绿脓假单胞菌(P.aerugin osa)、鲍氏不动杆菌(A.baumannii)属于内生性的后天耐受性，又属于最频繁产生的菌种，成为抗生素耐药性问题严重的菌种。绿脓假单胞菌、鲍氏不动杆菌中,多药耐药性是指，对氨基糖苷类(Aminoglycoside)、氟喹诺酮(Fluoroquinolone)、碳青霉烯(Carbapenem)等三种系列的药剂均有耐药性的菌株，对于这些多药耐药性菌株来讲，碳青霉烯几乎是唯一有效的抗生素，但是在10余年间，所表现出的共同点是对碳青霉烯也具有耐药性的菌株增加，抗生素治疗中产生了较大限制。绿脓杆菌或绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是革兰氏阴性菌，作为常见的感染性病原菌，对抗生素的敏感性低，会自然地易于获得抗生素耐药性，是引发使用人工呼吸器的呼吸系统感染、烧伤感染、囊性纤维化病患者的肺炎、尿路感染的病原菌，存在于人工通风机、吸入导管、污染的积水等病原，直接或间接传播给患者并附着，患有进行性疾病的患者治疗困难，呈现出高死亡率。
鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)是革兰氏阴性好氧性球杆菌，是很多医院院内感染的重要原因，尤其最近被氨基糖苷类、头孢菌素、氟喹诺酮、β-内酰胺酶抑制剂(beta-lactamase inhibitors)、以及对碳青霉烯表现出耐药性的多药耐药性鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumann ii)(MRAB)感染的情形增加。2010年在东京大学医院，46人感染鲍氏不动杆菌，其中10人死亡的事件，在最近10年间，引起了对在全世界范围剧增的抗生素耐药性强的MRAB的警惕心，加快了抗生素开发的节奏。鲍氏不动杆菌本身普遍存在于水、土壤或人类的皮肤，健康的人即便感染也不会发病。但是，免疫力差的人感染时，会因肺炎或败血症死亡，从1990年代起在美国、欧洲等地增加，从2000年起甚至出现了几乎任何抗生素都不起作用的种类。通常多药耐药性鲍氏不动杆菌(multi-drug resistant Acinetobacter baumanni i,MDRAB)是指对氨基糖苷类、氟喹诺酮、碳青霉烯等三种系列的药剂均有耐药性的菌株，此时，唯一对粘杆菌素(Colisti n)具有敏感性，而鲍氏不动杆菌除此之外还能够对替加环素(Tigecyclin e)表现出敏感性。作为医疗相关感染的主要病原菌的鲍氏不动杆菌因多药耐药性，碳青霉烯几乎是唯一有效的抗生素，但是在10余年间，对碳青霉烯具有耐药性的菌株在增加，感染症状的治疗受到了较大限制。最近，绿脓假单胞菌的耐药率为20％左右，而鲍氏不动杆菌迅速增加，大部分的大型医院超过了50％，碳青霉烯的耐药率增加导致了鲍氏不动杆菌的增加，在2010年全国重症室医疗相关感染率调查中，超越绿脓假单胞菌，继耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、肠球菌属(Enterococcus sp.)，占病原菌频率第三位。因此，国内重症患者感染病原菌中，频率高、致死率高，迫切需要开发治疗剂。
广义上被称为免疫反应的抗原抗体反应在包括人类及无脊椎动物中，发挥着生物体防御的主要作用。但是，昆虫或两栖类通过强化不同于诸如抗原抗体反应的后天性免疫系统的先天性免疫系统来保护自己。不仅在昆虫或两栖类，这样的先天性免疫在包括人及脊椎动物中对早期感染作为重要防御系统发挥作用。先天性免疫系统的最重要手段是获取对多种微生物具有杀菌、去活作用的抗菌肽。以抗菌性肽为中心的具有抗微生物作用的肽或蛋白质作为包括我们人类及家畜等的疾病防治以及因各种病原菌感染而引起的抗生素，利用可能性高。最近，抗生素耐药性问题越发严重，对利用这种抗菌肽的新型的新药候选物质的关注正在增加。抗菌肽以细菌的膜为靶向，具有抗菌活性，因此认为具有对于对现有抗生素具有耐药性的菌株也保持活性的特性。因此，多种源自天然的抗菌肽可替代因耐药菌株的出现而受到威胁的现有抗生素，作为新概念的抗生素探索中的重要生物资源而备受关注。
目前为止发现的昆虫的抗菌蛋白质以及肽，最初由Boman博士研究团队报道Cecropia蛾的杀菌肽以来，从大约200多种的昆虫分离，根据这些结构和大小，大致分为杀菌肽类、防卫素类、Phlorin以及包含大量甘氨酸的肽。
杀菌肽是由31-39个氨基酸构成的碱性蛋白质，最近该研究团队获得授权的源自柑橘凤蝶幼虫的新型抗菌肽(Papiliocin)具有包含N-末端的两亲性螺旋结构和C-末端的疏水性螺旋(helix)的α-螺旋-铰链-α-螺旋结构，对多种病原菌的抗菌活性以及抗炎症活性优异(非专利文献1)。尤其，明确N-末端的具有螺旋结构的区域对抗菌活性产生重要的作用，确认到对耐药菌株的突出的抗菌能力和抗炎症活性，并公之于众(专利文献1、非专利文献2)。滑爪蟾素(Magainin 2，MA)是源自两栖类的两亲性肽，对多种菌具有抗菌活性，该研究团队明确了将杀菌肽的N-末端和滑爪蟾素的N-末端肽结合而成的CA-MA肽的三维结构，并确认到抗菌、抗炎症活性突出(非专利文献3)。
另外，最近发表了设计并合成将Papiliocin的N端区域的8个残基和滑爪蟾素(Magainin)的N-末端残基的9个混合肽连接而成的PapMA-1，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌的抗菌活性优异(非专利文献4)。
持续进行与连接Papiliocin以及滑爪蟾素而合成的肽有关的研究的结果，发明人从母体抗菌肽(PapMA-1)以能够使抗菌活性增效的方式替代氨基酸残基，设计了PapMA-2至PapMA-24的肽。与此同时，发明人确认到在本发明设计的抗菌肽不仅对革兰氏阴性菌表现出有意义的抗菌活性，与现有抗生素混合处理时表现出有意义的协同效应，不仅对革兰氏阳性菌，对革兰氏阴性菌中的大肠杆菌和鲍氏不动杆菌及其抗生素耐药菌株能够表现出优异的抗菌效果，从而完成了本发明。
在先技术文献
专利文献
专利文献1：KR10-1150281B1
非专利文献
非专利文献1：Kim,Jin-Kyoung,et al.“Structure and function o fpapiliocin with antimicrobial and anti-inflammatory activities isolated fromthe swallowtail butterfly,Papilio xuthus.”Journal of Biological Chemistry286.48(2011):41296-41311.
非专利文献2：Lee,Eunjung,et al.“Functional roles of aromati c residuesand helices of papiliocin in its antimicrobial and an ti-inflammatoryactivities.”Scientific reports 5(2015).
非专利文献3：Oh,Donghoon,et al.“Role of the hinge region an d thetryptophan residue in the synthetic antimicrobial peptides,cecropin A(1-8)-magainin 2(1-12)and its analogues,on their a ntibiotic activities andstructures.”Biochemistry 39.39(2000):11855-11864.
非专利文献4：Shin,Areum,et al.“Peptoid-Substituted Hybrid Antimicrobial Peptide Derived from Papiliocin and Magainin 2with EnhancedBacterial Selectivity and Anti-inflammatory Activity.”Biochemistry 54.25(2015):3921-3931.
发明内容
发明要解决的问题
为此，发明人以将作为抗菌肽的Papiliocin的N-末端区域的残基以及滑爪蟾素的N-末端区域的残基结合而成的PapMA-1抗菌肽为主型，在PapMA-1的序列中，通过第15个氨基酸即丙氨酸(A)被色氨酸(W)替代；和/或第18个氨基酸即苯丙氨酸(F)被色氨酸(W)替代，制备对革兰氏阴性菌的抗菌活性更高的PapMA-2、PapMA-3以及PapMA-4抗菌肽。
另外，所述PapMA-1至PapMA-4的肽中，第11个氨基酸被赖氨酸替代；和/或第15个氨基酸被苯丙氨酸或赖氨酸替代，来设计PapMA-5至PapMA-10的抗菌肽。
另外，所述PapMA-1至PapMA-10的肽中，第14个氨基酸即丝氨酸(S)被谷氨酸(E)替代，来设计PapMA-11至PapMA-14的抗菌肽。
另外，所述PapMA-2至PapMA-14的肽中，第9个氨基酸即脯氨酸(P)被D-赖氨酸(k)替代；和/或第14个氨基酸即谷氨酸(E)被L-赖氨酸(K)替代，来设计PapMA-15至PapMA-20的抗菌肽。
并且，所述PapMA-1至PapMA-20的肽中，第9个氨基酸即脯氨酸(P)或D-赖氨酸(k)被D-亮氨酸(l)替代，来设计PapMA-21至PapMA-24的抗菌肽。
确认到所述抗菌肽不仅对作为革兰氏阴性菌的大肠杆菌和鲍氏不动杆菌及其抗生素耐药菌表现出优异的抗菌效果，与抗生素一同给药时，能够表现出有意义的协同效应的抗菌活性，从而完成了本发明。
因此，本发明的目的在于，提供一种新型抗菌肽，其对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或其多药耐药菌表现出优异的抗菌活性。
另外，本发明的另一目的在于，提供一种抗菌组合物，其将所述抗菌肽作为有效成分。
并且，本发明的又一目的在于，提供一种抗菌组合物，将所述抗菌肽与抗生素一同以复合剂进行给药，而对革兰氏阴性多药耐药菌表现出优异的协同效应的抗菌活性。
解决技术问题的方案
为了实现上述目的，本发明提供一种抗菌肽，其由如下的氨基酸序列构成：由记载为序列编号1的氨基酸序列构成的肽中，发生选自由如下(i)至(v)所组成的组中的任意一个以上的替代：
(i)第9个氨基酸即脯氨酸(P)被D-赖氨酸(k)或D-亮氨酸(l)替代；
(ii)第11个氨基酸即苯丙氨酸(F)被亮氨酸(L)替代；
(iii)第14个氨基酸即丝氨酸(S)被谷氨酸(E)或L-赖氨酸(K)替代；
(iv)第15个氨基酸即丙氨酸(A)被色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)或亮氨酸(L)替代；
(v)第18个氨基酸即苯丙氨酸(F)被色氨酸(W)替代。
另外，本发明提供一种新型合成肽，其由选自由序列编号2至序列编号24所组成的组中的任意一个氨基酸序列构成。
本发明的优选一实施例中，所述抗菌肽由如下的氨基酸序列构成：由记载为序列编号1的氨基酸序列构成的肽中，第15个氨基酸即丙氨酸(A)以及第18个氨基酸即苯丙氨酸(F)中的任意一个或两个氨基酸被色氨酸(W)替代，这可以由记载为序列编号2至序列编号4的氨基酸序列中的任意一个构成。
本发明的优选一实施例中，所述抗菌肽可以由如下氨基酸序列构成：选自由序列编号1至序列编号4所组成的组中的任意一个氨基酸序列中，发生选自由第11个氨基酸即苯丙氨酸(F)被亮氨酸(L)替代；以及第15个氨基酸即丙氨酸(A)或色氨酸(W)被苯丙氨酸(F)或亮氨酸(L)替代所组成的组中的至少一个以上的替代，这可以由记载为序列编号5至10的氨基酸序列中的任意一个构成。
本发明的优选一实施例中，所述抗菌肽由如下氨基酸序列构成：选自由序列编号1至序列编号10所组成的组中的任意一个氨基酸序列中，第14个氨基酸即丝氨酸(S)被谷氨酸(E)替代，这由选自由序列编号11至序列编号14所组成的组中的任意一个氨基酸序列构成。
本发明的优选一实施例中，所述抗菌肽由如下氨基酸序列构成：选自由序列编号2至序列编号14所组成的组中的任意一个氨基酸序列中，发生选自由第9个氨基酸即脯氨酸(P)被D-赖氨酸(k)替代；以及第14个氨基酸即谷氨酸(E)被L-赖氨酸(K)替代所组成的组中的至少一个以上的替代，这由选自由序列编号15至序列编号20所组成的组中的任意一个氨基酸序列构成。
本发明的优选一实施例中，由如下氨基酸序列构成：选自由序列编号1至序列编号20所组成的组中的任意一个氨基酸序列中，第9个氨基酸即脯氨酸(P)或D-赖氨酸(k)被D-亮氨酸(l)替代，这由选自由序列编号21至序列编号24所组成的组中的任意一个氨基酸序列构成。
另外，本发明提供一种抗菌用药物组合物，其包含由如下氨基酸序列构成的抗菌肽作为有效成分：由记载为序列编号1的氨基酸序列构成的肽中，发生选自由如下(i)至(v)所组成的组中的任意一个以上的替代：
(i)第9个氨基酸即脯氨酸(P)被D-赖氨酸(k)或D-亮氨酸(l)替代；
(ii)第11个氨基酸即苯丙氨酸(F)被亮氨酸(L)替代；
(iii)第14个氨基酸即丝氨酸(S)被谷氨酸(E)或L-赖氨酸(K)替代；
(iv)第15个氨基酸即丙氨酸(A)被色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)或亮氨酸(L)替代；
(v)第18个氨基酸即苯丙氨酸(F)被色氨酸(W)替代。
另外，本发明提供一种将所述抗菌肽作为有效成分的食品添加剂。
另外，本发明提供一种将所述抗菌肽作为有效成分的饲料添加剂。
