CN116621939B

CN116621939B - 一种抗菌肽lrgg在制备氟喹诺酮类药物抗菌增效剂中的应用

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Publication number: CN116621939B
Application number: CN202310556957.3A
Authority: CN
Inventors: 马红霞; 孔令聪; 刘磊; 崔琪; 于函冬; 官丽莉; 张海朋; 贺承光
Original assignee: Jilin Agricultural University
Current assignee: Jilin Agricultural University
Priority date: 2023-05-17
Filing date: 2023-05-17
Publication date: 2024-01-19
Anticipated expiration: 2043-05-17
Also published as: CN116621939A; ZA202306022B

Abstract

本发明公开了一种抗菌肽LRGG在制备氟喹诺酮类药物抗菌增效剂中的应用，涉及生物医药技术领域。所述抗菌肽LRGG的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的抗菌肽LRGG与氟喹诺酮类药物联合应用，可对大肠杆菌、志贺氏痢疾杆菌及多杀性巴氏杆菌等革兰阴性菌产生协同杀菌作用。其中，LRGG与氟喹诺酮类药物联合应用对耐药牛源多杀性巴氏杆菌(MIC＝32μg/mL)的协同杀菌作用最强，可使氟喹诺酮类药物对耐药牛源多杀性巴氏杆菌的抗菌活性提高512倍(MIC＝0.0625μg/mL)，显著提高了氟喹诺酮类药物对耐药牛多杀性巴氏杆菌引起感染的治疗效果。

Description

一种抗菌肽LRGG在制备氟喹诺酮类药物抗菌增效剂中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种抗菌肽LRGG在制备氟喹诺酮类药物抗菌增效剂中的应用。

背景技术

牛A型多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida，Pm)是引起牛呼吸系统疾病(Bovinere spiratorydiseasecomplex，BRDC)的主要病原体之一，已呈世界性流行和分布。该病原多发于经长途运输的育肥架子牛中，导致了较高的发病率和死亡率。目前，牛A型Pm引发的疾病主要依赖抗生素的治疗，但随着抗菌药物的长期、不当使用，使其对氟喹诺酮类抗菌药物产生的耐药性日趋严重。面对这一现象，世界动物卫生组织(OIE)强调，新的药物研发往往跟不上新菌株出现的速度，所以保证现有抗生素的有效性至关重要。为此，研发常用药物抗菌增效剂是当前畜牧业有效实施“限抗减抗”政策和破解致病菌“无药可医”局面等关键科学问题的重要策略。

氟喹诺酮类抗菌药物是一类具有较广抗菌谱、高疗效的人工合成抗菌药物，长期应用于兽用防治领域。据统计估算，2023年畜禽抗生素的使用量占抗生素使用总量的52％，略高于人类使用量(48％)。在畜禽养殖中氟喹诺酮类抗菌药物使用量较多的是环丙沙星、恩诺沙星和诺氟沙星，其发挥抗菌作用的主要机制主要为两种：一是通过嵌入断裂DNA链，形成酶-DNA-药物三元复合物而抑制DNA回旋酶的切口活性和封口活性，达到杀菌目的；二是通过抑制拓扑异构酶IV而干扰细菌DNA的复制从而达到杀菌作用。

目前有报道称一些多杀性巴氏杆菌会产生环丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)抗性，而且可在不同菌株中水平传播，为了防止其他细菌例如大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和志贺氏杆菌等产生环丙沙星抗性，从而使临床治疗细菌感染变得复杂和困难，甚至濒临无药可用的境地，因此，探索新的策略和方法已成为当务之急。

抗菌肽作为一种潜在的增效剂，具有独特的抗菌机制、不损伤动物体细胞和不易产生耐药性等特点，可用于提高抗生素的抗菌功效，减少现有抗菌药物的用量。目前并未有抗菌肽协同氟喹诺酮类抗菌药物抗菌增敏的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗菌肽LRGG在制备氟喹诺酮类药物抗菌增效剂中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明研究发现抗菌肽LRGG与氟喹诺酮类药物联合应用可对大肠杆菌、志贺氏痢疾杆菌及多杀性巴氏杆菌等革兰阴性菌产生协同杀菌作用，因此可将其应用于制备氟喹诺酮类药物抗菌增效剂。