另外，本发明提供一种将所述抗菌肽作为有效成分的防腐组合物。
另外，本发明提供一种将所述抗菌肽作为有效成分的抗菌非处方药组合物。
并且，本发明提供一种抗菌用药物组合物，其将由如下的氨基酸序列构成的抗菌肽以及抗生素作为有效成分：由记载为序列编号1的氨基酸序列构成的肽中，发生选自由如下(i)至(v)所组成的组中的任意一个以上的替代：
(i)第9个氨基酸即脯氨酸(P)被D-赖氨酸(k)或D-亮氨酸(l)替代；
(ii)第11个氨基酸即苯丙氨酸(F)被亮氨酸(L)替代；
(iii)第14个氨基酸即丝氨酸(S)被谷氨酸(E)或L-赖氨酸(K)替代；
(iv)第15个氨基酸即丙氨酸(A)被色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)或亮氨酸(L)替代；
(v)第18个氨基酸即苯丙氨酸(F)被色氨酸(W)替代。
另外，本发明提供一种将所述抗菌肽以及抗生素作为有效成分的食品添加剂。
另外，本发明提供一种将所述抗菌肽以及抗生素作为有效成分的饲料添加剂。
另外，本发明提供一种将所述抗菌肽以及抗生素作为有效成分的防腐组合物。
另外，本发明提供一种将所述抗菌肽以及抗生素作为有效成分的抗菌非处方药组合物。
本发明的优选一实施例中，所述抗菌肽可以由记载为序列编号1至24的氨基酸序列中的任意一个构成。
本发明的另一优选实施例中，所述抗生素是选自由红霉素(Erythromycin)、氨苄青霉素(Ampicillin)、万古霉素(Vancomycin)、利奈唑胺(Linezolid)、甲氧西林(Methicillin)、苯唑西林(Oxacillin)、头孢噻肟(Cefotaxime)、利福平(Rifampicin)、阿米卡星(Amikacin)、庆大霉素(Gentamicin)、阿米卡星(Amikacin)、卡那霉素(Kanamycin)、妥布霉素(Tobramycin)、新霉素(Neomycin)、厄他培南(Ertapenem)、多尼培南(Doripenem)、亚胺培南/西司他汀(Imipenem/Cilastatin)、美罗培南(Meropenem)、头炮他啶(Ceftazidime)、头孢吡肟(Cefepime)、头孢洛林(Ceftaroline)、头孢吡普(Ceftobiprole)、氨曲南(Aztreonam)、哌拉西林(Piperacillin)、多粘菌素B(PolymyxinB)、粘杆菌素(Colistin)、环丙沙星(Ciprofloxacin)、左氧氟沙星(Levofloxacin)、莫西沙星(Moxifloxacin)、加替沙星(Gatifloxacin)、替加环素(Tigecycline)、其组合以及它们的衍生物所组成的组中的任意一个以上。
本发明的又一优选实施例中，所述抗菌用药物组合物对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及其抗生素耐药菌株具有抗菌活性。
本发明的又一优选实施例中，所述革兰氏阳性菌是选自由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)所组成的组中的任意一个以上。
本发明的优选一实施例中，所述革兰氏阴性菌是选自由大肠杆菌(Escherichiacoli)、绿脓假单胞菌(Psedomonas aeruginosa)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)或鼠伤寒沙门杆菌(Salmonella typhimurium)所组成的组中的任意一个以上。
发明效果
因此，本发明提供一种从柑橘凤蝶幼虫分离的抗菌肽Papiliocin(Pap)的N-端区域和滑爪蟾素(Magainin 2，MA)的N-末端区域残基连接而成的Papiliocin混合肽衍生物即抗菌肽PapMA-1，与此同时，提供一种所述PapMA-1的肽中替代氨基酸残基以提升抗菌活性的PapMA-2至PapMA-24的抗菌肽。
本发明的抗菌肽通过替代氨基酸残基，与母体肽相比，抗菌效果能够提升。由此，不仅对革兰氏阴性菌表现出有意义的抗菌活性，将本发明的抗菌肽与仅对革兰氏阳性菌表现出强抗菌活性而对革兰氏阴性菌不具有抗菌活性或具有低抗菌活性的抗生素混合处理时，表现出有意义的协同效应，不仅对革兰氏阳性菌，对革兰氏阴性菌及其抗生素耐药菌能够表现出优异的抗菌效果。因此，包含本发明的抗菌肽的抗菌组合物以及包含本发明的抗菌肽和抗生素的复合剂的抗菌组合物可以用作抗菌用药物组合物、食品添加剂、饲料添加剂、防腐组合物以及非处方药组合物，即使包含少量浓度的化学抗生素也能够表现出提升的抗菌活性。
附图说明
图1是确认8μg/ml的本发明的肽PapMA-1至PapMA-24与在售的抗生素对大肠杆菌(E.coli)的抗菌活性的协同效应的图。
图2是确认8μg/ml的本发明的肽PapMA-1至PapMA-24与在售的抗生素对大肠杆菌的耐药菌即MDREC的抗菌活性的协同效应的图。
图3是确认8μg/ml的本发明的肽PapMA-1至PapMA-24与在售的抗生素对鲍氏不动杆菌的抗菌活性的协同效应的图。
图4是确认8μg/ml的本发明的肽PapMA-1至PapMA-24与在售的抗生素对鲍氏不动杆菌的耐药菌即MDRAB的抗菌活性的协同效应的图。
具体实施方式
下面，对本发明进行详细说明。
要求开发对于对抗生素具有耐药性的多药耐药菌，表现出抗菌活性的抗生素，并且报道据此制备的抗菌肽，但是关于与现有抗生素一同混合处理而能够表现出协同效应的抗菌肽，日后需进一步研究。
本发明的抗菌肽不仅对革兰氏阴性菌表现出有意义的抗菌活性，而且与仅对革兰氏阳性菌表现出有效的抗菌活性的抗生素混合处理时，对作为革兰氏阴性菌的大肠杆菌以及不动杆菌及其抗生素耐药菌株，抗菌肽和抗生素通过优异的协同效应表现出抗菌活性，因此，即便投入少量的抗生素，对大肠杆菌以及不动杆菌及其多药耐药菌也能够表现出抗菌效果，故有效。
因此，本发明提供一种新型合成肽，其由如下氨基酸序列构成：由记载为序列编号1的氨基酸序列构成的肽中，发生选自由如下(i)至(v)所组成的组中的任意一个以上的替代：
(i)第9个氨基酸即脯氨酸(P)被D-赖氨酸(k)或D-亮氨酸(l)替代；
(ii)第11个氨基酸即苯丙氨酸(F)被亮氨酸(L)替代；
(iii)第14个氨基酸即丝氨酸(S)被谷氨酸(E)或L-赖氨酸(K)替代；
(iv)第15个氨基酸即丙氨酸(A)被色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)或亮氨酸(L)替代；以及
(v)第18个氨基酸即苯丙氨酸(F)被色氨酸(W)替代。
另外，本发明提供一种抗菌肽，其由如下氨基酸序列构成：由记载为序列编号1的氨基酸序列构成的肽中，发生选自由如下(i)至(v)所组成的组中的任意一个以上的替代：
(i)第9个氨基酸即脯氨酸(P)被D-赖氨酸(k)或D-亮氨酸(l)替代；
(ii)第11个氨基酸即苯丙氨酸(F)被亮氨酸(L)替代；
(iii)第14个氨基酸即丝氨酸(S)被谷氨酸(E)或L-赖氨酸(K)替代；
(iv)第15个氨基酸即丙氨酸(A)被色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)或亮氨酸(L)替代；以及
(v)第18个氨基酸即苯丙氨酸(F)被色氨酸(W)替代。
另外，本发明提供一种新型合成肽，其由选自由序列编号2至序列编号24所组成的组中的任意一个氨基酸序列构成。
本发明的“由记载为序列编号1的氨基酸序列构成的肽”是通过脯氨酸将Papiliocin(Pap)的N-末端区域的1至8区域的8个残基和滑爪蟾素(Magainin 2，MA)的N-末端的4至12区域的9个残基的肽连接而成的由18个残基构成的合成肽即PapMA-1(非专利文献4)。
所述“由记载为序列编号1的氨基酸序列构成的肽”中，第15个氨基酸即丙氨酸(A)被色氨酸(W)替代；和/或第18个氨基酸即苯丙氨酸(F)被色氨酸(W)替代，优选为记载为序列编号2至序列编号4中的任意一个氨基酸序列的抗菌肽。
所述“抗菌肽”的序列中，通过“丙氨酸(A)和/或苯丙氨酸(F)被色氨酸(W)替代”，序列能够被最优化，以表现出比由序列编号1的氨基酸序列构成的肽增强的抗菌活性，或者与现有的抗生素混合处理时，能够具备更高的协同效应。
更具体而言，所述抗菌肽中，由记载为序列编号2的氨基酸序列构成的抗菌肽是PapMA-2，是记载为序列编号1的氨基酸中第18个氨基酸即苯丙氨酸被色氨酸替代的序列。
由记载为序列编号3的氨基酸序列构成的抗菌肽是PapMA-3，是记载为序列编号1的氨基酸序列中第15个氨基酸即丙氨酸被色氨酸替代的序列。
由记载为序列编号4的氨基酸序列构成的抗菌肽是PapMA-4，是记载为序列编号1的氨基酸序列中第15个氨基酸即丙氨酸以及第18个氨基酸即苯丙氨酸被色氨酸替代的序列。
另外，本发明的抗菌肽是，所述“由记载为序列编号1至序列编号4的氨基酸序列构成的肽”中，第11个氨基酸即苯丙氨酸(F)被亮氨酸(L)替代；和/或第15个氨基酸即丙氨酸(A)或色氨酸(W)被苯丙氨酸(F)或亮氨酸(L)替代，优选为记载为序列编号5至序列编号10中的任意一个氨基酸序列的抗菌肽。
本发明的“肽”的序列中，通过所述“被苯丙氨酸或亮氨酸替代”的步骤，序列能够被最优化，以表现出比由序列编号1至序列编号4的氨基酸序列构成的肽增强的抗菌活性，或与现有的抗生素混合处理时，能够具备更高的协同效应。已知若具有两性结构的抗菌肽的疏水性、α-螺旋形结构的量以及阳离子性提高，则与生物膜的相互作用提高，因此抗菌活性增强，最优化这些条件，能够提高肽的抗菌活性(非专利文献2)。本发明中，替代疏水性残基，欲增强抗菌活性以及与现有抗生素的协同效应。苯丙氨酸是芳香族氨基酸中疏水性最强的氨基酸，亮氨酸和异亮氨酸在脂肪族氨基酸中疏水性最强的氨基酸。在异亮氨酸的情形下，D-氨基酸的价格极高，由于经济性的问题，在肽的最优化中大多使用亮氨酸。因此，本发明中，由亮氨酸或苯丙氨酸来替代脂肪族疏水性氨基酸中低疏水性的第15个残基即丙氨酸的位置，从而能够提高抗菌活性。另外，用作为脂肪族氨基酸疏水性高的亮氨酸来替代肽的第11个氨基酸即芳香族疏水性氨基酸苯丙氨酸，能够增强抗菌活性和与现有抗生素的协同效应。
更具体而言，本发明的新型抗菌肽中，由记载为序列编号5的氨基酸序列构成的抗菌肽是PapMA-5，是序列编号1的氨基酸序列中第15个残基即丙氨酸(A)被苯丙氨酸(F)替代的序列。
由记载为序列编号6的氨基酸序列构成的抗菌肽是PapMA-6，是序列编号1的氨基酸序列中第15个残基即丙氨酸(A)被亮氨酸(L)替代的序列。
由记载为序列编号7的氨基酸序列构成的抗菌肽是PapMA-7，是序列编号1的氨基酸序列中第11个残基即苯丙氨酸(F)被亮氨酸(L)替代；以及第15个残基丙氨酸(A)被苯丙氨酸(F)替代的序列。
由记载为序列编号8的氨基酸序列构成的抗菌肽是PapMA-8，是序列编号1的氨基酸序列中第11个残基即苯丙氨酸(F)被亮氨酸(L)替代；以及第15个残基丙氨酸(A)被亮氨酸(L)替代的序列。
由记载为序列编号9的氨基酸序列构成的抗菌肽是PapMA-9，是序列编号2的氨基酸序列中第11个残基即苯丙氨酸(F)被亮氨酸(L)替代的序列。
由记载为序列编号10的氨基酸序列构成的抗菌肽是PapMA-10，是序列编号2的氨基酸序列中第11个残基即苯丙氨酸(F)被亮氨酸(L)替代；以及第15个残基丙氨酸(A)被亮氨酸(L)替代的序列。
所述“由记载为序列编号1至序列编号10的氨基酸序列构成的肽”中，第14个氨基酸即丝氨酸(S)可以被谷氨酸(E)替代，优选为记载为序列编号11至序列编号14中任意一个的氨基酸序列的抗菌肽。
在所述“抗菌肽”的序列中，通过“丝氨酸(S)被谷氨酸(E)替代”，序列能够被最优化，以便本发明的抗菌肽表现出比由序列编号1至序列编号10的任意一个氨基酸序列构成的肽增强的抗菌活性，或与现有的抗生素混合处理时，能够具备更高的协同效应。
本发明的特征在于，由负电荷(酸性)氨基酸即谷氨酸来替代第14个残基即作为极性氨基酸的丝氨酸，诱导整个肽的电荷下降。具体而言，作为母体肽的PapMA-1的总电荷为+8，与此相反，优选本发明的抗菌肽(PapMA-11至PapMA-14)的总电荷为+7。
具体而言，本发明的“抗菌肽”优选由选自由序列编号11至序列编号14所组成的组中的任意一个氨基酸序列构成，但不限定于此。
更具体而言，所述抗菌肽中，由记载为序列编号11的氨基酸序列构成的抗菌肽是PapMA-11，是记载为序列编号1的氨基酸序列中第14个氨基酸即丝氨酸被谷氨酸替代的序列。
由记载为序列编号12的氨基酸序列构成的抗菌肽是PapMA-12，是记载为序列编号7的氨基酸序列中第14个氨基酸即丝氨酸被谷氨酸替代的序列。
由记载为序列编号13的氨基酸序列构成的抗菌肽是PapMA-13，是记载为序列编号9的氨基酸序列中第14个氨基酸即丝氨酸被谷氨酸替代的序列。
由记载为序列编号14的氨基酸序列构成的抗菌肽是PapMA-14，是记载为序列编号2的氨基酸序列中第14个氨基酸即丝氨酸被谷氨酸替代的序列。
所述“由记载为序列编号1至序列编号14的氨基酸序列构成的肽”中，第9个氨基酸即脯氨酸(P)被D-赖氨酸(k)替代；和/或第14个氨基酸即谷氨酸(E)被L-赖氨酸(K)替代，优选为记载为序列编号15至序列编号20中的任意一个的氨基酸序列的抗菌肽。
在所述“抗菌肽”的序列中，通过“脯氨酸(P)和/或谷氨酸(E)被D-赖氨酸(k)和/或L-赖氨酸(K)替代”，序列能够被最优化，以便本发明的抗菌肽表现出比由序列编号1至序列编号14中的任意一个氨基酸序列构成的肽增强的抗菌活性，或与现有的抗生素混合处理时，能够具备更高的协同效应。
本发明的特征在于，由L-赖氨酸(k)替代第9个氨基酸即极性残基的脯氨酸；和/或由正电荷(碱性)残基的D-赖氨酸(k)替代第14个氨基酸即负电荷(酸性)残基的谷氨酸，从而诱导弯曲(bent)部分的电荷升高。优选这样的特征体现在，阳离子性随着由D-赖氨酸替代诱导弯曲结构的第9个脯氨酸而更加提高的方面。具体而言，作为母体肽的PapMA-1的总电荷是+8，与此相反，优选本发明的抗菌肽(PapMA-15至PapMA-20)的总电荷为+8至+10。
具体而言，本发明的“抗菌肽”优选由选自由序列编号15至序列编号20所组成的组中的任意一个氨基酸序列构成，但不限定于此。
更具体而言，所述抗菌肽中，由记载为序列编号15的氨基酸序列构成的抗菌肽是PapMA-15，是记载为序列编号7的氨基酸序列中第9个氨基酸即脯氨酸被D-赖氨酸(k)替代的序列。
由记载为序列编号16的氨基酸序列构成的抗菌肽是PapMA-16，是记载为序列编号9的氨基酸序列中第9个氨基酸即脯氨酸被D-赖氨酸(k)替代的序列。
由记载为序列编号17的氨基酸序列构成的抗菌肽是PapMA-17，是记载为序列编号12的氨基酸序列中第9个氨基酸即脯氨酸被D-赖氨酸(k)替代以及第14个氨基酸即谷氨酸L-赖氨酸(K)替代的序列。
由记载为序列编号18的氨基酸序列构成的抗菌肽是PapMA-18，是记载为序列编号13的氨基酸序列中第9个氨基酸即脯氨酸被D-赖氨酸(k)替代以及第14个氨基酸即谷氨酸L-赖氨酸(K)替代的序列。
由记载为序列编号19的氨基酸序列构成的抗菌肽是PapMA-19，是记载为序列编号12的氨基酸序列中第9个氨基酸即脯氨酸被D-赖氨酸(k)替代的序列。
由记载为序列编号20的氨基酸序列构成的抗菌肽是PapMA-20，是记载为序列编号13的氨基酸序列中第9个氨基酸即脯氨酸被D-赖氨酸(k)替代的序列。
所述“由记载为序列编号1至序列编号20的氨基酸序列构成的肽”中，第9个氨基酸即脯氨酸(P)或D-赖氨酸(k)被D-亮氨酸(l)替代，优选为记载为序列编号21至序列编号24中任意一个的氨基酸序列的抗菌肽。
在所述“抗菌肽”的序列中，通过“脯氨酸(P)或D-赖氨酸(k)被D-亮氨酸(l)替代”，序列能够被最优化，以便本发明的抗菌肽表现出比由序列编号1至序列编号20中的任意一个氨基酸序列构成的肽增强的抗菌活性，或与现有的抗生素混合处理时，能够具备更高的协同效应。
本发明的特征在于，由非极性残基的D-亮氨酸(l)来替代第9个氨基酸即极性残基的脯氨酸或正电荷(碱性)残基的D-赖氨酸(k)，从而诱导弯曲部分的疏水性提高。优选这样的特征体现在，诱导肽内形成的弯曲结构随着由D-亮氨酸替代第9个残基即脯氨酸而更加提高。通过本发明的肽序列中第9个氨基酸残基，肽能够表现出弯曲结构或线性(linear)结构。从本发明的抗菌肽与现有的抗生素一同给药时能够表现出协同效应的观点出发，抗菌肽的结构优选弯曲结构而非线性结构。为此，优选将第9个残基的位置由D-亮氨酸替代脯氨酸，从而设计出能够更加增强协同效应的肽。作为母体肽的PapMA-17以及PapMA-18的总电荷是+10，与此相反，优选PapMA-21以及PapMA-22减小为+9，作为另一母体肽的PapMA-19以及PapMA-20的总电荷是+8，与此相反，优选PapMA-23以及PapMA-24的总电荷减小为+7。
具体而言，本发明的“抗菌肽”优选由选自由序列编号21至序列编号24所组成的组中的任意一个氨基酸序列构成，但不限定于此。
更具体而言，所述抗菌肽中，由序列编号21的氨基酸序列构成的抗菌肽是PapMA-21，是序列编号17的氨基酸序列中第9个氨基酸即D-赖氨酸被D-亮氨酸替代的序列。
由记载为序列编号22的氨基酸序列构成的抗菌肽是PapMA-22，是记载为序列编号18的氨基酸序列中第9个氨基酸即D-赖氨酸被D-亮氨酸替代的序列。
由记载为序列编号23的氨基酸序列构成的抗菌肽是PapMA-23，是记载为序列编号19的氨基酸序列中第9个氨基酸即D-赖氨酸被D-亮氨酸替代的序列。
由记载为序列编号24的氨基酸序列构成的抗菌肽是PapMA-24，是记载为序列编号20的氨基酸序列中第9个氨基酸即D-赖氨酸被D-亮氨酸替代的序列。
但是，本发明的抗菌肽并非仅限定于所述序列编号1至24的氨基酸序列，可以包括序列编号1至24的氨基酸序列的功能性等同物。
所述“功能性等同物”是指如下所述的肽：由于肽的氨基酸添加、替代或缺失，与所述新型抗菌肽的氨基酸序列具有至少70％以上，优选80％以上，更优选90％以上，进一步优选95％以上的序列等同性，表现出与新型抗菌肽实质相同性质的生理活性。
本发明的新型抗菌肽是合成肽，用于所述合成的方法优选通过本领域的通常的肽的化学合成方法(W.H.Freeman and Co.,Proteins；structures and molecularprinciples(1983))合成，具体而言，更优选通过溶液相肽合成(Solution Phase Peptidesynthesis)、固相肽合成(Solid-phase peptide syntheses)、片段缩合法以及F-moc或T-BOC化学法合成，更具体而言，最优选通过溶液相肽(Merrifield,RB.,J.Am.Chem.Soc.,85.2149:196)合成，但不限定于此。
本发明的“新型抗菌肽”优选对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及其抗生素的耐药菌株具有抗菌活性，但不限定于此。具体而言，所述革兰氏阳性菌是包括葡萄球菌属(Staphylococcus)、李斯特菌属(Listeria)、链球菌属(Streptococcus)、棒杆菌属(Corynebacterium)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、芽孢杆菌属(Bacillus)的革兰氏阳性菌，优选为本领域公知的所有革兰氏阳性菌，更优选为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)，但不限定于此。所述革兰氏阴性菌是包括大肠杆菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、钩端螺旋体属(Leptospira)、立克次氏体属(Rickettsia)的革兰氏阴性菌，优选为本领域公知的所有革兰氏阴性菌，更优选为大肠杆菌(Escherichia coli)、绿脓假单胞菌(Psedomonas aeruginosa)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)或鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，具体而言，最优选为大肠杆菌(Escherichia coli)或鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumanni i)中的任意一个，但不限定于此。
在本发明的具体实施例中，为了合成表现优异的抗菌活性的新型抗菌肽，发明人由色氨酸替代从柑橘凤蝶幼虫分离的抗菌肽Papiliocin(Pap)的N-末端区域和滑爪蟾素(Magainin 2，MA)的N-末端区域残基连接而成的Papiliocin混合肽即PapMA-1的第15个氨基酸即丙氨酸和/或第18个氨基酸即苯丙氨酸，制备了序列目录2至4的衍生肽，并将其命名为PapMA-2、PapMA-3以及PapMA-4(表1)。
另外，所述PapMA-1至PapMA-4的肽中，第11个氨基酸即苯丙氨酸(F)被亮氨酸(L)替代；和/或第15个氨基酸即丙氨酸(A)或色氨酸(W)被苯丙氨酸(F)或亮氨酸(L)替代，从而设计出PapMA-5至PapMA-10的抗菌肽(表1)。
另外，所述PapMA-1至PapMA-10的肽中，由谷氨酸(E)替代第14个氨基酸即丝氨酸(S)，设计出PapMA-11至PapMA-14的抗菌肽(表1)。
另外，所述PapMA-2至PapMA-14的肽中，由D-赖氨酸(k)替代第9个氨基酸即脯氨酸(P)；和/或由L-赖氨酸(K)替代第14个氨基酸即谷氨酸(E)，设计出PapMA-15至PapMA-20的抗菌肽(表1)。
另外，所述PapMA-1至PapMA-20的肽中，由D-亮氨酸(l)替代第9个氨基酸即脯氨酸(P)或D-赖氨酸(k)，设计出PapMA-21至PapMA-24的抗菌肽(表1)。
另外，发明人对PapMA-1至PapMA-24所表现出的抗菌活性进行确认的结果，确认到PapMA-1至PapMA-24均对革兰氏阴性菌表现出高的抗菌活性(表3至表7)。另外，确认到现有的用作抗生素的红霉素、万古霉素以及利奈唑胺对革兰氏阳性菌具有抗菌活性，而对革兰氏阴性菌的抗菌活性极低(表8)。
另外，发明人为了确认PapMA-1至PapMA-24是否能够与现有的抗生素表现出协同抗菌活性，与红霉素、万古霉素或利奈唑胺一同给药至革兰氏阴性菌以及抗生素耐药菌株的结果，确认到与用抗生素单独处理时表现出的抗菌活性相比，表现出有意义地提升水平的抗菌活性(表9至表33)，并确认到这是本发明的合成肽与抗生素表现出了有意义地提升效果的抗菌活性的结果(表35至表38以及图1至图4)。
因此，作为本发明的抗菌肽的PapMA-1至PapMA-24不仅对革兰氏阴性菌表现出更有意义的抗菌活性，而且将本发明的抗菌肽与仅对革兰氏阳性菌具有有意义的抗菌活性而对革兰氏阴性菌具有低抗菌活性的抗生素一同给药时，对革兰氏阴性菌及其抗生素耐药菌株表现出优异的增效性抗菌活性，因此，本发明的抗菌肽或将其与抗生素一同包含的复合剂能够有用地用作抗菌组合物的有效成分。
另外，本发明提供一种抗菌用药物组合物，其包含由记载为序列编号1的氨基酸序列构成的肽中，发生选自由如下(i)至(v)所组成的组中的任意一个以上的替代的氨基酸序列构成的抗菌肽作为有效成分：
(i)第9个氨基酸即脯氨酸(P)被D-赖氨酸(k)或D-亮氨酸(l)替代；
(ii)第11个氨基酸即苯丙氨酸(F)被亮氨酸(L)替代；
(iii)第14个氨基酸即丝氨酸(S)被谷氨酸(E)或L-赖氨酸(K)替代；
(iv)第15个氨基酸即丙氨酸(A)被色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)或亮氨酸(L)替代；
(v)第18个氨基酸即苯丙氨酸(F)被色氨酸(W)替代。
并且，本发明提供一种将所述抗菌肽以及抗生素作为有效成分的抗菌用药物组合物。
另外，本发明提供一种包含所述抗菌肽作为有效成分的抗菌助剂。
另外，本发明提供一种包含所述抗菌肽以及抗生素作为有效成分的抗菌助剂。
在所述“抗菌肽”的序列中，通过“由色氨酸(W)替代丙氨酸(A)和/或苯丙氨酸(F)”，序列能够被最优化，以表现出比由序列编号1的氨基酸序列构成的肽增强的抗菌活性，或与现有的抗生素混合处理时，能够具备更高的协同效应。
在所述“抗菌肽”的序列中，通过“由亮氨酸(L)替代苯丙氨酸(F)和/或由苯丙氨酸(F)或亮氨酸(L)替代丙氨酸(A)或色氨酸(W)”，序列能够被最优化，以表现出比由序列编号1至序列编号4的氨基酸序列构成的肽增强的抗菌活性，或与现有的抗生素混合处理时，能够具备更高的协同效应。
在所述“抗菌肽”的序列中，通过“丝氨酸(S)被谷氨酸(E)替代”，序列能够被最优化，以便本发明的抗菌肽表现出比由序列编号1至序列编号10中的任意一个的氨基酸序列构成的肽增强的抗菌活性，或与现有的抗生素混合处理时，能够具备更高的协同效应。
在所述“抗菌肽”的序列中，通过“脯氨酸(P)和/或谷氨酸(E)被D-赖氨酸(k)和/或L-赖氨酸(K)替代”，序列能够被最优化，以便本发明的抗菌肽表现出比由序列编号1至序列编号14中的任意一个氨基酸序列构成的肽增强的抗菌活性，或与现有的抗生素混合处理时，能够具备更高的协同效应。
在所述“抗菌肽”的序列中，通过“脯氨酸(P)或D-赖氨酸(k)被D-亮氨酸(l)替代”，序列能够被最优化，以便本发明的抗菌肽表现出比由序列编号1至序列编号20中的任意一个氨基酸序列构成的肽增强的抗菌活性，或与现有的抗生素混合处理时，能够具备更高的协同效应。
具体而言，本发明的“抗菌肽”优选由选自由序列编号1至序列编号24所组成的组中的任意一个氨基酸序列构成，但不限定于此。
本发明的“抗生素”是指，对革兰氏阳性菌具有抗菌活性而对革兰氏阴性菌具有低抗菌活性或没有抗菌活性的，只要是本领域内已知的，任意使用也无妨。具体而言，本发明的抗生素优选选自由红霉素(Erythromycin)、氨苄青霉素(Ampicillin)、万古霉素(Vancomycin)、利奈唑胺(Linezolid)、甲氧西林(Methicillin)、苯唑西林(Oxacillin)、头孢噻肟(Cefotaxime)、利福平(Rifampicin)、阿米卡星(Amikacin)、庆大霉素(Gentamicin)、阿米卡星(Amikacin)、卡那霉素(Kanamycin)、妥布霉素(Tobramycin)、新霉素(Neomycin)、厄他培南(Ertapenem)、多尼培南(Doripenem)、亚胺培南/西司他汀(Imipenem/Cilastatin)、美罗培南(Meropenem)、头炮他啶(Ceftazidime)、头孢吡肟(Cefepime)、头孢洛林(Ceftaroline)、头孢吡普(Ceftobiprole)、氨曲南(Aztreonam)、哌拉西林(Piperacillin)、多粘菌素B(Polymyxin B)、粘杆菌素(Colistin)、环丙沙星(Ciprofloxacin)、左氧氟沙星(Levofloxacin)、莫西沙星(Moxifloxacin)、加替沙星(Gatifloxacin)、替加环素(Tigecycline)、其组合以及它们的衍生物所组成的组中的任意一个以上，更具体而言，更优选选自由红霉素、万古霉素、利奈唑胺所组成的组中的任意一个以上，但不限定于此。