LRGG(序列为：LLRLLRRGGRRLLRLL)是一条含有七肽重复序列及β-转角结构的抗菌肽，本发明研究发现，在多杀性巴氏杆菌中联合氟喹诺酮类抗菌药物具有明显抗菌增敏作用，对其作用机制进行研究发现LRGG可抑制病原菌外膜LPS和内膜转铁蛋白FecD而增加药物积聚，从而发挥抗菌增敏作用。

基于此，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种增强氟喹诺酮类药物抗菌敏感性的抗菌肽LRGG，所述抗菌肽LRGG的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供抗菌肽LRGG在制备氟喹诺酮类药物抗菌增效剂中的应用。

进一步地，所述氟喹诺酮类药物包括环丙沙星。

本发明还提供一种氟喹诺酮类药物抗菌增效剂，包括抗菌肽LRGG。

本发明还提供一种抗菌组合物，包括氟喹诺酮类药物和抗菌肽LRGG。

进一步地，所述氟喹诺酮类药物包括环丙沙星。

本发明还提供上述的抗菌组合物在制备抗菌药物中的应用。

本发明还提供一种抗菌药物，包括上述的抗菌组合物。

进一步地，所述氟喹诺酮类药物和所述抗菌肽LRGG的质量比为1:(0.8～8)。

进一步地，所述抗菌药物还包括药学上可接受的辅料。

本发明公开了以下技术效果：

本发明提供的抗菌肽LRGG与氟喹诺酮类药物联合应用，可对大肠杆菌、志贺氏痢疾杆菌及多杀性巴氏杆菌等革兰阴性菌产生协同杀菌作用。其中，LRGG与氟喹诺酮类药物联合应用对耐药牛源多杀性巴氏杆菌(MIC＝32μg/mL)的协同杀菌作用最强(见图1)，可使氟喹诺酮类药物对耐药牛源多杀性巴氏杆菌的抗菌活性提高512倍(MIC＝0.0625μg/mL)，显著提高了氟喹诺酮类药物对耐药牛多杀性巴氏杆菌引起感染的治疗效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例2药物敏感性实验的实验结果；

图2为多杀性巴氏杆菌P32的时间-杀菌曲线；

图3为实施例4小鼠保护实验的实验结果；其中A为小鼠生存曲线；B为小鼠肺部载菌量；

图4为实施例5大蜡螟保护实验的实验结果，即大蜡螟生存曲线。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

以下实施例使用的供试菌如下：铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)K3、鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)JS1和肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia)JP20已在文献“赵晓欧.新型四环素类抗生素增效剂胍乙啶的发掘以及协同作用机制的研究[D].长春：吉林农业大学，2022.DOI:10.27163/d.cnki.gjlnu.2022.000463”中公开；

福氏志贺杆菌(Shigellaflexneri)QY1已在文献“ZhaoXiaoou,ZhangMengna,Muhammad Inametal.AnAntibacterialPeptidewithHighResistancetoTrypsinObtainedbySubstituting d-AminoAcidsforTrypsinCleavageSites[J].Antibiotics(Basel),2021,10”中公开；

大肠杆菌(Escherichiacoli)B2、沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)、粘质沙雷菌(Serratiamarcescens)和维氏气单胞菌(Aeromonasveronii)已在文献“SongMeirong,LiuYuan,HuangXiaoyongetal.Abroad-spectrumantibioticadjuvant reversesmultidrug-resistantGram-negativepathogens[J].NatMicrobiol,2020,5:1040-1050”中公开；

多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)P32已在文献“徐冠艺.基于牛A型巴氏杆菌recA氟喹诺酮类药物耐药抑制剂筛选研究[D].长春：吉林农业大学，2022.DOI:10.27163/d.cnki.gjlnu.2022.000513”中公开。

实施例1LRGG的制备

人工合成抗菌肽LRGG，序列为：LLRLLRRGGRRLLRLL(SEQ ID NO.1)。

合成方法：委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

实施例2药物敏感性实验

本实施例在于研究抗菌肽LRGG与环丙沙星(CIP)对不同致病菌最低抑菌浓度。

将各种供试菌分别接种于MH平板，其中多杀性巴氏杆菌P32接种于MH(血清)平板，放置于37℃培养箱中培养48h，从平板上挑选一个单菌落接入MH斜面上，其中多杀性巴氏杆菌P32单菌落接种于MH(血清)斜面上，37℃培养24h，备用。从活化的斜面上挑一环供试菌到5mL液体培养基中，37℃，160rpm振荡培养过夜，用液体培养基稀释至细菌浓度为10⁶CFU/mL，作为供试菌液。