本发明的“抗菌用药物组合物”对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及其抗生素耐药菌株具有抗菌活性，具体而言，优选对如下病原菌表现出抗菌活性，但不限定于此：鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumanni i)、放线菌属(Actinomyces sp.)(例如，衣氏放线菌(Actinomyces israelii)以及内氏放线菌(Actinomyces naeslundii))、气单胞菌(Aeromonas sp.)(例如，嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、维罗纳气单胞菌温和生物变种(温和气单胞菌)(Aeromonas veronii biovar sobria(Aeromonas sobria))以及豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae))、嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum)、木糖氧化产碱菌(Alcaligenes xylosoxidans)、伴放线放线杆菌(Actinobacillusactinomycetemcomitans)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)(例如，炭疽杆菌(Bacillusanthracis)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、以及嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、拟杆菌属(Bacteroides sp.)(例如，脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis))、巴尔通氏体(Bartonella sp.)(例如，杆菌状巴尔通氏体(Bartonellabacilliformis)以及汉氏巴尔通氏体(Bartonella henselae))、双歧杆菌属(Bifidobacterium sp.)、博德特氏菌属(Bordetella sp.)(例如，百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、副百日咳博德特氏菌(Bordetella parapertussis)以及支气管败血性博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica))、疏螺旋体属(Borrelia sp.)(例如，回归热疏螺旋体(Borrelia recurrentis)以及包氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi))、布鲁氏菌属(Brucella sp.)(例如，流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、犬布鲁氏菌(Brucella canis)、马尔他布鲁氏杆菌(Brucella melintensis)以及猪布鲁氏菌(Brucella suis))、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia sp.)(例如，类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pseudomallei)以及洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia))、弯曲杆菌属(Campylobacter sp.)(例如，空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、结肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、红嘴鸥弯曲杆菌(Campylobacter lari)以及胎儿弯曲杆菌(Campylobacter fetus))、二氧化碳嗜纤维菌属(Capnocytophaga sp.)、人心杆菌(Cardiobacterium hominis)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumonia)、鹦鹉热嗜衣原体(Chlamydophila psittaci)、柠檬酸杆菌属贝纳特氏立克次体(Citrobacter sp.Coxiella burnetii)、棒状杆菌属(Corynebacteriumsp.)(例如，白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)、杰氏棒状杆菌(Corynebacterium jeikeum)、棒状杆菌(Corynebacterium))、梭状芽胞杆菌属(Clostridium sp.)(例如，产气荚膜梭状芽胞杆菌(Clostridium perfringens)、艰难梭状芽胞杆菌(Clostridium difficile)、肉毒梭状芽胞杆菌(Clostridium botulinum)以及破伤风梭状芽胞杆菌(Clostridium tetani))、啮蚀艾肯氏菌(Eikenella corrodens)、肠杆菌属(Enterobacter sp.)(例如，产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)以及包含诸如肠毒性大肠杆菌(enterotoxigenic E.Coli)、肠侵袭性大肠杆菌(enteroinvasive E.Coli)、肠致病性大肠杆菌(enteropathogenic E.Coli)、肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagicE.Coli)、肠凝集性大肠杆菌(enteroaggregative E.Coli)以及泌尿道致病性大肠杆菌(Uropathogenic E.coli)等机会感染性大肠杆菌的大肠杆菌(Escherichia coli))、肠球菌属(Enterococcus sp.)(例如，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)以及屎肠球菌(Enterococcus faecium))、埃利希氏体属(Ehrlichia sp.)(例如，恰菲埃利希氏体(Ehrlichia chafeensia)以及犬埃利希体(Ehrlichia canis))、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、真杆菌属(Eubacterium sp.)、土拉热弗朗西斯菌(Francisella tularensis)、核粒梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、阴道加德纳氏菌(Gardnerella vaginalis)、麻疹孪生球菌(Gemella morbillorum)、嗜血杆菌(Haemophilus sp.)(例如，流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)、埃及嗜血杆菌(Haemophilus aegyptius)、副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)、溶血性嗜血杆菌(Haemophilus haemolyticus)以及副溶血嗜血杆菌(Haemophilus parahaemolyticus))、螺杆菌属(Helicobacter sp.)(例如，幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、同性恋螺杆菌(Helicobacter cinaedi)以及芬纳尔螺杆菌(helicobacter fennelliae))、金氏金菌(Kingella kingii)、克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)(例如，克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、肉芽肿克雷伯氏杆菌(Klebsiella granulomatis)以及产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca))、乳酸杆菌属(Lactobacillus sp.)、单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、肾脏钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、嗜肺性军团病杆菌(Legionella pneumophila)、肾脏钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、消化链球菌属(Peptostreptococcus sp.)、黏膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)、摩根氏菌属(Morganella sp.)、动弯杆菌属(Mobiluncus sp.)、微球菌属(Micrococcus sp.)、分枝杆菌属(Mycobacterium sp.)(例如，麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)、鸟结核杆菌(Mycobacterium avium)、牛型结核杆菌(Mycobacteriumbovis)以及海鱼分枝杆菌(Mycobacterium marinum))、支原体属(Mycoplasm sp.)(例如，肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、人支原体(Mycoplasma hominis)以及生殖支原体(Mycoplasma genitalium))、诺卡氏菌属(Nocardia sp.)(例如，星状诺卡菌(Nocardiaasteroides)、奶牛乳房性诺卡氏菌(Nocardia cyriacigeorgica)以及巴西诺卡菌(Nocardia brasiliensis))、奈瑟氏菌属(Neisseria sp.)(例如，淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)以及脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis))、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、类志贺氏毗邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)、普雷沃氏菌属(Prevotella sp.)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas sp.)、产黑素普雷沃菌(Prevotella melaninogenica)、变形杆菌属(Proteus sp.)(例如，普通变形菌(Proteusvulgaris)以及奇异变形杆菌(Proteus mirabilis))、普罗威登斯菌属(Providencia sp.)(例如，产碱普罗威登斯菌(Providencia alcalifaciens)、雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)以及斯氏普罗威登斯菌(Providencia stuartii))、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、马红球菌(Rhodococcus equi)、沙门氏菌属(Salmonella sp.)(例如，肠道沙门氏菌(Salmonellaenterica)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、副伤寒沙门氏菌(Salmonellaparatyphi)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonellacholerasuis)以及鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))、沙雷氏菌属(Serratiasp.)(例如，粘质沙雷氏菌(Serratia marcesans)以及沙雷菌液化(Serratialiquifaciens))、志贺氏菌属(Shigella sp.)(例如，痢疾志贺氏菌(Shigelladysenteriae)、福氏志贺氏杆菌(Shigella flexneri)、波伊德氏志贺氏菌(Shigellaboydii)以及宋内氏志贺氏菌(Shigella sonnei))、葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)(例如，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、溶血葡萄球菌(Staphylococcus hemolyticus)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus))、链球菌属(Streptococcus sp.)(例如，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、壮观霉素抗性血清型6B肺炎链球菌(Spectinomycin-resistant serotype 6B Streptococcus pneumoniae)、链霉素抗性血清型9V肺炎链球菌(Streptomycin-resistant serotype 9V Streptococcus pneumoniae)、红霉素抗性血清型14肺炎链球菌(Erythromycin-resistant serotype 14Streptococcus pneumoniae)、奥普托欣抗性血清型14肺炎链球菌(Optochin-resistant serotype 14Streptococcuspneumoniae)、利福平抗性血清型18C肺炎链球菌(Rifampicin-resistant serotype 18CStreptococcus pneumoniae)、四环素抗性血清型19F肺炎链球菌(Tetracycline-resistant serotype 19F Streptococcus pneumoniae)、青霉素抗性血清型19F肺炎链球菌(Penicillin-resistant serotype 19F Streptococcus pneumoniae)以及三甲氧苄氨嘧啶抗性血清型23F肺炎链球菌(Trimethoprim-resistant serotype 23F Streptococcuspneumoniae)、氯霉素抗性血清型4肺炎链球菌(Chloramphenicol-resistant serotype4Streptococcus pneumoniae)、链霉素抗性血清型9V肺炎链球菌(Streptomycin-resistant serotype 9V Streptococcus pneumoniae)、奥普托欣抗性血清型14肺炎链球菌(Optochin-resistant serotype 14Streptococcus pneumoniae)、利福平抗性血清型18C肺炎链球菌(Rifampicin-resistant serotype 18C Streptococcus pneumoniae)、青霉素抗性血清型19F肺炎链球菌(Penicillin-resistant serotype 19F Streptococcuspneumoniae)或三甲氧苄氨嘧啶抗性血清型23F肺炎链球菌(Trimethoprim-resistantserotype 23F Streptococcus pneumoniae)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、变形链球菌(Streptococcus mutans)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、A组链球菌(Group A streptococci)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、B组链球菌(Group Bstreptococci)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、C组链球菌(Group Cstreptococci)、咽峡炎链球菌(Streptococcus anginosus)、类马链球菌(Streptococcusequismilis)、D组链球菌(Group D streptococci)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、F组链球菌(Group F streptococci)以及咽峡炎链球菌(Streptococcus anginosus、G组链球菌(Group G streptococci)、螺旋菌(Spirillum minus)、念珠状链杆菌(Streptobacillusmoniliformi)、密螺旋体属(Treponema sp.)(例如，品他病密螺旋体(Treponemacarateum)、雅司螺旋体(Treponema pertenue)、梅毒密螺旋体(Treponema pallidum)以及地方性螺旋体(Treponema endemicum)、惠普尔病致病原(Tropheryma whippelii)、解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum))、韦荣球菌属(Veillonella sp.)、弧菌属(Vibrio sp.)(例如，霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)、创伤弧菌(Vibriovulnificus)、解藻阮酸弧菌(Vibrio alginolyticus)、拟态弧菌(Vibrio mimicus)、霍氏弧菌(Vibrio hollisae)、河流弧菌(Vibrio fluvialis)、麦奇尼科夫氏弧菌(Vibriometchnikovii)、海鱼弧菌(Vibrio damsela)以及弗尼斯弧菌(Vibrio furnisii))、耶尔森氏菌属(Yersinia sp.)(例如，小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)以及鼠疫叶尔森氏菌(Yersinia pestis))以及嗜麦芽黄单胞菌(Xanthomonas maltophilia)。
所述革兰氏阳性菌是包含葡萄球菌属(Staphylococcus)、李斯特菌属(Listeria)、链球菌属(Streptococcus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)以及芽孢杆菌属(Bacillus)的革兰氏阳性菌，优选为本领域公知的所有革兰氏阳性菌，更优选为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或表皮葡萄球菌(S.epidermidis)，但不限定于此，优选可以包含它们的抗生素耐药菌株。
所述革兰氏阴性菌是包含大肠杆菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、钩端螺旋体属(Leptospira)、立克次体属(Rickettsia)的革兰氏阴性菌，优选为本领域公知的所有革兰氏阴性菌，更优选为大肠杆菌(Escherichia coli)、绿脓假单胞菌(Psedomonas aeruginosa)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)或鼠伤寒沙门杆菌(Salmonella typhimurium)，具体而言，最优选为大肠杆菌(Escherichia coli)或鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)中的任意一个，但不限定于此，优选可以包括它们的抗生素耐药菌株。
本发明的抗菌肽与现有的抗生素一同混合处理时，对革兰氏阴性菌及其抗生素耐药菌株表现出有意义的增效性抗菌效果，因此，本发明的抗菌肽以及抗生素复合剂有用地用作抗菌用药物组合物的有效成分。
本发明的抗菌用药物组合物在临床给药时，可以非口服给药,可以以一般医药品制剂的形式使用。非口服给药可以指，通过诸如直肠、静脉、腹膜、肌肉、动脉、皮肤、鼻腔(Nasal)、吸入、眼球以及皮下等口服之外的给药路径的给药。将本发明的抗菌用药物组合物用作药品时，还可以包含一种以上表现出相同或类似功能的有效成分。
即，本发明的抗菌用药物组合物实际上可以以非口服的多种剂型给药，在形成制剂的情形下，使用填充剂、增量剂、结合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂等的稀释剂或赋形剂进行配制。用于非口服给药的制剂包含灭菌水溶液、非水性溶剂、悬浮剂、乳剂、冻干制剂、栓剂。非水性溶剂、悬浮溶剂可以使用丙二醇(Propylene glycol)、聚乙二醇、诸如橄榄油的植物油、诸如油酸乙酯的可注射的酯等。栓剂的基质材料可以使用witepsol、聚乙二醇(macrogol)、Tween 61、可可脂、月桂油(laurin butter)、甘油明胶等。
另外，本发明的抗菌用药物组合物可以与诸如生理盐水或有机溶剂等允许作为药剂的多种载体(Carrier)混合进行使用，为了增加稳定性或吸收性，诸如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖等碳水化合物、诸如抗坏血酸(Ascorbic acid)或谷胱甘肽(Glutathione)等抗氧化剂(Antioxidants)、螯合剂(Chelating agents)、低分子蛋白质或其他稳定剂(Stabilizers)可以用作药剂。
本发明的抗菌用药物组合物的有效用量是0.01至100mg/kg，优选0.1至10mg/kg，一天可以给药一次到三次。
本发明的药物组合物中，抗菌肽或抗菌肽和抗生素的复合剂总有效剂量可以通过药丸(Bolus)形式或相对短期注射(Infusion)等，以单次给药量(Singlc docs)向患者给药，并通过以多次给药量(Multiple does)长期给药的分次治疗方案(Fractionatedtreatment protocol)进行给药。所述浓度不仅考虑药的给药路径以及治疗次数，还考虑患者的年龄以及健康状态等多种因素来确定患者的有效给药量，因此考虑到这一点时，本领域的普通技术人员根据本发明的药物组合物的特定用途能够确定恰当的有效给药量。
本发明的抗菌助剂可以在抗生素给药时、与抗生素一同、抗生素处理前、抗生素处理后给药，可以用作用于增强抗生素抗菌活性的助剂。所述助剂优选与抗生素一同具有抗菌活性的提升效果，优选增加抗生素对革兰氏阴性菌以及抗生素耐药菌株的抗菌活性。
另外，本发明提供一种食品添加剂，其包含由如下氨基酸序列构成的抗菌肽作为有效成分：由记载为序列编号1的氨基酸序列构成的肽中，发生选自由如下(i)至(v)所组成的组中的任意一个以上的替代：
(i)第9个氨基酸即脯氨酸(P)被D-赖氨酸(k)或D-亮氨酸(l)替代；
(ii)第11个氨基酸即苯丙氨酸(F)被亮氨酸(L)替代；
(iii)第14个氨基酸即丝氨酸(S)被谷氨酸(E)或L-赖氨酸(K)替代；
(iv)第15个氨基酸即丙氨酸(A)被色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)或亮氨酸(L)替代；以及
(v)第18个氨基酸即苯丙氨酸(F)被色氨酸(W)替代。
并且，本发明提供一种将所述抗菌肽以及抗生素作为有效成分的食品添加剂。
本发明的食品添加剂中，所述“抗菌肽”优选由选自由序列编号1至序列编号24所组成的组中的任意一个氨基酸序列构成，但不限定于此，可以是其衍生物以及功能性等同物。
本发明的抗菌肽与现有的抗生素一同混合处理时，对革兰氏阴性菌及其抗生素耐药菌株表现出有意义的增效性抗菌效果，因此，本发明的抗菌肽或抗菌肽以及抗生素的复合剂可有用地用作食品添加剂的有效成分。
将本发明的抗菌肽或抗菌肽以及抗生素的复合剂用作食品添加剂时，可以直接添加所述抗菌肽或抗菌肽以及抗生素的复合剂或与其他食品成分一同使用，可以根据通常的方法恰当地使用。有效成分的混合量可以根据其使用目的来恰当地确定。一般而言，相对于原料，本发明的抗菌肽或抗菌肽以及抗生素的复合剂以15重量份以下，优选以10重量份以下的量进行添加。但是，在长期摄取的情形下，所述量可以是所述范围以下，在稳定性方面没有任何问题，因此有效成分可以以所述范围以上的量使用。
没有特别限制所述食品的种类。能够添加所述物质的食品的例子有肉类、香肠、面包、巧克力、糖类、点心类、饼干类、披萨、拉面、其他面类、口香糖类、包含冰淇淋类的奶制品、各种汤、饮料、茶、保健饮料、酒精饮料以及维生素复合剂等，均包含通常意义上的食品。
另外，本发明提供一种饲料添加剂，其包含由如下氨基酸序列构成的抗菌肽作为有效成分：由记载为序列编号1的氨基酸序列构成的肽中发生选自由如下(i)至(v)所组成的组中的任意一个以上的替代：
(i)第9个氨基酸即脯氨酸(P)被D-赖氨酸(k)或D-亮氨酸(l)替代；
(ii)第11个氨基酸即苯丙氨酸(F)被亮氨酸(L)替代；
(iii)第14个氨基酸即丝氨酸(S)被谷氨酸(E)或L-赖氨酸(K)替代；
(iv)第15个氨基酸即丙氨酸(A)被色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)或亮氨酸(L)替代；以及
(v)第18个氨基酸即苯丙氨酸(F)被色氨酸(W)替代。
并且，本发明提供一种将所述抗菌肽以及抗生素作为有效成分的饲料添加剂。