采用微量肉汤稀释法和棋盘法测定最小抑菌浓度(MinimumInhibitoryConcentration，MIC)和分级抑菌浓度(FractionalInhibitoryConcentration，FIC)，操作全部在超净台内进行。将实施例1制备的LRGG与环丙沙星用MH和MH(血清)培养基稀释成不同终浓度，各取100μL加入96孔板中，然后在每孔中加入100μL供试菌液，混匀置于37℃的培养箱中培养20h，测OD₆₀₀值，记录LRGG和环丙沙星单独MIC值及两药联合时的FIC值。

MH平板质量组成：0.2wt％牛肉粉、0.15wt％可溶性淀粉、1.75wt％酸水解酪蛋白、1.0wt％琼脂，溶剂为去离子水。

MH(血清)平板质量组成：0.2wt％牛肉粉、0.15wt％可溶性淀粉、1.75wt％酸水解酪蛋白、1.0wt％琼脂，0.1％血清，溶剂为去离子水。

MH液体培养基质量组成：0.2wt％牛肉粉、0.15wt％可溶性淀粉、1.75wt％酸水解酪蛋白，溶剂为去离子水。

MH(血清)液体培养基质量组成：0.2wt％牛肉粉、0.15wt％可溶性淀粉、1.75wt％酸水解酪蛋白，0.1％血清，溶剂为去离子水。

结果如图1所示，单独使用时，抗菌肽LRGG对多杀性巴氏杆菌的MIC＝4μg/mL，具有较强抗菌作用；环丙沙星对多杀性巴氏杆菌P32菌株表现为耐药(MIC＝32μg/mL)。当2μg/mL(1/2×MIC)LRGG联合环丙沙星时，耐环丙沙星多杀性巴氏杆菌对环丙沙星的MIC从32μg/mL下降为0.0625μg/mL，MIC降低了512倍，即从耐药转变为敏感。

实施例3时间-杀菌曲线

本实施例在于研究亚抑菌浓度的LRGG与环丙沙星联合用药对多杀性巴氏杆菌生长的抑制效果。

将多杀性巴氏杆菌P32接种于MH(血清)平板，放置37℃培养箱中培养48h，从平板上挑选一个单菌落接入MH(血清)斜面上，37℃培养24h，备用。从活化的斜面上挑一环供试菌到5mLMH(血清)液体培养基中，37℃，160rpm振荡培养过夜，用MH(血清)液体培养基稀释至细菌浓度为10⁶CFU/mL，获得多杀性巴氏杆菌P32菌液。

将实施例1制备的LRGG和环丙沙星用MH(血清)液体培养基稀释成不同浓度8μg/mL(2×MIC)LRGG、64μg/mL(2×MIC)环丙沙星、2μg/mL(1/2×MIC)LRGG联合1μg/mL环丙沙星，2μg/mL(1/2×MIC)LRGG联合0.5μg/mL环丙沙星，各取50μL加入96孔板中，然后在每孔中加入100μL多杀性巴氏杆菌P32菌液，混匀置于37℃的培养箱中培养20h，测OD₆₀₀值，同时以MH(血清)液体培养基作为空白对照，结果见图2所示。

结果如图2所示，选取8μg/mL(2×MIC)浓度的LRGG和64μg/mL(2×MIC)浓度的环丙沙星作为对照，发现8μg/mL浓度的LRGG可在8h后抑制多杀性巴氏杆菌P32的生长，64μg/mL浓度的环丙沙星在10h后抑制多杀性巴氏杆菌P32的生长，但是2μg/mL(1/2×MIC)LRGG联合0.5μg/mL环丙沙星时，在5h后可抑制多杀性巴氏杆菌P32的生长，证明LRGG与环丙沙星具有良好的协同抑菌效果。