本发明的饲料添加剂中，所述“抗菌肽”优选由选自由序列编号1至序列编号24所组成的组中的任意一个氨基酸序列构成，但不限定于此，可以是其衍生物以及功能性等同物。
本发明的抗菌肽与现有的抗生素一同混合处理时，对革兰氏阴性菌及其抗生素耐药菌株表现出有意义的增效性抗菌效果，因此，本发明的抗菌肽或抗菌肽以及抗生素的复合剂有用于饲料添加剂的有效成分。
本发明的饲料添加剂的效果在于，代替现有的抗生素，抑制有害的食品病原菌的生长，使动物的健康状态良好，改善家畜的增重量和肉质，增加产奶量以及免疫力。本发明的饲料添加剂可以制备成发酵饲料、混合饲料、颗粒形式以及青贮等形式。
所述发酵饲料除本发明的抗菌肽或抗菌肽以及抗生素复合剂以外，添加多种微生物群或酶，从而能够通过使有机物发酵来进行制备，混合饲料可以通过混合多种一般饲料和本发明的肽以及抗生素复合剂来进行制备。颗粒形式的饲料可以通过在造粒机对所述混合饲料等施加热量和压力进行制备，青贮可以通过用微生物发酵青饲料来进行制备。潮湿的发酵饲料可以通过如下进行制备：收集诸如食物垃圾等有机物并搬运，按照一定比率混合用于杀菌过程的水分调节的赋形剂后，在适合发酵的温度下发酵24小时以上，调节含水量使其包含约70％。发酵干燥饲料可以通过如下进行制备：使潮湿的发酵饲料进一步经过干燥过程，调节含水量使其包含30％至40％左右。
另外，本发明提供一种防腐组合物，其包含由如下氨基酸序列构成的抗菌肽作为有效成分：由序列编号1的氨基酸序列构成的肽中发生选自由如下(i)至(v)所组成的组中的任意一个以上的替代：
(i)第9个氨基酸即脯氨酸(P)被D-赖氨酸(k)或D-亮氨酸(l)替代；
(ii)第11个氨基酸即苯丙氨酸(F)被亮氨酸(L)替代；
(iii)第14个氨基酸即丝氨酸(S)被谷氨酸(E)或L-赖氨酸(K)替代；
(iv)第15个氨基酸即丙氨酸(A)被色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)或亮氨酸(L)替代；以及
(v)第18个氨基酸即苯丙氨酸(F)被色氨酸(W)替代。
并且，本发明提供一种将所述抗菌肽以及抗生素作为有效成分的防腐组合物。
本发明的防腐组合物中，所述“抗菌肽”优选由选自由序列编号1至序列编号24所组成的组中的任意一个氨基酸序列构成，但不限定于此，可以是其衍生物以及功能性等同物。
所述防腐组合物有食品的防腐剂、化妆品保存剂或药品保存剂等。所述食品的防腐剂、化妆品保存剂以及药品保存剂是为了防止药品的变质、腐败、变色以及化学变化而使用的添加物，包含杀菌剂、抗氧化剂，抑制细菌、霉、酵母等微生物的繁殖，食品以及药品中还包含阻碍腐败微生物生长或发挥杀菌作用等功能性抗生素。这种防腐组合物的理想条件是无毒且即便微量也要有效。
另外，本发明提供一种抗菌非处方药，其包含由如下氨基酸序列构成的抗菌肽作为有效成分：由记载为序列编号1的氨基酸序列构成的肽中发生选自由如下(i)至(v)所组成的组中的任意一个以上的替代：
(i)第9个氨基酸即脯氨酸(P)被D-赖氨酸(k)或D-亮氨酸(l)替代；
(ii)第11个氨基酸即苯丙氨酸(F)被亮氨酸(L)替代；
(iii)第14个氨基酸即丝氨酸(S)被谷氨酸(E)或L-赖氨酸(K)替代；
(iv)第15个氨基酸即丙氨酸(A)被色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)或亮氨酸(L)替代；以及
(v)第18个氨基酸即苯丙氨酸(F)被色氨酸(W)替代。
并且，本发明提供一种将所述抗菌肽以及抗生素作为有效成分的抗菌非处方药。
本发明的抗菌非处方药中，所述“抗菌肽”优选由选自由序列编号1至序列编号24所组成的组中的任意一个氨基酸序列构成，但不限定于此，可以是其衍生物以及功能性等同物。
本发明的抗菌肽与现有的抗生素一同混合处理时，对革兰氏阴性菌及其抗生素耐药菌株表现出有意义的增效性抗菌效果，因此，本发明的抗菌肽或抗菌肽以及抗生素的复合剂能够有用地用作食品添加剂的有效成分。
将本发明的组合物用作非处方药添加物时，可以直接添加本发明的肽以及抗生素复合剂或与其他非处方药或非处方药成分一同使用，可以根据通常的方法恰当地使用。可以根据使用目的来恰当地确定有效成分的混合量。
本发明的非处方药组合物不限于此，优选可以是消毒清洁剂、沐浴泡沫、漱口水、湿巾、肥皂洗剂、洗手液、加湿器填充剂、口罩、软膏剂、贴片或过滤器填充剂。
＜实施例1＞抗菌肽的合成
为了以对革兰氏阴性菌及其多药耐药菌表现出抗菌活性的肽为对象，设计抗菌肽即连接Papiliocin的N末端残基以及滑爪蟾素(Magainin)的N末端残基的序列，设计出记载为序列编号1的氨基酸序列的抗菌肽(PapMA-1)(非专利文献4)。
记载为序列编号1的氨基酸序列的抗菌肽(PapMA-1)中，通过第15个氨基酸即丙氨酸(A)被色氨酸(W)替代；和/或第18个氨基酸即苯丙氨酸(F)被色氨酸(W)替代，设计出记载为序列编号2至序列编号4的氨基酸序列的抗菌肽(PapMA-2至PapMA-4)。
然后，所述记载为序列编号1至序列编号4的氨基酸序列的抗菌肽中，通过第11个氨基酸即苯丙氨酸(F)被亮氨酸(L)替代；和/或第15个氨基酸即丙氨酸(A)或色氨酸(W)被苯丙氨酸(F)或亮氨酸(L)替代，设计出记载为序列编号5至序列编号10的氨基酸序列的抗菌肽(PapMA-5至PapMA-10)。
另外，所述记载为序列编号1至序列编号10的氨基酸序列的抗菌肽中，通过第14个氨基酸即丝氨酸(S)被谷氨酸(E)替代，设计出记载为序列编号11至序列编号14的抗菌肽(PapMA-11至PapMA-14)。
另外，所述记载为序列编号2至序列编号14的氨基酸序列的抗菌肽中，通过脯氨酸(P)被D-赖氨酸(k)替代；和/或第14个氨基酸即谷氨酸(E)被L-赖氨酸(K)替代，设计出记载为序列编号15至序列编号20的抗菌肽(PapMA-15至PapMA-20)。
另外，所述记载为序列编号1至序列编号20的氨基酸序列的抗菌肽中，通过第9个氨基酸即脯氨酸(P)或D-赖氨酸(k)被D-亮氨酸(l)替代，设计出记载为序列编号21至序列编号24的抗菌肽(PapMA-21至PapMA-24)。
所设计的肽序列使用N-(9-芴基)甲氧羰基(N-(9-fluorenyl)methoxy carbonyl；Fmoc)合成法，以固相肽合成法合成肽，并对其进行提纯(Bio chimica et BiophysicaActa(BBA)-Biomembranes 1798.10(2010):1913-1925)。然后使用UV分光光度计对所合成的肽的浓度进行定量，并用反相高效液相色谱法(Reverse-phase HPLC)对最终的肽的纯度(＞98％)进行了分析。
其结果，如以下的[表1]所示，合成了由序列编号1至24的氨基酸序列构成的抗菌肽。
[表1]
在本发明中合成的肽的序列
Figure BDA0001918019230000341
Figure BDA0001918019230000351
＜实施例2＞抗菌肽的抗菌活性的确认
＜2-1＞抗菌肽对革兰氏阳性菌以及革兰氏阴性菌的抗菌活性的确认
为了比较本发明的抗菌肽表现出的抗菌活性，测定了抗菌肽或现有的抗生素对革兰氏阴性菌以及革兰氏阳性菌表现出的抗菌活性。通过测定在营养成分充足的MH培养基中菌体未分裂的肽的最小抑菌浓度(Minimal in hibitory浓度：MIC)来测定所述抗菌活性。
具体而言，购入如下[表2]记载的菌株，用MH培养基以每ml细菌数达到2×106菌落形成单位(colony-forming units，CFUs)的方式进行稀释，以100μl为单位分到96-孔微量滴定板(Microtiter plate)后，将用MH培养基稀释的肽溶液(2:1分阶段稀释的溶液)，以100μl为单位添加到各孔中。将滴定板在37℃下培养16小时后，用ELISA读出器(Bio-TekIns truments)，在620nm条件下测定了各孔的吸光度，来确定肽的MIC。当MI C值为相关浓度以上时，将MIC假设为相关浓度，并进行了后续实验。
[表2]
本发明中所使用的菌株及其获取处
Figure BDA0001918019230000361
其结果,如以下的表3至表7所示，确认到序列编号1至24的肽对所有的革兰氏阴性菌具有高抗菌活性。
首先，可知序列编号2至4的PapMA-2、PapMA-3以及PapMA-4的肽与作为肽母体的PapMA-1相比，对革兰氏阴性菌中的鲍氏不动杆菌及其耐药菌表现出优异4倍的抗菌活性。尤其，PapMA-2、PapMA-3、PapMA-4肽表现出与已知对革兰氏阴性菌的抗菌活性高的比较肽Papiliocin或蜂毒肽相比拟的抗菌活性。确认到这些肽以及用作比较对照组的抗菌肽Papiliocin对所有革兰氏阴性菌选择性地具有极高的抗菌活性，对革兰氏阳性菌具有非常低的抗菌活性(表3)。
[表3]
PapMA-1至PapMA-4肽对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌以及抗生素耐药菌的抗菌活性
Figure BDA0001918019230000371
以PapMA-5至PapMA-10的肽为对象确认抗菌活性的结果，确认到如以下的[表4]所示，序列编号5至10的肽对所有革兰氏阴性菌具有高抗菌活性。确认到与PapMA-1相比，序列编号7至10的PapMA-7、PapMA-8、Pap MA-9以及PapMA-10肽尤其对革兰氏阴性菌中的大肠杆菌所表现出的抗菌活性的水平增加2倍以上，表现出比PapMA-1优异的抗菌活性。
尤其PapMA-7以及PapMA-8肽的情形下，确认到对大部分革兰氏阴性菌的抗菌活性与PapMA-1、PapMA-2、PapMA-3以及PapMA-4相同或比之更高的抗菌活性。另外，PapMA-6、PapMA-7以及PapMA-8肽在革兰氏阴性菌中尤其对绿脓假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌表现出有意义地提升水平的抗菌活性，这表示抗菌活性与已知对革兰氏阴性菌的抗菌活性高的比较肽Papi liocin或蜂毒肽相类似(表4)。
[表4]
PapMA-5至PapMA-10肽对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌以及抗生素耐药菌的抗菌活性
Figure BDA0001918019230000381
Figure BDA0001918019230000391
确认到如以下的[表5]所示，序列编号11至14的肽对所有革兰氏阴性菌具有高抗菌活性。确认到与序列编号1的肽(PapMA-1)相比，尤其对大肠杆菌鲍氏不动杆菌以及鼠伤寒沙门氏菌表现出有意义的高水平的抗菌活性，PapMA-12、PapMA-13以及PapMA-14表现出比PapMA-1优异2倍以上的抗菌活性。
与此同时，序列编号11至14的肽对多药耐药菌也表现出优异的抗菌活性，确认到PapMA-12、PapMA-13以及PapMA-14比PapMA-1优异2至4倍的抗菌活性。
[表5]
PapMA-11至PapMA-14肽对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌以及抗生素耐药菌的抗菌活性
Figure BDA0001918019230000392
另外，确认到序列编号15至20的肽对所有革兰氏阴性菌具有高抗菌活性(表6)。确认到与序列编号1的肽(PapMA-1)相比，尤其对大肠杆菌、鲍氏不动杆菌以及鼠伤寒沙门氏菌表现出有意义的高水平的抗菌活性，PapMA-15、PapMA-17、PapMA-19以及PapMA-20表现出比PapMA-1优异2倍以上的抗菌活性。
与此同时，序列编号15至20的肽对多药耐药菌也表现出优异的抗菌活性，确认到PapMA-15、PapMA-17、PapMA-19以及PapMA-20表现出比Pa pMA-1优异2至4倍的抗菌活性。
[表6]
PapMA-15至PapMA-20肽对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌以及抗生素耐药菌的抗菌活性
Figure BDA0001918019230000401
最后，确认到序列编号21至24的肽对所有革兰氏阴性菌具有高抗菌活性(表7)。确认到与序列编号1的肽(PapMA-1)相比，尤其对大肠杆菌、鲍氏不动杆菌以及鼠伤寒沙门氏菌表现出有意义的高水平的抗菌活性，从而PapMA-21、PapMA-22、PapMA-23以及PapMA-24表现出比PapMA-1优异2倍以上的抗菌活性。
与此同时，序列编号21至24的肽对于多药耐药菌也表现出优异的抗菌活性，由此确认到PapMA-21、PapMA-22、PapMA-23以及PapMA-24表现出比PapMA-1优异2至4倍的抗菌活性。
[表7]
PapMA-21至PapMA-24对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌以及抗生素耐药菌的抗菌活性
Figure BDA0001918019230000411
＜2-2＞现有抗生素对革兰氏阳性菌以及革兰氏阴性菌的抗菌活性的确认
为了与现有的抗生素比较本发明的抗菌肽的抗菌活性，确认到抗生素对相同的革兰氏阳性菌以及革兰氏阴性菌菌株所表现出的MIC浓度。
具体而言，以与所述实施例＜2-1＞相同的方法准备对象菌株，分别用抗生素红霉素(Erythromycin)、万古霉素(Vancomycin)或利奈唑胺(Li nezolid)处理，确认到来确认抗生素的MIC。
其结果，如以下的[表8]所示，确认到抗生素如已知般对革兰氏阴性菌表现出32μg/ml以上的MIC，具有低抗菌活性，相反，对革兰氏阳性菌，所有抗生素表现出极高的抗菌活性(表8)。
[表8]
现有抗生素对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌以及抗生素耐药菌株的抗菌活性。
Figure BDA0001918019230000421
＜实施例3＞抗菌肽以及抗生素同时处理时协同效应的确认
＜3-1＞抗菌肽以及抗生素混合处理时抗生素的MIC变化的确认
确认到本发明的抗菌肽对革兰氏阴性菌表现出高抗菌活性，由此确认将仅对革兰氏阳性菌表现出强抗菌活性而对革兰氏阴性菌不具有有意义的抗菌活性的抗生素与本发明的合成肽混合处理时，是否表现出有意义的协同活性。
具体而言，准备在所述[表2]记载的各菌株，用MH培养基以每ml细菌数达到2×106菌落形成单位(colony-forming units，CFUs)的方式进行稀释，以100μl为单位分到96-孔微量滴定板(Microtiter plate)后，将用MH培养基从MIC值起开始稀释的肽溶液(2:1分阶段稀释的溶液)，以50μl为单位添加到各孔中。然后，将抗生素溶液稀释到MH培养基中，以50μl为单位添加到各孔中，以相同地实施，来确定各混合液的MIC值。
其结果，如以下的[表9]至[表12]所示，将现有的抗生素红霉素、万古霉素、利奈唑胺与本发明的抗菌肽的PapMA-1至PapMA-24一同给药，确认是否表现出抗菌活性的协同效应的结果，确认到以1/2的MIC值处理本发明的肽时，红霉素对大肠杆菌及其耐药菌以及鲍氏不动杆菌及其耐药菌的MIC最多降低1024倍(表9至表12)。
首先，以序列编号1的PapMA-1肽为母体设计的衍生物肽即序列编号2至4的肽中，尤其序列编号2的PapMA-2肽以与PapMA-1相同的肽浓度分别施加给菌株时，与PapMA-1相比，确认到与PapMA-2混合的抗生素的MIC值降低2至4倍。
例如，将肽以肽MIC的1/4浓度即16μg/ml与抗生素混合并处理大肠杆菌时，确认到将PapMA-1与红霉素或利奈唑胺混合的情形下红霉素以及利奈唑胺的MIC值分别为2以及16μg/ml(分别为抗生素MIC的1/64、1/16)。与此相比，将PapMA-2与红霉素或利奈唑胺混合进行处理的情形下，红霉素以及利奈唑胺的MIC值为0.5以及8μg/ml，确认到各抗生素的MIC降低至1/256以及1/32的水平(表9)。
另外，PapMA-7对大肠杆菌示出32μg/ml的MIC，以其1/2浓度即16μg/ml，将PapMA-7与红霉素或利奈唑胺混合进行处理时，红霉素以及利奈唑胺的MIC值分别为0.125以及1μg/ml，确认到与单独处理各抗生素的情形下的MIC值相比，降低至1/512以及1/256的水平(表9)。由此可知，PapMA-7肽不仅在单独给药的情形下也比PapMA-1肽示出更低的MIC浓度，表现出优异的抗菌活性，而且比起与PapMA-1肽混合处理的情形，在与抗生素混合处理的情形下，红霉素、万古霉素以及利奈唑胺的MIC值示出更降低的水平。
通过该方法进行比较时确认，本发明的PapMA-3、PapMA-4、PapMA-5、PapMA-10、PapMA-11、PapMA-15、PapMA-21、PapMA-22、PapMA-23以及PapMA-24肽与现有的抗生素进行混合处理时，以与PapMA-1肽类似的水平，对大肠杆菌及其多药耐药菌即MDREC1229表现出抗菌活性的协同效应，PapMA-2、PapMA-6、PapMA-7、PapMA-8、PapMA-9、PapMA-12、PapMA-13、PapMA-14、PapMA-16、PapMA-17、PapMA-18、PapMA-19以及PapMA-20肽以高于PapMA-1肽的水平表现出与现有抗生素的协同效应(表9至表10)。
[表9]
用PapMA-1至PapMA-24抗菌肽处理时，抗生素对大肠杆菌的抗菌活性(9-1)
Figure BDA0001918019230000441
Figure BDA0001918019230000451
(9-2)
Figure BDA0001918019230000452
Figure BDA0001918019230000461
(9-3)
Figure BDA0001918019230000462
(9-4)
Figure BDA0001918019230000471
(9-5)
Figure BDA0001918019230000481
(9-6)
Figure BDA0001918019230000491
(9-7)
Figure BDA0001918019230000501
[表10]
用PapMA-1至PapMA-24的抗菌肽处理时，抗生素对MDREC 1229的抗菌活性
(10-1)
Figure BDA0001918019230000502
Figure BDA0001918019230000511
(10-2)
Figure BDA0001918019230000512
(10-3)
Figure BDA0001918019230000521
(10-4)
Figure BDA0001918019230000531
(10-5)
Figure BDA0001918019230000541
(10-6)
Figure BDA0001918019230000551
(10-7)
Figure BDA0001918019230000561
另外，确认到如以下的[表11]以及[表12]所示，PapMA-7对鲍氏不动杆菌也表现出提升水平的协同效应。对鲍氏不动杆菌，PapMA-1示出64μg/ml的MIC，因此将其1/4浓度即8μg/ml的PapMA-1与红霉素同时给药时，确认到红霉素示出0.5μg/ml的MIC，与单独处理红霉素相比，MIC示出1/64的水平，确认到与利奈唑胺同时给药时，与将利奈唑胺单独给药时相比，MIC示出1/32的水平(表11)。另外，对鲍氏不动杆菌，PapMA-2示出16μg/ml的MIC，因此将其1/2浓度即8μg/ml的PapMA-2与红霉素同时给药时，确认到红霉素示出0.125μg/ml的MIC，与用红霉素单独处理相比，MIC示出1/256的水平，与利奈唑胺同时给药时，确认到与将利奈唑胺单独给药时相比，MIC为8，示出1/32的水平(表11)。
与此相比较，在PapMA-7的情形下，以与PapMA-1或PapMA-2相同的浓度即8μg/ml处理，并与红霉素混合处理时，确认到红霉素的MIC值降低至0.125μg/ml，与单独给药时的MIC相比，降至1/256的水平(表11)。另外，将利奈唑胺进行给药时，利奈唑胺的MIC值为1，示出1/256的水平。以与红霉素相同的状态，对万古霉素也添加8μg/ml的PapMA-7肽时，与此进行混合处理的万古霉素的MIC降至2μg/ml(1/512)。即，由此确认到在PapMA-7肽的情形下，以与作为模板肽的PapMA-1或PapMA-2相同的浓度进行处理时，通过与现有抗生素混合处理，协同效应有意义地提升。
根据以与其相同的方法混合处理PapMA-1至PapMA-24的抗菌肽和抗生素，确认到对鲍氏不动杆菌以及作为其多药耐药菌的MDRAB12035的抗生素的MIC浓度变化，表现出与大肠杆菌相同的状态，确认到本发明的PapMA-5、PapMA-10、PapMA-11、PapMA-16、PapMA-17、PapMA-22、PapMA-23以及PapMA-24肽与现有的抗生素混合处理时，以与PapMA-1肽相类似的水平，表现出抗菌活性的协同效应。另外确认到与PapMA-1肽相比，PapMA-2、PapMA-3、PapMA-6、PapMA-7、PapMA-8、PapMA-9、PapMA-12、PapMA-13、PapMA-14、PapMA-19以及PapMA-20肽以高水平表现出了与现有抗生素的协同效应(表11以及表12)。
[表11]
处理PapMA-1至PapMA-24肽时，抗生素对鲍氏不动杆菌的抗菌活性
(11-1)
Figure BDA0001918019230000571
Figure BDA0001918019230000581
(11-2)
Figure BDA0001918019230000582
(11-3)
Figure BDA0001918019230000591
(11-4)
Figure BDA0001918019230000601
(11-5)
Figure BDA0001918019230000611
(11-6)
Figure BDA0001918019230000621
(11-7)
Figure BDA0001918019230000631
[表12]
用PapMA-1至PapMA-24肽处理时，抗生素对MDRAB 12035的抗菌活性(12-1)
Figure BDA0001918019230000632
Figure BDA0001918019230000641
(12-2)
Figure BDA0001918019230000642
(12-3)
Figure BDA0001918019230000651
(12-4)
Figure BDA0001918019230000661
(12-5)
Figure BDA0001918019230000671
(12-6)
Figure BDA0001918019230000681
(12-7)
Figure BDA0001918019230000691
另外，如从以下的[表13]所确认，作为比较对照组，混合Papiliocin和抗生素，确认抗生素对大肠杆菌以及鲍氏不动杆菌的抗菌活性的结果，P apiliocin自身的抗菌活性非常优秀，但与抗生素混合时，与本发明的肽相比，未带来抗菌活性大大提升的效果(表13)。
[表13]
用比较对照组即Papiliocin处理时，抗生素对大肠杆菌以及鲍氏不动杆菌的抗菌活性
Figure BDA0001918019230000692
＜3-2＞抗菌肽以及抗生素混合处理时抗菌肽的MIC变化的确认
将抗菌肽以及抗生素混合处理时，确认到由于协同效应，抗生素的MI C能够有意义地降低，因此确认到将抗菌肽以及抗生素混合处理时抗菌肽的MIC浓度是否变化。
其结果，如以下的[表14]至[表33]所示，在添加抗生素时测定抗微生物的抗菌活性的结果，确认到添加抗生素时，抗菌肽对大肠杆菌及其耐药菌(MDREC 1229)、鲍氏不动杆菌及其耐药菌(MDRAB 12035)的MIC降至256倍(表14至表33)。
例如，如从本发明所确认，红霉素对鲍氏不动杆菌的多药耐药菌MDRA B 12035的MIC值是32μg/ml。以红霉素为基准时，能够确认抗菌肽通过与现有抗生素的混合处理的协同效应。以红霉素的MIC的1/4浓度即8μg/ml与PapMA-1肽混合来处理MDRAB 12035时，确认到PapMA-1的MIC值降至4μg/ml，与单独处理抗菌肽时的MIC值相比降至1/16的水平。与此相比，适用于本发明的衍生物肽时，在将红霉素以8μg/ml的浓度处理时，确认到PapMA-2至PapMA-24的MIC降至1至8μg/ml，与单独处理时的MI C值相比降至1/4至1/32的水平，从而确认到将本发明的抗菌肽与抗生素混合进行处理时，在抗菌活性方面表现出协同效应(表29至表33)。
以与其相同的方法进行比较时，确认到将本发明的现有抗生素以MIC的1/4浓度处理并将PapMA-1至PapMA-24肽进行混合处理时，以1/2至1/128水平的浓度处理抗菌肽，对大肠杆菌及其耐药菌(MDREC 1229)、鲍氏不动杆菌及其耐药菌(MDRAB 12035)能够表现出有意义的抗菌活性，从而确认到与PapMA-1类似或提升水平的协同抗菌活性(表14至表33)。
[表14]
用抗生素处理时，PapMA-1至PapMA-4肽对大肠杆菌的抗菌活性
Figure BDA0001918019230000701
Figure BDA0001918019230000711
[表15]
用抗生素处理时，PapMA-5至PapMA-10肽对大肠杆菌的抗菌活性
Figure BDA0001918019230000712
[表16]
用抗生素处理时，PapMA-11至PapMA-14肽对大肠杆菌的抗菌活性
Figure BDA0001918019230000721
[表17]
用抗生素处理时，PapMA-15至PapMA-20肽对大肠杆菌的抗菌活性
Figure BDA0001918019230000722
Figure BDA0001918019230000731
[表18]
用抗生素处理时，PapMA-21至PapMA-24肽对大肠杆菌的抗菌活性
Figure BDA0001918019230000732
Figure BDA0001918019230000741
[表19]
用抗生素处理时，PapMA-1至PapMA-4肽对MDREC 1229的抗菌活性
Figure BDA0001918019230000742
[表20]
用抗生素处理时，PapMA-5至PapMA-10肽对MDREC 1229的抗菌活性
Figure BDA0001918019230000743
Figure BDA0001918019230000751
[表21]
用抗生素处理时，PapMA-11至PapMA-14肽对MDREC 1229的抗菌活性
Figure BDA0001918019230000752
[表22]
用抗生素处理时，PapMA-15至PapMA-20肽对MDREC 1229的抗菌活性
Figure BDA0001918019230000761
[表23]