实施例4小鼠保护实验

将60只ICR小鼠(雌性，体重18-22g)随机分为6组，每组10只动物，分组如下：

第一组：菌液组(2×10⁹CFU/mL)+PBS；

第二组：菌液组(2×10⁹CFU/mL)+LRGG(8mg/kg，10μL)；

第三组：菌液组(2×10⁹CFU/mL)+环丙沙星(6.4mg/kg，10μL)；

第四组：菌液组(2×10⁹CFU/mL)+LRGG+环丙沙星(4+0.5mg/kg，10μL，此浓度环丙沙星和LRGG的质量比为1:8)；

第五组：菌液组(2×10⁹CFU/mL)+LRGG+环丙沙星(4+1mg/kg，10μL，此浓度环丙沙星和LRGG的质量比为1:4)；

第六组：菌液组(2×10⁹CFU/mL)+LRGG+环丙沙星(8+6.4mg/kg，10μL，此浓度环丙沙星和LRGG的质量比为1:1.25)。

菌液制备：将多杀性巴氏杆菌P32按照实施例3的方法进行培养后，得到发酵液，离心得到菌体，之后重悬，得到2×10⁹CFU/mL的菌悬液。

小鼠气管注射0.5mL多杀性巴氏杆菌P32菌悬液(2×10⁹CFU/mL)建立小鼠腹膜炎模型。感染1h后，按照上述分组，分别腹腔注射不同剂量的抗菌药物(其中，各组的抗菌药物用PBS稀释后注射，第一组为对照组，以等量PBS代替)后，在7天内记录处理后小鼠的存活率和小鼠肺部的细菌负荷，结果见图3。

图3中A显示，环丙沙星(6.4mg/kg)生存率为22.2％，LRGG(8mg/kg)生存率为41.667％，LRGG联合环丙沙星(4+0.5mg/kg)生存率为71.429％，LRGG联合环丙沙星(4+1mg/kg)生存率为85.714％，LRGG联合环丙沙星(8+6.4mg/kg)生存率为100％。肺部载菌量结果如图3中B所示，LRGG联合环丙沙星(4+0.5mg/kg)与对照相比菌落数也减少了2个数量级左右。以上结果说明LRGG与环丙沙星联用在小鼠体内也具有显著的保护作用。

实施例5大蜡螟保护实验

大蜡螟幼虫48只(18-22mg)随机分为6组，每组8只，分组如下：

第一组；菌液组(1×10⁹CFU/mL)+PBS；

第二组：菌液组(1×10⁹CFU/mL)+LRGG(8mg/kg，10μL)；

第三组：菌液组(1×10⁹CFU/mL)+环丙沙星(6.4mg/kg，10μL)；

第四组：菌液组(1×10⁹CFU/mL)+LRGG+环丙沙星(4+0.5mg/kg，10μL，此浓度环丙沙星和LRGG的质量比为1:8)；

第五组：菌液组(1×10⁹CFU/mL)+LRGG+环丙沙星(4+1mg/kg，10μL，此浓度环丙沙星和LRGG的质量比为1:4)；

第六组：菌液组(1×10⁹CFU/mL)+LRGG+环丙沙星(8+6.4mg/kg，10μL，此浓度环丙沙星和LRGG的质量比为1:1.25)。

菌液制备：将多杀性巴氏杆菌P32按照实施例3的方法进行培养后，得到发酵液，离心得到菌体，之后重悬，得到1×10⁹CFU/mL的菌悬液。

在第一腹足分别用10μL的多杀性巴氏杆菌P32菌悬液(1×10⁹CFU/mL和感染。感染1h后，按照上述分组，分别腹腔注射不同剂量的抗菌药物(其中，各组的抗菌药物用PBS稀释后注射，第一组为对照组，以等量PBS代替)，在5天内记录处理后大蜡螟的存活率，结果见图4。

如图4显示，环丙沙星(6.4mg/kg)生存率为12.5％，LRGG(8mg/kg)生存率为20％，LRGG联合环丙沙星(4+0.5mg/kg)生存率为41.667％，LRGG联合环丙沙星(4+1mg/kg)生存率为66.667％，LRGG+CIP(8+6.4mg/kg)生存率为80％。以上结果说明LRGG在体内也可以恢复环丙沙星敏感性。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种抗菌肽LRGG在制备环丙沙星的抗菌增效剂中的应用，其特征在于，所述抗菌肽LRGG的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述环丙沙星通过与所述抗菌增效剂产生协同增效作用来提高对多杀性巴氏杆菌的敏感性。

2.一种多杀性巴氏杆菌的抗菌组合物，其特征在于，所述抗菌组合物由环丙沙星和抗菌肽LRGG组成；

所述抗菌肽LRGG的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述环丙沙星和所述抗菌肽LRGG的质量比为1:(1.25～8)。

3.一种如权利要求2所述的抗菌组合物在制备抗多杀性巴氏杆菌的药物中的应用。

4.一种抗多杀性巴氏杆菌的药物，其特征在于，活性成分包括权利要求2所述的抗菌组合物。

5.根据权利要求4所述的抗菌药物，其特征在于，所述抗菌药物还包括药学上可接受的辅料。