用抗生素处理时，PapMA-21至PapMA-24肽对MDREC 1229的抗菌活性
Figure BDA0001918019230000771
[表24]
用抗生素处理时，PapMA-1至PapMA-4肽对鲍氏不动杆菌的抗菌活性
Figure BDA0001918019230000772
Figure BDA0001918019230000781
[表25]
用抗生素处理时，PapMA-5至PapMA-10肽对鲍氏不动杆菌的抗菌活性
Figure BDA0001918019230000782
[表26]
用抗生素处理时，PapMA-11至PapMA-14肽对鲍氏不动杆菌的抗菌活性
Figure BDA0001918019230000791
[表27]
用抗生素处理时，PapMA-15至PapMA-20肽对鲍氏不动杆菌的抗菌活性
Figure BDA0001918019230000792
Figure BDA0001918019230000801
[表28]
用抗生素处理时，PapMA-21至PapMA-24肽对鲍氏不动杆菌的抗菌活性
Figure BDA0001918019230000802
[表29]
用抗生素处理时，PapMA-1至PapMA-4肽对MDRAB 12035的抗菌活性
Figure BDA0001918019230000811
[表30]
用抗生素处理时，PapMA-5至PapMA-10肽对MDRAB 12035的抗菌活性
Figure BDA0001918019230000812
Figure BDA0001918019230000821
[表31]
用抗生素处理时，PapMA-11至PapMA-14肽对MDRAB 12035的抗菌活性
Figure BDA0001918019230000822
[表32]
用抗生素处理时，PapMA-15至PapMA-20肽对MDRAB 12035的抗菌活性
Figure BDA0001918019230000823
Figure BDA0001918019230000831
[表33]
用抗生素处理时，PapMA-21至PapMA-24肽对MDRAB 12035的抗菌活性
Figure BDA0001918019230000832
Figure BDA0001918019230000841
另外，如从以下的[表34]所确认可知，用抗生素处理时与作为比较对照组的Papiliocin混合来确认Papiliocin的抗菌活性的结果，与本发明的肽相比，未带来抗菌活性大大提升的效果(表34)。
[表34]
用抗生素处理时，比较对照组Papiliocin对大肠杆菌以及鲍氏不动杆菌的抗菌活性
Figure BDA0001918019230000842
Figure BDA0001918019230000851
＜3-3＞抗菌肽以及抗生素混合处理时，利用MIC值的抗菌活性的协同效应的确认
利用对各混合液确定的MIC值，关于对菌株的抗菌活性，评价肽与抗生素的协同效应。为了评价，使用了分数抑制浓度(Fractional inhibito ry浓度；FIC)值(Elion,GertrudeB.,Samuel Singer,and George H.Hit chings.Journal of BiologicalChemistry 208.2(1954):477-488.)。
具体而言，利用在所述实施例＜3-1＞以及＜3-2＞计算的MIC值，通过如下[数学式1]计算了FIC值，根据所计算的FIC值，如下进行评价：＜0.5:协同效应(Synergyeffect)；0.5-1,部分协同效应(Partial synerg y effect),1.0：加性效应(Additiveeffect)；2.0-4.0,无差别(Indif ference)；＞4.0：拮抗作用(Antagonism)
数学式1
Figure BDA0001918019230000852
为了使用FIC值来判断协同效应，一般使用的方法是棋盘分析法(Che ckerboardassay)，是在抑制菌的生长的孔中选择最低的FIC指数值的方法。但是，该方法中选择一个FIC指数以抗生素的抗菌活性更低时具有更大的协同效应的方式计算，因此不准确，具有实验误差多的问题。因此，用所述[数学式1]计算的FIC指数再次使用如下[数学式2]，计算了平均F IC指数(He,Jing,Charles G.Starr,and William C.Wimley.Biochimica etBiophysica Acta(BBA)-Biomembranes 1848.1(2015):8-15.)。
数学式2
Figure BDA0001918019230000861
其结果，如从如下[表35]至[表38]所示，利用FIC值对将作为现有的抗生素的红霉素、万古霉素或利奈唑胺与本发明的抗菌肽PapMA-1至PapM A-24一同给药的抗菌活性的协同效应进行确认的结果，仅对革兰氏阳性菌具有高抗菌活性而对革兰氏阴性菌没有活性的抗生素与本发明的抗菌肽一同给药时，对于对所有的抗生素属于革兰氏阴性菌的大肠杆菌，得出低于0.5或类似水平的0.09至0.51的FIC指数，确认到协同效应优异。另外，对于多药耐药菌(MDREC 1229)得出非常低于0.5的0.06至0.31范围的FI C指数，确认到协同效应非常优异。
对于鲍氏不动杆菌，得出极低于0.5的0.05至0.54的FIC指数，确认到协同效应非常优异，对于其耐药菌(MDRAB 12035)，得出极低于0.5的0.04至0.61的FIC指数，确认到协同效应非常优异。
因此确认到对于最近因严重的耐药性问题而成为社会隐患的革兰氏阴性菌，作为与现有抗生素的复合剂适用本发明的抗菌肽时，能够具有高协同效应(表35至表38以及图1至图4)。
[表35]
表示在抗菌肽以及抗生素混合处理时，对大肠杆菌的抗菌活性的协同效应的FIC指数的比较
Figure BDA0001918019230000862
Figure BDA0001918019230000871
[表36]
表示抗菌肽以及抗生素混合处理时，对多药耐药菌MDREC 1229的抗菌活性的协同效应的FIC指数的比较
Figure BDA0001918019230000872
Figure BDA0001918019230000881
[表37]
表示混合处理抗菌肽以及抗生素混合处理时,对鲍氏不动杆菌的抗菌活性的协同效应的FIC指数的比较
Figure BDA0001918019230000882
Figure BDA0001918019230000891
[表38]
抗菌肽以及抗生素混合处理时，表现出对多药耐药菌MDREC 1229的抗菌活性的协同效应的FIC指数的比较
Figure BDA0001918019230000892
下面，对包含本发明涉及的所述抗菌肽作为有效成分的药品的制备例进行说明，但是本发明只是用于具体说明，并非旨在限定。用本发明的对革兰氏阴性菌以及革兰氏阳性菌表现出抗菌活性的抗菌肽，根据通常的方法，按照如下组分以及配比制备了制备例1的药品。
＜制备例1＞药物制剂的制备
＜1-1＞粉剂的制备
本发明的肽以及抗生素复合剂2g
乳糖1g
混合上述成分，填充到气密包中，制备了粉剂。
＜1-2＞片剂的制备
本发明的肽以及抗生素复合剂100mg
玉米淀粉100mg
乳糖100mg
硬脂酸镁2mg
将上述淀粉混合后，根据通常的片剂的制备方法定型，从而制备了片剂。
＜1-3＞胶囊的制备
本发明的肽以及抗生素的复合剂100mg
玉米淀粉100mg
乳糖100mg
硬脂酸镁2mg
将上述淀粉混合后，根据通常的胶囊的制备方法填充到胶囊中，从而制备了胶囊。
＜1-4＞丸药的制备
本发明的肽以及抗生素复合剂1g
乳糖1.5g
甘油1g
木糖醇0.5g
将上述成分混合后，根据通常的方法以每个丸达到4g的方式进行制备。
＜1-5＞颗粒的制备
本发明的肽以及抗生素复合剂150mg
大豆提取物50mg
葡萄糖200mg
淀粉600mg
将上述成分混合后，添加100mg的30％的乙醇，在摄氏60度下干燥，形成颗粒后，填充到包内。
＜1-6＞注射剂的制备
本发明的肽以及抗生素复合剂500ng
甘露醇180mg
Na2HPO42H2O 26mg
蒸馏水2974mg
根据通常的注射剂的制备方法，以给出的含量包含上述成分，从而制备了注射剂。
<110> 建国大学校产学协力团
<120> 与抗生素对革兰氏阴性多药耐药菌具有增效性抗菌效果的抗菌肽及其用途
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<400> 23
Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys Ile Leu Lys Leu Leu His Glu Phe Lys
1 5 10 15
Lys Phe
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<211> 18
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<220>
<223> PapMA-24
<400> 24
Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys Ile Leu Lys Leu Leu His Glu Ala Lys
1 5 10 15
Lys Trp
<210> 25
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Papiliocin
<400> 25
Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys Ile Glu Lys Val Gly Arg Asn Val Arg
1 5 10 15
Asp Gly Ile Ile Lys Ala Gly Pro Ala Val Ala Val Val Gly Gln Ala
20 25 30
Ala Thr Val Val Lys
35
<210> 26
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 滑爪蟾素
<400> 26
Gly Ile Gly Lys Phe Leu His Ser Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala Phe
1 5 10 15
Val Gly Glu Ile Met Asn Ser
20
<210> 27
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Melittin
<400> 27
Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln
20 25

Claims (7)

1.一种抗菌肽，其特征在于，
所述抗菌肽的氨基酸序列为选自序列编号2；序列编号4；序列编号9；序列编号10；序列编号13；序列编号14；序列编号16；序列编号18；序列编号20；序列编号22；以及序列编号24中的一种。
2.一种抗菌组合物，其特征在于，
包含权利要求1所述的抗菌肽作为有效成分。
3.根据权利要求2所述的抗菌组合物，其特征在于，
还包含抗生素作为有效成分。
4.根据权利要求2所述的抗菌组合物，其特征在于，
所述抗菌组合物对革兰氏阴性菌具有抗菌活性。
5.根据权利要求4所述的抗菌组合物，其特征在于，
所述革兰氏阴性菌是选自由大肠杆菌(Escherichia coli)、绿脓假单胞菌(Psedomonas aeruginosa)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)或鼠伤寒沙门杆菌(Salmonella typhimurium)所组成的组中的任意一个以上。
6.根据权利要求3所述的抗菌组合物，其特征在于，
所述抗生素是选自由红霉素(Erythromycin)、氨苄青霉素(Ampicillin)、万古霉素(Vancomycin)、利奈唑胺(Linezolid)、甲氧西林(Methicillin)、苯唑西林(Oxacillin)、头孢噻肟(Cefotaxime)、利福平(Rifampicin)、阿米卡星(Amikacin)、庆大霉素(Gentamicin)、卡那霉素(Kanamycin)、妥布霉素(Tobramycin)、新霉素(Neomycin)、厄他培南(Ertapenem)、多尼培南(Doripenem)、亚胺培南/西司他汀(Imipenem/Cilastatin)、美罗培南(Meropenem)、头炮他啶(Ceftazidime)、头孢吡肟(Cefepime)、头孢洛林(Ceftaroline)、头孢吡普(Ceftobiprole)、氨曲南(Aztreonam)、哌拉西林(Piperacillin)、多粘菌素B(Polymyxin B)、粘杆菌素(Colistin)、环丙沙星(Ciprofloxacin)、左氧氟沙星(Levofloxacin)、莫西沙星(Moxifloxacin)、加替沙星(Gatifloxacin)、替加环素(Tigecycline)、其组合以及它们的衍生物所组成的组中的任意一个以上。
7.根据权利要求2所述的抗菌组合物，其特征在于，
所述抗菌组合物是选自由药物组合物、食品添加剂、饲料添加剂、防腐组合物以及非处方药组合物所组成的组中的任意一个。
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